CN114404573A - Wnt3a蛋白质在促进动物生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Wnt3a蛋白质在促进动物生长中的应用。本发明利用Wnt3a基因构建重组表达质粒并诱导表达重组Wnt3a蛋白质发现，重组Wnt3a蛋白质能够提高肠道上皮细胞和骨骼肌卫星细胞的细胞活力，促进肠道上皮细胞、骨骼肌卫星细胞和肠道干细胞的增殖，显著提高类肠团生成率和出芽率。因此，可将Wnt3a蛋白质用于促进动物生长，类肠团培养以及制备动物生长促进剂等。本发明拓宽了Wnt3a蛋白质及其编码基因的应用范围，同时为动物生长促进剂，细胞增殖促进剂等的制备提供了新的来源。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及Wnt3a蛋白质在促进动物生长中的应用。
背景技术
Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络。在哺乳动物中，Wnt家族包括已经鉴定出的19个Wnt配体和10个卷曲蛋白(FZD1～10)。其中，Wnt配体可与卷曲蛋白相互作用，导致各种细胞内信号传导级联激活，这些信号传导级联又可以交叉连接或独立发挥作用，调节多种多样的生化过程。
Wnt3a是Wnt/β-catenin经典途径中的主要配体。当存在Wnt3a配体时，其会与细胞膜上的受体FZD结合激活Wnt信号通路，导致β-catenin去磷酸化，使得β-catenin在细胞质中富集并转移至细胞核内，与T细胞特异性转录因子TCF结合，调控c-Myc基因、细胞周期蛋白质D1(Cyclin D1)和亮氨酸重复单位的G蛋白质偶联受体5(Lgr5)等关键靶基因转录。目前的研究发现Wnt3a与多种恶性肿瘤相关。例如，王理等通过分析检测肝细胞性肝癌患者癌组织和血Wnt3a的表达发现其与肝癌进展密切相关，可将Wnt3a作为细胞性肝癌特异诊断和预后的标志物(王理,潘刘翃,姚敏,et al.Wnt3a作为新标志物对肝癌诊断和预后的临床价值[J].中华医学杂志,2016,96(44):5.)。本申请在对人源Wnt3a重组蛋白质的研究中也发现其可增强小鼠干细胞活性，但人源Wnt3a重组蛋白质对猪干细胞的增殖却没有影响，提示Wnt3a重组蛋白质或具有种属差异。而对不同种属的Wnt3a进行发掘，或可发现其不同的生物功能，丰富其应用范围。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供Wnt3a蛋白质在促进动物生长中的应用。
本发明的第一个目的是提供Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进动物生长或在制备动物生长促进剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供Wnt3a蛋白质或其编码基因在提高细胞活力或在制备提高细胞活力的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进细胞增殖或在制备促进细胞增殖的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进类肠团生长或出芽或在制备促进类肠团生长或出芽的产品中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过克隆猪Wnt3a基因，构建重组表达质粒后通过表达纯化获得了重组Wnt3a蛋白质；所述猪Wnt3a蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码猪Wnt3a蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明发现重组Wnt3a蛋白质能够显著提高肠道上皮细胞、骨骼肌卫星细胞以及猪类肠团的活力(P<0.05)，显著提高细胞增殖标志蛋白PCNA、Lgr5以及Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(Active β-catenin、TCF4、CyclinD1)的表达量(P<0.05)。而提高肠道上皮细胞及骨骼肌卫星细胞活力并促进细胞增殖有助于促进动物生长。因此，本发明申请保护Wnt3a蛋白质或其编码基因的以下应用：
所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进动物生长或在制备动物生长促进剂中的应用。
所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在提高细胞活力或在制备提高细胞活力的产品中的应用。
所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进细胞增殖或在制备促进细胞增殖的产品中的应用。
所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进类肠团生长或出芽或在制备促进类肠团生长或出芽的产品中的应用。
具体地，所述Wnt3a蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述编码Wnt3a蛋白质的基因序列如SEQ ID NO.2所示，见实施例1。
具体地，所述动物为猪。
具体地，Wnt3a蛋白质或其编码基因可以提高肠上皮细胞和/或骨骼肌卫星细胞的细胞活力。
具体地，Wnt3a蛋白质或其编码基因可以促进肠上皮细胞、骨骼肌卫星细胞和/或肠道干细胞增殖。
具体地，所述肠上皮细胞为IPEC-J2细胞。
具体地，所述促进细胞活力或增殖是通过制备重组Wnt3a蛋白质，并将细胞置于含重组Wnt3a蛋白质的培养基中实现的。
具体地，当培养细胞为肠上皮细胞或骨骼肌卫星细胞时，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为20～320ng/mL。
优选地，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为40～320ng/mL，见实施例5和6。
更优选地，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为80～160ng/mL，见实施例5和6。
更进一步优选地，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为80ng/mL，见实施例5和6。
具体地，当培养细胞为肠道干细胞时，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为150～600ng/mL。
优选地，所述培养基中重组Wnt3a蛋白质的浓度为600ng/mL，见实施例5。
具体地，所述重组Wnt3a蛋白质的制备方法为：利用去除信号肽的Wnt3a基因构建重组表达质粒后转入表达工程菌中诱导表达。
具体地，所述表达质粒为PET-32α，所述表达工程菌为BL21。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现重组Wnt3a蛋白质能够提高肠道上皮细胞和骨骼肌卫星细胞的细胞活力，促进肠道上皮细胞、骨骼肌卫星细胞和肠道干细胞的增殖，显著提高类肠团生成率和出芽率。因此，可将Wnt3a蛋白质用于促进动物生长，类肠团培养以及制备动物生长促进剂等。本发明拓宽了Wnt3a蛋白质及其编码基因的应用范围，同时为动物生长促进剂，细胞增殖促进剂等的制备提供了新的来源。
此外，本发明还成功构建了重组Wnt3a蛋白质的诱导表达方法并成功纯化获得了重组Wnt3a蛋白质。与市售人源Wnt3a重组蛋白质的价格相比，本发明所述猪源Wnt3a重组蛋白质的制备价格低，降低了不必要的科研经费投入，有利于猪Wnt3a蛋白质的研究，也为Wnt3a作为促生长用新型饲料添加剂的开发奠定了基础。
附图说明
图1为Wnt3a基因和去除信号肽的Wnt3a基因的PCR电泳结果及其序列比对结果；其中，图A为Wnt3a基因的PCR电泳结果图；图B为Wnt3a基因测序结果与NCBI中Wnt3a预测序列的比对结果；图C为去除信号肽的Wnt3a基因的PCR电泳结果图；图D为去除信号肽的Wnt3a基因与Wnt3a基因的序列比对结果；图中M1为DNA 2000 Marker；1为Wnt3a基因片段；2为去除信号肽的Wnt3a基因片段。
图2为Wnt3a基因及表达质粒的双酶切检测电泳结果；其中，图A为双酶切后去除信号肽的Wnt3a基因的水平凝胶电泳结果，图B为双酶切后PET-32α空质粒的水平凝胶电泳结果；图中M1为DNA 2000 Marker；M2为DNA 15000 Marker；1为双酶切后去除信号肽的Wnt3a基因；2为双酶切后的PET-32α空质粒。
图3为重组质粒PET-32α-Wnt3a的单双酶切及PCR验证结果；其中，图A为EcoR Ⅰ单酶切后重组质粒后的电泳结果；图B为Hind Ⅲ单酶切后重组质粒后的电泳结果；图C为EcoRⅠ与HindⅢ双酶切后重组质粒后的电泳结果；图D为重组质粒的PCR验证结果；图中M1为DNA2000Marker；M2为DNA 15000Marker；1为EcoR Ⅰ单酶切；2为Hind Ⅲ单酶切；3为EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切；4为PET-32α空质粒；5为PET-32α-Wnt3a单克隆。
图4为重组Wnt3a(rpWnt3a)蛋白质的检测结果；其中，图A为rpWnt3a蛋白质诱导表达前后的检测结果；图B为Wnt3a抗体验证结果；图C为His标签抗体验证结果；图中1为IPTG诱导后；2为IPTG诱导前；3为Wnt3a抗体验证；4为His标签抗体验证。
图5为纯化后rpWnt3a蛋白质的检测结果；其中，图A为IPTG诱导后上清及rpWnt3a蛋白质的表达量检测结果；图B为不同洗脱次数纯化后rpWnt3a蛋白质的检测结果。
图6为rpWnt3a处理IPEC-J2细胞结果；其中，图A为rpWnt3a蛋白质处理细胞的最佳浓度筛选结果；图B为rpWnt3a处理IPEC-J2细胞后增殖标志物PCNA蛋白质；图C为图B所示结果的数据统计图；图D为WB检测rpWnt3a蛋白质处理IPEC-J2细胞Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质表达量的影响结果；图E为图D所示结果的数据统计图。图F为rpWnt3a对猪肠道干细胞扩增的影响；图G为rpWnt3a对猪类肠团生成效率的影响；图H为rpWnt3a对猪类肠团出芽效率的影响。
图7为rpWnt3a处理骨骼肌卫星细胞结果；其中，图A为rpWnt3a处理骨骼肌卫星细胞最佳浓度筛选；图B为比较rpWnt3a和rhWnt3a分别处理骨骼肌卫星细胞活性检测试验结果；图C为rpWnt3a蛋白质处理骨骼肌卫星细胞后增殖标志PCNA蛋白质的表达结果；图D为图C所示结果的数据统计图；图E为WB检测rpWnt3a蛋白质处理骨骼肌卫星细胞Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质表达量的影响结果；图F为图E所示结果的数据统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 猪Wnt3a基因的克隆
1、克隆猪Wnt3a基因的ORF区域
本发明提取了21日龄的健康杜×长×大仔猪的小肠的RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板克隆猪Wnt3a基因(ORF区域)。
参照GenBank中的Wnt3a预测序列，以其ORF(蛋白质编码区)为目的基因设计引物，设计引物如下所示：
Wnt3a-F：ATGGCCCCTCTTGGATATTTCATATTC
Wnt3a-R：CTACTTGCAGGTGTGCACGTCGTAG
以反转录所得cDNA为模板，利用引物Wnt3a-F/Wnt3a-R和高保真酶体系克隆目的片段，结果用琼脂糖水平凝胶电泳检测，将与预测大小一致的特异性条带胶回收并测序。
猪Wnt3a基因克隆的反应条件如表1所示：
表1猪Wnt3a基因克隆反应条件
猪Wnt3a基因克隆的反应体系如表2所示：
表2猪Wnt3a基因克隆体系
猪Wnt3a的ORF扩增结果如图1A所示，图1B为测序结果。由图1A和1B可知，本发明成功克隆到了猪Wnt3a的ORF区域，其序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2 重组质粒PET-32α-Wnt3a的构建
构建重组质粒PET-32α-Wnt3a
(1)猪Wnt3a基因去信号肽加酶切位点
将克隆所得猪Wnt3a基因的碱基序列转换为相应的氨基酸序列，其序列如SEQ IDNO.1所示。用SignalP查询发现猪Wnt3a蛋白质的信号肽为前18个氨基酸。去除信号肽对应序列，以去掉信号肽的Wnt3a为目的片段，重新设计引物Wnt3a-F1、Wnt3a-R1，所述正向引物Wnt3a-F1中包括保护碱基和酶切位点EcoRⅠ，反向引物Wnt3a-R1中包括保护碱基和酶切位点Hind Ⅲ。
Wnt3a加酶切位点的引物如下所示：
Wnt3a-F1：CGGAATTC AGCTACCCGATCTGGTGGTCCCTGGC
Wnt3a-R1：CCAAGCTT CTACTTGCAGGTGTGCACGTCGTAG
斜体部分分别为酶切位点EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ。
PCR模板为实施例1中的目的基因Wnt3a的克隆胶回收产物。
PCR的体系与反应条件与实施例1相同。
PCR结束后，通过琼脂糖水平凝胶电泳检测，将与预测大小一致的特异性条带做胶回收，结果如图1所示。其中，去掉信号肽的Wnt3a目的片段的水平凝胶电泳图结果如图1C所示，图1D为测序结果。由图1C和1D可知，本发明成功获得了去除了信号肽的猪Wnt3a基因。
(2)双酶切质粒pET-32a和猪Wnt3a目的片段
分别将表达质粒pET-32a和加了酶切位点的Wnt3a PCR产物用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切。
双酶切体系如表3所示：
表3双酶切质粒pET-32a和猪Wnt3a目的片段
配制好质粒pET-32a的双酶切体系后，将其置于37℃水浴锅中双酶切两小时，通过水平式琼脂糖凝胶电泳做胶回收。
加了酶切位点的Wnt3a置于37℃水浴锅中双酶切两小时后用DNA产物纯化试剂盒回收。
取少量回收后的双酶切Wnt3a目的片段和双酶切质粒pET-32a进行检测，双酶切Wnt3a目的片段的水平凝胶电泳图如图2A所示，双酶切质粒pET-32a的水平凝胶电泳图如图2B所示。由图2A和2B可知，本发明成功获得了Wnt3a目的片段和pET-32a的酶切片段。
(3)构建重组质粒PET-32α-Wnt3a
测量步骤(2)回收的猪Wnt3a目的基因片段与质粒pET-32a的浓度，用T4连接酶配制20μL反应体系，构建重组质粒PET-32α-Wnt3a，连接产物转化至宿主菌中扩繁。
连接体系如表4所示：
表4双酶切质粒pET-32a和猪Wnt3a目的片段的连接
实施例3 受体菌株DH5a扩繁重组质粒PET-32α-Wnt3a
取10μL实施例2中连接得到的重组质粒PET-32α-Wnt3a，将其转化到大肠杆菌菌株DH5a中，用加了AMP(氨苄青霉素钠最终浓度为50μg/mL)的LB固体培养板涂布并37℃培养12～16h，挑取单克隆并用实施例1中的Wnt3a-F1和Wnt3a-R1引物进行PCR验证。
具体过程如下：
1、将重组质粒PET-32α-Wnt3a转入受体菌株DH5α中
(1)将受体菌株DH5a从-80℃取出置于4℃冰上融化；
(2)10μL质粒加入50μL感受态细胞中冰上混匀，置于4℃冰上30min；
(3)42℃水浴10～90s冰上3min静置；
(4)加500μL不加氨苄的LB液体培养基，37℃摇床200r/min摇60min；
(5)300r/min离心2min，吸掉上清，留60μL培养液吹打均匀后涂布于已加AMP(终浓度50μg/mL)LB固体培养板；
(6)涂板后37℃培养箱中放置10～20min后倒置继续培养12～16h；
(7)挑取8～10个单克隆于1.5mL离心管中扩繁8h，引物PCR验证；取转化成功的菌株按菌株：甘油比例465：200保种于1.5mL的离心管中。
2、重组质粒抽提
取50mL过夜培养的含有重组质粒PET-32α-Wnt3a的DH5α菌液至50mL离心管中，10000r/min离心5min弃上清收集菌体并抽提质粒；抽提质粒后测质粒浓度。
3、重组质粒验证
将抽提所得重组质粒PET-32α-Wnt3a进行单双酶切验证，同时用质粒PET-32α的通用引物T7/T7er进行PCR验证，以质粒PET-32α空质粒为对照。
单双酶切体系与双酶切质粒体系相同，单双酶切之后用琼脂糖水平凝胶电泳检测酶切结果。
重组质粒PET-32α-Wnt3a的单双酶切验证及PCR验证结果如图3所示。其中，图3A为EcoR Ⅰ单酶切后重组质粒后的电泳结果；图3B为Hind Ⅲ单酶切后重组质粒后的电泳结果。图3C为EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切后重组质粒后的电泳结果；由图3A～C可知，单酶切水平凝胶电泳图条带位置与重组质粒水平凝胶电泳图条带位置相同，双酶切水平凝胶电泳图条带位置与双酶切质粒水平凝胶电泳图条带位置相同，表明本发明成功构建了重组质粒PET-32α-Wnt3a。图3D为重组质粒的PCR验证结果，其结果也表明成功构建了重组质粒PET-32α-Wnt3a。
4、将重组质粒PET-32α-Wnt3a转入表达菌株BL21中
将重组质粒PET-32α-Wnt3a转入宿主菌株BL21中，将重组质粒转入受体菌株DH5α中步骤相同。
用PET-32α的通用引物T7/T7-Ter或者引物Wnt3a-F1、Wnt3a-R1进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性菌。比较各单克隆之间表达量的差异，选取表达量最高的单克隆并保种。
实施例4 大肠杆菌BL21中可溶性His标签rpWnt3a蛋白质的表达纯化
对于特定蛋白的诱导表达，最佳的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度和诱导时间需要通过实验确定。实验筛选得到了重组猪Wnt3a(rpWnt3a)蛋白质的最佳诱导条件为：30℃、160r/min、1mM IPTG诱导培养5～6h。利用此诱导条件进行了rpWnt3a的诱导表达及纯化，具体如下：
1、蛋白质rpWnt3a的诱导表达及纯化
(1)将实施例3中蛋白质rpWnt3a表达量最高的保种菌株，接种到10mL含AMP(最终浓度50μg/mL)的LB培养液中，37℃摇床200r/min培养过夜；
(2)取1mL接种到100mL的已加氨苄的LB液体培养基中37℃摇床200r/min培养3～4h，至菌液的OD600达到0.6；
(3)取出1mL菌液至15mL离心管中。剩余菌液加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，30℃摇床160r/min继续培养5～6h；
(4)50mL离心管收集菌液，4℃10000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀；
(5)PBS重悬沉淀，离心去上清，重复两次；
(6)称量沉淀，加裂解液10mL/g，溶菌酶终浓度1mg/mL冰上放置裂解30min；
(7)冰上超声波细胞破碎仪破碎30min，超声功率200～300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，取上清。混匀，重复两次；
(8)取3mL上清与10mL镍柱混合冰上结合1h，结合期间需轻微摇晃混匀3～4次；
(9)洗涤液洗涤三次，再用洗脱液洗涤三次。
2、SDS-PAGE电泳及其考马斯亮蓝染色验证蛋白质rpWnt3a的表达
制样后进行SDS-PAGE电泳，将胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色30min后脱色液洗涤过夜。
rpWnt3a蛋白质的检测结果如图4所示；其中，图4A为rpWnt3a蛋白质诱导表达前后的检测结果；图4B为Wnt3a抗体验证结果；图4C为His标签抗体验证结果；图中1为IPTG诱导后；2为IPTG诱导前；3为Wnt3a抗体验证；4为His标签抗体验证。由图4可知，本发明成功获得了rpWnt3a蛋白质。
纯化后的rpWnt3a蛋白质的检测结果如图5所示；其中，图5A为IPTG诱导后上清及rpWnt3a蛋白质的表达量检测结果；图5B为不同洗涤和洗脱次数纯化后rpWnt3a蛋白质的检测结果，洗涤3次目的为洗杂带，洗脱3次为将rpWnt3a蛋白质洗脱下来。由图5可知，本发明成功纯化获得了rpWnt3a蛋白质，且纯化效果好。
实施例5 rpWnt3a蛋白质对IPEC-J2细胞增殖及其细胞活力的影响
1、rpWnt3a蛋白质对IPEC-J2细胞(来源于新生仔猪空肠细胞系)增殖及其细胞活力的影响
将IPEC-J2细胞以每孔3×103个细胞接种到96孔细胞培养板中，对照组用完全培养基培养，试验组分别用含20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL和320ng/mL rpWnt3a蛋白质溶液的完全培养基培养，并分别在接种后的第24h、48h、72h检测细胞活力。
结果如图6A～C所示，图6A为rpWnt3a处理IPEC-J2细胞的最佳浓度筛选结果；图6B为rpWnt3a处理IPEC-J2细胞后增殖标志物PCNA蛋白质；图6C为图6B的数据统计图。由图6A～C可知，rpWnt3a蛋白质处理IPEC-J2细胞的优选浓度范围为20～360ng/mL，更优的浓度范围为80～160ng/mL，最佳浓度为80ng/mL。
2、rpWnt3a蛋白质处理IPEC-J2细胞对Wnt信号通路的影响。
根据实施例5(1)所得结果，将IPEC-J2细胞按照5×104个/孔接入6孔细胞培养板，以80ng/mL重组蛋白质rpWnt3a处理48h后，通过RIPA裂解液收集细胞样品，并借助BCA试剂盒检测细胞样品蛋白质浓度。然后，WB检测IPEC-J2细胞后对Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质表达量的影响，结果如图6D和图6E所示。由图6D和图6E可知，rpWnt3a能够显著提高Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(β-catenin、TCF4、c-Myc、CyclinD1)的表达量(P<0.05)。
上述结果表明rpWnt3a蛋白质能有效促进IPEC-J2细胞增殖分化。
3、rpWnt3a蛋白质支持肠道干细胞增殖
分离仔猪空肠隐窝获取肠道干细胞，与基质胶混匀后接种于48孔板中；在37℃细胞培养箱中预热20min，对照组加入250μL含Wnt3a CM(条件性培养基)的干细胞培养基，试验组分别加入0、150、300、600ng/mL rpWnt3a蛋白质的干细胞培养基，培养6d至隐窝细胞完全扩增为具有典型“芽状”结构的肠道类器官，统计类肠团生成效率和出芽效率，评价类器官生长优势。
所述Wnt3a CM(条件性培养基)中Wnt3a的获得方式与本发明不同，其是由L Wnt-3A细胞(货号：GNM27)表达获得。
蛋白质rpWnt3a支持猪肠道干细胞增生的试验结果如图6F～H所示。由图6F可知，与含Wnt3a CM相比，rpWnt3a可以促进猪肠道干细胞扩增，其中浓度600ng/mL rpWnt3a更有效的促进猪肠道干细胞扩增；由图6G可知，将rpWnt3a注入猪类肠团培养24h后，与含Wnt3aCM相比，其促进了肠道类肠团生成效率。由图6H可知，与对照组相比，rpWnt3a可以显著提高猪类肠团出芽效率。
实施例6 rpWnt3a蛋白质对骨骼肌卫星细胞增殖及其细胞活力的影响
1、rpWnt3a蛋白质对骨骼肌卫星细胞增殖及其细胞活力的影响
rpWnt3a蛋白质对骨骼肌卫星细胞增殖及其细胞活力的影响与实施例5第1步筛选步骤相同，骨骼肌卫星细胞源自仔猪的背最长肌。
结果如图7A所示，由图7A可知，rpWnt3a处理骨骼肌卫星细胞的优选浓度范围为20～360ng/mL，更优的浓度范围为80～160ng/mL，最佳浓度为80ng/mL。
2、比较rpWnt3a蛋白质与市售rhWnt3a蛋白质对骨骼肌卫星细胞增殖及活力的影响
采用与实施例5相同的方法比较rpWnt3a和市售rhWnt3a(货号：5036-WN-010)分别处理骨骼肌卫星细胞后的细胞活性，检测比较结果如图7B所示。由图7B可知，相同条件下，本发明所述rpWnt3a蛋白质相比于市售rhWnt3a可以显著提高骨骼肌卫星细胞的细胞活力。rpWnt3a蛋白质处理骨骼肌卫星细胞后增殖标志PCNA蛋白质的表达结果如图7C和7D所示，Western blot验证结果表明，rpWnt3a蛋白质能够显著提高骨骼肌卫星细胞增殖标志蛋白质PCNA的表达量，作用高于rhWnt3a组但差异不显著。
3、rpWnt3a蛋白质处理骨骼肌卫星细胞对Wnt信号通路的影响。
采用与实例5相同的方法，检测rpWnt3a蛋白质处理骨骼肌卫星细胞对Wnt信号通路的影响。WB检测重组蛋白质rpWnt3a处理骨骼肌卫星细胞后对Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质表达量的影响结果如图7E所示。由图7E可知，rpWnt3a能够显著提高骨骼肌卫星细胞增殖标志蛋白质PCNA、Lgr5以及Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(Active β-catenin、β-catenin、TCF4、Lgr5、c-Myc、CyclinD1)的表达量(P<0.05)，且rpWnt3a组中靶蛋白质TCF4、Lgr5的表达量显著高于rhWnt3a组(P<0.05)，rpWnt3a组靶蛋白质c-Myc、CyclinD1相比于rhWnt3a组表达量增加但差异不显著。上述结果表明rpWnt3a蛋白质能有效促进骨骼肌卫星细胞增殖分化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> Wnt3a蛋白质在促进动物生长中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa domestica)
<400> 1
Met Ala Pro Leu Gly Thr Pro Ile Pro Leu Thr Gly Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ser Thr Pro Ile Thr Thr Ser Leu Ala Val Gly Pro Gly Thr
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Thr Gly Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
35 40 45
Val Pro Leu Gly Leu Ala Pro Cys Ala Ala Thr Val Gly Ile Met Pro
50 55 60
Ser Val Ala Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ile Gly Gly Cys Gly His Gly
65 70 75 80
Pro Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Ile Ala Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Pro Gly Pro Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala Gly Ser Ala Pro Val
100 105 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Pro Ala Val Thr Ala Ser Cys
115 120 125
Ala Gly Gly Ser Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Ala His Gly Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Thr Leu Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ala Ile Gly
145 150 155 160
Pro Gly Gly Met Val Ser Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Ala Ser Ala Met Ala Ala His Ala Ala Gly Ala Gly Ala
180 185 190
Gly Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Leu Cys Leu Cys His Gly Leu
195 200 205
Ser Gly Ser Cys Gly Val Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Pro Ala Pro
210 215 220
Ala Ala Ile Gly Ala Pro Leu Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Gly
225 230 235 240
Met Val Val Gly Leu His Ala Gly Ser Ala Gly Thr Val Gly Thr Leu
245 250 255
Ala Pro Ala Thr Thr Thr Pro Leu Val Pro Thr Gly Ala Ala Leu Val
260 265 270
Thr Thr Gly Ala Ser Pro Ala Pro Cys Gly Pro Ala Pro Gly Thr Gly
275 280 285
Ser Pro Gly Thr Ala Ala Ala Thr Cys Ala Val Ser Ser His Gly Ile
290 295 300
Ala Gly Cys Ala Leu Leu Cys Cys Gly Ala Gly His Ala Ala Ala Thr
305 310 315 320
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Cys His Cys Val Pro His Thr Cys Cys Thr
325 330 335
Val Ser Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ile Thr Ala Val His Thr Cys Leu
340 345 350
<210> 2
<211> 1059
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa domestica)
<400> 2
atggcccctc ttggatattt catattcctc tacggcctga agcaagctct gggcagctac 60
ccgatctggt ggtccctggc tgttgggccc cagtactcat ccctggggac acagcccatc 120
ctctgcgcca gtatcccagg cctggtaccc aagcagctgc gtttctgccg gaactatgtg 180
gagatcatgc ccagcgtggc agagggcatc aagatcagca tccaagagtg ccaacaccag 240
ttccgtggcc gccggtggaa ttgcaccact atcaacaaca gcctggccat ctttggcccc 300
gtgctggaca aagccacccg ggagtctgcc ttcgtgcacg ctatcgcctc cgctggagtt 360
gccttcgctg tgactcgctc gtgtgcggag ggctccgctg ccatctgcgg ctgcagcagc 420
cgtcaccagg gctctcccgg tgagggctgg aagtggggcg ggtgcagcga ggacattgag 480
ttcggcggga tggtgtctcg ggagttcgca gatgcgcggg agaaccggcc agacgctcgc 540
tccgcaatga accgtcacaa caatgaggct gggcgccagg ccatcgccag ccacatgcac 600
ctcaagtgca agtgccatgg gctgtcaggc agctgtgagg tgaagacctg ctggtggtcg 660
cagcctgact tccgtgccat tggcgacttc ctcaaggaca agtacgacag cgcctctgag 720
atggtggtgg agaagcaccg cgagtcacgt ggctgggtgg agaccctgcg gccacgctac 780
acctacttta aggtgcccac agagcgcgac ttggtctact atgaggcctc acccaacttc 840
tgtgaaccca accccgagac gggatccttc ggtacacgtg accgcacctg caacgtgagc 900
tcacatggca ttgatggctg tgacctgctg tgctgcggcc gaggccacaa cgcacgcact 960
gagaggcgga gggagaagtg ccactgtgtc ttccactggt gctgttacgt gagctgccag 1020
gagtgcacgc gcatctacga cgtgcacacc tgcaagtag 1059
Claims (10)
1.Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进动物生长或在制备动物生长促进剂中的应用，其特征在于，所述Wnt3a蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述动物为猪。
3.权利要求1所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在提高细胞活力或在制备提高细胞活力的产品中的应用。
4.权利要求1所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进细胞增殖或在制备促进细胞增殖的产品中的应用。
5.权利要求1所述Wnt3a蛋白质或其编码基因在促进类肠团生长或出芽或在制备促进类肠团生长或出芽的产品中的应用。
6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述细胞为肠上皮细胞和/或骨骼肌卫星细胞。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述细胞为肠上皮细胞、骨骼肌卫星细胞和/或肠道干细胞。
9.根据权利要求3～5任一所述应用，其特征在于，所述促进细胞活力或增殖是通过制备重组Wnt3a蛋白质，并将细胞置于含重组Wnt3a蛋白质的培养基中实现的。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述重组Wnt3a蛋白质的制备方法为：利用去除信号肽的Wnt3a基因构建重组表达质粒后转入表达工程菌中诱导表达。
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2021
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