CN109161516A - 一种猪肠道隐窝分离和3d类器官培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法。本发明在猪肠道隐窝分离的过程中加入青霉素和链霉素，避免了后期培养过程中由肠道微生物导致的污染，通过优化水平摇转仪处理肠段的转速和时间及涡旋仪涡旋的次数和时间，使获得的隐窝形态更完整，存活率和出芽率更高。本发明优化了用于隐窝和3D类器官培养的培养液的配方，使隐窝能更好地分化形成3D类器官并稳定地生长和分化。本发明确定了猪肠道隐窝的分离条件和最佳培养方法，为后续利用猪肠道3D类器官研究肠道病毒和细菌感染奠定了良好的基础。

Description

一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法

技术领域

本发明属于动物组织学技术领域。具体涉及一种猪肠道隐窝分离的方法和3D类器官的培养方法。

背景技术

传统用于肠道生理和病理过程研究的二维(2D)细胞系由单一种类细胞组成，而肠道各部分有其独特的组织结构和生理功能，2D细胞系不能真实模拟肠道的结构、功能和发病过程，严重制约了肠道生理和病理过程的研究。近年来肠道3D类器官的发展为肠道及肠道疾病的相关研究提供了新的有用的工具。肠道3D类器官培养是在基质胶和多种生长因子存在的条件下在体外培养肠干细胞，使之逐渐增殖，分化出包括潘氏细胞、杯状细胞在内的几乎所有类型的肠上皮细胞，并形成具有多个隐窝区域的空腔样结构(迷你肠)，同时保留肠干细胞自我更新和多向分化的能力(Stelzner M,et al.A nomenclature forintestinal in vitro cultures.American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology.2012,302(12):G1359-G1363.Mahe MM et al.Establishment ofhuman epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.Journalof visualized experiments.2015,97:e52438.)，因此3D类器官能真实地反映肠道的生理和病理过程。

目前人和小鼠的肠道3D类器官模型的研究已经比较成熟，人们能够在体外稳定传代培养人和小鼠的肠道3D类器官，且能长期冻存和复苏(Sato T et al.Single Lgr5 stemcells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymalniche.Nature.2009,459：262-265.Sato T et al.Paneth cells constitute the nichefor Lgr5 stem cells in intestinal crypts.Nature.2011,469：415-418)，而且人和小鼠的肠道3D类器官已被广泛应用于病毒和细菌的感染研究(Saxena K et al.Humanintestinal enteroids:a new model to study human rotavirus infection,hostrestriction,and pathophysiology.Journal of Virology.2016,90(1):43-56.Yin Y etal.Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primaryintestinal organoids.Antiviral Research.2015,123:120-131)。

猪肠道疾病每年给全球养猪业造成严重的经济损失，目前人们主要利用传统的2D细胞系来进行猪肠道疾病的相关研究，但由于2D细胞系不能模拟体内真实情况，影响了对其研究的进展，同时随着人们对动物福利意识的增强，使直接利用动物模型来进行研究也受到了限制，因此迫切需要开发一种新型的体外模型来模拟体内的真实状况，开展猪肠道的生理和病理过程研究。3D类器官的发展为解决这一问题提供了有用的途径，但目前关于猪肠道3D类器官模型的研究仅有3篇报道，并且3篇文献报道的培养方法均存在一定的缺陷，其中Gonzalez等报道的猪肠道隐窝分离方法分离过程中需要不断观察分离的效果，根据观察结果进而延长孵育和摇转处理的时间，受主观因素影响较大，且培养过程中不添加类器官生长所必须的烟酰胺，导致后续培养的类器官形态差异较大(Gonzalez LM etal.Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model forthe study of intestinal epithelial regeneration.PLoS ONE.2013,8(6):e66465)；Khalil等介绍的方法由于在分离的过程中不加抗生素，可能导致后续培养过程中由于肠道微生物的污染而使类器官无法生长,同时在分离过程中用100μm滤网过滤隐窝，有可能导致完整隐窝的大量丢失，因为我们在研究中发现隐窝的大小远远超过100μm(Khalil HA etal.A Novel culture system for adult porcine intestinal crypts.Cell and TissueResearch.2016,365(1)：123-134)；B.van der Hee在分离过程中采用70μm滤网过滤，这可能导致完整隐窝丢失更多，并且B.van der Hee分离的类器官在培养过程中形态空洞化严重(B.van der Hee et al.Optimized procedures for generating an enhanced,nearphysiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.Stem CellResearch.2018,28:165-171)。

上述文献报道的猪肠道隐窝分离和3D类器官培养方法均存在一定的缺陷，正是本发明所解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是建立稳定的猪肠道隐窝的分离方法和猪肠道3D类器官模型培养方法。本发明通过参考与猪源相近的人肠道隐窝分离和3D类器官模型的培养方法，对比已报道的猪肠道隐窝分离和3D类器官模型的培养方法，进而建立了稳定的猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法。

本发明的技术方案如下所述：

1.猪肠道隐窝的分离

(1)无菌采集仔猪空肠中段迅速置于含冷PBS缓冲液的50ml离心管中；

(2)取平皿放于冰上并加少许冷PBS，将肠段转移至平皿中，用眼科镊剥离浆膜，纵向剖开肠段后用盖玻片轻轻刮去绒毛，用手术刀片将肠段切成小块后用冷PBS缓冲液反复洗涤干净；

(3)转移肠块至含冷PBS(其中加有10mmol/L EDTA和1mmol/L二硫苏糖醇(DTT))的平皿中；

(4)将平皿置于水平摇转仪上，4℃振摇孵育25min；

(5)孵育结束后转移肠块至加有冷PBS的50ml离心管中，用涡旋仪涡旋后弃上清；

(6)向沉淀的组织块中加入冷PBS，用涡旋仪涡旋后收取上清于离心管中，上清即为隐窝悬液。

2.猪肠道3D类器官的培养

(1)将获得的隐窝悬液离心后弃上清，加入适量冷PBS缓冲液重悬后计数；

(2)计数完成后离心去上清，根据计数结果用合适体积的预冷的Matrigel胶重悬，使隐窝数达到25个/10μl，铺于24孔板中，每孔40μl；

(3)将24孔板置于37℃培养箱中15min，使胶完全凝固；

(4)每孔加入预热的含生长因子的DMEM/F12培养液500μl，于37℃培养箱中继续培养，培养液每两天更换一次；

(5)培养8天左右(具体培养时间根据类器官数量和大小决定)可直接用于实验研究或传代培养或冻存。

附图说明

图1：倒置式生物显微镜下观察到的新鲜分离的猪肠道隐窝形态，比例尺为100μm。

图2：倒置式生物显微镜下观察到的包埋于Matrigel胶中的猪肠道隐窝生长为3D类器官的效果图，A-H分别为培养1-8d的3D类器官，比例尺为100μm。附图标记说明：图2中的A图是培养1d的3D类器官；图2中的B图是培养2d的3D类器官；图2中的C图是培养3d的3D类器官；图2中的D图是培养4d的3D类器官；图2中的E图是培养5d的3D类器官；图2中的F图是培养6d的3D类器官；图2中的G图是培养7d的3D类器官；图2中的H图是培养8d的3D类器官。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

本发明所需的相关试剂与配方：

DMEM/F12培养液(货号：SH30023.01B)购自美国Hyclone公司。

胎牛血清(FBS，货号：10099141)、N2 supplement(货号：17502048)、B27supplement(货号：12587010)、EGF(货号：PHG0311)购自美国Gibco公司。

n-Acetyl Cysteine(货号：A7520)、Nicotinamide(货号：N0636)、SB202190(货号：S7067)购自美国Sigma-Aldrich公司。

LY2157299(货号：S2230)、Y27632(货号：S1049)购自美国Selleck公司。

Primocin(货号：ant-pm-1)购自美国InvivoGen公司。

Matrigel胶(货号：356231)购自美国BD Biosciences公司。

Wnt3a(货号：5036-WN-500)、R-spondin1(货号：4645-RS-250)购自美国R&DSystem公司。

Noggin(货号：96-250-38-100)购自美国PeproTech公司。

PBS(磷酸盐缓冲液，简称PBS缓冲液):称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g于800ml去离子水中，调节pH至7.4，然后用蒸馏水定容至1000ml。

完全培养液(含生长因子的DMEM/F12培养液)的配制如表1所示。

表1完全培养液(含生长因子的DMEM/F12培养液)的配制

用0.22μm滤膜过滤除菌。

2.本发明猪肠道隐窝的具体分离步骤：

(1)将小量分装的Matrigel胶放于4℃冰箱过夜融化；

(2)将PBS(含100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，下同)提前放于4℃冰箱预冷，同时在隐窝分离实验开始前准备好冰盒；

(3)无菌采集4～8周龄健康仔猪空肠中段2～3cm，迅速置于含10ml冷PBS的50ml离心管中；

(4)将10cm平皿放于冰上并加5ml冷PBS，取出肠段放于平皿中，用眼科镊剥离浆膜，纵向剖开后用盖玻片轻轻刮去绒毛；

(5)转移肠段至含5ml冷PBS的新平皿中，用手术刀片将肠段切成长、宽均为3mm左右的块状，将块状肠段转移至含20ml冷PBS的50ml离心管中；

(6)用10ml移液管反复吹打10次，静置10s后吸弃上清，加入新鲜的冷PBS 20ml；

(7)重复步骤(6)3到4次直至上清液澄清；

(8)将块状肠段转移至加有20ml冷PBS(含10mmol/L EDTA，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT))的平皿中，平皿置于水平摇转仪上，4℃70r/min振摇孵育25min；

(9)用眼科镊将肠段转移至加有10ml冷PBS的50ml离心管中，于涡旋仪(Kylin-Bell，型号：VORTEX-5，下同)上以1档的转速涡旋2次，每次10s，待肠组织沉降后吸弃上清；

(10)再加10ml冷PBS，于涡旋仪上以1档的转速涡旋2次，每次10s，待组织沉降后收集上清液于一新的50ml离心管中(注意不要吸到大的沉降物)；

(11)重复步骤(10)四到五次，收集的上清液即为隐窝悬液，悬液中隐窝形态如图1中所示。

3.本发明猪肠道3D类器官培养方法：

(1)向收集的猪肠道隐窝悬液中加入胎牛血清(FBS)至终浓度为10％，于4℃270g离心5min；

(2)吸弃上清，加入10ml冷DMEM/F12培养液，轻轻重悬后转移至一新的15ml离心管；

(3)取20μl隐窝悬液滴于盖玻片上，于显微镜下计数；

(4)计数完成后，将装有隐窝悬液的离心管于4℃100g离心5min，吸弃上清；

(5)根据计数结果，加入一定量的Matrigel轻轻重悬隐窝，使隐窝数达到25个/10μl；

(6)将重悬的隐窝铺于24孔细胞培养板，40μl/孔，置于37℃含5％CO₂的培养箱中15min使Matrigel凝固；

(7)每孔加入500μl预热的含生长因子的DMEM/F12培养液，置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养；

(8)每两天更换一次含生长因子的DMEM/F12培养液；

(9)类器官生长至8天左右，可用于后续实验研究、传代培养或者冻存。

4.试验结果：

(1)猪肠道隐窝的分离。从倒置式生物显微镜下可见分离的隐窝形态完整，数量较多(件图1)，说明本发明的方法分离效果良好。

(2)猪肠道隐窝培养成为类器官。从倒置式生物显微镜下可见，分离的猪肠道隐窝随着培养时间的延长逐渐出芽，生长形成类器官(图2)，培养至8天左右可用于实验或传代或冻存。

本发明对文献报道的肠道隐窝分离和3D类器官培养方法进行优化创新，稳定了猪肠道隐窝分离的条件，优化了含生长因子培养液的配方，使猪肠道类器官的生长稳定。为后续进行猪肠道病毒、细菌感染的体外模拟研究奠定了良好的基础。

Claims (5)

1.一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法，其特征包括以下步骤：

(1)猪肠道隐窝的分离：无菌采集仔猪空肠中段，洗涤后剥离浆膜，纵向剖开肠段，刮去绒毛，切成小块后用冷PBS缓冲液洗涤干净，转移至含10mmol/L EDTA和1mmol/L二硫苏糖醇的冷PBS缓冲液的平皿中，于水平摇转仪上振摇孵育后，将肠段转移至加有冷PBS缓冲液的离心管中，于涡旋仪上涡旋后吸弃上清，再加冷PBS缓冲液，于涡旋仪上涡旋后收集上清液，即为隐窝悬液；

(2)猪肠道3D类器官的培养：将上步所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入适量冷PBS缓冲液重悬后计数，计数完成后离心去上清，根据计数结果用合适体积的预冷的Matrigel胶重悬，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中，待胶完全凝固后加入预热的含生长因子的DMEM/F12培养液，于37℃培养箱中继续培养，培养液每两天更换一次。

2.根据权利要求1所述的猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法，其特征在于，步骤(1)所述猪肠道隐窝的分离，获得的肠段在水平摇转仪上的孵育条件为4℃70r/min 25min；将孵育好的肠段转移至加有10ml冷PBS的50ml离心管中，于涡旋仪上以1档的转速涡旋2次，每次10s，待组织沉淀后吸弃上清；再加10ml冷PBS，于涡旋仪上以1档的转速涡旋2次，每次10s，收集上清液于一新的50ml离心管中，并重复四到五次，收集的上清液即为隐窝悬液。

3.根据权利要求1所述的猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的猪肠道3D类器官的培养，所用培养液为含生长因子的DMEM/F12培养液，其配方为：在DMEM/F12培养液中加入100ng/ml的Wnt3a，500ng/ml的R-spondin1，100ng/ml的Noggin，1×的血清替代物B27supplement和N2supplement，1mmol/L n-Acetyl Cysteine，50ng/ml的重组人表皮生长因子(EGF),10μmol/L的SB202190，即P38抑制剂，500nmol/L的LY2157299，即TGFβ抑制剂，10μmol/L的Y27632，即ROCK1抑制剂，10mmol/L的Nicotinamide，100μg/ml的Primocin。

4.权利要求1中所述的猪肠道隐窝分离和3D类器官培养方法在猪肠道类器官相关研究中的应用。

5.权利要求3中所述的含生长因子的DMEM/F12培养液在猪肠道类器官相关研究中的应用。