CN105473077A - 用于羊水收集和细胞分离的细胞、方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是用于安全的、高产量的无菌羊水收集的方法和装置。所述装置配置成允许装置获得通向羊膜腔所有区域的通道的足够的灵活度，允许羊水收集装置插入羊膜和绒毛膜的足够的硬度，还允许对母亲和胎儿的伤害无显著风险的足够的柔韧度。进一步公开的是从足月羊水中分离的细胞以及用于使用、重组和分化这些细胞的方法。

Description

用于羊水收集和细胞分离的细胞、方法和装置

相关申请

本申请要求2013年3月15日提交的序列号为61/801,256的美国临时专利申请的优先权，通过引用将上述申请的内容并入本文。

技术领域

在一个实施例中，本文所述的发明涉及生物材料的获得，所述生物材料包括羊水和细胞，包括出生时的羊水和细胞，在某些方面涉及无菌羊水的安全、高产的收集及其装置和方法。在另一个实施例中，本发明涉及来自羊水的细胞和细胞培养物，例如胎儿或婴儿的细胞，以及用于分离、扩增、重组、分化和储存所述细胞的方法，以及所述细胞在治疗方法、治疗、疾病预防、新药研发、个性化医学、再生医学、组织产生及万能血库中的应用，以及相关的方法和成分。

背景技术

用于分离细胞、细胞重组和产生多能细胞和多潜能细胞的方法，以及组织、器官和干细胞疗法，是包括个性化医学和再生医学在内的多种治疗应用的需求。已知多种人类干细胞和其它细胞类型，包括在早期胚胎发育期间分离的胚胎干细胞，以及诸如间充质干细胞或成人干细胞之类的成体干细胞。一些非干细胞可被重组进入更原始的阶段。

羊水是围绕、保护和帮助胎儿发育的水介质，例如，提供机械屏障、提供生长因子，以及通过填充发育的气室来划定将要成为永久气室的空间，从而促进肺部发育。羊水包含大量的分子成分，包括肺表面活化物质、细胞因子、生长因子、胎儿皮脂，以及传递的生存信号。

在Haas的美国专利号7,596,385、美国专利公布号US2005/0054093和US2005/0042595以及Atala等人的美国专利公布号US2005/0124003和国际专利申请号WO03/042405中描述了用于从羊水中分离胎细胞的方法。用于收集羊水的方法和装置，包括在怀孕的第一个或第二个三个月期间进行的羊膜腔穿刺术，以及M.Hallmanetal.,IsolationofHumanSurfactantfromAmnioticFluidandaPilotStudyofitsEfficacyinRespiratoryDistressSyndrome,Pediatrics1983,71(4):473-482中所描述的方法，该方法利用标准的手术室主动抽吸装置。

可用于收集、提取和分离生物组分，包括细胞物质、羊水及从中发现的细胞，的方法和装置还不完全令人满意，例如，在其安全性、避免所收集的物质污染(例如，空气污染)、细胞产量、效率，和/或避免组分破坏的能力等方面。

用于分离干细胞和/或从更分化的细胞中产生多潜能和/或多能干细胞的方法是，例如，包括再生医学和个性化医学(个体优化治疗)在内的细胞治疗应用所需要的。在这方面需要细胞资源及分离方法。还需要能够很方便地从大量捐赠者中获得的源材料细胞，例如，用于量大的且能够进行操作的细胞分离。本发明提供了满足这种需求的实施例。

例如，需要用于安全的、高产量的、羊水成分破坏最小的无菌羊水收集的方法和装置，用于包括存在于怀孕各时期的羊水内的细胞在内的成分的提取、增殖和分化的方法和设备，以及用于安全的、可靠的、不会损害现有的治疗相关细胞资源的具有重组能力从而产生多能和多潜能细胞的细胞物质的提取和分离方法。

同样，需要大量的能够进行操作、重组和分化的，用于再生医学、治疗和疾病预防、个性化医学及组织产生的细胞，以及通用供体库。在所提供的实施例中，具有满足这些需求的方法、设备、细胞和成分。

发明内容

在提供的实施例中是用于羊水，例如，晚期或足月的羊水收集和细胞，例如，来自羊水的胎儿或婴儿的细胞分离、扩增、重组和分化的装置和设备，通过这种方法获得的细胞和成分，以及将所述细胞和成分用于例如治疗和再生医学和个性化医学的方法。

根据本发明的典型实施例，羊水收集装置包括收集室用于接收来自提取管的羊水，所述提取管安装有一个用来插入羊膜囊的进口。所述提取管和进口安装成让所述装置具有足够的灵活度以获得通向羊膜腔所有区域的通道，让所述羊水收集装置具有足够的坚硬度以插入羊膜和绒毛膜，还具有足够的柔韧度从而不具有对母亲和胎儿的产生伤害的明显风险。这样，本发明允许安全的、高产量的无菌羊水收集。

根据本发明的另一个典型实施例，羊水收集装置包括一个进口，所述进口包括一个在远端部分的主进口以及至少一个在所述进口侧面部分的附加进口。用这种方式，本发明避免了可能造成延时的堵塞，由此减少了收集所需时间，并因此降低了对母亲和胎儿造成伤害的风险。此外，本实施例排除了当所述主进口接触到胎儿表面时可能造成的胎儿皮肤擦伤的风险。

还根据本发明的另一个典型实施例，羊水收集装置包括一个进口，其配置来实现提取管和羊膜之间的不透水密封。以这种方式，本发明防止未收集的羊水流出羊膜囊以及污染物进入羊膜囊，由此提高产量并维持羊水的无菌性。此外，所述典型实施例的不透水密封促成了用于输送所述羊水的虹吸，免除了对外部抽吸源的需求，因此进一步降低了羊水污染的风险。

在一个实施例中，本发明提供羊水收集装置，包括：收集室；与收集室连接的收集室出口阀；与收集室连接的收集室进口阀；与收集室进口阀连接的近端液体抽取管，所述近端液体抽取管包含医用级材料；与所述近端液体抽取管连接的远端液体抽取管，所述远端液体抽取管包含输送部分和进口，其中所述进口包括主进口、穿刺头和一个或多个侧面进口。

在一个实施例中，本发明提供分离的胎儿或婴儿细胞，包括选自CD73和CD90组成的组中的标记的表面表达，所述细胞的表面不表达CD105；或者所述细胞表面表达CD34。一方面，在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞表面可以不表达CD105而表达CD34。在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞可以表达转录因子Oct-4。在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞表面可以不表达CD45。在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞可以是粘着的。在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞可以具有成纤维细胞形态。在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞可以是多能的或多潜能的。一方面，在任一前述实施例中，所述分离的胎儿或婴儿细胞能够在连续培养中生长至少50天；或所述细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或所述细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。

在一个实施例中，本发明提供的是成分，包括任一前述实施例或其组合中的胎儿或婴儿细胞。

在一个实施例中，本发明提供的是成分，包括多个胎儿或婴儿细胞，其中至少10％的细胞表面表达CD90，CD73和CD34，而少于5％的细胞表面表达CD105。在一个实施例中，至少50％的细胞表达转录因子Oct-4。在一个实施例中，少于5％的细胞表面表达CD45。在一个实施例中，至少50％的细胞是粘着的。在另一个实施例中，至少50％的细胞具有成纤维细胞形态。在另一个实施例中，至少50％的细胞是多能的或多潜能的。在一个实施例中，至少50％的细胞能够在连续培养中生长至少50天；或多数细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或多数细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。在任一前述成分实施例或其任一组合中，所述成分还包括羊水。在一个实施例中，所述细胞的浓度为每升至少1百万个细胞。

在一个实施例中，本发明提供用于分离胎儿或婴儿细胞的方法，包括：(a)在大于21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,或39周的妊娠时期获取羊水；以及(b)从所述羊水中回收胎儿或婴儿细胞。在一个实施例中，步骤(a)中的获取包括通过剖腹产术收集羊水。在任一前述方法实施例中，步骤(b)中的回收可以包括从羊水中去除微粒物质。在一个实施例中，步骤(b)中的回收还包括进行梯度离心。在任一前述方法实施例或其任一组合中，所述方法还可以包括在使细胞增殖的条件下培养回收的细胞。在任一前述方法实施例或其任一组合中，在每升步骤(a)获得的羊水中，步骤(b)中的回收细胞可以包含至少1百万个细胞。在任一前述方法实施例或其任一组合中，步骤(a)获得的羊水量可以是至少或大约10mL,20mL,30mL,40mL,50mL,60mL,70mL,80mL,90mL,100mL,200mL,300mL,400mL,500mL,600mL,700mL,800mL,900mL,或1000mL。在任一前述方法实施例或其任一组合中，所述羊水可以是足月的羊水。在任一前述方法实施例或其任一组合中，所述胎儿或婴儿细胞可以包括任一前述分离的胎儿或婴儿细胞实施例中的细胞。

在任一前述方法实施例或其任一组合中，所述胎儿或婴儿细胞可以包括表面表达选自CD73和CD90组成的组中的标记的细胞，所述细胞表面不表达CD105或表达CD34。在一个实施例中，所述细胞表面表达CD73和CD90。在一个实施例中，所述细胞表面不表达CD105而表达CD34。在一个实施例中，所述细胞表达转录因子Oct-4。在另一个实施例中，所述细胞表面不表达CD45。在另一个实施例中，所述细胞是粘着的。在一个实施例中，所述细胞具有成纤维细胞形态。在另一个实施例中，所述细胞是多能的或多潜能的。还在另一个实施例中，所述细胞能够在连续培养中生长至少50天；或所述细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或所述细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。

在任一前述方法实施例或其任一组合中，所述方法还可以包括重组所述回收的细胞，由此产生多潜能或多能细胞。在一个实施例中，所述重组包括进行iPSC。在一个实施例中，所述方法还包括将细胞分化为所需要的细胞或组织类型。在进一步的实施例中，所需要的细胞或组织类型选自造血细胞、神经元细胞、内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组。

本发明还提供治疗方法，包括将任一前述成分实施例或其任意组合中的成分用于患者。

在一个实施例中，本发明公开的是库存细胞的方法，包括：(a)获取一个或多个样品，每个样品包含权利要求2-10任一所述的细胞；(b)在保护样品中至少一些细胞的存活力的条件下储存所述样品；以及(c)保存与样品获取对象身份相关的数据。在一个实施例中，所述储存包括使用一种或多种冷冻保护剂处理样品。在一个实施例中，步骤(a)包括获取多个样品，每个样品取自不同对象。

在另一个实施例中，本发明公开的是细胞库，包括：(a)多个样品，每个样品包含权利要求2-10任一所述的细胞或权利要求11-20任一所述的成分；以及(b)包含所述样品的个体身份和回收数据的数据库。在一个实施例中，多个样品中的每个样品来自单个对象。在任一前述细胞库实施例中，所述数据可以包括与单个样品来源对象的身份相关的信息。

还在另一个实施例中，本发明公开的是用于收集羊水的方法，包括：(a)通过受试者子宫壁上的切口插入羊水收集装置；(b)穿刺受试者的羊膜；以及(c)从受试者的羊膜囊中收集羊水，所述受试者是妊娠至少30周的孕妇。在一个实施例中，所述受试者妊娠期满。在另一个实施例中，所述羊水收集装置是任一前述装置实施例或其任意组合中所述的装置。在某些实施例中，步骤(b)还包括穿刺绒毛膜。在一些实施例中，步骤(c)中的所述收集包括一个或多个：(i)通过打开羊水收集装置的进口阀开始虹吸以将羊水输送至羊水收集装置的收集室中；(ii)将羊水收集装置的收集室置于羊水收集装置进口下方；(iii)连接负压源和羊水收集装置的出口来开始羊水输送；以及(iv)重置羊水收集装置的进口来回收基本上所有可用的羊水。在一个实施例中，所述方法还包括步骤(d)移去羊水收集装置。在一些实施例中，所述切口通过羊水收集装置产生。在一些实施例中，所述方法在少于大约10分钟，大约9分钟，大约8分钟，大约7分钟，大约6分钟，大约5分钟，大约4分钟，大约3分钟，大约2分钟或大约1分钟内完成。

附图说明

图1根据本发明的典型实施例描绘了羊水收集装置100。

图2通过FACS分析显示了足月羊水来源细胞的细胞表面标记表达。表明了标记表面表达阳性的细胞在群体中的比例。

图3根据本发明的典型实施例描绘了提取羊水的方法300。

详细说明

在本文提供的具体实施例的下列描述中，结合附图来参考，所述附图作为本文的一部分并通过描绘可以实施本发明的具体实施例的方式呈现。要理解的是，在不超出本发明范围的情况下，可以使用其它实施方式，可以进行结构改变。

在提供的实施例中有装置、设备以及用于收集、分离生物材料的方法，以及生物材料，包括细胞和细胞源，例如从羊水中获得的细胞和细胞源，以及通过所述方法获得的细胞和其它物质的用途，包括治疗和分析用途，例如，用于再生医学(包括个性化供体和通用供体应用)。

多种人类干细胞正被用于治疗或评估用于临床试验中，包括体细胞，例如间质干细胞和造血干细胞，例如，分别用于神经疾病和血液疾病中。其它具有更高分化能力的体细胞可被重组进入更原始阶段，例如内皮细胞重组形成多能干细胞。

诱导的多能干(iPS)细胞已经由多种细胞类型产生，包括皮肤成纤维细胞。Masipetal.,2010,MolHumReprod16(11):856-868；TakahashiandYamanaka,2006,Cell126(4):663-676；Yuetal.,2007,Science318(5858):1917-1920.备选的起始材料的选择基于：便于重组，包括足够的增殖速率、疾病模型的遗传背景、易于获得足够数量的活细胞，以及遗传准确性。Hannaetal.,2009,Nature462(7273):595-601；Parketal.,2008,Cell134(5):877-886；Yeetal.,2009,Blood114(27):5473-5480；Caretteetal.,2010,Blood115(20):4039-4042；Kumano,etal.,2012,Blood119(26):6234-6242；Ikehataetal.,2003,EnvironMolMutagen41(4):280-292；Ikehataetal.,2004,MutatRes556(1-2):11-24；OsanaiandLee,2011,MedMolMorphol44(4):200-206.

可用于产生iPS细胞的方法已经与一些具体问题相关联。例如，大部分iPS细胞由成人皮肤成纤维细胞产生。尽管如此，由于表观遗传记忆，用作iPS细胞产生资源的细胞所剩余的表观遗传状态会影响衍生的iPS细胞的分化能力。具体而言，iPS细胞系能够通过继续表达一组关键的供体细胞基因来维持组织来源的表观遗传记忆。Marchettoetal.,2009,PLoSOne4(9):e7076；Ghoshetal.,2010,PLoSOne5(2):e8975；Bar-Nuretal.,2011,CellStemCell9(1):17-23.表观遗传记忆能够影响许多细胞资源的分化能力，能够使某些分化的细胞(例如神经祖细胞、某些血细胞、成纤维细胞、肌原细胞、胰岛β细胞和其它胰细胞)不适于iPS细胞产生。Kimetal.,2010,Nature467(7313):285-290；Poloetal.,2010,NatBiotechnol28(8):848-855；Bar-Nuretal.,2011,CellStemCell9(1):17-23；Marchettoetal.,2009,PLoSOne4(9):e7076；Ghoshetal.,2010,PLoSOne5(2):e8975.

因此，在某些环境中具有多潜能分化能力的更原始的细胞是更加合适的用于iPS细胞产生的起始材料，其具有广泛的分化能力。

在某些环境中，稚细胞环具有与环境接触最少、包含未损坏基因组，和/或具有在体外培养系统中增殖和/或扩增能力的，适于细胞重组，例如，用于组织、器官和/或干细胞治疗。来自足月的或接近足月的胎儿或新生儿的某些细胞物质将满足这些特征。出生时的细胞资源，例如羊水细胞包含具有这些特征的细胞，但通常被丢弃了。

羊水包含分子成分，包括在整个发育过程中从胎儿和羊膜脱落至羊水中的存活的细胞物质。所述脱落细胞代表了胎儿的发育情况。随着胎儿日益增加的生物表面(例如，肺发育)，预计脱落细胞的数量更多。羊水的翻覆次数多，每24小时高达数次。因此，任何收集的细胞不会在该介质中长时间内处于悬浮状态。细胞内容物被认为主要是胎儿起源。

可以在出生时用于收集所述细胞物质的可用方法还不完全令人满意，例如，关于母亲和孩子的安全隐患。例如，在通过可用方法获得的羊水中，污染物(例如，母血和空气)的存在会破坏无菌性，导致，例如，羊水中分子成分的破坏和结构改变、引入空气传播的致病菌以及干扰羊水中细胞的低氧状态、导致蛋白失活。缺乏效率及长时间的程序会导致母亲或胎儿的伤害。例如，羊膜腔穿刺术，通常在第一个或第二个三个月进行，产生有限数量(通常大约2mL)的羊水并且需要使用插入腹腔进入羊膜腔内的尖锐注射器(例如，通过超声导向)，具有导致婴儿伤害甚至死亡的巨大风险(例如1-10％)。M.Hallmanetal.,IsolationofHumanSurfactantfromAmnioticFluidandaPilotStudyofitsEfficacyinRespiratoryDistressSyndrome,Pediatrics1983,71(4):473-482所描述的方法，使用了标准手术室主动抽吸装置，通过子宫壁上的切口将污染物引入了系统，抽吸装置通过该切口插入羊膜腔内。

胚胎干细胞分离的备选方案，例如成体间充质干细胞(MSCs)的使用以及分化细胞恢复成多能和多潜能细胞(例如，通过多能干细胞(iPSC)的诱导)可以避免政治、道德和伦理问题之类的缺点。这类方法还可以避免与现有羊水收集方法相关的安全隐患。然而，使用成体细胞具有遗传品质降低的风险，例如暴露在紫外线之类的诱变剂中、抽烟、杀虫剂以及微生物，其可引起突变并导致癌症或在组织生成和治疗中的不良行为。

提供解决这些困难的成分、方法以及装置。

在某些实施例中，提供用于羊水，例如，足月或接近足月的羊水收集的设备、装置和方法，例如，用于回收羊水材料中具有医学价值的成分。在一些实施例中，所述收集发生在剖腹产期间。在一些实施例中，这类实施例有利于无菌羊水收集，例如不含母血、空气，和/或其它污染物的以及安全有效的羊水收集，例如，在妊娠晚期例如足月收集。在一些实施例中，这类实施例对羊水成分没有或只有最小程度的破坏，没有伤害母亲或胎儿的重大风险，和/或产生高比例的可用羊水。在一些实施例中，所述设备、装置和方法具有允许在剖腹产中常规使用的性质，例如易于使用并且最小程度地干扰手术过程，例如，通过使用一次性无菌装置、尽可能少地接触环境空气以及最大限度的无菌。因此，在提供了有用于安全、无菌、高产以及成分破坏最小的羊水收集的方法和装置的实施例。

还提供用于收集、分离和扩增通过所述设备、装置和方法获得的物质，包括细胞和细胞部分的方法及其用途，包括医学用途，例如在治疗和再生方法中的应用)。还提供通过使用所述设备、装置和方法从羊水中获得的物质，包括细胞和细胞部分及包含所述物质的成分。

还提供用于扩增、重组和分化所述细胞和细胞部分的方法，以及使用这些细胞和细胞部分的方法，例如，用于细胞和组织生成、再生和个性化医学、疾病治疗以及其它过程的方法。

A.定义

除非另有限定，本文所使用的所有行业术语、符号和其它科学术语或术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了更加清楚和/或以备参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，这种定义所包含的内容不应该必然理解为代表了所述定义与本领域通常理解含义的本质区别。本文所描述的或参考的许多技术和程序是本领域技术人员深刻理解的并且使用常规方法学通常采用的。

本公开自始至终，以范围形式呈现了本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁明了，不应当解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应该理解为已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的个体数值。例如，如1～6的范围描述应该理解为已经具体公开了如1～3，1～4，1～5，2～4，2～6，3～6等的子范围，以及所述范围内的个体数值，例如1，2，3，4，5和6。在另一个实施例中，以“周”为单位的范围描述也包括了所述周端点之间的天数的公开。这适用于所有宽度的范围。

如本文所用，术语“羊水”可以理解为羊膜腔内存在的全部液体和非液体成分，例如其中包含的液体、固体、半固体或细胞组分，无论是否是悬浮的。

如本文所用，术语“羊水收集装置”指本文所述的装置的任一典型实施例。有时被叫做“所述装置”。

如本文所用，术语“剖腹产术”可以理解为任何在孕妇身上进行的包括剖腹手术和子宫切开术的外科手术，无论是否还包括胎儿娩出。

如本文所用，术语“cryo-TEM”指冰冻透射电子显微镜。

如本文所用，术语“安全的”可以理解为对母亲和/或胎儿无重大风险的任何方法或装置。

如本文所用，术语“虹吸”可以理解为两点之间的液体运输，借助液体两个位置之间的压差提供运输动力。

如本文所用，术语“胎儿皮脂”可以理解为在子宫内胎儿皮肤分泌的物质，在羊水中这种物质以半固态的白色块状物或分散的聚集体形式出现。

如本文所用，“足月”描述了至少38孕周的怀孕时期。

如本文所用，“过期”描述了妊娠大于41周的怀孕时期。

如本文所用，“分离的”，当用于描述一个或多个细胞时，指的是已经从它们的天然环境中分离出来的一个或多个细胞，包括从细胞起源的对象例如患者中分离，和/或从天然环境中的一种或多种其它组分例如羊水、碎片、胎儿皮脂、组织、组织聚集体和其它细胞中分离。

如本文所用，“胎儿的”用于描述来自胚胎期之后及出生之前的发育中的哺乳动物(例如人类)的细胞或其它物质的性质。如本文所用，“婴儿的”用于描述来自从出生至1岁龄的新生或幼小的哺乳动物包括早产儿和新生儿的细胞或其它物质的性质。本发明提供的细胞和成分通常分离自孕晚期或足月的羊水，因此通常包括胎儿细胞及早期的婴儿细胞，例如初生的或新生儿细胞，例如，来自不大于一天的婴儿。

如本文所用，“多能的”指的是细胞分化成三个胚层，内胚层、中胚层和外胚层中任一胚层的细胞类型的能力。“多潜能的”指的是细胞分化成大量多元的但细胞系数目有限的细胞的能力。

B.羊水收集装置

本发明提供用于回收羊水的方法和装置。

根据本发明的典型实施例，羊水收集装置包括收集室用于接收来自提取管的羊水，所述提取管安装有进口用来插入羊膜囊。所述提取管和进口安装成允许装置具有足够的灵活度以获得通向羊膜腔所有区域的通道，允许羊水收集装置具有足够的坚硬度以插入羊膜和绒毛膜，还允许有足够的柔韧度从而不具有对母亲和胎儿的产生伤害的显著风险。这样，本发明允许安全的、高产量的无菌羊水收集。

根据本发明的另一个典型实施例，羊水收集装置包括一个进口，所述进口包括一个在进口远端部分的主进口以及至少一个在所述进口侧面部分的附加进口。用这种方式，本发明避免了可能造成延时的堵塞，由此减少了收集所需时间，并因此降低了对母亲和胎儿造成伤害的风险。此外，本实施例排除了当所述主进口接触到胎儿表面时可能造成的胎儿皮肤擦伤的风险。

还根据本发明的另一个典型实施例，羊水收集装置包括进口，用来使提取管和羊膜之间达到基本不透水密封。以这种方式，本发明防止未收集的羊水流出羊膜囊以及污染物进入羊膜囊，由此提高产量并维持羊水的无菌性。此外，所述典型实施例的基本不透水密封便于形成用于输送羊水的虹吸，其避免了对外部抽吸源的需求，因此进一步降低了羊水污染的风险。

图1根据本发明的典型实施例描绘了羊水收集装置100。羊水收集装置100包括收集室110、收集室出口阀120、收集室进口阀130、近端液体抽取管部分140和远端液体抽取管部分150。远端液体抽取管部分150包括输送部分160和进口170。进口170包括主进口171、穿刺头172和一个或多个侧面进口173。

将进口170插入羊膜囊，羊水通过所述液体抽取管，包括近端液体抽取管部分140和远端液体抽取管部分150从羊膜囊运输至收集室110中。近端液体抽取管部分140可以包括所需长度的医用级导管。当程序完成时，可以关闭收集室进口阀130并移去液体抽取管140和150。可以开启收集室出口阀120，从收集室110中排出收集的羊水。

远端液体抽取管部分150配置来插入羊膜囊。在一个实施例中，安装远端液体抽取管部分150，使其在插入羊膜囊时与羊膜囊达到基本不透水密封。这种基本不透水密封提供了许多突出的功能优势。首先，这种基本不透水密封维持了羊膜囊内部和外部之间的压差。这种压差允许羊水稍微高一些的环境压力从而启动羊水从羊膜囊至收集室110的虹吸。在一个实施例中，收集室110位于进口170的下方，通过重力促进运输，直到基本上所有的羊水材料被收集。任选地，可以将负压泵加在收集室出口阀120来开始虹吸。

所述基本不透水密封的第二个典型优势是防止污染物进入羊膜囊。

第三个优势是虹吸不需要真空泵，可以加快羊水的恢复使用。

第四个优势是所述密封防止未收集的羊水流出羊膜囊，由此提高产量并改善胎儿分娩的清晰度和身体通道。

在一个实施例中，选择远端液体抽取部分150的材料，从而产生远端液体抽取部分150与一层或多层羊膜囊膜之间的基本不透水密封。在某些实施例中，采用聚氯乙烯(“PVC”)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚亚安酯或聚碳酸丙烯，或其任意合适的组合来生产远端液体抽取部分150。在一些实施例中，为满足所需硬度，可以加入软化剂。在没有任何理论束缚时，可以使用任何合适的可模压的聚合物塑料来生产远端液体抽取部分150。在其它的实施例中，使用尼龙、硅酮和聚丙烯。在没有任何理论束缚时，可以将任何合适的材料用于远端液体抽取部分150的穿刺端，只要它的强度足以穿刺羊膜囊，并且柔韧度足以使其不具有伤害胎儿的重大风险。切角和材料性质决定了远端液体抽取部分150的功能。在一些实施例中，所述切角在大约0度至大约90度之间。在优选的实施例中，所述切角在大约25度至大约75度之间。在某些实施例中，根据导管材料，可以采用凹面或凸面形状的角。在进一步的实施例中，在导管外面加上软材料的环以促进形成基本不透水密封。

在一个实施例中，远端液体抽取部分150和近端液体抽取设备140的尺寸足够大，以达到快速液体抽取，但不会大到阻止虹吸开始。通常使用简写为Fr的法兰西标度或法国测量系统来测量导管的大小。1F的导管直径为1/3mm，因此圆形导管的毫米单位的直径可以通过除所述法兰西尺寸3:D(mm)＝Fr/3的公式来确定。在一些实施例中，在临床环境中使用大约13至大约34(外径大约4.3mm至大约11.3mm)范围内的法国测量导液管。内径取决于所使用的材料。在没有任何理论束缚的情况下，可以使用任何适合保持材料的硬度和灵敏性的内径。

在一个实施例中，选择远端液体抽取部分150的材料以提供足够的柔韧性，使用户能够在收集过程中、在液体排出的时候操纵进口170进入胎儿周围的液体袋。这样，进一步提高了羊水的产量。在某些实施例中，采用聚氯乙烯(“PVC”)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚亚安酯或聚碳酸丙烯，或其任意合适的组合来生产远端液体抽取部分150。在一些实施例中，为满足所需硬度，可以加入软化剂。在没有任何理论束缚时，可以使用任何合适的可模压的聚合物塑料来生产远端液体抽取部分150。在其它的实施例中，使用尼龙、硅酮和聚丙烯。

在一个实施例中，进口170既作为切割工具，又作为收集系统进口。在一个实施例中，进口170配置成允许穿刺羊膜囊，同时将胎儿伤害降至最低。在一个实施例中，类似于远端液体抽取部分150，选择进口170的尺寸和材料，使远端液体抽取部分150的强度足以穿刺羊膜囊，并且柔韧度足以使其不具有伤害胎儿的重大风险。在一个实施例中，穿刺头171呈大约0度至大约90度的角。在优选的实施例中，穿刺头171呈大约25度至大约75度的角。在某些实施例中，根据导管材料，可以采用凹面或凸面形状的角。在一些实施例中，穿刺头171呈大约25度、大约30度、大约35度、大约40度、大约45度、大约50度、大约55度、大约60度、大约65度、大约70度、大约75度的角。在一个实施例中，穿刺头171呈小于25度的角。在另一个实施例中，穿刺头171呈大于75度的角。在一个实施例中，穿刺头171呈45度的角。在一些实施例中，进口170由聚氯乙烯(“PVC”)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚亚安酯或聚碳酸丙烯，或其任意合适的组合制成。在一些实施例中，为满足所需硬度，可以加入软化剂。在没有任何理论束缚时，可以使用任何合适的可模压的聚合物塑料来生产进口170。在其它的实施例中，使用尼龙、硅酮和聚丙烯。在一个实施例中，进口170的内径是10mm。在一个实施例中，进口170的内径是大约10mm。在某些实施例中，进口170的内径是大约8.0mm、大约8.1mm、大约8.2mm、大约8.3mm、大约8.4mm、大约8.5mm、大约8.6mm、大约8.7mm、大约8.8mm、大约8.9mm、大约9.0mm、大约9.1mm、大约9.2mm、大约9.3mm、大约9.4mm、大约9.5mm、大约9.6mm、大约9.7mm、大约9.8mm，或大约9.9mm。在某些实施例中，进口170的内径是大约10.1mm、大约10.2mm、大约10.3mm、大约10.4mm、大约10.5mm、大约10.6mm、大约10.7mm、大约10.8mm、大约10.9mm、大约11.0mm、大约11.1mm、大约11.2mm、大约11.3mm、大约11.4mm、大约11.5mm、大约11.6mm、大约11.7mm、大约11.8mm、大约11.9mm，或大约12.0mm。在一个实施例中，进口170的外径是12.5mm。在一个实施例中，进口170的外径是大约12.5mm。在某些实施例中，进口170的外径是大约10.5mm、大约10.6mm、大约10.7mm、大约10.8mm、大约10.9mm、大约11.0mm、大约11.1mm、大约11.2mm、大约11.3mm、大约11.4mm、大约11.5mm、大约11.6mm、大约11.7mm、大约11.8mm、大约11.9mm、大约12.0mm、大约12.1mm、大约12.2mm、大约12.3mm，或大约12.4mm。在某些实施例中，进口170的外径是大约12.6mm、大约12.7mm、大约12.8mm、大约12.9mm、大约13.0mm、大约13.1mm、大约13.2mm、大约13.3mm、大约13.4mm、大约13.5mm、大约13.6mm、大约13.7mm、大约13.8mm、大约13.9mm、大约14.0mm、大约14.1mm、大约14.2mm、大约14.3mm、大约14.4mm，或大约14.5mm。

通过在分娩后丢弃的羊膜上做试验，结合在角质化程度低的人类皮肤区域即：对穿刺或组织损伤敏感性高的区域做试验来模拟对胎儿的影响，凭经验已经确定了多种塑料和尺寸。

在一些实施例中，进口170包括一个或多个侧面进口173。提供侧面进口173是为了防止当主进口与羊膜腔内的任何表面例如羊膜、绒毛膜或胎儿接触时可能发生的堵塞。此外，如果主进口171贴在羊膜、绒毛膜或外部胎儿表面，侧面进口173提供压力释放系统。在没有这种压力释放系统的情况下使用羊水收集装置可能需要中止抽吸系统或物理操控设备离开胎儿，每种情况都可能导致中断收集和高风险的胎儿伤害，例如长时间的皮肤擦伤。在本实施例的一方面，应该标定进口170的大小以确保附加进口173在羊水收集装置100操作期间始终浸没在羊膜囊中；在这方面，如果所有的附加进口173没有浸没，那么空气将被引入所述装置，破坏液体流动并污染产物。在一个实施例中，进口170长大约1.5cm至大约15.0cm。在一个实施例中，进口170的长小于10cm。在一些实施例中，进口170大约1.5cm、大约2.0cm、大约2.5cm、大约3.0cm、大约3.5cm、大约4.0cm、大约4.5cm、大约5.0cm、大约5.5cm、大约6.0cm、大约7.5cm、大约8.0cm、大约8.5cm、大约9.0cm、大约9.5cm、大约10.0cm、大约10.5cm、大约11.0cm、大约11.5cm、大约12.0cm、大约12.5cm、大约13.0cm、大约13.5cm、大约14.0cm、大约14.5cm，或大约15.0cm。在一些实施例中，进口170的长大于15.0cm。

本文所述的羊水收集装置100配置成最大限度地降低收集的羊水的污染。在一个实施例中，通过使用惰性的或医学相关的气体例如，但不限于，举几个来说，氮气、氙，或一氧化氮预填充所述装置来实现污染的进一步降低。像这样，在一个实施例中，所述装置的尖头可以配置可拆卸封条(未显示)，所述封条盖住尖头的进口洞孔，在装置刚要插入前拆掉。

在一些实施例中，选择主进口171的尺寸以避免羊水收集装置100中的胎儿皮脂、血块或其它物质造成的堵塞。在依赖外部抽吸的羊水收集装置中，可以提高抽吸压力来克服堵塞，这会增加空气或其它污染物被引入系统的风险。在本发明的一个实施例中，可以通过配置进口170使主进口171的内径不宽于近端液体抽取管部分140和/或远端液体抽取管部分150的内径来防止堵塞。此外，在其它实施例中，位于进口170周围的附加进口173的最大直径可以窄于进口170的内径。

虽然，为了解释的目的，上述典型实施例的许多结构和功能参考单个装置进行描述，但是，应该容易理解的是，在不脱离本发明范围的情况下，这些结构和功能的任何一个可以被单独使用或以任何组合使用。

上述羊水收集装置可以预包装成无菌的、随时可用的配置。此外，可以使用外部可拆卸罩密封所述进口，由此保持无菌并将医学相关气体(如果使用的话)控制在管内直到尖头完全插入羊膜腔内。在一些实施例中，所述可拆卸罩配置来行使进口170的一种或多种功能，例如，包含穿刺头并具有足够的硬度来穿刺羊膜囊。

C.羊水收集以及细胞的分离、培养、重组和分化

本发明提供用于收集羊水并从羊水中分离细胞的方法。在一些实施例中，通过收集羊水例如，使用本发明所述装置来进行所述方法。在其它实施例中，所述方法包括从羊水中获得胎儿和/或婴儿的细胞，例如，与羊水拓扑连接的胎儿上皮表面脱落的细胞。

怀孕晚期或足月的羊水收集

通常，在怀孕晚期或足月时收集羊水，例如，在大于第二个三个月或大于21孕周的时期，例如至少22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,或41孕周、在第三个三个月期间，或足月时(至少38孕周)，或妊娠过期(大于41孕周)时。在一个实施例中，在剖腹产过程中分离羊水，例如，足月剖腹产，例如，由于不复杂的原因而进行的剖腹产，例如，由于臀位、前次剖腹产或害怕阴道分娩。

与怀孕早期例如在第一个或第二个三个月的羊水收集例如，通过羊膜腔穿刺术相比，从足月或晚期羊水中获得细胞可以最大限度地降低胎儿和母亲的危险。此外，羊水数量和可用细胞数量朝着足月妊娠日益增加。在足月或接近足月时收集羊水能够获得高产量。在一个实施例中，从单个患者身上获得的羊水体积是至少或大约10mL,20mL,30mL,40mL,50mL,60mL,70mL,80mL,90mL,100mL,200mL,300mL,400mL,500mL,600mL,700mL,800mL,900mL,1000mL,1500mL,或2000mL。来自晚期或足月羊水而不是生命后期的细胞分离还能够降低暴露于诱变剂中和损伤的风险，并产生具有原始或更原始状态的基因组的细胞。

此外，从晚期或足月羊水中获得的细胞具有不同的性质。例如，脱落至羊水介质中的细胞的细胞成分、基因表达谱以及分化状态随着怀孕过程，即，随着胎儿年龄而改变。母体的激素表达也随着妊娠时期而变化。例如，肺表面活性剂的产生开始于妊娠30周左右，刚要足月前达到最大量。由于激素小到足以通过胎盘，母体激素的改变反映在胎体循环中并因此可能影响发育中的胎儿细胞的信号传导和表观遗传谱。例如，在足月分娩前的最后一周内母体皮质醇的激增诱导了胎儿II型肺细胞的成熟，促进了吸气所需的肺表面活性剂的产生。在个体的一生中始终维持着II型肺细胞的成熟。因此，胎儿细胞的表观遗传改变与妊娠时期相关。因此，怀孕晚期，例如，足月，的环境将独特的性质传递给胎儿细胞，包括成熟状态、细胞功能以及转录谱。

在妊娠期间，羊水每2天进行置换/再生。这确保了羊水中存在的细胞成分大多是存活的并具有与胎龄相关的性质。因此，与更早时间点获得的细胞物质相比，在足月分娩时获得的细胞物质是独一无二的。大约200-400mL的羊水由肺分泌，其余的羊水来自尿液、细胞内和细胞外间隙，在羊水中可能存在许多细胞类型。并且，在第三个三个月，吞咽和肾功能的提高也会影响细胞成分和生长能力，因为羊水的渗透压有显著的降低。ModenaandFieni,2004,ActaBiomed75Suppl1:11-13。

羊水收集

图3是本发明典型实施例所述的羊水收集方法300的方框图。应该理解的是，方法300可以包括任何数量的附加或备选任务。图3显示的任务不必按照所述顺序进行，并且方法300可以包含在更复杂的具有本文没有阐述的其它功能的程序或过程中。使用图1和2所述的实施例可以实现方法300，为了解释的目的，方法300的下列描述可以参考与上述图1和图2相连的元件。

如图3所示，方法300包括在孕妇的子宫壁上制作切口301，例如，在剖腹产过程中。步骤301可以采用标准的医生的手术刀进行。还如图3所示，方法300包括通过步骤301中制作的子宫壁切口插入羊水收集装置302。步骤302中使用的羊水收集装置可以包括与图1和图2相关的上述实施例。方法300还包括使用步骤302的羊水收集装置穿刺羊膜303。步骤303还可以包括穿刺绒毛膜。在一个实施例中，所述尖头插入10cm深。在一些实施例中，所述尖头插入深度为大约3cm至大约30cm。在一些实施例中，所述尖头插入深度为大约4cm、大约5cm、大约6cm、大约7cm、大约8cm、大约9cm、大约10cm、大约11cm、大约12cm、大约13cm、大约14cm、大约15cm、大约16cm、大约17cm、大约18cm、大约19cm、大约20cm、大约21cm、大约22cm、大约23cm、大约24cm、大约25cm、大约26cm、大约27cm、大约28cm，或大约29cm。

方法300还包括使用步骤302的羊水收集装置从羊膜囊收集羊水304。步骤304可以包括启动虹吸将羊水运输至羊水收集装置的收集室，例如通过打开羊水收集装置的进口阀。步骤304还可以包括将羊水收集装置的收集室置于羊水收集装置的进口下方。步骤304还可以包括连接负压源和羊水收集装置的出口来开始羊水输送。步骤304可以包括重置羊水收集装置的进口来回收基本上所有可用的羊水。

最后，方法300包括从羊膜囊移去羊水收集装置905。步骤905可以包括关闭羊水收集装置的进口阀。在一个实施例中，在收集的材料中见不到血。步骤905还可以包括为继续使用而排空收集系统/对整个装置的表面进行处理和灭菌。在一个实施例中，所述表面采用70％乙醇灭菌，以便在任何后续进行的步骤中保持无菌，例如，在层流空气流动台设置中，例如，用于本发明所述细胞物质的分离以及用于液体储存。

在一个实施例中，所述羊水收集程序在1分钟之内完成。在一个实施例中，所述羊水收集程序在1至2分钟内完成。在一个实施例中，所述羊水收集程序在不超过3分钟内完成。在一个实施例中，与标准的剖腹产手术程序相比，所述方法得到简化，例如，通过防止羊水泄漏到手术伤口中，改善能见度和身体通道。在一个实施例中，胎儿的皮肤不受装置尖头的影响。

来自羊水的细胞的分离、培养、继代培养、重组和分化

本发明还提供用于羊水，例如晚期或足月羊水，例如，采用本发明提供的方法和装置收集到的细胞的分离的方法。在一个实施例中，表面灭菌后，将装置转移至层流空气流动台，将收集室的出口打开来移出羊水。可以保留部分羊水作为参照。

在一个实施例中，过滤羊水以除去碎片，例如分离胎儿皮脂和大的组织碎片聚集物。已知许多合适的过滤方法可以用于本实施例中。在一个实施例中，羊水通过100微米的尼龙网过滤。过滤后分离细胞，例如通过离心，例如差速离心，例如使用梯度，例如密度梯度，例如蔗糖梯度或Ficoll蔗糖梯度。在一个实施例中，使用Ficoll400蔗糖梯度在室温下、500g离心5分钟。梯度离心后，可以收集细胞层，例如，使用移液管。

可以通过细胞计数来确定产量。在一个实施例中，所述程序产出至少或大约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％的存活细胞。在优选的实施例中，所述程序产出至少或大约50％的存活细胞。在一个实施例中，在每升收集的羊水中，所述方法产出至少或大约100,200,300,400,500,600,700,800,900,或1000万存活的细胞。

在一些实施例中，培养分离的细胞，例如，用于扩增细胞。在一个实施例中，将细胞转移至培养容器中，例如，含有适于所需细胞类型的生长培养基的烧瓶。典型的培养基是补充了胎牛血清(FCS)的DMEM、成纤维细胞/间充质干细胞生长培养基、内皮细胞生长培养基(ECM)以及小气道上皮生长培养基(SAGM)。在一个实施例中，使用成纤维细胞生长培养基。在一个实施例中，使用间充质干细胞生长培养基。在一个实施例中，使用内皮细胞生长培养基。在一个实施例中，使用小气道上皮生长培养基。在没有任何理论束缚的情况下，在某些实施例中可以使用其它的细胞培养基。在一个实施例中，在培养基中培养分离的细胞至少或大约1周、2周、3周、4周或5周。在某些实施例中，在培养基中培养分离的细胞至少或大约11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30天。可以使用流式细胞计数法、显微镜或其它已知的程序来评估培养细胞的行为和表型。

在一个实施例中，细胞得到增殖，例如，在继代培养中。在一个实施例中，细胞增殖至少或大约10,20,30,40,50,60,或70天，或30次群体倍增，或直到细胞扩增至少10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000倍，或1百万、2百万，或3百万倍，或直到细胞到达衰老期或细胞刚要到达衰老期之前。

在一个实施例中，通过在低氧条件下继代培养来维持Oct-4的高表达，相当于子宫内低氧张力。

本发明还提供的是用于重组和分化细胞的方法，例如，产生所需细胞或组织类型，例如用于再生治疗应用。在某些实施例中，细胞被重组至分化程度更低的时期，例如多能或多潜能时期。重组方法，例如多能干细胞的诱导(iPSC)是众所周知的，可以用来还原细胞的分化，从而产生多能或多潜能细胞。在TakahashiandYamanaka,2006,Cell126(4):663-676,andinYuetal.,2007,Science318(5858):1917-1920中描述了典型的方法。

在一些实施例中，将细胞例如多能或多潜能细胞分化成所需要的细胞或组织类型。在一个实施例中，在用于产生所需细胞类型或组织类型，例如，内胚层、外胚层或中胚层衍生的组织，例如肝细胞或组织、内分泌组织、肺细胞或组织、血细胞、骨髓细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、心脏细胞或组织，例如心肌细胞、视觉细胞或组织、神经细胞或组织、脑细胞或组织、肌肉细胞或组织、皮肤细胞或组织、胰细胞或组织，例如β-细胞、成脂细胞、骨软骨原细胞、骨原细胞及神经细胞的条件下培养细胞。在某些实施例中，所述细胞在其它细胞类型中分化成神经元、肝细胞、胰岛细胞、肾细胞和造血细胞。在一些实施例中，所述细胞分化为代表所有三个胚层的细胞类型。在一些实施例中，所述细胞在重组后保留着跨胚层的高效分化能力。一方面，所述细胞与人类胚胎干细胞或细胞系相比具有更高的造血能力。一个所述人类胚胎干细胞系为H9。另一方面，所述细胞具有将近100％的神经元细胞分化能力。在一些实施例中，所述细胞分化为成骨细胞或脂肪细胞。

分化方法是众所周知的。许多已知方法中的任何一个可以结合本实施例使用，例如，颁发给Haas的美国专利号7,596,385、美国专利公布号US2005/0054093和US2005/0042595，以及颁发给Atala等人的美国专利公布号US2005/0124003和国际专利申请号WO03/042405中所述的方法，以及“Teratocarcinomasandembryonicstemcells:Apracticalapproach,”E.J.Robertson,ed.,IRLPressLtd.1987；“GuidetoTechniquesinMouseDevelopment,”P.M.Wassermanetal.eds.,AcademicPress1993；“EmbryonicStemCellDifferentiationinvitro,M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993；“PropertiesandusesofEmbryonicStemCellsProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy,”P.D.Rathjenetal.,Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998；和“Stemcellbiology,”L.M.Reid,Curr.OpinionCellBiol.2:121,1990.中所述的方法。

分化诱导剂、熟化剂和熟化因子用于特定细胞类型的分化也是众所周知的，例如颁发给Rambhatla等人的美国专利号6,506,574中所述的试剂，例如，正丁酸用于分化为肝细胞，以及其它的熟化剂、熟化因子、生长因子、肽类激素、细胞活素、配体受体复合物、皮质类固醇、视黄酸和有机溶剂，例如DMSO、伴随cAMP增强剂的糖皮质激素、甲基异丁基黄嘌呤和消炎痛。分化剂的选择将取决于所需细胞或组织类型。

虽然上面已经描述了本发明的多个实施例，但是应该理解的是它们仅仅是以实例的方式呈现出来，而非限制的方式。同样地，各种图表可以描绘实例结构或本公开的其它构造，这是为了帮助理解可包含在本公开内的特征和功能。本公开不限于图表所示的实例结构或构造，而是可以使用各种替代结构和构造来实现。另外，虽然以上根据各种典型的实施例和实施方式描述了本公开，但应该理解的是，在一个或多个单独的实施例中描述的各种特征和功能的适用性不限于描述它们的特定实施例。相反地，它们可被单独或以某种组合的方式应用于一个或多个本公开的其它实施例中，无论这样的实施例是否被描述过，并且无论这些特征是否作为描述的实施例的组成部分而存在。因此，本公开的宽度和范围不应该受到任何上述典型实施例的限制。

D.来自羊水的胎儿细胞和婴儿细胞

本发明还提供分离自羊水的细胞，例如胎儿细胞和婴儿细胞。通常，细胞大量存在。在一个实施例中，细胞能够进行培养、在细胞培养中扩增、重组、分化和/或克隆筛选。在另一个实施例中，细胞是粘着的。在另一个实施例中，细胞包含完整基因组，例如，比来自成人来源的细胞具有更少的突变，例如间充质干细胞。

在一个实施例中，所述细胞表达非常少或水平非常低的造血标记或不表达造血标记，例如CD45。在另一个实施例中，所述细胞表面表达前体标记，例如CD90和CD34。在另一个实施例中，所述细胞表面表达CD73。在一些实施例中，群体中大约99％的细胞表面表达CD90，群体中大约0％的细胞表面表达CD45，群体中大约98％的细胞表面表达CD73，群体中大约14％的细胞表面表达CD34。在一些实施例中，群体中至少或大约15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的细胞表面表达CD90、CD34和/或CD73。在另一个实施例中，所述细胞表面不表达CD105或表达较低水平的CD105。在一个实施例中，群体中只有非常小的比例例如少于或少于大约10,5,4,3,2,1,0.5％或更少的细胞表面表达CD105和/或CD45或其它造血标记。

在一个实施例中，细胞表现出成纤维细胞样形态和生长特征，例如，在使用光学显微镜观察时，具有类似于成纤维细胞的形状、大小和粘附性质。在另一个实施例中，细胞起源于上皮间质。

在一个实施例中，细胞具有高增殖能力，例如在连续培养中生长至少10,20,30,40,50,60,70或更多天的能力，在培养中增殖至少30次群体倍增的能力，在培养中扩增至少10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000倍，或1百万、2百万或3百万倍的能力。在一些实施例中，细胞终有一死，即，不能在培养中无限存活。在一些实施例中，细胞是多潜能的或多能的，或能够重组为多潜能或多能的细胞类型。

E.细胞的用途

本发明提供的细胞在多种治疗和其它的应用中有用，例如治疗方法、治疗、疾病预防、新药研发、个性化医学、再生医学、组织和细胞产生，以及万能血库。所述细胞适用于组织工程目的、移植、体内或体外的治疗分子形成、在个性化医学应用中以及通用供体库中。因此，本发明还提供在所述治疗方法和其它方法中使用本发明提供的细胞和成分的方法。

在一些实施例中，本发明提供的羊水和/或细胞是冻存的，例如，保存在含有介质或缓冲液和冷冻保护剂的冷冻保护溶液中，例如，用于储存在低温生物样品库中。在一些实施例中，对细胞进行储存前和储存后处理。

可以使用标准技术冻存细胞。用于冻存的介质的例子有Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、199培养液(M199)、F-12培养基和RPMI培养基。缓冲液的例子是磷酸盐缓冲液(PBS)。冷冻保护剂的例子是二甲亚砜(DMSO)和甘油。冷冻保护溶液的例子是：DMEM/甘油(1:1),DMEM/7.5％DMSO,M199/7.5％DMSO,以及PBS/3.5MDMSO。任选地，在冻存前可以使用青霉素或链霉素之类的抗生素处理样品。可以使用快速的、瞬间冷冻方法或通过更传统的可控速冷冻方法来完成冻存。羊膜组织的快速冷冻可以通过将样品置于含有冷冻保护溶液的冷冻管中，然后快速将冷冻管浸没在液氮中来完成。一般的慢速冷冻可以通过将样品置于含有冷冻保护溶液的冷冻管中，然后将冷冻管置于-70℃冰箱中来完成。或者，使用标准的程序降温仪对样品进行可控速冷冻。细胞产物可以用于重建治疗，无论是体内的还是体外的，从而产生生长因子、细胞活素以及其它的生物反映调节剂之类的因子。

在一些实施例中，所述细胞被用于基因修饰方法中，例如在转染程序中利用熟知的基因修饰技术引入感兴趣的基因，例如，引入改善细胞存活力或使细胞永生的基因，例如通过TERT(端粒酶反转录酶)基因的引入。

这里提供的细胞、成分和组织例如分化的细胞有利于疾病的治疗，例如，但不限于，不育症、肝硬化、胰腺炎、糖尿病、帕金森氏症、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、癌症，例如白血病例如急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性混合型白血病以及急性未分化性白血病；慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、幼年型慢性粒细胞白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、淋巴瘤例如非何杰金淋巴瘤、何杰金病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、乳癌、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、肾细胞癌、遗传性血液病、脑失调例如阿尔茨海默氏病、难治性贫血、难治性贫血伴环状铁幼粒红细胞、难治性贫血伴原始细胞增多、难治性贫血伴原始细胞增多转化型、再生障碍性贫血、范科尼贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、纯红细胞再生障碍、急性型骨髓纤维化、特发性骨髓外化生、骨髓纤维变性、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、白细胞异常色素减退综合征、慢性肉芽肿性疾病、中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、网状组织发育不全、黏多醣贮积症、赫尔勒综合征、黏多糖贮积症IS型、Hunter综合征、黏多糖贮积症Ⅲ型、黏多糖贮积症Ⅳ型、黏多糖贮积症Ⅵ型、黏多糖贮积症Ⅶ型、β-葡糖醛酸酶缺乏、脑白质肾上腺素萎缩症、粘脂沉积症Ⅱ、克拉伯病、高歇病、尼曼-皮克病、酸性脂酶缺乏症、异染性脑白质病变、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多症、组织细胞增生症X、噬红细胞作用、遗传性红细胞异常、乙型地中海型贫血、镰刀形红细胞贫血病、遗传性免疫系统疾病、共济失调毛细血管扩张、婴儿型遗传性粒细胞缺乏症、白细胞粘附缺陷、迪格奥尔格综合征、少淋巴细胞综合征、Omenn综合征、重症联合免疫缺陷、常见变异型免疫缺陷病、威斯科特-奥尔德里奇综合征、X连锁淋巴增生性障碍、其它遗传性疾病、HGPRT缺损、软骨毛发发育不良、血小板无力症、骨胳石化症、遗传性血小板异常、无巨核细胞、先天性血小板减少症、浆细胞病以及特发性巨球蛋白血。

在某些实施例中，所述细胞用于自体同源的/异源的组织再生/代替治疗，包括角膜上皮缺损、软骨修复、面部磨削术、烧伤的治疗和皮肤外伤、黏膜、鼓膜、肠道内膜和神经结构的伤口修复。例如，心肌性能的增强可以通过将细胞移植入损坏的心肌内实现(细胞心肌成形术(CCM))，从而增强心肌性能并治疗末期心脏病。所述细胞还可以用于修复许多中枢神经系统紊乱(CNS)，例如，Caoetal.,2002,“Stemcellrepairofcentralnervoussysteminjury,”JNeuroscienceRes68:501-510.中所描述的。所述细胞还可以用于损伤组织的重建治疗，通过手术植入用于组织再生为此产生分化的细胞的细胞层、解聚的细胞，以及包埋在载体中的细胞。所述细胞还可以用于组织工程构建。这样的构建包含形成适合细胞生长的骨架的生物相容性聚合物。所述骨架可以塑造成加热阀、容器(管状的)、平面结构或任何其它合适的形状。这样的构建众所周知，例如WO02/035992，和美国专利号6,479,064,6,461,628中描述的那些。

要意识到的是，为了清楚的目的，以上表述已经描述了本发明关于细胞收集装置的不同功能单元和/或组件的实施例。然而，显而易见的是不同功能单元、组件或模块之间的任何合适的功能分配可以在不损坏本发明的情况下使用。例如，由不同组件完成的功能可以由同一组件完成。因此，具体功能单元的参考仅仅被视为提供所述功能的合适方法的参考，而不是严格的逻辑或物理结构或组织的指示。

本文使用的术语和短语，以及它们的变形，除非另有明文规定，应该被理解为开放式结束，而非限制。例如前面所述的：术语“包括”应该被理解为“包括，而非限制”等等；术语“例子”用于提供讨论项目的典型实例，并非其详尽的或限制性的列表。以及诸如“常规的”、“传统的”、“通常的”、“标准的”、“已知的”和具有相似含义的术语之类的形容词，不应该被理解为将所述项目限制为指定期间或可作为指定时间的项目。但是这些术语应该被理解为包含常规的、传统的、通常的或标准的现在或将来任何时间已知的可用技术。同样的，用连词“和”连接的项目组不应该被理解为要求这些项目中的每个和每一个都存在于分组中，而应该被理解为“和/或”，除非另有明文规定。类似地，用连词“或”连接的项目组不应该被理解为要求所述组内的相互排他性，而应该被理解为“和/或”，除非另有明文规定。此外，虽然本公开的项目、元件或成分可能以单数形式表述或要求，但是复数形式也考虑在其范围之内，除非明确表述限制为单数形式。例如，“一种”装置包括一种或多种装置。在某些情况下出现诸如“一个或多个”、“至少”、“但不限于”或其它类似短语的扩展词语和短语，不应该被理解为在这些扩展短语可能不出现的情况下意指或要求范围更窄的情况。

实施例

下述实施例旨在进一步描述和解释本发明的各个方面，但不以任何方式、模型或形式明确地或暗示地限制本发明的范围。

实施例1：羊水细胞的分离

在知情同意后，从由于不复杂的原因(臀位、前次剖腹产或害怕阴道分娩)而进行足月剖腹产的健康孕妇体内收集羊水。使用外科手术刀切开子宫壁之后，立即将本发明所述装置的尖头通过胎膜插入大约10cm深，收集羊水。在这个实施例中，总产量大约为1200ml。关闭通向收集袋的进口/软管并移开装置。材料/羊水中没有可见的血，所述材料/羊水为混浊液体，具有白色/黄色的颜色。收集过程耗时不到1分钟。装置的尖头没有被胎儿皮脂堵塞。此外，手术人员发现，与标准的剖腹产手术过程相比，此次手术过程简单了，因为羊水(多至1.5升)没有泄漏到手术伤口中，使可见性和身体通道改善。此外，胎儿皮肤没有受到装置尖头的影响。

将含有收集材料的装置放入冷箱中并立即转移至细胞培养室内，用70％的乙醇对装置进行表面灭菌。在层流空气流动台上，打开收集室的出口，320ml的羊水被用于分离羊水细胞物质，其余的部分被用于化学分析以及储存作为参照。通过100微米的尼龙网过滤羊水，从而分离胎儿皮脂和大的组织碎片聚集物。然后将过滤后的材料放在Ficoll400蔗糖梯度上并于室温下、500g离心5分钟。用移液管收集蔗糖和水之间的混浊的细胞层部分。将所述细胞层部分的一小滴置于Bürker室上(用于细胞计数)并在光学显微镜下镜检。加入台盼蓝评估细胞存活力，在计数具有完整外部形态的有核细胞时，收集程序之后2小时的存活细胞的典型百分比是70％。从400ml中回收的存活细胞总数确定为2百万个细胞，即每升5百万个细胞。将梯度离心的细胞物质转移至含有将要扩增的所需细胞类型的特定的生长培养基的25cm²的细胞Falcon培养瓶中。发现细胞在细胞培养过程中成倍增加。在新收集的细胞部分上进行的FACS表明没有造血类型细胞的迹象，但发现了大量的上皮和间质来源的细胞。

实施例2：保留了初始构象状态的羊水表面活性剂部分的分离

在知情同意后，从由于不复杂的原因(臀位、前次剖腹产或害怕阴道分娩)而进行足月剖腹产的健康孕妇体内收集羊水。切开子宫壁之后，立即将本发明所述装置的尖头通过胎膜插入大约10cm深，收集羊水。在这个实施例中，总产量为450ml。关闭通向收集袋的进口/软管并移开装置。在材料/羊水中无可见的血，所述材料/羊水为混浊液体，具有白色/黄色的颜色。收集材料的过程的各方面同实施例1。

羊水样品储存在所述装置的收集室内并置于4℃冰箱内，直到进行处理。

通过下列步骤产生羊水部分：

1、使用Sigma3-18K于10℃、500g离心5分钟，用于除去细胞和细胞碎片。

2、回收不含有细胞和细胞碎片的羊水上清液。并使用塑料移液管(例如Finnpipette250微升通用吸头)通过移液除去游离的皮脂脂肪聚集物(源自胎儿皮肤)。

3、使用Sigma3-18K在10℃、15000g对步骤2获得的上清液超速离心10分钟。

4、除去步骤3的上清液。

5、收集步骤3产生的表面活性剂沉淀(小量的羊水还包含在所述沉淀中，防止沉淀干燥)。

6、将步骤5收集的粘性沉淀物质置于Sigma微量离心机中，于10℃、19000g再一次离心1分钟。

7、然后将表面活性剂表面相沉淀与小量多余的防止干燥的羊水一起储存在Eppendorf1.5ml管中。

8、如果步骤7中的表面活性剂沉淀变得太粘稠，可选择地使用所需用量的步骤3中的上清液进行重悬。

9、将获得的表面活性剂部分分成两等份，每份200微升。一份作为对照，另一份进行空气照射，将医用级空气(隆德大学儿童医院中心医用空气供应)以每分钟0.75升的速度吹过所述材料5分钟。

对照的和空气照射的表面活性剂通过冷冻透射电镜(cryo-TEM)分析，一种无伪影方法很适合研究肺表面活性剂。用移液管将微量的(5μl)实施例2制备的肺表面活性剂材料的样品铺在碳冷冻格上，然后立即放入液态乙烷(–180℃)中使其玻璃化。所述样品在37℃、100％湿度条件下进行玻璃化。在配有La2B6灯丝的PhilipsBio-twin120冷冻电镜下观察样品。所述冷冻透射电镜样品一直保持在-180℃以下。采用配有适用于Macintosh电脑的DigitalMicrograph3.31软件的GatanCCD采集图像。所述空气照射的材料在脂双层压缩结构中显示出明显的结构变化，似乎是由表面活性剂从大量的、紧紧压缩的片状体消耗成管状的髓磷脂样形状所致。当表面活性剂从II型细胞中分泌出来时是LB’s的形式，然后在空气－水界面经过转化形成管状的髓磷脂。因此，本发明所述装置保留了初始合成的表面活性剂的原始结构。最显著的现象是表面活性剂部分体积的增加(与最初压缩的表面活性剂解压成包含更多水的结构相一致)。暴露在空气中的那部分的体积将增加3倍多(700微升)。

实施例3：足月羊水细胞的分离

在知情同意后，从由于简单原因而进行足月剖腹产的健康孕妇体内收集羊水。在这个实施例中，羊水的总产量为450ml。使用实施例1所述的装置原型。在收集的羊水中无可见的血，所述羊水混浊并具有白色/黄色的颜色。收集程序耗费不到1分钟。将收集的材料放入冷箱中并立即转移至细胞培养室内，用70％的乙醇对装置进行表面灭菌。

在层流空气流动台上，打开收集室的出口，400ml的羊水被用于分离细胞物质。收集的羊水的剩余部分被用于化学分析，然后储存作为参照。为分离细胞，通过100微米的尼龙网过滤400mL羊水，从而分离胎儿皮脂和大的组织碎片聚集物。然后将过滤后的材料放在Ficoll400蔗糖梯度上并于室温下、500g离心5分钟。用移液管收集存在于蔗糖和水交界面的细胞层部分。为进行细胞计数，将所述部细胞层部分的一小滴置于Bürker室上并使用光学显微镜镜检。加入台盼蓝评估细胞存活力，计算具有完整外部形态的细胞。收集程序之后2小时的存活细胞的百分比是70％。从450ml羊水中回收的存活细胞总数确定为2百万个细胞(每升收集的羊水中有5百万个细胞)。

将梯度离心的细胞物质转移至含有成纤维细胞生长培养基的25cm²的细胞培养瓶中。培养5天后，通过低倍光学显微镜观察细胞，以确定细胞在培养过程中已成倍增加。所述细胞是粘着的并具有成纤维细胞形态。

使用已知方法通过FACS分析细胞，评价诸如CD45之类的造血标记以及CD34,CD105,CD90和CD73的表面表达。用标记抗体(抗CD90-APC，抗CD73-PE，抗CD105-FITC，抗CD45-FITC和抗CD34-APC)对细胞染色，通过流式细胞仪分析标记的表面表达。带有合适的荧光物的IgG作为阴性对照使用。结果如下列表1所示。

表1细胞表面标记的表达

标记	阳性细胞(％)	总体表面表型
			CD90	99.8	+
CD73	99.9	+
			CD105	2.69	-
CD45	0.19	-
			CD34	14	+

如表1所示，高比例的细胞被确定为表面表达CD90(99.8％),CD73(99.9％),以及CD34(14％)，而非常低比例的细胞显示出表面表达CD105(2.69％)或CD45(0.19％)。因此，在这个实施例中，从羊水中分离出胎儿/婴儿细胞群体，基本上不表达造血表面标记(例如CD45)，而表达前体标记CD90和CD34，表达CD73，以及基本上不表达CD105。

实施例4：来自羊水的细胞的继代培养和扩增

如实施例3所述，在知情同意后，从由于简单原因而进行足月剖腹产的健康孕妇体内收集羊水。在这个实施例中，羊水的总产量为600ml。按照实施例3所述方法收集材料并分离细胞。

使用与实施例3相同的条件对细胞进行继代培养并使其在培养中增殖大约60天。在大约70天时，细胞扩增大约1000000倍，达到衰老期。每天的群体倍增数大约为1。

实施例5：羊水来源细胞重组为多能状态并分化为心肌细胞

按照实施例4所述方法分离、继代培养和扩增羊水来源的胎儿/婴儿细胞。对细胞进行TakahashiandYamanaka,2006,Cell126(4):663-676.中所述的多能干细胞诱导(iPSC)程序以恢复它们的分化。这个程序成功地脱分化细胞，形成多能干细胞。

然后在中胚层特定培养基中使多能细胞分化，用于产生心肌细胞。简而言之，含有BMP-4的血清培养基足以促使中胚层分化。经活体显微镜确认，这个程序成功地将细胞分化为搏动心肌细胞。

实施例6：来自足月羊水的细胞的分离

在这个实施例中，使用基于特别设计的导管的装置，从两个独立的通过剖腹产进行的正常健康婴儿分娩获得大量的1200mL和450mL的羊水。使用实施例1所述的装置原型。简而言之，采用特别设计的软塑料穿刺头通过穿刺羊膜并通过重力流虹吸将羊水收集到无菌袋中，获得提取的羊水。在提取过程中，羊水及其包括来自胎儿的细胞物质和附加的胚胎组织在内的成分与大的颗粒物(例如胎儿皮脂)分离开。羊水的提取在胎儿刚要分娩之前进行。一旦获得羊水，然后就通过过滤和密度梯度离心分离细胞物质。将过滤的样品在850g离心5分钟，使细胞沉淀下来。除去上清，用DMEM+10％FCS重新悬浮沉淀。将样品置于淋巴细胞分离剂(MedinorAB或AXIS-SHIELD)上于850g进行密度梯度离心20分钟，完成进一步的分离。通过台盼蓝(Sigma-Aldrich)计数分离的细胞，并铺在用鼠尾胶原蛋白(BDBioscience)预包被的6孔板上，置于成纤维细胞培养基(ScienCellResearchlaboratories)、内皮细胞培养基(ScienCellResearchlaboratories)、小气道上皮细胞生长培养基(Lonza)或DMEM+5％FCS中。在第11-25天，在这些培养基中出现的菌落，要么被单独挑取并扩增，要么被汇集并扩增。细胞每隔一天或每隔两天分别以1:5或1:7的比例分离。通过超速离心，上清液用于分离表面活性剂和存在的其它生物活性分子。

从480和250mL的羊水收集物中分别获得11×10⁶和6×10⁶个存活的细胞。

实施例7：来自羊水的细胞的继代培养和扩增

将实施例6中从足月羊水中收集的细胞铺在4种培养基上，每一种分别含有：1)成纤维细胞/间充质干细胞生长培养基(FCM)；2)内皮细胞生长培养基(ECM)；3)小气道上皮细胞生长培养基(SAGM)；以及4)含有5％胎牛血清的普通DMEM培养基。在含有FCM、ECM或SAGM的培养基中，发生细胞附着和增殖，伴随着细胞集落的出现。在这些培养基中，三种独特类型的细胞集落可以基于它们的形态进行区分。含有FCM的培养基具有高比例的1型集落，含有ECM的培养基具有高比例的2型集落，以及含有SAGM的培养基具有高比例的3型集落。细胞的继续培养显示，具有1型或2型形态的集落增殖形成大的集落尺寸并在铺板后11天内达到满板。3型集落表现出有限的生长能力并在培养24天内到达衰老期，而在1型和2型集落的培养中长达60天没有到达衰老期。分别挑取1型和2型的单个集落并在FCM或ECM培养基中增殖，发现两种细胞类型都具有大约20小时的倍增速率。当羊水细胞未进行先前的克隆筛选或纯化的情况下增殖时，经过FCM或ECM培养基几个阶段的培养，形成的粘附层对应于所使用的细胞培养基表现出形态均一的1型或2型细胞。因此，实施例9中的重组实验在未进行克隆筛选的培养细胞材料上进行。

实施例8：羊水来源的干细胞的特性

通过流式细胞仪分析在实施例7中获得的1型和2型细胞(分别在FCM和ECM中扩增的)的成纤维细胞标记、间充质干细胞标记、内皮细胞标记、造血细胞标记以及多能标记OCT4。按照下列步骤进行流式细胞分析。通过温和的胰蛋白酶消化作用从满板培养物中制备单个细胞的悬浮液。在PBS+2％FCS中悬浮细胞并与荧光标记抗体一起孵育30min。所使用的抗体是CD45(FitC-偶联),CD34(APC-偶联),CD90(APC-偶联),CD73(PE-偶联),CD105(FitC-偶联)(Pharmingen)。同型相同抗体作为对照，用于排除非特异结合。使用FACSCanto流式细胞仪(BECKMAN)和FlowJo软件进行定量分析。

虽然有独特的形态外貌，但是1型和2型细胞集落表现出了相同的细胞表面表型。参见图2的FACS。这些细胞不表达泛造血细胞标记CD45，都表达CD90和CD73，表达低水平的CD105。细胞的一小部分还表达CD34。这些细胞表达与之前研究的通过羊水穿刺程序获得的足月前羊水中的具有间充质干细胞表型的干细胞相似的标记。然而，与这些研究相比，足月羊水中的细胞表现出CD105的表达显著降低。当最初收集到这些细胞时，它们还表达多能标记Oct4，随后该标记在后续培养中丢失。

为进一步研究从足月羊水中获得的具有间充质干细胞表型的1型和2型细胞的特性，使用标准的21天成骨或成脂诱导方法检测这些细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞的潜能。通过茜素红染色检测钙沉淀，以及油红O染色检测脂质空泡积累来确定这些细胞的多潜能。

为了体外分化为成骨细胞，将1型和2型细胞以3×10³/cm²的密度接种于完全NH扩大培养基(Miltenyi)中并使其附着过夜。第二天，将培养基更换为成骨细胞诱导培养基(完全NH扩大培养基+10mMβ-甘油磷酸+0.05mML-抗坏血酸维生素C-2-磷酸+0.1μM地塞米松贮存液+1％AB/AM溶液(Sigma))。使细胞分化21天，期间每2-3天更换一次培养基。在第21天用茜素红对细胞进行染色，以计算钙矿物含量。

为了体外分化为脂肪细胞，将1型和2型细胞以2×10⁴/cm²的密度接种于完全NH扩大培养基(Miltenyi)中并培养3-7天，直到培养物100％铺满。在第7天，将培养基更换为NHAdipDiff培养基(Miltenyi)+1％AB/AM溶液(Sigma)。使细胞分化14天，期间每2-3天更换一次培养基。在第14天，用油红O对细胞进行染色，以检测脂质空泡。

这些结果共同表明，存在于足月羊水收集物中的数量最多的增殖性的粘附细胞类型是独特的足月羊水干细胞(AFSC)。

实施例9：足月羊水干细胞的重组

对在实施例7中获得并在实施例8中鉴定的足月羊水干细胞(AFSC)的重组能力进行评估。附着的单层细胞采用在四环素(tet)诱导启动子的控制下表达下列重组因子的慢病毒载体进行转导：OCT4SOX2,LIN28,KLF4和C-MYC。GFP也在四环素诱导启动子的控制下表达。

具体地，分别使用慢病毒载体FU-tet-o-hOct4,FU-tet-o-hSox2,FU-tet-o-hKlf4,FU-tet-o-hcMyc,FU-tet-o-hLin28,tet-诱导的GFP标记载体以及FUdeltaGW-rtTA。为产生病毒，在铺满50-70％时转染293T细胞。对于10cm平板，使用10ml添加了10％FCS和1％P/S的DMEM和40μgDNA(10:7:3载体:ΔR8.91:vsv-g)。第二天将培养基换成6ml新鲜培养基。随后2天收集病毒并使用0.45μm滤器过滤。用非浓缩的慢病毒转导AFSC细胞8-12个转导循环，以获得60-80％转导效率。在转导的时候，将1μg/mlDox加入对照孔的培养基中，以评估转导效率。一旦达到80％的转导效率，对细胞进行胰蛋白酶化并平铺在FCM或ECM+1μg/mlDox中的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上。平铺后48h将转导细胞的培养基更换为50％hESC培养基+1μg/mlDox，平铺后72h更换为100％hESC+1μg/mlDox培养基。每隔一天更换hESC培养基+1μg/mlDox，直到出现iPS样集落。在病毒转导后20至30天左右挑取iPS样集落(具有清晰的边缘和层积的具有大核仁的细胞)。

在细胞转导后，向对照孔的培养基中加入四环素来评估GFP的比例，作为重组因子的激活度量。在平铺的羊水干细胞群中观察到大约60-80％GFP的转导效率时获得最高的重组效率。从估算的150,000个起始细胞中挑取了42个iPS集落，iPS生成效率大约为0.03％。从这42个iPS集落中随机选取9个用于扩增和详细鉴定。所有进行遗传准确性检测的iPS克隆均表现出正常的染色体组型并具有类似于人类ES细胞系的增殖、形态和生长特征。如实时PCR分析显示，所有的iPS细胞系被证实是多能的，内源性表达多能标记OCT4,SOX2,KlLF4,C-MYC,NANOG,DNMT3B和TDGF1(CRIPTO)，与人类ES细胞系H1,HUES-3和HUES-6的表达水平相当。皮下移植入Nod/Scid/Il2rg-/-小鼠中的9个细胞系中的7个形成畸胎癌。7个畸胎癌中的5个表现出细胞典型的3个胚层，表明中胚层、内胚层和外胚层细胞谱系的产生。两个细胞系表现出内胚层和中胚层细胞谱系。这些结果证实了从足月AFSC细胞中有效产生多能干细胞系的可行性。

实施例10：足月AFSC来源的iPS细胞系的分化潜能

评估实施例9中获得的AFSC来源的iPS细胞系的跨胚层分化潜能。采用两种建好的神经谱系分化和造血谱系分化的高效方法分别进行细胞系分化(Kirkebyetal.,2012,Cellreports1(6):603-614；Woodsetal.,2011,StemCells29(7):1158-1164)。已经证实具有高的血细胞分化效率的脐带血内皮细胞衍生的iPS细胞系，和已经证实能够有效分化为神经谱系的人类ES细胞系H9，被用作对照。在3个随机挑选的AFSC来源的iPS细胞系的分化之后，观察到有效的血液(中胚层)谱系的分化，其水平显著高于H9ES细胞系(22.2+/-4.4％CD45+细胞，相比于来自H9细胞系的0.33％CD45+细胞)。脐带血衍生的iPS细胞系表现出高的血液分化潜能(50.9+/-5.1％CD45+细胞；n＝3)。然而，与AFSC-iPS细胞系朝着神经谱系的有效分化不同，虽然使用可能的神经分化方法，但脐带血-iPS细胞系继续将细胞分化成中胚层谱系。使用神经细胞方法分化的脐带血和AFSC-iPS细胞系均表现出细胞MAP2(成熟神经标记)和TUJ1(未成熟神经标记)阳性，而在脐带血衍生的iPS细胞系中具有表现出更加不同的分化能力的明显的非神经细胞(TE7染色的中胚层成纤维细胞)。此外，与羊水衍生的iPS细胞系相比，脐带血衍生的iPS细胞系还表现出减弱的红细胞分化能力，而所有的AFSC-iPS细胞系在集落形成单位试验中都能形成红细胞。人类ES细胞系H9表现出有效的神经谱系分化能力以及严重降低的血细胞分化潜能。Bocketal.,2011,Cell144(3):439-452.脐带血和AFSC衍生的iPS细胞系均产生了造血细胞和祖细胞(CD34)，而脐带血系产生了更高的血细胞数量(AF-iPS细胞系和CB-iPS细胞系分别产生了22.2+/-4.4％和50.9+/-5.1％；n＝3CD45+细胞)。

对iPS细胞系和对照组的脐带血iPS细胞系和人类ES细胞系进行微阵列分析，将这些细胞的基因表达谱与起始细胞材料(AFSC)进行比较。观察到起始细胞材料和AFSC衍生的iPS细胞系之间干细胞标记的相关性，暗示了整个重组过程中几种干细胞基因的维持。这个观察结果表明在iPS细胞系中维持了AFSC多潜能性。这些结果合在一起表明了AFSC是理想的用于获得新的iPS细胞系的起始材料，并且表明表观遗传记忆在整个重组过程中保留了它们广泛的产生具有多胚层分化能力的iPS细胞系的干细胞潜能。

本申请自始至终，参考了各种网站数据内容、出版物、专利申请和专利。(通过统一资源定位系统或URL、万维网地址引用网站。)本文通过引用将每个所述参考的公开内容全部包含于此。

本发明不限于本文公开的实施例范围，所述实施例旨在作为本发明个别方面的单一解释，任何功能等同的均在本发明范围内。除本文所描述的这些模型和方法之外，对本发明的模型和方法的各种修改，根据前面的描述和教学，对本领域技术人员将是显而易见的，同样地要落入本发明范围内。这些修改或其它实施例在背离了本发明的真实范围和精神的情况下不能得到实施。

Claims (57)

1. 提供以下典型权利要求是为了进一步解释本发明的一些实施例，不应被理解为申请人视为其发明的范围限制。

   我们要求：

   1.羊水收集装置，包括：

   收集室；

   连接收集室的收集室出口阀；

   连接收集室的收集室进口阀；

   连接收集室进口阀的近端液体抽取管，所述近端液体抽取管包含医用级材料；以及连接近端液体抽取管的远端液体抽取管，所述远端液体抽取管包含输送部分和进口，所述进口包括主进口、穿刺头和一个或多个侧面进口。
2. 2.分离的胎儿细胞或婴儿细胞，包括选自CD73和CD90组成的组中的标记的表面表达，其特征在于：

   所述细胞的表面不表达CD105；或者

   所述细胞的表面表达CD34。
3. 3.根据权利要求2所述的分离的细胞，所述细胞包括CD73和CD90的表面表达。
4. 4.根据权利要求2或3所述的分离的细胞，所述细胞的表面不表达CD105而表达CD34。
5. 5.根据权利要求2-4任一所述的分离的细胞，所述细胞表达转录因子Oct-4。
6. 6.根据权利要求2-5任一所述的分离的细胞，所述细胞的表面不表达CD45。
7. 7.根据权利要求2-6任一所述的分离的细胞，所述细胞是粘着的。
8. 8.根据权利要求2-7任一所述的分离的细胞，所述细胞具有成纤维细胞形态。
9. 9.根据权利要求2-8任一所述的分离的细胞，所述细胞是多能的或多潜能的。
10. 10.根据权利要求2-9任一所述的分离的细胞，其特征在于：

    所述细胞能够在连续培养中生长至少50天；或

    所述细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或

    所述细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。
11. 11.一种成分，包含权利要求2-10任一所述的胎儿或婴儿细胞。
12. 12.一种成分，包括多个胎儿细胞或婴儿细胞，其特征在于，至少10％的所述细胞的表面表达CD90，CD73和CD34，而少于5％的所述细胞的表面表达CD105。
13. 13.根据权利要求12所述的成分，其特征在于，至少50％的所述细胞表达转录因子Oct-4。
14. 14.根据权利要求12或13所述的成分，其特征在于，少于5％的所述细胞的表面表达CD45。
15. 15.根据权利要求12-14任一所述的成分，其特征在于，至少50％的所述细胞是粘着的。
16. 16.根据权利要求12-15任一所述的成分，其特征在于，至少50％的所述细胞具有成纤维细胞形态。
17. 17.根据权利要求12-16任一所述的成分，其特征在于，至少50％的所述细胞是多能的或多潜能的。
18. 18.根据权利要求12-14任一所述的成分，其特征在于：

    至少50％的所述细胞能够在连续培养中生长至少50天；或

    多数所述细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或

    多数所述细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。
19. 19.根据权利要求11-18任一所述的成分，还包括羊水。
20. 20.根据权利要求19所述的成分，其特征在于，所述细胞的浓度为每升至少1百万个细胞。
21. 21.用于分离胎儿或婴儿细胞的方法，包括：

    (a)在大于21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38或39周的妊娠时期获取羊水；以及

    (b)从羊水中回收胎儿或婴儿细胞。
22. 22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的获取包括通过剖腹产术收集羊水。
23. 23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的回收包括从羊水中去除微粒物质。
24. 24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的回收还包括进行梯度离心。
25. 25.根据权利要求21-24任一所述的方法，还包括在使细胞增殖的条件下培养回收的细胞。
26. 26.根据权利要求21-25任一所述的方法，其特征在于，在每升步骤(a)获得的羊水中，步骤(b)中的回收细胞包含至少1百万个细胞。
27. 27.根据权利要求21-26任一所述的方法，其特征在于，步骤(a)获得的羊水量可以是至少或大约10mL,20mL,30mL,40mL,50mL,60mL,70mL,80mL,90mL,100mL,200mL,300mL,400mL,500mL,600mL,700mL,800mL,900mL或1000mL。
28. 28.根据权利要求21-27任一所述的方法，其特征在于，所述羊水是足月的羊水。
29. 29.根据权利要求21-28任一所述的方法，其特征在于，所述胎儿或婴儿细胞包括权利要求2-10任一所述的细胞。
30. 30.根据权利要求21-28任一所述的方法，其特征在于，所述胎儿或婴儿细胞包括表面表达选自CD73和CD90组成的组中的标记的细胞，所述细胞的表面不表达CD105或表达CD34。
31. 31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述细胞的表面表达CD73和CD90。
32. 32.根据权利要求30或31所述的方法，其特征在于，所述细胞的表面不表达CD105而表达CD34。
33. 33.根据权利要求30-32任一所述的方法，其特征在于，所述细胞表达转录因子Oct-4。
34. 34.根据权利要求30-33任一所述的方法，其特征在于，所述细胞的表面不表达CD45。
35. 35.根据权利要求30-34任一所述的方法，其特征在于，所述细胞是粘着的。
36. 36.根据权利要求30-35任一所述的方法，其特征在于，所述细胞具有成纤维细胞形态。
37. 37.根据权利要求30-36任一所述的方法，其特征在于，所述细胞是多能的或多潜能的。
38. 38.根据权利要求30-37任一所述的方法，其特征在于：

    所述细胞能够在连续培养中生长至少50天；或

    所述细胞能够在培养中增殖至少30次群体倍增；或

    所述细胞能够在连续培养中扩增至少1,000,000倍。
39. 39.根据权利要求21-38任一所述的方法，还包括重组所述回收的细胞，由此产生多潜能或多能细胞。
40. 40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述重组包括进行iPSC。
41. 41.根据权利要求21-40任一所述的方法，还包括将细胞分化为所需要的细胞或组织类型。
42. 42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所需要的细胞或组织类型选自造血细胞、神经元细胞、内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞组成的组。
43. 43.一种治疗方法，包括将权利要求11-18任一所述的成分用于患者。
44. 44.一种库存细胞的方法，包括：

    (a)获取一个或多个样品，每个样品包含权利要求2-10任一所述的细胞；

    (b)在保护样品中至少一些细胞的存活力的条件下储存所述样品；以及

    (c)保存与样品获取对象身份相关的数据。
45. 45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述储存包括使用一种或多种冷冻保护剂处理样品。
46. 46.根据权利要求44或45所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括获取多个样品，每个样品取自不同对象。
47. 47.一种细胞库，包括：

    (a)多个样品，每个样品包含权利要求2-10任一所述的细胞或权利要求11-20任一所述的成分；以及

    (b)包含所述样品的个体身份和回收数据的数据库。
48. 48.根据权利要求47所述的细胞库，其特征在于，多个样品中的每个样品来自单个对象。
49. 49.根据权利要求47或48所述的细胞库，其特征在于，所述数据包括与单个样品来源对象的身份相关的信息。
50. 50.用于收集羊水的方法，包括：

    (a)通过受试者子宫壁上的切口插入羊水收集装置；

    (b)穿刺受试者的羊膜；以及

    (c)从受试者的羊膜囊中收集羊水，所述受试者是妊娠至少30周的孕妇。
51. 51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述受试者妊娠期满。
52. 52.根据权利要求50或51所述的方法，其特征在于，所述羊水收集装置是权利要求1所述的装置。
53. 53.根据权利要求50-52任一所述的方法，其特征在于，步骤(b)还包括穿刺绒毛膜。
54. 54.根据权利要求50-53任一所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的收集包括一个或多个：

    (i)通过打开羊水收集装置的进口阀开始虹吸，将羊水输送至羊水收集装置的收集室中；

    (ii)将羊水收集装置的收集室置于羊水收集装置的进口下方；

    (iii)连接负压源和羊水收集装置的出口来开始羊水输送；以及

    (iv)重置羊水收集装置的进口来回收基本上所有可用的羊水。
55. 55.根据权利要求50-54任一所述的方法，所述方法还包括步骤(d)移去羊水收集装置。
56. 56.根据权利要求50-55任一所述的方法，其特征在于，所述切口通过羊水收集装置产生。
57. 57.根据权利要求50-56任一所述的方法，其特征在于，所述方法在少于大约10分钟，大约9分钟，大约8分钟，大约7分钟，大约6分钟，大约5分钟，大约4分钟，大约3分钟，大约2分钟或大约1分钟内完成。