CN112538457A - 一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法，所述方法包括两步法解离猪肝脾脏组织获取导管干细胞和猪肝脾脏类器官三维培养两个部分。本发明基于猪肝脾脏导管干细胞分离的三维类器官培养方法，解决了猪肝脾脏类器官建立技术难题，推进了类器官技术在动物营养研究中的应用。

Description

一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法。
背景技术
肝脏和脾脏是动物机体营养代谢与免疫调控的重要枢纽，具有很强的自我修复能力，主要由(lgr5标记的)导管干细胞驱动。基于导管干细胞的全能性，近年来已经有小鼠和人肝脏类器官培养技术出现。相对于小鼠或者人肝脾脏细胞系来说，类器官能够更好的复现组织级别的生物学表型，在病理研究和药物筛选方面具有非常广阔的前景。而对于动物营养研究领域来说，长期以来由于缺乏家畜来源成熟的肝脏、脾脏细胞通用细胞系，很多营养与免疫研究无法开展，处于技术性滞后阶段。主要问题在于从动物来源分离的细胞活性不高，无法稳定的在体外高代次增殖，容易丢失基因片段，生物学表型不能稳定复现。因此，目前动物营养领域主要用动物模型进行营养素功能评价与疾病机制探索。建立动物模型存在场地限制、处理方式难、周期长和成本高等诸多局限性。因此，建立稳定的家畜来源肝脾脏类器官分离培养技术迫在眉睫，对于推进现代动物营养研究具有里程碑意义。
目前，小鼠与人肝脾脏类器官主要是基于多能诱导干细胞(iPS cell)和成体组织导管干细胞通过添加其增殖分化所必须的微环境因子如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和抑制剂如A83-01等实现类器官培养，对于建立家畜来源肝脾脏类器官具有很好的借鉴意义。但是，对于家畜如猪来说，并没有根据猪肝脾脏生理生化特征与发育特点的导管干细胞分离技术和专用培养基。虽然有人尝试用小鼠的肝脏类器官培养基用于猪肝脏类器官培养，但是类器官形成率、类器官活性和类器官增殖能力无法达到基本的营养与药物筛选试验要求，且批次效应明显。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于猪肝脾脏导管细胞分离的3D类器官培养方法包括如下A和B两个部分：
A、两步法解离猪肝脾脏组织获取导管干细胞：
(1)配制猪肝脾组织解离液，所述猪肝脾组织解离液由F12培养基添加IV型胶原蛋白酶、中性蛋白酶和HEPES配制而成；所述IV型胶原蛋白酶在F12培养基中的浓度为2.5mg/mL，所述中性蛋白酶在F12培养基中的浓度为0.15mg/mL，所述HEPES在F12培养基中的浓度为15μM；使用猪肝脾组织解离液前将猪肝脾组织解离液预热至15～25℃；用抗黏连冲洗液覆盖并冲洗无菌无酶离心管，然后用F12培养基再次冲洗无菌无酶离心管，再弃去所有液体；盖紧离心管管盖后置于冰上，备用；所述无菌无酶离心管规格为15mL和50mL；
(2)将新鲜猪肝脏或者脾脏组织放入装有DPBS的培养皿中并切成3～6mm的组织碎片，将组织碎片转移至步骤(1)准备的50mL无菌无酶离心管中，再用DPBS清洗，使组织碎片沉于无菌无酶离心管管底，去除含有细胞碎屑的上清；
(3)向沉淀有碎片的无菌无酶离心管中加入猪肝脾组织解离液重悬组织碎片，于37℃水浴10～15min，待组织碎片沉淀后，取出无菌无酶离心管中10mL的上清液并将上清液转移至新的50mL无菌无酶离心管中，置于冰上或4℃；再次向沉淀有碎片的无菌无酶离心管中加入猪肝脾组织解离液重悬组织碎片，于37℃水浴10～15min，待组织碎片沉淀后，取出无菌无酶离心管中10mL的上清液并将上清液转移至已经储存有10mL上清液的50mL无菌无酶离心管中，置于冰上或4℃；重复操作直至获得50mL上清液为止，完成第一步解离；
(4)将步骤(3)得到的上清液在200g、2～8℃条件下离心2～5min，去上清后再加入温和细胞解离液，于15～25℃、200rpm条件下摇床孵育5～10min，得到孵育后的液体，完成第二步解离；
(5)将步骤(4)所得的孵育后的液体通过70μm细胞筛网，过滤到置于冰上的经步骤(1)处理后的50mL无菌无酶离心管中，得第一步过滤后的滤液；
(6)将步骤(5)所得的滤液通过37μm双向细胞筛网再次过滤，弃去滤液，然后用F12培养基将双向细胞筛网上的导管细胞洗脱至预先湿润的50mL无菌无酶离心管中，完成第二步过滤；再分装到4个经步骤(1)处理的15mL无菌无酶离心管中，于300g、2～8℃条件下离心3～7min，去除干净上清，每管留5～10μL，置于冰上；
B、猪肝脾脏类器官培养：
(7)配制全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，所述全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基由F12培养基添加ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin配制而成；所述ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、10～15μM、1～1.5％、1.5～2.5nM、10～15mM、1.5～2.5mM、10～20μM、10～15nM、80～100ng/mL、10～15ng/mL、450～500nM、450～550ng/mL、80～120ng/mL、45～60ng/mL、8～12ng/mL；预热24孔细胞培养板，于冰箱4℃预冷200μL移液枪头30min以上，冰上解冻基质胶；
(8)用步骤(1)预冷的200μL枪头吸取30μL解冻的基质胶到步骤(6)所得的装有分离出的导管细胞的离心管中，充分混匀，得导管细胞悬浮液；
(9)将步骤(8)所得的导管细胞悬浮液转移到步骤(8)准备的24孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱孵育10～15min，促进基质胶凝固，得凝固后的24孔细胞培养板；
(10)取出凝固后的24孔细胞培养板，加入全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，于37℃、5％CO2培养箱，每2～3d更换一次全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，4～5d即可传代。
优选地，步骤(7)中所述ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、15μM、1％、2nM、12mM、2mM、15μM、15nM、90ng/mL、15ng/mL、500nM、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL。
全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基主要用于不同日龄猪肝脏和脾脏类器官培养，但不限于此。本配方中提及的最低浓度即可满足肝脾脏类器官分离培养基需要。
本发明提出的猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法具有以下特点：
(1)提出两步法分离猪肝脾脏导管干细胞，相对于小鼠或人肝脏类器官分离培养的一步法，具有收获率高，细胞活性好，最终类器官形成率高的优势。
(2)本发明所述的全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，是基于猪肝脾脏生理生化指标测定和大量类器官实验筛选而出，营养组分配比和浓度最适合猪脏器来源类器官培养，具有高度的特异化优势。
总之，本发明所述的猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法法推进了类器官技术在动物营养研究中的应用。
附图说明
图1为实施例2中第三天猪脾脏类器官形态图；
图2为实施例3中第三天猪肝脏类器官形态图。
具体实施方式
实施例1
猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法：
A、两步法解离猪肝脾脏组织获取导管干细胞
猪肝脾组织解离液组分及配比见表1：
表1
Figure BDA0002853949790000041
(1)实验前准备：a.按表1准备好50mL现配的组织解离液，置于4℃保存备用，使用前需要将解离液预热至室温(15～25℃)。b.用5mL抗黏连冲洗液(Anti-AdherenceRiinsing Solution，STEMCELL)完全覆盖冲洗15mL无菌无酶离心管内部(共需4个)，然后弃去冲洗液；用15mL的Advanced DMEM/F12再次完全冲洗，然后弃去所有液体；同样方法，取20mL抗黏连冲洗液和20mL Advanced DMEM/F12冲洗50mL无菌无酶离心管1个，盖紧所有离心管盖子置于冰上备用；
(2)将储存于冷的(4℃)DPBS中的新鲜(距离取样2小时以内的)猪肝脏或者脾脏组织取出，放到装有5mL冷DPBS的10nm培养皿中，用弯头剪刀将组织块剪切成3～6mm的小碎片；将碎片转移至新的50mL无菌无酶离心管中，加入10mL冷的DPBS清洗，让碎片随重力沉降，去除含有细胞碎屑的上清，重复两次即可；
(3)加入室温(15～25℃)本发明提出的优化型组织解离液15mL重悬(2)清洗后的组织碎片，37℃水浴15钟。用10mL玻璃移液管上下用力吹打碎片5～10次，待碎片组织重力沉降后，取出10mL上清部分储存于新50mL无菌无酶离心管中，至于冰上或4℃冰箱。再加入室温(15～25℃)新的本发明提出的优化型组织解离液10mL,继续水浴15min，继续收集上清部分10mL到离心管中，重复该步骤5次，直到获得约50mL上清部分为止(第一步解离)；
(4)将(3)所获得的上清部分以200g，2～8℃，离心3min后，弃去上清，加入10mL温和型细胞解离液(GCDR，STEMCELL)，室温(15～25℃)以200rpm速度，于摇床孵育5～10min(第二步解离)；
(5)将(4)孵育后液体，通过70μm细胞筛网过滤到置于冰上的新50mL无菌无酶离心管中，弃去滤网(第一步过滤)；
(6)将(5)所获滤液通过37μm双向细胞筛网过滤，弃去滤液。然后，翻转细胞筛网盖到(1)所准备的预先润湿的50mL无菌无酶离心管上，用10mL玻璃移液器吸取10～12mL冷的(4℃)Advaced DMEM/F12培养基将导管细胞洗脱到预先润湿的离心管中(第二步过滤)；
(7)用预先润湿的10mL玻璃移液器，上下吹打(6)所获导管细胞滤液3～6次，然后立刻均分到4个(1)所预先润湿的15mL无菌无酶离心管中。
(8)将(7)所述4个离心管，以300g，2～8℃，离心5min，然后用玻璃移液器或者移液枪，尽量去除干净上清部分，避免扰动导管细胞，每个管底留下大约5～10μL即可，置于冰上。
B.猪肝脾脏类器官培养：
全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基的具体成分见表2：
表2
Figure BDA0002853949790000051
使用全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基猪肝脏脾脏类器官培养具体步骤如下：
(1)实验前需提前在培养箱预热24孔细胞培养板，冰箱4℃预冷200μL移液枪头，至少30min以上；提前冰上解冻基质胶。后续全部流程需在超净工作台完成；
(2)用预冷的200μL枪头吸取30μL解冻的基质胶到A部分所述分离出的导管细胞，缓慢上下吹动混合5～8次，充分混匀，避免产生气泡；
(3)将移液器设置到50μL，把(2)步骤所有的悬浮液转移到24孔板的一个小孔并形成圆顶装结构，缓慢滴到小孔中央，避免扰动或形成气泡。重复步骤，处理完剩下的导管细胞；
(4)将(3)准备好的培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育10～15min，促进基质胶凝固；
(5)取出凝固好的24孔培养板，加入本发明提出的猪肝脾脏类器官培养基750μL，然后，放回37℃，5％CO2培养箱开始培养；
(6)每d观察并拍照记录类器官其情况，每2～3d完全更换一次培养基，通常第4～5d就可以做传代。
实施例2
断奶仔猪脾脏类器官培养方法：
(1)取新鲜21日龄断奶仔猪脾脏组织一份于冷(4℃)的DPBS，基于本发明提出的两步法分离出脾脏导管细胞；
(2)实验前需提前在培养箱预热24孔细胞培养板，冰箱4℃预冷200μL移液枪头，至少30min以上；提前冰上解冻基质胶；
(3)用预冷的200μL枪头吸取30μL解冻的基质胶到A部分所述分离出的导管细胞，缓慢上下吹动混合5～8次，充分混匀，避免产生气泡；
(4)将移液器设置到50μL，把(2)步骤所有的悬浮液转移到24孔板的一个小孔并形成圆顶装结构，缓慢滴到小孔中央，避免扰动或形成气泡；重复步骤，处理完剩下的导管细胞；
(5)将(3)准备好的培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育10～15min，促进基质胶凝固；
(6)取出凝固好的24孔培养板，加入本发明提出的猪肝脾脏类器官培养基750μL，然后，放回37℃，5％CO2培养箱开始培养；
(7)每d观察并拍照记录类器官其情况，每2-3d完全更换一次培养基；第3d脾脏类器官见图1。
实施例3
断奶仔猪肝脏类器官培养方法：
本实例提供一种基于本发明的一种等同替换概念的应用，主要是用Wnt3a生长因子条件培养基替换Wnt3a生长因子细胞因子，也属于本发明的保护范围内。
A.Wnt3a生长因子细胞因子的制备：
(1)解冻一份液氮冻存的ATCC-L-Wnt3a生长因子细胞(ATCC CRL-2647)。用DMEM+10％胎牛血清FBS+G418(0.4mg/mL)配制成L-Wnt3a生长因子基础培养基；
(2)将15mL新鲜配制的L-Wnt3a生长因子基础培养基加入到T75培养瓶中，加入解冻的L-Wnt3a生长因子细胞，放入37℃，5％CO2培养箱，持续培养直到贴满；
(3)按照1比4传代到4个新的T75培养瓶中，每个瓶子同样添加10mL的新鲜配制的L-Wnt3a生长因子基础培养基，继续培养2～3d，直到贴满；
(4)收获每个T75瓶贴满后的培养基，每隔24小时收集一次，将收获的培养基以1000×g(2990rpm),2～8℃，离心5min；收集上清液，通过0.22μm细胞筛网过滤到新的50mL无菌无酶离心管；
(5)将所有收获的培养基充分混合即Wnt3a生长因子条件培养基，按25mL每50mL离心管分装，于-80℃冰箱保存备用；
B.脾脏类器官培养方法：
(6)将Wnt3a生长因子条件培养基添加到本发明提出的培养基替换Wnt3a生长因子细胞因子，Wnt3a生长因子条件培养基的占比为30～50％，其他成分浓度不变；
(7)用预冷的200μL枪头吸取30μL解冻的基质胶到A部分所述分离出的导管细胞，缓慢上下吹动混合5～8次，充分混匀，避免产生气泡；
(8)将移液器设置到50μL，把步骤所有的悬浮液转移到24孔板的一个小孔并形成圆顶装结构，缓慢滴到小孔中央，避免扰动或形成气泡；重复步骤，处理完剩下的导管细胞；
(9)将准备好的培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育10～15min，促进基质胶凝固；
(10)取出凝固好的24孔培养板，加入本发明提出的猪肝脾脏类器官培养基750μL，然后，放回37℃，5％CO2培养箱开始培养；
(11)每d观察并拍照记录类器官其情况，每2～3d完全更换一次培养基；第3d肝脏类器官见图2。

Claims (6)

1.一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，所述方法包括如下A和B两个部分：
A、两步法解离猪肝脾脏组织获取导管干细胞：
(1)配制猪肝脾组织解离液，所述猪肝脾组织解离液由F12培养基添加IV型胶原蛋白酶、中性蛋白酶和HEPES配制而成；所述IV型胶原蛋白酶在F12培养基中的浓度为2.5mg/mL，所述中性蛋白酶在F12培养基中的浓度为0.15mg/mL，所述HEPES在F12培养基中的浓度为15μM；使用猪肝脾组织解离液前将猪肝脾组织解离液预热至15～25℃；用抗黏连冲洗液覆盖并冲洗无菌无酶离心管，然后用F12培养基再次冲洗无菌无酶离心管，再弃去所有液体；盖紧离心管管盖后置于冰上，备用；所述无菌无酶离心管规格为15mL和50mL；
(2)将新鲜猪肝脏或者脾脏组织放入装有DPBS的培养皿中并切成3～6mm的组织碎片，将组织碎片转移至步骤(1)准备的50mL无菌无酶离心管中，再用DPBS清洗，使组织碎片沉于无菌无酶离心管管底，去除含有细胞碎屑的上清；
(3)向沉淀有碎片的无菌无酶离心管中加入猪肝脾组织解离液重悬组织碎片，于37℃水浴10～15min，待组织碎片沉淀后，取出无菌无酶离心管中10mL的上清液并将上清液转移至新的50mL无菌无酶离心管中，置于冰上或4℃；再次向沉淀有碎片的无菌无酶离心管中加入猪肝脾组织解离液重悬组织碎片，于37℃水浴10～15min，待组织碎片沉淀后，取出10mL的上清液转移至有10mL上清液的50mL无菌无酶离心管中，置于冰上或4℃；重复操作直至获得50mL上清液为止，完成第一步解离；
(4)将步骤(3)得到的上清液在200g、2～8℃条件下离心2～5min，去上清后再加入温和细胞解离液，于15～25℃、200rpm条件下摇床孵育5～10min，得到孵育后的液体，完成第二步解离；
(5)将步骤(4)所得的孵育后的液体通过70μm细胞筛网，过滤到置于冰上的经步骤(1)处理后的50mL无菌无酶离心管中，得第一步过滤后的滤液；
(6)将步骤(5)所得的滤液通过37μm双向细胞筛网再次过滤，弃去滤液，然后用F12培养基将双向细胞筛网上的导管细胞洗脱至预先湿润的50mL无菌无酶离心管中，完成第二步过滤；再分装到4个经步骤(1)处理的15mL无菌无酶离心管中，于300g、2～8℃条件下离心3～7min，去除上清，每管留5～10μL，置于冰上；
B、猪肝脾脏类器官培养：
(7)配制全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，所述全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基由F12培养基添加ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin配制而成；所述ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、10～15μM、1～1.5％、1.5～2.5nM、10～15mM、1.5～2.5mM、10～20μM、10～15nM、80～100ng/mL、10～15ng/mL、450～500nM、450～550ng/mL、80～120ng/mL、45～60ng/mL、8～12ng/mL；预热24孔细胞培养板，于冰箱4℃预冷200μL移液枪头30min以上，冰上解冻基质胶；
(8)用步骤(1)预冷的200μL枪头吸取30μL解冻的基质胶到步骤(6)所得的装有分离出的导管细胞的离心管中，充分混匀，得导管细胞悬浮液；
(9)将步骤(8)所得的导管细胞悬浮液转移到步骤(8)准备的24孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱孵育10～15min，促进基质胶凝固，得凝固后的24孔细胞培养板；
(10)取出凝固后的24孔细胞培养板，加入全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，于37℃、5％CO2培养箱，每2～3d更换一次全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，4～5d即可传代。
2.如权利要求1所述的猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述IV型胶原蛋白酶在F12培养基中的浓度为2.5mg/mL，所述中性蛋白酶在F12培养基中的浓度为0.15mg/mL，所述HEPES在F12培养基中的浓度为15μM。
3.如权利要求1所述的猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，步骤(7)中所述ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、15μM、1％、2nM、12mM、2mM、15μM、15nM、90ng/mL、15ng/mL、500nM、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL。
4.一种猪肝脾组织解离液，其特征在于，所述猪肝脾组织解离液由F12培养基添加IV型胶原蛋白酶、中性蛋白酶和HEPES配制而成；所述IV型胶原蛋白酶在F12培养基中的浓度为2.5mg/mL，所述中性蛋白酶在F12培养基中的浓度为0.15mg/mL，所述HEPES在F12培养基中的浓度为15μM。
5.一种全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，其特征在于，所述全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基由F12培养基添加Rock激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin配制而成；所述Rock激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、10～15μM、1～1.5％、1.5～2.5nM、10～15mM、1.5～2.5mM、10～20μM、10～15nM、80～100ng/mL、10～15ng/mL、450～500nM、450～550ng/mL、80～120ng/mL、45～60ng/mL、8～12ng/mL。
6.如权利要求5所述的全小分子无血清猪肝脾脏类器官培养基，其特征在于，所述ROCK激酶抑制剂、HEPES缓冲液、B-27血清替代物、L-谷氨酰胺、尼克酰胺、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺、胃泌素I、FGF-19、FGF-2、TGF-βI型受体抑制剂、Wnt3a生长因子、R-脊椎蛋白、EGF、Noggin在F12培养基中的浓度分别为10μM、15μM、1～1.5％、2nM、12mM、2mM、15μM、15nM、90ng/mL、15ng/mL、500nM、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979179A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 扬州大学 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170191030A1 (en) * 2014-05-16 2017-07-06 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved culture method for organoids
CN109161516A (zh) * 2018-09-13 2019-01-08 华中农业大学 一种猪肠道隐窝分离和3d类器官培养的方法
CN109609441A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种肾脏组织类器官3d培养的培养基及类器官培养方法
CN110129256A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种猪源3d胎盘类器官模型的建立方法
CN110317775A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 中国科学院上海生命科学研究院 用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基
CN111394299A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 南京鼓楼医院 一种肝脏类器官的体外构建方法及应用
CN111979179A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 扬州大学 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170191030A1 (en) * 2014-05-16 2017-07-06 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved culture method for organoids
CN110317775A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 中国科学院上海生命科学研究院 用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基
CN109161516A (zh) * 2018-09-13 2019-01-08 华中农业大学 一种猪肠道隐窝分离和3d类器官培养的方法
CN109609441A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种肾脏组织类器官3d培养的培养基及类器官培养方法
CN110129256A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种猪源3d胎盘类器官模型的建立方法
CN111394299A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 南京鼓楼医院 一种肝脏类器官的体外构建方法及应用
CN111979179A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 扬州大学 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. VAN DER HEE等: "Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids", 《STEM CELL RESRARCH》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979179A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 扬州大学 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法
CN111979179B (zh) * 2020-08-24 2022-12-27 扬州大学 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

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