CN115287268A - 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法 - Google Patents

一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法，通过将分离的猪回肠隐窝干细胞先增殖并分化成3D肠类器官再打散成单细胞后进行培养，获得单层肠类器官，然后接种病毒便能够用于后续的应用。并且，在病毒接种时同时在培养基中加入胆汁酸，所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸，有助于猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖。

Description

一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法。
背景技术
猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)在分类上属于冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)、甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)、Rhinacovirus亚属、菊头蝠冠状病毒HKU2种(Rhinolophus bat coronavirus HKU2)，是一类有囊膜的单股正链RNA病毒。电子显微镜形态学观察显示， SADS-CoV病毒颗粒呈卵圆形，直径约100nm～120nm，具有典型的冠状病毒特征，囊膜表面可见冠状的S蛋白突起。预防SADS-CoV感染成为养猪业亟待解决的问题。
胆汁酸(bile acid，BA)是一类胆固醇衍生双亲分子(cholesterol-derivedamphipathic molecules)，能在动物小肠中溶解食物中的脂肪，促进脂类化合物及脂溶性维生素的消化及吸收。BA在哺乳动物的脂类代谢中至关重要，其在机体内的合成和转化受到肠道菌群的调控。肠道细菌参与胆酸合成的途径主要有两条：其一，肠道菌群能够通过水解反应将肝脏中合成的初级胆酸转化为次生胆酸，两类胆酸随后经回肠重吸收，通过门脉循环 (portal circulation)回到肝脏，与甘氨酸(人)或牛磺酸(小鼠)共价结合，形成共轭胆酸。其二，肠道菌群能将共轭态胆酸(conjugated bile acids) 去共轭化，由于未共轭态胆酸的重吸收效率低下，肠道细菌介导的胆酸去共轭化是促进机体分泌及排放胆酸的重要机制。
作为肠道菌群重要的代谢产物之一，胆汁酸(bile acid，BA)对免疫细胞的调节作用一直是领域内的研究热点。已有的研究表明，BA能够通过单核-巨噬细胞表面的G蛋白偶联型胆酸受体1(GPBAR1，或TGR5和胆酸膜型受体，M-BAR)或核内的核受体亚家族1H成员4(NR1H4，也称为法尼醇X受体，FXR)，抑制NF-κB介导的炎症反应。
BA结合TGR5能够提高巨噬细胞中环磷酸腺苷(cAMP)的浓度，激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和cAMP应答原件结合蛋白 (cAMP-responsive element-bindingprotein，CREB)，从而降低信号转导及转录活化蛋白1(signal transducer and activatorof transcription 1，STAT1) 的磷酸化，抑制下游干扰素刺激基因(interferonstimulate genes，ISGs) 的转录和表达，最终介导炎症抑制反应。然而更重要的是，天然次级胆汁酸不但能够抑制巨噬细胞的炎性反应，也能够对非免疫细胞产生抑炎作用；比如，用脱氧胆酸或石胆酸处理上皮细胞系Caco-2，能够显著抑制其 IL-18的表达。
类器官3D培养是一种新兴的用来研究组织成体干细胞生长、分化、器官形成的体外研究系统。肠道类器官的3D培养是将分离的肠道隐窝或干细胞植入含有多种生长因子的基质胶中，在基质3D支撑下生成具有肠道上皮样结构的微型空心球体，这些球体被称为肠道类器官。
发明内容
本发明为一种基于胆酸促进猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法及其应用。
本发明首先提供了胆汁酸在促进猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的应用，所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。其中，胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸的终浓度为100μM。
本发明又提供了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法，包括以下步骤：
(1)分离猪回肠隐窝干细胞，猪回肠隐窝干细胞增殖并分化成3D肠类器官；
(2)将步骤(1)得到的3D肠类器官打散成单细胞后进行培养，获得单层肠类器官；
(3)将猪急性腹泻综合征冠状病毒接种到步骤(2)获得的单层肠类器官，同时在培养基中加入胆汁酸，所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。
优选的，步骤(1)中猪回肠隐窝干细胞培养5～7天后，增殖并分化成3D肠类器官。
优选的，步骤(1)中取2-8日龄仔猪回肠，分离获得隐窝干细胞后，按体积比1∶1加入肠类器官培养基及Matrigel重悬后，接种到培养板上，待凝固后加入肠类器官培养基进行培养。其中，肠类器官培养基的品牌为 STEM CELL，货号06005；Matrigel的品牌为Corning，货号356231。
优选的，步骤(2)中培养3～5天后单细胞汇聚形成单层肠类器官。
优选的，在培养基中加入胆汁酸的终浓度为100μM。更优选的，步骤 (3)中加入胆汁酸后培养时间不少于48h。
本发明体外培养了一种二维猪肠道类器官，能够支持猪急性腹泻综合征冠状病毒的复制。本发明不仅为探寻对肠道冠状病毒具有调控作用的小分子活性代谢产物提供了体外高通量筛选平台，也将在猪肠道冠状病毒与肠道代谢物相互作用的研究中发挥作用。
同时，本发明研究发现胆汁酸()中的胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA) 或鹅脱氧胆酸(CDCA)能够促进猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖，而其他单一种类的胆汁酸成分比如牛磺酸鹅脱氧胆酸 (TCDCA)、甘氨酸鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)或牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)均没有这方面的作用。
附图说明
图1为小肠隐窝在基底胶中培养得到3D肠道类器官显微镜观察结果图，比例尺：50μm。
图2为将3D肠道类器官的单细胞悬浮液播种在涂有基底胶的96孔板中，形成2D肠道单层的显微镜观察结果图，比例尺：50μm。
图3为猪肠道类器官单层用钙黏蛋白E、Ki-67、微管素和嗜铬粒蛋白 A等细胞标记物(红色)免疫染色结果图，用DAPI观察细胞核(蓝色)，比例尺：50μm。
图4为将十二指肠和空肠肠道类器官单层接种于不同MOI的培养基或SADS-CoV-GFP，并在感染后1或48小时进行滴定检测结果图。
图5为BA处理后SADS-CoV-GFP感染示意图。
图6为SADS-CoV-GFP单独或与BAs同时在37℃下接种回肠猪肠道类器官单分子膜48h的检测结果图，采用RT-qPCR和TCID50法测定病毒基因组拷贝数和效价。
图7为在不同浓度的CA存在下，SADS-CoV-GFP感染猪肠道类器官 48h的检测结果图。
图8为在CA处理的猪肠道类器官和NT对照中，SADS-CoV-GFP(绿色)和SADS-CoV-N蛋白(红色)共定位结果图，比例尺：50μm。
图9为对照组(NT)和CA处理组在感染后不同时间点的病毒基因组拷贝数(左图)和病毒滴度(右图)检测结果图。
具体实施方式
实施例1
(1)猪回肠类器官3D培养模型的建立。
分离猪回肠隐窝干细胞。取2-8日龄仔猪回肠，纵向剪开后冲洗肠道内部并剪成2mm小段，随后用D-PBS(品牌Hyclone)反复冲洗，直至上清清亮。加入隐窝分离液(品牌STEMCELL，货号7174)摇床孵育30 分钟以分离隐窝，弃去上清，1％BSA(BBI Life Sciences)重悬沉淀并经 70μm细胞筛过滤后回收隐窝，300×g，4℃离心5分钟后弃去上清，加入肠类器官培养基(品牌STEM CELL，货号06005)及Matrigel(品牌Corning，货号356231)各100μL重悬后接种于24孔板，待凝固后加入肠类器官培养基，37℃(5％CO2)培养箱中培养。
培养大约5-7天后，肠道隐窝干细胞增殖并分化成3D肠类器官，其中央腔由上皮细胞组成的绒毛区和隐窝区结构包围(图1)，图1中十二指肠(duodenum)、空肠(jejunum)及回肠(ileum)类器官在培养第1天形成单层球体，培养3天后出芽形成隐窝突起，在第5天形成隐窝朝外，绒毛朝里的枝状结构。
(2)2D单层类器官培养并鉴定其细胞类型
由于病毒感染3D肠类器官无法接触到内部结构区域，所以在3D肠类器官进行病毒感染的实验是非常困难的。因此，我们尝试将3D肠类器官进行平面2D单层培养，选取培养5-7天已经成熟的肠类器官，加入1mL DME/F12(Hyclone，货号SH30023.01)吹打后回收，随后用1mL 0.05％ Trypsin-EDTA(Gibco，货号25300054)进行分离消化，将肠类器官打散为单细胞后接种于细胞培养板。培养3-5天后单细胞逐渐汇聚形成单层肠类器官(图2)。
以回肠为例，2D猪小肠类器官表达上皮钙黏蛋白(E-cadherin)及增殖细胞标志(Ki-67)，此外鉴定了不同类型的肠上皮细胞，包括肠细胞 (Villin)及肠内分泌细胞(Chromogranin A)，结果如图3所示，表明2D 猪小肠类器官保持上皮细胞特征并且包含不同类型的肠上皮细胞。
为了评估二维猪肠道类器官是否支持SADS-CoV的复制，我们将拯救获得的SADS-CoV-GFP病毒(病毒拯救方法见公开日为“2019年11月19 日”、公开号为CN110468155A的发明专利申请，其中用GFP的编码基因序列替代ORF3序列)接种到十二指肠或空肠猪肠道类器官中，利用 qRT-PCR和TCID50分别检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。结果如图4所示，以回肠为例，在不同的感染剂量下，与1h相比，48h组病毒拷贝数分别增加63、933、1175倍，病毒滴度检测结果与拷贝数呈正相关，在感染后48h分别达到3.3、5.14、6.02log10，在空肠和十二指肠中也可看到相似的变化。证明十二指肠、空肠及回肠均能被SADS-CoV-GFP感染。
实施例2
胆酸(cholic acid，CA)促进猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖。
我们评估了单个胆汁酸(BA)在促进SADS-CoV复制方面的功效，方法是在回肠2D类器官中加入胆酸(cholic acid，CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺酸鹅脱氧胆酸(TCDCA)、甘氨酸鹅脱氧胆酸 (GCDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)或牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，同时接种SADS-CoV-GFP，具体操作步骤如图5所示。将3D类器官打散成单细胞悬液后接种于Matrigel预处理的96孔细胞板，在加入肠道类器官培养基中扩增分化后形成单层平面的2D形态。以MOI＝0.1的SADS-CoV-GFP 或MOI＝1的PEDV对PIE进行感染，同时加入各类BA，终浓度均为100μM。将培养板置于37℃摇床孵育1h后，弃去上清，PBS清洗3遍，加入含有对应浓度胆汁酸的培养基，放入37℃培养箱中继续培养。在感染后48小时收集上清并通过qRT-PCR和TCID50分别检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。
结果如图6所示，加入胆汁酸可导致病毒基因组增加约65倍，使病毒滴度增加约65倍。与未处理对照组(NT)相比，DCA或CDCA处理的猪肠道类器官也显示出病毒滴度增加，尽管其程度低于CA处理的回肠猪肠道类器官培养物。相比之下，TCDCA、GCDCA、UDCA或TUDCA几乎不支持SADS-CoV复制。丙酸对SADS-CoV的复制没有增强作用，为无关对照。
此外，使用不同浓度的CA对PIE进行处理，在感染后48h检测病毒增殖情况，结果发现CA以剂量依赖的方式支持SADS-CoV复制(图7)。使用间接免疫荧光在感染后48h检测病毒结构蛋白——核衣壳蛋白(N) 与SADS-CoV-GFP(使用GFP替换辅助蛋白ORF3)的共定位。结果如图 8所示，与对照组相比，CA处理组荧光强度显著增加，证明CA的处理促进了SADS-CoV结构蛋白及非结构蛋白的表达。
通过qRT-PCR和TCID50检测了对照组和CA处理组在感染后不同时间点的病毒基因组拷贝数和病毒滴度。结果如图9所示，在感染后1h，对照组组和CA处理组的病毒滴度并不存在差异，但在感染后6h，CA处理组的病毒滴度显著高于对照组，并且这种促进作用在后续的时间点均有体现。说明CA对于SADS-CoV-GFP的促进作用发生在感染的前6小时。

Claims (9)

1.胆汁酸在促进猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的应用，所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸的终浓度为100μM。
3.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒在猪肠道类器官上增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离猪回肠隐窝干细胞，猪回肠隐窝干细胞增殖并分化成3D肠类器官；
(2)将步骤(1)得到的3D肠类器官打散成单细胞后进行培养，获得单层肠类器官；
(3)将猪急性腹泻综合征冠状病毒接种到步骤(2)获得的单层肠类器官，同时在培养基中加入胆汁酸，所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸或鹅脱氧胆酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中猪回肠隐窝干细胞培养5～7天后，增殖并分化成3D肠类器官。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中取2-8日龄仔猪回肠，分离获得隐窝干细胞后，按体积比1∶1加入肠类器官培养基及Matrigel重悬后，接种到培养板上，待凝固后加入肠类器官培养基进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，肠类器官培养基的品牌为STEM CELL，货号06005；Matrigel的品牌为Corning，货号356231。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中培养3～5天后单细胞汇聚形成单层肠类器官。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在培养基中加入胆汁酸的终浓度为100μM。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入胆汁酸后培养时间不少于48h。
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