CN113039268A - 病毒感染的细胞系和动物模型的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备病毒感染的细胞系或动物模型的方法。根据本发明，由于通过胆汁酸或胆汁酸衍生物将病毒的脂质膜双层的包膜从人源的脂肪包膜变为目标动物模型来源的脂肪包膜，因此可以制备病毒感染的动物模型，其可以以临床上有用的方式使用而不受物种特异性的限制。此外，由于将病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合并在该细胞系的培养基中处理该混合物，因此该细胞系的制备方法可以获得非常高水平的被病毒感染的细胞系。另外，当使用本发明的细胞系的制备方法时，可以感染来源于各种物种和器官的细胞系，而不受病毒的物种特异性和特定组织的亲器官性的结合力的限制。

Description

病毒感染的细胞系和动物模型的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生产病毒感染的细胞系或动物模型的方法，更具体地，涉及一种使用包膜病毒生产病毒感染的细胞系或动物模型的方法，该包膜病毒的脂质双层已被目标动物的脂质双层替代。
背景技术
通常，病毒体(virion)是具有感染宿主细胞能力的病毒颗粒，它包括核心基因组，该基因组包含诸如DNA或RNA的遗传物质，以及衣壳(capsid)，该衣壳是一种蛋白质壳，其具有保护这种遗传物质的功能，并且在某些情况下，还包括包膜(envelope)。包括包膜的病毒类型包括DNA病毒，例如疱疹病毒(Herpesvirus)；RNA病毒，例如黄病毒(Flavivirus)和逆转录病毒(Retrovirus)等。
另一方面，引起肝炎的病毒(肝炎病毒)可以分为包膜病毒(B，C和D型)和非包膜病毒(A和E型)。估计乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,以下称为“HBV”)在世界范围内的感染率约为3.5亿，是一种典型的包括包膜的病毒，是导致慢性肝病的主要原因。HBV是具有属于嗜肝DNA病毒家族的DNA基因组的病毒，并引起急性和慢性肝炎。尤其是，HBV的患病率在某种程度上由于疫苗的开发而有所降低，在韩国和中国，慢性感染患者的比例已达到5％至8％。然而，事实是，由于母婴垂直HBV感染的持续爆发，仍有大量慢性肝炎患者存在。慢性HBV感染会导致肝癌以及肝炎和肝硬化。WHO的研究表明，大约80％的肝癌是由慢性乙型肝炎引起的，并且乙肝病毒感染者的肝癌发病率比非乙肝病毒感染者高约300倍。
基于HBV表面抗原(HBsAg)中两个表位(d/y，w/r)，将HBV分为8种基因型，其遗传碱基序列彼此相差约8％或更高，或分为4种血清型(adw，adr，ayw和ayr等)。由于作为肝炎病毒宿主的肝脏会诱导免疫耐受，因此即使在组织相容性错配的肝同种异体移植物中，该病毒也可以存活而不会被排斥。
另一方面，对于丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,以下称为“HCV”)，全世界约有1.7亿人感染了该病毒。其高感染率主要在发达国家。HCV感染与纹身，麻醉药品之类的药物施用和AIDS感染高度相关。大多数HCV感染具有慢性病程，并引起肝硬化和肝癌作为其并发症。HCV是一种RNA基因组病毒，是属于黄病毒科的肝炎病毒，分为六种基因型(1至6型)，将每种基因型分为多种亚型。HCV的这些亚型在感染HCV的患者中进一步分化，并具有表现出遗传多样性的准种(quasispecies)。
在慢性HBV感染的情况下，通过口服核苷类似物以抑制病毒增殖或通过将干扰素注射到感染的患者中来进行治疗。核苷类似物具有比干扰素更好的治疗效果，并且存在以下问题：长期使用核苷类似物会导致HBV对它产生耐药性，并且还可能导致HBV对其他药物产生交叉耐药性。另外，在HCV感染的情况下，在1990年代尝试了干扰素单药疗法，其治疗成功率仅为10％。在2000年代，聚乙二醇干扰素α和利巴韦林(ribavirin)的联合治疗使治疗成功率提高了约50％。但是，该疗法引起严重的药物不良反应，因此难以实现实际治疗。近来，已经开发了直接抗病毒剂(DAA)，并且口服此类药物3到6个月，可以获得约80％至90％的治疗成功率，而且几乎没有副作用。然而，由于DAA药物非常昂贵，因此存在这样的问题，即这些药物成为许多患者治疗的障碍，并造成巨大的社会成本损失。另外，迄今为止开发的HBV和HCV治疗剂存在问题，因为这些治疗剂最终不能杀死病毒，而仅抑制其增殖。
如上所述，尚未开发出能够最终杀死HBV和HCV的药物的原因是，没有利用体外细胞培养系统主动培养病毒的方法。另外，没有可用的方法能够通过感染传统上可用于感染实验的小尺寸的小动物如小鼠来产生动物模型。
由于这种情况，对于病毒，尚未准确确定病毒感染的生命周期。在这方面，对于HBV，尚未阐明破坏cccDNA的机制，而cccDNA是核内病毒基因组复制的模板。对于HCV，尚未阐明在感染患者中表现出遗传多样性的准种的机制。因此，尚未开发出完美和理想的抗病毒药物。
包括脂质双层包膜的病毒(如HBV和HCV)表现出物种特异性(或狭窄的宿主范围)和器官嗜性(tropism)，这使得在体外和小型动物中难以实现病毒感染和培养。因此，到目前为止，在病毒治疗剂的开发方面还没有进展。因此，迫切需要感染有包括HBV和HCV的包膜病毒的体外和小型动物模型，作为阐明这些病毒的生命周期和发病机理的工具。
在过去的几年中，在用于HBV和HCV的动物模型的开发中，已经取得了重大进展，例如能够感染病毒的嵌合动物模型的构建。然而，缺乏动物模型提出了一个问题，即没有临床上合适的方法来开发适用于病毒性肝炎疾病的治疗剂。具体地，由于HBV和HCV仅使用人和黑猩猩作为宿主，因此存在病毒具有如此有限的宿主范围的问题，这在产生体内模型和体外模型方面存在特别的困难。
技术问题
本发明的目的是提供一种产生病毒感染的细胞系模型的方法和由其产生的细胞系。
本发明的目的是提供一种产生病毒感染的动物模型的方法以及由其产生的动物模型。
本发明的另一个目的是提供一种病毒感染的细胞系；以及使用病毒感染的动物模型筛选治疗病毒性疾病的候选药物的方法。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。
解决问题的技术方案
首先，本发明人已经发现，在用胆汁酸或胆汁酸衍生物和包膜病毒的混合物处理细胞系的培养基的情况下，胆汁酸机械地扩大了细胞系的脂质双层，从而引起细胞膜破坏，从而不管病毒的物种特异性和组织特异性如何，都发生病毒感染。此外，本发明人已经发现，在以与上述相同的方式用包括脂质双层的包膜病毒感染源自目标动物的细胞系的情况下，可以产生与目标动物细胞系具有相同的脂质双层的包膜病毒，然后将由此产生的包膜病毒注射到目标动物中，有可能产生可以在临床上非常有效地使用的动物模型。从而完成了本发明。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种生产病毒感染的细胞系的方法。
本发明的细胞系的制备方法包括以下步骤：将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合；和将与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒添加到细胞系的培养基中。
如本文所用，“包含脂质双层的包膜病毒”是指包膜病毒，其包含含有遗传物质，例如DNA或RNA的核心基因组和衣壳，所述衣壳是起到保护这种遗传物质作用的蛋白质壳；和含有脂质双层的包膜。
在本发明中，包膜病毒可以包括任何病毒，只要该病毒还包括除了构成病毒本身的衣壳之外的包含脂质双层的包膜，其实例包括但不限于，以DNA为遗传物质的肝炎病毒，痘病毒，疱疹病毒等；以RNA作为遗传物质的冠状病毒，线状病毒，弹状病毒，沙粒病毒，黄病毒，逆转录病毒等。优选地，病毒可以是肝炎病毒，更优选乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。但是，病毒不限于此。
在本发明中，被包含脂质双层的包膜病毒感染的细胞系是指被该病毒感染的细胞系，例如即使在体外进行一定次数或一段时间的传代培养也能保持其特性的细胞系。优选地，细胞系可以被永生化，从而可以在体外连续传代培养。然而，本发明不限于此。
本发明的生产被包含脂质双层的包膜病毒感染的细胞系的方法包括以下步骤：将病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物体外混合，添加到培养的细胞系的培养基中。常规上，难以在体外用包膜病毒(包括脂质双层)诱导培养的永生化细胞系的感染。但是，在将胆汁酸或胆汁酸衍生物与病毒混合并将混合物用于处理永生化细胞系的培养基的情况下，细胞系的脂质双分子层膨胀，因此细胞膜被机械破坏。因此，即使在体外，也可以非常有效地诱导永生化细胞系被包含脂质双层的包膜病毒感染。
由于这种作用，有可能使用衍生自各种物种和组织的细胞系来产生病毒感染的细胞系模型，而不受限于病毒种类特异性和对特定组织具有嗜性的病毒特异性。
在本发明中，对于人而言，胆汁酸(bile acid)是由肝脏中的胆固醇合成的初级胆汁酸，其分为胆酸(cholic acid)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid)；大肠中的肠道细菌通过新陈代谢从初级胆汁酸中产生次级胆汁酸，其中胆酸被代谢成脱氧胆酸(deoxycholic acid)或鹅去氧胆酸被代谢成石胆酸(lithocholic acid)。另外，胆汁酸可以与肝脏中的甘氨酸或牛磺酸缀合，并因此转化为牛磺胆酸(taurocholic acid)和甘氨胆酸(glycocholic acid)(它们是胆酸的衍生物)，牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholicacid)和甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid)(它们是鹅去氧胆酸的衍生物)，甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)和牛磺脱氧胆酸(taurodeoxycholic acid)(它们是脱氧胆酸的衍生物)，或葡糖石胆酸(glycolithocholic acid)和牛磺石胆酸(taurolithocholic acid)(它们是石胆酸的衍生物)。另一方面，对于啮齿动物，鼠胆酸(muricholic acid)作为次级胆汁酸存在。
在本发明中，胆汁酸或胆汁酸衍生物可以是选自下组的任何的一种或多种：胆酸，鹅去氧胆酸，脱氧胆酸，石胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅去氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，葡糖石胆酸，牛磺石胆酸和鼠胆酸，优选牛磺鹅去氧胆酸或牛磺胆酸，其中更优选牛磺鹅去氧胆酸可用于HBV，牛磺胆酸或牛磺鹅去氧胆酸可以用于HCV。然而，本发明不限于此。
在本发明中，细胞系可以源自正常或癌组织并在体外传代培养，并且可以根据常规方法永生化。细胞系可以是例如选自下组的任何一种或多种：肝细胞系，肺细胞系，肾细胞系，肌肉细胞系，乳腺细胞系，免疫T细胞系，生殖细胞系，其可优选衍生自人或小鼠。然而，本发明不限于此。
在本发明中，人肝来源的细胞系可以是HepG2细胞系或Huh-7细胞系，小鼠肝来源的细胞系可以是Hepa1c1c7细胞系或H4-II-E细胞系。然而，本发明不限于此。
在本发明中，人源的永生化细胞系可以是，但不限于选自下组的任何一种或多种：属于肺癌细胞系的SNU-1327细胞系和A549细胞系，属于肾癌细胞系的A-498细胞系，属于乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞系，属于免疫T细胞系的Jurkat细胞系，属于宫颈癌细胞系的HeLa细胞系。
在本发明中，小鼠来源的永生化细胞系可以是，但不限于选自下组的任何一种或多种：LA-4细胞系(其是肺癌细胞系)，RAG细胞系(其是肾癌细胞系)，MTV/TM-011细胞系(其是乳腺癌细胞系)，EL4细胞系(其是免疫T细胞系)和LC540细胞系(其是睾丸癌细胞系)。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种病毒感染的细胞系。
本发明的病毒感染细胞系可以通过将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合，并向永生化细胞系的培养基中添加与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒。
本发明的病毒感染细胞系可以通过上述的制备方法来制备，因此，省略了与包含脂质双层，胆汁酸衍生物，永生细胞系，生产方法等的包膜病毒有关的细节的描述，以避免由于重复描述而导致说明书的过度复杂。
在本发明的又一个实施方式中，提供了一种筛选用于治疗病毒性疾病的治疗性候选物的方法。
用于筛选病毒性疾病的治疗性候选物的方法包括以下步骤：培养被包膜病毒感染的细胞系，所述包膜病毒包括本发明的脂质双层；向细胞系中添加病毒性疾病的治疗性候选物。
本发明的筛选方法中使用的病毒感染细胞系可以通过上述制备方法来制备，因此，省略了与包膜病毒有关的细节的描述，包括脂质双层，胆汁酸，胆汁酸衍生物，细胞系，生产方法等，以避免由于重复描述而使说明书过度复杂。
在本发明中，病毒性疾病是指其症状是由病毒感染引起的疾病，其中病毒感染具有嗜性的组织，从而在组织中引起病理变化。病毒性疾病可以包括任何疾病，只要该疾病引起组织的病理变化，并且可以优选地是病毒性肝炎。然而，病毒性疾病不限于此。
在本发明中，病毒性肝炎是由病毒感染引起的肝炎，并且存在乙型肝炎，其占肝炎患者的86％；以及丙型肝炎，其占肝炎患者的12％。乙型肝炎的病因分为垂直传播和获得性感染，在垂直传播中母婴感染发生在出生时，而获得性感染则在出生后发生。对于获得性感染，95％的感染者具有类似于感冒的症状，并且可以自然治愈；但是，有5％至10％的感染者无法治愈，可能会发展成慢性肝炎。相反，对于垂直传播，大多数感染者会发展成慢性肝炎。另一方面，丙型肝炎仅在约10％至15％的患者中是自限性的，与乙型肝炎相比相对较小，并且85％至90％以上的患者发展为慢性肝炎。在10％至20％的慢性肝炎患者中，诸如肝硬化或肝癌之类的疾病会在20至30年内发展。
在本发明中，对于病毒性疾病，通过血清学测试检查相关抗原和抗体来鉴定感染。因此，为了鉴定病毒性疾病的治疗性候选物是否具有治疗作用，本发明的筛选方法可以进一步包括在各病毒感染细胞系和已添加病毒性疾病的治疗性候选物的培养的病毒感染细胞系中，确定各培养的病毒感染细胞系中存在或不存在病毒基因组或表面抗原的步骤。
在本发明中，在已经添加了治疗性候选物的病毒感染的细胞系模型中，病毒基因组或存在的表面抗原的水平与病毒感染的细胞系相比降低了。可以选择候选药物作为病毒性疾病的治疗物质。
在本发明中，在鉴定病毒基因组或表面抗原存在或不存在的步骤中，可以在蛋白质或核酸水平上进行鉴定。
在本发明中，检测蛋白质或核酸水平的方法是已知的。可以通过例如抗原-抗体反应，与表面抗原特异性结合的底物，或与核酸，肽适体的反应等进行检测。
在本发明中，在病毒性疾病中，对于乙型肝炎，存在或不存在抗原，例如HBsAg抗原(其是表面抗原)，HBeAg抗原(其是分泌抗原)和作为核心抗原的HBcAg抗原可以通过已知的检测方法进行鉴定，例如荧光激活细胞分选，ELISA，Western印迹，时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和免疫组化；HBV DNA的存在与否可通过基因扩增实验(例如聚合酶链反应和实时聚合酶链反应)进行检测。然而，本发明不限于此。
在本发明中，对于丙型肝炎，可以通过已知的检测方法来鉴定HCV核心蛋白的检测以及抗HCV抗体的存在与否，并且可以通过基因扩增实验，比如，聚合酶链反应和实时聚合酶链反应来检测HCV RNA的存在与否。然而，本发明不限于此。
在本发明的又一个实施方式中，提供了一种生产病毒感染的动物模型的方法。
本发明的生产方法包括以下步骤：使包含脂质双层的包膜病毒的脂质层被源于目标动物的脂质层代替；将已经完成脂质层置换的病毒注射到目标动物体内。
如本文所用，“包含脂质双层的包膜病毒”是指这样的病毒，其包括含有诸如DNA或RNA的遗传物质的核心基因组，以及起到保护这种遗传物质的功能的蛋白质壳的衣壳；和含有脂质双层的包膜。
在本发明中，包膜病毒可以包括任何病毒，只要该病毒进一步包括除了构成病毒本身的衣壳之外的含有脂质双层的包膜，其实例包括但不限于，以DNA为遗传物质的肝炎病毒，痘病毒，疱疹病毒等；以RNA作为遗传物质的冠状病毒，线状病毒，弹状病毒，沙粒病毒，黄病毒，逆转录病毒等。优选地，病毒可以是肝炎病毒，更优选乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。但是，病毒不限于此。
在本发明中，使包含脂质双层的包膜病毒的脂质层被源于目标动物的脂质层代替的步骤可以通过以下步骤进行：将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合；将与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒添加到源于目标动物的永生化细胞系的培养基中。优选地，该步骤可以进一步包括从培养基中分离包含目标动物来源的脂质双层的包膜病毒的步骤。
根据本发明的上述生产方法，用目标动物来源的脂质层代替病毒的人源脂质层，这可以促进膜融合，从而引起跨物种感染。
在本发明中，分离包膜病毒的步骤可以通过常规方法，例如离心和色谱法进行。然而，本发明不限于此。
在本发明中，目标动物可以是人类以外的脊椎动物，并且可以优选地选自下组的任何一种或多种：小鼠，大鼠，兔，鸟，猫，狗，猪，绵羊，山羊，鹿，马和牛，最优选小或大鼠。然而，目标动物不限于此。
在本发明中，在使用除人类以外的脊椎动物的情况下产生病毒感染的动物模型的情况下，该动物模型可用于理解各种现象，例如病毒的感染途径和由病毒引起的疾病发展。由于动物模型在免疫系统等方面与人类相似，因此可以得出显著的结果。
在本发明中，细胞系可以源自上述动物的正常或癌组织并在体外传代培养，并且可以按照常规方法永生化。该细胞系可以是例如选自下组的任何一种或多种：肝细胞系，肺细胞系，肾细胞系，肌肉细胞系，乳腺细胞系，免疫T细胞系，生殖细胞系，优选为Hepa1c1c7(其为小鼠肝癌细胞系)，H4-II-E细胞系(其为大鼠肝癌细胞系)，LA-4细胞系(其为小鼠肺癌细胞系)，RAG细胞系(其为小鼠肾癌细胞系)，MTV/TM-011细胞系(其为小鼠乳腺癌细胞系)，EL4细胞系(其为小鼠免疫T细胞系)，LC54细胞系(其为小鼠睾丸癌细胞系)等。
在本发明中，对于人而言，胆汁酸是由肝脏中的胆固醇合成的初级胆汁酸，其分为胆酸和鹅去氧胆酸；大肠中的肠道细菌通过新陈代谢从初级胆汁酸中产生次级胆汁酸，其中胆酸被代谢成脱氧胆酸或鹅去氧胆酸被代谢成石胆酸。另外，胆汁酸可以与肝脏中的甘氨酸或牛磺酸缀合，并因此转化为牛磺胆酸和甘氨胆酸(它们是胆酸的衍生物)，牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸(它们是鹅去氧胆酸的衍生物)，甘氨脱氧胆酸和牛磺脱氧胆酸(它们是脱氧胆酸的衍生物)，或葡糖石胆酸和牛磺石胆酸(它们是石胆酸的衍生物)。另一方面，对于啮齿动物，鼠胆酸作为次级胆汁酸存在。
在本发明中，胆汁酸或胆汁酸衍生物可以是选自下组的任何的一种或多种：胆酸，鹅去氧胆酸，脱氧胆酸，石胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅去氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，葡糖石胆酸，牛磺石胆酸和鼠胆酸，优选牛磺鹅去氧胆酸或牛磺胆酸，其中更优选牛磺鹅去氧胆酸可用于HBV，牛磺胆酸或牛磺鹅去氧胆酸可以用于HCV。然而，本发明不限于此。
在本发明中，在与病毒混合的情况下，胆汁酸或胆汁酸衍生物可以以10至100μmol/L，优选50至100μmol/L，更优选80至100μmol/L的浓度使用。然而，本发明不限于此。如果胆汁酸的使用浓度低于10μmol/L，可能无法充分去除病毒包膜。并且，如果胆汁酸的使用浓度高于100μmol/L，病毒基因组的稳定性等会受到损害。
在本发明中，在将胆汁酸或胆汁酸衍生物与包括脂质双层的包膜病毒混合，并将该混合物添加至源自目标动物模型的细胞系的培养基中时，病毒的脂质双层包膜被源自目标动物模型的脂质层替代，因此该病毒能够感染人类以外的动物而没有物种特异性。
在本发明的又一个实施方式中，提供了一种病毒感染的动物模型。
在本发明中，动物模型可以通过以下来生产：制备除人以外的目标动物，使包含脂质双层的包膜病毒的脂质双层包膜被源于目标动物的脂质双层包膜代替，然后向目标动物中注射已经完成脂质层包膜置换的病毒。
在本发明中，可以将病毒注射到目标动物的静脉，例如尾静脉中。然而，本发明不限于此。
在本发明中，可以通过上述生产方法来生产动物模型，因此，省略了与包膜病毒有关的细节的描述，包括脂质双层，胆汁酸，胆汁酸衍生物，细胞系，靶动物，生产方法等，以避免由于重复描述而导致说明书过于复杂。
在本发明的又一个实施方式中，提供了一种筛选用于治疗病毒性疾病的治疗候选物的方法。
本发明的用于筛选病毒性疾病的治疗性候选物的方法包括以下步骤：饲养本发明的病毒感染的动物模型；和向动物模型中添加病毒性疾病的治疗性候选物。
本发明的筛选方法中使用的感染了病毒的动物模型可以通过上述制备方法来制备，因此，为了避免由于重复描述而导致说明书的过度复杂性，省略了与包含脂质双层，胆汁酸衍生物，永生化细胞系，靶动物，生产方法等的包膜病毒有关的细节的描述。
在本发明中，病毒性疾病是指由病毒感染引起的感染，其中病毒感染具有嗜性的组织，从而在组织中引起病理变化。如上所述，病毒性疾病可以包括任何疾病，只要该疾病引起组织中的病理变化，并且可以优选病毒性肝炎。然而，病毒性疾病不限于此。
在本发明中，病毒性肝炎是由病毒感染引起的肝炎，并且存在乙型肝炎，其占肝炎患者的86％；以及丙型肝炎，其占肝炎患者的12％。乙型肝炎的病因分为垂直传播和获得性感染，在垂直传播中母婴感染发生在出生时，而获得性感染则在出生后发生。对于获得性感染，95％的感染者具有类似于感冒的症状，并且可以自然治愈；但是，有5％至10％的感染者无法治愈，可能会发展成慢性肝炎。相反，对于垂直传播，大多数感染者会发展成慢性肝炎。另一方面，丙型肝炎仅在约10％至15％的患者中是自限性的，与乙型肝炎相比相对较小，并且85％至90％以上的患者发展为慢性肝炎。在10％至20％的慢性肝炎患者中，诸如肝硬化或肝癌之类的疾病会在20至30年内发展。
在本发明中，对于病毒性疾病，通过血清学测试检查相关抗原和抗体来鉴定感染。因此，为了鉴定病毒性疾病的治疗性候选物是否具有治疗作用，本发明的筛选方法可以进一步包括在分别饲养的病毒感染动物模型中和已添加病毒性疾病的治疗性候选物的培养的病毒感染细胞系中，确定各培养的病毒感染细胞系中存在或不存在病毒基因组或表面抗原的步骤。
与本发明的饲养病毒感染的动物模型相比，在添加了治疗性候选物的病毒感染的动物模型中，病毒基因组或存在的表面抗原的水平降低的情况下，可以选择候选物作为病毒性疾病的治疗物质。
在本发明中，在鉴定病毒基因组或表面抗原存在或不存在的步骤中，可以在蛋白质或核酸水平上进行鉴定。
在本发明中，检测蛋白质或核酸水平的方法是已知的。可以通过例如抗原-抗体反应，与表面抗原特异性结合的底物，或与核酸，肽适体的反应等进行检测。
在本发明中，在病毒性疾病中，对于乙型肝炎，存在或不存在抗原，例如HBsAg抗原(其是表面抗原)，HBeAg抗原(其是分泌抗原)和作为核心抗原的HBcAg抗原可以通过已知的检测方法进行鉴定，例如荧光激活细胞分选，ELISA，Western印迹，时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和免疫组化；HBV DNA的存在与否可通过基因扩增实验(例如聚合酶链反应和实时聚合酶链反应)进行检测。然而，本发明不限于此。
在本发明中，对于丙型肝炎，可以通过已知的检测方法来鉴定HCV核心蛋白的检测以及抗HCV抗体的存在与否，并且可以通过基因扩增实验，比如，聚合酶链反应和实时聚合酶链反应来检测HCV RNA的存在与否。然而，本发明不限于此。
本发明的有益效果
根据本发明，对于病毒的人源性脂质双层包膜，胆汁酸或胆汁酸衍生物使得将人源性脂质层替换为目标动物模型来源的脂质层，从而可以产生病毒感染的细胞系或动物模型，其可以在临床上有效使用，而不受物种特异性的限制。
附图说明
图1示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活的细胞分选来鉴定HepG2细胞系中的HBV的HbcAg所获得的结果，所述HepG2细胞系是人肝癌细胞系。
图2示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活细胞分选鉴定Hepa1c1c7细胞系中HBV的HbcAg所获得的结果，所述Hepa1c1c7细胞系是小鼠肝癌细胞系。
图3和图4示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活细胞分选鉴定A498细胞系或RAG细胞系中的HBV的HbcAg所获得的结果，所述A498细胞系是人肾癌细胞系，RAG细胞系是小鼠肾癌细胞系。
图5和图6示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活细胞分选鉴定作为人乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞系或作为小鼠乳腺癌细胞系的MTV/TM-011细胞系中的HBV的HbcAg所获得的结果。
图7示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活细胞分选鉴定Jurkat细胞系中的HBV的HbcAg所获得的结果，Jurkat细胞系是人免疫T细胞系。
图8示出了本发明的一个实施方式的通过荧光激活细胞分选鉴定HeLa细胞系中HBV的HbcAg所获得的结果，所述HeLa细胞系是人子宫细胞系。
图9至图16示出了本发明的一个实施方式的免疫染色结果。
图17至图22示出了本发明的一个实施方式的通过对病毒感染的动物模型的器官进行H&E染色而获得的结果。
发明详述
在本发明的一个实施方式中，提供了一种生产病毒感染的细胞系的方法，该方法包括以下步骤：将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合；以及向细胞系的培养基中加入与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种产生病毒感染的动物模型的方法，该方法包括以下步骤：准备除人以外的目标动物；使包含脂质双层的包膜病毒的脂质层被源于目标动物的脂质层替代；以及将已经完成脂质层置换的病毒注射到目标动物体内。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
[制备实施例1]肝炎病毒的分离
从原州市遣散基督教医院(伦理委员会批准号：CR316312)获得正常血清(乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)阴性)和肝炎病毒感染的血清(HBV或HCV阳性)。
将上述各血清添加到装有3ml缓冲液的试管中，该缓冲液含有20g/L的蔗糖，50mmol/L的Tris-HCl(pH 7.5)和30mmol/L的NaCl。将混合物以220000g离心1小时。然后，从试管中取出上清液，并将5ml磷酸盐缓冲液(PBS)溶液添加到试管中，以稀释HBV或HCV。然后，使用罗氏公司的COBAS TaqMan系统通过实时PCR测定稀释液中所含的HCV RNA或HBVDNA，以确定分离出的病毒的浓度。
[制备实施例2]细胞系培养
实施例中使用的细胞系购自韩国细胞系库，并使用韩国细胞系库指定的培养基和培养方法进行细胞培养。
对于啮齿动物细胞系，使用以下细胞系：小鼠C57L(美国杰克逊实验室)衍生的Hepa1c1c7细胞系或H4-II-E细胞系，其是肝癌细胞系；RAG是肾癌细胞系；EL4是免疫T细胞系；LC540是睾丸癌细胞系；以及LA-4是肺癌细胞系。
对于人细胞系，使用了以下细胞系：HepG2或Huh-7，其是肝癌细胞系；A-498是肾癌细胞系；MDA-MB-231是乳腺癌细胞系；A549是肺癌细胞系；Jurkat是免疫T细胞系；HeLa是子宫癌细胞系。作为对照，使用作为肝细胞系的PLC/PRF5细胞系。
在此，解冻后，将细胞传代培养3次以稳定细胞，然后培养24小时。此后，进行肝炎病毒感染。
[实施例1]病毒感染细胞系模型的制备
为了制备包膜病毒感染的细胞系模型，将制备实施例1中分离的HBV(1×106拷贝/ml/孔的HBV)与100μmol/L的牛磺鹅去氧胆酸(以下称为“tCDCA”)混合，并且将制备实施例1中分离的HCV(1×106IU/ml/孔的HCV)与tCDCA或牛磺胆酸(以下称为“tCA”)混合。在这里，tCA与HCV混合并用于感染小鼠肝细胞。在所有其他情况下都使用了tCDCA。
5×106个细胞/ml的细胞系(HepG2，Huh-7，A549，A-498，MDA-MB-231，Jurkat，HeLa，Hepa1c1c7，EL4，H4-I I-E，LA-4，LC540或RAG细胞系)分配到6孔板的每个孔中，并培养24小时。然后，向其中添加与HBV或HCV混合的tCDCA或tCA溶液，并进一步培养24小时。在此，作为对照组，使用仅添加了HBV或HCV而没有tCDCA或tCA溶液。然后，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤3次，并用不含病毒的细胞培养基(DMEM)代替培养基。最后，用100μmol/L的tCDCA或tCA处理细胞培养基，并进一步培养3天，从而制备病毒感染的细胞系模型(以下称为“感染的细胞系”)。
[实施例2]通过HBV验证感染的细胞系
在实施例1中产生的每种HBV感染的细胞系和从中收集的培养基中，测定存在的HBsAg和HBV DNA的水平。此处，HBsAg的测定通过制造商提供的实验方法，使用ElecsysHBsAg II CLIA试剂盒(REF：07251076119，瑞士罗氏)进行，HBV DNA的测定是通过使用罗氏公司的COBAS TaqMan系统的专门检验机构(韩国Biogeno有限公司，韩国)进行的。
另外，使用抗HBcAg抗体进行了FACS分析，以测量存在的HBcAg水平。具体地，将100μl/孔的抗HBcAg抗体(10E11)(目录号为MA1-7608；美国赛默飞世尔)添加至微量ELISA板中，并使反应在4℃下进行过夜。然后，另外向其中加入200μl/孔的1X ELISA/ELISPOT稀释剂(Invitrogen，美国)，并使反应进行1小时。将实施例1中产生的每种感染HBV的细胞系分配到已经完成反应的每个孔中，并使反应进行2小时。然后，将用100μl的1X ELISA/ELISPOT稀释剂以1∶30的比例稀释的抗HBcAg抗体(10E11)加入到板中，并使反应进行1小时。然后，使与100μl的HRP缀合的抗兔IgG的另外反应进行30分钟。为了检测HBcAg，使用了FACSCalibur，其结果示于表1和表2。这里，作为阳性对照，使用了PLC/PRF5细胞系(释放HBV表面抗原的人肝脏来源的细胞系)，并测定其中存在的HBsAg和HBcAg的水平。
[表1]
Figure BDA0003039778650000151
[表2]
Figure BDA0003039778650000152
如表1和表2所示，鉴定出在人类肝癌细胞系HepG2和小鼠肝癌细胞系Hepa1c1c7的培养基中检测到HBsAg和HBcAg，并且其中至少存在100拷贝的HBV DNA。同样，作为通过FACS检测HBV的HBcAg的结果，如基因组水平所示，已确定该细胞系感染了tCDCA处理的HBV。
此外，可以确定，在源自人和小鼠肝脏以外的各种器官的各细胞系(A498，MDM-MB-231，Jurkat，HeLa，H4-II-E，RAG，EL4和LC540)的培养基中检测到HBsAg和HBcAg，并且其中存在HBV DNA。
从以上结果可以看出，在将人和小鼠肝癌细胞系的细胞培养基分别与胆汁酸或胆汁酸衍生物和HBV一起处理的情况下，可以诱导HBV感染细胞系。这表明胆汁酸或胆汁酸衍生物可以消除HBV的物种特异性(或狭窄的宿主范围)和器官嗜性，从而诱导HBV感染源自肝脏以外的各种物种和组织的细胞系。
[实施例3]通过HCV验证感染的细胞系
在实施例1中，在实施例1中制备的各HCV感染的细胞系和从中收集的培养基中，测定存在的HCV核心和HCV RNA的水平。具体地，通过请求使用罗氏公司的COBAS TaqMan系统的专门检验机构(韩国Biogeno有限公司，韩国)进行HCV RNA的测定。结果示于表3和表4。此处，作为对照，使用仅用HCV处理而无胆汁酸衍生物处理的组。
[表3]
Figure BDA0003039778650000161
[表4]
Figure BDA0003039778650000162
如表3和表4所示，鉴定出HCV RNA以1000IU/ml或更高的浓度存在于各人类肝癌细胞系HepG2细胞系和小鼠肝癌细胞系Hepa1c1c7细胞系的培养基中。另外，已鉴定出在人和小鼠来源的细胞系中也检测到HCV RNA，所述细胞系来自肝脏以外的器官。
从以上结果可以看出，与HBV的结果相似，在用胆汁酸或胆汁酸衍生物和HCV一起处理各人和小鼠肝癌细胞系的细胞培养基的情况下，可以诱导HCV感染细胞系。此外，可以看出胆汁酸或胆汁酸衍生物可以消除HCV的物种特异性或狭窄的宿主范围和器官嗜性，从而诱导HCV感染源自各种物种和组织的细胞系。
从实施例2和3中描述的结果，可以看出，在用胆汁酸或胆汁酸衍生物和HBV或HCV一起处理细胞系的情况下，胆汁酸或胆汁酸衍生物使细胞系的脂质双层膨胀，从而引起细胞膜的机械破坏，从而可以非常有效地诱发肝炎病毒感染。
[实施例4]源自小鼠肝癌细胞系的病毒的产生
为了制备包膜病毒感染的动物模型，将制备实施例1中分离的HBV(1×108拷贝/ml/孔的HBV)或HCV(1×108IU/ml/孔的HCV)与100μmol/L的tCDCA混合。
将Hepa1c1c7细胞系以1×105个细胞/ml分配到6孔板中，并培养24小时。然后，向其中加入与HBV或HCV混合的tCDCA溶液，并进一步培养24小时。在此，作为对照，使用仅添加了tCDCA溶液的组。然后，用PBS溶液洗涤3次，并用不含病毒的细胞培养基代替培养基。随后，进一步进行培养3天。然后，以与制备实施例1相同的方式，从获自Hepa1c1c7细胞系的培养基中分离病毒。
在这里，在分离出的病毒中，脂质双层包膜被替换为来自Hepa1c1c7细胞系中的一种。因此，将这些病毒分别命名为源自小鼠肝癌细胞系的HBV(以下称为“cHBVcc”)和源自小鼠肝癌细胞系的HCV(以下称为“cHCVcc”)。然后，使用COBAS TaqMan系统(瑞士罗氏)通过实时PCR检测相应病毒的浓度。
[实施例5]cHBVcc和cHCVcc的病毒稳定性
在确定它们的交叉感染性之前，在各种环境中检测实施例4中获得的cHBVcc和cHCVcc的病毒稳定性。
用cHBVcc或cHCVcc处理人血清(HS)，小鼠血清(MS)和细胞系的培养基，然后以与实施例2相同的方式测定血清或培养基中存在的HBsAg和HBV DNA的水平。结果示于表5中。在此，使用慢性肝炎患者的血清作为对照。
[表5]
Figure BDA0003039778650000171
如表5所示，可以看出，与对照相比，已经实现了用小鼠肝癌细胞系来源的脂质双层替代的cHBVcc，显示出阴性的表面抗原性，并且基因组数量大大减少。然而，基因组的数量对应于远远高于最小感染剂量的值，因此就病毒包膜状态而言，甚至cHBVcc也显示出稳定性，因此cHBVcc可以非常有效地感染目标动物，例如人或小鼠。
[实施例6]同种异体细胞中病毒交叉感染的鉴定
[6-1]鉴定cHBVcc的交叉感染性(1)
在Hepa1c1c7细胞系中鉴定了实施例4中获得的cHBVcc的交叉感染性。具体地，用混合溶液(cHBVcc+tCDCA)处理Hepa1c1c7细胞系，所述混合溶液通过将实施例4中的cHBVcc与100μmol/L的tCDCA或cHBVcc混合而获得，然后以与实施例2相同的方式测定HBsAg和HBVDNA。结果示于表6中。在此，作为对照，使用制备实施例1中获得的HBV(野生型HBV)。
[表6]
Figure BDA0003039778650000181
如表6所示，在Hepa1c1c7细胞系中，在用野生型HBV处理的情况下未发生感染，在与tCDCA的混合物处理的情况下，则会发生感染。
此外，已经确定在Hepa1c1c7细胞系中，即使在没有tCDCA(cHBVcc)的情况下，用其脂质双层被来自Hepa1c1c7细胞系的脂质双层代替的cHBVcc处理，也发生了cHBVcc感染。
从以上结果中，可以看出，即使在不存在胆汁酸或胆汁酸衍生物的环境中，使用胆汁酸或胆汁酸衍生物已经实现了脂质双层包膜的替换的病毒可以感染其他同种异体细胞，而且可以非常有效地感染对应于与细胞相同种类的动物。
[6-2]鉴定cHCVcc的交叉感染性(2)
在Hepa1c1c7细胞系中鉴定了实施例4中获得的cHCVcc的交叉感染性。具体地，用通过将实施例4中的cHCVcc与100μmol/L的tCDCA或cHCVcc混合而获得的混合溶液(cHCVcc+tCDCA)处理Hepa1c1c7细胞系，然后以与实施例3相同的方式测定HCV RNA。结果示于表7。在此，作为对照，使用制备实施例1中得到的HCV(野生型HCV)。
[表7]
Figure BDA0003039778650000191
如表7所示，已经确定，在Hepa1c1c7细胞系中，仅注射野生型HCV的情况下，未发生野生型HCV的感染，而用tCDCA混合物处理的情况下，则会发生感染。。
此外，已经确定在Hepa1c1c7细胞系中，即使在不存在tCDCA的情况下，用其脂质双层被来自Hepa1c1c7细胞系的脂质双层代替的cHCVcc处理，也发生了感染。
从以上结果可以看出，即使在不存在胆汁酸或胆汁酸衍生物的环境中，使用胆汁酸或胆汁酸衍生物已经实现了脂质双层包膜的替换的病毒可以感染异种细胞，而且可以非常有效地感染一种物种与衍生细胞的物种相同的动物。
[6-3]交叉感染性的鉴定(3)
向HepG2细胞系中加入通过将制备实施例1中分离的HBV(1×108拷贝/ml/孔的HBV)或HCV(1×108IU/ml/孔的HCV)与100μmol/L的tCDCA混合得到的溶液。然后，进行与实施例4相同的方法，以得到已完成脂质双层包膜替换的HBV和HCV。然后，用100μmol/L胆汁酸混合溶液(HBV+tCDCA或HCV+tCDCA)处理HepG2细胞系，然后以与实施例2和实施例3相同的方式测定HBsAg和HBV DNA或HCV RNA的水平。结果示于表8和9。
[表8]
Figure BDA0003039778650000192
[表9]
Figure BDA0003039778650000193
如表8所示，在tCDCA存在下，用脂质双层包膜来自HepG2细胞系的HBV感染了HepG2细胞系，从而在其中检测到HBsAg和HBV DNA。此外，如表9所示，已鉴定出HepG2细胞系被脂质双层包膜来源于HepG2细胞系的HCV感染，因此其中存在182IU/ml的RNA。
从以上结果可以看出，使用胆汁酸或胆汁酸衍生物已经实现了脂质双层包膜的替换的病毒可以非常有效地感染同种异体细胞。
[6-4]交叉感染性的鉴定(4)
向HepG2细胞系中加入通过将制备实施例1中分离的HBV(1×108拷贝/ml/孔的HBV)或HCV(1×108IU/ml/孔的HCV)与100μmol/L的tCDCA混合得到的溶液。然后，进行与实施例4相同的方法，以得到已完成脂质双层包膜替换的HBV和HCV。然后，用100μmol/L胆汁酸混合溶液(HBV+tCDCA或HCV+tCDCA)处理Hepa1c1c7细胞系，然后以与实施例2和实施例3相同的方式测定HBsAg和HBV DNA或HCV RNA的水平。结果显示在表10和11中。
[表10]
Figure BDA0003039778650000201
[表11]
Figure BDA0003039778650000202
如表10和11所示，在tCDCA存在下，用脂质双层包膜来自HepG2细胞系的HBV感染了Hepa1c1c7细胞系，从而在其中检测到HBsAg和HBV DNA。此外，如表11所示，已鉴定出Hepa1c1c7细胞系被脂质双层包膜来自HepG2细胞系的HCV感染，因此其中存在182.3IU/ml的RNA。
从以上结果可以看出，使用胆汁酸或胆汁酸衍生物已经实现了脂质双层包膜的替换的病毒可以感染异种细胞，并且还可以感染一种物种不同于衍生细胞的物种的动物。
[6-5]交叉感染性的鉴定(5)
向Hepa1c1c7细胞系中加入通过将制备实施例1中分离的HBV(1×108拷贝/ml/孔的HBV)或HCV(1×108IU/ml/孔的HCV)与100μmol/L的tCDCA混合得到的溶液。然后，进行与实施例4相同的方法，以得到已完成脂质双层包膜替换的HBV和HCV。然后，用100μmol/L的胆汁酸混合溶液(HBV+tCDCA或HCV+tCDCA)处理HepG2细胞系，然后以与实施例2和实施例3相同的方式测定HBsAg和HBV DNA或HCV RNA的水平。结果示于表12和13。
[表12]
Figure BDA0003039778650000211
[表13]
Figure BDA0003039778650000212
如表12所示，在tCDCA存在下，用脂质双层包膜来自Hepa1c1c7细胞系的HBV感染了HepG2细胞系，从而在其中检测到HBsAg和HBV DNA。此外，如表13所示，鉴定出Hepa1c1c7细胞系被脂质双层包膜衍生自HepG2细胞系的HCV感染，因此其中存在300IU/ml的RNA。
从以上结果可以看出，使用胆汁酸或胆汁酸衍生物已经实现了脂质双层包膜的替换的病毒可以非常有效地感染同种异体细胞。
[实施例7]HBV和HCV病毒感染的动物模型的制备和验证
将实施例4中制备的cHBVcc或cHCVcc以100μl(1×108基因组当量)的量注射到小鼠C57L的尾静脉中，并且将小鼠饲养1周以产生病毒感染的动物模型(以下称为“感染动物”)。在此，作为对照，使用了以100μl的量注射了人来源的野生型HBV的小鼠。
[7-1]血清中的病毒测试
从每只被感染的动物获得血清，并测定血清中存在的HBsAg和HBV DNA的水平。在此，作为对照，使用来自小鼠的血清，其中小鼠注入了具有人源性脂质双层包膜的野生型HBV。以与实施例2和3相同的方式进行HBsAg和HBV DNA或HCV RNA的测定，结果示于表14和15。
[表14]
Figure BDA0003039778650000221
[表15]
Figure BDA0003039778650000222
如表14所示，确定感染动物血清中HBsAg的水平为1.2指数，并且HBV DNA以585拷贝/ml存在。另外，如表15所示，可以确定，对于HCV RNA，对照显示为15IU/ml或更低，而mHCVcc显示为180IU/ml。
从以上结果可以看出，注射cHBVcc和cHCVcc可以在诸如人以外的物种如小鼠的小动物中诱导HBV感染。
[7-2]肝功能测试
在被感染的动物中，为了检查是否发生了由病毒感染引起的肝炎，通过本领域的常规方法进行了肝功能测试，其中测定了血清中的丙氨酸氨基转氨酶(ALT)的水平。
结果，注射cHBVcc的感染动物的ALT被测为150U/L。
从以上结果可以看出，由于正常ALT值为34或更低，注射cHBVcc可以在作为被感染动物的小鼠中引起HBV感染，表明在被感染动物中已经发生肝炎。
[7-3]组织活检
从感染的动物切下肝组织，用10％福尔马林固定，然后包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成4μm厚的切片，并进行补液和石蜡去除。然后，通过常规方法对切片进行H&E染色，结果示于图9至16。
如图9和14所示，由于在肝实质的多个部位观察到单核细胞(淋巴细胞)的浸润增加，并且在门静脉周区域也观察到单核细胞的浸润和球囊状的肿块(balloon-shapedmass)，因此确认发生了炎症。这类似于人类急性乙型肝炎的组织学发现。
如图15和图16所示，已经确定单核细胞(淋巴细胞)浸润到回肠的绒毛中。
从以上结果可以看出，本发明的cHBVcc可以感染啮齿动物，并且这种感染可以导致由HBV感染引起的在肾和髂的组织以及肝组织中的急性炎症。
[7-4]免疫染色试验
从感染的动物切下肝组织，用10％福尔马林固定，然后包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成4μm厚的切片，并进行补液和石蜡去除。然后，组织与抗HBcAg的抗体反应，HBcAg是HBV核心抗原，并与第二抗体结合，该第二抗体结合了可以可视化的物质(生物素)。然后，用Hoechst 33258染色15分钟。然后，通过50％甘油进行固定，并在显微镜下进行观察。结果在图9至图14中示出。
如图17至22所示，已经确定在肝细胞，肾细胞和回肠绒毛细胞中，细胞质被染成棕色。
从以上结果可以看出，通过使用本发明的动物模型的制备方法，可以非常有效地制备可以在临床上有效使用的动物模型而不受物种特异性的限制，这是因为将人源性病毒脂质层替换为目标动物模型源性脂质层。
尽管已经详细描述了本发明的具体部分，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些具体描述仅针对优选实施方式提供，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实质范围应由所附权利要求书及其等同物来限定。
工业适用性
根据本发明，对于人源的病毒脂质层，胆汁酸或胆汁酸衍生物可以将脂质层替换为目标动物模型来源的脂质层。从而可以制备病毒感染的细胞系或动物模型，其可以在临床上有效使用，而不受物种特异性的限制。因此，在工业上的可应用性在于细胞系和动物模型可用于非常有效地筛选由包括脂质双层包膜的病毒引起的疾病的治疗剂，从而显著降低与其相关的社会成本。

Claims (27)

1.一种制备病毒感染的细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合；和
向细胞系的培养基中加入与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其中制备病毒感染的细胞系的方法在体外进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中包括脂质双层的包膜病毒是肝炎病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述胆汁酸衍生物是选自以下的任意一种或多种：鹅去氧胆酸，脱氧胆酸，石胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅去氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，葡糖石胆酸，牛磺石胆酸和鼠胆酸。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞系是选自下组的任意一种或多种：：肝细胞系，肺细胞系，肾细胞系，肌肉细胞系，乳腺细胞系，免疫T细胞系和生殖细胞系。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞系衍生自人或小鼠。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述人源细胞系是HepG2。
9.一种病毒感染的细胞系，其通过将包含脂质双层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合，并将与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒添加到细胞系的培养基中而产生。
10.如权利要求9所述的细胞系，其中所述包膜病毒是肝炎病毒。
11.一种制备病毒感染的动物模型的方法，包括以下步骤：
准备除人以外的目标动物；
使包含脂质双层的包膜病毒的脂质层被源于目标动物的脂质层替代；和
向目标动物中注射已经完成脂质层替换的病毒。
12.如权利要求11所述的方法，其中通过以下步骤进行使包括脂质双层的包膜病毒的脂质层被源于目标动物的脂质层替代的步骤：
将包含脂质层的包膜病毒与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合；和
将与胆汁酸或胆汁酸衍生物混合的病毒添加到源于目标动物的细胞系的培养基中。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述目标动物是人以外的脊椎动物。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述脊椎动物是选自下组的任意一种或多种：小鼠，大鼠，兔子，鸟，猫，狗，猪，绵羊，山羊，鹿，马和牛。
15.如权利要求11所述的方法，其中，包括脂质层的包膜病毒是肝炎病毒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
17.如权利要求12所述的方法，其中，所述胆汁酸衍生物是选自下组的任意一种或多种：鹅去氧胆酸，脱氧胆酸，石胆酸，牛磺胆酸，甘氨胆酸，牛磺鹅去氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，葡糖石胆酸，牛磺石胆酸和鼠胆酸。
18.一种病毒感染的动物模型，其是通过制备除人以外的目标动物而制备的；使包含脂质双层的包膜病毒的脂质双层包膜被源于目标动物的脂质双层包膜代替；以及将已经完成脂质双层包膜替换的病毒注射到目标动物体内。
19.如权利要求18所述的方法，其中包括脂质双层包膜的包膜病毒是肝炎病毒。
20.一种筛选病毒性疾病的治疗候选物的方法，包括以下步骤：
培养权利要求9所述的病毒感染的细胞系；和
向所述细胞系中添加病毒性疾病的治疗候选物。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述病毒性疾病是病毒性肝炎。
22.如权利要求20所述的方法，还包括：
在每个培养的病毒感染的细胞系和已添加治疗候选物的病毒感染的细胞系中，鉴定是否存在病毒基因组或抗原的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中，与培养的病毒感染的细胞系相比，在已经添加了治疗候选物的病毒感染的细胞系中病毒基因组或存在的表面抗原的水平降低的情况下，选择该候选物作为病毒性疾病的治疗物质。
24.一种筛选病毒性疾病的治疗候选物的方法，包括以下步骤：
饲养权利要求18所述的病毒感染的动物模型；和
向病毒感染的动物模型中添加病毒性疾病的治疗候选物。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述病毒性疾病是病毒性肝炎。
26.如权利要求24所述的方法，还包括：
在每个饲养的病毒感染的动物模型和已添加治疗候选物的病毒感染的动物模型中，鉴定是否存在病毒基因组或抗原的步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其中，与饲养的病毒感染的动物模型相比，在添加了治疗候选物的病毒感染的动物模型中，病毒基因组或存在表面抗原的水平降低的情况下，选择该候选物作为病毒性疾病的治疗物质。
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