CN1545550A - 含泡沫逆转录病毒包膜蛋白的感染性嗜肝dna病毒颗粒的制备及其使用方法 - Google Patents

含泡沫逆转录病毒包膜蛋白的感染性嗜肝dna病毒颗粒的制备及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产生在体外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，此方法包括：(a)将(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体和(ii)包含编码泡沫病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸的泡沫逆转录病毒包膜表达载体导入细胞；(b)培养该细胞从而产生含有泡沫病毒包膜至少一个片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中所述嗜肝DNA病毒毒粒在体外具有感染性。本发明还提供了测定抗嗜肝DNA病毒药物敏感性的方法，测定来源于被感染病人的嗜肝DNA病毒复制能力的方法，及鉴定嗜肝DNA病毒核酸中与抗嗜肝DNA病毒药物抗性相关的突变的方法。

Description

含泡沫逆转录病毒包膜蛋白的感染性嗜肝DNA 病毒颗粒的制备及其使用方法
本申请要求2001年6月21日提交的美国临时申请No.60/299,906的权益，该申请的内容在本文引入作为参考。
在本申请的正文中，以作者和日期的形式引用了各种出版物。在说明书之后，权利要求书之前以字母顺序列出了这些出版物的完整引文。包括前文和后文中引用的所有专利、专利申请和出版物都作为一个整体在此引入作为参考。为了更全面地介绍本发明完成时技术人员所了解的本技术领域现状，这些专利申请的内容也作为一个整体在本申请中引用作为参考。
背景技术
HBV复制
原代培养的肝细胞及数种肝癌细胞系中HBV全长DNA分子克隆的瞬时表达可以产生B型肝炎病毒(HBV)颗粒。这种方式产生的病毒颗粒与受HBV感染个体中的感染性病毒毒粒(Dane颗粒)相似，它们的感染性已在黑猩猩上得到证实。不幸的是，此类体外细胞系统产生的HBV颗粒不能有效地感染体外培养的肝细胞系(如HepG2细胞系)，使HBV复制研究和抗病毒药物研发受到限制。
与此相似，正如美国专利NO.6,242,187所述，利用HBV耐药试验载体产生的HBV病毒颗粒不能感染靶宿主细胞，此点在建立HBV双细胞药物敏感性分析方法时也是一大障碍。感染受阻的原因尚不清楚，可能它反映了目前可用肝细胞系的表面上缺乏功能性HBV受体，但也有数据支持其他解释。HBV受体至今仍未得以鉴定。
因此，需要建立合适的手段和方法，以便产生可以感染体外培养的肝细胞系的嗜肝DNA病毒颗粒。另外，也需建立合适的手段和方法来产生嗜肝DNA病毒颗粒，并使用这种嗜肝DNA病毒颗粒在一种宿主细胞和一种靶细胞——即体外双细胞体系中进行药物敏感性及抗性试验、病毒适合度分析和基因型分析。
发明概述
相应地，本发明的一个目的是提供一种产生可以感染体外维持的(maintained)肝细胞系的嗜肝DNA病毒颗粒的方法。
本发明的另一目的是提供一种利用感染性嗜肝DNA病毒颗粒在双细胞体系中进行药物敏感性和抗性试验的方法。
本发明的另一目的是提供一种利用感染性嗜肝DNA病毒颗粒在体外进行药物敏感性和抗性试验的方法，其中产生可检测信号来测定感染性。
本发明的另一目的是提供一种上述的在体外进行药物敏感性和抗性试验的方法，其利用含有来源于病人的片段、具有感染性的嗜肝DNA病毒颗粒。
本发明的另一目的是提供一种利用感染性嗜肝DNA病毒颗粒测定病人嗜肝DNA病毒复制能力的体外方法。
本发明的另一目的是提供一种鉴定嗜肝DNA病毒中赋予化合物抗性的突变的方法，所述化合物可以抑制嗜肝DNA病毒的复制。
本发明可以通过制备一种在体外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒(virion)达到本发明的上述及其它目的，所述制备包括：(a)将(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，和(ii)包含编码泡沫病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸的泡沫逆转录病毒包膜表达载体，导入细胞，和(b)培养该细胞，从而产生至少含有泡沫病毒包膜蛋白一个片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中病毒毒粒在体外具有感染性。
附图简述
图1-HBV指示性基因病毒载体
图2-HBV抗性试验载体
图3-HBV及HFV包膜蛋白的组构
发明详述
本发明提供了：制备具体外感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，该方法包括：
(a)将(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，和(ii)包含编码至少泡沫病毒包膜蛋白一个片段的核酸的泡沫逆转录病毒包膜表达载体导入细胞，和
(b)培养该细胞，从而产生至少含有泡沫病毒包膜蛋白一个片段的嗜肝DNA病毒，其中该病毒毒粒在体外具有感染性。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体缺失编码嗜肝DNA病毒包膜蛋白的核酸。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体包含来源于嗜肝DNA病毒基因组的至少一个基因，所述基因组选自以下基因组：土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因组、黄鼠肝炎病毒(GSHV)基因组、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)基因组、雪雁肝炎病毒(SGHV)基因组及人乙型肝炎病毒(HBV)基因组。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体包含来源于人乙型肝炎病毒(HBV)基因组的一个基因。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包含一外源调控元件。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中外源调控元件为人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中泡沫逆转录病毒包膜表达载体包含来源于泡沫病毒基因组的基因的至少一个片段，所述基因组选自以下基因组：猿猴(siman)泡沫病毒(SFV)基因组、猫泡沫病毒(FFV)基因组、牛泡沫病毒(BFV)基因组、海狮泡沫病毒(SLFV)基因组、仓鼠泡沫病毒(HaFV)基因组和人泡沫病毒(HFV)基因组。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述基因编码包膜蛋白或其片段。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中泡沫逆转录病毒包膜表达载体包含来源于人泡沫病毒(HFV)基因组的一个基因或其片段。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中来源于人泡沫病毒(HFV)基因组的基因或基因片段编码gp130env包膜基因产物或其片段。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中细胞为哺乳动物细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中细胞为鸟类细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中鸟类细胞为鸟类肝细胞(hepacyte)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
在进一步的实施方案中，提供了上述方法，本发明提供了上述方法，其中人类细胞为人胚肾细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中哺乳动物细胞为293细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中人类细胞为人肝癌(hepatoma)细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中人肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在体外具有感染性的嗜肝DNA病毒颗粒，它包含泡沫逆转录病毒包膜蛋白的至少一个片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒是分离的。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，其中泡沫逆转录病毒选自以下病毒：猿猴泡沫病毒(SFV)、猫泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海狮泡沫病毒(SLFV)、仓鼠(hampster)泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒包含嵌合包膜蛋白，所述嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白结构域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白结构域组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒还包含从嗜肝DNA病毒感染者分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，其中从嗜肝DNA病毒感染者分离的核酸编码一种逆转录酶。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种嗜肝DNA病毒毒粒，嗜肝DNA病毒颗粒还包含了指示性核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞，其中细胞为哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞，其中哺乳动物细胞为293细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞，其中人类细胞为人肾细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含嗜肝DNA病毒毒粒的细胞，其中人类细胞为人肝癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种测定抗嗜肝DNA病毒药物的敏感性的方法。该方法包括：
(a)向第一细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的第一细胞以产生嗜肝DNA病毒毒粒；
(c)将步骤(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒与第二细胞混合，其中将抗嗜肝DNA病毒药物加入第一或第二细胞中，或加入第一和第二细胞中。
(d)测定第二细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量，其中可检测信号的量取决于嗜肝DNA病毒毒粒对第二细胞的感染；和
(e)将步骤(d)中测定到的信号量与无药物存在时测得的信号量相比较，其中在药物存在的情况下，如果信号量下降说明对药物敏感，如果信号量无变化或上升则说明对药物产生抗性。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中步骤(a)的嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包含了来源于嗜肝DNA病毒感染的病人的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因中至少一个片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中基因是HBV P基因、HCV C基因、HBV X基因或HBV S基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸编码逆转录酶。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中第二细胞为哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中第二细胞为鸟类细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中鸟类细胞为鸟类肝细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中人类细胞为人胚肾细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中哺乳动物细胞为293细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中人类细胞为人肝癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中人肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中泡沫逆转录病毒选自以下病毒：猿猴泡沫病毒(SFV)、猫泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海狮泡沫病毒(SLFV)、仓鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中步骤(a)(i)的核酸编码gp130env包膜蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中(a)(i)的核酸编码嵌合的包膜蛋白，其主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白结构域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白结构域组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了上述的敏感性测定方法，其中第二细胞在其表面表达一种蛋白质，该蛋白质可与人泡沫病毒包膜蛋白结合。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种测定来源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的复制能力的方法，该方法包括：
(a)向第一细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的细胞以产生嗜肝DNA病毒毒粒；
(c)将步骤(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒与第二细胞混合；
(d)测定第二细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量，其中可检测到的信号量取决于嗜肝DNA病毒毒粒对第二细胞的感染；
(e)将步骤(d)的测量值标准化(normalizing)；和
(f)将步骤(e)标准化后的测量值与采用对照参比嗜肝DNA病毒经步骤(a)至(d)而测得的信号量相比较，其中与对照组相比，信号量上升意味着来源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的复制力增强，信号量降低意味着来源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的复制力下降。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种测定抗嗜肝DNA病毒药物敏感性的方法，该方法包括：
(a)向第一细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的细胞；
(c)将细胞与抗嗜肝DNA病毒药物接触；
(d)测定细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量；和
(e)将步骤(d)所测得的信号量与不存在药物的条件下测得的信号量相比较，其中药物存在时信号量降低说明对药物敏感，信号量无变化或升高则说明对药物有抗性。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中步骤(a)中的嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包括来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中来源于受嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一个片段。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中基因为HBVP基因或HBV C基因。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种鉴定嗜肝DNA病毒中与抗嗜肝DNA病毒药物抗性相关的突变的方法，该方法包括：
(a)在应用抗嗜肝DNA病毒药物前对嗜肝DNA病毒核酸进行测序；
(b)依据第50项权利要求的方法测定步骤(a)中测序的嗜肝DNA病毒对药物的敏感性；
(c)将该嗜肝DNA病毒与药物相接触，使步骤(b)中测量的嗜肝DNA病毒对药物的敏感性降低；
(d)将步骤(a)测定的序列与步骤(c)中嗜肝DNA病毒接触药物后所测定的序列相比较，以鉴定嗜肝DNA病毒核酸中与抗嗜肝DNA病毒药物抗性相关的突变。
在进一步的实施方案中，本发明提供了上述方法，其中测量步骤(b)包括使用双细胞分析法测定经步骤(a)测序的嗜肝DNA病毒对抗嗜肝DNA病毒药物的敏感性。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种通过利用来源于人泡沫病毒(HFV)的包膜蛋白使HBV病毒毒粒伪型化(pseudotyping)来制备感染性人乙型病毒(HBV)颗粒的方法。
本发明的另一实施方案提供了一种通过利用来源于HBV和HFV包膜蛋白中特定功能结构域的嵌合包膜蛋白进行伪型化来制备感染性HBV颗粒的方法。
本发明的进一步实施方案包括利用人泡沫病毒包膜蛋白，或来源于嗜肝DNA病毒和人泡沫病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制备其他各种嗜肝DNA病毒。举例来说，其他嗜肝DNA病毒包括土拨鼠肝炎病毒(WHV)、黄鼠肝炎病毒(GSHV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、雪雁肝炎病毒(SGHV)及人乙型肝炎病毒(HBV)和其他从猫、啮齿类、有袋动物和鸟类分离出来的文献资料不多的嗜肝DNA病毒，但并不仅限于这些。
本发明的其他实施方案包括利用各种其他泡沫病毒包膜蛋白，或来源于嗜肝DNA病毒和各种其他泡沫病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制备嗜肝DNA病毒的方法。所述其他泡沫病毒包括猿猴泡沫病毒(SFV)、猫泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海狮泡沫病毒(SLFV)、仓鼠泡沫病毒(HaFV)，但并不仅限于这些。
本发明的其他实施方案包括利用逆转录病毒包膜蛋白，或来源于嗜肝DNA病毒和逆转录病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制备HBV或其他各种嗜肝DNA病毒的方法。举例来说，其他逆转录病毒包括但不限于下列病毒：
(i)B型逆转录病毒(鼠乳腺瘤病毒)；
(ii)哺乳类C型逆转录病毒(亲嗜性鼠白血病病毒、双嗜性鼠白血病病毒、长臂猿白血病病毒、猫白血病病毒、B亚群)；
(iii)鸟肉瘤/白血性增生(leukosis)逆转录病毒(A、B/E、D亚群)；
(iv)D型逆转录病毒(Mason-Pfizer猴病毒、猿猴逆转录病毒1和2)；
(v)人T细胞白血病病毒(I型和II型)和牛白血病病毒；
(vi)慢病毒(1型及2型人类免疫缺陷病毒、马感染性贫血病毒、冰岛病毒(maedi virus)/绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒)；
(vii)鱼逆转录病毒(大眼梭鲈鱼白血病及肉瘤病毒、黑鱼逆转录病毒)；
(viii)果蝇逆转录病毒(gypsy)
本发明的其他实施方案包括：利用来源于其他各种包膜病毒的包膜蛋白或来源于嗜肝DNA病毒和其他各种包膜病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制备嗜肝DNA病毒的方法。举例来说，其他具包膜的病毒包括披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、弹状病毒、丝状病毒、副粘液病毒、正病毒(orthoviruses)、布尼亚病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、虹色病毒和轮状病毒，但并不限于这些。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种测定HBV和其他各种嗜肝DNA病毒复制能力的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法以测定HBV和其他各种嗜肝DNA病毒对抑制HBV逆转录酶及其他嗜肝DNA病毒逆转录酶的药物的敏感性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定HBV逆转录酶及其他嗜肝DNA病毒逆转录酶的新的和/或另外的抑制剂的方法。
本发明中测定HBV复制能力的手段(means)和方法可应用于鉴定新型HBV复制抑制剂，其中HBV复制包括但不局限于抑制cccDNA形成、毒粒装配及从细胞中排出。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定HBV P基因中突变的方法，所述突变使HBV对逆转录酶抑制剂的敏感性发生变化。
本发明中用于鉴定改变对逆转录酶抑制剂敏感性的突变的手段和方法可适用于HBV复制的其他步骤，包括但不局限于cccDNA形成、毒粒装配及从细胞中排出。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定HBV P基因中改变HBV复制能力或“适合度(fitness)”的突变的一种方法。
本发明用于鉴定HBV P基因中改变复制能力的突变的方法可用于鉴定其他HBV基因(核心(C)，表面(S)和反式激活(X))中改变HBV复制能力的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过测定HBV药物敏感性来指导HBV感染患者抗病毒治疗的方法
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过测定HBV复制能力来指导治疗抗HBV药物治疗失败的患者的方法。
用来源于泡沫逆转录病毒的包膜蛋白制备伪型化的嗜肝DNA病毒毒粒，就可以实现本发明中的实施方案。
泡沫病毒(foamy virus或spumavirus)的复制
嗜肝DNA病毒(包括HBV)和逆转录病毒的复制途径有些相似，二者均包装基因组长度的RNA，利用逆转录酶(RT)生成的双链(ds)DNA作为病毒基因在受感染细胞中的转录模板。泡沫病毒(亦称为泡沫病毒)是逆转录病毒种中一个非典型的逆转录病毒属，其复制途径的多个方面都与其他逆转录病毒属不同。值得注意的是，泡沫病毒复制中这些不同寻常的方面与包括HBV在内的嗜肝DNA病毒的复制特征非常相似，这也反应了嗜肝DNA病毒和泡沫病毒间共同的进化性联系。据报道泡沫病毒可感染来源于多种哺乳动物及鸟类的多种细胞，提示泡沫病毒受体是一种普遍表达的细胞表面蛋白。
嗜肝DNA病毒和泡沫病毒复制间的相似性
嗜肝DNA病毒和逆转录病毒在复制过程中均利用RT。在嗜肝DNA病毒的复制过程中，RT将包装好的单链前基因组RNA转录成双链基因组DNA的转化过程发生于病毒颗粒进入新的宿主细胞之前。相较之下，在逆转录病毒的复制过程中，逆转录步骤发生于病毒进入细胞之后。
最近的研究表明，和其它所有已知的逆转录病毒不同，约有10％～15％泡沫病毒颗粒包含基因组长度的双链DNA(Yu等，1996，“泡沫病毒的复制——一种不同于嗜肝DNA病毒和逆转录病毒的复制途径”， Science271：1579-1582；Yu等，1999，“有证据证明人泡沫病毒基因组是DNA”，J.Virol.70：1250-1254)。在此类逆转录病毒中，病毒颗粒感染新细胞前明显有逆转录发生，因而与嗜肝DNA病毒复制过程中的RT步骤类似。
在新感染的细胞中，嗜肝DNA病毒和逆转录病毒均产生大量的病毒核心蛋白。对于嗜肝DNA病毒来说核心蛋白为C蛋白，而对于逆转录病毒来说，核心蛋白包括了含基质(MA)、衣壳(CA)和核壳(NC)等蛋白功能域的Gag多聚蛋白。嗜肝DNA病毒和泡沫病毒的核心蛋白瞬时定位到细胞核。而其他逆转录病毒的从头合成的核心蛋白(Gag多聚蛋白)仅存在于受感染细胞的胞浆内。除了泡沫病毒外，所有逆转录病毒Gag多聚蛋白的NC域都有一高度保守的半胱氨酸-组氨酸(Cys-His)基序，该基序对于NC与逆转录病毒基因组RNA的结合及包装是必需的(Berkowitz等，1996，RNA的包装，Curr.Top.Microbiol.Immunlo.214：177-218)。泡沫病毒Gag多聚蛋白的NC域缺乏Cys-His基序，但有数个富含甘氨酸和精氨酸的区域(Gly-Arg)(Schliephake等，1994，泡沫病毒前Gag蛋白的核定位，J.Virol.68：4946-4954.。Yu等，1996，人泡沫病毒Gag蛋白的羧基端包含可分离的核酸结合域和核转运域，J.Virol.70：8255-8262)。其中一个区域具有充当核定位信号的功能。嗜肝DNA病毒的核心蛋白(C蛋白)中存在相似的Aly-Arg基序，它可能在RNA的包装和C蛋白的核定位中发挥重要作用(HattonT等，1992，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的RNA及DNA结合活性：一种测定其在病毒复制中作用的模型，J.Virol.66：5232-5241.Nassal，M，1992，乙型肝炎核心蛋白中富含精氨酸域对于将基因组包入衣壳和有效的病毒正链DNA合成是必需的，但对于病毒的装配并非必需，J.Virol.66：4107-4116)。
除了泡沫病毒外，所有已知逆转录病毒都以Gag-Pol多聚蛋白的形式表达pol基因(RT和整合酶(IN)蛋白)。(Jacks，T，1990.逆转录病毒基因表达中的翻译抑制和逆转座子，p.93-124；In R.Swanstrom和P.K.Vogt(ed)，逆转录病毒：复制策略，Springer-Veriag，Berlin，Germany.)。相较之下，泡沫病毒以与Gag多聚蛋白分离的形式表达其Pol蛋白，这一点与嗜肝DNA病毒的Pol表达类似(YU S.F.等，1996，人泡沫病毒的复制——一种与逆转录病毒及嗜肝DNA病毒不同的途径，Science 271：1579-1582；Lochelt，M.等，1991，含全长人泡沫逆转录病毒基因组的感染性DNA克隆的构建和bel-1基因的诱变，Virology 184：43-54；YU S.F.等，1996，人泡沫病毒对造血细胞的有效持续性感染，J.Virol.，vol.70：1250-1254)。
泡沫病毒颗粒的形成只在胞浆内发生，但随病毒不同其精确的定位可能不同。除泡沫病毒之外，所有已知逆转录病毒从细胞表面出芽，从质膜获得外层包膜。相较之下，泡沫病毒和嗜肝DNA病毒从内质网膜(ER)出芽，从细胞内区室获得包膜。后者可能解释了为什么在很大程度上嗜肝DNA病毒和泡沫病毒均与细胞相连，而其他逆转录病毒易于从细胞脱离出来。Zeraba等，1998，人泡沫病毒Gag前体中p3Gag域的羧末端为病毒高效感染所必需，Virology 247：7-13；Yu S.F.等，1993，利用新型定量方法分析人泡沫病毒中bel和bet开放阅读框的作用，J.Virol.67：6618-6624。
在颗粒形成之前及形成期间，嗜肝DNA病毒和逆转录病毒均在宿主细胞特定的区室内富集特定的包膜蛋白，该区室为病毒包膜外膜的来源。对于嗜肝DNA病毒来说，这些包膜蛋白为由S基因(大、中、小S基因)编码的三表面蛋白，对于逆转录病毒来说则是由包膜基因(env)编码的表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)。据报道，嗜肝DNA病毒的S蛋白和泡沫病毒TM蛋白含有将其定位于内质网区室的分选基序。Goepfer P.A.等，1997，将人泡沫病毒多聚蛋白定位于内质网的分选基序，J.Virol.71：778-784；T.Kamimura等和P.Roingeard，1990。除了泡沫病毒，在已知的逆转录病毒中，即使不是全部，也有许多病毒env蛋白的表达对于病毒毒粒从细胞排出来说可有可无(虽然env缺失的颗粒无感染性)。相较之下，感染性的泡沫病毒颗粒从细胞排出依赖于env基因的表达(4和22)。类似地，感染性嗜肝DNA病毒毒粒的装配依赖于S基因产物的表达。更为特别的说，出芽需要大S蛋白的适当表达。表中Bruss & Ganum，1991。
泡沫病毒和嗜肝DNA病毒共有的特征在表1中总结列出。
至于人乙型肝炎病毒，通过瞬时转染培养的细胞而产生的HBV颗粒在体内具有感染性，但在体外无感染性。感染受阻可能是因为细胞表面缺乏合适的HBV受体。相较之下，人泡沫病毒(HFV)可感染的宿主范围广泛，可感染大量不同的细胞系。说明HFV受体可能是一种普遍表达的细胞表面蛋白。
HBV和HFV的复制途径在颗粒的装配和出芽方面具有一些相似的特征。本发明介绍了利用HBV之类嗜肝DNA病毒和HFV之类逆转录病毒之间复制途径的相似处，来绕过嗜肝DNA病毒在细胞培养中感染性受限这一障碍的手段和方法。在一个优选的实施方案中，可用HFV包膜蛋白或包含HBV和HFV包膜蛋白特定功能域的嵌合蛋白产生HBV颗粒，使之能够利用人泡沫病毒受体进入大量不同类型的细胞。
本文所用的“嗜肝DNA病毒基因组表达载体”是指包含嗜肝DNA病毒基因组至少一个片段、导入合适的细胞系之后能够瞬时转录嗜肝DNA病毒RNA并产生嗜肝DNA病毒蛋白的载体。
“泡沫逆转录病毒包膜表达载体”是指包含泡沫逆转录包膜基因至少一个片段、并在导入合适的细胞系之后可瞬时产生泡沫逆转录病毒包膜蛋白的载体。
“指示性核酸”是指这种核酸能够直接产生或通过反应产生可测定或可观测特征或可检测信号，比如可检测波长的颜色或光，或DNA或RNA充当指示剂时特定DNA或RNA结构的改变或产生。首选的指示性基因实例是编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因；来源于诸如photonis pyralis(荧火虫)和Renilla reniformis(三色堇)的、编码荧光素酶的1uc基因；编码碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白的大肠杆菌phoA基因及编码氯霉素乙酰转移酶的细菌性CAT基因。其他首选的指示性基因实例是易于用放射免疫测定法(RIA)、荧光激活细胞分选法(FACS)之类方法测定的分泌蛋白或细胞表面蛋白，举例来说包括生长因子、细胞因子和细胞表面抗原(如分别为生长激素、IL-2、CD4)。“指示性基因”还包括一个选择性基因，也称为选择性标记物。举例来说，适当的基因哺乳动物细胞选择性标记物是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、潮霉素、新霉素、zeocin或大肠杆菌gpt。对于上述的指示性基因实例来说，指示性基因与病人来源的片段是独立的，即不同的、单独的基因。在某些情况下病人来源的片段也用作指示性基因。在病人来源的片段与用作抗病毒靶点的多个病毒基因相对应的实施方案中，其中一个基因可以用作指示性基因。
正如美国专利NO.6,242,187所述，指示性核酸或指示性基因可能具有一定功能，也可能无功能。
“嗜肝DNA病毒指示性载体”或“指示性基因病毒载体”是指具有嗜肝DNA病毒基因组元件和一个指示性基因如荧火虫荧光素酶，并能瞬时转录RNA的DNA载体。RNA包含了将RNA病毒装配入嗜肝DNA病毒毒粒、利用嗜肝DNA病毒聚合酶将RNA转录物逆转录和表达指示性基因所需的信号/元件。
“包装宿主细胞”或“第一细胞”是指支持嗜肝DNA病毒基因组表达载体和泡沫逆转录病毒包膜表达载体瞬时表达的细胞。
“靶细胞”或“第二细胞”是指表达泡沫逆转录病毒包膜受体的细胞，由泡沫逆转录病毒伪型化的嗜肝DNA病毒毒粒一旦通过泡沫逆转录病毒受体进入该细胞，该细胞即能支持嗜肝DNA病毒的复制。“由泡沫逆转录病毒伪型化的嗜肝DNA病毒毒粒”指包含有一个或多个来源于泡沫逆转录病毒的蛋白质的嗜肝DNA病毒毒粒。
本文所用的“病人来源的片段”包括来源于人和各种动物种属的核酸片段。这些种属包括但不局限于黑猩猩、马、牛、猫和狗。
可利用数种可替换克隆技术中任何一种技术将病人来源的片段插入上述的载体中，如嗜肝DNA病毒表达载体。举例来说，通过将II类限制性位点同时引入质粒骨架和病人来源的片段、或通过尿嘧啶DNA糖基化酶引物克隆、或利用重组方法或无缝克隆等方法所做的克隆。
可使用任何分子克隆或基因扩增方法获得病人来源的片段。如下所述，在欲引入嗜肝DNA病毒表达载体之类载体的病人来源片段末端引入病人序列接头位点，对其进行修饰。举例来说，在诸如PCR之类的基因扩增方法中，在PCR反应中所用引物的末端引入与病人序列接头位点相对应的限制性位点。类似地，在诸如cDNA克隆之类的分子克隆方法中，将所述的限制性位点引入到用于合成第一链或第二链cDNA的引物末端；或对克隆或未克隆的DNA进行引物-修复之类的方法中，将所述限制性位点引入修复反应所用引物的末端。病人序列接头位点也可以是病人来源片段和嗜肝DNA病毒表达载体间进行同源重组或互补退火的区域。设计病人序列接头位点和引物是为了提高病人来源片段的表现度(representation)。设计有病人序列接头位点的多组载体可以提供单个载体不能提供的、病人来源片段的表现度。
本文所用的“复制能力”在这里定义为病毒复制情况的量度，亦称之为病毒适合度。在一个实施方案中，可以通过评价病毒复制一轮的能力来测定复制能力。
本文所用的“对照抗性试验载体”定义为包含一段标准肝DNA病毒(如HBVayw)序列和一个指示性基因的抗性试验载体。
本文所用的“标准化”定义为相对于引发指示性基因表达的病毒颗粒的数目，对所测定的指示性基因表达量加以标准化。例如，将测得的荧光素酶活性值除以感染时测得的病毒颗粒数来进行标准化。
“质粒”和“载体”用小写p后接字母和/或数字来命名。这里起始的质粒可以从不受限制的商业途径、公共途径获得，或可依据已发表的方法从现有质粒构建。另外，与那些所描述质粒等效的质粒在该技术领域都是已知的，对于普通的技术人员是直观的。
本发明使用该技术领域熟知的常规连接技术及限制性酶切技术构建载体(参见Ausubel等，1987，当代分子生物学操作规程，WileyInterscience；或Maniatis等，1992，分子克隆：实验手册，Cold ApringHarbor Laboratory)。对提取的质粒、DNA序列或人工合成的寡聚核苷酸依所需的形式进行切割、加尾和连接。可以通过DNA测序分析对所有引入合成DNA的DNA结构进行确认(Sanger等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci，74，5463-5467)。
产生具有来源于泡沫病毒的包膜蛋白的、具有感染性的伪型化嗜肝DNA病毒毒粒的方法的建立，导致了使用体外细胞分析嗜肝DNA病毒的方法的建立。这些分析方法包括但不局限于药物敏感性及抗性试验、病毒适合度试验和鉴定与药物抗性相关的嗜肝DNA病毒突变的基因型分析。
下文提供的实施例对本发明作进一步说明和解释，这些实施例对本发明不作任何限制。
                       实施例1
利用来源于人泡沫病毒的包膜蛋白伪型化乙型肝炎病毒
本实施例提供了产生可感染原代培养物和已建立细胞系HBV病毒毒粒的手段和方法，其中这些细胞表达人泡沫病毒(HFV)受体。此处提供的手段和方法描述了将HFV包膜蛋白引入HBV外膜，及感染可受HFV感染——即细胞表面表达有HFV受体的靶细胞的过程。以此法产生的HBV颗粒通与HFV受体结合并与之相互作用进入细胞，从而绕过了HBV的正常进入途径，据认为该途径涉及到HBV表面蛋白(S)和宿主细胞上一种仍未得以鉴定的HBV受体。普遍认为HBV不能感染培养细胞很可能是由于粘附和/或侵入等步骤受阻。本实施例中利用HFV包膜蛋白伪型化产生感染性HBV的手段和方法适用于其他嗜肝DNA病毒，其中一些可以充当HBV疾病的有用动物模型，如鸭嗜肝DNA病毒、土拨鼠嗜肝DNA病毒。另外，实施例中利用HFV包膜蛋白伪型化产生感染性HBV的手段和方法适用于利用其他泡沫病毒、逆转录病毒和各种具包膜病毒的包膜蛋白将HBV和其他嗜肝DNA病毒伪型化。
用于生成HFV包膜蛋白伪型化的HBV颗粒并成功感染所培养细胞的系统涉及到下列组分：
(i)HBV基因组表达载体：包含HBV基因组的DNA载体，
该载体在导入合适的细胞系后能瞬时转录HBV RNA并产生HBV蛋白。
(ii)HBV指示性载体：包含HBV基因组元件和一个指示性基因如荧火虫荧光素酶基因，并能完成RNA瞬时转录的DNA载体。该RNA包含将RNA装配入HBV病毒毒粒、利用HBV聚合酶将RNA转录物逆转录及表达指示性基因所必需的信号/元件。
(iii)HFV包膜表达载体：包含HFV包膜基因的DNA载体，在导入合适的细胞系后该载体能瞬时产生HFV包膜蛋白。
(iv)包装宿主细胞或第一细胞：能支持HB V基因组表达载体和HFV包膜表达载体瞬时表达的细胞。
(v)靶细胞或第二细胞：表达HFV包膜受体的细胞，一旦经HFV伪型化的HBV颗粒进入，该细胞即能支持HBV的复制。
HBV基因组表达载体在导入包装宿主细胞后能产生HBV颗粒。HBV调控元件、来源于其他物种的外源调控元件如人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)可以调控HBV的基因表达。在本发明的一个优选实施方案中，用人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)调控HBV基因组的表达。HBV基因组表达载体也可含有指示性基因，如荧火虫荧光素酶基因。在这种情况下，该载体称为“HBV指示性基因病毒载体”或更一般的“指示性基因病毒载体”。指示性基因为利用宿主包装细胞中所产生病毒感染后靶细胞感染性的测定提供了一种敏感、便利的机制。靶细胞中指示性基因的产物量即荧光素酶活性，是HBV完成单轮复制的一个直接指标。通过以各种其他来源的HBV基因序列(如P基因逆转录酶序列)置换HBV指示性基因病毒载体中特定的HBV基因序列的方法，HBV指示性基因病毒载体可用于构建“HBV抗性/适合度试验载体”。这些来源可以包括携带有药物敏感性或抗性HBV病毒株(如对拉米夫定耐药或敏感的病毒，[3TC])的病人样品和具明确RT序列的HBV分子克隆，其中该RT序列包含或缺失与药物抗性相关的突变(M550V)。
HFV包膜表达载体包含HFV包膜基因区，用于产生HFV包膜基因产物(gp130env)。gp130env是一种多聚蛋白，它在细胞质的区室内被细胞的“弗林样”蛋白酶切割为成熟的包膜表面部分(gp80SU)和跨膜部分(gp48TM)。SU和TM共同在HFV的识别及进入宿主细胞的过程中起作用。将HFV包膜表达载体随HBV基因组载体一同引入宿主包装细胞导致病毒外膜中含HFV包膜蛋白的HBV病毒毒粒(伪型化的病毒颗粒)的产生。包括但不限于CMV-IE启动子/增强子或HFV启动子/增强子的各种调控元件可以调控HFV包膜在宿主细胞中的表达。在本发明的一个优选实施方案中，通过将HFV包膜基因区插入一含CMV-IE启动子/增强子的表达载体(如pCXAS，Petropoulos等，1999，完整引用)中完成HFV包膜表达载体的装配。
包装宿主细胞可包括大量各种人类或哺乳动物细胞系如人胚肾细胞(HEK293)和人肝癌细胞(HepG2，Huh7)，但并不局限于这些。理想的包装宿主细胞在引入HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体DNA后可瞬时产生大量经HFV伪型化的HBV病毒毒粒。
靶细胞可包括原代细胞和细胞系，更特别的说包括原代肝细胞及肝源细胞系，包括但并不仅限于HepG2和Huh7细胞(ref)。理想的靶细胞表面表达HFV受体，能支持HBV复制过程中病毒粘附和侵入的下游步骤。
为了产生感染性的HBV病毒颗粒，将HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体共同导入宿主包装细胞。数天后，收集宿主包装细胞产生的HFV伪型化HBV颗粒，接种宿主细胞。接种数天后，测定靶细胞的感染性。可利用包括但不限于磷酸钙-DNA沉淀法、电穿孔法的各种非常完善的操作方法实现HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体的导入。可利用包括但不限于检测HBV抗原(基于抗体的Western印迹及ELISA检测)、HBV核酸(如PCR、RT-PCR、Northern印迹及Southem印迹检测)的方法完成HBV对靶细胞的感染性测定。
在本发明的一个优选实施方案中，使用CMV-IE启动子/增强子调控HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体。HBV基因组表达载体含有一个荧光素酶指示性基因。包装宿主细胞为HEK293。利用磷酸钙-DNA沉淀法将HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体导入包装宿主细胞。每种载体DNA制剂的用量为5～10微克。转染后，包装细胞孵育24～72小时。收集并冻融细胞及培养基以便释放与细胞相联的病毒毒粒。将培养基离心并过滤，滤液作为感染宿主靶细胞的HFV伪型化HBV原种。靶细胞为HepaG2或Huh7。感染后48～72小时，裂解受感染的细胞，测定裂解液中的荧光素酶活性。受感染细胞中测得的荧光素酶活性值作为HBV完成单轮复制的直接指标。
                    实施例2
利用来源于人泡沫病毒和乙型肝炎病毒的嵌合包膜蛋白将乙型肝炎病毒伪型化
本实施例提供了一种手段和方法以产生可感染原代培养细胞及表达人泡沫病毒(HFV)受体的已建立细胞系的HBV病毒毒粒。此处提供的手段和方法描述了将HBV/HFV嵌合包膜蛋白整合入HBV外膜，并感染可受HFV感染——即表面表达有HFV受体的靶细胞的过程。用此法产生的HBV病毒毒粒通过与HFV受体结合并相互作用侵入细胞，从而绕过了HBV的正常进入途径，据认为该途径涉及到HBV表面蛋白(S)和宿主细胞中一种仍未得以鉴定的HBV受体。普遍认为HBV不能感染培养细胞很可能是由于粘附和/或侵入等步骤受阻。基于此实例，很明显的，利用HBV/HFV嵌合包膜蛋白伪型化方法产生感染性HBV的方法适用于伪型化其他含来源于其他泡沫病毒、逆转录病毒和各种具包膜病毒的HBV和其他嗜肝DNA病毒。
用于生成HFV包膜蛋白伪型化的HBV颗粒和成功感染培养的细胞的系统涉及到了下列组分：
HBV基因组表达受体：包含HBV基因组的DNA载体，该载体在导入合适的细胞系后能瞬时转录HBV RNA，并产生HBV蛋白；
HBV指示性基因病毒载体：包含HBV基因组元件和一个指示性基因如荧火虫荧光素酶基因的DNA载体，并能完成RNA的瞬时转录。其中该RNA包含将RNA装配入HBV病毒毒粒、利用HBV聚合酶将RNA逆转录及表达指示性基因所必需的信号/元件；
HBV/HFV嵌合包膜表达载体：含有编码HBV/HFV嵌合包膜的基因序列的DNA载体，在导入合适的细胞系后能瞬时生成HBV/HFV嵌合包膜蛋白；
包装宿主细胞：能支持HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体瞬时表达的细胞。
靶细胞：表达HFV包膜受体的细胞，一旦HBV/HFV嵌合包膜伪型化的HBV颗粒进入，该细胞支持HBV的复制。
在导入包装宿主细胞后，HBV基因组表达载体能产生HBV颗粒。HBV调控元件、来源于其他物种的外源调控元件如人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)可能调控HBV的基因表达。在本发明的一个优选实施方案中，用人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)调控HBV基因组的表达。HBV基因组表达载体也可含有指示性基因，如荧火虫荧光素酶基因。在这种情况下，该载体称为“HBV指示性基因病毒载体”(图1)。指示性基因为利用宿主包装细胞中所产生病毒感染后靶细胞感染性的测定提供了一种敏感、便利的机制。靶细胞中指示性基因的产物量即荧光素酶活性，是HBV完成单轮复制的一个直接指标。HBV基因表达载体和/或HBV指示性基因病毒载体可用于“HBV抗性/适合度试验载体”的构建(参见图2及后面的实例3)。通过用各种其他来源的HBV基因序列(如P基因逆转录酶序列)置换HBV指示性基因病毒载体中特定HBV基因序列的方法，HBV指示性基因病毒载体可用于构建“HBV抗性/适合度试验载体”。这些来源可以包括携带有药物敏感性或抗性HBV病毒株(如对拉米夫定耐药或敏感的病毒，[3TC])的病人样品和具明确RT序列的HBV克隆，其中该RT序列包含或缺失与药物抗性相关的突变(M550V)。
HFV包膜表达载体包含HFV包膜基因区，用于产生HFV包膜基因产物(gp130env)。gp130env是一种多聚蛋白，它在细胞质的区室内被细胞的“弗林样”蛋白酶切割为成熟的包膜表面部分(gp80SU)和跨膜部分(gp48TM)。SU和TM共同在HFV的识别及进入宿主细胞的过程中起作用。HBV的PreS1/PreS2/S基因随所用启动子的不同编码三种不同的蛋白。S、M和L这三种蛋白具有相同的C-端，在PreS1和/或PreS2的存在或缺失方面存在差异(参见图3)。HBV/HFV嵌合包膜表达载体包含编码嵌合蛋白的序列，其中该嵌合蛋白包含来源于整个S域的氨基酸序列和附加的、与HFV SU(gp80)包膜基因区共价结合的PreS1和PreS2序列。在本发明的一个优选实施方案中，HBV/HFV嵌合包膜包含融合在整个HBV S框架的HFV SU区、PreS2序列及缺失C-端的序列PreS1序列。在本发明的另一优选实施方案中，HBV/HFV嵌合包膜包含融合在整个HBV S框架的HFV SU区，缺失N-端的PreS1序列及缺失C-端的PreS2序列。HBV/HFV嵌合包膜表达载体用于产生HBV/HFV嵌合包膜基因产物。将HBV/HFV嵌合包膜表达载体随HBV基因组载体一同导入宿主包装细胞导致病毒外膜中含HBV/HFV嵌合包膜蛋白的HBV病毒毒粒(伪型化的病毒颗粒)产生。包括但不限于CMV-IE启动子/增强子、或HFV启动子/增强子或HBV的S启动子的各种调控元件可以调控HFV包膜在宿主细胞中的表达。在本发明的一个优选实施方案中，通过将HBV/HFV嵌合包膜基因序列插入一含CMV-IE启动子/增强子(如pCXAS，Petropoulos等，1999)的表达载体中完成HFV包膜表达载体的装配。
包装宿主细胞可包括大量不同的人类或哺乳动物细胞系如人胚肾细胞(HEK293)和人肝癌细胞(HepG2，Huh7)，但并不局限于这些。理想的包装宿主细胞在引入HBV基因组表达载体和HBV/HFV嵌合包膜表达载体DNA后可瞬时产生大量经HBV/HFV嵌合包膜蛋白伪型化的HBV病毒毒粒。
靶细胞可包括原代细胞和细胞系，更特别的说包括原代肝细胞及肝源细胞系，包括但并不局限于HepG2和Huh7细胞。理想的靶宿主细胞表面表达HFV受体，能支持HBV复制过程中病毒粘附和侵入的下游步骤。
为了产生感染性的HBV病毒颗粒，将HBV基因组表达载体和HBV/HFV嵌合包膜表达载体共同导入宿主包装细胞。数天后，收集宿主包装细胞产生的HBV/HFV嵌合包膜伪型化的HBV颗粒，接种宿主细胞。接种数天后，测定靶细胞的感染性。可利用包括但不限于磷酸钙-DNA沉淀法、电穿孔法的各种非常完善的操作方法完成HBV基因组表达载体和HBV/HFV嵌合包膜表达载体的导入。可利用包括但不限于检测HBV抗原(基于抗体的Western印迹及ELISA检测)、HBV核酸(如PCR、RT-PCR、Northern印迹及Southern印迹检测)的方法完成HBV对靶细胞的感染性测定。
在本发明的一个优选实施方案中，使用CMV-IE启动子/增强子调控HBV基因组表达载体和HFV包膜表达载体。HBV基因组含有一个荧光素酶指示性基因。包装宿主细胞为HEK293。利用磷酸钙-DNA沉淀法将HBV基因组表达载体和HBV/HFV嵌合包膜表达载体导入包装宿主细胞。每种载体DNA制剂的用量为5～10微克。转染后，包装细胞孵育24～72小时。收集并冻融细胞及培养基以便释放与细胞相联的病毒毒粒。将培养基离心并过滤，滤液作为感染宿主靶细胞的HBV/HFV嵌合包膜伪型化HBV原种。靶细胞为HepaG2或Huh7。感染后48～72小时，裂解受感染的细胞，测定裂解液中的荧光素酶活性。感染细胞中测得的荧光素酶活性值作为HBV完成单轮复制的直接指标。
                   实施例3
HBV药物敏感性和复制能力(“病毒适合度”)的测定方法
本实施例提供了准确、可重现地测定HBV药物敏感性及鉴定新/另外的HBV复制抑制剂的手段和方法。本实例进一步提供了手段和方法以测定对逆转录酶抑制剂或以HBV复制其他步骤为靶点的药物/化合物表现出敏感性下降的HBV复制能力。本实例中测定药物敏感性和复制能力的手段和方法适用于其他嗜肝DNA病毒，其中一些如鸭嗜肝DNA病毒、土拨鼠嗜肝DNA病毒可以充当HBV疾病有用的动物模型。
利用美国专利NO.6,242,187和美国系列号为No.09/766,344中所述的手段和方法进行药物敏感性和复制能力试验。专利的内容在此引入作为参考。用上述的“HBV抗性/适合度试验载体”、“HFV包膜包装载体”、“包装宿主细胞”和“靶细胞”完成药物敏感性和复制能力试验。
包装宿主细胞可包括各种人类或哺乳动物细胞系，包括但并不局限于人胚肾细胞(HEK293)和人肝癌细胞(HepG2，Huh7)。理想的包装宿主细胞在导入“HBV抗性/适合度试验载体”DNA后将产生大量伪型化的HBV病毒毒粒。靶细胞可包括原代细胞和细胞系。更特别的说包括原代肝细胞及肝源细胞系，包括但并不限于HepG2和Huh7细胞。理想的靶宿主细胞表面表达HFV受体(s)，能支持HBV复制过程中病毒粘附和侵入的下游步骤。
HBV抗性/适合度试验载体表达HBV基因，在它们导入包装宿主细胞后能产生HBV颗粒。HBV抗性/适合度试验载体也包含一个功能性指示性基因，如荧火虫荧光素酶基因。感染后靶细胞中产生荧光素酶活性值为HBV复制能力的直接指标。利用来源于各种来源的HBV P基因序列(编码逆转录酶活性)构建HBV抗性/适合度试验载体。这些来源可包括携带有药物敏感性或抗性HBV病毒株(如对拉米夫定耐药或敏感的病毒)的病人样品和具明确RT序列的HBV克隆，其中该RT序列包含或缺失与药物抗性相关的突变(M550V)。
为了产生感染性HBV病毒颗粒，将HBV抗性/适合度试验载体和实例中所述的HFV包膜包装载体DNA共转染包装宿主细胞如HEK293。包膜包装载体必须能产生HFV包膜蛋白gp80SU、gp48TM(如pCXAS-HFVenv)或含HBV及HFV包膜蛋白特定功能域的嵌合包膜蛋白(pCXAS-HBV/HFVenv)等HFV包膜蛋白。转染数天后收集宿主包装细胞产生的HFV伪型化HBV病毒颗粒，然后将之感染靶宿主细胞(对细胞进行冻融可以释放与细胞相联的病毒颗粒从而提高滴度)。感染数天后，裂解靶细胞并测定荧光素酶活性。
受感染细胞所测得的荧光素酶活性值可作为“感染性”的直接指标，感染性亦称为“复制能力”或“体外适合度”，即病毒完成单轮复制的能力。通过将受试病毒(如来源于病人样品的RT序列)产生的荧光素酶活性值与一来源于HBVVayw等已鉴定HBV分子克隆的参照病毒所产生的荧光素酶活性值比较来评估相对适合度。适合度低于参照病毒的病毒在感染靶细胞后所产生的荧光素酶活性低于参照病毒。适合度测量值用参照病毒的百分数表示，如参照病毒的25％、50％、75％、100％或125％。
在无药物和药物存在的条件下，测定同一受试病毒(如来源于病人样品的RT序列)所产生的荧光素酶活性值，将测得的活性值加以比较来评价病毒对抗病毒药物(如逆转录酶抑制剂)的敏感性。为了制作对药物活性准确定量的抑制曲线，可在大范围的药物浓度下对病毒进行试验(Petropoulos等，1999)。典型地，药物活性以抑制50％或95％病毒复制所需的药物浓度表示，分别称为IC50和IC95。抑制药物敏感性受试病毒复制的药物浓度和抑制已鉴定的药物敏感性参照病毒HBVayw复制的药物浓度相同。这种情况下，受试病毒和参照病毒的IC50基本相同。抑制药物敏感性降低的病毒复制的药物浓度比抑制已鉴定药物敏感性参照病毒复制的药物浓度要高。这种情况下，受试病毒的IC50高于参照病毒的IC50。抑制药物敏感性增加的病毒复制的药物浓度比抑制已鉴定药物敏感性参照病毒复制的药物浓度要低。此时，受试病毒的IC50低于参照病毒的IC50。
                      实施例4
与HBV药物敏感性和/或复制能力相关的基因突变的鉴定方法
本实施例提供了一种鉴定逆转录酶中改变HBV药物敏感性和/或复制适合度的突变的手段和方法。此处鉴定逆转录酶改变HBV药物敏感性和/或复制适合度的突变的手段和方法适用于HBV复制中包括但不限于cccDNA形成、病毒装配、病毒出芽的其他步骤。本实例还提供了对特定逆转录酶突变对于药物敏感性和/或复制适合度的影响进行定量的手段和方法。对特定逆转录酶突变对于药物敏感性和/或复制适合度的影响进行定量的手段和方法适用于其他涉及到HBV复制的基因，包括C和X基因中的突变。
如实施例1中所描述和引用的那样构建HBV抗性/适合度试验载体。对来源于病人样品的抗性/适合度试验载体、或来源于HBV抗性/适合度试验载体库的克隆、或利用定点突变进行人工改造使之含有特定突变的HBV抗性/适合度试验载体进行药物敏感性和适合度测定，以准确、定量地确定药物敏感性和与已鉴定参照标准相比的相对适合度。在本发明的另一个实施方案中，从同一病人的不同时间点，例如，在开始治疗之前、药物治疗变化之前或之后、或疾病恶化的病毒标记物(RNA拷贝数)、免疫标记物(CD4 T细胞)或临床标记物(机会性感染)变化之前或之后，收集病毒比较其药物敏感性和/或适合度。可对病人样品的检测结果作进一步检验，验证与观察到的药物物敏感性和/或相对适合度相关的逆转录酶活性变化。
病人HBV样品的逆转录酶活性
可以利用广泛应用的任一分析方法来测定逆转录酶的活性，这些方法包括但并不限于通过基于分子信标(参考Kramer？)或5’-核酸外切酶活性(Liet和Petropoulos，1996)的常规或实时PCR进行同聚物延伸(如Oligo dT：poly rC)来测定逆转录酶活性。在一个实施方案中，利用一种定量PCR分析法测定与病毒颗粒相关的逆转录酶活性。该定量PCR分析法可以检测与热稳定DNA聚合酶相关的5’-核酸外切酶活性。在本发明的一个实施方案中，将病人病毒的HBV RT活性与未接触逆转录酶抑制剂或其他抗病毒药物的参照病毒(即“野生型”)的HBV RT活性相比。在另一实施方案中，从同一病人的不同时间点，例如，在开始治疗之前、药物治疗变化之前或之后、或疾病恶化的病毒标记物(RNA拷贝数)、免疫标记物(CD4 T细胞)或临床标记物(机会性感染)变化之前或之后，收集病毒进行HBV的RT活性测定，并加以比较。
病人HBV样品的基因型分析
利用广为应用的基因型分析方法(如核酸测序、差异探针杂交、寡核苷酸矩阵杂交)对HBV抗性/适合度试验载体DNA进行分析，不管该载体DNA为库还是构成库的单个克隆。在本发明的一个实施方案中，通过病毒RNA纯化、RT-PCR和双脱氧核苷酸链末端测序来测定病人HBV样品的序列。将测定的序列与数据库中存在的参照序列相比较，如有可能也与同一病人在开始治疗前的病人样品相比较，鉴定基因型中与参照序列或处理前序列不同、且与所观察到的药物敏感性和/或复制能力改变相关的序列。
定点突变株的药物敏感性和病毒复制适合度分析
利用在已鉴定药物敏感性病毒(即“野生型”)的明确遗传背景的基础上引入特定突变的抗性/适合度试验载体，来评估与HBV药物敏感性和病毒复制适合度相关的基因型改变。突变可以单独引入，也可和/或同其他调节病毒对药物敏感性和/或药物适合度的突变联合引入。使用任何一种广为有效的定点诱变方法将突变引入到抗性/适合度试验载体中。在本发明的一个实施方案中，使用了用于定点诱变的兆碱基引物PCR法。利用实例3中所述的药物敏感性和/或适合度分析方法检测包含特异的或一组突变的抗性/适合度试验载体。病毒突变株的适合度与缺乏特定突变的参照病毒相比较。观察到的药物敏感性和/或适合度变化归因于在耐药试验载体中引入的特定突变。在本发明的一个相关实施方案中，构建了逆转录酶上含有导致550位发生氨基酸替换(M550V，M550I)的定点突变的敏感性/适合度试验载体。适合度测定结果使特定的逆转录酶氨基酸替换和药物敏感性/适合度的改变相关联。
                                 表1
特征 典型逆转录病毒 泡沫逆转录病毒 嗜肝DNA病毒 参考文献
病毒聚合酶 逆转录酶 逆转录酶 逆转录酶
衣壳/聚合酶表达 偶联 独立 独立 S.F.Yu，DN Baldwin等，1996；I Jordan等，1996；T Lockelt等，1996
衣壳加工 有 无 无 Lineal，1999中综述
衣壳核酸结合基序 Cis-His Gly-Arg Gly-Arg SF Yu，K Edelmann等，1996
衣壳中基本DNA结合域 无 有 有 SF Yu，K Edelmann等，1996
衣壳核定位功能 无 有 有 AW Schliephake，A Rethwillm，1994
成熟病毒毒粒中的核酸 ssRNA ssRNA，dsDNA dsDNA S.F.Yu，DN Baldwin等，1996；S.F.Yu，1999
病毒毒粒的装配和出芽 胞浆(细胞) 内质网 内质网 T Kamimura等，1981，P.Roingeard等，1990
Env ER保留“双赖氨酸基序” 无 有 有 P.A.Goepfert等，1997
病毒毒粒装配/释放 独立于包膜 依赖于包膜 依赖于包膜 Bruss和Ganem，1991
内在启动子 无 有 有 T.lochelt等，1993
反式活化 有/无 有 有 WS Blair，1994；Venkatesh等，1992
细胞内循环 否 可能存在 是 Lineal，1999中综述
所有参考文献与在正文列出的一致。小综述：泡沫病毒是不同寻常的逆转录病毒。M.L Lineal，Journal of Virology，73(3)，p747-1755(1999)
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Claims (55)

1.一种制备在体外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，该方法包括：
(a)向细胞中导入(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，和(ii)包含编码泡沫病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸的泡沫逆转录病毒包膜表达载体；
(b)培养细胞从而产生含有泡沫病毒包膜蛋白至少一个片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒在体外具有感染性。
2.权利要求1的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体缺失编码嗜肝DNA病毒包膜蛋白的核酸。
3.权利要求1的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体包含来源于嗜肝DNA病毒基因组的至少一个基因，所述基因组选自以下基因组：土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因组、黄鼠肝炎病毒(GSHV)基因组、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)基因组、雪雁肝炎病毒(SGHV)基因组及人类乙型肝炎病毒(HBV)基因组。
4.权利要求3的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体包含来源于人乙型肝炎病毒(HBV)基因组的基因。
5.权利要求3的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包含外源调控元件。
6.权利要求5的方法，其中外源调控元件为人巨细胞病毒即早基因启动子/增强子(CMV-IE)。
7.权利要求1的方法，其中泡沫逆转录病毒包膜表达载体包含来源于泡沫病毒基因组的基因的至少一个片段，所述基因组选自以下基因组：猿猴泡沫病毒(SFV)基因组、猫泡沫病毒(FFV)基因组、牛泡沫病毒(BFV)基因组、海狮泡沫病毒(SLFV)基因组、仓鼠泡沫病毒(HaFV)基因组和人泡沫病毒(HFV)基因组。
8.权利要求7的方法，其中基因编码包膜蛋白或其片段。
9.权利要求1的方法，其中泡沫逆转录病毒包膜表达载体包含来源于人泡沫病毒(HFV)基因组的基因或其片段。
10.权利要求9的方法，其中来源于人泡沫病毒(HFV)基因组的基因或其片段编码gp130env包膜基因产物或其片段。
11.权利要求1的方法，其中细胞为哺乳动物细胞。
12.权利要求1的方法，其中细胞为鸟类细胞。
13.权利要求12的方法，其中鸟类细胞为鸟类肝细胞。
14.权利要求11的方法，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
15.权利要求14的方法，其中人类细胞为人胚肾细胞。
16.权利要求11的方法，其中哺乳动物细胞为293细胞。
17.权利要求14的方法，其中人类细胞为人肝癌细胞。
18.权利要求17的方法，其中人肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。
19.一种在体外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒，它包含泡沫逆转录病毒包膜蛋白的至少一个片段。
20.权利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒是分离的。
21.权利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中泡沫逆转录病毒选自以下病毒：猿猴泡沫病毒(SFV)、猫泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海狮泡沫病毒(SLFV)、仓鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
22.权利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒包含嵌合包膜蛋白，该嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白结构域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白结构域组成。
23.权利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒还包含从嗜肝DNA病毒感染者分离的核酸。
24.权利要求23的嗜肝DNA病毒毒粒，其中从嗜肝DNA病毒感染者分离的核酸编码逆转录酶。
25.权利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒还包含指示性核酸。
26.包含权利要求19至25任一项中嗜肝DNA病毒毒粒的细胞。
27.权利要求26的细胞，其中细胞为哺乳动物细胞。
28.权利要求27的细胞，其中哺乳动物细胞为293细胞。
29.权利要求27的细胞，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
30.权利要求29的细胞，其中人类细胞为人肾细胞。
31.权利要求29的细胞，其中人类细胞为人肝癌细胞。
32.一种测定抗嗜肝DNA病毒药物敏感性的方法，该方法包括：
(a)向第一细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的第一细胞以产生嗜肝DNA病毒毒粒；
(c)将步骤(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒与第二细胞混合，其中抗嗜肝DNA病毒药物加入第一或第二细胞中，或加入第一和第二细胞中；
(d)测定第二细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量，其中可检测信号的量取决于嗜肝DNA病毒毒粒对第二细胞的感染；和
(e)将步骤(d)中测定到的信号量与无药物存在时测得的信号量相比较，其中药物存在时信号量下降说明对药物敏感，信号量无变化或上升则说明对药物产生抗性。
33.权利要求32的方法，其中步骤(a)的嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包含来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
34.权利要求33的方法，其中来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一个片段。
35.权利要求34的方法，其中基因是HBV P基因、HCV C基因、HBV X基因或HBV S基因。
36.权利要求34的方法，其中来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸编码逆转录酶。
37.权利要求32的方法，其中第二细胞为哺乳动物细胞。
38.权利要求32的方法，其中第二细胞为鸟类细胞。
39.权利要求32的方法，其中鸟类细胞为鸟肝细胞。
40.权利要求37的方法，其中哺乳动物细胞为人类细胞。
41.权利要求40的方法，其中人类细胞为人胚肾细胞。
42.权利要求37的方法，其中哺乳动物细胞为293细胞。
43.权利要求40的方法，其中人类细胞为人肝癌细胞。
44.权利要求43的方法，其中人肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。
45.权利要求32的方法，其中泡沫逆转录病毒选自下列病毒：猿猴泡沫病毒(SFV)、猫泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海狮泡沫病毒(SLFV)、仓鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
46.权利要求32的方法，其中步骤(a)(i)的核酸编码gp130env包膜蛋白。
47.权利要求32的方法，其中步骤(a)(i)的核酸编码嵌合包膜蛋白，该嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白结构域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白结构域组成。
48.权利要求32的方法，其中第二细胞在其表面表达一种蛋白，该蛋白与人泡沫病毒包膜蛋白结合。
49.一种测定来源于嗜肝DNA病毒感染病人的病毒复制能力的方法，该方法包括：
(a)向第一细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的细胞以产生嗜肝DNA病毒毒粒；
(c)将步骤(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒与第二细胞混合；
(d)测定第二细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量，其中可检测信号的量取决于嗜肝DNA病毒毒粒对第二细胞的感染；
(e)将步骤(d)的测量值标准化；和
(f)将步骤(e)标准化后的测量值与采用对照参比嗜肝DNA病毒经步骤(a)至(d)而测得的信号量相比较，其中与对照组相比信号量上升意味着复制能力提高，信号量降低意味着来源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的复制能力下降。
50.一种测定抗嗜肝DNA病毒药物敏感性的方法，该方法包括：
(a)向细胞中导入：
(i)嗜肝DNA病毒基因组表达载体，
(ii)编码泡沫逆转录病毒包膜蛋白至少一个片段的核酸，和
(iii)指示性核酸；
(b)培养步骤(a)得到的细胞；
(c)将细胞与抗嗜肝DNA病毒药物接触；
(d)测定细胞中指示性核酸产生的可检测信号的量；和
(e)将步骤(d)所测得的信号量与不存在药物的条件下测得的信号量相比较，其中药物存在时信号量降低说明对药物敏感，信号量无变化或升高则说明对药物有抗性
51.权利要求50的方法，其中步骤(a)中的嗜肝DNA病毒基因组表达载体还包括来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
52.权利要求51的方法，其中来源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一个片段。
53.权利要求52的方法，其中基因为HBV P基因或HBV C基因。
54.一种鉴定嗜肝DNA病毒核酸中与抗嗜肝DNA病毒药物抗性相关的突变的方法，该方法包括：
(a)在应用抗嗜肝DNA病毒药物前对嗜肝DNA病毒核酸进行测序；
(b)依据权利要求50的方法测定步骤(a)中测序的嗜肝DNA病毒对药物的敏感性；
(c)将嗜肝DNA病毒与药物相接触，使步骤(b)中测得的嗜肝DNA病毒对药物的敏感性降低；
(d)将步骤(a)测定的序列与步骤(c)中嗜肝DNA病毒接触药物后所测定的序列相比较，以鉴定嗜肝DNA病毒核酸中与抗嗜肝DNA病毒药物抗性相关的突变。
55.权利要求54的方法，其中测量步骤(b)包含依据权利要求32的方法，测定经步骤(a)测序的嗜肝DNA病毒对抗嗜肝DNA病毒药的敏感性。
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