KR20070029681A

KR20070029681A - 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화

Info

Publication number: KR20070029681A
Application number: KR1020067020019A
Authority: KR
Inventors: 존 오도리코; 브렌다 칸; 나단 트레프
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-03-14
Also published as: IL177599A; GB2427874A; GB0621363D0; EP1730268A2; GB2427874B; JP5244765B2; JP4491014B2; AU2005230832A1; US7585672B2; CA2555571C; WO2005097977A2; JP2007531526A; CA2555571A1; US20050260749A1; WO2005097977A3; IL177599A0; AU2005230832B2; JP2010075186A

Abstract

분화를 겪는 인간 배아 줄기 세포의 컬쳐에서 내배엽 위탁 세포 및 이자 혈통 세포의 비율을 증가시키는 방법이 기재된다. 상기 방법은 또한 종양원성 능력을 갖지 않는 줄기 세포 유래 컬쳐를 일으킨다.

줄기 세포, 내배엽, 이자 혈통, 분화

Description

줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화{DIFFERENTIATION OF STEM CELLS TO ENDODERM AND PANCREATIC LINEAGE}

관련 출원의 교차-참조

본 출원은 2004 년 4 월 1 일에 출원된 (미국)가출원 제 60/559,209 호를 우선권으로 주장한다.

연방정부에 의하여 후원된( federally sponsored) 연구 또는 개발에 관한 진술

결정됨.

배경 기술

제I형 당뇨병은, 이자 섬 베타 세포(pancreatic islet beta cell)의 파괴에 의하여 야기되는 인간의 자가 면역질환이다. 비록 그 증상이 외인성 인슐린의 투여에 의하여 조절될 수 있다 하더라도, 현재 상기 질병은 비가역적이다. 제I형 당뇨병은 인간 집단에서 가장 빈번한 자가 면역 질환 중 하나이며, 중요한 공중 보건 문제이다.

면역 억제 치료와 결합될 경우, 전체 이자 또는 분리된 섬 세포의 이식이, 인슐린 비의존성을 회복시켜, 제I형 당뇨병에 있어서의 효과적인 치료법이라는 것이 이미 발견되었다. 인간 시체 기증자로부터의 분리된 섬(islets)을 이용한 현행 치료요법의 성공은, 원칙적으로, 인간 당뇨병에 있어서의 세포-기재 치료요법 이 성공적일 수 있다는 것의 증거이다. 그러나, 이용가능한 기관 또는 섬 세포의 결핍은 상기 치료요법을 단지 매우 선택된 환자에게 만으로 제한시켰다. 인간 시체로부터 수집될 수 있는 섬 세포의 양은 극히 제한되어 있다. 따라서, 상당한 양의 섬 세포를 생산할 수 있는 기술은, 상기 질병에 대한 잠재적인 치료요법에 있어서 매우 바람직할 것이다.

영장류 및 인간 배아 줄기 세포는 컬쳐(culture) 내에서 분리 및 증식된다. 배아 줄기 세포는, 컬쳐에서 자기-재생 및 증식을 통하여 무한히 유지될 수 있으나, 다수의 상이한 혈통으로 자발적으로 분화할 수 있는 능력을 또한 가지고 있는 줄기 세포이다. 비선택적 조건 하에서, 마우스 및 인간 배아 줄기 세포를 포함하는 다양한 종류의 줄기 세포가, 자발적으로 이자 혈통을 포함하는 다수의 혈통의 세포로 분화할 것이라는 사실이 이미 실증되었다. 상기 분화된 세포는 이자 십이지장 호메오박스 1 (PDX 1) 유전자, 이자 혈통을 상술하는(specifying) 전사 인자를 발현시킬 수 있으며, 인슐린 호르몬을 또한 발현시킬 수 있다는 것이 이미 밝혀졌다. 그러나, 선택적 조건 하에서가 아닌 경우, 줄기 세포는 자발적으로 다양한 종류의 상이한 혈통으로 분화하며, 단지 작은 비율의 세포 만이 임의의 특정 혈통으로 분화될 것이다. 또한, 비선택된 줄기 세포 집단은 종양원성(tumorigenic)이며, 이는 그것들이 면역 결핍 동물에서, 미분화된 세포 ES 세포와 마찬가지로, 테라토마(teratomas)로 알려진 비-악성 종양을 생산시킬 것을 의미한다.

발명의 개요

본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 이자 섬 세포의 혈통으로의 분화를 지시하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 숙주로의 이식시 테라토마를 형성하지 않는 세포의 내배엽 강화(enriched) 집단을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 내배엽 혈통으로 위탁되며(committed), 추가적으로 이자 섬 세포로 분화할 수 있고, 이식시 테라토마를 형성하지 않는 세포의 컬쳐에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기재 선택이 인간 배아 줄기 세포로부터 유래하는 세포 배양에 사용되어, 세포 내로 삽입된 외인성 유전자의 사용없이, 배양으로부터 종양원성 퍼텐셜(potential)을 제거할 수 있다는 사실의 최초의 실증인 것으로 여겨진다.

이식을 위한 줄기 세포 유래 세포의 잠재적 사용에 대한 가장 큰 장애물(hurdle) 중 하나인, 미분화된 줄기 세포의 종양원성 특성을 극복하면서, 다량으로 내배엽 및 이자 세포의 생산을 가능케 한다는 것이 본 발명의 특징이다.

기타 본 발명의 객관적인 특징 및 이점들은, 하기의 명세서로부터 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도1은 분류된 배아유사체(embryoid bodies)의 특성을 나타내는 하기 실시예로부터의 일부 실험 결과의 그래프 도시이다.

도2는 PDX1 에 대하여 양성인 세포의 비율을 나타내는 하기 실시예로부터의 일부 실험 결과의 또다른 그래프 제시이다.

도3은 세포 컬쳐에서 PDX1 발현시 FGF10 의 사용의 효과를 나타내는 실험결과의 또다른 그래프 도시이다.

도4는 Pdx1 전사의 QPCR 분석을 나타내는 데이터의 또다른 그래프 도시이다.

도5는 분류된 세포를 특성화하면서 수득된 실험결과의 그래프 도시이다.

도6은 분류된 세포의 종양원성 능력을 나타내는 그래프 도시이다.

도7은 하기 기재된 강화 방법(enrichment processes)을 사용하여 분류된 뮤린 ES 세포로부터의 섬 전구체(islet precursors)의 특징을 나타내는 차트 및 표이다.

발명의 상세한 설명

세포의 집단이 이자 혈통으로 제공되는 세포들을 포함하는 내배엽 운명(fate)으로 위탁된 세포에 있어서 강화(enriched)되는 것과 같이, 영장류 및 인간 배아 줄기 세포의 분화를 안내하는 기술들이 본원에 기재된다. 달리 말하면, 상기 방법은 이자 기원 세포(pancreatic progenitor cell)의 백분율에 있어서 강화된(enriched) 세포의 혼합물을 야기시킨다. 3가지 독립된 기술들이 본원에 기재되어 있으며, 이들 각각은 독립적으로 컬쳐에 의하여 생산된 이자 기원 세포의 백분율을 증가시키는 작용을 한다. 전적으로, 상기 3가지 방법은, 이자 기원 세포의 가장 높은 가능한 공헌(contribution)을 가지는, 인간 배아 줄기 세포로부터 생산된, 분화된 세포 컬쳐를 강화하는, 지금까지 공지된 최적의 기술을 나타낸다. 삽입된 외인성 유전자를 수반하지 않는 방법을 사용하여, 세포 표면 항원을 결합하는 것에 의하여 미분화된 세포를 제거하도록 세포를 분류하는 것이, 언젠가 인간 환자 내로 도입될 수 있는 임의의 세포 집단에 있어서 매우 중요한 속성(attribute)인 테라토마 형성을, 상기 세포 집단 내에서 제거하는 데에 매우 효과적이라는 것이 본원에서 또한 교시된다. 이는 미분화된 ES 세포의 종양원성 능력이, 선택 기준의 이성적인 선택에 의하여, ES 세포 분화된 자손(progeny)으로부터 효과적으로 제거될 수 있다는 것의 최초의 실증일 것으로 여겨진다.

인간 배아 줄기 세포로부터 이자 기원 세포를 생산하는 표준 방법 중 하나에서, 본 발명자들은 우선 단일의 미분화된 ES 세포를 현탁액 컬쳐로 주입함으로써, 배아 줄기 세포를 시험관 내에서(in vitro) 분화시킨다. 현탁액 컬쳐에서, ES 세포는 응집(aggregate)하고 배아유사체(EBs)로 불리는 2 층 구조를 형성하며, 이는 예비-이식 단계 배아와 유사하며, 이는 부분적으로 3 가지 배아 배엽층(germ layer), 중배엽, 외배엽 및 내배엽으로 위탁되는 세포를 소유한다. 통상의 배아의 연구에 근거하여, 다양한 조직 분화 사건을 촉진시키는 초기 배아 유도 상호작용은, 발달의 상기 단계에서 시작한다. 다수의 상기 중요한 조직 유도 상호작용은 상기 단계에서 및 배아유사체 내에서 발생할 수 있다. 현택액 컬쳐의 7 내지 14 일 후에, EBs 는 조직 컬쳐 기질 상에서 배양(plated)되고, 통상의 조직 컬쳐 조건 하에서 추가로 증식 및 분화가 가능케된다. 추가적인 미세한 중재(intervention)를 요구하면서, 몇몇 신경 및 중간엽(mesenchymal) 세포 형태의 상당한 분화가 상기 단계에서 자발적으로 일어난다. 그러나, 고전적인 발달 연구에 의하여 단지 부분적으로 정의되어온, 수많은, 그리고 다방면에 걸친 상호작용을 수반하면서, 이자 혈통을 발생시키는 배아 내배엽 세포의 모양(appearance)은 더욱 복잡한 것으로 나타난다.

본 발명자들은 분화를 겪으면서 줄기 세포 컬쳐 내의 이자 혈통 세포의 백분율을 증가시키는 3 가지 중재를 발전시켜왔다. 첫번째 방법은 최종 내배엽 세포로 발달하는데 있어서의 보다 큰 퍼텐셜을 가지는 EBs 의 선택을 수반하며, 이자 세포는 상기 혈통으로부터 유래한다. 두번째 강화 방법은 이자 세포 형태의 성장을 촉진하는 성장-강화 인자를 사용한, 배지의 사용을 수반한다. 세번째 기술은 원치 않는 세포를 제거하고, 바람직한 혈통의 세포를 선택하는 양성 및 음성 선택의, 3-층(three-tier) 접근법을 수반한다. 세번째 기술은 이자 혈통으로 분화하는 컬쳐 내의 세포의 백분율을 증가시키는데에 함께 또는 독립적으로 사용될 수 있다.

하기 기재된 몇몇 방법(procedure)들은 우선 마우스 ES 세포를 사용하여 수행되었다. 상기 방법들은 인간 ES 세포를 사용한 용도에 용이하게 적용될 수 있다. 마우스 ES 세포의 유도 및 몇몇 세포 표면 마커들이 인간 ES 세포의 그것과 다른 반면에, 선택을 위하여 사용되는 마커가, 뮤린 세포와 반대되는 것으로서의 인간 세포에 있어서 적절한 것으로 대체되어야만 한다는 단지 중요한 변화를 제외하고는, 하기 기재된 세포 선택 방법은 인간 ES 세포에 동일하게 적용 가능하다. 예를 들면, 미분화된 ES 세포에 대항하는 선택에 있어서의 선택 기준은, 마우스 ES 세포 내의 세포 표면 항원 SSEA-1 및 인간 ES 세포 내의 SSEA3/4 마커에 기초한다. 유사하게, 컬쳐로부터 내장 난황낭 (visceral yolk sac; VYS) 세포를 제거하기 위하여, 마우스 세포 컬쳐 내의 SSEA-3 의 발현 및 인간 세포 컬쳐 내의 SSEA-1 의 발현에 대항하여 선택한다. 마우스 및 인간 내피 세포는, 내피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)를 발현시키며, 상기의 발현은 내피 혈통으로 위탁된 뮤린 및 인간 세포를 검출하는 양성 선택에 사용될 수 있다.

상기 선택을 수행함에 있어서, 일반적으로 보다 큰 입자, 및 특히 EBs 전체를 선택할 수 있는 기구가 바람직하다. 그러한 하나의 기구는 COPAS 기구(Union Biometrica, Inc.)이며, 이는 형광-활성화 세포 분류기 (fluorescence-activated cell sorter; FACS) 기계의 그것과 유사한 원리에 의하여 작동되나, 이는 보다 큰 크기의 세포 입자를 허용한다. 세포 응집체(aggregate)를 분류할 수 있는 임의의 기기가 본 발명의 방법에 있어서의 사용에 있어서 적합하다. 자기 활성 세포 분류(magnetic activated cell sorting; MACS)는 또한 이러한 종류의 세포 분류 방법에의 사용에 있어서도 성공적으로 적용될 수 있다.

본원에 기재된 방법의 또다른 속성은, 줄기 세포 컬쳐의 종양원성 경향이 선택에 의하여 단독으로 효과적으로 제거될 수 있다는 것의 발견이다. 면역손상(immunocompromised) 마우스 내로 주입시, ES 세포는 테라토마를 형성하며, 이는 비-악성 성장이거나, 불완전하게 조직된 구조에서 다수의 상이한 조직 형태로 만들어진 종양이다. 테라토마의 발생이 숙주의 수명을 위협하는 것으로 여겨지지 않더라도, 테라토마는 숙주에 있어서 대사 에너지의 크고, 추하며, 낭비적인 것이다. 인간 ES 세포에 의하여 형성된 테라토마의 특성화는 [Gertow et al., Stem Cells and Development, 13:421-435 (2004)] 에서 발견된다. 인간 ES 세포가 최종적으로 세포 또는 조직의 인간 환자로의 이식에 있어서 사용될 경우, 그와 같이 도입된 세포는 종양원성 능력이 없는 것이 아마도 바람직하다. 당해 기술 분야에서, 이러한 능력을 제거하는 것으로 교시되어온 주요한 기술들은, 외인성 유전자를 ES 세포 내로 삽입하고, 그 후 도입된 유전자의 발현 특성에 근거하여 분화된 세포를 선택하는 것에 근거한다. 그러나, 인간 ES 세포 컬쳐 내로 삽입된 외인성 유전자의 사용은, 최적으로 회피되는 또다른 세트의 안정성 문제를 수반한다. 세포 표면 마커에 근거한 세포 선택이, 실제적인 수준에서, 종양원성이 아니며, 테라토마를 형성하지 않는 줄기 세포 유래 세포 컬쳐를 생산하는데에 충분하다는 것은 아마도 본원에서 최초로 교시된다. 과잉의 위험으로서, 및 오해를 회피하기 위하여, 종양원성이라는 표현의 사용은, 미분화된 인간 ES 세포의 테라토마-형성 특성에 적용하려는 의도이며, 마우스 내로 주입시 ES 세포가 악성을 생산하지 않기 때문에, 임의의 종류의 악성을 의미하려는 의도는 아니다. 단순히 선택에 의한 종양원성 특성의 제거는, 유용한 인간 치료를 위한 실험실 모델로부터 유래된 줄기 세포의 진행 과정에서의 또다른 중요한 단계이다.

일반적인 컬쳐 조건:

미분화된 뮤린 ES 세포를, 상기 기재된 바와 같이([Kahan et al., 2003)]), 조사된(irradiated) 공급자 세포 상에서, 15% FCS, L-글루타민, NEAA(비-필수 아미 노산), 메르캅토에탄올(MES 배지) 및 LIF 가 보충된 DMEM-고 글루코스 배지에서 성장시켰다. EBs 를 생산하기 위하여, ES 세포 단일층을 2% 치킨 혈청을 사용하여 15 분 동안, 2 mM EDTA 로 처리하였다. 세포를 MES 배지에서 재현탁하고, 20 ㎛ 니텍스 필터(Nitex filter)를 통하여 여과하여, 단일 세포 현택액을 수득하였다. 2 × 10⁶ 세포를, 10% CO₂ 내의 5 ml MES 배지에서 실리콘화된 비-조직 컬쳐 P60 접시에 위치시켰다. 컬쳐를 매일 갱신하고, 보다 큰 접시에 나누어 배지 산화를 방지하였다. 7 일 EBs 를 수집하고, 카운트하고, 면역조직화학 염색을 위한 13 mm 글래스(glass) 겔라틴-코팅된 커버슬립(coverslips)을 포함하는 24 웰(well) 플레이트(plate)에서 30 내지 50 EBs 의 밀도로 위치시키거나, 또는 정량 PCR(QPCR)을 포함하는 다른 분석을 위한 겔라틴화된 조직 켤쳐 디쉬(dishes)에 비례하게 더 큰 수로 위치시켰다. EBs 를 5% CO₂ 내의 10% FCS 를 가진 DMEM-고 글루코스 배지에 위치시켰다.

미분화된 세포를 15% 혈청 대체물(Serum Replacement(SR)), NEAA, L-글루타민, 메르캅토에탄올 및 bFGF(4nd/ml)이 보충된 DMEM/F12 배지에서 공급자 세포 상에서 유지시킨 것을 제외하고는, 인간 ES 세포의 컬쳐를 위한 조건이 유사하였다. 디파제(dipase) 및 콜라게나제(collagenase)를 가진 컬쳐를 콜로니가 풀어질때까지 부드럽게 처리함에 의하여, 인간 EBs 를 단일 세포로부터가 아닌 ES 세포의 무손상 콜로니(colonies)로부터 초기화하였다. EBs 를, 15% 태아 비복 혈청(fetal calf serum; FCS)을 사용하여 보충되었으며, bFGF 를 결핍한 이전의 배지 내의 현 탁액에서 유지하였다. 현탁 컬쳐의 14 일 후, 5% CO₂ 내에 10% FCS 를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 EBs 를 배양시켰다.

1. 세포 표면 항원, 단계-특이적 배아 항원-3 ( SSEA -3) 을 발현시키는 무손 상 EBs 의 선택

모든 ES 응집체가, SSEA-3 을 발현시키는, 완전히 분화된 내장 난황낭 세포의 외부 세포 층을 가진 EBs 로 성공적으로 성숙하는 것은 아니다. 단일클론 항-SSEA-3 항체 및 형광으로 태그된(tagged) 2 차 항체를 가진 생 EBs 를 짧게 인큐베이팅한 후, 형광-활성화 세포 분류기(FACS) 기계의 그것과 유사한 원리에 의하여 작동하는 COPAS 기구 (Union Biometrica, Inc.)를 사용하여, 집단 내의 고-발현자를 분리하였다. 그러나, 더 큰 입자 세포 분류기로서 생각될 수 있는 COPAS 기구는, 보다 더 큰 틈을 가지며, 전체 이자 섬 및 전체 C. elegans 기생충(worms)의 크기 순서로 실체(entities)를 분류할 수 있다. 기계에 의하여 선택된 EBs 를 조직 컬쳐 웰로 분류하고, 분화가 가능하도록 추가로 컬쳐하고, 이자 마커의 발현에 대하여 분석하였다.

SSEA -3 염색:

7 일된 EBs 를 15 분 동안, 40 ℃ 에서, 10% FCS 를 가진 DMEM 에서 1:50 으로 희석된 단일클론 항-SSEA-3 복수 (Developmental Studies Hybridoma Bank, U Iowa) 를 사용하여 인큐베이팅하고, 그 후 10% FCS 를 가진 20-50 폴드(fold) 과량의 찬 DMEM 을 사용하여 헹구어냈다. 다음으로, 헹구어 내기 전에, EBs 를 10% FCS 를 가진 DMEM 내에서, 15 분 동안, 40℃ 에서, 2 차 항체(Alexa-fluor 488 goat anti-rat IgM(1:1000)(Molecular Probes))를 사용하여 인큐베이팅하였다. COPAS 분류에 있어서, 염색된 EBs 를 Ca++, Mg++ 및 1% FCS 를 함유하는 찬 PBS 에서 현탁시키고, 겐타마이신(gentamycin)으로 보충된 배지를 함유하는 웰로 분류하였다.

결과:

분류를 수반한 추가적인 21 일 동안의 분화 후에, 최고 5-10% SSEA-3 EB 발현자를 사용하여 초기화된 컬쳐는, 주로 SSEA-3 음성 EBs 를 함유하는 비분류된 컬쳐를 행하는 것보다, YY, 초기 이자 세포의 마커를 염색하는 다수의 더욱 많은 세포 (약 10 폴드)를 나타내었다. 도 1 은 큰 입자 세포 분류기에 의하여 분류된 SSEA-3 고 세포는, SSEA-3 음성 또는 저 세포보다, 더욱 많은 내배엽 전사(Sox 17 및 Pdx1) 및 섬 분화(NGN3 및 인슐린(Ins1))의 지시자를 함유하였다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 내배엽 및 이자 혈통의 세포에 있어서 컬쳐의 성공적인 강화를 나타낸다.

2. FGF10 으로 보충된 배지를 사용한 분화하는 세포의 처리

섬유모세포(fibroblast) 성장 인자 10(FGF10)은, 이자의 통상의 발달에 있어서 필수적이며, 초기 이자 전구체 세포의 증식을 촉진하는 것에 의하여 작용할 수 있다는 것이 문헌에서 보고되었다([Bhushan, et al., 2001]). FGF10 을 마우스 및 인간 배아 내의 초기 이자 상피(epithelium)를 둘러싼 중간엽 내에서 발현시켰다. 상기 성장 인자의 ES 세포 컬쳐의 분화에 대한 효과를 연구하도록 결정하 였다.

FGF10 으로 보충된 배지 내의 컬쳐

EBs 를 상기 기재된 바와 같이 발달시키고, 7 일 째에 10% FCS 를 가진 DMEM-고 글루코스에서 위치시켰다. 2 일 후, 상기 배지를 50 ng/ml FGF10 을 함유하는 1% FCS 배지를 가진 DMEM-고 글루코스에 의하여 대체하였다. 면역형광 및/또는 정량 PCR 방법(QPCR)에 의하여 세포를 이자 마커에 대하여 분석하기 전까지, FGF10 을 함유하는 배지를 추가적인 5-19 일 동안, 매일, 갱신하였다.

결과:

결과 형광 및 QPCR 시험의 분석은, 이자 선조(progenitor)를 발현하는 PDX1 의 상당한 강화를 나타내었다. 하기 표 1 은 각각 미처리된 세포와 비교하여, 이식 후 7 일 및 14 일에서, pdx1 전사의 5 및 2.5 폴드 강화를 나타내는 QPCR 데이터의 지지를 나타낸다. 유사하게, FGF10 이 결핍되어 성장한 세포와 비교하여 이식 후 14 일까지, 2.5 폴드의 인슐린 전사의 증가가 있었다. 50 ng/ml 이상의 농도에서 사용된 FGF10 이 효과적이었다. 도 2 는 FGF10 보충 배지에서 12 일 성장 후, PDX1(2 내지 3 이상의 폴드)을 염색하는 세포의 증가된 수를 나타낸다. 표 1 은 QPCR 데이터의 지지를 나타낸다. 도 3 은 FGF10 처리된 세포 컬쳐 내의, 강화된 pdx1 전사 풍부를 보여주는 QPCR 데이터를 나타낸다. 미분화된 인간 ES 세포와 비교하여, 50 ng/ml FGF10 에 노출된 분화된 유도체들은 70 폴드 이상의 pdx1 전사 mRNA 를 나타내었다. FGF10 효과는, EB 컬쳐에 이은 상(phase)에서, 세포가 FGF10 에 노출될 때 더욱 명백해진다.

3. 자기 활성 세포 분류( MACS ) 분리를 사용한, 이자 전구체 세포의 강화 및 기형발생성( teratogenecity)의 감소

앞서, ES 세포 자손이 이자 십이지장 호메오박스(PDX1, IPF1), 필수 이자 전사 인자를 발현한다는 것을 밝혔다. 이제, 본원에서 PDX1 을 발현하는 세포로부터 유래된 ES 세포가, 세포 표면 항원, 상피 세포 부착 분자(EpCAM)를 발현하는 상피-유사 세포의 시트(sheet) 중에서 ES 세포 분화 컬쳐 내에서 별개의(discrete) 로시(loci)로 존재하는 것을 밝혀내었다. 세포를 발현하는 대다수의 EpCAM 이 PDX1 음성인 반면, PDX1을 발현하는 모든 세포들은 또한 EpCAM 을 공-발현한다. 중요하게, 신경 및 중간엽 세포를 포함하는, 상기 컬쳐 내의 다수의 기타 세포 형태는, EpCAM 을 염색하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 EpCAM 양성 세포의 선택에 의하여, PDX1 양성 세포의 상대적인 비율을 증가시킬 수 있을 것이라고 추론하였다. 그러나, 몇몇 미분화된 ES 세포 및 내장 난황난(VYS) 세포들은 또한 EpCAM 을 공-염색하였다. 안출된 전략은 (마우스 ES 세포 내의) 세포 표면 항원 SSEA-1 및 (인간 ES 세포 내의) SSEA3/4 의 배타적인 발현에 근거하여, 우선 미분화된 ES 세포를 제거하는 것이었다. 그 후, VYS 세포를 마우스 컬쳐 내의 SSEA-3 및 인간 컬쳐 내의 SSEA-1 의 배타적 발현에 근거하여, 제거하였다. 최종적으로, EpCAM 양성 세포에 대한 양성 선택을 사용하여, EpCAM 을 발현시키는 내배엽 집단을 선택적으로 분리하였다. 사용된 MACS 방법은 자기 비드(bead)를 2 차 항체에 부착시키고, 그 후 상기 세포를 강한 영구 자석에 위치하고 있는 분리 컬럼을 통과시키는 것에 근거한다. 자기적으로 표식된(labeled) 세포를 컬럼내에 보유하고, 통과하는 비표식된 세포로부터 분리하였다. 자기장으로부터 컬럼을 제거한 후에, 보유된 부분(fraction)을 용출시켰다. 보유된 세포 또는 통과하는 세포를 취하느냐에 따라서, 음성 및 양성 선택 전략 모두 가능하다.

MACS 분리 프로토콜(MACS Separation Protocol)은 하기 기재된 상세한 프로토콜로서, 이는 ES 및 VYS 세포를 제거하기 위한, 2 가지 음성 선택 컬럼을 사용하고(SSEA1 및 그 후 SSEA3 1 차 항체를 사용하고), 최종적으로 EpCAM 발현에 대한 제 3 양성 컬럼 선택을 사용하여, 마우스 ES 세포의 방법에 수반되는 단계를 개설한다. 인간 ES 세포 컬쳐에 있어서, 최초 음성 선택이 미분화된 인간 ES 세포를 제거하기 위하여 SSEA3/4 를 사용하여 이루어지고, 그 후 SSEA1 음성 선택 및 그 후 EpCAM 양성 선택 단계에 의하여 VYS 세포를 제거한다는 점을 제외하고는, 상기 3 가지 분리 전략은 유사하다.

MACS 분리 프로토콜

제 1 음성 분리를 위한 세포 제조

상기 절차를 PBS, 2X 를 가진 3 P60 플레이트(plate) EB₇ _+n 을 헹구면서 시작하였다. 그 후, 플레이트를 15 분 동안, 1.5 ml 2 mM EDTA 및 흡입된(aspirated) EDTA 에서 인큐베이팅하였다. 그 후, 1.5 ml 0.05% 트립신을 5 분 동안, 37 ℃ 에서 첨가하였으며, 그 후, 1.5 ml DMEM/HEPES + 10% FCS 를 첨가하고, 부드럽게 세포를 재현탁시켰다. 그 후 추가적인 DMEM + 10% FCS 를 첨가하여, 총 10-15 ml 를 제조하였다. 세포들을 그 후 40 ㎛ 필터를 통하여 50 ml 튜브로 여과하고, 20 ㎛ 니텍스 필터로 재여과하였다. 여과물을 톨루이딘 블루(Toluidine Blue; TB)를 사용하여 1:5 로 희석하고, 세포를 카운트하였다(50 ㎕ + 150 ㎕ + 50 ㎕ TB). 2 × 10⁷ 세포를 215 ml 튜브에 첨가하고, 임상 원심분리에서 3 분 동안 스피드 #5 로 원심분리하였다. 그 후, 각각의 펠렛을 SSEA-1 항체를 함유하는 100 ㎛ DMEM/HEPES + 10% FCS 에서 재현탁하고, 냉장고(4-8℃)에서 15 분 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 5 ml 찬 DMEM/HEPES + 10% FCS 를 튜브 당 첨가하고, 3 분, 21 ℃ 에서 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 완전히 제거하였다. 세포를 160 ㎛ DMEM/HEPES + 10% FCS/튜브에서 재현탁하고, 40 ㎕ 래트 항-마우스 IgM 자기 비드를 각각의 튜브에 첨가하였다. 상기 혼합물을 잘 혼합하고, 냉장고(4-8℃)에서 15 분 동안 인큐베이팅하였다. 여기에, 5 ml 찬 DMEM/HEPES + 10 % FCS/튜브를 첨가하고, 그 후, 3 분 동안 21℃ 에서 원심분리하였다. 상층액을 완전히 제거하였다. 각각의 펠렛을 0.5 ml 찬 가스제거된( degassed ) DMEM/HEPES + 10 % FCS 에서 재현탁시켰다. 여기에, 약 40 ml DMEM/HEPES + 10% FCS 를 10 분 동안 실온(RT) 에서 진공을 사용하여 가스제거하고, 그 후 혼합물을 냉각안정(chilling)시켰다.

제 1 음성 선택

기구를 준비하기 위하여, 자석을 스탠드(stand)에 부착시키고, LD 컬럼을 하부에 수집(collection) 튜브를 가진 자석에 위치시켰다. 10% FCS 를 가진 2 ml 의 찬 가스제거된 DMEM/HEPES 를 적용시키고, 배지가 각각의 컬럼을 통하여 런(run)하도록 하는 것에 의하여, 각각의 컬럼을 완전히 세척하였다. 상기 배지를 아이스(ice)내의 멸균된 15 ml 수집 튜브로 전달하였다. 그 후, 세포를 배지에 첨가하고, 1 ml 세포를 LD 컬럼에 첨가하고, 유출액을 수집하였다. 그 후, 컬럼을 2x1 ml 가스제거된 배지로 세척하고, 고갈된(depleted)부분으로서 총 유출액을 수집하였다. 그 후, 10 ㎕ 세포를 제거하고, 1:10 으로 희석하여 카운트(10 ㎕ + 40 ㎕ + 50 ㎕ TB)한 후, 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리하였다.

제 2 음성 분리를 위한 세포 제조

상기 절차로부터의 세포의 표본(aliquots)을 160-240 ㎕ DMEM/HEPES + 10 % FCS (80 ㎕ / 10⁷ 세포)에서 현탁하였다. 여기에, 40-60 ㎕ 고트(goat) 항-래트 IgG 자기 비드 (20 ㎕ / 10⁷ 세포)를 첨가하였다. 상기 조합물을 잘 혼합하고, 냉장고(4-8℃)에서 15 분 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 5 ml DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 첨가하고, 혼합물을 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리하고, 그 후 상층액을 완전히 제거하였다. 펠렛을 1 ml 찬 가스제거된 DMEM/HEPES + 10 % FCS 에서 재현탁하였다.

제 2 음성 분리 컬럼

2 ml 의 찬 가스제거된 DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 적용시키고, 이를 런(run)시킴으로써 제 2 LD 컬럼을 세척하였다. 배지를 아이스 내의 멸균된 15 ml 수집 튜브로 전달하였다. 그 후, 세포를 LD 컬럼에 적용시키고, 유출액을 수집하였다. 2x 1 ml 가스제거된 배지를 사용하여 컬럼을 세척하고, 고갈된 부분으로서의 총 유출액을 수집하였다. 그 후, 세포를 카운트하고, 1:4 = 10 ㎕ + 10 ㎕ + 20 ㎕ TB 로 희석하였다. 그 후, 혼합물을 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리하였다.

양성 분리를 위한 세포 제조

상기 절차로부터의 펠렛을 항-EpCAM 항체를 함유하는 100 ㎕ DMEM/HEPES + 10 % FCS 에서 재현탁하고, 냉장고(4-8℃)에서 15 분 동안 인큐베이팅하였다. 여기에, 5 ml 의 찬 DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 첨가하고, 조합물을 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하였다. 세포를 20-40 ㎕ 고트 항-래트 IgG 자기 비드가 첨가된, 80-160 ㎕ DMEM/HEPES + 10 % FCS 에서 재현탁하였다. 조합물을 잘 혼합하고, 냉장고(4-8 ℃)에서 15 분 동안 인큐베이팅하였다. 5 ml 의 찬 DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 첨가하고, 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리 한 후, 상층액을 완전히 제거하였다. 세포를 1 ml 의 찬 가스제거된 DMEM/HEPES + 10 % FCS 에서 재현탁하였다.

양성 분리 컬럼

우선, 3 ml 찬 가스제거된 DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 적용시키고, 이를 런(run)시킴으로써, LS 컬럼을 세척하였다. 배지를 15 ml 수집 튜브로 전달하였다. 세포를 LS 컬럼으로 적용시키고, 유출액을 수집하였다. 컬럼을 3 x3 ml DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 사용하여 세척하고, 총 3 ml 를 더욱 첨가하기 전에 통과시켰다. LS 컬럼을 제거하고, 멸균된 15 ml 원심분리 튜브에 위치시켰다. 컬럼에, 5 ml 의 DMEM/HEPES + 10 % FCS 를 첨가하고, 부착물, 컬럼이 보충된 플런져(plunger)를 사용하여 양성 부분을 견고하게 쏟아내었다(flushed out). 세포를 3 분 동안, 21 ℃ 에서 원심분리하고, 1-2 ml MES/HEPES 배지 + 겐타마이신에서 재현탁하였다. 그 후, 수집된 세포에 대하여 세포 카운트를 수행하고, 세포를 TB 로 1:2 로 희석하였다. 세포를 24 웰 플레이트 내의 1-2 x 10⁵ 세포/웰에 위치시켰다.

항체 희석은 하기에 따른다:

음성 선택에 대하여:

SSEA-3 : 최종 희석비 1:50 이 되도록하는 어사이티즈-운크(ascites-unk)를 사용하여, 4 ㎕ 내지 200 ㎕ 를 첨가하여 1:50 으로 희석.

SSEA-1 : 500 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml 의 원액(stock)을 희석하기 위하여, 40 ㎕ 내지 200 ㎕ 를 첨가하여 1:5 로 희석.

양성 선택에 대하여:

EpCAM : 500 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml 의 원액을 희석하기 위하여, 2 ㎕ 내지 100 ㎕ 를 첨가하여 1:50 으로 희석.

MACS 분류 전략에 의하여 선택된 EpCAM + 세포 (~ 98 % 순수)가 내배엽 및 이자 혈통에 있어서 증가되었는지 여부를 시험하기 위하여, QPCR 분석을 분류에 이어 즉시, 및 또한 DMEM + 15 % SR 및 FGF10 (후 분류, 4 일; 도 5)에서의 성장 4 일 후에, 세포 상에서 수행하였다. 이 때, 컬쳐를, [Bonnel-Weir et al, (2001)]의 이자 선조 분화 프로토콜의 변형을 나타내는 조건으로 바꿈으로써, 후-분류된 세포의 이자 분화의 추가적인 강화를 달성하였으며, 이는 마트리겔(Matrigel) 기질 및 BSA, ITS, 베타-메르캅토에탄올, NEAA, L-글루타민, 니코틴아미드, 엑센딘 4 및 FGF10 을 함유하는 DMEM/F12 배지로 구성된다. 후-분류된 세포를 분화 배지(후-분류 25 일, 도 5)에서 21 일 후에 QPCR 및 IHC 에 의하여 추가적으로 분석하였다.

분류 전략이 생체 내에서(in vivo) ES 의 성장 후에 테라토마 형성을 감소시켰는지 여부를 시험하기 위하여, 미분화된 마우스 ES 세포, 또는 분화된, 미분류된 ES 세포-유래 세포 또는 분화된, 새롭게 분류된 ES 세포 후손을, 면역결핍(NOD-SCID) 마우스 내로 이식하였다. 세포의 등급화된 수를 신 피막(renal capsule) 또는 피하적으로 주입하였다. 동물들을 10 주 까지의 기간 동안 종양 형성에 대하여 모니터링하였으며, 피하 종양을 매 3 일 마다 측정하고, 주입된 동물의 신장에 대하여 조직검사를 수행하였다.

실험결과:

도 4 및 도 7 은 QPCR 에 의하여 분석된 분류된 집단에서의 PDX1-발현 세포의 강화를 나타낸다. 도 4 에서, 마우스 ES 세포는 x-축 상에 지시된 바와 같은 상이한 단계로 컬쳐되고, 그 후, 상기 기재된 바와 같이 EpCAM+ 세포에 있어서 분류되었다. Pdx1 유전자 발현을 QPCR 에 의하여 평가하고, 미분화된 ES 세포와 비교하였다 (컬럼 1 및 1.0 폴드로 표준화). 또한, 모든 데이터는 GAPDH 대조 수준으로 표준화되고, 데이터 포인트는 생물학적 2배 또는 3배 샘플을 나타낸다. 상기 데이터는 분류 없이, 이후 단계 컬쳐에서의 pdx1 전사의 추가의 상대적인 증가의 부재를 나타내면서, 세포가 컬쳐 내에서 및 궁극적으로 pdx1 발현 정점(plateaus)에서 분화함에 따라, pdx1 전사가 시간이 경과함에 따라 단지 조금 증가하는 것을 나타낸다. 대조적으로, pdx1 전사는 계속되어 시간이 증가함에 따라 EpCAM+ 세포에서 축적한다. 궁극적으로, 분류된 세포는 미분화된 ES 세포와 비교하여 pdx1 유전자 발현의 > 95-폴드 및 미분류된 세포와 비교하여 4-5 폴드 강화를 나타낸다. 도 7 은 상기 분류 전략을 사용하여 강화된 시간이 경화함에 따라, 내배엽 마커 Sox17 에서 상당한 증가, 및 Oct 4, 미분화된 줄기 세포 마커에서 감소를 나타내는, 또다른 분류 실험의 결과를 나타낸다. 다시, EpCAM+ 분류 세포에서의 pdx1 발현이, 미분류된 집단의 그것에 대하여 3-10 폴드 증가하였다.

약 98% 순수한 EpCAM+ 세포를 4 일 동안, 15 % SR 및 FGF10 을 함유하는 상기 지시된 바와 같은 컬쳐 배지에 위치시키고, 그 후, 니코틴아미드, 엑센딘4 및 FGF10 을 함유하는 혈청 프리(free) 배지 내의 컬쳐에서 추가적인 21 일 동안 컬쳐하였다. 도 5 는 후-분류된 세포에 있어서 상기 상이한 프로토콜은, 더욱 분화된 섬(islet) 표현형에 대한 미분화된 세포 및 내배엽으로부터 벗어난 진행성 경향으로 귀결된다. 더욱 구체적으로, 및 상기 실험에서 제시된 바와 같이, 분류는 pdx1 및 YY 전사의 상당한 강화로 귀결된다(후-분류 0 일 대 미분류). FGF10 보충 배지에서 4 일 후, 컬쳐는 Sox17 전사에서 ~300 폴드 증가를 나타내었다(후-분류 4 일 대 후-분류 0 일). 이는, 증식때문에 발생하기 쉬운 pdx1 또는 Epcam 전사의 감소없이, 4 일에 걸쳐 총 세포 수에서 ~4-5 폴드 증가에 의하여 성취된다. 본 방법에 지시된 바와 같이 혈청 프리 배지에서 21 일 동안 (25일 후-분류 까지) 상기 확장된 집단의 후속하는 컬쳐는, 미분화된 줄기 세포의 위탁된 분화를 나타내면서, 미분화된 줄기 세포 마커(Oct 4) 에서, 상당한 (dramatic) 감소로 귀결되었다. 또한, Sox17 전사에서의 감소에 기초한 내배엽의 성숙이 있었다. 동시에, 본 발명자들은 이자 마커 유전자 발현(Pdx1 , YY 및 인슐린)의 수준에서의 일관되며, 상당한 증가를 관찰하였다. 상기 분화 조건 하에서, 세포는 그 형태를 두드러진 방법으로 변경하였고, 연합(coalescing)하여, 궁극적으로 세관-유사(tubule-like) 또는 관-유사(duct-like) 구조를 형성하였다. 전체적으로, 미분류된 세포와 비교하여, 추가적인 확장 및 분화를 유도하는 분류 스킴(scheme) 및 컬쳐 프로토콜은, 이자 전구체 세포에서, 대략 12- 폴드의 총 집단의 0.07 % 내지 총 집단의 0.9 % 의 증가를 나타내었다. 또한, 상기 프로토콜은 세포를 발현하는 인슐린에서 성공적으로 50-폴드 증가를 생성하였다. 유전자 발현 및 형태의 상기와 같은 변화는, 이자발생과정(pancreaticogenesis) 동안, 배에서 발생하는 다수의 세포 및 분자 변화를 반영한다.

Oct4 발현의 상당한 감소에 근거하여, EpCAM+ 세포가 테라토마를 덜 형성하는 경향이 있다는 가설을 세웠다. 따라서, 상기 가설을 시험하기 위한 실험을 설계하였다. 우선, 8주된 면역결핍 NOD-SCID 마우스의 신 피막 하에서, 0.5 × 10⁶ 미분화된 뮤린 ES 세포 또는 분화된 뮤린 ES 세포의 미분류된 집단을 이식하였다. 신장을 주입 3 주 후 수집하였다. 상기 모든 동물들은 가시적인 종양으로 심하게(grossly) 발달하였다. 대조적으로, 0.5 × 10⁶ SSEA1 음성, SSEA3 음성, 및 EpCAM 양성 세포가 주입된 동물들은, 심하게 또는 조직학적으로 테라토마를 발달시키지 않았다(5마리 동물 중 0 마리). 따라서, MACS-분류 세포는 면역결핍 마우스의 신 피막 하에서 주입시 테라토마를 생성시키지 않는다. 도 6 은 또다른 실험을 나타내며, 여기서 세포는 피하적으로 접종된다. 상기 실험은 또한 또다른 대조 세포 집단, SSEA1-, SSEA3-, 및 EpCAM- 분류 세포 집단을 포함하며, 10 주까지 동안 성장을 시험하였다. 피하 지점에서, 마우스 내에 접종된 미분화된 ES 세포는 빠르게 큰 테라토마(>10mm)로 성장하였으며, 분화된 세포 또한 빠르게 종양을 형성하였다(도 6). 중요하게도, 미분화된 ES 세포는 또한 일반적으로 면역-경쟁력있는(immunocompetent) 마우스에서 테라토마를 형성하였다(데이터는 제시되지 않음). 놀랍게도, 3-단계 전략에 의하여 상기 분류된 EpCAM+ 분화된 세포는 종양을 형성하지 않았다(도 6). 접종 후 10 주 까지 변화되지 않은 상태로 남으면서, 3 mm 미만의 크기인 안정한 결절(nodule)이 EpCAM+ 분류 세포 주입의 모든 경우에 형성되었다. 결절의 조직학적 분석은 샘(glandular) 구조의 우세, 내배엽 유도체의 암시를 나타내었다. 테라토마에서 전형적으로 관찰되는 기타 배(germ) 층의 다중의 변화하는 유도체는 결절에 존재하지 않았다. 비록 분류된 세포 집단이 생체 내에서(in vivo) 테라토마를 형성하지 않았다 하더라도, 분류된 집단의 죽음 또는 에이폽토시스(apoptosis)가 테라토마 형성의 결핍의 원인이 아님을 나타내면서, 세포는 본원에서 밝혀진 특정 조건 하에서, 시험관 내에서(in vitro) 생존하고 증식하였다. 또한, 이는 동시에 결과적인 세포 집단의 종양원성을 감소하는 동안, 시험관 내에서(in vitro) 세포의 확장을 위한 조건이 안출되어왔다는 것을 지시한다.

상기 언급된 3 가지 방법 모두, 최초 미분화된 줄기 세포 컬쳐로부터, 내배엽 및 이자 혈통으로 지시되는 세포의 집단을 증가시키는 결과를 나타내었다. 특히, MACS 분류 전략은 이자 분화를 강화시키고, 잔여의 미분화된 ES 세포를 감소시킴으로써 분화된 ES 세포 유도체의 종양원성을 감소시켰다. 따라서, MACS 분류 스킴에 의하여 선택된 EcCAM 양성 세포는, 내배엽 및 이자 혈통에 대하여 강화화하는 능력을 제공하는 것 외에, 궁극적인 임상 치료 적용에 있어서 중요한 성질인, 덜 종양원성이다. 이는 외인성 유전자의 ES 세포 내로의 도입을 수반하지 않는 ES 세포 후손에 있어서 감소된 또는 제거된 종양원성 능력의 최초의 실증인 것으로 여겨진다.

Claims

내배엽 및 이자 혈통(pancreatic lineages)의 세포를 위한, 줄기 세포로부터 유래된 컬쳐(culture)를 강화(enrich)하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:

줄기 세포를 배아유사체(embryoid bodies)의 형성으로 컬쳐하는 단계; 및

종 적합(species appropriate) 세포 표면 단계-특이적 배아의 발현을 위하여 배아유사체 중에서 선택하고, 내배엽 및 이자 세포로의 분화를 위한, 세포 표면 단계-특이적 항원을 발현하지 않는 배아유사체 만을 컬쳐하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포이고, 종 적합 표면 항원이 단계 특이적 배아 항원-1인 방법.
제 2 항에 있어서, SSEA-1 의 발현에 대항하고, 상피 세포 표면 항원(EpCAM)의 발현을 위한 선택을 추가로 포함하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 선택이 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting)에 의하여 수행되는 방법.
인간 배아 줄기 세포로부터 유래한 컬쳐를, 내배엽 및 이자 혈통의 세포로 강화하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:

줄기 세포가 분화를 시작하는 것을 가능케 하는 조건 하에서, 인간 배아 줄기 세포를 컬쳐하는 단계; 및

배아 줄기 세포 컬쳐를 섬유모세포 성장 인자 10 (FGF10)로 보충하는 단계.
제 5 항에 있어서, SSEA-1 의 발현에 대항하는 선택, SSEA-3 의 발현에 대항하는 선택, 및 상피 세포 표면 항원 (EpCAM) 의 발현을 위한 선택의 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 선택이 자기 활성화 세포 분류에 의하여 수행되는 방법.
줄기 세포로부터 유래한 컬쳐를, 내배엽 및 이자 혈통의 세포로 강화하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:

줄기 세포가 분화를 시작하는 것을 가능케 하는 조건 하에서, 줄기 세포를 컬쳐하는 단계; 및

단계 특이적 배아 항원-1 (SSEA-1)의 발현의 결핍을 위하여, 단계 특이적 배아 항원-3 (SSEA-3)의 발현의 결핍을 위하여, 및 상피 세포 표면 항원 (EpCAM) 의 발현을 위하여, 줄기 세포를 선택하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 선택이 자기 활성화 세포 분류에 의하여 수행되는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 분화를 시작하는 것을 가능케 하는 줄기 세포를 컬쳐하는 단계가, 배아 유사체의 형성을 촉진하는(encourage) 줄기 세포를 컬쳐하는 것을 포함하는 방법.
하기 단계를 포함하는, 종양원성 능력(tumorigenic capability)을 가지지 않는 줄기 세포 유래 세포 집단을 창조(creation)하는 방법:

줄기 세포가 분화를 시작하는 것을 가능케 하는 조건 하에서, 줄기 세포를 컬쳐하는 단계; 및

미분화된 상태와 연관된 세포 표면 마커의 발현의 결핍을 위하여, 및 특정 분화된 혈통으로의 위탁(commitment)을 지시하며, 그 결과 세포 컬쳐가 면역손상(immunocompromised) 마우스 내로 주입시 테라토마를 형성하지 않는 세포 표면 마커의 발현을 위하여, 줄기 세포를 선택하는 단계.
제 12 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 미분화된 상태와 연관된 세포 표면 마커가 SSEA-1 및 SSEA-3 인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 특정 분화된 혈통으로의 위탁을 지시하는 세포 표면 마커가, 상피 세포 표면 항원(EpCAM)인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 선택이 자기 활성화 세포 분류에 의하여 수행되는 방법.