KR101687344B1

KR101687344B1 - 평면 기재상의 세포 부착 및 배양을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR101687344B1
Application number: KR1020117013831A
Authority: KR
Inventors: 첸야씨옹; 벤자민 프라이어
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2008-11-20
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2016-12-16
Also published as: AU2009316583B2; KR20110089426A; BRPI0921996A2; EP2366022B1; US20180258387A1; JP5719305B2; ES2584053T3; RU2547925C2; AU2009316583A1; JP2012509086A; CN102257132B; AU2016206314B2; HK1162191A1; CA2744227C; PL2366022T3; WO2010059778A1; EP2366022A1; RU2011124902A; CA2744227A1; AU2016206314A1

Abstract

본 발명은 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재상에서의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법에 관한 것이다.

Description

평면 기재상의 세포 부착 및 배양을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR CELL ATTACHMENT AND CULTIVATION ON PLANAR SUBSTRATES}

본 발명은 출원 번호 제61/116,452호(출원일: 2008년 11월 20일)에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 흡착층(adlayer) 및 영양 세포층(feeder cell layer)이 결여된 평면 기재상의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법에 관한 것이다.

포유류 세포의 배양은 생명 과학 및 보건 과학에서 많은 공정들 중 하나이다. 고정-의존성 세포를 수반하는 포유류 세포 배양 및 분석을 위한 용기는 흔히 예를 들어 폴리스티렌과 같은 중합체 또는 유리로 만들어지며, 이는 빈번하게는 세포가 용기 표면에 부착되게 하는 추가의 표면 처리를 필요로 한다. 그러한 처리는 예를 들어 흡착, 그래프팅 또는 플라스마 중합 기술에 의해 표면 상에 흡착층을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표면 처리는 용기 표면 그 자체의 화학적 개질을 통한 것일 수 있으며, 이는 예를 들어 대기 코로나, 무선 주파수 진공 플라스마(radio frequency vacuum plasma), DC 글로우 방전(glow discharge), 및 마이크로파 플라스마 처리(microwave plasma treatments)에 의해 성취될 수 있다.

만능 줄기 세포, 특히 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포를 배양하는 현재의 방법은 복잡한 배양 조건들, 예를 들어 영양 세포층을 갖는 고형 기재 표면 상에서 또는 세포외 기질 단백질의 흡착층을 갖는 고형 기재 표면 상에서 배아 줄기 세포를 배양하는 것을 필요로 한다. 이들 방법을 이용하는 배양 시스템에서는 흔히 배양되고 있는 줄기 세포의 종과는 다른 종으로부터 얻어지는 세포외 기질 단백질(이종(xenogeneic) 물질) 또는 영양 세포가 사용된다. 영양 세포에의 노출에 의해 얻어지는 배지, 즉 미분화 ES 세포 이외의 세포에 의해 조절된 배지를 사용하여 ES 세포를 배양할 수 있으며, 배지는 동물 혈청으로 보충될 수 있다.

예를 들어, 문헌[Reubinoff et al., Nature Biotechnol. 18:399-404, 2000] 및 문헌[Thompson et al., Science 282:1145-1147, 1998]에는 마우스 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용한 인간 배반포 유래의 ES 세포주의 배양이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Xu et al., Nature Biotechnology 19: 971-974, 2001]에는 인간 ES 세포를 분화 없이, 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리하기 위한 매트리젤(MATRIGEL)® 및 라미닌의 사용이 개시되어 있다. 다른 예에서, 문헌[Vallier et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005]에는 인간 ES 세포를 분화 없이, 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리하기 위한 우태아 혈청의 사용이 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.

다른 예에서, 문헌[Wanatabe et al., Nature Biotechnol. 35:681-686, 2007]은 "ROCK 저해제는 해리된 인간 배아 줄기 세포의 생존을 가능케 한다"고 진술하며, 마우스 배아 섬유아세포를 영양 세포로서 사용하고, 콜라겐 및 매트리젤®을 세포외 기질 단백질로 사용하고 Y-27632 또는 파수딜(Fasudil)을 ROCK의 저해를 위하여 사용하여, 해리-유도된 아폽토시스(apoptosis)의 감소, 클로닝 효율의 증가 (대략 1%로부터 대략 27%로) 및 유전자 전달 후 서브클로닝(subcloning)의 촉진을 입증한다. 더욱이, Y-27632로 처리한 해리된 인간 ES 세포는 무혈청 현탁 배양에서 아폽토시스로부터 보호되었다.

다른 예에서, 문헌[Peerani et al., EMBO Journal 26:4744-4755, 2007]은 "인간 배아 줄기 세포(hESC) 배양의 공간적 구성의 복잡성은 hESC 운명에 영향을 주는 이질적인 미시환경(microenvironments)(니치(niche))을 생성한다. 이 연구는 hESC 분화의 속도 및 진행 경로(trajectory)가 hESC 니치 특성의 엔지니어링에 의해 제어될 수 있음을 입증한다. 니치 크기 및 조성은 분화 유도 인자와 분화 저해 인자 사이의 균형을 조절한다. 기계적으로는, Smad1 시그널링(signaling)의 니치 크기-의존적인 공간적 구배는 hESC와 hESC-유래된 배외 내배엽(extra-embryonic endoderm, ExE) 사이의 길항적 상호작용의 결과로서 생성된다. 이들 상호작용은 ExE에 의한 골형성 단백질-2(bone morphogenetic protein-2, BMP2)의 그리고 hESC에 의한 그의 길항제인 성장 분화 인자-3(growth differentiation factor-3, GDF3)의 국소화된 분비에 의해 매개된다. Rho-관련 키나아제(Rho-associated kinase, ROCK)의 저해제를 이용한 처리뿐만 아니라 GDF3, BMP2 및 Smad1에 대한 siRNA(small interfering RNA)로 처리된 hESC의 미세패터닝(micropatterning)도 Smad1 활성화의 독립적인 제어가 hESC의 콜로니 크기-의존적 분화를 구제할 수 있음을 보여준다. 우리의 결과는, 공간 정보의 통합에서 그리고 hESC 자기-재생 및 분화의 니치-크기 의존적 제어에서 Smad1의 역할을 예시한다."고 진술한다.

다른 예에서, 문헌[Koyanagi, M et al., J Neurosci Res. 2008 Feb 1; 86(2): 270-80]은 "Rho-GTPase가 뉴런을 비롯한 많은 세포 유형의 아폽토시스에 연루되나, 이의 작용 메카니즘이 완전히 이해되지 않았다. 여기서, 우리는 배아 줄기 세포-유래된 신경 전구 세포의 이식 동안의 아폽토시스에서의 Rho 및 ROCK의 역할을 조사하였다. 우리는 신경 전구체의 해리가 Rho를 활성화시켜 아폽토시스를 유도함을 알아내었다. Rho 저해제 C3 세포외효소(exoenzyme) 및/또는 ROCK 저해제 Y-27632를 이용한 처리에 의해 해리-유도된 아폽토시스(아노이키스(anoikis))의 양이 20-30% 감소된다. 아폽토시스의 초기의 형태적 징후인 막 수포형성(Membrane blebbing); 카스파아제(caspase)-3의 절단; 및 미토콘드리아로부터의 사이토크롬(cytochrome) c의 방출이 또한 ROCK 저해에 의해 감소된다. 이들 결과는 신경 전구 세포의 해리가 Rho/ROCK 경로를 통하여 적어도 부분적으로 매개되는 고유 세포 사멸 경로를 이끌어낸다. 게다가, 동물 이식 모델에서, Rho 및/또는 ROCK의 저해는 이식된 세포의 급성 아폽토시스를 억제한다. 이식 후, 종양 괴사 인자-알파 및 프로-신경 성장 인자가 이식편 주위에서 강하게 발현된다. ROCK 저해는 이들 염증성 사이토카인에 의해 향상되는 아폽토시스를 또한 억제한다. 종합해 보면, 이들 결과는 Rho/ROCK 시그널링의 저해가 세포 대체 요법에서 이식된 세포의 생존을 개선시킬 수 있음을 나타낸다."고 진술한다.

이종 재료의 사용은 만능 줄기 세포를 이용하는 소정의 응용에 부적당할 수 있다. 대안적인 재료가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Stojkovic et al., Stem Cells 23:895-902, 2005]에는 인간 ES 세포를 분화 없이, 영양 세포 없이 배양하기 전에 고형 기재 표면을 처리하기 위하여 인간 혈청을 사용하는 것이 개시되어 있다.

대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다.

예를 들어, 문헌[Cheon et al., BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 Oct 2005]에는 ES 세포가 자가-재생을 일으키게 촉발시킬 수 있는 상이한 성장 인자가 보충된 비조절된 혈청 대체 배지에서 ES 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Levenstein et al., Stem Cells 24: 568-574, 2006]에는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 ES 세포의 장기 배양을 위한 방법이 개시되어 있다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 ES 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유하는 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며, FGF 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 적어도 약 100 ng/mL의 FGF를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 염기성 FGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며, 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 기질 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 염기성 섬유아세포 성장 인자; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하였으며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.

만능 줄기 세포는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 잠재적인 자원을 제공한다. 현재, 인간 ES 세포주의 대규모 배양은 문제가 있으며, 상당한 난제를 제공한다. 이들 난제에 대한 가능한 해법은 인간 ES 세포를 단일 세포로서 계대 및 배양하는 것이다. 단일 세포는 예를 들어 계수, 트랜스펙션(transfection) 등과 같은 표준 조직 배양 기술에 더욱 기꺼이 따른다.

예를 들어, 니콜라스(Nicolas) 등은 렌티바이러스(lentivirus) 벡터에 의한 유전자 변형 이후 형광-활성화 세포 분류에 의해 단리된 단일 세포로부터 인간 ES 세포주를 생성 및 확장시키는 방법을 제공한다(문헌[Stem Cells Dev. 16:109-118, 2007]).

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제2005158852호에는 "단일 인간 배아 줄기 세포의 성장 및 생존을 개선시키는" 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 단일 미분화 hES 세포를 수득하는 단계; 단일 미분화 세포를 세포외 기질과 혼합하여 상기 세포를 둘러싸는 단계; 및 상기 혼합물을 성장 환경에서 영양 배지를 이용하여 영양 세포 상에 접종하는 단계를 포함한다.

다른 예에서, 문헌[Sidhu et al., Stem Cells Dev. 15:61-69, 2006]에는 유세포 분석법에 의한 단일 세포 제제의 분류에 의해 모 주(parent line)인 hES3으로부터 유래되는 세 가지 인간 ES 세포 클론, hES 3.1, 3.2 및 3.3을 처음으로 보고하는 것이 기재되어 있다.

그러나, 인간 ES 세포를 단일 세포로서 계대 및 배양하는 것은 유전자 이상 및 만능성의 손실에 이르게 된다. 배양 조건이 유전자 안정성 및 만능성의 유지에서 중요하다. 일반적으로, 인간 ES 세포주의 계대는 수동으로 행해지거나 또는 콜라게나아제, 리버라아제 또는 디스파아제와 같은 효소 에이전트(agent)를 이용하여 행해진다.

예를 들어, 드레이퍼(Draper) 등은 "다섯 가지 독립적인 경우에 세 가지의 독립적인 인간 배아 줄기 세포주에서 염색체 17q의 획득을 포함하는 핵형 변화"의 존재를 언급하고 있다(문헌[Nature Biotechnol. 22:53-54, 2004]).

다른 예에서, 버자드(Buzzard) 등은 "우리는 단지 하나의 핵형 변화 이벤트를 여하튼 탐지하였다. 사용된 배양 방법은, 우리의 방법이 대부분의 다른 그룹에 의해 사용된 것과 명백히 상이하다면, 우리의 결과와 약간의 관계가 있었을 수 있다. 전형적으로 우리는 파쇄된 피펫의 에지를 이용하여 먼저 콜로니를 절개함으로써 7일 후에 인간 ES 세포를 계대한다. 효소적 또는 화학적 세포 해리 방법은 이 방법에 전혀 포함되지 않는다. 우리는 이것이 우리 수중의 hES(인간 ES) 세포의 상대적인 세포유전학적 탄력성을 설명할 수 있다고 추측한다."고 진술한다(문헌[Nature Biotechnol. 22:381-382, 2004]).

다른 예에서, 미탈리포바(Mitalipova) 등은 "벌크 계대 방법은 배양물에서의 장기간 계대 후 이수성(aneuploid) 세포 집단을 영속시킬 수 있지만, 핵형을 손상시키지 않고서 보다 짧은 기간 동안 (최대 적어도 15회의 계대) 사용될 수 있으며, 장기간 수동 증식 조건에 이어서 단독의 수동 계대 방법보다 더 많은 양의 hES 세포를 필요로 하는 실험에서 한정된 벌크 계대 하에서 hES 세포에서 정상 핵형을 유지할 수 있다."고 진술한다(문헌[Nature Biotechnol. 23:19-20, 2005]).

다른 예에서, 헹(Heng) 등은 "당해 결과는 두 번째 프로토콜(온건한 피펫팅을 이용한 트립신 처리)이 첫 번째 프로토콜(스크래칭을 이용한 콜라게나아제 처리)보다 세포 생존력에 훨씬 덜 해롭다. 이는 다시 보다 큰 동결-해동 생존률로 바뀌어졌다."고 진술한다 (문헌[Biotechnology and Applied Biochemistry 47:33-37, 2007]).

다른 예에서, 하세가와(Hasegawa) 등은 "우리는 완전한 해리를 용인하는 hESC 하위주(subline)를 확립하였다. 이들 세포는 높은 재도말 효율과, 또한 높은 클로닝 효율을 나타내며, 상기 세포는 삼배엽층(three germ layers)으로 분화되는 그의 능력을 유지한다."고 진술한다 (문헌[Stem Cells 24:2649-2660, 2006]).

다른 예에서, 미국 특허 출원 제61/030,544호는 적어도 약 0.9% 질소 내지 적어도 약 11% 질소 및 적어도 약 12% 산소 내지 적어도 약 30% 산소를 함유하고, 흡착층 및 영양 세포가 결여된 고형 기재 표면에 대한 세포 부착, 이 위에서의 배양 및 이로부터의 탈리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포는 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리된다.

영양 세포 및 흡착층의 부재 하에 만능 줄기 세포를 비롯한 세포를 이 세포의 만능성을 유지하면서 배양하기 위한 방법 및 조성물이 상당히 필요하다. 본 발명은 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재상의 만능 줄기 세포의 성장, 증식 및 분화 방법을 제공하며, 여기에서, 세포는 평면 기재에 결합하기 위하여 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물로의 처리를 필요로 하지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명은 약 12% 이하의 N, 적어도 약 12% 내지 적어도 약 55%의 O 및 약 18도 내지 약 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착, 배양 및 분화를 위한 방법을 제공한다.

<도 1>
도 1은 인간 배아 줄기 세포 H1의 평면 기재에 대한 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 H-1152의 효과를 나타낸 것이다. 패널 a): 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(표 1에서 막 번호 2) 상의 세포 부착을 도시. 패널 b): 나일론 막(표 1에서 막 번호 4) 상의 세포 부착을 도시. 패널 c): 셀룰로오스 아세테이트 막(표 1에서 막 번호 5) 상의 세포 부착을 도시. 패널 d): 폴리카보네이트 막(표 1에서 막 번호 7) 상의 세포 부착을 도시. 패널 e): 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막(표 1에서 막 번호 12) 상의 세포 부착을 도시.
<도 2>
도 2는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 혼합 셀룰로오스 에스테르 막에 대한 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 Y-26732의 효과를 나타낸 것이다. 패널 a): 대조군 웰 내의 세포 부착을 도시. 패널 b): 10μM의 Y-26732로 처리한 세포에 대한 세포 부착을 도시. 패널 c): 20μM의 Y-26732로 처리한 세포에 대한 세포 부착을 도시.
<도 3>
도 3은 매트리젤® 코팅 표면(실선) 및 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(표 1에서 막 번호 1)(점선)에서의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 증식 곡선을 나타낸 것이다.
<도 4>
도 4는 세포주 H1의 인간 배아 줄기 세포의 대표적인 세포로부터의 G-밴드형(banded) 염색체를 나타낸 것이다. 패널 a): 10 계대 동안 매트리젤® 코팅 표면 상에서 배양한 세포로부터의 염색체를 도시. 패널 b): 10 계대 동안 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(표 1에서 막 번호 1) 상에서 배양한 세포로부터의 염색체를 도시.
<도 5>
도 5는 폴리카보네이트 막에 대한 부착에서의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포에 대한 Rho 키나아제 저해제 Y26732의 효과를 나타낸 것이다. 패널 a): 대조군 웰 내의 세포 부착을 도시. 패널 b): 10μM의 Y-26732로의 처리 후의 세포 부착을 도시. 패널 c): 20μM의 Y-26732로의 처리 후의 세포 부착을 도시.
<도 6>
도 6은 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 폴리카보네이트 막(표 1에서 막 번호 7)에 대한 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 H-1152의 효과를 나타낸 것이다. 패널 a): 대조군 웰 내의 세포 부착을 도시. 패널 b): 0.03μM의 H-1152를 배지에 첨가하는 경우의 세포 부착을 도시. 패널 c): 0.1μM의 H-1152를 배지에 첨가하는 경우의 세포 부착을 도시. 패널 d): 0.3μM의 H-1152를 배지에 첨가하는 경우의 세포 부착을 도시. 패널 e): 1μM의 H-1152를 배지에 첨가하는 경우의 세포 부착을 도시. 패널 f): 3μM의 H-1152를 배지에 첨가하는 경우의 세포 부착을 도시.
<도 7>
도 7은 Rho 키나아제 저해제 H-1152를 세포 배양 배지로부터 제거한 후의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 폴리카보네이트 막(표 1에서 막 번호 9)으로부터의 탈리를 나타낸 것이다. 패널 a): 3μM의 H-1152를 배양 배지 내에서 유지하는 경우의 세포 탈리를 도시. 패널 b): H-1152를 배양 배지로부터 제거한 경우의 세포 탈리를 도시.
<도 8>
도 8은 다음을 포함하는 평면 기재에 대한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 부착에서의 막 기공 크기 및 Rho 키나아제 저해제 처리의 효과를 나타낸 것이다: 패널 a 및 c에서 표1의 폴리카보네이트 막 번호 10; 및 패널 b 및 d에서 표 1의 폴리카보네이트 막 번호 11. 패널 a 및 b): 3μM의 H-1152를 배양 배지 내에서 유지하는 경우의 세포 탈리를 도시. 패널 c 및 d): H-1152를 배양 배지로부터 제거한 경우의 세포 탈리를 도시.
<도 9>
도 9는 3 계대 동안 폴리카보네이트 막(표 1에서 막 번호 8)에서 배양한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서 만능성과 관련된 마커의 발현의 유지를 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 유전자의 발현은 리얼-타임(real-time) PCR에 의해 결정하였다. 솔리드(solid) 막대는 미분화 인간 배아 줄기 세포주 H1로부터 수득한 데이터를 나타낸 것이다. 해쉬형(Hashed) 막대는 폴리카보네이트 막 상에서 배양한 세포로부터 수득한 데이터를 나타낸 것이다.
<도 10>
도 10은 폴리카보네이트 막(표 1에서 막 번호 8) 상에서 12 계대 동안의 배양 이후에, 인간 배아 줄기 세포주 H1이 배상체(embryoid body)를 형성하는 능력을 나타낸 것이다. 도면은 단일의 실험으로부터의 대표적인 데이터를 나타낸 것이다.
<도 11>
도 11은 본 발명의 평면 기재의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다.
<도 12>
도 12는 울트라웨브(ULTRAWEB)™ 평면 기재의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다.
<도 13>
도 13은 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 다양한 평면 기재에 대한 결합에서의 규명된 배지 mTESR™의 효과를 나타낸 것이다.

개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특색, 실시 양태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "흡착층"은 공유 (그래프팅으로도 공지됨) 또는 비-공유 (흡착으로도 공지됨) 결합 중 어느 하나에 의해 표면에 분자를 부착시킴으로써 고형 기재의 표면 상에 형성되는 층을 말한다. 예를 들어, 흡착층을 만드는 데 사용되는 분자는 예를 들어 세포외 기질 단백질, 아미노산 등을 포함할 수 있는 단백질성 분자, 및 예를 들어 폴리에틸렌이민과 같은 비-생물 분자일 수 있다.

"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1, 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대한 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 베타, MAFA, PAX4 또는 PAX6. β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키어리(Brachyury), 믹스-유사(Mix-like) 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-키트(Kit), CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, NKX6.1 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(원시 창자관) 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배 중의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커를 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-키트, CD99 및 MIXL1.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 ,"췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "배자외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포군을 말한다: SOX7, AFP 또는 SPARC.

"세포외 기질 단백질"은 체내 또는 태반에서 세포들 사이에서 보통 발견되는 단백질성 분자를 말한다. 세포외 기질 단백질은 조직, 체액, 예를 들어 혈액, 또는 비-재조합 세포 또는 재조합 세포 또는 박테리아로 조절된 배지로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 레벨 증가 및 음성 마커의 레벨 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소더민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF3 베타, GSC, FGF17, 또는 GATA6.

본 명세서에 사용되는 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.

본 명세서에 사용되는 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.

줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.

분화는 특화되지 않은 ("미결정된(uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표면"은 세포 배양 또는 분석에서 사용하려고 하는 고형 기재 용기 또는 매트릭스의 분자의 최외층을 말한다. 표면의 원소 조성, 거칠기(roughness) 및 습윤성은 각각 X-선 광전자 분광법(X-Ray Photoelectron Spectroscopy, XPS), 원자력 현미경법(Atomic Force Microscopy, AFM) 및 접촉각 측정에 의해 분석할 수 있다.

다양한 용어가 배양 중인 세포를 설명하기 위하여 사용된다. "유지"는 일반적으로 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어지거나 이어지지 않을 수 있다. "계대"는 세포를 하나의 배양 용기로부터 제거하고, 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 이들을 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.

세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양, 즉 조직으로부터 세포를 분리한 후 첫번째 배양을 P0으로 명명한다. 첫번째 계대배양(subculture) 후에, 세포를 2차 배양으로 기재한다(P1 또는 계대 1). 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증식(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기재, 배지, 성장 조건 및 계대 간 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 좌우된다.

본 발명의 평면 기재

본 발명에 사용하기에 적합한 평면 기재는 만능 세포가 부착할 수 있는 지지체를 제공할 수 있는 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 평면 기재는 폴리카보네이트로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 평면 기재는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PETE)로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 평면 기재는 나일론으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 평면 기재는 셀룰로오스 아세테이트로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 평면 기재는 혼합 셀룰로오스 에스테르로 이루어질 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 평면 기재의 예는 표 1에서 찾을 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명은 약 12% 이하의 N, 적어도 약 12%의 O 내지 적어도 약 55%의 O 및 약 18도 내지 약 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착, 배양 및 분화를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 적어도 약 8%의 N 내지 적어도 약 12%의 N 및 적어도 약 12%의 O 내지 적어도 약 55%의 O를 함유하는 평면 기재는 거친 섬유 표면, 또는 대안적으로 평활한 표면일 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 약 12% 이하의 N, 적어도 약 12%의 O 내지 적어도 약 55%의 O 및 약 18도 내지 약 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착 방법을 제공한다:

a. 만능 줄기 세포의 현탁액을 수득하는 단계, 및

b. 세포 현탁액을 평면 기재에 첨가하고, 세포가 부착되게 하는 단계.

일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 세포가 표면에 부착한 후에, 배양에서 유지된다. 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 세포가 표면에 부착된 후에, 평면 기재상에서 분화된다.

일 실시형태에서, 약 12% 이하의 N, 적어도 약 12%의 O 내지 적어도 약 55%의 O 및 약 18도 내지 약 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층 및 영양 세포층이 결여된 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포 부착은 세포를 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리함으로써 증진된다. Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물은 세포가 부착된 후에 세포로부터 제거될 수 있다.

Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물은 Y-27632, 파수딜, H-1152 및 하이드록시파수딜로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 상기 적어도 하나의 화합물은 약 10 μM의 농도로 사용된다.

본 발명의 평면 기재의 특성화

일 실시형태에서, 본 발명의 평면 기재 표면의 원소 조성은 X-선 광전자 분광법(XPS)으로 분석될 수 있다. 화학분석용 전자 분광법(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis, ESCA)으로도 공지된 XPS는 어떤 원소 또는 원자가 고형 기재 표면에 존재하는지를 결정하고(수소 및 헬륨을 제외한 모든 원소의 0.1 원자 퍼센트 초과의 농도가 검출될 수 있음), 그러한 원소 또는 원자의 결합 환경을 결정하기 위한 방법으로서 사용된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 평면 기재 표면의 거칠기는 원자력 현미경법(AFM)으로 분석될 수 있다. 0.1 ㎚(1 Å) 까지의 측면 해상도 및 0.01 ㎚(0.1 Å)까지의 수직 해상도를 갖는 표면 원자 또는 분자는 AFM에 의해 이미지화될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 평면 기재 표면의 습윤성은 접촉각의 측정에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 정적 세실 드롭법에 의한 접촉각 측정은 고형 기재 표면과 액체 사이의 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 접촉각은 고형 기재의 표면 상에 있는 액체 드롭의 형상을 설명하며, 고형 기재의 표면 상의 액체의 접촉각이고, 이는 액체, 고체 및 기체가 만나는 접촉 라인에서 액체 내에서 측정된다. 물 접촉각이 90°보다 큰 표면은 소수성이라고 하며, 물 접촉각이 90°보다 작은 표면은 친수성이라고 한다. 극도로 친수성인 표면, 즉 물에 대한 친화도가 높은 표면 상에서, 물 소적은 완전히 퍼지게 된다 (0°의 유효 접촉각).

일 실시 형태에서, 본 발명의 평면 기재 표면의 음전하 밀도는 이 표면의 크리스탈 바이올렛(crystal violet)과의 반응성을 측정함으로써 분석될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 양전하를 지니는데, 상기 양전하는 크리스탈 바이올렛이 음으로 하전된 분자 및 분자의 부분, 예를 들어 중합체 표면 상에 존재하는 음으로 하전된 작용기에 결합하는 것을 가능하게 한다. 높은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면과 낮은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면이 동일한 거칠기 및 그에 따라 동일한 면적을 갖는다면, 높은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면은 낮은 크리스탈 바이올렛 반응성을 갖는 표면보다 더 높은 밀도의 음전하를 갖는다.

만능 줄기 세포

만능 줄기 세포의 특성화

만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다(문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사(Vector Laboratories, Burlingame Calif.)가 설명한 바와 같이 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출되는 바와 같이, OCT-4 및 TERT를 발현한다.

증식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배상체를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배상체를 평가함으로써 결정될 수 있다.

증식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.

만능 줄기 세포의 공급원

사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능성 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 만능성 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다. 비-만능 세포, 예를 들어, 성인 체세포로부터 유래된 만능 줄기 세포도 또한 적합하다.

일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등에 의해 문헌 [참조: 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조된다.

만능 줄기 세포의 배양

일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따른 배양 이전에 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 세포외 기질 단백질 또는 영양 세포의 층 상에서 배양된다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 영양 세포 층 상에서 배양된다. 영양 세포층 상에서 만능 줄기 세포를 분화 없이 성장시키는 것은 (i) 영양 세포 층을 포함하는 배양 용기를 수득하는 것; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 미-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.

다른 예에서, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양 세포가 없는 배양에서 분화 없이 만능 줄기 세포를 성장시키는 것은 (i) 하나 이상의 세포외 기질 단백질을 갖는 고형 기재 표면 상의 흡착층; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 미-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.

대안적인 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 미-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지에서, 혼합 셀룰로오스 에스테르를 포함하는 평탄한 표면 상에서 배양된다.

배양 배지: 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 일례를 미국 특허 출원 공개 제20020072117호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 미국 특허 제6642048호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 국제특허 공개 WO2005014799호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 문헌[Xu et al., Stem Cells 22: 972-980, 2004]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20070010011호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Cheon et al., BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 Oct 2005]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Levenstein et al., Stem Cells 24: 568-574, 2006]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050148070호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050233446호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 제6800480호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050244962호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 국제특허 공개 제WO2005065354호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 국제특허 공개 제WO2005086845호에서 찾아볼 수 있다.

적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마 # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 또한 제조될 수 있다.

만능 줄기 세포의 분화

본 발명의 일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 그들의 만능성을 유지하면서 배양에서 증식된다. 시간에 따른 세포의 만능성의 변화는 만능성과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 결정할 수 있다. 대안적으로, 만능성의 변화는 분화와 관련된 마커, 또는 다른 세포 유형과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 모니터할 수 있다.

다른 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 배양에서 증식되며, 이어서 다른 세포 유형으로의 그 분화를 촉진하는 방식으로 처리된다. 다른 세포 유형은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 신경 세포, 심장 세포, 간세포 등으로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2007030870호에 개시된 방법에 따라 신경 전구체 및 심근세포로 분화될 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 개시된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnol. 23:1534-1541, 2005]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131:1651-1662, 2004]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25: 29 - 38, 2007]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-키트, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.

만능 줄기 세포는 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006]에 개시된 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 한 측면에서, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.

본 발명의 일 면에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, 및 하기의 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4 및 PAX6. 본 발명의 일 면에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 평면 기재에 대한 인간 배아 줄기 세포의 부착.

Rho 키나아제 저해제 Y26732는 표면 개질된 플레이트 상에서 인간 배아 줄기 세포의 부착을 증진시키는 것으로 나타났다(미국 특허 출원 제 61/030,544호 참고). 본 발명의 연구의 목적은 다른 평탄한 표면에 부착하는 인간 배아 줄기 세포의 능력을 결정하는 것이었다. 본 발명에서 시험한 평탄한 표면을 표 1에 나타내었다.

시험 전에, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 세포를 성장-인자 감소형 매트리젤®의 1:30 희석액으로 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 증식시켰다. 세포를 20 ng/ml의 bFGF(MEF-CM/bFGF)가 보충된 10 ml의 MEF 조절된 배지에서 100 ㎜ 배양 디쉬 상으로 씨딩하였다. 세포를 5% CO₂ 분위기와 함께 가습하여 37℃에서 배양하였다. 배지를 매일 새로운 MEF-CM/bFGF로 교환하였다. 일단 세포가 대략 80% 컨플루언스에 도달하면, 세포를 37℃에서 5분 동안 1mg/ml의 리버라아제(LIBERASE)로 처리함으로써 계대하였다. 효소를 디쉬에서 제거하고, 세포를 MEF-CM/bFGF로 헹굼으로써, 분해를 중단시켰다. 세포를 10 ml의 MEF-CM/bFGF 중에서 수동의 스크랩핑으로 수집하고, 50-ml의 코니컬(conical) 튜브로 옮겼다. 세포를 테이블탑(tabletop) 원심분리기 상에서 200x g(1000rpm)에서 원심분리하여, 펠렛을 형성하였다. 상층액을 제거한 후에, 세포를 40 ml의 MEF-CM/bFGF 중에 재현탁화시키고, 성장-인자 감소형 매트리젤®의 1:30 희석액으로 코팅된 4개의 100 ㎜ 배양 디쉬에 고르게 분배하였다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 100,000개 세포/㎠의 밀도로, 표 1에 기재된 다양한 평면 기재상으로 씨딩하였다. 평면 기재에는 흡착층과 섬유아세포 영양 세포층이 결여되어 있었다. 세포를 상술된 바와 같이 MEF-CM/bFGF에서 배양하였다. 평면 기재에 대한 세포의 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 H-1152의 효과를 결정하였다. 3μM의 H-1152를 세포를 씨딩하는데 사용되는 배지에 첨가하였다. 세포가 24시간 동안 부착되게 하였다. 이 시간 이후에, 세포를 실온에서 5분 동안 4%의 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그 다음, 세포를 1% 헤마톡실린으로 염색하고, 세포의 수를 광학 현미경으로 결정하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포는 Rho 키나아제 저해제에 독립적인 방식으로 하기의 막에 부착하였다: 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(막 번호 2 , 도 1, 패널 a); 나일론 막(막 번호 4, 도 1, 패널 b) 및 셀룰로오스 아세테이트 막(막 번호 5, 도 1, 패널 c). 이들 막에 대한 세포의 부착은 3μM의 H-1152의 첨가에 의하여 증진되었다(도 1, 패널 a-c).

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포는 하기의 평면 기재에 부착하기 위하여 3μM의 H-1152의 존재를 필요로 한다: 폴리카보네이트 막(막 번호 7, 도 1, 패널 d) 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막(막 번호 12, 도 1, 패널 e). 배양 배지로부터의 H-1152의 제거는 막 유형 둘 모두로부터의 H1 세포의 탈리를 야기한다. H-1152의 부재 하에서 이들 막에 대한 부착이 관찰되지 않았다.

실시예 2: 혼합 셀룰로오스 에스테르(막 번호 1)를 포함하는 평면 기재에 대한 인간 배아 줄기 세포의 부착에서의 Rho 키나아제 처리의 효과.

인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포를 실험적 조작 이전에 매트리젤® 코팅된 디쉬 상에 배양하였다. 세포를 MEF 조절 배지에 150,000개 세포/ ㎠의 밀도로 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(막 번호 1)에 씨딩하였다. 평면 기재에는 흡착층 및 섬유아세포 영양 세포층이 결여되어 있었다. 평면 기재에 대한 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 처리의 효과를 시험하였다. 세포를 0, 10, 또는 20μM의 Y26732로 처리하였다. 24시간 후에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구고, 공기 건조시키고, 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 세포의 수를 광학 현미경을 통해 결정하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다.

세포가 Y26732의 부재 하에서 평면 기재에 부착하는 것으로 관찰되었다(도 2, 패널 a). 10 및 20μM에서 Y26732의 첨가로, 평면 기재에 대한 세포의 부착이 증가되었다(도 2, 패널 b 및 c). 24시간 동안 배양 배지로부터의 Y26732의 제거로, 평면 기재로부터의 세포의 탈리가 야기되지는 않았다.

실시예 3: 인간 배아 줄기 세포의 증식 속도에서의 평면 기재 막 번호 1 상의 배양의 효과.

매트리젤® 코팅된 디쉬 상에 배양한 인간 배아 줄기 세포주의 세포와 막 번호 1 상에 배양한 세포의 증식 속도를 비교하였다. 세포를 두 기재상에 동일한 밀도로 씨딩하였다. 세포 수를 결정하기 위하여, 세포를 TrypLE 처리에 의하여 기재로부터 방출시켜, 단일 세포 현탁액을 생성시켰다. 세포 샘플을 도 3에 나타낸 시간에 취하였다. 세포가 비슷한 속도로 증식하는 것으로 관찰되었다. 배가 시간은 각각 매트리젤® 및 막 번호 1에서 약 1.151일 및 1.138일이다.

실시예 4: 인간 배아 줄기 세포는 혼합 셀룰로오스 에스테르(막 번호 1)를 포함하는 평면 기재상 에서 3 계대 동안 만능성을 유지한다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF-CM에, 75,000개 세포/㎠의 밀도로 혼합 셀룰로오스 에스테르 막(막 번호 1)을 포함하는 평면 기재상에 씨딩하였다. 세포를 상술된 방법에 따라 계대 전 5일 또는 6일 동안 배양하여, 약 75 내지 90% 컨플루언시에 도달하였다. 배양 배지를 매일 교환하였다. 3 계대 동안의 배양 후에, 세포를 수집하고, 만능성과 관련된 마커의 발현을 유세포 분석으로 결정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 95%가 넘는 세포가 Tra1-60, Tra1-81, SSEA-3 및 SSEA-4를 비롯한 만능성과 관련된 세포 표면 마커의 발현을 유지하였으며, 이는 세포가 여전지 만능성이었음을 나타낸다.

실시예 5: 인간 배아 줄기 세포는 혼합 셀룰로오스 에스테르(막 번호 1)를 포함하는 평면 기재상에서 10 계대 동안 안정한 핵형을 유지한다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리젤® 코팅된 배양 플레이트 또는 혼합 셀룰로오스 에스테르 막 상에서 10 계대 동안 배양하였다. 세포를 상술된 방법에 따라 배양하였다. 핵형을 20개의 G-밴드형 중기 세포를 분석함으로써 세포유전학적(cytogenetic) 분석에 의해 결정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 매트리젤® 코팅된 배양 플레이트에서 배양한 대표적인 세포(도 4, 패널 a) 및 혼합 셀룰로오스 막에서 배양한 다른 세포(도 4, 패널 b)의 G-밴드형 염색체는 정상의 남성 핵형을 나타내었다.

또한, 염색체 12p 프로브 및 17q 프로브를 사용하여, 형광 동소 혼성화(FISH)에 의해 200개의 간기 핵을 시험함으로써 핵형을 결정하여, 통상적인 세포유전학에 의해 결정할 수 없는 염색체 12 및 17 카피수의 변화를 갖는 매우 작은 집단을 동정하였다. 매트리젤® 및 혼합 셀룰로오스 에스테르 막에서 배양한 세포에서, 3염색체 12 및/또는 17을 갖는 비정상 세포가 검출되지 않았다.

실시예 6: 인간 배아 줄기 세포는 혼합 셀룰로오스 에스테르(막 번호 1)를 포함하는 평면 기재에서 인슐린 생성 세포로 분화할 수 있다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF 조절 배지에, 150,000개 세포/㎠의 밀도로 혼합 셀룰로오스 에스테르(막 번호 1)을 포함하는 평면 기재상에 씨딩하였다. 표 3에 약술된 분화 프로토콜에 따라 세포를 처리함으로써 세포를 인슐린 생성 세포로 분화시켰다. 세포를 대략 75 내지 90% 컨플루언시에 도달할 때까지 3일 내지 4일 동안 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 세포를 2%의 지방산이 없는 소혈청 알부민(FAF-BSA), 100 ng/ml의 액티빈 A 및 20 ng/ml의 Wnt3A를 함유하는 DMEM-F12 배지에서 2일 동안 처리한 후, DMEM-F12 배지, 2%의 지방산이 없는 소혈청 알부민(FAF-BSA) 및 100 ng/ml의 액티빈 A를 다시 2일 동안 처리하였다. 다음으로, 세포를 2%의 BSA, 20 ng/ml의 FGF7 및 250 nM의 사이클로파민-KAAD를 함유하는 DMEM-F12 배지로 3일 동안 처리한 후, 1%의 B27 보충물, 20 ng/ml의 FGF7, 250 nM의 사이클로파민-KAAD, 2 μM의 레틴산(retinoic acid, RA) 및 100 ng/ml의 노긴을 함유하는 DMEM-F12 배지로 4일 동안 처리하였다. 세포를 1%의 B27 보충물, 1 μM의 ALK5 저해제 2를(Axxora 카달로그 번호: ALX-270-445-M001), 100 ng/ml의 노긴, 100 ng/ml의 네트린(Netrin)-4, 50 ng/ml의 익센딘(Exendin)-4 및 1 μM의 DAPT를 포함하는 DMEM-F12 배지에서 3일 동안 처리하였다. 세포를 DMEM-F12 배지, 1%의 B27 보충물 및 1 μM의 ALK5 저해제 2에서 7일 동안 배양하고, 1%의 B27 보충물을 함유하는 DMEM-F12 배지에서 다시 7일 동안 배양하였다.

분화 프로토콜의 마지막에, RNA 샘플을 수집하여, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현을 결정하였다. 약 17의 인슐린에 대한 CT 수가 관찰되었다. GAPDH에 대한 상응하는 CT 값은 약 19이었으며; 이들 데이터는 세포가 처리 후에 높은 수준의 인슐린을 발현하는 것을 제시한다.

실시예 7: 인간 배아 줄기 세포는 Rho 키나아제 저해제에 의존적인 방식으로 폴리카보네이트 막을 포함하는 평면 기재에 부착한다.

인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포를 MEF 조절 배지에, 150,000개 세포/㎠의 밀도로 폴리카보네이트(막 번호 7)를 포함하는 평면 기재상에 씨딩하였다. 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 처리의 영향을 시험하였다: Rho 키나아제 저해제 Y26732를 0, 10, 또는 20μM의 농도로 배양 배지에 첨가하였다. 24시간 후에, 막 위의 세포를 실온에서 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구고, 공기 건조시키고, 클리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 세포의 수를 광학 현미경을 통해 결정하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다.

세포는 대조군 디쉬에서 막에 부착하지 않았다(도 5, 패널 a). Y26732의 첨가는 막 위에서의 세포의 부착을 야기하였다(도 5, 패널 b 및 c).

별도의 실험에서, 막 번호 7에 대한 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포의 부착에서의 Rho 키나아제 저해제 H-1152의 효과를 결정하였다. 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF-CM에, 150,000개 세포/㎠의 밀도로 폴리카보네이트 막(막 번호 7)을 포함하는 평면 기재상에 씨딩하였다. Rho 키나아제 저해제 H-1152를 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1 및 3μM의 농도로 배양 배지에 첨가하였다. 24시간 후에, 막 위의 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구고, 공기 건조시키고, 클리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 세포의 수를 광학 현미경을 통해 결정하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다.세포가 대조군 디쉬(도 6, 패널 a) 및 0.03 또는 0.1μM의 H-1152가 있는 디쉬(도 6, 패널 b 및 c)에서는 막에 부착하지 않았다. 그러나, 0.3, 1 및 3μM의 H-1152(도 6, 패널 d-f)로 처리한 배양에서는 부착이 관찰되었다.

실시예 8: 배양 배지로부터의 Rho 키나아제 저해제의 제거로, 폴리카보네이트 막을 포함하는 평면 기재로부터의 인간 배아 줄기 세포의 탈리가 야기된다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 20ng/ml bFGF 및 3μM의 Rho 키나아제 저해제 H-1152를 함유하는 MEF 조절 배지에 100,000개 세포/㎠의 밀도로 폴리카보네이트(막 번호 9)를 포함하는 평면 기재상으로 씨딩하였다. 세포를 24시간 동안 배양하였다. 이 시간 후에, 배양 배지를 20ng/ml bFGF를 함유하고 H-1152가 결여된 배양 배지로 교체하였다. 24시간 후에, 막 위의 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구고, 공기 건조시키고, 클리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 세포의 수를 광학 현미경을 통해 결정하였다. H-1152를 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다. 배양 배지로부터의 H-1152의 제거로, 평면 기재로부터의 세포의 탈리가 야기되었다(도 7).

실시예 9: 평면 기재의 공극률은 인간 배아 줄기 세포의 부착에 영향을 미친다.

계대 42의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 하기의 평면 기재상으로 씨딩하였다: 막 번호 10(기공 크기 0.4 μM); 및 막 번호 11(기공 크기 3 μM). 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF 조절 배지에 100,000개 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 또한, 평면 기재에 대한 세포의 부착에서의 Rho 키나아제 저해의 효과를 시험하였다. 세포 배양 배지에 3μM의 H-1152를 보충하였다. 24시간 후에, 배양 배지를 20ng/ml bFGF를 함유하고, H-1152가 결여된 MEF 배양 배지로 교체하였다. 다른 24시간 후에, 막 위의 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구고, 공기 건조시키고, 클리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 1μM의 H-1152를 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다. 세포의 수를 광학 현미경을 통해 결정하였다. 비히클을 함유하는 웰을 대조군으로 포함시켰다.

막 번호 11(도 8, 패널 b)보다 막 번호 10(도 8, 패널 a)에 더 많은 수의 세포가 부착되었다. 배양 배지 중의 1μM의 H-1152의 존재는 막(도 8, 패널 a 및 b) 위에 H1 세포의 부착을 유지하는 데 필요하다. 배양 배지로부터의 H-1152의 제거로, 막 번호 10 및 막 번호 11으로부터의 세포의 탈리가 야기되었다(도 8, 패널 c 및 d).

실시예 10: 인간 배아 줄기 세포는 폴리카보네이트 막을 포함하는 평면 기재상에서 다수의 계대 후에 이들의 만능성을 유지한다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 폴리카보네이트 막(막 번호 8)을 포함하는 평면 기재상으로 씨딩하였다. 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하고, 3μM의 H-1152가 보충된 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 세포 배양 배지를 매일 교환하였다. 배지로부터 H-1152의 제거로 세포를 계대하고, 세포를 온건한 스월링(swirling)에 의해 평면 기재로부터 제거하였다. 세포를 3 계대 동안 배양하고, 유세포 분석 및 정량적 RT-PCR 분석을 위해 수집하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 유세포 분석으로 결정된 바와 같이, 95%가 넘는 세포가 Tra1-60, Tra1-81, SSEA-3 및 SSEA-4를 비롯한 만능성과 관련된 세포 표면 마커를 발현하였다. 도 9는 3 계대 동안 폴리카보네이트 막 상에서 배양한 H1에서 발현된 다수의 유전자가 미분화 H1 세포에서와 유사한 수준임을 나타내는 정량적 RT-PCR의 결과를 나타낸 것이다.

별도의 연구에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 폴리카보네이트 막(막 번호 8)을 포함하는 평면 기재상으로 씨딩하였다. 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하고, 1μM의 H-1152가 보충된 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 세포 배양 배지를 매일 교환하였다. 배지로부터 H-1152의 제거로 세포를 계대하고, 세포를 온건한 스월링에 의해 평면 기재로부터 제거하였다. 세포를 9 계대 동안 배양하고, 유세포 분석을 위해 수집하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 95%가 넘는 세포가 Tra1-60, Tra1-81, SSEA-3 및 SSEA-4를 비롯한 만능성과 관련된 세포 표면 마커를 발현하였다.

만능성을 평가하는 대안적인 방법은 세포가 배상체를 형성하는 능력을 통한 것이다. 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 폴리카보네이트 막(막 번호 8)을 포함하는 평면 기재상으로 씨딩하였다. 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하고, 3μM의 H-1152가 보충된 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 세포 배양 배지를 매일 교환하였다. 배지로부터 H-1152의 제거로 세포를 계대하고, 세포를 온건한 스월링에 의해 평면 기재로부터 제거하였다. 세포를 12 계대 동안 배양하였다.

배상체 형성을 하기의 프로토콜에 의해 달성하였다. H1 세포를 수집하고, 울트라 로우 클러스터 플레이트(Ultra Low Cluster Plate)(Corning 카달로그 번호 3471)에서 20% 우태아혈청이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 50%의 배지를 교환함으로써 세포에 격일로 공급하였다. 14일 후에, 배상체를 형성하였다(도 10).

실시예 11: 인간 배아 줄기 세포는 폴리카보네이트 막을 포함하는 평면 기재상에서 배양된 이후에 완성 내배엽을 형성할 수 있다.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 폴리카보네이트(막 번호 8)를 포함하는 평면 기재상으로 씨딩하였다. 세포를 먼저 20ng/ml의 bFGF를 함유하고, 3μM의 H-1152가 보충된 MEF 조절 배지에서 배양하였다. 그 다음, 실험적 조작 이전에 10 계대 동안 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하고, 1μM의 H-1152가 보충된 MEF 조절 배지에서 배양하였다.

그 다음, 세포를 매트리젤®의 1:30 희석물이 코팅된 100 ㎜의 조직 배양 플레이트 상으로 씨딩하였다. 세포를 20ng/ml의 bFGF를 함유하는 MEF 조절된 배지에서 3일 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 2%의 지방산이 없는 소 혈청 알부민, 100ng/ml의 액티빈 A 및 20ng/ml의 Wnt3a가 보충된 DMEM/F12에서 2일 동안 처리한 다음, 2%의 지방산이 없는 소 혈청 알부민 및 100ng/ml의 액티빈 A가 보충된 DMEM/F12로 다른 2일 동안 처리하였다. 이 시간 후에, 세포를 TRYPLE 처리에 의해 방출시켜, 단일 세포 현탁액을 형성하였으며, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커의 발현을 유세포 분석으로 결정하였다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 90%가 넘는 세포가 CD99 및 CXCR4(CD184) 이중 양성이며, 12%의 세포가 CD9 양성 CXCR4 음성이다. 이들 데이터는 세포가 완성 내배엽으로 분화할 수 있는 능력을 보유하는 것을 제시한다.

실시예 12: 본 발명의 평면 기재의 물리적 특성.

본 발명의 평면 기재상의 표면 화학을 결정하였다. 표 7-10은 X-선 광전자 분광법(XPS) 분석 및 접촉각을 도시한 것이다. XPS에 대하여, 대략 5-10 ㎚(50-100 ㅕ)의 분석 깊이를 사용하였다. 전형적으로, 95%의 신호가 이러한 깊이 내부으로부터 시작한다.

막 1-3은 유사한 농도의 산소, 탄소(주로 C-O 및 C-(C,H)로서, 아마도 O-C-O) 및 질소(NO₃, NO₂ 및 아마도 C-N 및 R₄-N⁺로서)를 함유한다. 또한, 막 3은 미량 농도의 Na⁺ 및 SO_x를 함유하며, 더 높은 농도의 C-(C,H)를 함유한다. 막 4는 C-(C,H), C-(O,N) 및 (O,N)-C=O를 함유하고, 아마도 미량의 나트륨을 함유한다. 막 5는 주로 C-O 및 또한 C-(C,H)를 함유하며, O-C-O 및/또는 O-C=O를 함유한다. 미량 농도의 Na⁺ 및 SO_x도 또한 검출하였다. 막 6-11은 C-(C,H), C-O, O-C=O, C-N, CO3, p-p* 및 미량 농도의 R₄-N⁺, SO_x, 및 Na⁺ 또는 Cr³⁺ 중 하나를 함유한다. 또한, 막 6의 표면은 미량 농도의 염소를 함유할 수 있다. 미량 농도의 크롬이 오직 막 10 및 11에서만 검출되었으나, Na⁺는 막 6 내지 9에서 검출되었다. 막 12의 표면은 C-(C,H), C-O, O-C=O 및 PET와 일치하는 pi-pi*를 함유한다. 또한, 미량 농도의 질소 및 나트륨이 검출되었다.

도 11은 본 발명의 평면 기재의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다. 두 유형의 형태가 관찰되었다. 한 유형은 섬유의 개방 네트워크를 특징으로 한다. 두번째 유형은 표면에 분산되어 있는 원형 홀(hole)이 있는 평활한 시트(sheet)를 특징으로 한다.

표 10은 본 발명의 표면으로부터의 접촉각 측정을 나타낸 것이다. 표면 1 내지 5는 약 18° 내지 약 32°의 접촉각 측정치를 갖는다. 만능 줄기 세포는 표면 1-5에 부착하기 위하여, Rho 키나아제 활성의 저해제의 존재를 필요로 하지 않는다.

표면 6 내지 12는 32° 보다 더 큰 접촉각 측정치를 갖는다. 만능 줄기 세포는 이들 표면에 부착하기 위하여, Rho 키나아제 활성의 저해제의 존재를 필요로 한다.

실시예 13: 폴리아민으로 구성된 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착.

폴리아민으로 구성된 평면 기재를 제US6743273호 및 문헌[Schindler M et al, Biomaterials 26(28): 5624-5631; 2005]에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 평면 기재는 상표명 울트라웨브™ 하에 판매되어, 상업적으로 입수가능하다. 울트라웨브™ 합성 표면은 평균 섬유 직경이 280㎚인 무작위로 배향된 전기방사 폴리아미드 나노섬유로 구성된다. 섬유 크기 분포는 200 내지 400㎚이다. 시험한 첫번째 울트라웨브™ 표면은 약간 친수성 표면(카달로그 번호 3870XX1)을 가졌고, 두번째 표면인 표면(카달로그 번호 3871XX1)은 약간 친수성이었고, 폴리아민 물질로 코팅되어, 순수 양 전하를 위한 유리 아민기를 갖는 나노섬유를 제공하였다. 두 표면 모두는 소수성 상호작용을 통하여, 단백질 흡수에서 매우 효과적이다. 5 미크론 해상도 및 10,000X 확대 주사 전자 현미경사진을 도 12에 나타내었다. 그러나, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포는 시험한 울트라웨브™ 표면 중 어느 하나에 부착할 수 없었다.

실시예 14: 본 발명의 평면 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착에서의 규정된 배지 이용의 효과.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 하기의 평면 기재상으로 씨딩하였다: 막 1(혼합 셀룰로오스 에스테르), 막 4(나일론), 막 5(셀룰로오스 아세테이트) 및 니트로셀룰로오스. 세포를 규정된 배지 mTESR™에 1:3 희석하여 씨딩하고, 24시간 동안 배양하였다. MEF 조절 배지에서의 병행의 배양물을 대조군으로 포함시켰다. mTESR™에서의 세포의 배양은 평탄한 표면에 대한 세포의 부착 능력에 영향을 미치지 않았다. 세포는 막 1, 4 및 5 및 니트로셀룰로오스에 부착할 수 있었다. mTESR™을 사용하여 세포의 가장 큰 결합을 나타내는 막은 막 4, 다음으로 막 5이었고, 이는 니트로셀룰로오스와 같았으며, 그 다음으로 막 1이었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 측면은 실시예 및 바람직한 실시 양태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 청구항에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.

Claims

a. 만능 줄기 세포의 현탁물을 수득하는 단계, 및
b. 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 나일론 또는 셀룰로오스 아세테이트를 포함하는 평면 기재에 세포 현탁물을 첨가하고 세포가 부착되게 하는 단계를 포함하여,
12% 이하의 N, 적어도 12%의 O 내지 적어도 55%의 O 및 18도 내지 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층(adlayer) 및 영양 세포층(feeder cell layer)이 결여된 평면 기재에 만능 줄기 세포를 부착시키는 방법.
제1항에 있어서, 세포가 기재에 부착된 후에, 세포를 배양으로 유지하는 방법.
제1항에 있어서, 세포가 기재에 부착된 후에, 세포가 분화되는 방법.
제1항에 있어서, 만능 줄기 세포의 현탁물을 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리함으로써, 기재에 대한 만능 줄기 세포의 부착을 향상시키는 방법.
제4항에 있어서, 만능 줄기 세포가 기재에 부착된 후에, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물을 제거하는 방법.
제4항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물이 Y-27632, 파수딜(Fasudil), H-1152 및 하이드록시파수딜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제6항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물이 Y-27632인, 방법.
제6항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물이 H-1152인, 방법.
제1항에 있어서, 기재가 혼합 셀룰로오스 에스테르, 나일론 또는 셀룰로오스 아세테이트를 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 세포의 부착을 위해 Rho 키나아제 활성의 저해제의 존재를 필요로 하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 기재가 (i) 거친 섬유 표면 또는 (ii) 평활 표면을 가지는, 방법.
제1항에 있어서, 기재가 다공성인, 방법.
a. 인간 만능 줄기 세포의 현탁물을 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물로 처리하는 단계;
b. 처리된 인간 만능 줄기 세포의 현탁물을, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 나일론 또는 셀룰로오스 아세테이트를 포함하는 평면 기재에 접촉시키는 단계;
c. 세포가 평면 기재의 표면에 부착되도록 하는 단계; 및
d. 세포가 평면 기재의 표면에 부착된 후에 Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물을 제거하는 단계를 포함하여,
12% 이하의 N, 적어도 12%의 O 내지 적어도 55%의 O 및 18도 내지 32도의 접촉각을 가지며, 흡착층(adlayer) 및 영양 세포층(feeder cell layer)이 결여된 다공성 평면 기재의 표면에 인간 만능 줄기 세포를 부착시키는 방법.
제13항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물이 평면 기재에 대한 세포 현탁물의 부착을 향상시키는 것인, 방법.
제13항에 있어서, 기재가 혼합 셀룰로오스 에스테르, 나일론 또는 셀룰로오스 아세테이트를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 세포의 부착을 위해 Rho 키나아제 활성의 저해제의 존재를 필요로 하지 않는, 방법.
제13항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물이 Y-27632, 파수딜(Fasudil), H-1152 및 하이드록시파수딜(hydroxyfasudil)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제13항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물을 0.1 μM 내지 100 μM 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, Rho 키나아제 활성을 저해할 수 있는 화합물의 제거가 세포의 탈리를 유발하지 않는, 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 평면 기재의 표면 상에 부착된 후에, 세포를 배양으로 유지하는 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 평면 기재의 표면 상에 부착된 후에 추가적으로 분화되는, 방법.