JP2012508584A - ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化 - Google Patents
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)(35 U.S.C § 119(e))に基づき、2008年11月14日に提出されたENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLSという表題の米国仮特許出願第61/114,857号;および、2008年12月9日に提出されたENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLSという表題の米国仮特許出願第61/121,084号、に対する優先権を主張する非仮出願(nonprovisional application)である。上記に列挙したそれぞれの優先権出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
enture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)に見られるものであってもよい。本明細書および本特許請求の範囲において使用されているように、「a」または「an」は、それが使用されている文脈に応じて1つ以上を意味することがあると理解されるものとする。よって、例えば、「細胞(a cell)」という記載は、少なくとも1つの細胞が利用され得るということを意味することがある。
BIOLOGICAL MATERIALS FOR TREATING DISEASESという表題の米国特許第7,427,415号;GELS FOR ENCAPSULATION OF BIOLOGICAL MATERIALSという表題の米国特許第6,911,227号;および、GELS FOR ENCAPSULATION OF BIOLOGICAL MATERIALSという表題の米国特許第6,911,227号、第5,529,914号、第5,801,033号、第6,258,870号において、より詳細に記載されており、これは、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。
2/264,760号に詳細に記載されている。この米国出願第12/264,760号は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。
ENDODERMという表題の米国特許第7,510,876号にも記載されており、この米国特許第7,510,876号は、本明細書によりその全体が組み入れられるものとする。
588,693号にも記載されている。この米国出願第11/588,693号は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
-expressing endodermという表題の米国出願第11/115,868号から選択される1種類以上のマーカー、を発現する。これら米国出願は、本明細書により参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
とりわけ、例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、α‐1‐アンチトリプシン、プロトロンビン凝固因子、トランスフェリン、および、例えばシトクロムP‐450などの解毒酵素、などのタンパク質を発現する。よって、本明細書で用いられているように、「部分的に成熟した肝細胞」は、アルブミンまたは別の1種類以上のタンパク質を発現しているか、または正常な成熟肝細胞の機能または外観を有し始めていてもよい。
先端細胞;内分泌前駆細胞、および内分泌性ホルモン分泌細胞)であることを意味することもある。
明細書で用いられているように、「細胞分化環境」という語は、当該分化可能細胞が、誘導されて分化するか、または誘導されて、分化した細胞中においてヒト細胞培養物が豊富となる細胞培養条件を指す。成長(増殖)因子により誘導される、この分化した細胞系統は、自然に均質(homogeneous)となることが好ましい。「均質(homogeneous)」という語は、所望の細胞系統をおよそ50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%より多く含有する集団を指す。
いくつかの実施形態は、in vitroで培養していたおよび/または分化させていた細胞を凍結保存するための方法に関する。このような保存により、in vitroでの分析またはin vivoでの植え込みのいずれかに関連した、バンキング(banking)、品質管理、ならびに他の所望の手順および操作が可能となるであろう。移植前の細胞保存のための方法には、細胞を凍結すること(凍結保存)による、;または、凍結する温
度かそれよりも高い温度で細胞を冷却させておくこと(冬眠)による、組織の保存が含まれる。Chanaud et al. 1987 Neurosci Lett 82: 127-133;Collier et al. (1987) 436: 363-366;および、Sauer et al. 1991 Neurology and Neuroscience 2: 123-135;Gage et al. 1985 Neurosci Lett 60: 133-137、を参照のこと。これら文献の開示内容は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。冬眠は、凍結保存した組織に比べ、グラフト生存率および機能を上昇させることが報告されているが、細胞は、冬眠期間の間に細胞生存率を危険にさらすことなくこのような条件下で長期維持することができる能力を持つものでなくてもよい。
的に適合性である、任意の培地が含まれる。
冬眠温度は、典型的には0〜5℃の範囲であり、好ましくは約4℃である。即時(instant)方法と併せて、数多くの培地の種類を冬眠培地として使用することができる。細胞を凍結する、および冬眠状態にするための先行技術方法では、緩衝液および添加タンパク質を含み、時として、例えば血清など、全体的にはっきりしない構成成分を含むこともある、複合培地が利用される。しかしながら、毒性および免疫原性を最小限にするためには、このような添加剤は、ヒトへの移植には望ましくない。好ましい実施形態では、冬眠培地は、添加Ca++を含有しない。特定の実施形態では、細胞を冬眠状態にするための培地は、添加タンパク質を含有せず、および/または、緩衝液を含有しない。好ましい冬眠培地は、例えば、生理食塩水中に、追加のグルコースを全く含まないか、または約0.1%〜0.9%のグルコースを含むなど、生理食塩水中に最少量のグルコースもしくは中程度の量のグルコースを含むか、またはこれらからなる。好ましい実施形態では、当該冬眠培地は、約0.1〜0.5%のグルコースを含むか、またはこれからなる。より好ましい一実施形態では、当該培地は、約0.2%グルコースを含むか、またはこれからなる。好ましい実施形態では、当該冬眠培地は、非常に低いパーセンテージ(vol/vol)のNaCl、例えば約0.1〜1%のNaCl、好ましくは約0.5〜0.9%のNaCl、を含むか、またはこれからなる。特定の実施形態においては、例えばハンクス平衡塩類溶液、ダルベッコ最小必須(minimal essential)培地、またはイーグル変法最小必須培地などの、さらなる複合培地を使用してもよい。特定の実施形態においては、選択した冬眠培地を、添加剤、例えば、添加タンパク質(例えば、哺乳動物の血清タンパク質または全血清(好ましくは熱非働化したもの))緩衝液(例えば、リン酸緩衝液、HEPES、等) 抗酸化剤、成長(増殖)因子、KCl(例えば約30mMのもの)、乳酸塩(例えば約20mMのもの)、ピルビン酸塩、MgCl2(例えば約2〜3mMのもの)、ソルビトール(例えば約300mMのもの)、または当該分野において周知の他の添加剤など、で補うことが望ましいことがある。
いくつかの実施形態では、細胞は、凍結保存溶液を用いて凍結保存する。凍結保存溶液または凍結保存培地としては、凍結保存剤、すなわち、細胞を凍結または解凍することによる細胞内および/または細胞膜のダメージから細胞を守る化合物、を含有する溶液が挙げられる。凍結保存剤は、当該凍結保存剤に接触させた細胞の生存率および/または機能性が、凍結保存剤の非存在下で同様に凍結または解凍した細胞に比べた場合に、亢進されているということにより同定される。任意の凍結保存剤は即時方法と併せて使用してもよく、また、この語は、細胞内凍結保存剤および細胞外凍結保存剤の両方を包含するよう意
図されている。
下する。細胞を凍結するより低い温度に冷却する際、好ましくは、この温度低下はゆっくりと生じ、その結果、これら細胞が、凍結保存剤の細胞内濃度と細胞外濃度との間の平衡を確立することとなり、その結果、細胞内の氷の結晶の形成が阻害される。いくつかの実施形態においては、冷却速度は、細胞を、過剰な水分喪失および凍結保存剤の毒性効果から守るのに十分速い速度であることが好ましい。その後、この細胞を、−20℃〜約−250℃の温度で凍結保存してもよい。好ましくは、細胞は、氷の再結晶化のリスクを最小限にするべく、−90℃未満で保存する。特に好ましい実施形態では、当該細胞は、液体窒素中で、約−196℃で凍結保存する。あるいは、コントロールされた凍結は、市販の電子的に制御されたフリーザー機器の助けを借りて達成されてもよい。
凍結保存後、細胞は、利用可能な任意の方法により解凍してもよい。好ましい一実施形態では、細胞は、例えば37℃の液体に手早く浸漬させることなどにより、急速に解凍する。細胞を解凍するとすぐに、希釈培地の添加により、当該凍結保存剤の希釈が達成される。
の全体が組み入れられるものとする。
保存後、細胞の生存率および/または機能性を移植前に検査して、例えば移植における使用など、使用への適性を確認することが望ましいことがある。これは、当該分野において公知の種々の方法を用いて達成してもよい。例えば、例えばトリパンブルーまたはエチジウムブロマイドまたはアクリジンオレンジなどの、生体染色法を用いて細胞を染色してもよい。特定の実施形態においては、移植に適した細胞の集団は、少なくとも約50〜100%が生存可能である。好ましい実施形態では、移植に適した細胞の集団は、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、が生存可能である。特に好ましい実施形態においては、このような細胞の集団は、少なくとも約85%が生存可能である。
本明細書に記載の一実施形態は、カプセル化デバイスに関する。このようなデバイスを哺乳動物に植え込んで、種々の疾患および障害を治療することができる。好ましい実施形態では、当該デバイスは、治療用生物学的活性剤および/または細胞をその中に完全にカプセル化することのできる、生体適合性の免疫隔離用デバイスを構成する。例えば、この
ようなデバイスは、治療に有効な量の細胞を以下のような細孔サイズを有する半透膜内に収容していてもよい。すなわち、酸素、ならびに細胞の生存および機能に重要な他の分子はこの半透膜を通って移動できるが、免疫系の細胞はその細孔を通って透過することも横切ることもできないような細孔サイズである。同様に、このようなデバイスは、治療に有効な量の生物学的活性剤、例えば血管新生因子、成長(増殖)因子、ホルモン等、を含有してもよい。
達成されている限り、特定の、デバイスのサイズ、形状、デザイン、体積容量、および/または当該カプセル化デバイスを作るために用いられる材料、に限定されないことが意図されているものとする。
一実施形態においては、当該カプセル化されるデバイスは、細胞および/または生物学的活性剤の漏出を防止するために当該デバイスの周辺または端部を密封または溶接することによって作られる区画以外に、当該デバイス中に1つ以上の区画を作ることにより改良される。図1は、当該デバイスの一実施形態の概略図の例であるが、当該デバイスは、このデザインのみに拘束されるということは意図されていない。むしろ、当該デザインには、変形、例えば当該分野においてよくある(routine)ものなど、が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、デバイスデザインは、カプセル化された生物学的活性剤および/または細胞の種類に応じて、ならびに、その研究のニーズと機能とを満たすべく、変更されてもよい。妥当な任意のサイズまたは形状を有するデバイスを、さらに区画化して、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、またはそれ以上のチャンバーまたは区画を有するようにしてもよい。複数の区画を作る目的の1つは、それにより、当該カプセル化された細胞と、例えば、当該デバイスを取り囲む間隙スペース(interstitial space)との間での栄養素および酸素の交換のための表面積が増加するという点にある;例えば図1〜11を参照のこと。さらに、大きなクラスター/凝塊の中心に密集した細胞は、栄養素および酸素を得られないか、または、受け取る栄養素および酸素がより少なくなるために、生存することができない可能性があるが、こうしたデザインは、大きな細胞凝集塊(aggregate)もしくはクラスターもしくは凝塊(agglomeration)を妨げるか、または促進しない。したがって、複数のチャンバーまたは区画を含有するデバイスは、当該チャンバー/区画(単数または複数)の全体に細胞を分散させる能力がより優れている。このように、各細胞が栄養素および酸素を受け取る機会がより多くあることによって、細胞生存は促進され、また、細胞死は促進されない。
。さらに他の局面では、当該溶接継目は、平行ではあるが等距離ではない。上記の例に見られるように、このようなデザインは、当該溶接継目が横断して走り当該デバイスの両方の境界線を連結する場合には完全に隔てられる、2、3、4、5、6、7、8、9、10個までもしくはそれより多い数のチャンバーを効率的に形成し得るか、または、互いに入り込んだ(interdigitated)1つの連続したチャンバーを作り出し得る。また、平行な、または、平行かつ等距離である溶接継目とともに、特定の好例のデバイスが図1〜11に記載されているが、さらに他のデバイスは、例えばいずれの溶接継目にも遮断されることのない領域を有する長い溶接継目など、任意の方向または向きの溶接継目で、カスタマイズまたは作製されてもよい。用いる溶接継目の種類および数は、使用する細胞集団または薬剤、および如何なる処理または目的のためであるのかに依存し得る。いくつかの実施形態では、溶接継目は、当該デバイスの見た目を変えるよう配置されてもよい。
目7の総数、直径および分布は、任意の細胞製品または薬剤の、装填によるダイナミクスおよび増殖速度、に適応するために最適化されてもよいデザインパラメータである。
構成成分となる細胞透過性および不透過性の膜は、Baxter社によるこれまでに上述されたか、またはそうでなければこれまでTheraCyte社製細胞カプセル化デバイスとして参照されたそれらの特許など、当該分野において記載されているが、そうした文献としては例えば、米国特許第6,773,458号;第6,520,997号;第6,156,305号;第6,060,640号;第5,964,804号;第5,964,261号;第5,882,354号;第5,807,406号;第5,800,529号;第5,782,912号;第5,741,330号;第5,733,336号;第5,713,888号;第5,653,756号;第5,593,440号;第5,569,462号;第5,549,675号;第5,545,223号;第5,453,278号;第5,421,923号;第5,344,454号;第5,314,471号;第5,324,518号;第5,219,361号;第5,100,392号;および第5,011,494号、が挙げられる。これら文献は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。
適合性材料の例としては、異方性材料、ポリスルホン(PSF)、ナノファイバーマット、ポリイミド、テトラフルオロエチレン/ポリテトラフルオロエチレン(PTFE;テフロン(登録商標)としても知られている)、ePTFE(延伸ポリテトラフルオロエチレン)、ポリアクリロニトリル、ポリエーテルスルホン、アクリル樹脂、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド、ならびに、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース(HPMC)膜、が挙げられるが、これに限定されない。これらの、および実質的に同様の膜の種類および構成成分は、いくつか例を挙げるならば、少なくとも、Gore(登録商標)、Phillips Scientific(登録商標)、Zeus(登録商標)、Pall(登録商標)およびDewal(登録商標)により製造されている。
また、カプセル化された細胞および/または生物学的活性剤を植え込み部位にて維持するため、および、例えばその植え込み部位からの、発現および分泌された治療用ポリペプチドなどの拡散を可能にするために、植え込み部位に固定化される植え込み可能なデバイスも提供する。一局面では、当該植え込み部位は、当該処置の焦点である組織または器官にあるか、またはその近くに近接している。他の局面では、当該デバイスから分泌される薬剤の送達が位置依存性ではなく、かつ、その薬剤の体内分布が当該脈管構造に依存性である場合には、当該デバイスは、離れた位置に植え込んでもよい。
例えば、好ましい一実施形態では、当該生体適合性デバイスは、前腕、または側腹部、または背部、または臀部、または下肢等の皮膚下の皮下に植え込まれ、当該デバイスは、例えば当該デバイスの除去が必要となる時まで、その場所に実質的にとどまる。
本明細書に記載のデバイスは内表面と外表面とを有するが、ここでは、当該デバイスは、少なくとも1つの空隙(またはリザーバー、または腔、またはコンテナー、または区画)を含有し、また、少なくとも1つの空隙は、当該デバイスの内表面に開かれている。従来型の植え込み可能なデバイスは、一般に、硬質の非伸張可能な生体適合性材料で作製される。本明細書に記載の当該デバイスの一実施形態は、伸張可能な材料で作製する。他の実施形態は、非伸張可能な材料に向けられたものである。当該デバイスが伸張する能力を有するかどうかは、当該デバイスの作製に使用する材料、例えば、伸張可能であるか、または、伸張可能なように、もしくは伸張できる能力を有するようにデザインされていてもよいポリマーシース(polymer sheath)など、に本質的に備わった性質によるものであってもよい。例えば、さらなる細胞を収容するか、または、現存のデバイスを詰め替えるためにサイズが伸張するデバイスが提供される。
period in time)、または、最初の植え込み後の任意の時点で、細胞または薬剤を装填および充填してもよい。このような伸張可能な収納器は、体内への植え込みに適した不活性材料、例えば、哺乳動物への、より具体的にはヒトの体内への植え込みに適した、金属、チタン、チタン合金またはステンレス鋼合金、プラスチック、およびセラミックなど、で構成される。
は、縦軸を有する外側スリーブ、その縦軸に沿った少なくとも1つの通路、ならびに、当該デバイスに協同的に係合するように適応させた遠位端(distal end)およびデバイス係合領域、が含まれる。類比(analogy)として、当該デバイスホルダーは、ある任意の時点で、または長期間にわたって、2つ以上のディスクまたはカセットを収容することのできるディスクホルダーまたはカセットホルダーと同じ様に機能する。さらにもう1つの実施形態では、当該デバイスホルダーは、当該ホルダーの高さを増加させるように適応させた伸張器を含有する。
もう1つの実施形態は、適切な治療剤もしくは生物学的活性剤および/または細胞で定期的に充填または洗い流すことのできる、詰め替え可能なリザーバー、腔、コンテナーまたは区画を備えたカプセル化デバイスに関する。かかる充填は、治療に有効な量の、適切な治療剤もしくは生物学的活性剤および/または細胞を、植え込まれたリザーバー、腔、コンテナーまたは区画中へと、例えば、真皮下または皮下に、シリンジまたは、in vivoで、類似のリザーバー、腔、コンテナーもしくは区画を充填するための、当該分野における標準的な他の手段を用いて注入することにより達成されてもよい。
いくつかの実施形態では、当該システムに含まれる細胞密度は、約1×105、1×106細胞/ml〜約1×1010細胞/mL、またはそれ以上である。いくつかの実施形態においては、細胞は、細胞が当該システム中へと導入される/された時点、または細胞が当該システムにて十分に発生および/もしくは成熟する時点、例えばin vivoで機能的細胞へとさらに発生もしくは成熟する必要のある前駆細胞の植え込み時点、で発現される機能のうち少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上を示す機能性を有した状態で、当該システム中で、培養条件下またはin vivoにて、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月または1年以上にわたり、生存する。いくつかの実施形態においては、当該システム中の細胞は、該システム中で増大し、その結果、当該システムのin vivoへの植え込みにあたり細胞密度および/または細胞機能を上昇させる。
細胞および組織のカプセル化/免疫隔離に関する分野への障壁の1つは、細胞および組織をカプセル化するのに用いられる高分子膜を横断する十分な酸素および栄養素輸送の不足であった。この不十分な気体および栄養素交換の結果が、代謝活性の低下と細胞死である。本明細書に記載の実施形態は、先行技術のこの欠点に対処する、植え込み可能な細胞カプセル化デバイスに関する。
1998 47(7): 1027-32、を参照のこと。これら文献の開示内容は、本明細書において明示的に、参照により組み入れられるものとする。これらの研究は、組織を免疫隔離して移植する場合、例えば腎臓被膜などの血管新生化された領域においてでさえ、酸素分圧は、そ
れらの天然状態と比べると低下する(37〜46mmHg)、ということを示している。したがって、こうしたほぼ無酸素の状況により、結果として、特に、細胞が細胞クラスターのコアまたはカプセル化用デバイスのコアに近ければ近いほど、細胞死が引き起こされる可能性がある。
Kirk-Othmer, Third Ed., Vol. 10, pages 874-81, John Wiley & Sons (1980)に記載のもの挙げられる。例えば、有用なPFCとしては、パーフルオロ‐4‐メチルモルホリン、パーフルオロトリエチルアミン、パーフルオロ‐2‐エチルテトラヒドロフラン、パーフルオロ‐2‐ブチルテトラヒドロフラン、パーフルオロペンタン、パーフルオロ‐2‐メチルペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロ‐4‐イソプロピルモルホリン、パーフルオロジブチルエーテル、パーフルオロヘプタン、パーフルオロオクタン、およびその混合物、が挙げられる。好ましい不活性フルオロケミカル液体としては、パーフルオロヘキサン、パーフルオロ‐2‐ブチルテトラヒドロフラン、パーフルオロヘプタン、パーフルオロオクタン、およびその混合物が挙げられる。本明細書に記載の実施形態において有用な市販のPFCsとしては、FLUORINERT(商標)流体、例えば、1990 product bulletin #98-0211-5347-7(101.5) NPI, FLUORINERT.TM. fluidsに記載の、FC‐72、FC‐75、FC‐77およびFC‐84など(Minnesota Mining and Manufacturing Company社、ミネソタ州セントポール、から入手可能)、およびその混合物、が挙げられる。
一実施形態では、in vivoの当該カプセル化用デバイス中の細胞を画像化または検出するための手段が提供される。画像化は、幹細胞療法において、重要な役割を果たす。例えば、非侵襲型の画像化法は、次のことをするのに用いることができる:すなわち、(1)扱おうとする細胞および/または疾患の、存在、重症度または表現型を判定する;(2)有害な、または標的としていない細胞型および構造、例えば嚢胞または小嚢胞など、の外観について、移し植え細胞治療をモニタリングする;(3)治療の送達をガイドする;(4)疾患の経時変化を追跡し、治療の効果または有効性を評価する;(5)標識を提供し、治療のメカニズムを定義づける;(6)移し植えた細胞の生存および機能を分析および評価する;ならびに、(7)例えば、本明細書に記載の、置き換えおよび/または膵臓前駆細胞の植え込みによる糖尿病の治療のための細胞療法などの細胞療法に関する、移し植え、生存、および局所機能を判定することなどにより、あらゆる細胞治療のプロセスを一般的に容易化する、こと。加えて、細胞療法は、罹病率/死亡率を減少させることを目的とするが、本明細書において記載した、かつ、以下でより詳細に記載する非侵襲性の画像化技術は、例えば予備試験または前臨床研究などにおいて、有用なサロゲートエンドポイントとして役立ち得る。
の長方形パターン)が必要である。一般的には、共焦点顕微鏡画像を生じさせるのに、3つの主な走査バリエーションが用いられている。根本的に同等の共焦点動作(fundamentally equivalent confocal operation)は、横方向に平行移動する試料ステージを、固定された照射光ビームとともに用いる(ステージ走査)か、走査光ビームを、固定されたステージとともに用いる(ビーム走査)か、または、回転するNipkowもしくはNipkovディスク中の孔を通って透過される光点のアレイを用いて、試料の走査の際、ステージと光源の両方を固定状態に維持することにより、達成することができる。それぞれの技術には、性能の特徴があり、その技術はその性能の特徴により特殊な共焦点用途に対しては有利となるが、他の用途に対してはその特徴の有用性は制限される、というものである。
幹細胞および分化していない幹細胞の二次元(2‐D)における形状を明らかにすることができるということが記載された。Rice et al. (2007) J Biomed Opt. 2007 Nov-Dec;12(6)を参照のこと。この文献の開示内容は、明示的に本明細書において参照により組み入れられるものとする。一実施形態では、多能性幹細胞は、蛍光タンパク質、例えば、強化緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescence protein)、を発現するよう遺伝的に改変されてもよく、また、多能性幹細胞プロモーター(例えば、OCT4もしくはNANOG、または今後同定される任意の他の多能性幹細胞プロモーター)により駆動されてもよい。皮下植え込みよりも深い、すなわち皮膚表面より下の深さの、それら植え込み可能なデバイスについては、二光子が、共焦点顕微鏡法よりも深い、非侵襲性の画像化を提供する。さらには、使用される赤外光は、生細胞に対して、可視光または紫外光曝露よりも害が少ない。これは、蛍光励起に必要な光子エネルギーは焦点面のみで発生し、焦点外の面にある細胞または組織では起こらないためである。
は、すべて、その開示内容全体が、本明細書により、参照により本願中へとその全体が組み入れられるものとする。
以下の実施例を少なくとも部分的に行い、第一に、生体適合性デバイスおよび医療用/機械的デバイスなどの、膵臓前駆細胞をカプセル化する方法の完全性を判定し、;また、第二に、完全にカプセル化された膵臓前駆細胞が、カプセル化されていない膵臓前駆細胞(コントロール)に比べて生存するかどうか、および、in vivoにて、機能するホルモン分泌細胞へと成熟するかどうか、を判定した。
AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS、および、2008年11月4日に提出された米国出願第12/264,760号、STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF、に詳細に記載されている。この、国際
出願PCT/US2007/062755および米国出願第12/264,760号は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。
許第6,773,458号;第6,156,305号;第6,060,640号;第5,964,804号;第5,964,261号;第5,882,354号;第5,807,406号;第5,800,529号;第5,782,912号;第5,741,330号;第5,733,336号;第5,713,888号;第5,653,756号;第5,593,440号;第5,569,462号;第5,549,675号;第5,545,223号;第5,453,278号;第5,421,923号;第5,344,454号;第5,314,471号;第5,324,518号;第5,219,361号;第5,100,392号;および第5,011,494号、においてさらに記述されている。これら文献はすべて、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。膵臓前駆細胞を、ex vivoで当該デバイス中に装填したか、または、いったん、当該デバイスをある期間の間植え込んで、当該デバイスの予備血管新生化(prevascularization)をさせておき、その後、当該細胞を、in vivoで、当該デバイスの片側の装填用ポートを介して装填したか、のいずれかを行った。
応答性であることを示すには、50pM未満の血清ヒトC‐ペプチドレベルまたは25pM未満のインスリンレベルは無意味(insignificant)である、ということを示した。この同じ基準を、これらの研究で用いた。当該研究の結果を表1に示す。血清C‐ペプチドレベルが他のいずれの動物よりもずっと高かったグルコース刺激後30分時点の動物番号681を除き、8、12および15週間後の原形Theracyte社製デバイスおよび改変Theracyte社製デバイスは、ともに、同程度の血清ヒトC‐ペプチドレベル(動物番号675〜676および679〜681)を有していた。
;モルモット抗インスリン(INS)、1:500(ダコ社製、A0564);ウサギ抗ソマトスタチン(SST)、1:500(ダコ社製、A0566);ヤギ抗ソマトスタチン(SST)、1:300(Santa Cruz Biotechnology社製、SC‐7819);ヤギ抗グルカゴン(GCG)、1:100(Santa Cruz Biotechnology社製、SC‐7780)。画像化は、共焦点顕微鏡法(ニコン社製、Eclipse 80i、Ci)により行った。
移植された膵臓前駆細胞集団のin vivoにおける機能に宿主とグラフトとの間の細胞間接触が必要であったかどうかを判定するべく、細胞を予備血管新生化無しの細胞カプセル化デバイス中へ装填した。
〜823と比較のこと。事実、当該カプセル化された細胞は、皮下に植え込んだ場合に、例えば動物番号833〜835(TC SQ 1.5M)を819〜821(SQ 1.9〜2.4M)と比較すると、当該カプセル化されていないものよりもよく機能した。よって、本実施例において明確に示されたように、移植された完全にカプセル化された細胞は、あらゆる、宿主とグラフトとの間の細胞間接触がすべて非存在下であっても生存、増殖および成熟することから、宿主とグラフトとの間の細胞間接触は必ずしも必要ではない。
細胞移植は、利用可能な細胞源の不足およびオペレーション上の問題やロジスティックな問題が障害となっているために、移植用の細胞源が、患者にとって都合のよい時に、制限無く提供される必要性がある。
ぞれ50ng/mL)とを含有する15ml殺菌チューブへと移し、穏やかに混合し、50×gで手短にスピンさせた。上清を除去し、細胞を、25μg/mLで、DNAseをプラスした同じ緩衝液中に再懸濁し、および回転培養にかけた。
多能性幹細胞培養条件
多能性幹細胞、特に、ES細胞およびIPS細胞、の培養、増殖および維持は、実質的に、上記D'Amour et al. 2005 & 2006およびKroon et al. 2008に記載の通りに行った。DMEM‐F12/1%グルタマックス/1%非必須アミノ酸/1%Pen‐Strep/0.2%b‐メルカプトエタノール、というES基礎培地を用いた。ステージ0またはhES細胞増殖では、種々の成長(増殖)因子ならびに/またはインスリンおよびインスリン様成長因子のレベルを非常に低く保った。フィーダーフリー多能性幹細胞を、低いレベルのヒト血清を用いて培養した。この多能性幹細胞は、Rhoキナーゼ阻害剤Y27632を用いて維持した。同様の結果となる他のRhoキナーゼ阻害剤を使用してもよいとのことは理解されるであろう。当該ES細胞または多能性幹細胞培養条件は、上述した実施例1および2と実質的に同様である。
のを助ける。また、成長(増殖)因子のレベルがhES細胞の増殖およびそれらの多能性を促進し、かつその細胞の分化を促進しないよう低く維持される限りは、様々なまたは低いレベルのbFGF、アクチビンA、B、または他のTGF‐β増殖因子ファミリーメンバー、特にGDF‐8および‐11、ならびに例えばheregulinなどのErrb2結合リガンド、の任意の組み合わせを使用してhES細胞培養物を促進してもよい。本明細書に記載の実施形態では、多能性幹細胞培養物を維持および増殖させることにおいて種々の成長(増殖)因子(いくつかの場合には巨大タンパク質)が記載されているが、大規模製造に基づいた場合のこれらのタンパク質のコストは高いため、法外な費用のかかるものとなってしまう。より大きな成長(増殖)因子タンパク質の代わりにするために特定の低分子を同定および特徴決定することは、それ自体、有益であることがある。そのような分子の1つはノルエピネフリン(NE)であり、これは、SMALL MOLECULES SUPPORTING
PLURIPOTENT CELL GROWTH AND METHODS THEREOFと題され、2009年4月27日に提出された米国出願第61/172,998号に、より詳細に記載されており、また、これは、本明細書において参照によりその全体が組み入れられる。一実施形態では、約5ng/mL、約10ng/mL、約20ng/mL、約30ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mLまたはそれ以上を用いて、多能性幹細胞培養物、例えば、hES培養物またはiPS培養物を維持する。好ましい一実施形態では、hES細胞培養物において、約50ng/mLを用いてもよい。
多能性幹細胞の、特にES細胞およびIPS細胞の、方向性を持った分化は、実質的に
、上記D'Amour et al. 2005 & 2006およびKroon et al. 2008ならびに2009年4月22日に提出されたCELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLSと題された米国出願第61/171,759号を含む上述の関連米国出願、に記載の通りに行った。これら文献は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。
腸内胚葉(またはPDX1陰性前腸)細胞でかなり発現されるHNF4‐αはあまり発現しない。胚体内胚葉細胞は、後のステージ3、4または5の細胞で観察されるマーカー、例えば、すなわち、PDX1陽性前腸内胚葉細胞で発現するPDX1、NNF6、SOX9およびPROX1、または、PDX1陽性膵臓前駆細胞もしくはPDX1/NKX6.1共陽性膵臓前駆細胞で発現するPDX1、NKX6.、PTF1A、CPAおよびcMYC、または、内分泌前駆細胞で発現するNGN3、PAX4、ARXおよびNKX2.2、または、多ホルモン性もしくは単一ホルモン性の膵臓内分泌細胞で発現するINS、GCG、GHRL、SSTもしくはPP、などもあまり発現しない。
約48時間(約2日間)の多能性幹細胞のDEへの分化の後、当該DE分化培地を、別の培地条件で交換した。ここにいう別の培地条件とは、ヒト前腸内胚葉(PDX1陰性前腸内胚葉)形成またはステージ2の細胞を促進する培地条件である。この細胞培養培地は、RPMI1640/1%グルタマックス/1%Pen‐Strepおよび0.2%FBSまたはFBSのさらなる増加、例えば約2%FBS、を含む。上記ステージ1の培養培地と同様に、それぞれ、約1:5000または1:1000または約0.02%もしくは0.1%のITSサプリメントを添加した。
ージ1のDEとは区別される。PDX1陰性前腸細胞は、後のステージ3、4または5の細胞で観察されるマーカー、例えば、すなわち、PDX1陽性前腸内胚葉細胞で発現するPDX1、NNF6、SOX9およびPROX1、または、PDX1陽性膵臓前駆細胞もしくはPDX1/NKX6.1共陽性膵臓前駆細胞で発現するPDX1、NKX6.1、PTF1A、CPAおよびcMYC、または、内分泌前駆細胞で発現するNGN3、PAX4、ARXおよびNKX2.2、または、多ホルモン性もしくは単一ホルモン性の膵臓内分泌細胞で発現するINS、GCG、GHRL、SSTもしくはPP、などもあまり発現しない。
ステージ2のPDX1陰性前腸内胚葉細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進するために、当該PDX1陰性前腸内胚葉細胞培養培地を交換し、約1または2μMのレチノイン酸(RA)のいずれかを含有し約0.25μMのKAAD‐シルコパミン(Cylcopamine)を含有しかつ約50ng/mLのノギン(Noggin)を含有するかまたは含有しない、DMEM 高グルコース/1%グルタマックス/1%Pen‐Step/1%B27サプリメント、を含む培地中でインキュベートした。あるいは、一部の培養物は、RAを受ける代わりに、1nM〜約3nMの芳香族レチノイド(E)‐4‐[2‐(5,6,7,8‐テトラヒドロ‐5,5,8,8‐テトラメチル‐2‐ナフチレニル)‐1プロペニル]安息香酸(TTNPB)を受けた。さらに他の培養物は、約1mMのドルソモルフィンを受けた。この細胞をこの培養培地中で約3日間インキュベートした。細胞は、約1〜5日、好ましくは2〜4日、およびより好ましくは3日インキュベートしてもよいとのことは理解されるであろう。
PDX1陽性前腸内胚葉細胞からの、適切に分化するPDX1/NKX6.1共陽性膵臓前駆細胞の分化をさらに促進するするために、当該PDX1陽性前腸内胚葉細胞培養培地を交換し、RAまたは例えばTTNPBなどのレチノイン酸誘導体またはノギン(noggin)またはドルソモルフィンを含有しない以外は、上記ステージ3にあるのと同様の基礎培地、DMEM 高グルコース/1%グルタマックス/1%Pen‐Step/1%B27サプリメント、を含む培地中でインキュベートした。その代わりとして、当該培養物に、約50ng/mLのノギン(Noggin)、KGFおよびFGFを添加した。当該培養物に、約10〜100ng/mLの上皮増殖因子および繊維芽細胞成長因子(EGFおよびFGF)を添加してもよいとのことは理解されるであろう。好ましくは約10〜50ng/mL、または好ましくは約10ng/mLのEGF、および約50ng/mLのFGF、が当該培養物に添加される。あるいは、FGFが当該培養物に添加されなくてもよく、または各約25〜100ng/mLの、ノギン(Noggin)、KGF、FGF、もしくは好ましくは約50ng/mLのノギン(Noggin)、KGFおよびFGFを用いた。当該細胞を、培地交換しながら、この培地中に約4〜5日間保持した。細胞は、差し支えない程度に培地交換しながら、培地中で、約2〜6日、好ましくは3〜5日、およびさらにより好ましくは4〜5日、保持してもよい、とのことは理解されるであろう。
このステージ4の細胞培養培地にて約3〜5日後、当該細胞培養物を、:i)フローサイトメトリー分離および/または精製および分析用;ii)上記にてより詳細に論じた細胞カプセル化デバイスへのカプセル化用;および/または、iii)哺乳動物への移植用、に、調製した。あるいは、ステージ4からの細胞培養物を、フローサイトメトリーおよび/または移植の前に、約1〜2日間、成長(増殖)因子をマイナスした、DMEM 高グルコース/1%グルタマックス/1%Pen‐Step/1%B27サプリメント、の培地中に移したか、または適応させた。
モン性の内分泌細胞が選択されなかったか、または、この集団中で豊富になってなかったことを示している。したがって、CD142を正の免疫選択に用いて、PDX1陽性(postiive)膵臓前駆細胞または上皮細胞を豊富にしおよび/または精製してもよく、一方、当該素通り分画(当該抗体カラムに結合しない分画または細胞;すなわちCD142−)は膵臓内分泌型細胞で豊富になる。米国出願第12/107,020号の表10についても参照のこと。
凍結保存された集団を含む、当該PDX1陽性膵臓前駆細胞培養物またはPDX1陽性膵臓前駆細胞が豊富になった集団が、in vivoで発生し、かつ、グルコース感受性インスリン分泌細胞へと成熟することが十分にできるかどうかを判定するために、当該前駆細胞集団を、上記実施例1および2にて記載したものと同様のカプセル化用デバイス中へ、平滑末端化された(blunted)適切な大きさのゲージの針を有するハミルトンシリンジか、またはメーカーの手順に従った遠心装填法のいずれかを用いて、装填した。
れるまで、遠心する。次いで、大いに注意を払ってこの装填用構成成分を除去し、当該装填されたデバイスを確保する。
ロインスリンから切り出されるかプロセシングされるため、ヒトC‐ペプチドが検出されること、および内因性のマウスC‐ペプチドが検出されないこと、は、インスリン分泌が、グラフトした(外因性の)細胞由来のものであることを示している。
Claims (34)
- 哺乳動物においてin vivoでインスリンを産生するための方法であって、前記方法が、:
(a) in vitroのヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞集団を、植え込み可能な半透過性デバイス中へと供給すること;
(b) 前記デバイスを前記細胞前駆細胞集団とともに哺乳動物宿主中へと植え込むこと;ならびに
(c) 前記前駆細胞集団が、腺房細胞と、少なくとも一部がin vivoにてグルコース刺激に応答してインスリンを産生するインスリン分泌細胞である内分泌細胞とを含むように、前記前駆細胞集団を前記デバイスにおいてin vivoで成熟させ、それにより、前記哺乳動物においてin vivoでインスリンを産生させること、
を含む方法。 - PDX1陽性膵臓前駆細胞を腺房細胞または導管細胞(duct cell)へと成熟させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記デバイスを、まず、前記哺乳動物に植え込むことにより予備血管新生化させる、請求項1に記載の方法。
- 前記デバイスが、前記デバイス中の前記ヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞集団の体積に対する表面積の比を最大化するための複数の溶接継目(weld)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記デバイスが、前記宿主の血管新生化を増加させるための複数の溶接継目を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記デバイスが詰め替え可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記デバイスが伸張可能(expandable)である、請求項1に記載の方法。
- 前記in vivoの細胞集団をモニタリングする、請求項1に記載の方法。
- グルコース刺激後の前記哺乳動物の血清中に、25pMを超えるインスリンが検出可能である、請求項1に記載の方法。
- グルコース刺激後の前記哺乳動物の血清中に、50pMを超えるヒトC‐ペプチドが検出可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団を、前記宿主哺乳動物の1つ以上の細胞から守る、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物が免疫抑制されている、請求項1に記載の方法。
- ヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞集団の作製に、細胞集団を解凍することが含まれる、請求項1に記載の方法。
- ヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞集団の作製に、PDX1/NKX6.1共陽性膵臓前駆細胞の細胞集団を豊富にすることがさらに含まれる、請求項1に記載の方法。
- ヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞集団の作製に、細胞集団をCD142抗原に結合する抗体に接触させて前記CD142結合細胞を豊富にすることにより、PDX1/NKX6.1共陽性膵臓前駆細胞の細胞集団を豊富にすることがさらに含まれる、請求項1に記載の方法。
- 生細胞をカプセル化するための少なくとも1つのチャンバーを含む、哺乳動物宿主中へと植え込むための細胞カプセル化用アセンブリ(cell encapsulating assembly)であって、前記カプセル化用アセンブリをそれにより形成するところの前記アセンブリの周辺端部の第一の接着部、および、前記チャンバーの体積を効果的に減少させるがデバイス表面積を増加させる第二の接着部、を含む、アセンブリ。
- 前記アセンブリが半透膜を含む、請求項16に記載のアセンブリ。
- 前記アセンブリが、第三または第四の接着部を有し、前記チャンバー体積をさらに減少させる、請求項16に記載のアセンブリ。
- 少なくとも1つの装填用ポート(loading port)をさらに含む、請求項16に記載のアセンブリ。
- 2つの装填用ポート含む、請求項16に記載のアセンブリ。
- 前記アセンブリが生細胞をさらに含む、請求項16に記載のアセンブリ。
- 前記生細胞がヒトPDX1陽性膵臓前駆細胞である、請求項21に記載のアセンブリ。
- 哺乳動物への移植に適したものである、凍結保存したヒト膵臓前駆細胞集団。
- 前記細胞集団の細胞が、前記哺乳動物において島または腺房細胞へと成熟する能力を有する、請求項23に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団の細胞が、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌することができるベータ細胞へと成熟する能力を有する、請求項23に記載の細胞集団。
- 前記膵臓前駆細胞集団がPDX1陽性膵臓前駆細胞を含む、請求項23に記載の細胞集団。
- 移植に適した細胞のin vitroの集団を保存する方法であって、前記方法が、
a) ヒト膵臓前駆細胞の集団を凍結保存溶液に接触させ、それにより凍結保存用の細胞のin vitroの集団を保存すること;および
b) 前記前駆細胞の凍結保存温度を約0℃未満へと低下させ、それにより、移植に適した膵臓前駆細胞の集団を得ること、
を含む方法。 - 前記前駆細胞の凍結保存温度を約−50℃未満へと低下させる、請求項27に記載の方法。
- 前記前駆細胞の凍結保存温度を約−100℃未満へと低下させる、請求項27に記載の方法。
- 前記前駆細胞の凍結保存温度を約−150℃未満へと低下させる、請求項27に記載の
方法。 - 前記前駆細胞の凍結保存温度を約−190℃未満へと低下させる、請求項27に記載の方法。
- 移植に適した細胞のin vitroの集団を提供する方法であって、前記方法が、凍結保存細胞集団の温度を上昇させて、移植に適した膵臓前駆細胞の集団を得ることを含む、方法。
- 前記細胞集団を細胞カプセル化アセンブリへと供給する段階をさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞カプセル化アセンブリが請求項16に記載のアセンブリである、請求項33に記載の方法。
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