JP2005532259A - 培養およびカプセル化された膵臓幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願第60/342,250号(2001年12月21日出願)の利益を主張し、この内容は、本明細書中に全ての目的に対して参考として援用される。
該当なし。
該当なし。
本発明は、グルコースに応答してインスリン産生を産出する細胞の安定した培養物を産出するために、インサイチュの条件下でカプセル化および成熟され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関連する。これらの細胞は、培養において増大可能(expandable)かつ安定の両方であり、そして後期発生段階へと誘導され得るという点で有利である。本発明は、中間の分化段階の細胞を、後期膵臓細胞へと、インビトロで培養する工程を回避する。
哺乳動物膵臓は、胚前腸芽から発生する。胚芽が成長するにつれ、管系は、分岐形態形成によって発達する。腹側および背側の原基が融合した後、新たな器官が成長し、そして2つの連結した構造(外分泌系および内分泌系)へと成熟する。膵臓の大部分は、消化酵素を産生する腺房細胞から構成される。内分泌系は、β細胞(これは、インスリンを産生する)、α細胞(これは、グルカゴンを産生する)およびδ細胞(これは、ソマトスタチンを産生する)を含む。内分泌細胞は、島と呼ばれるクラスターへと組織化される。
本発明は、以下:(i)細胞が、1平方センチメートルあたり約180細胞の初濃度で第2容器への第1培養容器から継代して、1平方センチメートルあたり約1,800細胞まで増殖され得る、および(ii)増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方が、90%のPDX−1が陽性であり、そして1:100と1000:1との間のインスリン:アクチンmRNA比を有する、という特性を有する、増殖する膵臓細胞の細胞培養物をカプセル化することにより、インサイチュで哺乳動物へインスリンを供給する方法を提供する。カプセル化後、この細胞は、インスリン分泌細胞に成熟させるために、この細胞を許容する哺乳動物に移植されるかまたは埋め込まれる。
「カプセル化」は、細胞が、生体適合性無細胞性材料(例えば、アルギン酸ナトリウム、ポリリジン)により取り囲まれるプロセスをいう。好ましくは、低分子(糖および低分子量のタンパク質のようなもの)は、カプセル化細胞を取り囲む環境から吸収され得るかまたは、カプセル化細胞を取り囲む環境へと分泌され得る。同時に、大きい分子および免疫細胞による、カプセル化された細胞へのアクセスは、限定される。
本発明は、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在し、そして膵臓幹細胞はカプセル化される間、インスリン産生凝集物へと成熟され得るという知見に関する。これらの膵臓幹細胞は、膵臓から直接単離された細胞性構造物およびカプセル化膵島の機能
を再利用する。膵臓幹細胞は、培養において増殖できる有益を提供するが、このカプセル化手順は、凝集物を有する細胞のサイズおよび数に対するコントロールを可能にする。
本発明は、中間段階の膵臓幹細胞の集団の、インスリン分泌細胞凝集物への成熟を誘導する方法を提供する。代表的に、初期工程として、中間段階の膵臓幹細胞が、膵臓から単離される。膵臓から収集された細胞は、内分泌および外分泌可能な分化細胞を産生し得る多様な集団である。これらの分化細胞は、膵性内分泌分子(例えば、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンならびに他の内分泌ホルモン)、および膵性外分泌分子(例えば、アミラーゼ)を発現する。さらに、培養された細胞集団の一部は、培養において複製および増殖が可能である。従って、本発明で使用されるこの中間段階の膵臓幹細胞集団は、ドナーの膵臓から単離され得る。次いで、新鮮に単離された膵臓細胞は、中間段階の膵臓幹細胞の増殖を促進する条件下で培養される。
ドナー供給源は、培養膵臓細胞由来の1以上のドナー膵臓、または膵臓内分泌ホルモンおよび膵臓外分泌ホルモンを産生し得る細胞を生じ得る他の供給源であり得る。好ましい実施形態では、その後の培養のために単離された細胞は、1以上の寄贈された膵臓から得られる。本明細書中に記載される方法は、寄贈された膵臓の年齢に依存しない。従って、胎児から成体の年齢にわたるドナーから単離された膵臓材料が用いられ得る。
一旦、膵臓がドナーから収集されたら、これは代表的に、種々の方法を用いて、培養するための個々の細胞または細胞の小さな群を生じるように処理される。1つのこのような方法は、回収された膵臓組織が酵素消化のために清浄および調製されることを要する。酵素処理は、回収された組織の実質が、より小さな単位の膵臓細胞材料へと解離されるように、結合組織を消化するために用いられる。収集された膵臓組織は、収集された器官の全体的構造から、膵臓細胞材料、部分構造および個々の膵臓細胞を分離するために1以上の酵素を用いて処理される。コラゲナーゼ、DNAse、Liberase調製物(米国特許第5,830,741号および同第5,753,485号を参照のこと)ならびに他の酵素は、本明細書中に開示される方法での使用が意図される。
(A.一般的細胞培養手順)
一旦膵臓細胞が入手および単離されたら、これらは、所望の中間段階集団の増殖を、または他の実施形態では、より成熟した細胞型の分化を選択する条件下で培養される。一般的細胞培養方法論は、Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第4版,John Wiley & Sons(2000)に見出され得る。代表的に、膵臓細胞は、他の哺乳動物細胞に適切な条件下で、例えば、加湿インキュベーター中に37℃で、5% CO2の条件下で培養される。細胞は、当該分野で公知の種々の基材(例えば、負の表面電荷を有する、ホウケイ酸ガラス製のチューブ、ボトル、ディッシュ、クローニングリング、プラスチック製の組織培養チューブ、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、増大した増殖表面積(GSA)または食道ドップラーモニタ(Esophageal Doppler Monitor;EDM)仕上げを有する容器、GSAを増大させるための複数の内部シートを有するフラスコ、Fenwalバッグおよび他の培養容器)で培養され得る。
ドナー膵臓から収集された細胞は通常、ドナーの死と単離手順の開始との間に、温かい虚血または冷たい虚血の期間を経ている。さらに、単離手順の間に、膵臓細胞は通常、タンパク質分解消化ならびに機械的ストレスおよび剪断ストレスに供される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらの細胞によって経験された種々の外傷は、膵臓幹細胞集団(例えば、条件的前駆細胞)の増大をもたらす種々の細胞プロセスをアップレギュレートし得る。中間細胞集団は、単離または精製後に細胞を低血清培地中に直接配置することによって満足のいく効率で作製され得る。それにもかかわらず、単離手順の間に細胞によって経験された外傷は、細胞の生存および培養への適応に有害な影響を有し得るので、新鮮に単離された細胞を、高濃度の血清(例えば、>4%)を含む安定化培地中で維持して、培養プロセスの効率を改善することがときどき所望される。この維持期間は、短くてもよい(例えば、一晩)。必要に応じて、細胞は、高血清培地中で長期の増殖期間にわたって維持され得る。
一旦膵臓細胞が単離されたら、増殖している中間段階集団の出現を促進するために、細胞は選択的培地へと移植される。この選択的培地は、膵臓内分泌ホルモンを分泌する能力を保持する細胞の増殖、または高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌する、より分化した細胞へと成熟する可能性を保持する細胞の増殖に好都合である。一般に、選択的培地は、線維芽細胞および間葉細胞を犠牲にして、上皮細胞または上皮様細胞の増殖に好都合であるが、純粋な上皮培養物は、本発明の方法における膵臓細胞の有利な使用のために必要とされるとは示されていない。代表的に、上皮選択的培地は、培養中での一定期間の増殖(例えば、各継代における集団の増大に依存して、2回、3回、4回または5回の継代)後に、ほぼ純粋な(例えば、<10%の線維芽細胞または間葉細胞)細胞の集団を生じる。
この状況で用いられる場合、「低血清培地」とは、約1%未満の血清を有する培地をいう。従って、無血清培地は、一種の低血清培地である。0%と1%との間の血清、例えば、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%または0.9%の血清の濃度を有する培地は、適切な濃度の血清を無血清培地へと添加することによってか、または無血清培地と血清含有培地とを混合して所望の濃度の血清を達成するかのいずれかによって調製され得る。
成長ホルモン(GH)を含む上皮選択培養培地は、中間分化の有益な膵臓細胞集団の出現を促進するために使用される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、細胞増殖を支持する、血清中に通常見出されるマイトジェン性物質をGHが代理し得るが、血清は、それほど望ましくない細胞集団(例えば、線維芽細胞および間葉細胞)の過剰増殖を促進する他のマイトジェン性因子を含むことが仮定される。それゆえ、GHを含有する補充混合物での血清の置換は、中間の分化状態の細胞集団の増殖を選択する。無血清培地中でのGHの機能は、本発明の代替実施形態では他の補充成分で置換され得るが、天然抽出物中で、または組換えタンパク質として、GHが容易に利用可能であることによって、GH含有培地は、本明細書中に開示された方法について適切な上皮選択培地となる。
完全無血清培地のために基本培地へと添加される代表的成分としては、以下が挙げられる:組換えヒトインスリン(0.1μg/ml〜100μg/ml)、トランスフェリン(0.1μg/ml〜100μg/ml)、上皮増殖因子(0.1ng/ml〜100ng/ml)、エタノールアミン(0.1μg/ml〜100μg/ml)、アプロチニン(0.1μg/ml〜100μg/ml)、グルコース(0.1mg/ml〜100mg/ml)、ホスホエタノールアミン(0.1μM〜100μM)、トリヨードチロニン(triiodothyronone)(0.1pM〜100pM)、セレン(0.1nM〜100nM)、ヒドロコルチゾン(0.01μM〜100μM)、プロゲステロン(0.1nM〜10nM)、フォルスコリン(0.1μM〜100μM)、ヒレグリン(0.1nM〜100nM)およびウシ下垂体抽出物(0.1μg/ml〜500μg/ml)。細胞増殖を支持するために全ての補充成分が必要とされるわけではない;特定の補充物についての最適な濃度または必要性は、単一成分を省略するかまたはその濃度を低減し、そして細胞増殖に対する影響を観察することによって経験的に決定され得る(Stephanら,前出を参照のこと)。
低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移動することは、中間分化状態を有する、規定された細胞集団の選択を促進する。この細胞集団は、継代培養された場合増殖し続けるが、膵臓マーカー(例えば、PDX−1)の高い発現レベルを維持する。刺激されていない、この集団は、比較的低レベルの膵臓内分泌ホルモン(例えば、インスリン)を分泌するが、本発明の方法に従って成熟して、高分泌細胞が得られ得る。低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移送するために、細胞は、高血清培地から低血清培地へと離脱され得るか、または単離後に低血清培地中に直接配置され得る。SM95およびSM98のような培地は、適切な低血清培地であるが、SM95は、膵臓細胞の成熟の際にわずかに改善されたインスリン分泌を生じる。
成熟プロセスにおける予備的な工程において、中間段階の膵臓幹細胞は、適切な培養条件下で増殖する。簡潔に、中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培地皿または新しい培養皿で増殖し、この細胞がコンフルエンスに達しないことを確実にするように注意する。両タイプの皿由来の細胞は混合され、以下に記載されるようにカプセル化されるかまたは培養皿に再度播種される。
馴化培地皿は、中間段階の膵臓幹細胞を増殖するために、あらかじめ使用していた培養皿である。一旦、この細胞が単層を形成すると(代表的には約5日で、初回継体培養の播種密度に依存する)、これらはトリプシン処理によって除去される。馴化培養皿を生産するために、100%のコンフルエント細胞培養の増殖は必要とされない。低濃度のトリプシン(代表的には、標準的な細胞培養で使用された濃度の1/2または1/4)は、マトリックスの広範囲の分解を防ぐために好ましい。あるいは、細胞の単層は、界面活性剤を用いて基材を抽出することによって除去され得、界面活性剤は、細胞を除去するが、分泌されたマトリックスを残す(Gospodarowiczら,Proc Natl Acad Sci USA 77:4094−8(1980)を参照のこと)。
中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培養容器と新しい培養容器との混合体上に分配される。培養時間は、これらの細胞が増殖可能である限りは重要でない。好ましい実施形態において、膵臓から単離されたばかりの細胞(例えば、1回または2回のみ継代される)が使用される。既に述べられたように、中間段階の膵臓幹細胞の集団の増殖を促進するために、これらの細胞は、低血清培地で増殖される。これらの細胞がお互い接触せず、好ましくはコンフルエンスに達する前に収集されるような密度で、細胞は播種される。当業者は、播種された細胞数は、コンフルエントに達する前の培養時間に影響するということを認識している。
適応培養後、中間の増殖幹細胞のカプセル化は、カプセル内に細胞性凝集体の形成を生じる。この凝集体は、膵臓から新しく単離されたカプセル化膵島に類似する細胞性構造物およびタンパク質の発現表現型を有する。
カプセル化細胞は、ヒドロゲルによって取り囲まれている。ヒドロゲルは、種々の材料で作製され得、アルギン酸、アガロースおよびポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。これらの材料は、架橋される場合、イオン結合または共有結合のいずれかで、水中にヒドロゲルを形成する。
細胞のカプセルの例として、ポリリジン膜を有するアルギン酸カプセルの形成が記述される。当業者は、カプセルはまた、アルギン酸およびポリリジンまたは他の材料の改変体を用いて形成され得ること、そしてこの形成プロセスは、カプセル化細胞の機能に影響しないで同様に修飾され得るということを認識している。この細胞の機能を試験するためのアッセイは、本願における第IV節のカプセル化細胞の埋め込みおよび第VIの表現型アッセイで提供する。
当業者は、ある状況下において、さらなる工程が、埋め込みされたカプセル化膵臓細胞に対して実施され、宿主応答を減少させ得るということを認識している。好ましい方法は、マイクロカプセルをマクロカプセルへ取り込みさせることである。この技術は、本明細書中において参考として援用される米国特許第5,545,423号に記載される。
カプセル化後、中間の増殖幹細胞は凝集体を形成する。凝集体の細胞性構造物およびタンパク質の発現形態は、本願の第VI節に記載されるように、免疫染色によって分析され得る。代表的な細胞の凝集体は、以下の表現型を有する:細胞の単層は、凝集体の外周を取り囲み、CK−19を発現するが、凝集体の内部の細胞は、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンを発現する。CK−19を発現する細胞は、おそらく未分化細胞である;中心の、ホルモンを発現する細胞は、おそらく成熟細胞である。
哺乳動物への埋め込みまたは移植、および内分泌機能をその後モニターすることは、膵島移植で一般に使用される方法に従って実施され得る:例えば、Ryanら、Diabetes 50:710−19(2001);Peckら、Ann Med 33:186−92(2001);Shapiroら、N Engl J Med343(4):230−8(2000);Carlssonら、Ups J Med Sci 105(2):107−23(2000)およびKuhtreiber,WM,Cell Encapsulation Technology and Therapeutics,Birkhauser,Boston,1999を参照のこと。埋め込みの好ましい部位は、腹腔、肝臓および腎臓カプセルを含む。
当業者は、意図したレシピエントに対して、マイクロカプセルの適切な投薬量を決定し得る。この投薬量は、レシピエントのインスリン必要量に依存する。マイクロカプセルによって分泌されたインスリンレベルは、免疫学的にまたは生物学的活性量によって決定され得る。レシピエントの体重はまた、投薬量を決定する場合、考慮に入れられ得る。必要に応じて、カプセル化細胞に対するレシピエントの応答がモニターされるように、一つより多い埋め込みが実施され得る。従って、埋め込みに対する応答は、カプセル化細胞の投薬量に対するガイドとして、使用され得る。(Ryanら、Diabetes 50:710−19(2001))
(B.動物におけるカプセル化細胞機能のモニタリング)
レシピエントにおけるカプセル化細胞の機能は、グルコースに対するレシピエントの応答をモニターすることによって決定され得る。カプセル化細胞の埋め込みは、血中グルコースレベルのコントロールを生じ得る。さらに、膵臓内分泌ホルモン、インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの上昇したレベルの徴候は、移植されたカプセル化細胞の機能を表し得る。
成熟膵臓細胞が存在するときを知るために、インビボまたはインビトロで増殖するかどうかを、培養の特定段階でおよびカプセル化後に、膵臓細胞の表現型をアッセイすることが有用である。特定のタンパク質の発現は、細胞の正体または分化状態と相関するので、細胞は、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質の発現について分析されて、これらの正体または分化状態が評価され得る。例えば、新鮮に単離した膵臓組織では、アミラーゼの発現は、この細胞を外分泌腺房細胞と同定し、一方、インスリンの発現は、この細胞を内分泌膵島細胞と同定する。同様に、初期分化段階の膵島細胞は通常、サイトケラチンCK−19について陽性であり、一方、成熟島細胞は、CK−19のより少ない発現を示す。
膵臓細胞の集団を同定するために用いられ得る、多数の細胞性マーカーが存在する。単離されて培養されたドナー細胞は、分化した膵臓細胞の種々の表現型指標および遺伝子型指標を提示し始める。これらの指標またはマーカーにおける変化は、初期増殖期の後であるかまたは単離および精製の直後であるかにかかわらず、無血清環境への膵臓細胞のシフトに対する応答であると考えられる。表現型指標および遺伝子型指標の例としては、調節される(例えば、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれか)条件的前駆細胞集団中に存在する種々の分子マーカーが挙げられる。これらの分子マーカーとしては、CK−19が挙げられ、CK−19は、膵臓の条件的幹細胞のマーカーであると仮定される。
膵臓細胞の正体、分化または成熟度を特徴付けるために用いられ得る1つのマーカーは、インスリンmRNAのレベルである。例えば、本発明の中間の細胞集団は、規定された範囲内のインスリンmRNAの発現を示す。インスリンmRNAを定量するための方法としては、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護およびプライマー伸長が挙げられる。1つの実施形態では、RNAは、培養細胞の集団から抽出され、そしてプロインスリンメッセージの量が定量的逆転写PCRによって測定される。逆転写の後、インスリンcDNAは、インスリンcDNA配列にハイブリダイズするプライマー、および増幅産物の量がサンプル中に存在するmRNAの量に関連する増幅条件を用いてサンプルから特異的かつ定量的に増幅される(例えば、Zhouら,J Biol Chem 272:25648−51(1997)を参照のこと)。反応速度定量手順は、出発mRNAレベルが決定され得る精度に起因して好ましい。
β細胞の重要な機能の1つは、グルコースレベルに従ってそのインスリン分泌を調整することである。代表的に、静的グルコース刺激(SGS)アッセイは、増殖している付着膵臓細胞で行われて、これらの細胞が異なるグルコースレベルに応答してインスリンを分泌し得るか否かを同定し得る。細胞は一般に、ほぼコンフルエントになるまで適切な基材上で培養される。SGS試験の3日前、培養培地は、同様の特徴だがインスリンを欠き、そして1g/Lのグルコースのみを含む培地によって交換される。この培地は、毎日、3日間にわたって変更され、そしてSGS試験が4日目に行われる。
代表的に、中間段階の膵臓幹細胞をドナー膵臓から単離する。単離された膵臓細胞の混合集団を、中間段階の膵臓幹細胞の増殖を促進する条件下で培養する。
膵臓細胞は、死体膵臓から単離した。膵臓は、多臓器ドナー(59歳白人男性)から取り出した。臓器の取り入れは、United Network for Organ Sharing(UNOS)および局所臓器ドナー機構(local organ donor organization)によって調整された。
膵臓組織を、機械的分散およびHBSS中のLiberase(1.5mg/ml)を用いた消化によって解離した。管カニューレを介して、240mLのLiberase溶液を膵臓へ注入した。臓器を800ml焼なましビーカーにて、この組織が軟らかくなるまで、37℃で約10〜20分間インキュベートした。
膵島を単離後、約57%の膵島を含む細胞画分を、増殖のために直ちに組織培養容皿へ置いた。初代培養は、継代0(p0)細胞と称された。最初に、87%の無血清SM95および13%の#7培地(20%FCS含有)からなる混合培地で、細胞を増殖した。培地の組成は、本願のIIIA2節に列挙する。4日目の最初の培地交換において、p0細胞を100%の無血清SM95培地へ転換した。培養期間中、培養培地を1週間に2回交換し、そして、浮遊細胞を使用済みの培地と共に取り除いた。
成熟の前段階として、中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培養皿と新しい培養皿との組み合わせで生育する。
p3細胞を新しい皿に播種し、標準培養条件下の無血清SM95培地で増殖した。この細胞のインビトロでの分析は、安定したインスリンレベルを示し、そしてグルカゴンmRNAを発現したということを示した(p1細胞およびp2細胞と比較)。しかしながら、培養中のp3細胞は、グルコース調節様式において、高値のインスリンを分泌し、これはp3細胞が標準的な膵島様機能を有したことを示している。
培養したp0細胞、p2細胞およびp3細胞からのインスリンおよびグルカゴンmRNAの発現を、RT−PCRアッセイによって決定した。RNAを、RNeasyミニキット(QIAGEN #74104)を用いて製造業者の指示に従って単離した。簡潔には、溶解緩衝液(650μl/10cmプレート)をこの細胞に添加し、使い捨ての細胞スクレーパー(Fisher#087732)を用いて収集し、次いでQIAshredder(QIAGEN#79654)を用いて破壊した。総RNAを溶解産物から単離し、次いでRiboGreen RNA Quantitationアッセイ(Molecular Probes#R−11490)を用いて定量した。RNAサンプルを、cDNA合成まで−80℃で凍結保存した。各サンプルの二連のアリコート(各々0.5μg)を、20pmoleのオリゴ(dT)16を用い、製造業者の指示に従って、Omniscript RTキット(QIAGEN#205111)を用いて逆転写し、次いで各cDNAサンプルを、TE緩衝液(pH8.0)を用いて100μlになるように希釈し、そして−20℃にて保存した。リアルタイムPCRを、2μlの各cDNAサンプルおよび望ましいプライマーを用いて、Roche Molecular LightCyclerで実施した。製造業者の指示に従って、ハイブリッドプローブプロトコルおよびDNA Master Hybridizationミックス(Roche#2158825)を用いて、アクチンおよびインスリンを測定した。並行して増幅された各産物の検量線との比較により、PCRで定量した。
ほぼコンフルエントになるまで、細胞を培養した。SGS試験の3日前に、インスリンを欠乏しかつ1g/Lのグルコースのみを含む類似特性の培地によって、培養培地を交換した。この培地を3日毎に交換し、SGS試験を4日目に施行した。
およそ1400万の培養されたP2細胞を、カプセル化P3細胞になるように、高Gアルギン酸および高Mアルギン酸の混合物中でカプセル化した。P2細胞を3mlの1.4%アルギン酸塩溶液に懸濁し、次いで、直径約700μmのアルギン酸ゲル球体を含む細胞を形成するために、0.33% CaCl2・2H2O溶液へジェットヘッドを介して噴霧した。このゲル球体を、5〜9分間、0.33% CaCl2・2H2O溶液に浸漬し、次いで8分間、0.13% CaCl2・2H2O溶液に浸漬した。次いで、膜を形成するため、および細胞内にカプセル化するために、ゲル球体を2分間、0.1% ポリ−L−リジン溶液で処理した。次いで、このカプセルを1分間、0.33% CaCl2・2H2Oに浸漬した。カプセルを生理食塩水で洗浄し、10分間、0.2%アルギン酸に浸漬し、そして生理食塩水で再度洗浄した。次いで、カプセルを5分間、0.05%ポリリジンに浸漬し、その後、生理食塩水で洗浄した。カプセル内のアルギン酸ゲルを、5分間、55mMクエン酸ナトリウムで処理することにより液化した。別の生理食塩水の洗浄後、カプセルを10分間0.2%アルギン酸で処理し、次いで、生理食塩水で再度洗浄した。カプセル化を完成するために、カプセルを8分間、RPMIに浸漬した。
カプセル化後24時間以内に、増殖膵臓細胞は凝集し、そして、これは膵臓から直接単離されたカプセル化膵島と類似の細胞性構造物を表した。インビボのアッセイおよびインビトロのアッセイは、カプセル化増殖膵臓細胞が、インビトロにおいて再構築された膵島のように機能し得ることを示した。
免疫組織化学により調べる細胞は、顕微鏡検査のためのスライドガラスチャンバー上で培養し得る。あるいは、従来の組織培養で増殖した細胞またはカプセル化細胞を、手動で培養物から取り除き、薄切のためにパラフィンで包埋し得る。PDX−1抗体を、Leonard J.ら、Mol.Endocrinol.,1993,10月7日(10)1275−83の技術に従って作製し得る。
カプセル化p3凝集物のインビトロでの機能を、SGSアッセイによって決定した(表4)。細胞は、3.7μU/カプセル/時間の基礎インスリン放出レベルおよび2.3μU/カプセル/時間の刺激性グルコース放出レベルを有した。この割合は、培養されたp3細胞の割合よりも低かった。この抑えられた応答に対する一つの説明は、アルギン酸がインスリンに結合するということである。SGS試験は、細胞がカプセル化された後であるが、アルギン酸のインスリン結合能力が満足される前に実施された。インスリンに対するアルギン酸の結合は、インスリン産生細胞周囲のアルギン酸によるインスリン染色の存在によって示された(図3E)。
カプセル化p3凝集物のインビボでの機能を決定するために、カプセル化細胞をSTZ誘導性糖尿病SCIDマウスへ移植した。この実験動物(SCIDマウス)を、ストレプトゾトシン(220mg/kg)の腹腔内単回注射を用いて糖尿病にした。この動物は、一週以内に高血中グルコース(>400mg/dl)になった。
比較のために、p3膵臓細胞を膵臓から直接単離された膵島細胞(糖尿病処置に対するモデル系)と比較した。膵臓からの単離直後、アルギン酸マイクロカプセルで簡単にカプセル化した場合、この膵島細胞は、目に見える構造を呈する。カプセル化膵島細胞は、培養において維持され、そしてインスリン発現試験およびSGS試験によって測定されたように、機能的な膵島活性を保持した。糖尿病ラットへ移植された場合にいつ機能するかについて、カプセル化膵島細胞はまたインビボで証明した。
ヒト膵島を上記のようにドナー膵臓から単離した(これは少なくとも60%純粋)。カプセル化前に、新たに単離された膵島を、非付着性のFenwall培養バッグ内に4〜48時間、血清を含むM7培地中での浮遊培養に維持した。カプセル化後、カプセル化膵島細胞を2年半までの間、培養を維持した。6ヶ月間(HD302)および28ヶ月間(HD314)培養を維持したカプセル化膵島の二つの集団を分析した。
9ヶ月間(HD357)培養を維持していたカプセル化膵島のインビトロでの機能を、静グルコース刺激(SGS)アッセイ(異なるグルコースレベルに対する応答において、この細胞がインスリンを分泌する能力を測定する)を用いてアッセイした。
9ヶ月間培養を維持したカプセル化膵島(HD357)のインビボでの機能を、STZ誘導性糖尿病ヌードラットへ移植することによりアッセイした(図6)。ラット1においては、移植二日以内に、459mg/dl(移植前レベル)から99mg/dlまで、血中グルコースレベルが減少した。ラット2においては、二日以内に、561mg/dl(移植前値)から79mg/dlまで、血中グルコースレベルが減少した。
比較のために、膵島をCK−19陽性細胞ならびにPDX−1陽性細胞の位置および構造を決定するために、膵臓組織において分析した。膵臓組織において、CK−19陽性細胞およびPDX−1陽性細胞と関連する目に見える構造は見出されなかった。
ドナー膵臓の組織サンプルを、膵島単離のためにドナー膵臓をトリミングする時点に得た。サンプルを組織学的特徴付けのために処理した。天然の膵島および膵臓周囲組織を、CK−19、PDX−1、内分泌ホルモンおよびアミラーゼに対して染色した(図8、A〜F)。
Claims (7)
- インサイチュにおいて、哺乳動物にインスリンを提供する方法であって、該方法は、以下:
(a)増殖する膵臓細胞の細胞培養物をカプセル化する工程であって、該細胞は以下:(i)第1培養容器から第2容器へと1平方センチメートルあたり約180細胞の初濃度で継代されて、1平方センチメートルあたり約1,800細胞へと増殖する能力、および(ii)増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方が、90% PDX−1陽性であり、そして、1:100と1000:1との間のインスリン:アクチンのmRNA比を有する、という特性を有する、工程;
(b)インスリン分泌細胞を成熟させるために、該カプセル化された細胞を該細胞を許容する哺乳動物へ挿入する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞が、細胞凝集物へ成熟する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞凝集物へ成熟する、請求項1に記載の方法であって、CK19陽性細胞のカプセル化膜および内部細胞塊を含み、ここで、該凝集物が、50〜5000の膵臓細胞を含み、そして50ミクロンと300ミクロンとの間の直径を有する細胞。
- 前記哺乳動物が、糖尿病のヒトである、請求項1の記載の方法。
- 前記細胞培養が、1:10と100:1との間のインスリン:アクチンmRNA比を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記カプセル化工程は、以下:カプセルを作製するためにアルギン酸を用いて前記細胞を包囲する工程、二価カチオンを用いて該アルギン酸を架橋する工程、および該カプセルを囲むためにポリリジン膜を提供する工程、を包含する、請求項1に記載の方法。
- カプセル化膵臓細胞を含む組成物であって、該細胞は以下:(i)第1培養容器から第2容器へと1平方センチメートルあたり約180細胞の初濃度で継代して1平方センチメートルあたり約1,800細胞へと増殖する能力、および(ii)増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方は90% PDX−1陽性であり、そして、1:100と1000:1との間のインスリン:アクチンのmRNA比を有する、という特性を有する、組成物。
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