MXPA02004268A - Medio para preparar celulas dediferenciadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un medio para preparar celulas dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhans. El medio comprende en un medio de cultivo fisiologicamente aceptable una cantidad eficaz de un ambiente de matriz solida para un cultivo tridimensional, una proteina de matriz soluble, y un primer y segundo factor para desarrollar, mantener y expandir las celulas dediferenciadas. Tal medio puede utilizarse en un metodo in vitro para expansion celular de isleta.

Description

MEDIO PARA PREPARAR CÉLULAS DEDIFERENCIADAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN (a) Campo de la Invención La invención se refiere a un medio para preparar células dediferenciadas y más particularmente a un medio de alimentación básico para el desarrollo, mantenimiento y expansión de una población celular dediferenciada con al menos biopotencialidad, que puede utilizarse en un método in vitro para expansión celular de isleta. 10 (b) Descripción de la Técnica Anterior Diabetes mellitus Diabetes mellitus se ha clasificado como tipo I, o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) y tipo II, o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM). Los pacientes con NIDDM se han subdivido además en (a) no obeso (posiblemente IDDM en evolución), (b) obeso, y (c) inicio de madurez (en pacientes jóvenes). Entre la población con diabetes mellitus, aproximadamente 20% padece de IDDM. La diabetes se desarrolla ya sea cuando ocurre una rendimiento disminuido de insulina o cuando una sensibilidad disminuida a insulina no puede compensarse por una capacidad aumentada para secreción de insulina. En pacientes con IDDM, una reducción en la secreción de insulina es el factor principal en la patogénesis, mientras que en pacientes con NIDDM, una reducción en la sensibilidad a insulina es el factor principal. El soporte principal del tratamiento de diabetes, especialmente para la WMipl-imilÜMiÉiiilii ?? li HnÉ- .? i i i i enfermedad tipo I, ha sido la administración de insulina exógena. Racional para más terapias fisiológicas El control de glucosa ajustado parece ser la clave para la prevención de complicaciones secundarias de diabetes. Los resultados de las Complicaciones de Diabetes y Prueba de Control (DCCT), una prueba aleatorizada multicentro de 1441 pacientes con diabetes dependiente de insulina, indicó que el inicio y progresión de retinopatía diabética, nefropatía, y neuropatía podría retrasarse por terapia intensiva de insulina (The Diabetes Control and Complication Trial Research Group, N. Engl. J. Med. 1 993; 29:977-986). Sin embargo, el control de glucosa estricto, se asocia con un incremento de tres veces en incidencia de hipoglucemia severa, incluyendo episodios de ataque apopléjico y coma. También, aunque los niveles de hemoglobina glucosilada disminuyeron en el grupo de tratamiento, solamente 5% mantuvo un nivel promedio por debajo de 6.05% a pesar de la enorme cantidad de esfuerzo y recursos asignados al soporte de pacientes en el régimen intensivo (The Diabetes Control and Complication Trial Research Group, N. Engl. J. Med. 1 993; 29:977-986). Los resultados de DCCT claramente indicaron que el control intensivo de glucosa puede reducir significativamente (pero no completamente proteger contra) complicaciones microvasculares a largo plazo de diabetes mellitus. Otras opciones terapéuticas El suministro de insulina en una manera fisiológica ha sido un objetivo elusivo ya que la insulina se purifica primero por Banting, Best, McLeod y Collip. Aún en un paciente con control de glucosa ajustado, sin embargo, la insulina exógena no ha sido capaz de lograr el metabolismo de glucosa de una fuente de insulina endógena que responde a los cambios de un momento a otro en concentración de glucosa y por lo tanto protege contra el desarrollo de complicaciones microvasculares durante el largo periodo. Un objetivo principal de la investigación de diabetes, sin embargo, ha sido el desarrollo de nuevas formas de tratamiento que tratan de reproducir de manera más cercana el estado fisiológico normal. Tal planteamiento, una bomba de insulina de ciclo cerrado acoplada a un sensor de glucosa, que imita la función de la célula ß en la cual la secreción de insulina se regula de manera cercana, aún no ha sido exitoso. Solamente la terapia de reemplazo de endocrina en la forma de un transplante ha probado ser efectiva en el tratamiento diabetes mellitus. Aunque los transplantes de tejido que produce insulina son un avance lógico sobre inyecciones de insulina subcutáneas, aún está lejos de aclarar si los riesgos de la intervención y del tratamiento inmunosupresivo a largo plazo asociado son inferiores en pacientes diabéticos bajo tratamiento convencional. A pesar de la evidencia anterior de los beneficios potenciales de transplante de páncreas vascularizado, permanece una intervención quirúrgica compleja, que requiere la administración a largo plazo de inmunosupresión crónica con sus efectos secundarios concurrentes. Además, casi 50% de los pacientes con transplantes exitosos muestran curvas de tolerancia empeoradas ( right FH eí al., Arch Surg., 1989: 124:796-799; Landgraft R eí al., Diabetología 1991 ; 34 (compl. 1 ): S61 ; Morel P eí al., Transplantation 1991 ; 51 :990-1000), que origina preguntas acerca de su protección contra las complicaciones a largo plazo de hiperglicemia crónica. Las complicaciones principales del transplante de páncreas completo, así como también el requerimiento para inmunosupresión a largo plazo, ha limitado su aplicación más amplia y proporcionado ímpetu para el desarrollo de transplante de isleta. Teóricamente, el transplante de isletas solas, aunque permite el control glicémico ajustado, tiene varias ventajas potenciales sobre el transplante de páncreas completo. Estas incluyen lo siguiente: (i) morbididad quirúrgica mínima, con la infusión de isletas directamente en el hígado a través de la vena porta; (ii) la posibilidad de retransplantación simple para fallas de injerto; (iii) la exclusión de complicaciones asociadas con el páncreas exocrino; (iv) la posibilidad de que las isletas sean menos inmunogénicas, eliminando la necesidad de inmunosupresión y permitiendo el transplante temprano en diabéticos no urémicos; (v) la posibilidad de modificar las isletas in vitro antes del transplante para reducir su inmunogenicidad; (vi) la habilidad para encapsular las isletas en membranas artificiales para aislarlas del sistema inmune huésped; y (vii) la posibilidad relacionada de utilizar xenotransplantación de isletas inmunoaisladas como parte de un sistema biohíbrido. Además, permiten la apilación del tejido crioconservado endocrino y un programa de control de calidad estandarizado y cuidadoso antes de la implantación. El problema de transplante de isleta Los números adecuados de isletas isogenéticas transplantadas en un sitio de implantación confiable pueden solamente invertir las anormalidades metabólicas en receptores diabéticos en el corto plazo. En aquellos que eran normoglicémícos después del transplante, ocurrió la hiperglicemia dentro de 3-12 mo (Orloff M, eí al., Transplantation 1988; 45:307). El regreso del estado diabético que ocurre con el tiempo se ha atribuido ya sea a la ubicación ectópica de las isletas, a una interrupción del eje enteroinsular, o al transplante de una masa celular de isleta inadecuada (Bretezel RH, eí al., En: Bretzel RG (ed) Diabetes mellitus (Berlín: Springer, 1990) p. 229). Los estudios de historia natural a largo plazo del transplante de isleta, que examinan los parámetros diferentes a la función del injerto, son pocos en número. Solamente se encontró un reporte en el cual se hizo específicamente un intento para estudiar la morfología del injerto (Alejandro R, eí al., J. Clin Invest 1986; 78: 1339). En ese estudio, las isletas purificadas se transplantaron en el hígado canino a través de la vena porta. Durante la continuación prolongada, las fallas retrasadas de función del injerto ocurrieron. Desafortunadamente, el injerto se examinó solamente al final del estudio, y no con el tiempo como función declinada. Laá fallas de injerto retrasadas también se han confirmado por otros investigadores para perros (Warnock GL eí al., Can. J. Surg., 1988; 31 : 421 y primates; Sutton R, eí al., Transplant Proc, 1987, 19; 3525). Se presume que la mayoría de las fallas son el resultado del rechazo a pesar de la inmunosupresión apropiada. Debido a estas fallas, actualmente hay mucho entusiasmo por el inmunoaislamiento de isletas, que podría eliminar la necesidad de inmunosupresión. Las razones son apremiantes. La inmunosupresión es ^y^ dañina para el receptor, y puede deteriorar la función de la isleta y posiblemente la supervivencia de la célula (Metrajos P eí al., J. Surg. Res., 1993; 54: 375). Desafortunadamente, las isletas microencapsuladas inyectadas en la cavidad peritoneal del perro fallan dentro 5 de 6 meses (Soon-Shiong P, eí al., Transplantation 1992; 54: 769), y las isletas colocadas en un páncreas biohíbrido vascularizado también fallaron, pero en aproximadamente un año. Sin embargo, en cada caso, la evaluación histológica del injerto ha indicado una pérdida substancial de masa de isleta en estos dispositivos (Lanza RP, eí al., Diabetes 1992; 41 : 1503). Ninguna razón se ha adelantado para estos cambios. Por lo tanto, el mantenimiento de una masa celular de isleta eficaz después del transplante sigue siendo un problema significativo. Además de este asunto sin resolver, se encuentra el problema actual de la falta de tejido fuente para transplante. El número de donadores humanos es insuficiente para mantener el número potencial de receptores. Además, dado el estado actual de la materia de aislamiento de isleta, el número de isletas que pueden aislarse de un páncreas se encuentra lejos del número requerido para invertir de manera eficaz la hiperglicemia en un receptor humano. 20 En respuesta, tres tecnologías competentes se han propuesto y se encuentran en desarrollo. Primero, la crioconservación de isleta y apilación de isleta. Las técnicas incluidas, no obstante, son costosas e incomodas, y no se prestan fácilmente a adopción difundida. Además, la masa de la célula de isleta también se pierde durante el ciclo de congelación-descongelación. Por lo tanto, existe una solución a largo ? ili iiipriliBinÉillMilBllí l l l l t í i T ' ' mí ^y^¡¡^ plazo deficiente al problema de masa celular de isleta insuficiente. Segundo, es el desarrollo de xenotransplante de isleta. Esta idea se ha acoplado a la tecnología de encapsulación de isleta para producir un implante biohíbrido que no, al menos en teoría, requiere inmunosupresión. Permanecen muchos problemas por resolver con este planteamiento, no menos, es que el problema del mantenimiento de la masa celular de isleta después del transplante aún permanece. Tercero, es el recurrir al tejido fetal humano, que debe tener una mayor capacidad para expandirse ex vivo y después transplantarse. Sin embargo, además de los problemas de disponibilidad limitada de tejido, inmunogenicidad, existen los asuntos éticos complejos que rodean el uso de tal fuente de tejido que no se resolverá pronto. Sin embargo, existe una alternativa que ofrece posibilidades similares para expansión de la masa celular ilimitada próxima. Un planteamiento completamente nuevo, propuesto por Rosenberg en 1 995 (Rosenberg L eí al., Cell Transplantation, 1 995:4:371 -384), fue el desarrollo de tecnología para controlar y modular la neogénesis de la célula de isleta y nueva formación de isletas, tanto in vitro como in vivo. El concepto supone que (a) la inducción de la diferenciación de la célula de isleta fue de hecho controlable; (b) implica la persistencia de una célula como la célula germinal en el páncreas de adulto; y (c) que la(s) señal(es) que dirigirían el proceso completo podrían identificarse y manipularse. En una serie de estudios in vivo, Rosenberg y co-trabajadores establecieron que estos conceptos fueron válidos en principio, en el establecimíento in vivo (Rosenberg L eí al., Diabetes, 1 988;37:334-341 ; Rosenberg L eí al., Diabetología, 1996;39:256-262), y que la diabetes podría invertirse. Las enseñanzas bien conocidas de la expansión de la célula 5 de isleta in vitro de una fuente de tejido no fetal viene de Peck y co- trabajadores (Corneliu JG eí al., Horm. Metab. Res., 1997;29:271 -277), quienes describen el aislamiento de una célula germinal pluripotente del páncreas de ratón adulto que puede dirigirse hacia una célula que produce insulina. Estos descubrimientos no se han aceptado ampliamente.

Primero, el resultado no se ha probado que sea reproducible. Segundo, las células así llamadas pluripotenciales jamás se han caracterizado de manera adecuada con respecto al fenotipo. Y tercero, las células ciertamente no se han mostrado que son pluripotentes. Más recientemente dos otras tecnologías competentes se han propuesto, el uso de líneas celulares ß pancreáticas realizadas (Efrat S, Advanced Drug Delivery Reviews, 1998; 33: 45-52), y el uso de células germinales embrionales pluripotentes (Shamblott MJ eí al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 998;95: 1 3726-13731 ). La opción anterior, aunque atractiva, se asocial con problemas significativos. No solamente la célula realizada debe ser capaz de producir insulina, sino que también debe responder de una manera fisiológica al nivel prevaleciente de glucosa, y el mecanismo de sensibilización de glucosa se encuentra demasiado lejos de entenderse suficientemente bien para realizarlo en una célula. Muchas líneas celulares propuestas también son líneas transformadas, y por lo tanto tienen un potencial neoplástico. Con respecto a la última opción, ^^ gaÉ ?ggiáa t?á que tiene una célula germinal embrional en la mano es implorante debido a la posibilidad teórica de ser capaz de inducir diferenciación en cualquier dirección, incluyendo hacia la célula ß pancreática. Sin embargo, las señales necesarias para lograr este acontecimiento permanecen desconocidas. Sería altamente deseable proporcionarse con una plataforma para la preparación de células intermedias dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhans, su expansión y ia inducción guiada de la diferenciación de célula de isleta, conduciendo a célula que producen insulina que puede utilizarse para el tratamiento de diabetes mellitus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la invención es proporcionar una plataforma para la preparación de células intermedias dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhans, su expansión y la inducción guiada de diferenciación de célula de isleta, conduciendo a células que producen insulina que pueden utilizarse para el tratamiento de diabetes mellitus. De acuerdo con una modalidad de la presente invención se proporciona un método in vivo para la expansión de la célula de isleta, que comprende las etapas de a) preparar células dediferenciadas derivadas de isletas postnatales de células Langerhans; b) expandir las células dediferenciadas; e c) inducir las propiedades de diferenciación de célula de isleta de las células expandidas de la etapa b) para _*- -^¿ y - -tMBuf --*'"'• -"•** volverse células que producen insulina. Preferentemente, la etapa a) y la etapa b) se efectúan concurrentemente utilizando una matriz sólida, medio de alimentación básico, mantenimiento y expansión de una población celular dediferénciada con al menos biopotencialidad. Tal medio para preparar células dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhan comprende en un medio de cultivo fisiológicamente aceptable una cantidad eficaz de un ambiente de m triz sólida para un cultivo tridimensional, una proteína de matriz, y un primer y segundo factor para desarrollar, mantener y expandir las células dediferenciadas. Preferentemente, el primer factor induce una elevación en cAMP intracelular, y el segundo factor se deriva de células acinares. Las células acinares deben estar presentes además de otros tres factores con objeto de que ocurra el cambio. El prime factor puede comprender una o más de toxina de cólera (CT), forskolin, concentraciones elevadas de glucosa, un promotor de cAMP y EGF. El medio de cultivo puede comprender DMEM/12 complementado con una cantidad eficaz de suero de bovino fetal, tal como 10%. La proteína de matriz comprende una o más de laminina, colágeno tipo I y Matrigel™. Preferentemente, la etapa c) se efectúa al remover células de la matriz y resuspenderlas en un medio líquido básico que contiene proteínas de matriz solubles y factores de crecimiento. <IU?baMa Preferentemente, el medio líquido básico es CMRL 1 066 complementado con al menos 1 0% de suero de bovino fetal, en donde las proteínas de matriz solubles y factores de crecimiento se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina, IGF-1 , IGF-2, insulina y NGF. El 5 medio líquido básico puede comprender además concentración de glucosa de al menos 1 1 mM. El medio de líquido básico puede comprender además inhibidores de trayectorias de señalización intracelulares, conocidas de apoptosis y/o inhibidor específico de p38. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se 10 proporciona un método in vitro para producir células con al menos biopotencialidad, que comprende las etapas de: a) preparar células dediferenciadas derivadas de isletas postnatales de células Langerhans de un paciente; mediante el cual las células dediferenciadas se introducen in situ en el 15 paciente, las células se expanden y las propiedades de diferenciación de la célula de isleta se inducen in situ para volverse células que producen insulina. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proporciona un método in vitro para expansión de la célula germinal, que 20 comprende las etapas de: a) preparar células intermedias dediferenciadas derivadas de células germinales; b) expandir in vitro las células intermedias dediferenciadas; y c) inducir las propiedades de diferenciación de la célula 25 germinal in vitro de las células expandidas de la etapa b) para volverse células germinales. Preferentemente, las células germinales se seleccionan del grupo que consiste de células de músculo, piel, hueso, cartílago, pulmón, hígado, médula ósea y hematopoiéticas. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento de diabetes mellitus en un paciente, que comprende las etapas de a) preparar células dediferenciadas derivadas de isletas postnatales de células Langerhans del paciente; y} b) introducir las células dediferenciadas in situ en el paciente, en donde las células se expanden in situ y las propiedades de diferenciación de la célula de isleta se inducen in situ para volverse células que producen insulina. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento de diabetes mellitus en un paciente, que comprende las etapas de a) preparar células dediferenciadas derivadas de isietas postnatales de células Langerhans del paciente; b) expandir in vitro las células dediferenciadas; c) inducir las propiedades de diferenciación de la célula de isleta in vitro de las células expandidas de la etapa b) para volverse células que producen insulina; y d) introducir las células de la etapa c) in situ en el paciente, en donde las células producen insulina in situ. Para el propósito de la presente invención los siguientes -^tá^t?tUt^^á términos se definen abajo. La expresión "isletas post-natales de Langerhans" se propone significar células de isleta de cualquier origen, tal como humano, porcino y canino, entre otros.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra conversión de tipo celular de isleta a una estructura similar a un conducto (tejidos humanos). , (a) Isleta en el páncreas, (b) Isleta después del aislamiento y purificación, (c) isleta en matriz sólida comenzado para experimentar cambio cístico, (d-f) formación progresiva de estructura cística con pérdida completa de morfología de isleta. La Figura 2 ilustra la misma progresión de cambios como en la Figura 1 . Las células se manchan por inmunoquímica para insulina, (a) Isleta en páncreas, (b) Isleta después del aislamiento y purificación, (c-e) Pérdida progresiva de fenotipo de isleta. (f) Vista de energía elevada de pared cist compuesta de células epiteliales como conducto. Una célula aún contiene insulina (flecha). La Figura 3 ilustra la misma progresión de cambios como en la Figura 1 . Las células manchadas por inmunoquímica para glucagon. (a) Isleta en páncreas, (b) Isleta después del aislamiento y purificación, (c-e) Pérdida progresiva del fenotipo de isleta. (f) Vista de energía elevada de pared cist compuesta de células epiteliales como conducto. Una célula aún contiene glucagon (flecha). Las Figuras 4 A-C ilustran la demostración del fenotipo de célula por inmunoquímica CK-1 9. En el panel izquierdo superior-estructura cística en matriz sólida. Todas las células se manchan por CK-19, un marcador expresado en células epiteliales de conducto en el páncreas. Panel inferior- después del retiro de la matriz sólida y de regreso al cultivo de suspensión. Una estructura que muestra tanto componentes sólidos como epiteliales. Panel derecho superior- solamente el componente como epitelial retiene inmunoreactividad CK-19. El componente sólido ha perdido su expresión de CK-19, y aparece como isleta. Las Figuras 5 A-1 ilustran panel superior- apariencia ultraestructural de células que componen las estructuras císticas en matriz sólida. Observe el microvello y pérdida de granulos endosecretorios. Las células tienen la apariencia de células como conducto primitivo. Panel inferior- apariencia ultraestructural de estructuras císticas removidas de la matriz sólida y colocadas en cultivo de suspensión. Observe la reducción en microvello y la reaparición de granulos endosecretorios. Las Figuras 6 A-B ilustran hibridización in situ para mARN proinsulina. Panel superior- estructuras císticas con virtualmente ninguna célula que contiene el mensaje. Panel inferior- estructuras císticas se han removido de la matriz y colocado en cultivo de suspensión. Observe la apariencia ahora, de ambas estructuras, sólida y cística. Las estructuras sólidas tienen una expresión abundante de mARN pro-insulina. La Figura 7 ilustra liberación de insulina en el medio dé cultivo por las estructuras observadas en el panel inferior de la Figura 6. Observe que no hay insulina demostrable segregada del tejido cuando se encuentra en el estado cístico (hasta la columna izquierda). FN- fibronectina; IGF-1 -insulina-como factor de crecimiento; Gluc-glucosa. La Figura 8 ilustra Isletas incrustadas en matriz de colágeno y mantenidas en DMEM/F12-CT. Las fotos debajo del microscopio invertido (A, C, E) y secciones histológicas correspondientes manchadas por pancitokeratin AE 1 /AE3 por inmunoquímica (B, D, F). (A, C, E, x100; B, D, F, x200). La Figura 9 ilustra Isletas que en una etapa intermedia de transformación cística aún contienen células que (A) expresan mARN proinsulina y que (B) sintetizan y almacena proteína de insulina. (x400). La Figura 10 A ilustra nivel Intracelular de cAMP durante el curso de tiempo de transformación cística de isleta. Observe el nivel relativamente constante de cAMP intracelular en isletas mantenidas en CMRL 1066 sola. La Figura 10 B ilustra la cantidad integrada de cAMP (área bajo la curva en A) medida en 120 horas. No hay diferencias observadas entre isletas cultivadas en DMEM/F12-CT, CMRL-CT y CMRL-forskolin. Sin embargo, observe, que las isletas mantenidas en CMRL sola tiene significativamente menos cAMP intracelular. La Figura 1 0 C ilustra el porcentaje de isletas que experimentan transformación cística incrementada sobre el curso del tiempo del periodo de cultivo en grupos DMEM/F12-CT, CMRL-CT y CMRL-forskolin. Las isletas mantenidas en CMRL 1 066 tienen un nivel muy bajo de transformación cística que permanece constante. * p<0.05, ** p<0.01 , ***p<0.001 . La Figura 1 1 ilustra la pérdida progresiva de contenido de m ¡i i Í - - *-?-**~* . '-- -.~.-*«Az insuiina de tejido durante el curso del tiempo de transformación cística. Observe la reducción de infusión en isletas mantenidas en DMEM/F12-CT, CMRL-CT y CMRL-forskolin, que corresponde al inicio temprano de apoptosis por 16 horas. * p<0.03 La Figura 12 ilustra actividad apoptótica (A) e índice de marcación BrdU (B) de isletas cultivada en DMEM/F1 2-CT y CMRL 1066 sobre el curso del tiempo de transformación cística. Observe el cambio a la izquierda en el inicio de apoptosis en isletas en DMEM/F1 2-CT. *p<0.02; **p<0.01 ; ***p<0.Q01 La Figura 1 3 ilustra el efecto de péptidos que unen integrina GRGDSP y GRGESP (A), fibronectina y laminina de proteínas de matriz extracelulares (B) y una combinación de GRGDSP o GRGESP y laminina (C) en transformación cística de isleta. *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 . La Figura 14 ilustra el efecto de matriz extracelular en transformación cística de isleta en isletas caninas aisladas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La transformación de la célula in vivo que conducen a neogénesis de la célula ß y la nueva formación de isleta puede entenderse en el contexto de conceptos establecidos de biología en desarrollo. La transdiferenciación es un cambio de un fenotipo diferenciado a otro, incluyendo marcadores fenotípicos funcionales y morfológicos (Okada TS. , Develop. Growth and Differ. 1986;28:213-321 ).

El ejemplo principal estudiado de este proceso es el cambio de células de pigmento iridial anfibias a fibras de la cristalina del ojo, que procede a través de una secuencia de dediferenciación celular, proliferación y finalmente rediferenciación (Okada TS, Cell Dic. 1983; 13: 1 77-1 83; Okada TS, Kondoh H, Curr. Top. Dev. Biol., 1986;20: 1 -433; Yamada T, Monogr. Dev. Biol., 1977; 1 3: 1 -124). La transdiferenciación directa sin división celular también se ha reportado, aunque es mucho menos común (Beresford WA, Cell Differ. Dev., 1990:29:81 -93). Aunque la transdiferenciación se ha enseñado que es esencialmente irreversible, es decir, la célula transdiferenciadas no se invierte de nuevo al tipo celular del cual se origina, recientemente se ha reportado que esto no es el caso (Danto SI eí al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1 995; 1 2:497-502). Sin embargo, la demostración de transdiferenciación depende de definir en detalle el fenotipo de las células originales, y en probar que el nuevo tipo celular de hecho desciende de células que se definen (Okada TS, Develop. Growth and Differ. 1 986;28:21 3-321 ). En muchos casos, la transdiferenciación incluye una secuencia de etapas. Antes en el proceso, las células intermedias parece que no expresan ni el fenotipo del original ni los tipos celulares diferenciados subsecuentes, y por lo tanto se han denominado dediferenciados. El proceso completo se acompaña por replicación de ADN y proliferación celular. Se asume a priori que las células dediferenciadas son capaces de formar ya sea el original o un nuevo tipo celular, y de esta manera son multipotenciales (Itoh Y. Eguchi G, Cell Differ. , 1986; 18: 173-182; Itoh Y, Eguchi G, Develop. Biology, 1 986; 1 1 5:353-362; Okada TS, Develop. Growth and Differ, 1986;28:213-321 . La estabilidad del fenotipo celular en organismos adultos se relaciona probablemente al medio extracelular, así como también componentes citoplásmicos y nucleares que interactúan para controlar expresión genética. La conversión del fenotipo celular probablemente se lleva a cabo por el aumento selectivo de expresión genética, que controla el compromiso en desarrollo terminal de células. El páncreas se compone de varios tipos de células endocrinas y exocrinas, cada uno respondiendo a una variedad de influencias tróficas. La habilidad de estas células para experimentar un cambio en fenotipo se ha investigado extensivamente debido a las implicaciones para el entendimiento de enfermedades pancreáticas tales como cáncer y diabetes metlitus. La transdiferenciación de células pancreáticas se observa primero casi una década después. Las células como hepatocito, que normalmente no se encuentran presentes en el páncreas, se observan siguiendo la administración de carcinógeno (Rao MS eí al., Am. J. Pathol., 1983; 1 10:89-94; Scarpelli DG, Rao MS, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1981 ;78:2577-2581 ) a hámsteres y la alimentación de dietas vaciadas de cobre a ratas (Rao MS, eí al., Cell Differ., 1986; 18: 109-1 17). Recientemente, la transdiferenciación de células acinares aisladas en células como conducto se han observado por varios grupos (Arias AE, Bendayan M, Lab Invest., 1993;69:518-530; Hall PA, Lemoine NR, J. Pathol., 1992; 166:97-103; Tsap MS, Duguid WP, Exp. Cell Res., 1987; 168:365-375). En vista de estas observaciones es probablemente pertinente que durante el desarrollo embriónico, el anlagen pancreático y hepático se derivan de un endodermal común. Los factores que controlan el crecimiento y la maduración U¿-^*i <^- ?±—*-.- ....... — «^¡ | | pümni- y funcional del páncreas endocrino humano durante los periodos fetal y post-natal aún se entienden deficientemente, aunque la presencia de factores específicos en el páncreas se ha hipotetizado (Pictet RL eí al., En: Extracellular Matriz Influences on Gene Expression. Slavkin HC, 5 Greulich RC (eds). Academic Press, Nueva York, 1 975, pp.1 0). Alguna información se encuentra disponible en factores de crecimiento exocrino. El Factor Mesenquimal (MF), se ha extraído de fracciones particuladas de homogenatos de rata midgestacional o embriones de pollo. MF afecta el desarrollo celular al interactuar en la superficie celular de células precursoras (Rutter WJ. The development of the endocrine and exocrine páncreas. En: The Páncreas. Fitzgerald PJ. Morson AB (eds), Williams and Wiikins, Londres, 1980, pp.30) e influencia así la clase de células que aparecen durante el desarrollo pancreático (Githens S. Differentiation and development of the exocrine páncreas in animáis. En: Go VLW, eí al., (eds). The Exocrine Páncreas: Biology, Pathobiology and Diseases. Raven Press, Nueva York, 1986; pp.21 ). MF se comprende de al menos 2 componentes fundamentales, un componente estable de calor cuya acción puede duplicarse por análogos AMP cíclicos, y otro componente de proteína de peso molecular elevado (Rutter WJ. En: The Páncreas. Fitzgerald PJ. Morson AB (eds). Williams and Wiikins, Londres, 1 980, pp. 30). En la presencia de MF, las células se dividen activamente y diferencian largamente en células no endocrinas. Otros factores también se han implicado en maduración endocrina. Los factores de crecimiento de péptido soluble (GF) son un grupo de substancias tróficas que regulan tanto la proliferación celular como diferenciación. Estos factores de crecimiento son multi-funcionales y pueden accionar un amplio rango de respuestas celulares (Sporn & Roberts, Nature, 332:21 7-1 9, 1 987). Sus acciones pueden dividirse en 2 categorías generales, efectos en proliferación celular, que comprende la iniciación de crecimiento celular, división celular y diferenciación celular; y efectos en la función celular. Difieren de las hormonas de polipéptido en que actúan en una manera autocrina y/o paracrina (Goustin AS, Leof EB; et al. Cáncer Res., 46: 101 5-1029; 1 986; Underwood LE, eí al., Clinics in Endocrinol. & Metabol., 1 5:59-77, 1986). Especificas de su papel en los procesos individuales que comprenden crecimiento que necesita resolverse. Una familia de factores de crecimiento son las somatomedinas. El factor de crecimiento I como insulina (IGF-I), se sintetiza y libera en cultivo de tejido por las células ß de isletas de rata neonatal y fetal (Hill DJ, eí al., Diabetes, 36:465-471 , 1987; Rabinovitch A, eí al., Diabetes, 31 : 160-164, 1 982; Romanus JA eí al., Diabetes 34:696-792, 1985). IGF-II se ha identificado en páncreas fetal humano (Bryson JM et al., J. Endocrino!., 1 21 :367-373, 1 989). Ambos factores aumentan la replicación de la célula ß neonatal in vitro cuando se agregan al medio de cultivo (Hill DJ, eí al., Diabetes, 36:465-471 , 1987; Rabinovitch A, eí al., Diabetes, 31 : 160-164, 1982). Por lo tanto IGF's pueden ser mediadores importantes de la replicación de la célula ß en isletas de rata fetal y neonatal pero no en el desarrollo post-natal (Billestrup N, Martin JM, Endocrinol., 1 16: 1 1 75-81 , 1 985; Rabinovitch A, eí al., Diabetes, 32:307-12, 1 983; Swenne I, Hill DJ, Diabetología 32: 1 91 -197, 1 989; Swenne I, Endocrinology, 122:214-218, 1988; Whittaker PG, eí al., Diabetología, 18:323-328, 1980). Además, el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) también estimula la replicación de la célula de isleta fetal y su efecto no requiere producción incrementada de IGF-I (Swenne I, Endocrinology, 122:214-21 8, 1988). Además, el efecto de hormona de crecimiento en la replicación de células B fetales de rata parece ser grandemente independiente de IGF-I (Romanus JA eí al., Diabetes 34:696-792, 1985; Swenne I, Hill DJ, Diabetología 32: 191 -197, 1 989). En el páncreas de adulto, mARN de IGF-I se ubica en la célula D. Pero IGF-1 también se encuentra en membranas celulares de células ß y A, y en células de conducto disperso, pero no en células endoteliales vasculares o acinares (Hansson H-A eí al., Acta Physiol. Scand. 1 32:569-576, 1988; Hansson H-A eí al., Cell Tissue Res., 255:467-474, 1989). Esto es contradictorio para un reporte (Smith F eí al., Diabetes, 39 (compl. 1 ):66A, 1990), en donde la expresión de IGF-1 se identifica en células endoteliales vasculares y de conducto, y aparece para regenerar células endocrinas después de pancreatectomia parcial. No se ha mostrado que IGF's estimulará el crecimiento de células de conducto adultas o isletas. Ni IGF's estimulan el crecimiento del páncreas exocrino (Móssner J eí al., Gut 28:51 -55, 1987). Por lo tanto, es aparente que el papel de IGF-1 , especialmente en el páncreas de adulto, esta lejano de esto. El factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) se ha encontrado que inicia la transdiferenciación del epitelio de pigmento retinal en tejidos retínales neurales en embrión de pollo in vivo e in vitro (Hyuga M eí al., Int. J. Dev. Biol. 1993;37:31 9-326; Park CM eí al. , Dev. Biol. 1991 ; 148:322-333; Pittack C eí al., Development 1991 ; 1 1 3:577-588). Se ha demostrado que el factor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß) induce la transdiferenciación de células epiteliales mamíferas de ratón en células de fibroblasto [20]. De manera similar, el factor de crecimiento epitelial (BGF) y toxina de cólera se utilizaron para aumentar la formación de cist epitelial de conducto de entre fragmentos de célula acinar pancreática (Yuan S eí al., In vitro Cell Dev. Biol., 1995;31 :77-80). La búsqueda de los factores que median la diferenciación celular y supervivencia debe incluir tanto la célula como su microambiente (Bisell MJ eí al., J. Theor. Biol., 1982; 99:31 ), ya que una conducta de la célula se controla por otras células así como por la matriz extracelular (ECM) (Stoker AW eí al., Curr. Opin. Cel.. Biol., 1 990;2:864). ECM es un complejo dinámico de moléculas que sirven como un andamio para células parenquimales y no parenquimales. Su importancia en el desarrollo pancreático se resalta por el papel de mesenquima fetal en citodiferenciación de la célula epitelial (Bencosme SA, Am J. Pathol. 1 955; 31 : 1 149; Gepts W, de Mey J. Diabetes 1978; 27 (comp. 1 ):251 ; Gepts W, Lacompte PM. Am. J. Med., 1 981 ; 70: 105; Gepts W. Diabetes 1 965; 14: 619; Githens S. En: Go VLW, eí al. (eds) The Exocrine Páncreas: Biology, Pathobiology and Disease (Nueva York: Raven Press, 1 986) p. 21 ). ECM se encuentra en dos formas, matriz intersticial y membrana base (BM). BM es un complejo macromolecular de diferentes glucoproteínas, colágenos y proteoglicanos. En el páncreas, BM contiene laminina, fibronectina, colágeno tipos IV y V, así como también proteglicanos de sulfato heparan (Ingber D. En: Go VLW, eí al., (eds) The Páncreas: Biology, Pathobiology liH iEilim1ni i iri.il ^É&j H Ajajt,i- ÉJ-ÉÍ .IMlllll-liill i 'I—I and Disease (Nueva York: Reven Press, 1 993) p. 369). El papel específico de estas moléculas en el páncreas aún no se ha determinado. ECM tiene efectos profundos en diferenciación . El epitelio maduro que normalmente nunca expresa genes mesenquinales, puede inducirse para hacerlo por la suspensión en geles de colágeno in vitro (Hay ED. Curr. Opin. In Cell. Biol. 1993; 5: 1 029). Por ejemplo, las células epiteliales mamíferas aplanan y sueltan su fenotipo diferenciado cuando se unen a platos plásticos o geles de colágeno adherentes (Emermman JT, Pitelka DR. In vitro 1977; 1 3:316). Las mismas células voltean, polarizan, secretan proteínas lácteas, y acumulan una BM continua cuando el gel se deja contraer (Emerman JT, Pitelka DR. In vitro, 1977: 1 3:316). De esta manera, diferentes grados de retención o re-formación de BM son cruciales para la supervivencia celular y el mantenimiento del fenotipo epitelial normal (Hay ED. Curr. Opon. In Cell. Biol. 1993; 5: 1029). Durante los momentos de proliferación de tejido, y en la presencia de los factores de crecimiento apropiados, las células se liberan transitoriamente de limitaciones de supervivencia determinadas por ECM. Ahora se ha vuelto claro que existen dos componentes de la respuesta celular a interacciones de ECM, una física, incluyendo los cambios en forma y organización citoesquelética, la otra bioquímica, incluyendo agrupación de integrina y fosforilación de tirosina de proteína incrementada (Ingber DE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990;87:3579; Roskelley CD eí al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994;91 : 12378). Además de su papel regulador conocido en crecimiento celular y diferenciación, ECM se ha reconocido más recientemente como un regulador de la supervivencia celular (Bates RC, Lincz LF, Burns GF, Cáncer and Metástasis Rev., 1995; 14: 1 91 ). La interrupción de la relación de célula-matriz conduce a apoptosis (Frisch SM, Francis H, J. Cell. Biol., 1994; 124:619; Schwartz SM, Bennett MR, Am. J. Path., 1995: 147-229), una serie morfológica de eventos (Kerr JFK eí al., Br. J. Cáncer, 1 972:26:239), indicando un proceso de autodestrucción celular. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la tecnología de plataforma se basa en una combinación de las observaciones anteriores, que incorporan en un medio de alimentación básico los siguientes componentes que son necesarios y suficientes para la preparación de células intermedias dediferenciadas de isletas pancreáticas adultas de Langerhans: 1 . una matriz sólida que permite cultivo "tridimensional"; 2. la presencia de proteínas de matriz incluyendo pero no limitándose a colágeno tipo I y laminina; y 3. el factor de crecimiento EGF y promotores de cAMP, incluyendo pero no limitándose a toxina de cólera y forskolin. El medio de alimentación preferido es DMEM/F12 con 1 0% de suero de bovino fetal. Además, el tejido inicial debe aislarse recientemente y cultivarse sin purificación absoluta. El uso de un gel sólido que contiene proteína de matriz es una parte importante del sistema de cultivo, debido a que la matriz extracelular puede promover el proceso de transdiferenciación. Este punto se resalta por células acinares pancreáticas aisladas que se transdiferencian en estructuras como conductos cuando se atrapan en la membrana base ,.4-l^tA A. f.-^--»--f ^ - .f?. * .J.-,...&t._-, - Matrigel (Arias AE, Benday M, Lab Invest., 1993;69:518-530), o por células epiteliales pigmentadas retínales, que se transdiferencian en neuronas cuando se colocan en substratos que contienen laminina (Reh TA eí ai., Nature 1987;330:68-71 ). Más recientemente, Gittes eí al., demostraron, utilizando páncreas de ratón embriónico de 1 1 días, que la trayectoria de falla para crecimiento de epitelio pancreático embriónico es formar isletas (Gittes GK eí al., Development 1996; 122:439-447). En la presencia de constituyentes de membrana base, sin embargo, el epitelio de fundamento pancreático parece programarse para formar conductos. Este descubrimiento de nuevo enfatiza la interrelación entre los conductos e isletas y resalta el papel importante de la matriz extracelular. Esto completa la etapa 1 (la producción de células intermedias dediferenciadas) del proceso. Durante las 96 h iniciales de cultivo, las isletas experimentan una transformación cística con (Arias AE, Bendayan M. Lab Invest., 1993;69:518-530) una pérdida progresiva de expresión de gen de insulina, (2) una pérdida de inmunoreactividad para proteína de insulina, y (3) la apariencia de CKA 19, un marcador para células de conducto. Después de que la transformación se completa, las células tienen la apariencia ultraestructural de células como conducto primitivo. El alargamiento cist después de las 96 h iniciales se asocial, al menos en parte, con un tremendo incremento en la replicación celular. Estos descubrimientos son consistentes con la transdiferenciación de una célula de isleta en una célula de conducto (Yuan eí al., Differentiation, 1996; 61 :67-75, que muestra que las isletas aisladas incrustadas en un gel de colágeno tipo I en la presencia de un medio definido experimentan • ' • ff" transformación cística dentro de 96 horas). Etapa 2 - la generación de células ß funcionales, requiere un cambio completo de las condiciones de cultivo. Las células se mueven de la matriz digerida y resuspenden en un medio líquido básico tal como CMRL 1 066 complementado con 1 0% de suero de bovino fetal, con la adición de proteínas de matriz solubles y factores de crecimiento que incluyen, pero no se limitan a, fibronectina (10-20 ng/ml), IGF-1 (1 00 ng/ml), IGF-2 (100 ng), insulina (1 0-1 00 µg/ ml), NGF (1 0-1 00 ng/ml). Además, la concentración de glucosa debe incrementarse a arriba de 1 1 mM. Los aditivos de cultivo adicionales pueden incluir inhibidores específicos de trayectorias de señalización intracelular conocidas de apoptosis, incluyendo, pero no limitándose a un inhibidor específico de p38. La evidencia para el retorno a un fenotipo de la célula de isleta incluye: (1 ) la re-aparición de estructuras esféricas sólidas; (2= pérdida de expresión CK-19; (3) la demostración de granulos endosecretorios en microscopía de electrón; (4) la re-aparición de mARN pro-insulina en hibridización in situ; (5) el regreso de una liberación básica de insulina en el medio de cultivo. La presente invención se entenderá más fácilmente al referirse a los siguientes ejemplos que se dan para ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance.

EJEMPLO I Preparación de un medio de alimentación básico El propósito de este estudio es producir el mecanismo incluido en el proceso de transdiferenciación. Las isletas caninas se aislaron utilizando Canine Liberase™ y purificaron en un gradiente Euroficoll en un Separador de Célula Cobe 2991 . Las isletas recientemente aisladas se incrustan en gel de colágeno tipo I hasta 120 horas y cultivan en (i) DMEM/F12 más toxina de cólera (CT); (ii) CMRL 1066 complementado con CT; (iii) CMRL 1066 complementado con forskolin, y (iv) CMRL 1 066 solo. En 1 6 horas, los niveles intracelulares de cAMP (isletas fmol/103), determinados por ELISA, se incrementan en Grupos (i)-(iii) (642+17, 338+48, 1 128+221 ) en comparación con el Grupo iv (106±19, p<0.01 ). cAMP intracelular total en 120 horas (área integrada bajo la curva) coincide con el % de isletas que experimentan la transdíferenciación (63+2, 48+2, 35±3, 8±1 ), como se determina por histología de rutina, inmunocitoquímica para citokeratin AE 1 /AE3, y por una pérdida de expresión de gen pro-insulina en hibridización in situ. Para evaluar el papel de proteínas de matriz y ambiente 3-D, las isletas se incrustan en colágeno tipo I, Matrigel™ y gel de agarosa y cultivaron en DMEM/F12 más CT. Las isletas en colágeno tipo I y Matrigel™ demostraron una velocidad elevada de transformación cística (63±2% y 71 ±4%, respectivamente), en comparación con aquella en agarosa (0±0%, p<0.001 ). Además, la transdiferenciación de célula de isleta se bloquea parcialmente por incubación anterior de isletas recientemente aisladas con un péptido sintético que presente motivo RGD. En conclusión, estos estudios confirman el potencial de isletas ??f il lrí»M-M?¡ ? . ii iiMl i -fatott-J" — *'-* recientemente aisladas para experimentar la transdiferenciación de la célula epitelial. Los niveles elevados de cAMP intracelular y proteínas de matriz presentados en una construcción 3-dimensional son necesarios para que esta transformación se induzca. La naturaleza precisa de las células epiteliales resultantes, y la reversibilidad del proceso parece que se determina. EJEMPLO II Factores que median la transformación de isletas de Langerhans en estructuras como conducto epitelial MATERIALES Y MÉTODOS Purificación y Aislamiento de Isleta Pancreata de seis perros cruzados de ambos sexos (peso corporal 25-30 kg) se resecaron bajo anestesia general de acuerdo con el Consejo Canadiense para directrices del Cuidado Animal (Wang RN , Rosenberg L (1999) J Endocrology 163 181 -190). Antes del retiro, los conductos pancreáticos se canularon para permitir la infusión intraductal con Liberase Cl® (1 .25 mg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, USA) de acuerdo a procedimientos establecidos (Horaguchi A, Merrell RC (1 981 ) Diabetes 30 455-461 ; Ricordi C (1992) Pancreatic islet cell transplantation pp.99-1 12. Ed. Ricordi C. Austin: R. G. Landes Co.). La purificación se logró por separación del gradiente de densidad en un gradiente EuroFicoll de tres etapas utilizando un Procesador de Célula COBE 2991 (COBE BCT, Denver, CO. , USA) (Londres NJM eí al., (1992) Pancreatic islet cell transplantation pp1 1 3-123. Ed. Ricordi C. Austin: R.G. Landes Co.). La preparación final consiste de 95% de estructuras positivas de ditizona con diámetros que varían de 50 a 500 µm. Diseño Experimental Para evaluar eJ papel de cAMP intracelular, las isletas recientemente aisladas se incrustan en gel de colágeno tipo 1 (Wang RN, Rosenberg L (1999) J Endocrology 163 181 -190) y cultivan en: (i) DMÉM/F12 (GIBCO, Burlington, ON, CANADÁ) complementado con 10% de FBS, EGF (100 ng/ml) (Sigma, St. Lo?s, St. Louis, MO, USA) y toxina de cólera (100 ng/ml) (Sigma, St. Louis, MO, USA); (ii) CMRL1066 (GIBCO) complementado con 10% de FBS y toxina de cólera (100 ng/ml) y 16.5 mM de D-glucosa; (iii) CMRL1066 complementado con 10% de FBS y 2 µM de forskolin (Sigma, St. Louis, MO, USA), y (iv) CMRL1066 complementado con 10% de FBS. Aproximadamente 3000 isletas por grupo por punto en el tiempo se utilizaron. Las isletas se cultivan en 95% de aire / 5% de CO2 a 37°C, y el medio se cambia en días alternos. Las isletas representativas de cada grupo se examinan después del aislamiento (0 hora), y después en las horas 1 , 16, 36, 72 y 120 utilizando las siguientes investigaciones. Las siguientes series de experimentos se conducen para evaluar el papel de las interacciones de célula-matriz en el proceso de transformación cistíca. Primero, para determinar si el proceso requirió un ambiente de gel sólido, las isletas se cultivan en suspensión en DMEM/F12 con 10% de FBS más CT y EGF. Para determinar si un ambiente de gel sólido y proteínas de matriz extracelulares son requerimientos independientes, las isletas se incrustan en 1 .5% de gel de agarosa y se mantienen en DMEM/F12 con 10% de FBS más CT y EGF. Alternativamente, las isletas se cultivan en suspensión en DMEM/F12 con . -^. i - . ¿?.? a zt.,,A % de FBS más CT y EGF en la presencia de Laminina soluble (50 µg/ml) o Fibronectina (50 µg/ml) (Península Laboratories). Para determinar si el proceso fue, al menos en parte, mediado por integrina, las isletas se pre- incuban a 37°C por 60 min ya sea en la presencia del péptido GRGDSP que contiene motivo RGD o GRGESP de péptido de control (400 µg/ml) (Península Laboratories). Finalmente, para determinar s la transformación cística fue dependiente en el colágeno tipo I solo, las isletas también se incrustan en Matrigel® (Península Laboratories, Belmont, CA, USA). Análisis Morfológico Inmunocitoquímica El tejido se fina en 4% de paraformaldehído (PFA) e incrusta en 2% de agarosa siguiendo un procedimiento estándar de deshidratación y e incrustación de parafina Wang RN, Rosenberg L (1999) J. Endocrinology 163 181 -190). Un conjunto de seis secciones en serie (grosor 4 µm) se corta de cada bloque de parafina. Las secciones consecutivas se procesan para histología de rutina e inmunomanchan para hormonas pancreáticas (insulina, glucagon y somatostatin, Biogenex, San Ramón, CA. , USA) y el cocktail de pan- citokeratina AE1 /AE3 (Dako, Carpintería, CA. , USA), utilizando el método complejo AB (esptavidin-biotin, peroxidasa de rábano picante; Dako), como se describe previamente (Wang RN eí al., (1994) diabetología 37 1088- 1096). Para AE1 /AE3 de citokeratina, las secciones se pretrataron con 0.1 % de tripsina. Las secciones se incubaron durante la noche a 4°C con los anticuerpos primarios apropiados. Los controles negativos incluyeron la omisión de los anticuerpos primarios.

La hibridización in situ para mARN de pro-insulina humana (Novocastra, Burlington, ON, Canadá) se realizó en secciones consecutivas de isletas recientemente aisladas y estructuras císticas epiteliales en 120 horas. Las secciones se hibridizaron con una solución de cocktail de oligonucleótido marcado de fluoresceína por 2 horas a 37°C. Los portaobjetos se incubaron entonces con anti-FITC Fab de conejo conjugado con anticuerpo de fosfatasa alcalina (diluida 1 :200) por 30 minutos a temperatura ambiente. El producto de reacción se visualiza por una reacción de color catalizada por enzima utilizando un equipo de tetrazolio azul nitro y 5'-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (Wang RN, Rosenberg L (1999) J Endocrology 163 1 81 -190, Wang RN eí al., (1994) Diabetología 37 1 088-1 096). Análisis de Nivel cAMP Intracelular Las células se recolectaron del gel de colágeno y enjuagaron en 1 mM de PBS frío. Después de la adición de 200 µl de regulador lisis, cada muestra se sónica por 30 s, después se incuba por 5 min a temperatura ambiente. 1 00 µl de lisato de célula se transfiere a la placa revestida de Ig anti-conejo de mono. El contenido de cAMP intracelular de muestras no aciladas se mide utilizando equipo de inmunoanáliáis enlazado a enzima cAMP comercialmente disponible (rango de análisis 12.5 - 3200 fmol/cavidad, Ameraham, Little Chalfont, R. U.). Los datos se expresan como fmol por 103 isletas. Análisis de Contenido de Insulina El contenido de insulina celular se mide utilizando un radioinmunoanálisís de fase sólida (Immunocorp, Montreal, Québec, tf- - '------«-t-----.»---*.--------»--^^- ^ .*¡_fc,i.tA-- J.,¿=¡É¡¿MÍ» Canadá) (Wang RN, Rosenberg L (1 999) J Endocrology 163 181 -190) con una sensibilidad de 26.7 pmol/1 (0.1 5 ng/ml), una variabilidad de inter-análisis de <5%, y una exactitud de 100%. El equipo utiliza anticuerpos anti-humanos que reaccionan transversalmente coh insulina canina. Los valores obtenidos se corrigen para variaciones en el número de células al medir el contenido de ADN utilizando un análisis de ADN fluorométrico (Yuan S eí al., (1996) Differentiation 61 , 67-75). Los datos se expresan como µg por µg de ADN. Proliferación y Muerte Celular Las células cultivadas en DMEM/F12-CT y CMRL1 066 se recolectaron del gel utilizando colagenaza XI (0.25 mg/ml) (Sigma, Montreal, Que.) y procesaron para una muerte celular programada específica ELISA, que detecta fragmentos de ADN asociados con histona en el citoplasma celular - una marca del proceso apoptótico (Roche Molecular, Montreal, Que). (Paraskevas S eí al., (2000) Ann. Surgery en prensa). Las células se incubaron en regulador de lisis por 30 min, y el sobrenadante que contiene oligonucleosomas citoplásmicas se miden en una absorbancia de 405 nm. Las variaciones en el tamaño de muestra se corrigen al medir el contenido de ADN de la muestra total (Yuan S eí al., (1996) Differentiation 61 , 67-75). Para evaluar la proliferación celular, las células cultivadas en DMEM/F12-VCT y CMRL1066 se pre-incubaron con 10 µM 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU, Sigma) por 1 h a 37°C. Las células cultivadas se fijaron en 4% de PFA según se describe anteriormente. La inmunocoloración se pretrató con el método de complejo AB. Las ?iones se pretrataron con 0.1 % de tripsina y 2 N HCl de ADN desnaturalizado. Un anticuerpo monoclonal anti-BrdU se utilizó a 1 :500 de dilución (Sigma). Para calcular un índice de marcación BrdU, el número de células positivas para la reacción BrdU se determinó y se expresó como un porcentaje del número total de células contadas. Por cada grupo experimental y punto de tiempo, al menos 500 células se contaron por sección. Análisis Estadístico Los datos obtenidos de seis aislamientos de isleta diferentes se expresan como promedio + SEM. La diferencia entre los grupos se evaluó por análisis de un factor de varianza. RESULTADOS Cambios Morfológicos Bajo el microscopio invertido, las isletas frescamente aisladas aparecieron como esferoides sólidos. En este momento, no se demostraron las células positivas de citoqueratina (Figs. 8A-B). Para las isletas incorporadas en el colágeno tipo 1 y cultivadas en DMEM/F12 más CT, CMRL 1066 plus CT o CMRL 1066 plus forskolin, la diferenciación epitelial de conducto se observó primero coincidente con una pérdida de células en la periferia de isleta, a aproximadamente 16 horas. En este momento, las células que refuerzan los espacios císticos fueron positivas de citoqueratina (Figs. 8C-D). Las estructuras epiteliales completamente desarrolladas se presentaron en cultivo por 72 horas (Figs. 8E-F). Las isletas cultivadas en CMRL 1066 mantuvieron por sí solas una apariencia esferoide sólido para la duración del estudio y no superaron la transformación epitelial. La coloración inmunocitoquímica no demostró la co-localización de citoqueratina y las hormonas de célula de isleta. Es decir, al mantenerse con la observación en el páncreas intacto, aquella coloración de citoqueratina solamente se observó sobre las células epiteliales de conducto. La expresión de gen de pro-insulina y la proteína de insulina se perdieron progresivamente durante el período de diferenciación epitelial de conducto (Fig. 9). CAMP intracelular Después de 1 hora, los niveles intracelulares de cAMP de las isletas mantenidos en DMEM/F12-CT, CMRL1066-CT y CMRL1066-forskolin se elevaron significativamente en comparación a las isletas frescamente aisladas o a las isletas mantenidas en CMRL 1066 solas (Fig. 10A). De hecho, el nivel de cAMP de las isletas cultivadas en CMRCL 1066 solas no aumentó del todo durante el cursp del tiempo del estudio. El cAMP intracelular total medido durante 120 hr (área integrada bajo la curva) fue similar para las isletas cultivadas en DMEM/F12-CT, CMRL1066-CT y CMRL1066-forskolin (15+3, 16+2, 17+3 respectivamente), a pesar de que la elevación más sostenida de cAMP fue en las isletas de DMEM/F12-CT, las cuales se expusieron tanto a EGF como CT. En comparación, las isletas cultivadas en CMRL1066 solas tuvieron el nivel más bajo del cAMP intracelular total (4+1 , p<0.001 ) (Fig. 10B), y esto se traduce en el nivel más bajo de la transformación del conducto de isleta (Fig. 10C). Contenido de Insulina Intracelular El contenido celular de insulina (Fig. 1 1 ) fue el más alto en las isletas frescamente aisladas (1 1 +2 µg/µg de ADN). Después de 16 horas en cultivo, el contenido de insulina de células cultivadas en DMEM/F12-CT, CMRL1066-CT y CMRL1066-forskolin dramáticamente declinadas, cayeron a 7% del valor inicial por 120 horas. Las isletas cultivadas en CMRL1066 solas no superaron la transformación epitelial, y se mantuvieron a un nivel más elevado de insulina intracelular en comparación a los otros tres grupos (p<0.03, Fig. 1 1 ). Análisis de Muerte y Proliferación Celular Para determinar sí la pérdida celular durante la transformación cística se debió, al menos en parte, a la muerte celular programada, utilizamos una ELISA de muerte celular específica. A 16 horas, el enriquecimiento de oligonucleosoma citoplásmico fue significativamente mayor en isletas cultivadas con DMEM/F12-CT en comparación a las isletas cultivadas en CMRL1066 solas (p<0í02, Fig. 12A). Después de 36 horas, no hubo diferencia entre los grupos. Al observar los datos como un entero (Fig. 12A), parece que una onda de apoptosis ocurrió en ambos grupos de isletas, pero en aquello el curso del tiempo de la muerte celular se ajustó a la izquierda para las isletas que superan la transformación cística en DMEM/F12-CT. Para valorar la proliferación, las células se marcaron con BrdU. Siguiente al aislamiento, el índice de marcación de célula BrdU de isletas cultivadas en DMEM/F12-CT fue de 0.8% - idéntico a aquel de las isletas cultivadas en CMRL1 066 solas. Sin embargo, después de 36 horas, una onda de proliferación celular se aseguró en el grupo DMEM/F12-CT, con el índice de marcación alcanzando 18% a 120 horas (Fig. 12B). En comparación, el índice de marcación para isletas en ^•^ •• - -*^**- » >«"^^ CMRL1066 permaneció esencialmente invariable a lo largo de todo el período de estudio (p<0.1 ). El papel de las Interacciones de Integrin-ECM Para determinar si la elevación de cAMP intracelular fue suficiente para inducir la diferenciación epitelial de conducto, las isletas se mantuvieron en cultivo de suspensión en DMEM/F12-C5 y no se incorporaron en gel de colágeno. Bajo estas condiciones, no ocurrió la transformación epitelial. Esto sugiere que fue necesario un aumento en cAMP intracelular pero no un requisito suficiente para la transformación, y que el aglomerante debe jugar un papel importante en el proceso. Para determinar si lo que fue necesario fue el ambiente de gel sólido o la presencia de proteínas de aglomerante extracelular solas, ias isletas se incorporaron en gel de agarosa, gel de colágeno tipo 1 o Matrigel®. Solamente las isletas incorporadas en los dos geles anteriores superaron la transformación cística (Tabla 1 ). Además, las isletas mantenidas en suspensión en DMEM/F12-CT complementadas ya sea con laminína o fibronectina, fallaron en superar la transformación ductal. Estos experimentos indicaron que el proceso de transformación requirió la presencia de proteínas ECM presentadas en un ambiente de gel sólido. l^| ||g^g Tabla 1 El efecto de aglomerante extracelular sobre la transformación cística por isleta en isletas de panino aislado Tiempos Matrigel Colágeno Agarosa Laminina/fibronectína a Soluble 16 h 19 + 4.7 14 + 1.4 - 36 h 49 + 3.7 35 + 3.9 - 72 h 60 + 3.7 42 + 1.6 - 120 h 71 +4.5 63 + 2.4 - Para examinar el papel de señalamiento mediado por integrina en el proceso de transformación en una manera más directa, las isletas se pre-incubaron con el péptido GRGDSP que contiene motivo RGD antes de incubarse en el colágeno. Esto redujo la transformación cística a 57% del grupo DMEM/F12-CT de control (p<0.001 ) a 72 horas (Fig. 14A). El péptido de control, GRGESP, tuvo poca influencia sobre el proceso de transformación. Las isletas de pre-tratamiento ya sea con fibronectina o laminina soluble antes de incorporarse, redujeron la transformación cística a 50% de control (p<0.01 ) a 72 horas (Fig. 14B). La transformación Cística se redujo más a 33% de control, cuando las isletas se preincubaron tanto con GRGDSP como laminina (p<0.001 , Fig. 14C). DISCUSIÓN Las células diferenciadas usualmente mantienen sus especificidades celulares en el adulto, en donde la estabilidad de fenotipo i*iii?in? i iiim r i i celular se relaciona a una interacción de célula con su microambiente. Sin embargo, una perturbación o pérdida de factores estabilizantes, puede inducir a las células a cambiar su compromiso (Okada TS (1986) Develop Growth Diff 28, 213-221 ). Previamente, hemos reportado que las isletas aisladas de Langerhans incorporadas en el gel de colágeno tipo 1 pueden inducirse a superar la transdiferenciación a estructuras epiteliales similares al conducto (Yuan S. eí al. , (1996) Differentiation 61 , 67-75). Actualmente, se sabe muy poco respecto a los casos moleculares incluidos en la transdiferenciación. De aquí en adelante, el propósito del presente estudio fue caracterizar los factores incluidos en este proceso de transformación a fin de entender mejor las relaciones funcionales que confieren estabilidad morfogenética sobre células en la isleta aislada. Dada la escala de éxito a largo período casi pobre de las terapias en base a la célula para diabetes mellitus, en particular el transplante de ísleta (Rosenberg L. (1998) Int'l J Pancreatology 24, 145-168), los estudios tales como aquellos descritos aquí, podrían proporcionar nuevo desprendimiento en los tejidos que rodean el problema de falla de injerto. Existieron dos principales descubrimientos. Primero, demostramos que el proceso de transformación cística requiere tanto una elevación de cAMP intracelular como la presencia de proteínas ECM presentadas como un soporte sólido. Segundo, determinamos que la formación de una estructura cística de una esfera de isleta sólida es un proceso de dos etapas que incluye una onda de apoptosis de células endocrinas, seguida por la proliferación celular de las nuevas células f íijLÍ^¡jb.. .. i^^.^^ .?^ ¡ti fc Ut?Jb? 4kßUt fiti ?r?JÉL!¡a¡LÍLJÍ¡?tlii similares al conducto. La transducción de señal durante la transdiferenciación recientemente ha llegado a ser el sujeto de estudio, por lo tanto, la información detallada se encuentra no disponible. A pesar <Je ello, parece que el flujo de información mediada por cAMP juega un papel importante (Ghee M, Baker H, eí al. (1998) Mole Brain Res 55, 101 -1 14; Osaka H, Sabban EL (1997) Mole Brain Res 49, 222-228; Yarkwood SJ eí al. (1998) Mole Cell Endocrinol 138, 41 -50). En este estudio, encontramos que la elevación de cAMP intracelular fue una condición necesaria, pero no suficiente, para la inducción de la transformación de isleta a cist. Sin embargo, no fue solamente el valor máximo del aumento en cAMP intracelular que fue importante, más bien fue la duración de la elevación que se asoció con la frecuencia más alta de la transformación epitelial de conducto. El aumento en niveles de cAMP, como aquel producido por el medio complementado con EGF solo o forskolin sola, produjo una respuesta de transformación menos que máxima. La duración más larga de la elevación de cAMP se obtuvo en el medio complementado con uria combinación de EGF y CT. Es decir, al mantenerse con Yao eí al. (Yao H, Labudda K, Rim C, eí al. (1995) J. Biol. Chem 270, 20748-20753), fue quien demostró la neóesidad del señalamiento transitorio versus sostenido en la diferenciación inducida de EGF mediada por cAMP en células PC12. Este descubrimiento también sirvió para destacar las similitudes entre las células ß pancreáticas y las células de origen neuronal (Sharfmann R, Czernichow P (1997) Pancreatic growth and regeneration. Pp170-182. Ed Sarvetnick N. Austin: Karger Landes). Por lo tanto, como en otros ^ -1.-. ^*- ^ "t-*J"- - *y-^ . -, -..? .ll»?.. T .f.A..I siste as (Yao H, Labudda K, Rim C, eí al. (1995) J. Biol. Chem 270, 20748-20753), las respuestas celulares de las células isletas a la acción del factor de crecimiento pueden ser dependientes no solamente sobre la activación de los receptores de factor de crecimiento mediante factores de crecimiento específicos, sino sobre señales sincrónicas que elevan las señales intracelulares como cAMP. Un aumento en cAMP intracelular también es de interés, debido a que una elevación en cAMP puede formar parte de la apoptosis que controla el sistema efector en las células ß pancreáticas (Loweth AC, Williams GT, eí al. (1997) FEBS Lett 400, 285-288). Por lo tanto, es notable que la pérdida celular debido a la apoptosis es la primera etapa que observamos en el proceso de transformación de isleta a cist. Es interesante que la apoptosis debería ocurrir durante la transformación de isleta en este sistema, debido a que las isletas se incorporan en un gel de colágeno, y tal matriz se ha reportado que ayuda a promover o mantener el estado diferenciado de diferentes tipos de células en cultivo (Foster CS eí al., (1983) Dev Biol 96, 197-216; Yang J eí al. (1982) Cell Biol Int 6, 969-975; Rubin K eí al., (1981 ) Cell 24, 463-470). Por el otro lado, la matriz extracelular también promueve el proceso de transdiferenciación . Este punto se enfatiza por células acinares pancreáticas aisladas que transdiferencian las estructuras como conductos que se atrapan en Matrige® (Arias AE, Bendayan M (1 993) Lab Invest 69, 518-530), y por células epiteliales de pigmento retinal, que se transdiferencian en neuronas cuando se colocan en substratos que contienen laminina (Reh TA eí al., (1987). Nature 330, 68-71 ). Más recientemente, Gittes eí al., i^-a^,... ,. .------.----.i*---- - ..

(Gittes GK eí al., (1 996) Development 122, 439-447) demostraron, utilizando páncreas de ratón embrióníco de 1 1 días, que la trayectoria de falla para crecimiento de epitelio pancreático embriónico es formar isletas. En la presencia de constituyentes de membrana base, sin embargo, el epitelio fundamental pancreático parece programarse para formar conductos. Este descubrimiento de nuevo enfatiza la interrelación entre conductos e isletas y resalta el papel importante de la matriz extracelular. Sin soportar estas observaciones, la presencia de un soporte ECM sólido parece ser necesario, aunque no condición suficiente, para la transformación de una isleta sólida en una estructura como epitelial cística, la primer etapa de la cual, incluye muerte celular apoptótica. La conversión de un sólido a una estructura hueca es un proceso morfogenético observado frecuentemente durante embriogénesis de vertebrado (Coucouvanis E, Martin GR (1 995) Cell 83, 279-287). En el embrión de ratón prematuro, este proceso de cavitación transforma el ectodermo embriónico sólido en un epitelio en columna que rodea una cavidad. Se ha propuesto que la cavitación es el resultado del interjuego de dos señales, una de una capa exterior de células de endodermo que actúa sobre una corta distancia para crear una cavidad al inducir apoptosis de las células ectodérmicas interiores, y la otra una señal de rescate mediada por contacto con la membrana base que se requiere para la supervivencia de las células en columna (Coucouvanis E. Martín GR (1995) Cell 83, 279-287). La combinación de estas dos señales resulta en la muerte de células interiores no en contacto con ECM y la supervivencia de una capa única de células exteriores en contacto con la membrana i-l-t-i^J-^^^Ai^ . . . ^ - ^ .^ t^„ --^fft.-.ft jy-f, ¡*ifz Í. base. Una característica central de este modelo es la iniciación directa de apoptosis por una señal externa que causa muerte celular. La segunda característica clave del modelo es una señal que parece mediarse por la unión a ECM y rescata células de la muerte celular. Existe después de todo, un amplio precedente para dependencia celular en ECM para supervivencia (Meredith JE eí al., (1993) Mol Biol Cell 4, 953-961 ; Boudreau N, Sympson CJ, eí al., (1 995) Science 267, 891 -893). En nuestro modelo de transformación cística de isleta, la señal de muerte externa se proporciona probablemente por aquellos factores que incrementan cAMP intracelular. Además, la observación que la pérdida de célula durante el proceso de transformación ocurre preferencialmente en el centro de la isleta, da soporte a la noción de que ECM actúa como una señal de rescate para aquellas células en la periferia. El papel preciso de integrinas en este proceso permanece más completamente deliheado. La unión de integrina-ligando por su necesidad no contribuye a la señal de supervivencia. Por ejemplo, las integrínas pueden modular la respuesta celular a factores de crecimiento (Elliot B eí al., (1992) J Cell Physiol 1 52, 292-301 ). Un área no explorada en el presente estudio fue la reversibilidad del proceso de transformación. La reversibilidad de transdiferenciación se ha reportado en otros sistemas celulares (Erenpreisa J, Roach Hl (1996) Mechanisms of Aging & Develop 287, 165-182). La transdiferenciación puede incluir proliferación celular y la apariencia de una célula intermedia dediferenciada multipotencial (Yuan S eí al., (1996) Differentiation 61 , 67-75) que puede expresar marcadores ^^^^ característicos de varios fenotipos alternativos. Es posible que esto sea el caso en nuestro sistema (Yuan S eí al., (1996) Differentiation 61 , 67-75). De esta manera, puede ser posible expandir una población de células multipotenciales y después inducir la diferenciación guía a un fenotipo celular deseado, en este caso, una célula ß que produce insulina. El sistema in vitro empleado en estos estudios fue único por dos razones, no requiere tejido fetal y el tejido inicial, isletas adultas, se define bien. En resgmen, este estudio extiende nuestra observación previa de que las isletas adultas de Langerhans pueden transformarse en estructuras císticas epiteliales de conducto por un proceso de dos etapas que incluye apoptosis seguida por diferenciación celular y proliferación . El mecanismo bioquímico preciso parece incluir, al menos en parte, elevación de cAMP intracelular mediado por una combinación de toxina de cólera y EGF, y una señal de supervivencia contribuida por un soporte ECM sólido. El potencial de diferenciación de las células que comprende ia nueva estructura epitelial parece elucidarse completamente. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta solicitud se propone cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales tendencias de la presente descripción como vienen dentro de la práctica común o conocida dentro de la materia a la cual pertenece la invención y como puede aplicarse a las características esenciales establecidas anteriormente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas. ítlítiHiif i i j*"— "- " ****»- "*» •^fc**ti

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un medio para preparar células dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhans, que comprende en un medio de cultivo fisiológicamente aceptable una cantidad eficaz de: a) un ambiente de matriz sólida para un cultivo tridimensional; b) una proteína de matriz soluble; y c) un primer y segundo factor para desarrollar, mantener y expandir dichas células intermedias dediferenciada, dicho primer factor induciendo un aumento en cAMP intracelular.
2. 2. Un medio según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho segundo factor se deriva de células acinares.
3. 3. Un medio según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho medio de cultivo comprende DMEM/12 complementado con una cantidad eficaz de suero de bovino fetal.
4. 4. Un medio según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho primer factor comprende una o más de toxina de cólera (CT), forskolin, concentraciones elevadas de glucosa, un promotor de cAMP y EGF.
5. 5. Un medio según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha proteína de matriz comprende una o más de laminina, colágeno tipo I y Matrigel™.
6. 6. Un método para preparar células dediferenciadas derivadas de isletas post-natales de Langerhans, que comprende contactar , *?a***.?^MmB ^tMM?í*±^^ i*¡a *: .. dichas células con un medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. 7. Un método in vitro para la expansión de la célula germinal, que comprende las etapas de: a) transformar células germinales diferenciadas en células intermedias dediferenciadas; b) expandir in vitro dichas células intermedias dediferenciadas en un medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; e c) inducir diferenciación in vitro de dichas células intermedias dediferenciadas para volverse células germinales diferenciadas.
8. 8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado porque dichas células germinales se seleccionan del grupo que consiste de células de músculo, piel, hueso, cartílago, pulmón, hígado, médula ósea y hematopoiética.