MX2007002389A

MX2007002389A - Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas.

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Publication number: MX2007002389A
Application number: MX2007002389A
Authority: MX
Inventors: James A Thomson; Tenneille Ludwig
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2005-09-08
Publication date: 2009-02-12
Also published as: ES2624586T3; AU2005282414C1; EP1797172A2; AU2005282414B2; NZ553235A; GB0706625D0; BRPI0514641A; GB2432835A; DK3196296T3; CA2579652A1; EP3196296B1; NO20071486L; EP1797172B1; WO2006029198A3; US20090029465A1; GB2432835B; WO2006029198A2; AU2005282414A1; ES2708384T3; US20070238170A1

Abstract

Los métodos previos para cultivar células progenitoras embrionarias humanas han requerido ya sea células alimentadoras de fibroblasto o un medio que ha sido expuesto a células alimentadoras de fibroblasto con el fin de mantener las células progenitoras en un estado no diferenciado. Ahora se ha encontrado que si se utilizan altos niveles de factor de crecimiento de fibroblasto en un medio con ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y lípidos, las células progenitoras permanecerán con diferenciadas indefinidamente a través de múltiples pasos aún sin células alimentadoras o medio condicionado. Se puede utilizar una matriz humanizada de proteínas humanas como una matriz de basamento para cultivar las células. Las nuevas líneas de células progenitoras embrionarias humanas utilizando estas condiciones de cultivo, el medio y la matriz, nunca serán expuestas a células de animales, productos animales, células alimentadoras, o medio condicionado.

Description

CULTIVO DE CELULAS PROGENITORAS EMBRIONARIAS HUMANAS | I DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION ¡ Las células progenitoras se definen como células que son capaces de diferenciación en muchos otros tipos de células diferenciadas. Las células progenitoras embrionarias son células progenitoras de embriones que son cap ces de ; j diferenciación en la mayor parte, sino todos, los tipos de células diferenciadas del cuerpo maduro. Las células progenitoras son referidas como pluripotentes, lo que1 ¡ i I describe esta capacidad de diferenciación en muchos tipos dei i ; célula. Una categoría de célula progenitora pluripotente dej alto interés para la comunidad de la investigación ; es la célula progenitora embrionaria humana, abreviada aqu'í como¡ célula ES, la cual es una célula progenitora embrionaria derivada de una fuente embrionaria humana. Las células^ progenitoras embrionarias humanas son de un gran interés! científico porque son capaces de la proliferación indefinidaj en cultivo y de esta forma son capaces, por lo menos en principio, de suministrar células y tejidos para el reemplazo de tejido deficiente o defectuoso humano. La existencia en el cultivo de células progenitoras embrionarias humanas ofrece: el potencial de cantidades ilimitadas de células y ¿ejidos humanos para uso en una variedad de protocolos terapéuticos y programas de investigación para ayudar en la salud humana. Se Ref . ¡179894 i I contempla en el futuro que las células progenitoras! i 1 embrionarias humanas se proliferarán y se dirigiráh para diferenciarse en linajes específicos para así desarrollar células o tejidos diferenciadas que se pueden transplaritar en cuerpo humanos para propósitos terapéuticos. Se han descrito las técnicas básicas para crear y. cultivar células progenitoras embrionarias humanas. Las técnicas previamente reportadas funcionan, pero existen limitaciones e inconvenientes a muchos de los procedimientos! I ! actualmente utilizados para cultivar células progenitoras; embrionarias humanas. Una limitación es de preocupación! particular. La mayor parte de las líneas de células; progenitoras embrionarias humanas han sido, en un girado u otro, expuestas directamente a células de ratón o a un medio en donde las células de ratón han sido previamente cultivadas. El hecho de que algunas células ES humanas de: líneas de células existentes se encontró que exhiben el¡ residuo siálico Neu5Gc, que no se hace normalmente a través de células humanas, recibió mucha atención en la prensja. Las técnicas originales para la generación y cultivo de células progenitoras embrionarias humanas requirieron el uso de células alimentadoras de fibroblasto embrionario de ; ratón (MEF, por sus siglas en inglés) como una capa alimentadora en las cuales se podrían cultivar las células progenitoras embrionarias humanas. Las células alimentadoras de fibroblasto actúan, a través de alguno, pero aún no completamente entendido mecanismo, para estimular que las células progenitoras permanezcan en un estado no diferenciado. Más tarde se descubrió que se podría lograr el mismo fenómeno si las células progenitoras fueran expuestas a "medios condicionados". El medio condicionado no es más que el medio de cultivo de célula progenitora en el cu¡al las células alimentadores, tales como las MEF, han sido; ; i previamente cultivadas. Ya sea que las células alimen¿adoras! impartan algún factor al medio o remuevan algún factilor ¦del1i ! i medio, el resultado es que el medio condicionado sé puede, I i utilizar para cultivar células progenitoras1 sinj diferenciación. Cualquier condición de cultivo, el, crecimiento directo de ES humano en células alimentadoras de, murino, o el uso de medio condicionado, dan origen a una \ ; preocupación de que uno o más agentes tales como un virus se1 podrían transmitir de las células de ratón a las células ESj humanas. Si uno de los objetivos de los cultivos de células; progenitoras embrionarias humanas es crear tejidos que' finalmente pueden ser trasplantados al cuerpo humano, es altamente deseable que las células progenitoras nunca sean expuestas a las células de otras especies o a un medio ¡que ha, sido utilizado para cultivar células de otras especiéis. Por consiguiente, la definición de una condición de cultivo, que permitirá la proliferación y el cultivo de células progenitoras embrionarias humanas sin la capa alimentadora de fibroblasto, es de gran interés en el continuo desarrollo dej técnicas para cultivos de larga duración de células| progenitoras embrionarias humanas. ! Varias formulaciones de medio permitirán que lasi células ES humanas permanezcan sin diferenciar durante algún' tiempo, pero eso estado por lo general falla en mantenerse; así mismo. En particular, se define el crecimiento de célulasj ES humanas a partir de un cultivo de semilla inicial, en un| recipiente de cultivo para la confluencia en el mismoj recipiente de cultivo como un "paso" . Se han encontrad j I varias formulaciones de medio que permiten el cultjivo de! células ES humanas de uno o dos pasos sin una diferenciación; severa, pero después las células se diferencian rápidamente sobre pasos subsiguientes. Se ha llegado a creer que con el fin de que un medio verdaderamente dé soporte a la ! i proliferación indefinida de células ES humanas sin diferenciación, sin medio condicionado o células alimentadoras de fibroblasto, el medio debe demostrar que da soporte al cultivo de células ES humanas en un estado sustancialmente uniforme y no diferenciado durante al menos cinco pasos. También es importante que los cultivos permanezcan relativamente homogéneos y no diferenciados a ló largo del periodo de cultivo y retener todas las características importantes de las células ES humanas.

Un rasgo característico de las células progenitorasj embrionarias humanas en cultivo es que si las condiciones son menos que ideales, las células tendrán una tendencia a la! diferenciación. Es fácil inducir células ES humanas para diferenciar si existe una demanda para mantener las células ES humanas en un estado no diferenciado en el cultivo. La mayor parte de las condiciones de cultivo darán como¡ resultado, en algún nivel, una diferenciación no deseada, particularmente alrededor de la periferia de la colonia del ! ¡ células ES en crecimiento. Ya que las células ES se pueden i cultivar con algún grado de diferenciación no deseada, el objetivo es definir una condición de cultivo que permita que el cultivo permanezca no diferenciado como sea posible, es decir, con tan pocas células diferenciadas como sea po'sible. Se cree que se han utilizado estándares particularmente, estrictos para definir las condiciones que darán soporte al \ cultivo indefinido de cultivos de células ES no j diferenciadas. ' ! El estado de la diferenciación de un cultivo de célula progenitora se puede evaluar a través de las características morfológicas. Las células progenitoras no diferenciadas tienen una morfología característica, es decir, células pequeñas y compactas con bordes de células claramente definidos, una morfología que puede ser fácilmente vista a través del examen de un cultivo de célula progenitora bajo un i I l microscopio. En contraste, las células que se han diferenciado aparecen más grandes y más difusas con ¡ bordes indistintos. Ya que algunas de las células diferen !ciadasi: pueden, y normalmente lo hacen, aparecer en el margen de las colonias de células no diferenciadas, el cultivo de célula progenitora óptimo es uno que prolifera en el recipiente del, cultivo con solamente números mínimos de células en laj periferia del cultivo que parece que- están diferenciadas. Con I i experiencia, se puede juzgar el estado de la diferenciación yl la salud de los cultivos de células ES humanas visuálmentei con buena exactitud. ¡ Además, la suficiencia de un medio para soporjtar la derivación de nuevas líneas de células ES humanas jes uni criterio aún más estricto para la suficiencia de las condiciones de cultivo de la célula progenitora. Algunas condiciones de cultivo que dan soporte a la expansión yj i crecimiento de líneas de células progenitoras existentes no ; han probado que son suficientes para uso en la derivación de nuevas líneas de células ES humanas . Parece que la capacidad j para dar soporte en la iniciación de nuevas líneas de células ' progenitoras es una capacidad que no todas las condiciones de 1 cultivo de células progenitoras presentarán. La presente invención se resume como un método para cultivar células progenitoras embrionarias humanas sin la necesidad de células alimentadoras o medio condicionado, el método incluye el paso de cultivar las células progenitoras embrionarias humanas en un medio que incluye sales,! ; I vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de! fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, una sal de litio y lípidos, todos en una cantidad suficiente para mantener las células progenitoras en un estado no diferenciado a través de los múltiples pasos del cultivo. 1 La presente invención también está dirigida a uní i cultivo células in vitro de células progenitoras embrionarias! humanas cultivadas en un medio que incluye altos niveles de| factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino! butírico, ácido pipecólico, una sal de litio y lípidos de tal! forma que las células progenitoras se pueden cultivar1 indefinidamente en un estado no diferenciado sin la neéesidadi de células alimentadoras de fibroblasto o medio condicionado.. La presente invención también se resume , en la! creación de nuevas líneas de células progenitoras' embrionarias humanas que no ha sido expuestas a productosf animales, células alimentadoras o medio condicionado. Es un objeto de la presente invención definir condiciones de cultivo de larga duración para células progenitoras embrionarias humanas que evitan el uso de células de animal, ya sea células alimentadoras o1 medio condicionado en el cual las células progenitoras se cultivan. ¦ Es otro objeto de la presente invención definir i condiciones de cultivo para células progenitoras embrionarias ¡ humanas que están tan definidas como es posible mientras se; evita la exposición a células de animal o proteínas animales. ', Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente especificación . La Figura 1 es una ilustración gráfica de algunos¡ de los datos de los siguientes ejemplos. La Figura 2 es una ilustración gráfica adicional de¡ i los datos de los ejemplos siguientes. ¡ Se han identificado múltiples condiciones de, cultivo y medios que permiten el cultivo indefinido en la¡ proliferación de células progenitoras embrionarias humanas en un estado no diferenciado y también en la completa ausencia tanto de células alimentadoras como medio condicionado. Las condiciones de cultivo y el medio descrito aquí están enteramente libres de productos de animal y toda's las proteínas son de origen humano. El desarrollo de estos medios y condiciones de cultivo hace posible la derivación y mantenimiento de líneas de células ES humanas en condiciones definidas y controladas sin la exposición directa o indirecta a células d animal de cualquier clase, y también hace posible la derivación de nuevas líneas de células ES humanas que nunca han sido expuestas a células de animal o medios en donde las células de animal se cultivaron. El medió está libre de productos o proteínas animales. Este medio hai demostrado que da soporte a la proliferación de células ES noj diferenciadas a través de por lo menos veinticinco pasos, lo cual es una evidencia firme de que dará soporte a 'dichos cultivos indefinidamente. El medio preferido también ahora ha probado ser un soporte suficiente para la derivación de' nuevas líneas de células ES humanas, y estas nuevas líneasj han pasado a través de más de 10 pasos en el cultivo. ' Ha sido algunas veces la práctica en el ipasado' referirse al uso de medio condicionado como la creación de¡ condiciones de cultivo "libres de alimentadores" . Esta frase es un nombre poco apropiado, ya que las células alimentadoras de algún tipo aún son necesarias para condicionar el "medio condicionado". En la presente, las condiciones de cultivo se' describen permitiendo el cultivo "independiente de; alimentador" de células ES humanas. Por "independiente de la, alimentador" significa que no fue necesaria ninguna clase de células alimentadoras, humanas o animales, en ninguna parte del procedimiento y tampoco son requeridas para el cultivo ni la condición del medio. Las condiciones independientes del alimentador no requieren células alimentadoras para nada para ningún propósito. Un medio definido y humanizado para el cultivo y proliferación de células ES humanas típicamente incluye sales, vitaminas, una fuente de energía tal como glucosa, j minerales y aminoácidos. Para suplementar el medio y lasi condiciones de suministro para dar soporte al crecimiento de células, inicialmente el medio de las células progenitorasj incluye suero de una fuente u otra. También previamente se ha reportado que la adición del factor de crecimiento de fibroblasto más un reemplazo de suero aditivo permitirá el, cultivo de células ES humanas sin suero. El reemplazo del! suero puede ser un producto comercialmente disponible vendido! para ese propósito o se puede formular una mezcla de1 proteína, tal como albúmina de suero, vitaminas, minerales, o( transferrina o un sustituto de transferrina, e insulina o un sustituto de insulina. Este componente de reemplazo dé suero también se puede suplementar con selenio y con una mezcla dé lípidos. Se prefiere utilizar una mezcla de aditivo dé reemplazo de suero definido en lugar de suero de cualquier fuente en el cultivo de células ES humanas, con el fin de I i evitar los aspectos de variación en los constituyentes del suero y utilizar medios tan definidos como sea posible: Otrosi factores de crecimiento que se ha encontrado que son ventajosos para agregar al medio de cultivo son GABA,, ácido pipecólico, cloruro de litio, y factor beta de crecimiento de transformación (TGF ) , aunque el TGF& puede no ser necesario con niveles en incremento de FGF agregado al medio. Para evitar la necesidad de una capa alimeñtadorá de fibroblasto, previamente se pensó que era necesario mantener células ES humanas en un estado no diferenciado, sej reporta en la presente que la combinación del uso de' concentraciones más altas de FGF (de 10 a 1000 ng/ml) junto con el uso de ácido gama amino butírico (GABA) , ácido pipecólico, cloruro de litio y TGF-beta, permitirá que un medio dé soporte al crecimiento de células progenitores nol diferenciadas. La combinación de estos aditivos se ha¡ encontrado que es suficiente para mantener el cultivo del células ES humanas en un estado no diferénciadoi indefinidamente sin la exposición ya sea a células! ¡ l alimentadoras o medio condicionado. Estos aditivos son suficientemente demostrables. Sin embargo, todos estos pueden! no ser necesarios para cada formulación de medio . A través deí la eliminación selectiva de estos aditivos, se 1 puede> determinar empíricamente si uno o más de estos no son requeridos para lograr este resultado para un medio dado. Sin: embargo, es claro que la combinación es suficienté para permitir que una variedad de medios soporten el cultivo de larga duración y la proliferación de células ES humanas no diferenciadas sin células alimentadoras, o medio condicionado . Estos constituyentes son sujetos a algunas variaciones. Por ejemplo, se utiliza el LiCl en el medio porque estimula la trayectoria wnt. Las wnt por sí mismas u' otros estimuladores de esta trayectoria tal como activita podrían sustituirse como equivalentes de LiCl, aún cuando LiCl es probablemente el agente más económico para este i 1 propósito. Similarmente, GABA se cree que interactúa 'con ei receptor GABA, y la literatura científica incluye la identificación de varias moléculas que son agonistas de ese mismo receptor y podría sustituirse por GABA en el medio como¡ un equivalente. También se cree que PA también interactúa con, el receptor GABA. Tanto PA como GABA se encontró que son1 útiles en el medio a concentraciones utilizadas aquí, también j I se contempla que uno o el otro de estos constituyentes! podrían dramáticamente incrementarse en concentración para1 obviar la necesidad del otro. El factor de crecimiento de fibroblasto en> concentraciones más altas (de 40 a 100 ng/ml) parece que obvia la necesidad de células alimentadoras . El FGF preferido, I es FGF básico, también referido como bFGF y FGF2 , pero otros FGF que incluyen por lo menos FGF4 , FGF9, FGF17 y FGF18| serán j suficientes para este propósito también. También pueden; funcionar otros FGF, aún a concentraciones más altas. También es útil incluir en las condiciones de cultivo para las células ES humanas una matriz biológica en el recipiente de cultivo. Uno de dichos materiales que ha sido utilizado previamente es Matrigel™, el cual es una membrana de basamento artificial de origen celular de ratón, que es suministrada como un producto comercial libre de células de ratón. Sin embargo, el uso de Matrigel introduce en el cultivo un material que estando pobremente definido e¡ incluye material de origen, de murino. Aquí también se; describe como crear una matriz biológica de proteínas humanas que sustituya completamente al Matrigel. Esta matriz está compuesta de cuatro proteínas humanas: colágeno aisl|ado' de: placenta humana, fibronectina aislada de plasma humano, vitronectina aislada de plasma humano y laminina aislada de placenta humana. La combinación de estas cuatro proteínas es-suficiente, pero el uso de las cuatro podría no ser necesario! para soportar el crecimiento en cultivo de células ES¡ humanas. El uso de dicha matriz sin uno de vitronectina, j fibronectina, o laminina, pero incluyendo las otras tres! proteínas, da soporte al cultivo de células ES, con alguna pérdida en la pureza en el estado de diferenciación del cultivo de células ES. El método para hacer la matriz para el¡ crecimiento de la célula ES se describe en los siguientes ejemplos. Para llegar a los aditivos de medio enumerados^ anteriormente, se siguió la prueba metódica de más de 80 factores de crecimiento individuales. Ya que algunos de los aditivos parecen, al menos por unos pasos, que soportan el crecimiento de células ES humanas en cultivo, muchos fallan en los subsiguientes pasos para mantener las células ES en un; estado no diferenciado. Se fue capaz de identificar combinaciones de estos otros factores que dan los resultados de los aditivos de media descritos en los ejemplos siguientes. La observación de que los cultivos de células, progenitores embrionarias humanas (ES) han sido previamentel mantenidos en un estado no diferenciado solamente cuando se, cultivan en la presencia de células alimentadoras de fibroblasto o en medio condicionado ha conducido 1 a la! especulación de que los fibroblastos liberan en el medio un1 factor que actúa para inhibir la diferenciación de las: células ES . Los datos presentados a continuación demuestran! i que este no es el caso. Sin embargo, sin importar el lefectoi que es mediado por las células alimentadoras de fibroblasto; al medio, ahora es claro que el medio descrito a continuación sustituirá ese efecto. El medio descrito a continuación está definido, no contiene células de animal, y permite el cultivo! de larga duración de células ES humanas no diferenciadas. Se presenta un ejemplo de un medio en donde las proteínas; en el medio todas son humanas, para tener un medio "humanizado" y' una matriz para evitar cualquier preocupación posible acercai de los productos sub-celulares de origen animal. También se describe a continuación la derivación de nuevas líneas de células progenitores embrionarias humanas, utilizando este medio. Estas líneas de células ES humanas de1 i ¡ esta forma nunca han sido expuestas a células alimentadoras, medio condicionado, y productos animales o próteínas| animales. Se ha reportado previamente que las líneas ES humanas anteriores exhiben una forma de ácido siálico! I (Neu5Gc) que no se encuentra nativamente en células humanasj ya sea en cultivo o en el cuerpo. Ya que las líneas ES ¡humanasj anteriores adquirieron el Neu5Gc de condiciones de cultivo incluyendo; componentes de murino, las nuevas líneas de células ES .humanas descritas aquí serán y estarán enteramente libres de NeuSGc. EJEMPLOS Los constituyentes del medio TeSRl, que se' utilizaron para todos los cultivos descritos aquí a menos quei se indique otra cosa, se establece en la Tabla 1 siguiente.! Los experimentos preliminares sugirieron que la proliferación1 de célula ES humana no diferenciada fue óptima a un pH de j 7.2, osmolaridad de 350 mOsMoles, y una atmósfera de 10% de C02/5% de 02. Estas condiciones se utilizaron para todbs los cultivos subsiguientes descritos aquí. Ya que un medio con todos los constituyentes anteriores es suficiente y es preferido, no todos los componentes son necesarios para el cultivo exitoso de células ES humanas, dependiendo de la cantidad de células diferenciadas se desea tolerar que alguno de los componentes del medio puedan ser omitidos en un medio, particularmente si el medio solamente se utiliza a unos cuantos pasos. Para explorar que constituyentes podrían omitirse, las células ES humanas se cultivaron en variantes del medio anterior con componentes diferentes omitidos. Se colocaron en placas doscientas mil células y se dejaron crecer durante 7 días en el medió experimental, dos cavidades por tratamiento. Las células después sé I ensayaron para la expresión del factor de transcripción 0ct4, un i marcador reconocido de células no diferenciadas . Los datos de ese experimento se presentan como una gráfica en la Figura 1 , en donde los números de 0ct4 que expresan células en cada mediol i experimental se presentan como una fracción de esto a partir del medio preferido TeSRl . Observar que TGFS parece que es al| ! i menos un componente necesario , al menos en la presencia dej ! i altos niveles de FGF durante un cultivo a corto plazo . ) Observar también que otros constituyentes omitidos dieron comoj resultado porcentajes incrementados de células no diferenciadas, perol las diferencias son cuantitativas, y el medio no funcionó, al menos en algún grado para pasos de células limitados, sin esos componentes . El medio también ha sido utilizado para cultivar células ES humanas utilizando un nuevo material de matriz de! i origen humano . La nueva matriz está compuesta de las ¡ siguientes cuatro proteínas : 1 . Colágeno (aislado de placenta humana) a una concentración f inal de 10 Mg/ 100Ml/cm2 . 2 . Fibronectina (aislada de. plasma humana) a una concentración de 5 Mg/100Ml /cm2 . 3 . Vitronectina (aislada de plasma humana) a una 1 concentración de 0 . 2 Mg/100Ml/cm2 . 4 . Laminina (aislada de placenta humana) a una concentración final de 5 Mg/100/xl/cm2. Para ensamblar esta matriz, el colágeno se desnaturalizó con GuHCl 6M (HCl de guanidina) , filtrado a través de un filtro de .45 mieras y congelado en alícuotas. Después de la descongelación, el colágeno desnaturalizado se diluyó en PBS libre de Ca y Mg para lograr la concentración final apropiada y colocarse sobre placas. Las placas recubiertas se dejaron incubar a temperatura ambiente por no menos de 1 hora antes de que se colocaran en la placa los componentes de matriz adicionales. Después de esta incubación adicional, se diluyeron los componentes de matriz adicionales ( fibronectina, vitronectina y Laminina) en un PBS libre! de CA y Mg para lograr la concentración final apropiada y colocarse en la placa. Las placas cubiertas se dejaron incubar a temperatura ambiente por no menos de 1 hora antes de que se colocaran en las placas las células ES humanas . Utilizando el nuevo material de matriz, las células Es humanas de líneas previamente existentes se han cultivado durante un mínimo de 10 pasos mientras permanecieron no diferenciadas y proliferando . Para probar la necesidad estricta de componentes de matriz humanizada, se formularon variaciones de la matriz con uno o más compuestos omitidos. Los datos de ese experimento se presentan en la Figura 2. Las letras iniciales para cada condición experimental representan las proteínas en la matriz (C-colágeno, F-fibronectina, V-vitronectina, y L-laminina) . i Observar que las membranas CFV, CVL y CFL no funcionan bien y; I I mantienen las células ES en un estado no diferenciado, pero i . simplemente no son tan conductivas para que el cultivo de célula crezca según la condición de matriz CVFL. Este medio también ha probado que es capaz de soportar la iniciación de nuevas líneas de células progenitores embrionarias humanas. El proceso de derivaciónj para nuevas líneas puede ser una prueba difícilj paral formulaciones de medio, pero el uso de medio definido hace1 I I posible crear nuevas líneas de células progenitoras | embrionarias humanas que no han sido expuestas a proteínas o 1 matrices animales, y nunca han sido expuestas a cjélulas alimentadoras o medio en el cual se cultivaron las células i alimentadoras. Se cree que esto es un logro novedoso. Este trabajo se ha realizado solamente después de obtener la aprobación del consejo de revisión institucional y el consentimiento informado de los donadores. Los embriones humanos congelados que se crearon de seres humanos en protocolos de fertilización in vitro, pero fueron en exceso de necesidades clínicas, fueron donados. Los embriones se descongelaron y cultivaron para la etapa de blastócisto utilizando un sistema de cultivo de embrión secuéncial comercialmente disponible (series Vitrolife-GIII) . Después de la remoción de la zona pelúcida, la masa de la célula interna (ICM, por sus siglas en inglés) de los blastocistos humanos : se aislaron ya sea a través de inmunocirugía (Soltér and : i nowles, 1975, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 72, 72 : 5099j-5102 ) ¡ o como montajes completos cultivados (Evans and Kajufman, 1981, Nafcure, 292154-156) y se colocaron en placas de cultivo de 4 cavidades sobre el medio TeSRl definido con la matriz humanizada definida como se describe anteriormente (jcVFL) . Después de 48 horas iniciales de cultivo, el medio de c!ultivo i TeSRl se reemplazó sobre bases diarias. Después de 14 a 21 días, se, aislaron mecánicamente masas de células y se volvieron a colocar en las i placas sobre placas con CVFL. El aislamiento mecánico se continuó durante 2 a 3 pasos subsiguientes después de lo cual las colonias se hicieron pasar utilizando la enzima dispase. Las nuevas colonias se confirmaron como siendo nuevas líneas de células progenitores embrionarias humanas. Utilizando el medio TeSRl en los cuatro componentes i de matriz humanos identificados anteriormente, se derivaron , dos nuevas líneas de células ES humanas de 5 blastocistos ' i cultivados. En cuanto a este escrito, ambas líneas de células ES humanas ahora han estado continuamente en cultivo durante 6 meses a través de pasos sucesivos. Las líneas son estables y morfológicamente similares a las líneas de células progeni toras previo. El análisis EAC y RT-PCR, y el Western blotting demostraron que estás células expresan una serie de características marcadoras de células ES humanas. Los cuerpos embrioides derivados de estas líneas de células expresaron marcadores de las cuatro cajpas de: germen, y ambas líneas de células formaron teratomas que se: inyectaron en ratones de color marrón SCID. Después de 4 meses en-cultivo, una línea de células fue XXY (Síndrome Klinefelter) y las otras fueron cariotópicamente normales. El Síndrome linefelterj es una I de las anormalidades de cromosoma humanas más comunes, que sugiere que! está anormalidad puede estar presente en el embrión mismo en lugar de: un artefacto introducido a través del procedimiento de iniciación del cultivo de célula progenitora. TABLA 1 ; Formulación Completa del Medio TeSRl SALES INORGÁNICAS mM AMINOACIDOS ImM Cloruro de calcio 0.8232 L-Alanina 0.1392 (anhidro) 1 HEPES 11.76 Clorhidrato de L- 0.5488 Arginina Cloruro de magnesio 0.2352 L-Asparagina-H20 0.'l392 (anhidro) Sulfato de magnesio 0.319088 Acido L-Aspártico 0.1392 (MgS04) Cloruro de potasio 3.26144 L-Cisteína-HCl-H20 0.10784 (KC1) Bicarbonato de sodio 11.2112 2HC1 de L-Cisteína 0.0784 (NaHC03) Cloruro de sodio 94.55824 Acido L-Glutámico 0.il392 (NaCl) Fosfato sódico- 0.392 L-Glutamina 2.96 dibásico (anhidro) Monofosfato sódico 0.355152 Glicina 0.296 (NaH2PO4-H20) L-Histidina-HCl-H20 0.¡1176 MINERALES DE RESIDUO L-Isoleucina 0.326144 Nitrato férrico 0.00009408 L-Leucina 0.353584 (Fe(NO3)3-9H20) Sulfato férrico 0.001176 Clorhidrato de L- 0.391216 (FeS04-7H20) Lisina Sulfato cúprico 4.0768E-06 L-Metionina 0.090944 (CuS04-5H20) Sulfato de Zinc 0.001176 L-Fenilalanina 0.16856 (ZnS04-7H20) Metavanadato de 0.000056 L-Prolina 0.¡2176 amonio NH4V03 Sulfato Manganoso Mn 1.00592E-05 L-Serina 0.296 S04 H20) Molibdato de Amonio 1.00404E-05 L-Treonina 0.35016 NÍS04 6H20 4.94861E-06 L-Triptófano 0.0346528 Metasilicato de 0.004926108 2 Na 2H20 L-Tirosina 0.167776 sodio Na2Si03 9H20 SnC12 5.32544E-06 L-Valina 0.354368 CdC12 6.21931E-05 CrC13 9.41176E-06 VITAMINAS Ag No3 5.00293E-06 Acido ascórbico 0.375 A1C13 6H20 2.4855E-05 Biotina 1.12112E-05 Ba (C2H302)2 4.99217E-05 Cloruro de colina 0.0502544 CoC12 6H20 5.00221E-05 Pantotenato de D- 0.0036064 calcio Ge02 2.5337E-05 Acido fólico 0.00,4704 KBr 5.04202E-06 i-Inositol 0.05488 Kl 5.12048E-06 Niacinamida 0.012936 NaF 0.000500119 Clorhidrato de 0.0076048 piridoxina 1 ¡ KbCl 5.00414E-05 Riboflavina 0.0004704 i Zr012 8H20 9.03834E Clorhidrato de 0.024160217 tiamina ! Vitamina B12 0.000392 FACTORES DE CRECIMIENTO GABA 0.979 SUSTRATOS DE ENERGIA Acido pipecólico 0.000984 D-Glucosa 13.72784 bFGF 5.80E-06 Piruvato sódico 0.392 LiCl 0.979 TGF beta 1 2.35E-08 PROTEINAS Insulina Humana 0.0034438 LIPIDOS Holo transferrina 0.14 humana Acido linoleico 0.0070976 Albúmina de suero 199.7 humana Acido lipoico 0.00039984 Acido araquidónico 0.001312 OTROS COMPONENTES i Colesterol 0.0113798 Glutationa 0.00592996 ! ( reducida) DL-alfa tocoferol- 0.02962 Hipoxantina de NA 0.01176 ' acetato Acido linoleico 0.007184 Rojo fenol 0.0159936 ¡ Acido mirístico 0.008758 2HC1 de Putrescina 0.000394352 Acido oleico 0.00708 Timidita 0.00Í176 Acido palmitoleico 0.007862 2 -mercaptoetanol O.'l Acido esteárico 0.00703 Selenio 0.000Í77304 Plurónico F-68 0.238 ! Tween 80 0.3358 ¡ I i Se hace constar que con relación a , esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como anteceele, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Un método para iniciar una nueva línea cultivada de células progenitoras embrionarias humanas sin el uso de células alimentadoras o medio condicionado, caracterizado porque comprende el paso de: colocar en placas células de un blastocisto en un medio que incluye vitaminas, aminoácidos, glucosa, un ¿actor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y lípidos en cantidades suficientes para originar y mantener una nueva línea de células progenitoras en proliferación en un estado no diferenciado.
2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblasto en una concentración de al menos 40 ng/ml.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio también comprende transferrina e insulina.
4. - Un cultivo de células in vitro caracterizado porque comprende en un recipiente de cultivo: células progenitoras embrionarias humanas; un medio de cultivo, el medio de cultivo comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, o factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido i pipecólico, litio y lípidos en cantidades suficientes para mantener a las células progenitoras en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo, el medio estando libre de células alimentadoras y nunca habiendo sido expuesto a células alimentadoras; y una matriz humanizada hecha de colágeno humanó y al menos dos proteínas humanas seleccionadas del grupó que consiste de fibronectina, vitronectina y laminina. ;
5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la matriz incluye todo el colágeno, fibronectina, vitronectina y laminina.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblasto en una concentración de al menos 40 ng/ml.
7. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el medio también comprende transferrina e insulina.
8. - Un cultivo de células in vitro caracterizado porque comprende en un recipiente de cultivo: células progenitoras embrionarias humanas; una matriz humanizada hecha de colágeno humano y al menos dos proteínas humanas seleccionadas del grupo que i consiste de colágeno, fibronectina, vitronectina y laminina; Y un medio de cultivo, el medio de cultivo comprende vitaminas, aminoácidos, glucosa, factor de crecimiento de fibroblasto, y lípidos en cantidades suficientes t para mantener las células progenitoras en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo, el medio estando libre de células alimentadoras y nunca habiendo sido expuesto a células alimentadoras.
9. - Un método para cultivar nuevas células progenitoras embrionarias humanas caracterizado porque comprende los pasos de: (a) aislar la masa de célula interna de un embrión en el estado de blastocisto; (b) cultivar la células del paso (a) en un medio que incluye vitaminas, aminoácidos, glucosa, factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y lípidos en cantidades suficientes! para mantener a las células progenitoras en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo; (c) el paso de cultivar siendo conducido eh una matriz de proteínas humanas; y (d) expandir serialmente las células que proliferan en el medio.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las proteínas humanas en el medio ¡ incluyen por lo menos tres de las proteínas del grupo que consiste de colágeno, fibronectina, vitronectina y laminina.
11. - Un cultivo de células caracterizado porque comprende células progenitoras embrionarias humanas que crece en una matriz de proteínas humanas, las células progenitoras de un linaje que nunca ha sido expuesto a células animales, ' i ! proteínas animales, células alimentadoras o medio j condicionado, el medio del cultivo de células capjaz de , mantener las células a través de más de 20 pasos jen el | cultivo mientras las células permanecen no diferenciadas, mantener la pluripotencia y mantener el cariotipo normai .
12. - Un cultivo de células caracterizado porque comprende células progenitoras embrionarias humanas que no i exhiben el ácido siálico Neu5Gc . i