ES2708384T3 - Cultivo de células madre embrionarias humanas - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para cultivar células madre pluripotenciales humanas sin la necesidad de células alimentadoras o medio condicionado, incluyendo el método la etapa de cultivar las células madre pluripotenciales humanas en un medio de cultivo que comprende, en cantidades suficientes para mantener las células madre en un estado indiferenciado a través de múltiples pases del cultivo, albúmina, minerales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, lípidos, una transferrina o un sustituto de transferrina, insulina o un sustituto de insulina y todos menos uno de los siguientes constituyentes: factor de crecimiento de fibroblastos en una concentración de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, ácido gamma amino butírico, ácido pipecólico, TGFß y una sal de litio, estando el medio exento de células alimentadoras y sin haber estado expuesto nunca a células alimentadoras.

Description

DESCRIPCION
Cultivo de celulas madre embrionarias humanas
Algunos de los trabajos descritos en la presente memoria descriptiva fueron apoyados por subvenciones del Gobierno de los Estados Unidos y algunos no. Ninguno de los trabajos descritos en la presente memoria descriptiva sobre el proceso de derivacion de nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas fue apoyado por ninguna subvencion del Gobierno de los Estados Unidos. Hasta ese punto, la presente invencion se realizo con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos otorgado por las siguientes agencias: NIH RR017721. Los Estados Unidos tienen determinados derechos en la presente invencion.
Antecedentes de la invencion
Las celulas madre se definen como celulas capaces de diferenciarse en otros muchos tipos de celulas diferenciadas. Las celulas madre embrionarias son celulas madre procedentes de embriones que son capaces de diferenciarse en la mayorfa, si no todos, los tipos celulares diferenciados de un cuerpo adulto. Las celulas madre se describen como pluripotenciales, lo que hace referencia a su capacidad para diferenciarse en muchos tipos celulares. Un tipo de celula precursora pluripotencial de gran interes para la comunidad investigadora es la celula madre embrionaria humana, nombrada en este documento celula ES, que es una celula madre embrionaria derivada de una fuente embrionaria humana. Las celulas madre embrionarias humanas son de gran interes cientffico porque son capaces de proliferar indefinidamente en medios de cultivo y asf son capaces, al menos en principio, de proporcionar celulas y tejidos que permiten reemplazar tejidos humanos que fallan o defectuosos. La existencia de celulas madre embrionarias humanas en cultivo ofrece un potencial de cantidades ilimitadas de celulas y tejidos humanos para emplear en una gran variedad de protocolos y programas de investigacion de ayuda para la salud humana. Se preve que en el futuro las celulas madre embrionarias humanas proliferaran y se orientaran a diferenciarse en linajes especfficos de forma que se desarrollen celulas o tejidos diferenciados que puedan trasplantarse en cuerpos humanos con fines terapeuticos.
Se han descrito las tecnicas basicas para crear y cultivar celulas madre embrionarias humanas. Las tecnicas descritas previamente funcionan, pero muchos de los procedimientos usados actualmente para cultivar celulas madre embrionarias humanas tienen limitaciones e inconvenientes. Una de las limitaciones presenta una objecion especial. La mayorfa de las lfneas de celulas madre embrionarias humanas existentes se han expuesto, en mayor o menor grado, directamente a celulas de raton o a un medio en el que se han cultivado previamente celulas de raton. Por parte de la prensa, se presto gran atencion al hecho de que se encontrasen algunas celulas ES humanas de lfneas celulares existentes que exhiben el residuo sialico Neu5Gc, residuo que no es sintetizado normalmente por celulas humanas. Las tecnicas originales para la generacion y el cultivo de celulas madre embrionarias humanas requerfan el uso de celulas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de raton (MEF, del ingles Mouse Embryonic Fibroblast) como una capa alimentadora sobre la que las celulas madre embrionarias humanas podfan ser cultivadas. Las celulas alimentadoras de fibroblastos actuan, a traves de un mecanismo que no se comprende completamente todavfa, de forma que fomentan que las celulas madre permanezcan en un estado indiferenciado. Posteriormente, se descubrio que este mismo efecto podia conseguirse si las celulas madre se exponfan a “medios condicionados”. Un medio condicionado no es nada mas que un medio de cultivo de celulas madre sobre el cual las celulas alimentadoras, como las MEFs, habfan sido cultivadas previamente. Ya sea porque las celulas alimentadoras proporcionaban algun factor al medio o porque eliminaban algun factor del medio, el resultado es que el medio condicionado puede utilizarse para cultivar celulas madre sin diferenciacion. Cualquier condicion del cultivo, el crecimiento directo de celulas ES humanas sobre celulas alimentadoras murinas, o por el uso de medios condicionados, da origen a una preocupacion de que uno o mas agentes, como un virus, podrfan transmitirse desde las celulas de raton a las celulas ES humanas. Si uno de los objetivos de los cultivos de celulas madre embrionarias humanas es crear tejidos que en ultima instancia puedan transplantarse a un cuerpo humano, es sumamente deseable que las celulas madre nunca hayan sido expuestas a celulas de otras especies o a medios que hayan sido utilizados para cultivar celulas de otras especies. En consecuencia, definir la condicion de un cultivo que permitira la proliferacion y el cultivo de celulas madre embrionarias humanas sin la capa alimentadora de fibroblastos, es de gran interes en el desarrollo continuo de tecnicas para el cultivo a largo plazo de celulas madre embrionarias humanas.
Varias formulaciones de medios permiten que las celulas ES humanas permanezcan indiferenciadas durante cierto tiempo, pero este estado falla a menudo en el automantenimiento. En particular, el solicitante ha definido el crecimiento de celulas ES humanas desde un estado de siembra inicial en un recipiente de cultivo hasta la confluencia en el mismo recipiente de cultivo como un “pase”. El solicitante ha encontrado varias formulaciones de medios que permiten el cultivo de celulas ES humanas durante uno o dos pases sin una diferenciacion estricta, pero posteriormente las celulas se diferencian rapidamente durante pases sucesivos. El solicitante entiende que para que un medio permita verdaderamente la proliferacion indefinida de celulas ES humanas sin diferenciacion, en ausencia de un medio condicionado o celulas alimentadoras de fibroblastos, debe demostrarse que el medio puede mantener el cultivo de celulas ES humanas en un estado sustancialmente uniforme e indiferenciado durante al menos cinco pases. Tambien es importante que los cultivos permanezcan relativamente homogeneos e indiferenciados durante el periodo de cultivo y conserven todas las caracterfsticas significativas de las celulas ES humanas.
Un rasgo caracterfstico de las celulas madre embrionarias humanas en cultivo es que, si las condiciones estan por debajo de las optimas, las celulas tienden a diferenciarse. Es facil inducir las celulas ES humanas a diferenciarse, aunque existe la necesidad de mantener las celulas ES en un cultivo en estado indiferenciado. La mayorfa de las condiciones de cultivo dara como resultado un cierto grado de diferenciacion no deseada, particularmente en torno a la periferia de la colonia de celulas ES en crecimiento. Aunque las celulas ES pueden cultivarse con cierto grado de diferenciacion no deseada, el objetivo es definir una condicion de cultivo que permita al cultivo permanecer tan indiferenciado como sea posible, es decir, con el mfnimo de celulas diferenciadas posible. El solicitante cree que se han utilizado estandares especialmente restrictivos para definir las condiciones que daran soporte al cultivo indefinido de cultivos de celulas ES indiferenciadas.
El estado de diferenciacion de un cultivo de celulas madre puede evaluarse a traves de las caracterfsticas morfologicas. Las celulas madre indiferenciadas tienen una morfologfa caracterfstica, es decir, son celulas pequenas y compactas con bordes celulares claramente definidos, una morfologfa que puede verse facilmente mediante el examen de un cultivo de celulas madre con un microscopio. En cambio, las celulas que se han diferenciado aparecen mas grandes y mas difusas, con bordes poco definidos. Aunque algunas celulas diferenciadas pueden, y normalmente lo hacen, aparecer en el margen de las colonias de celulas indiferenciadas, el cultivo optimo de celulas madre es aquel que prolifera en el recipiente de cultivo con solo un numero mfnimo de celulas que parezcan estar diferenciadas en la periferia del cultivo. Con experiencia se puede evaluar visualmente con gran exactitud el estado de diferenciacion y la salud de los cultivos de celulas ES humanas.
Ademas, la suficiencia de un medio para soportar la derivacion de nuevas lfneas de celulas ES humanas es un criterio aun mas estricto para la suficiencia de las condiciones de cultivo de la celula madre. Algunas condiciones de cultivo que dan soporte a la expansion y al crecimiento de lfneas de celulas madre existentes, no han probado que sean suficientes para uso en la derivacion de nuevas lfneas de celulas ES humanas. Parece que la capacidad para dar soporte en la iniciacion de nuevas lfneas de celulas madre es una capacidad que no presentan todas las condiciones de cultivo de celulas madre.
El documento WO 03/020920 describe un sistema de cultivo para una expansion rapida de las celulas madre embrionarias humanas. Amit et al. (Biology of Reproduction, 2004; 70: 837-845) describen el cultivo exento de capa alimentadora y suero, de celulas madre embrionarias humanas. El documento WO 2004/055155 describe metodos de preparacion de celulas madre embrionarias humanas y de cultivos de celulas madre exentos de celulas alimentadoras y xenobioticos, empleando los mismos. Carpenter et al. (Developmental Dynamics, 2004; 229(2): 243­ 258) describen las propiedades de cuatro lfneas de celulas madre embrionarias mantenidas en un sistema de cultivo exento de celulas alimentadoras. Schmidt et al. (The International Journal of Developmental Biology, 2001; 45(2):421-429) describen que el litio influye en la diferenciacion y en la expresion genica especffica de tejido de celulas madre embrionarias de raton (E3) in vitro. Aubert et al. (Nature Biotechnology, 2002; 20(12): 1240-1245) describen que el escrutinio de genes funcionales en celulas madre embrionarias implica un antagonismo de Wnt en la diferenciacion neural. Park et al. (Anatomical Science International, 2004; 79:337) describen que la activacion de Wnt no se asocia al mantenimiento de la pluripotencia sino con una diferenciacion de las celulas madre embrionarias humanas.
Breve compendio de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo in vitro para cultivar celulas madre pluripotenciales sin la necesidad de celulas alimentadoras o medio acondicionado, incluyendo el metodo la etapa de cultivar las celulas madre pluripotenciales humanas en un medio de cultivo que comprende, en cantidades suficientes para mantener las celulas madre en un estado indiferenciado a traves de multiples pases del cultivo, albumina, minerales, vitaminas, aminoacidos, glucosa, lfpidos, una transferrina o un sustituto de transferrina, insulina o un sustituto de insulina, y todos menos uno de los siguientes constituyentes: factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico, TGFp y una sal de litio, estando el medio exento de celulas alimentadoras y sin haber estado expuesto nunca a celulas alimentadoras.
La presente invencion tambien proporciona un cultivo celular in vitro que comprende en un recipiente de cultivo: (i) celulas madre pluripotenciales humanas; (ii) un medio de cultivo, el medio de cultivo que comprende, en cantidades suficientes para mantener las celulas madre en un estado indiferenciado a traves de multiples pases de cultivo, albumina, minerales, vitaminas, aminoacidos, glucosa, lfpidos, una transferrina o un sustituto de transferrina, insulina o un sustituto de insulina y todos menos uno de los siguientes componentes: factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico y una sal de litio, estando el medio exento de celulas alimentadoras y sin haber estado expuesto nunca a celulas alimentadoras; y (iii) una matriz humanizada elaborada a partir de colageno humano y al menos una protefna humana seleccionada entre fibronectina, vitronectina y laminina.
En el presente documento tambien se describe la creacion de nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas que no han sido expuestas a productos animales, celulas alimentadoras o medio condicionado.
Es un objeto de la presente descripcion definir las condiciones de cultivo a largo plazo para celulas madre embrionarias humanas que eviten el uso de celulas animales, ya sean celulas alimentadoras o para un medio condicionado en el que se cultivan las celulas madre.
Es otro objeto de la presente descripcion definir las condiciones de cultivo para celulas madre embrionarias humanas que son como se han definido en la manera de lo posible, evitando al mismo tiempo la exposicion a celulas animales o protefnas animales.
Otros objetos, caracterfsticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente memoria descriptiva.
Breve descripcion de varias vistas de los dibujos
La Fig. 1 es una ilustracion grafica de algunos de los datos de los ejemplos siguientes.
La Fig. 2 es una ilustracion grafica adicional de datos de los ejemplos siguientes.
Descripcion detallada de la invencion
Se han identificado multiples condiciones de cultivo y medios que permiten el cultivo indefinido y la proliferacion de celulas madre embrionarias humanas en estado indiferenciado y tambien en ausencia completa tanto de celulas alimentadoras como de medio condicionado. Las condiciones del cultivo y los medios descritos en esta memoria estan totalmente exentos de productos animales y todas las protefnas son de origen humano. El desarrollo de estos medios y condiciones de cultivo hace posible la derivacion y el mantenimiento de lfneas de celulas ES humanas en condiciones definidas y controladas, sin una exposicion directa o indirecta a celulas animales de cualquier tipo, y tambien posibilita la derivacion de nuevas lfneas de celulas ES humanas que no han estado nunca expuestas a celulas animales o a un medio en el que se hayan cultivado celulas animales. El medio esta exento de productos animales o protefnas. Se ha demostrado que este medio permite la proliferacion de celulas ES indiferenciadas a traves de al menos veinticinco pases, lo que es una firme evidencia de que sustentara dichos cultivos indefinidamente. El medio preferido tambien ha demostrado ahora ser suficiente para permitir la derivacion de nuevas lfneas de celulas ES humanas, y estas nuevas lfneas han pasado a traves de mas de diez pases en cultivo. En el pasado, a veces ha existido la practica de referirse al uso de un medio condicionado como la creacion de condiciones de cultivo "exentas de alimentacion". Esta expresion es una denominacion incorrecta, ya que todavfa se requieren celulas alimentadoras de algun tipo para condicionar el "medio condicionado". En esta memoria se describen condiciones de cultivo que permiten el cultivo "independiente de un alimentador" de celulas ES humanas. Por "independiente de un alimentador" se entiende que no se necesitan celulas alimentadoras de ningun tipo, humanas o animales, en ninguna parte del proceso y no son necesarias ni para el cultivo ni para condicionar el medio. Las condiciones independientes del alimentador no requieren celulas alimentadoras en absoluto para ningun proposito.
Un medio definido y humanizado para el cultivo y la proliferacion de celulas ES humanas normalmente incluye sales, vitaminas, una fuente de energfa tal como glucosa, minerales y aminoacidos. Para complementar el medio y proporcionar unas condiciones que permitan el crecimiento celular, inicialmente los medios de cultivo de celulas madre inclufan suero procedente de una fuente u otra. Tambien se ha informado previamente de que la adicion de un factor de crecimiento de fibroblastos ademas de un aditivo de sustitucion del suero, permitira el cultivo de celulas ES humanas sin suero. El sustituto del suero puede ser un producto comercial disponible, vendido para ese proposito o puede ser una mezcla formulada de protefna, tal como albumina serica, vitaminas, minerales, una transferrina o un sustituto de transferrina, e insulina o un sustituto de la insulina. Este componente sustitutivo del suero puede complementarse tambien con selenio y con una mezcla de lfpidos. En la presente invencion se prefiere que, para cultivar celulas ES humanas, se utilice una mezcla de aditivo sustituto de suero definido, en lugar de un suero procedente de cualquier fuente, con el fin de evitar los aspectos de variacion en los componentes del suero y utilizar medios tan definidos como sea posible. Otros factores de crecimiento que se ha encontrado que son ventajosos para anadir al medio de cultivo son GABA, acido pipecolico, cloruro de litio y factor de crecimiento transformante beta (TGFp), aunque el TGFp puede no ser necesario con niveles crecientes de FGF anadidos al medio.
Para evitar la necesidad de una capa alimentadora de fibroblastos, que anteriormente se consideraba necesaria para mantener las celulas ES humanas en un estado indiferenciado, en esta memoria se describe que la combinacion del uso de mayores concentraciones de FGF (10 a 1000 ng/ml) junto con el uso de acido gamma amino butfrico (GABA), acido pipecolico, cloruro de litio y TGFp, permitira que un medio sustente el crecimiento de celulas madre indiferenciadas. Se ha encontrado que la combinacion de estos aditivos es suficiente para mantener indefinidamente el cultivo de celulas ES humanas en un estado indiferenciado, sin exposicion ya sea a celulas alimentadoras o a medios condicionados. Se ha demostrado que estos aditivos son suficientes. No obstante, no todos ellos pueden ser necesarios en todas las formulaciones de medios. Mediante una eliminacion selectiva de estos aditivos, se puede determinar empfricamente si uno o mas de ellos no son necesarios para conseguir este resultado para un medio dado. No obstante, queda claro que la combinacion es suficiente para permitir una variedad de medios que sustenten el cultivo a largo plazo y la proliferacion de celulas ES humanas indiferenciadas sin celulas alimentadoras o medio condicionado.
Estos constituyentes estan sujetos a alguna variacion. Por ejemplo, el LiCI se utiliza en el medio, ya que estimula la via wnt. Las wnts por si mismas u otros estimuladores de esta via como la activina, podrfan ser sustituidas como equivalentes de LiCl, aunque LiCl es probablemente el agente mas economico para este proposito. De forma similar, se cree que el GABA interacciona con el receptor de GABA, y las publicaciones cientfficas incluyen la identificacion de varias moleculas que son agonistas de ese mismo receptor y podrfan sustituir a GABA en el medio como un equivalente. Tambien se cree que PA tambien interacciona con el receptor de GABA. Aunque tanto PA como GABA resultaron ser utiles en el medio en las concentraciones usadas en esta memoria, tambien se preve que uno u otro de estos constituyentes podrfa incrementarse dramaticamente en concentracion para obviar la necesidad del otro. El factor de crecimiento de fibroblastos en altas concentraciones (40 a 100 ng/ml) parece eliminar la necesidad de utilizar celulas alimentadoras. El FGF que se prefiere es FGF basico, tambien descrito como bFGF y FGF2, pero otros FGFs que incluyen al menos FGF4, FGF9, FGF17 y FGF18 tambien seran suficientes para este proposito. Otros FGFs pueden funcionar tambien, incluso en concentraciones mayores.
Tambien es util incluir en las condiciones de cultivo de celulas ES humanas una matriz biologica en el recipiente del cultivo. Un material de este tipo que se ha utilizado previamente es Matrigel™, que es una membrana basal artificial procedente de celulas de raton, que se suministra como un producto comercial exento de celulas de raton. Sin embargo, el uso de Matrigel introduce en el cultivo un material que esta mal definido y que incluye material de origen murino. En esta memoria tambien se describe como crear una matriz biologica de protefnas humanas que sustituye completamente a Matrigel. Esta matriz esta compuesta por cuatro protefnas humanas: colageno aislado a partir de placenta humana, fibronectina aislada a partir de plasma humano, vitronectina aislada a partir de plasma humano y laminina aislada a partir de placenta humana. La combinacion de estas cuatro protefnas es suficiente, pero el uso de las cuatro puede no ser necesario para impulsar el crecimiento y el cultivo de celulas ES humanas. El uso de una matriz de este tipo sin una entre vitronectina, fibronectina o laminina, pero incluyendo las otras tres protefnas, favorece el cultivo de celulas ES, con cierta perdida de pureza en el estado de diferenciacion del cultivo de celulas ES. El metodo de preparacion de la matriz para el crecimiento de celulas ES se describe en los ejemplos de referencia siguientes.
Llegando a los aditivos del medio indicados anteriormente, se siguio la prueba metodica de mas de 80 factores de crecimiento individuales. Mientras que algunos de los aditivos parecfan, al menos en algunos pases, impulsar el crecimiento de celulas ES humanas en cultivo, muchos fracasaron en pases posteriores para mantener las celulas ES en un estado indiferenciado. Hemos sido capaces de identificar combinaciones de estos otros factores que dieron los resultados de los aditivos de medios descritos en los ejemplos de referencia a continuacion.
La observacion de que los cultivos de celulas madre embrionarias (ES) humanas se habfan mantenido previamente en un estado indiferenciado, solo cuando se cultivaban en presencia de celulas alimentadoras de fibroblastos, o en un medio condicionado, ha llevado a la especulacion de que los fibroblastos liberan en el medio un factor que actua para inhibir la diferenciacion de las celulas ES. Los datos presentados a continuacion demuestran que este no es el caso. Sin embargo, independientemente del efecto que esta mediado por las celulas alimentadoras de fibroblastos en el medio, ahora esta claro que los medios descritos a continuacion sustituiran ese efecto. El medio descrito a continuacion esta definido, no contiene celulas animales y permite un cultivo a largo plazo de celulas ES humanas indiferenciadas. Se presenta un ejemplo de un medio en el que las protefnas en el medio son todas humanas, para tener un medio “humanizado” y una matriz para impedir cualquier objecion relativa a productos subcelulares de origen animal.
Tambien se describe a continuacion la derivacion de nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas utilizando este medio. Estas lfneas de celulas ES humanas, por lo tanto, nunca han estado expuestas a celulas alimentadoras, a medio condicionado, a productos animales o a protefnas animales. Se ha informado previamente de que las lfneas de ES humanas anteriores presentan una forma de acido sialico (Neu5Gc) que no se encuentra de forma natural en las celulas humanas, ya sea en cultivo o en el cuerpo. Puesto que las lfneas de ES humanas anteriores adquirieron el Neu5Gc a partir de condiciones de cultivo que inclufan componentes murinos, las nuevas lfneas de celulas ES humanas descritas en esta memoria estaran y estan completamente exentas de Neu5Gc. Ejemplos de referencia
Los constituyentes del medio TeSR1, que se utilizo en todos los cultivos que se describen en esta memoria, salvo que se indique lo contrario, se recogen en la Tabla 1 a continuacion. Los experimentos preliminares del solicitante sugerfan que la proliferacion de celulas ES humanas indiferenciadas era optima a un pH de 7,2, una osmomolaridad de 350 mOsMol, y una atmosfera con 10% de CO2/ 5% de O2. Estas condiciones se emplearon en todos los cultivos posteriores descritos en esta memoria.
Aunque un medio con todos los constituyentes anteriores es suficiente y se prefiere, no todos los componentes son necesarios para el cultivo exitoso de celulas ES humanas. Dependiendo de la cantidad de celulas diferenciadas que se este dispuesto a tolerar, algunos de los componentes del medio se pueden omitir en un medio, particularmente si el medio se usa solo para unos pocos pases. Para investigar que constituyentes podrfan omitirse, se cultivaron celulas ES humanas sobre variantes del medio anterior, omitiendo diferentes componentes. Se extendieron en placas doscientas mil celulas y se cultivaron durante 7 dfas sobre los medios experimentales, dos pocillos por tratamiento. Las celulas se sometieron a ensayo despues para estudiar la expresion del factor de transcripcion Oct4, un marcador reconocido de celulas indiferenciadas. Los datos de ese experimento se presentan como un grafico en la Fig. 1, en donde los numeros de celulas que expresan Oct4 en cada medio experimental se presentan como una fraccion de las mismas desde el medio preferido TeSRI. Tengase en cuenta que el TGFp parece ser el componente menos necesario, al menos en presencia de altos niveles de FGF para un cultivo a corto plazo. Observese tambien que otros constituyentes omitidos dan lugar a porcentajes incrementados de celulas indiferenciadas, pero las diferencias son cuantitativas y el medio funciona sin esos componentes, al menos hasta cierto punto, para pases celulares limitados.
El medio tambien se ha utilizado para cultivar celulas ES humanas utilizando un nuevo material de matriz de origen humano. La nueva matriz se compone de las siguientes cuatro protefnas:
1. Colageno (aislado a partir de placenta humana) a una concentracion final de 10 pg/100 pl/cm2.
2. Fibronectina (aislada a partir de plasma humano) a una concentracion final de 5 pg/100 pl/cm2.
3. Vitronectina (aislada a partir de plasma humano) a una concentracion final de 0,2 pg/100 pl/cm2.
4. Laminina (aislada a partir de placenta humana) a una concentracion final de 5 pg/100 pl/cm2.
Para ensamblar esta matriz, el colageno se desnaturaliza con GuHCl 6 M (guanidina HCl), se filtra a traves de un filtro de 0,45 micrometros y se congela en partes alfcuotas. Despues de descongelar, el colageno desnaturalizado se diluyo en un PBS exento de Ca y Mg para alcanzar la concentracion final apropiada y se extendio en placas. Las placas recubiertas se incubaron a temperatura ambiente durante no menos de 1 hora, antes de que los componentes adicionales de la matriz se extendieran en placas. Despues de esta incubacion inicial, componentes adicionales de la matriz (Fibronectina, Vitronectina y Laminina) se diluyeron en un PBS exento de Ca y Mg para alcanzar la concentracion final apropiada y se extendieron en placas. Las placas recubiertas se incubaron a temperatura ambiente durante no menos de 1 hora antes de extender en placas las celulas ES humanas.
Usando el nuevo material de la matriz, celulas ES humanas de lfneas que existfan previamente se han cultivado durante un mfnimo de 10 pases, a la vez que permanecfan indiferenciadas y proliferaban.
Para someter a ensayo la estricta necesidad de los componentes de la matriz humanizada, se formularon variaciones de la matriz, omitiendo uno o varios componentes. Los datos de ese experimento se presentan en la Fig. 2. Las letras iniciales para cada condicion experimental representan las protefnas en la matriz (C-colageno, F-fibronectina, V-vitronectina y L-laminina). Observese que las membranas CFV, CVL y CFL funcionan bien y mantienen las celulas ES en un estado indiferenciado, pero simplemente no son tan propicias para el crecimiento de cultivos celulares como la condicion de la matriz CVFL.
Este medio tambien ha demostrado ser capaz de impulsar el inicio de nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas. El proceso de derivacion para nuevas lfneas puede ser una prueba diffcil para las formulaciones de un medio, pero el uso del medio definido permite crear nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas que no han estado expuestas a protefnas o a matrices animales y nunca han estado expuestas a celulas alimentadoras o a un medio en el que se habfan cultivado celulas alimentadoras. Se cree que esto es un logro novedoso.
Este trabajo se llevo a cabo solo despues de obtener la aprobacion de la junta de revision institucional y el consentimiento informado de los donantes. Se donaron embriones humanos congelados que fueron creados para protocolos humanos de fertilizacion in vitro, pero que excedieron las necesidades clfnicas. Los embriones se descongelaron y se cultivaron hasta la etapa de blastocisto, utilizando un sistema de cultivo de embriones secuencial, comercialmente disponible (serie Vitrolife-GIII). Despues de la eliminacion de la zona pelucida, la masa celular interna (ICM) de los blastocistos humanos se aislo mediante inmunocirugfa (Solter y Knowles, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:5099-5102) o como soportes completos cultivados (Evans y Kaufman, 1981, Nature, 292154-156) y se extendieron en placas de cultivo de 4 pocillos sobre el medio TeSR1 definido, con la matriz humanizada definida como se ha descrito anteriormente (CVFL). Despues de 48 horas iniciales de cultivo, el medio de cultivo TeSR1 se reemplazo diariamente. Despues de 14 a 21 dfas, se aislaron mecanicamente grupos de celulas y se volvieron a sembrar en placas con CVFL de nuevo aporte. El aislamiento mecanico continuo durante los 2 a 3 pases siguientes, despues de lo cual se realizaron pases en las colonias utilizando la enzima dispasa. Se confirmo que las nuevas colonias eran nuevas lfneas de celulas madre embrionarias humanas.
Utilizando el medio TeSR1 sobre los cuatro componentes de la matriz humana, identificados anteriormente, se derivaron dos nuevas lfneas de celulas ES humanas a partir de 5 blastocistos cultivados. En el momento de escribir este documento, ambas lfneas de celulas ES humanas han estado continuamente en cultivo durante 6 meses a traves de pases sucesivos. Las lfneas son estables y morfologicamente similares a las anteriores lfneas de celulas madre. Analisis con FACS y RT-PCR, y transferencia Western, demostraron que estas celulas expresan una serie de marcadores caracterfsticos de las celulas ES humanas. Los cuerpos embrionarios obtenidos a partir de estas lfneas celulares expresaban marcadores de las tres capas germinales, y ambas lfneas celulares formaban teratomas cuando se inyectaban en ratones SCID-beige. Despues de 4 meses en cultivo, una linea celular era XXY (sfndrome de Klinefelter) y la otra era cariotfpicamente normal. El sfndrome de Klinefelter es una de las anomalfas cromosomicas humanas mas comunes, lo que sugiere que esta anomalfa puede haber estado presente en el propio embrion, en lugar de un artefacto introducido por el proceso de iniciar el cultivo de las celulas madre.
TABLA 1 Formulacion completa del medio TeSRI
SALES INORGANICAS mM AMINOACIDOS mM
Cloruro calcico (Anhidro) 0,8232 L-Alanina 0,1392
HEPES 11,76 Clorhidrato de L-Arginina 0,5488
Cloruro magnesico (Anhidro) 0,2352 L-Asparagina-H2O 0,1392
Sulfato magnesico (MgSO4) 0,319088 Acido L-aspartico 0,1392
Cloruro potasico (KCl) 3,26144 L-Cistefna-HCl-H2O 0,0784 Bicarbonato sodico (NaHCO3) 11,2112 L-Cistina 2HCl 0,0784
Cloruro sodico (NaCl) 94,55824 Acido L-glutamico 0,1392
Fosfato sodico, dibasico (Anhidro) 0,392 L-Glutamina 2,96
Fosfato sodico, monobasico 0,355152 Glicina 0,296
(NaH2PO4-H2O)
L-Histidina-HCl-H2O 0,1176 MINERALES TRAZA L-Isoleucina 0,326144 Nitrato ferrico (Fe(NO3)3-9H2O) 0,00009408 L-Leucina 0,353584 Sulfato ferrico (FeSO4-7H2O) 0,001176 Clorhidrato de L-Lisina 0,391216 Sulfato de cobre (CuSO4-5H2O) 4,0768E-06 L-Metionina 0,090944 Sulfato de zinc (ZnSO4-7H2O) 0,001176 L-Fenilalanina 0,16856 Metavanadato sodico NH4VO3 0,000056 L-Prolina 0,2176
Sulfato de manganeso Mn SO4 H2O 1,00592E-05 L-Serina 0,296 Molibdato amonico 1,00404E-05 L-Treonina 0,352016 NiSO46H2O 4,94861E-06 L-T riptofano 0,0346528 Metasilicato sodico Na2SiO39H2O 0,004926108 L- Tirosina 2Na 2H2O 0,167776 SnCl2 5,32544E-06 L-Valina 0,354368 CdCl2 6,21931E-05
CrCl3 9,41176E-06 VITAMINAS
AgNO3 5,00293E-06 Acido ascorbico 0,375
AlCl36H2O 2,4855E-05 Biotina 1,12112E-05 Ba(C2H3O2)2 4,99217E-05 Cloruro de colina 0 0,0502544 CoCl26H2O 5,0021E-05 Pantotenato D-calcio 0. 0,0036064 GeO2 2,5337E-05 Acido folico 0,004704
KBr 5,04202E-06 i-Inositol 0,05488
KI 5,12048E-06 Niacinamida 0,012936
NaF 0,000500119 Clorhidrato de piridoxina 0,0076048 RbCl 5,00414E-05 Riboflavina 0,0004704 ZrOCl28H2O 9,03834E-05 Clorhidrato de tiamina 0,02460217
Vitamina B12 0,000392 FACTORES DE CRECIMIENTO GABA 0,979 SUSTRATOS
ENERGETICOS
Acido pipecolico 0,000984 D-Glucosa 13,72784 bFGF 5,80E-06 Piruvato sodico 0,392
LiCl 0,979
TGF beta 1 2,35E-08 PROTEINAS
LIPIDOS Insulina humana 0,0034438 Acido linoleico 0,0070976 Holotransferrina humana 0,14
Acido lipoico 0,00039984 Albumina serica humana 199,7
Acido araquidonico 0,001312
Colesterol 0,0113798 OTROS COMPONENTES
Acetato de DL-alfa tocoferol 0,02962 Glutation (reducido) 0,00592996 Acido linolenico 0,007184 Hipoxantina Na 0,01176
Acido mirfstico 0,008758 Rojo Fenol 0,0159936 Acido oleico 0,00708 Putrescina-2HCl 0,000394352 Acido palmitoleico 0,007862 Timidina 0,001176 Acido estearico 0,00703 2-mercaptoetanol 0,1
Selenio 0,000177304 Pluronic F-68 0,238
Tween 80 0,3358

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo in vitro para cultivar celulas madre pluripotenciales humanas sin la necesidad de celulas alimentadoras o medio condicionado, incluyendo el metodo la etapa de cultivar las celulas madre pluripotenciales humanas en un medio de cultivo que comprende, en cantidades suficientes para mantener las celulas madre en un estado indiferenciado a traves de multiples pases del cultivo, albumina, minerales, vitaminas, aminoacidos, glucosa, lfpidos, una transferrina o un sustituto de transferrina, insulina o un sustituto de insulina y todos menos uno de los siguientes constituyentes: factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico, TGFp y una sal de litio, estando el medio exento de celulas alimentadoras y sin haber estado expuesto nunca a celulas alimentadoras.
2. El metodo de la reivindicacion 1, donde la sal de litio es cloruro de litio.
3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde el medio comprende el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico y una sal de litio.
4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de al menos 40 ng/ml.
5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 40 ng/ml a 100 ng/ml.
6. Un cultivo celular in vitro que comprende en un recipiente de cultivo:
celulas madre pluripotenciales humanas;
un medio de cultivo, comprendiendo el medio de cultivo, en cantidades suficientes para mantener las celulas madre en un estado indiferenciado a traves de multiples pases de cultivo, albumina, minerales, vitaminas, aminoacidos, glucosa, lfpidos, una transferrina o un sustituto de la transferrina, insulina o un sustituto de insulina y todos menos uno de los siguientes constituyentes: factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico y una sal de litio, donde el medio esta exento de celulas alimentadoras y sin haber estado expuesto nunca a celulas alimentadoras; y
una matriz humanizada elaborada a partir de colageno humano y al menos una protefna humana seleccionada entre fibronectina, vitronectina y laminina.
7. El cultivo de la reivindicacion 6, donde la sal de litio es cloruro de litio.
8. El cultivo de la reivindicacion 6 o 7, donde el medio comprende el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 10 ng/ml a 1000 ng/ml, acido gamma amino butfrico, acido pipecolico y una sal de litio.
9. El cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de al menos 40 ng/ml.
10. El cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblastos en una concentracion de 40 ng/ml a 100 ng/ml.
11. El cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde la matriz incluye todos de entre colageno, fibronectina, vitronectina y laminina.
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