MX2011000123A - Diferenciacion de las celulas madre pluripotentes. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a métodos para diferenciar las células madre pluripotentes. En particular, la presente invención está dirigida a métodos y composiciones para diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo. La presente invención también proporciona métodos para generar y purificar agentes capaces de diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Description

DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE PLURIP0TEN La presente invención reivindica prioridad de la soli mero de serie 61/076,889, presentada el 30 de junio de 2008.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para dife lulas madre pluripotentes. En particular, la presente invención se d todos y las composiciones para diferenciar células madre plurip ulas que expresan marcadores característicos del linaje del e finitivo. La presente invención también proporciona métodos para rificar agentes capaces de diferenciar células madre pluripotentes e expresan marcadores característicos del linaje del endodermo de En el desarrollo embrionario de los vertebrados, u ripotencial da origen a un grupo de células que comprenden tres menes (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso cono trulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, stino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de rmedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de e initivo. Las células del endodermo definitivo expresan varios marcad o, por ejemplo, HNF-3beta, GATA4, MIXL1 , CXCR4 y SOX17.

La formación del páncreas se origina a partir de la diferen odermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del e creático expresan el gen de la homeosecuencia pancreático-duode ausencia de PDX1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la for yemas ventral y dorsal. Por lo tanto, la expresión de Pdx1 marca ica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro conti s tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino Los te idos e nes diabéticos inducidos con estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros (PNAS 99: 16105, 2002) el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhib oinositido 3-quinasa (LY294002) produjo células similares a las c En otro ejemplo, Blyszczuk y otros (PNAS 100:99 rma la generación de células que producen insulina a partir d dre embrionarias de ratón que expresan constitutivamente Pax4.

Micallef y otros reportan que el ácido retinoico puede promiso de las células madre embrionarias para formar en creático Pdx1 positivo. El ácido retinoico es más efectivo para resión de Pdx1 cuando se agrega a cultivos en el día 4 de difer células madre embrionarias, durante un período correspondi lización de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54:301 , 2005 iyazaki y otros reportan una línea de célula brionarias de ratón ue sobreex resan Pdx1. Sus resultados mbién observaron que el nivel de expresión de insulina y Pdx1 vio afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento F7 produjo una aumento en el nivel de transcripción para Pdx1 ( 79: 749, 2004).

Shiraki y otros analizaron los efectos de los fa cimiento que mejoran específicamente la diferenciación de célul brionarias en células Pdx1 positivas. Notaron que el TGF roduciblemente una proporción más elevada de células Pdx1 nes Cells. junio de 2005; 10(6): 503-16).

Gordon y otros demostraron la inducción de células end braquiuria [positiva]/ HNF-3beta [positivo] de células madre embri ón en ausencia de suero y en presencia de activina, junto con un in alización de Wnt (patente de los Estados Unidos núm. 2006/00034 Gordon y otros (PNAS, Volumen 103, página 168 man: "se re uirió la señalización simultánea de Wnt TGF be : 13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de puede evitar que se diferencien simplemente cultivándolas con el ibición de leucemia (LIF), las células madre embrionarias human ntenerse en condiciones muy especiales (patente de los Estad . 6,200,806; WO 99/20741 ; WO 01/51616).

D'Amour y otros describen la producción de cultivos enr l endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias hu sencia de una alta concentración de activina y bajo suero (D'Am os, 2005). Transplantar esas células debajo de la cápsula del ones produjo la diferenciación en células más maduras con cara algunos órganos endodérmicos. Las células de endodermo vado de células madre embrionarias humanas pueden, renciarse en células positivas al Pdx1 después de la adición d tente de los Estados Unidos núm. US 2005/0266554A1 ).

D'Amour otros (Nature Biotechnolo --24, 1392-140 En otro ejemplo, Fisk y otros reportan un sistema par ulas de los islotes pancreáticos de células madre embrionarias tente de los Estados Unidos núm. 2006/0040387A1). En este caso, renciación se dividió en tres etapas. Primero, las células madre em anas se diferenciaron en endodermo usando una combinación de ctivina A. Luego, las células se cultivaron con antagonistas del T o Noggin, en combinación con EGF o betacelulina para gener itivas para Pdx1. La diferenciación terminal se indujo mediante nicoti En un ejemplo, Benvenistry y otros afirman: "Concluim reexpresión de PDX1 mejoró la expresión de genes pa iquecidos, la inducción de la expresión de insulina puede requeri cionales que están presentes únicamente in vivo" (Benvenistr m Cells 2006; 24: 1923-1930).

La activina A es un miembro de la familia de TGF- ß qu amplia variedad de actividades biológicas, que incluyen la re ula n receptor. El receptor consiste de un complejo receptor hetero siste de dos tipos de receptores, tipo I (ActR-l) y tipo II (ActR-ll), tiene un dominio intracelular serina/treonina quinasa. Estos rece ilares estructuralmente con pequeñas regiones extracelulares teína y regiones intracelulares que consisten de dominios de q tR-l, pero no la ActR-ll, tiene una región rica en residuos de glicin minio GS) en el dominio de la yuxtamembrana. Primero, la acti e con la ActR-ll, que está presente en la membrana de la célula ma oligomérica con una quinasa constitutivamente activa. La A bién existe como una forma oligomérica, no se puede unir a la ausencia de ActR-ll. La ActR-l se recluta en un complejo c spués de la unión de activina A. Luego, la ActR-ll fosforila la Ac minio GS y activa su quinasa correspondiente.

El aislamiento y purificación de activina A es, frecue le a uede a menudo resultar en roducciones deficie En otro ejemplo, Arai, K. Y. y otros afirman: "Las acti tores de crecimiento multifuncional que pertenecen a la superf tor de crecimiento de transformación-ß. El aislamiento de act ntes naturales requiere varios etapas y únicamente produce c itadas. Aunque en estudios recientes se ha usado prep ombinantes, la purificación de activinas recombinantes aún ltiples etapas." (Protein Expression and Purification 49 (2006) 78 Se ha hecho esfuerzos considerables para desarr rnativa más potente o más económica para la activina A. Por ej ente de los Estados Unidos núm. US5215893 describe méto borar proteínas en cultivos celulares recombinantes que enas a ó ß de inhibina. En particular, se refiere a métodos para r DNA que codifica inhibina, y para elaborar variantes de inh íen de la secuencia de aminoácidos de inhibinas naturales, a anas los alelos de origen natural de éstas. ombinantes que contienen las cadenas a o ß de inhibina. En par ere a métodos para obtener y usar DNA que codifica inhibin borar variantes de inhibina que parten de la secuencia de amino ibinas naturales, animales o humanas y los alelos de origen natural En otro ejemplo, la patente de los Estados Uni 5665568 describe métodos para elaborar proteínas en cultivos ombinantes que contienen las cadenas a o ß de inhibina. En par iere a métodos para obtener y usar DNA que codifica inhibin borar variantes de inhibina que parten de la secuencia de amino ibinas naturales, animales o humanas y los alelos de origen natural En otro ejemplo, la patente de los Estados Uni 4737578 describe proteínas con actividad de inhibina que tienen u oximadamente 32,000 daltons. La molécula está compuesta de do tienen pesos moleculares de aproximadamente 18,000 y aproxim 000 daltons res ectivamente ue se unen entre sí or enlaces di -His-Cys-Ala-Cys-lle-OH, en donde R.sub.65 es lie o Arg. La cade conecta por enlaces disulfuro a la cadena de 14K.

Por lo tanto, prevalece una importante nece rnativas más económicas y más potentes para activina A que f renciación de las células madre pluripotentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona compuestos ca renciar células madre pluripotentes en células que expresan m acterísticos del linaje del endodermo definitivo. En una mod puestos capaces de diferenciar células madre pluripotentes e expresan marcadores característicos del linaje del endodermo péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de contienen or lo menos una mutación untual.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el árbol filogenético de péptidos TN 48.

La Figura 2 muestra el árbol filogenético de péptidos CTN 94.

La Figura 3 muestra la secuencia de ácidos nuclei uencia de aminoácidos de la pro-región de la activina A tipo silv clonó en pcDNA3.1(-).

La Figura 4 muestra la secuencia de ácidos nuciei ión madura de ACTN 1 , clonada en pcDNA3.1 (-).

La Figura 5 muestra la secuencia de ácidos nucleico longitud completa para ACTN 1 , que contiene la pro-región y dura, clonada en pcDNA3.1 (-).

La Fi ura 6 muestra la ca acidad de ACTN 1 ? ACT dición de la expresión de la intensidad de S0X17 con relac ulas control no tratadas.

Las Figuras 7A y 7B muestran los constructos de dos para obtener los péptidos de la presente invención. La estra la secuencia de ácidos nucleicos del gen de longitud com TN 1 , que contiene la pro-región y la región madura, cl NDER. Una representación gráfica del vector de expresión se n igura 7B.

Las Figuras 8A y 8B muestran la capacidad de ACT trol de activina A tipo silvestre clonados en sus respectivos ve resión mamífera para diferenciar células madre embrionarias células que expresan marcadores característicos del linaje del e initivo. La figura 8A muestra el efecto de los sobrenadantes en células de ensayo. La ACTN 1 clonada en pUNDER y un c ivina A ti o silvestre (OriGene clonada en CMV6-XL4 se tran sobrenadantes recolectados claros, o concentrados 10 baron en las diluciones mostradas en el bioensayo de e finitivo. Los datos mostrados representan los cambios con rela lulas no tratadas.

La Figura 9 muestra la expresión de los péptidos de la ención en sobrenadantes de células HEK293-F transfectadas co NDER que contienen los genes que codifican los péptidos d mpleta indicados (ACTN 2, ACTN 4, ACTN 5, ACTN 6, ACTN 7, y obtuvieron los sobrenadantes, y se analizaron mediante me stern; la membrana se analizó con un anticuerpo de activina A.

La Figura 10 muestra la expresión de los péptidos de l ención en sobrenadantes de células HEK293-F transfectadas co NDER que contienen los genes que codifican los péptidos d mpleta indicados (ACTN 9, ACTN 10, ACTN 11 , ACTN 12, ACTN , ACTN 17, ACTN 18, ACTN 19, ACTN 20, ACTN 21 , ACTN 22 i-activina A (Mab 3381 - lado izquierda de la mano), o un a iprecursor (Mab 1203 - lado derecho de la mano).

La Figura 12 muestra un perfil de purificación IMAC repr a ACTD 20. Después de cargar, la columna se lavó y la proteína una gradiente lineal de imidazol sobre 20 volúmenes de columna.

Las Figuras 13A-13F muestran los perfiles de eluci mbrana Western para las fracciones de imidazol para ACTD 1 ACTD 19, ACTD 20, ACTD 21 , y ACTD 22.

La Figura 14 muestra una membrana de Western repr a la expresión variante de follistatin de los sobrenadantes de l K293-F transfectadas con vectores que contienen los genes de ?? 1 , ACTA 2 y ACTA 3. La membrana se analizó con los an icados.

Las Figuras 15A y 15B muestran un perfil de purifi C representativo para ACTA 3 (Fi ura 15A . Des ués de íante de péptido ACTN 1 con el uso de una columna de afinidad Las Figuras 17A y 17B muestran la diferenciación d dre embrionarias humanas en células que expresan ma acterísticos del linaje del endodermo definitivo. La diferenci erminó con la medición del número de células (Figura 17A) y la i SOX17 (Figura 17B) con el uso de un IN Cell Analyzer 1 lthcare). Las células madre embrionarias humanas se trataron tro días con un medio que contiene 20 ng/ml Wnt3a más activina centraciones indicadas (barras negras) o un medio sin Wnt3a vina A las concentraciones indicadas (barras blancas).

La Figura 18 muestra la capacidad de ACTN 1 (barras na activina A de control (barras entramadas y barras solid renciar las células madre embrionarias humanas en células que readores característicos del linaje del endodermo definiti renadantes de las células HEK293-E transfectadas con ACTN brionarias humanas con el uso de activina A humana recombin dición de la intensidad de SOX17. Las células se trataron con activin centraciones indicadas durante cuatro días. Los datos mostrado eles de expresión medios de SOX17, tal como se detectaron con lyzer 1000 (GE Healthcare). La figura 19B muestra la capacidad d a diferenciar células madre embrionarias humanas en células que rcadores característicos del linaje del endodermo definit renadantes de las células HEK293-F (barras blancas) y las célul rras negras) transfectadas con ACTN 1 clonadas en pUNDER (pU control de activina A tipo silvestre (OriGene) clonado en pCMV dieron a las células madre embrionarias humanas en las conce icadas, y los niveles de expresión de SOX17 se determinaron c pués.

Las Figuras 20A y 20B muestran la curva estánd ivina A humana recombinante como se suministró or el fabrican porcentajes de células positivas de CXCR4 se muestran tamiento con activina A, o sin activina A o dos péptidos de riantes (ACTD3 y ACTD8), probados como materia prima de sob purificado o material purificado de IMAC.

Las Figuras 22A-22I muestran una intensidad por cien ra la expresión de SOX17 frente a una titulación de ncentraciones de péptidos dadas, en donde las concentra ptidos se calcularon previamente de los resultados de ELISA, po las curvas representativas comparan péptido de activin estre (ACTN1 ) con un péptido variante. El ajuste relativo para las curvas se muestra mediante valores de R2 representativos.

Las Figuras 23A-23H muestran los resultados al c mera etapa de diferenciación por medio del uso de medidas cit flujo, PCR, y de contenido alto para marcadores múltiples repre l endodermo definitivo. La fi ura 23A muestra el análisis FAC ra la expresión del gen S0X17 y F0XA2 al final de la primera renciación después del tratamiento con ACTN1 tipo silvestre o iantes ACTN4 ó ACTN48. La caja inserta muestra valores de a uno de los marcadores de genes.

Las Figuras 24A-24H muestran los resultados al fi cera etapa de diferenciación después del tratamiento con A estre o péptidos variantes ACTN4 ó ACTN48 durante la primera diferenciación. Los resultados representan análisis de contenido mero de células (figuras 24A y 24B), expresión de proteína uras 24C y 24D), expresión de proteína de CDX2 (figuras 24E ultados de RT-PCR para PDX1 ó CDX2 (figuras 24G y 24H) erta muestra valores de CT para cada uno de los marcadores de Las Figuras 25A-25B muestran los resultados de R l de la etapa cuatro de la diferenciación después del tratar TN1 tipo silvestre o péptidos variantes ACTN4 ó ACTN48 d DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a itación, la descripción detallada de la invención se divide en las s secciones que describen o ilustran ciertas características, moda icaciones de la presente invención. iniciones Las células madre son células indiferenciadas definid acidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenci ducir células progenitoras, que incluyen progenitores orrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferen a terminal. Las células madre también se caracterizan por su C a diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes c tir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ect como ara dar lu ar a te idos de múlti les ca as erminales de ticular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC ducir progenie que incluye HSC (autorrenovación), pr opotenciales restringidos a glóbulos rojos y todos los tipos y ulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes norma gre); (4) oligopotenciales, que se refiere a la capacidad de o grupo más restringido de linajes celulares que las célula ltipotenciales; y (5) unipotenciales, que se refiere a la capacidad d único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

Diferenciación es un proceso mediante el cual una ecializada ("no comprometida") o menos especializada, adq acterísticas de una célula especializada, tal como, por ejemplo, viosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferen renciada es una que toma una posición más especializada ("comp tro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando s ceso de diferenciación, se refiere a una célula ue ha se uido la renciación. Un marcador específico para el linaje se refier acterística específicamente asociada con el fenotipo de las célu je de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una prometida para linaje de interés.

"Linaje celular ß" se refiere a las células con expresión itiva para el factor de transcripción PDX1 y por lo menos u uientes factores de transcripción: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , 1 , HNF-3 beta, MAFA, PAX4, o PAX6. Las células que rcadores característicos del linaje de células ß incluyen células ß "Células que expresan marcadores característicos del odermo definitivo", "células de la etapa 1" o "etapa 1", como se sente descripción, se refiere a las células que expresan por lo men siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF-3 beta, GSC, CE F8, braquiuria, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FG esodermina (EOMES , DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, ulas del endodermo pancreático, células del tubo intestinal p ulas del intestino posterior.

"Células que expresan marcadores característicos dócrino pancreático", "células de la etapa 5" o "etapa 5", como presente descripción, se refiere a las células que expresan por o de los siguientes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , X4 o PTF-1 alfa. Las células que expresan marcadores caracterí je endocrino pancreático incluyen las células endocrinas pan células que expresan hormonas pancreáticas y las células secr rmonas pancreáticas y las células del linaje de las células ß.

"Endodermo definitivo", como se usa en la scripción, se refiere a las células que portan las característic lulas derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales cto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo resan los si uientes marcadores: HNF-3 beta GATA4 S0X17 minuido para un marcador negativo. El nivel detectable del ma ido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más b lulas de interés en comparación con otras células, de modo qu interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por i de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la téc "Célula mesendodérmica", como se usa en la scripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos u uientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX1 F-3 beta, GSC, FGF17 o GATA6.

"Célula endocrina pancreática", o "célula que e rmona pancreática", como se usa en la presente descripción, s a célula capaz de expresar por lo menos una de las siguientes h ulina, glucagon, somatostatina o polipéptido pancreático.

"Célula del endodermo pancreático", "célula de la e a a 4" como se usa en la resente descri ción se refiere a u lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, atostatina o polipéptido pancreático.

"Célula del intestino anterior", "célula de la etapa 3" o o se usa en la presente descripción, se refiere a una célu acidad de secretar por lo menos uno de los siguientes ma X1 , HNF1 , PTF1 alfa, HNF6, HB9, o PROX1.

"Célula de la línea preprimitiva", como se usa en la cripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos u uientes marcadores: Nodal o FGF8 "Célula del tubo intestinal primitivo", "célula de la et apa 2", como se usa en la presente descripción, se refiere a u la capacidad de secretar por lo menos uno de los rcadores: HNF1 , o alfa.

"Célula de la linea primitiva", como se usa en la cripción, se refiere a una célula que ex resa or lo menos u de estar dentro de la región de activina A que facilite la unión a un rnativamente, al menos una mutación puntual puede estar dentro d activina A que está dentro de la interfase homo-dímero.

Los péptidos de la presente invención pueden cont tación puntual. Alternativamente, los péptidos de la presente dén contener mutaciones de múltiples puntos. En una modalidad mutación puntual se determina al analizar la estructura cristalo ivina A, en donde los residuos de aminoácidos específicos se escog tación. Al menos una mutación puntual puede estar en la form erción de al menos un residuo de aminoácido. Alternativamente, al tación puntual puede estar en la forma de una deleción de al iduo de aminoácido. Alternativamente, al menos una mutación punt ar en la forma de una sustitución de al menos un residuo de aminoá La sustitución de al menos un aminoácido puede e ma de una sustitución de al menos un aminoácido aleatorio e aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: 101, 16F, 3 , 74F, 75A, 76N, 77L, 78K, 79S y 82V.

En una modalidad al menos una mutación puntual se tro de la secuencia de aminoácidos de activina A, a al menos u aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: 16F, 18V, 1 , 38N, 39Y, 41 E, 74F, 82V, 107N, 1091, 1 10V y 1 16S.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de la nción pueden encontrarse en la Tabla 1.

En una modalidad las secuencias de aminoácido tidos de la presente invención se traducen nuevamente en secu os nucleicos. La secuencia de ácido nucleico puede sinte rtarse en un vector de expresión para permitir la expresión en c míferos. La secuencia de ácidos nucleicos puede insertarse en expresión pcDNA3.1 (-). Alternativamente, la secuencia d leicos uede insertarse en una variante del vector cDNA3.1 - , resión que contiene una secuencia de ácidos nucleicos de un pé sente invención puede transfectarse de manera estable en una mífero. Cualquier método de transfección es adecuado para la ención. Dicho método de transfección puede ser, por ejemplo, tra diada por CaC , o transfección mediada por LIPOFECTAMINE™. mplo 2 para un ejemplo de un método de transfección adecuado.

La célula de mamífero puede ser cultivada en susp rnativamente, como una monocapa. Un ejemplo de célula de e puede emplearse para la presente invención puede encontra mplo 2, y una célula de mamífero alternativa que puede emple presente invención puede encontrarse en el Ejemplo 3.

En una modalidad alterna los péptidos de la presente eden expresarse en un sistema de expresión de la célula de un i rlo, por ejemplo, el sistema descrito en Kron, R y otros (J ological Methods 72 (1998) 9-14). mpotentes humanas. En una modalidad el sobrenadante se tes de la aplicación a células madre pluripotentes humanas.

En el caso en que los péptidos de la presente inv rifiquen del sobrenadante, los péptidos pueden purificarse usando nica de purificación de proteína adecuada tal como, por matografia de exclusión por tamaño. En una modalidad los pépt sente invención se purifican mediante cromatografía de afinidad.

En una modalidad los péptidos de la presente inv rifican por cromatografía de afinidad mediante un método que c etapas de: a. transfectar células con un vector que codifique u de la presente invención, b. permitir la expresión del péptido en las células, c. fraccionar las células y recolectar el sobrenad contiene el péptido, difican más para contener al menos una región que es capaz ecíficamente al ligando en el sustrato sólido en la columna de purif idad. En una modalidad los péptidos de la presente invención se s para contener al menos un lugar de unión metálica dentro de su aminoácidos. La modificación adicional puede consistir en la delec iduos de aminoácidos para formar la región que es capaz ecíficamente al ligando en el sustrato sólido en la columna de purif idad. Alternativamente, la modificación adicional puede consistir residuos de aminoácidos para formar la región que es capaz ecíficamente al ligando en el sustrato sólido en la columna de purif idad. Alternativamente, la modificación adicional puede consistir e residuos de aminoácidos para formar la región que es capaz ecíficamente al ligando en el sustrato sólido en la columna de purif idad. En una modalidad al menos un lugar de unión metálica consi iduos de histidina. En una modalidad los residuos de histidina se su En una modalidad alterna los péptidos de la presente purifican de acuerdo con los métodos descritos en Arai, K. otein Expression and Purification 49 (2006) 78-82). lamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes Caracterización de las células madre pluripotentes La pluripotencialidad de las células madre pluripotentes firmar, por ejemplo, al inyectar células en ratones con inmunod binada severa (SCID, por sus siglas en inglés), fijar los teratom an con el uso de 4 % de paraformaldehído y después a tológicamente para detectar la presencia de los tipos de células d as germinativas. Alternativamente, la pluripotencia se puede d la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos e a la presencia de marcadores asociados con las tres capas germi Las líneas de células madre pluripotentes propagadas s iotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G o, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fet cualquier momento durante la gestación, típicamente, esariamente antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de g ejemplos no limitantes son las líneas establecidas de célul brionarias humanas o células embrionarias germinativas huma o, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias hum y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composi a descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización ulas, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían la ripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejid mbién adecuadas son las células tomadas de una población d dre pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alime bién son adecuadas las líneas de células madre embrionarias tantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).

En una modalidad las células madre embrionarias hu dre pluripotentes de diferentes maneras. Alternativamente, las célul ripotentes se cultivan en un sistema de cultivo prácticamente libre entadoras, pero aún así, sustenta la proliferación de las célul ripotentes sin experimentar una diferenciación sustancial. El crecimie ulas madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin difer soporta con el uso de un medio acondicionado mediante el cultivo tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de las célul ripotentes en un cultivo libre de aiimentador, sin diferenciación, se s dio del uso de un medio definido químicamente.

Las células madre pluripotentes pueden colocarse re un sustrato de cultivo adecuado. En una modalidad el su tivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal c mplo, aquellos derivados de la membrana de base o que pued te de la adhesión molecular de los acoplamientos receptor-lig modalidad el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL re el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de promueve la supervivencia, propagación y retención de las cé características deseables. Todas estas características se benefi nción prestada en la distribución de sembrado y se puede d damente mediante alguien con conocimiento en la materia.

El medio de cultivo adecuado puede elaborarse uientes componentes tales como, por ejemplo, medio de Eagle m Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), Gibco núm. 11 dio de Eagle modificado por Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gi 29-018; medio basal DMEM F 2/50 % de Ham; 200 mM de L-g eo núm. 15039-027; solución aminoácida no esencial, Gibco 1 1 ercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor de crecimiento de fibr ico humano recombinante (bFGF), Gibco núm. 13256-029. mación de células productoras de hormonas pancreáticas a parti ulas madre pluripotentes característicos del linaje del endodermo definitivo que expresan marcadores característicos del l endodermo pancreático; y d. diferenciar las células que expresan marcadores cara del linaje del endodermo pancreático en células que marcadores característicos del linaje pancreático end En un aspecto de la presente invención la célula creática es una célula productora de hormonas pancreática pecto alternativo la célula endocrina pancreática es una c presa marcadores característicos del linaje de células ß. Una c presa marcadores característicos del linaje de células ß expresa nos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN3, X6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF-3 beta, MAFA, PAX4 o PAX6. En u la presente invención una célula que expresa marcadores cara l lina e de células es una célula .

CG2, cripto, CD9, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT nog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1 -60 o Tra1 -8 Los marcadores característicos del linaje del e finítivo se seleccionan del grupo que consiste de SOX17, GAT eta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteínas de la caja Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17 CR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente inv ropiada una célula que expresa al menos uno de los m racterísticos del linaje del endodermo definitivo. En un aspe sente invención una célula que expresa marcadores caracterí je del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores cara linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmi pecto alternativo una célula que expresa marcadores caracterí e del endodermo definitivo es una célula del endodermo definiti ccionan del grupo que consiste de NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , 4 y PTF-1 alfa. En una modalidad una célula endocrina pancreática expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, atostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es célula que expresa al menos uno de los marcadores características ocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención una c resa marcadores característicos del linaje endocrino pancreátic la endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática pued la que expresa la hormona pancreática. Alternativamente, la célula creática puede ser una célula que secreta hormona pancreática. mación de células que expresan los marcadores característicos endodermo definitivo En un aspecto de la presente invención las célula ripotentes se pueden diferenciar en células que expresan m acterísticos del lina e del endodermo definitivo or medio de sente invención durante aproximadamente un día a s ernativamente, las células madre pluripotentes se pueden trat dio que contiene un péptido de la presente invención oximadamente un día a aproximadamente cinco días. Alternat células madre pluripotentes se pueden tratar con un medio que péptido de la presente invención durante aproximadamente oximadamente cuatro días. Alternativamente, las célula ripotentes se pueden tratar con un medio que contiene un pép sente invención durante aproximadamente un día a aproxim S días. Alternativamente, las células madre pluripotentes se pue un medio que contiene un péptido de la presente invenció oximadamente un día a aproximadamente dos días. En una células madre pluripotentes se pueden tratar con un medio que péptido de la presente invención durante aproximadamente cuat Las células madre luri otentes ueden cultivarse s TRIGEL™ con factor de crecimiento reducido. Alternativamente, racelular puede ser la fibronectina. En una modalidad alterna l dre pluripotentes se cultivan y se diferencian sobre sustrato de do recubierto con suero humano.

La matriz extracelular se puede diluir antes de r trato de cultivo de tejido. Los ejemplos de métodos adecuados matriz extracelular y para recubrir el sustrato de cultivo de tejid ontrarse en Kleinman, H.K., y otros, Biochemistry 25:312 dley, M.A., y otros, J.Cell.Biol. 101 :151 1 (1985).

En una modalidad la matriz extracelular es MATRIG modalidad el sustrato de cultivo de tejido se recubre con MA una dilución de 1 :10. En una modalidad alterna el sustrato de do se recubre con MATRIGEL™ en una dilución de 1 : 15. Jalidad alterna el sustrato de cultivo de tejido se rec RIGEL™ en una dilución de 1 :30. En una modalidad alterna e una modalidad alterna el sustrato de cultivo de tejido se re TRIGEL™ con factor de crecimiento reducido en una dilución de 1 Las células madre pluripotentes se pueden tratar con contiene un péptido de la presente invención que se ha purif renadante de la célula que expresó el péptido. Alternativam ulas madre pluripotentes se pueden tratar con un medio que co tido de la presente invención que no se ha purificado del sobr la célula que expresó el péptido.

En el caso donde las células madre pluripotentes se t medio que contiene un péptido de la presente invención que ificado del sobrenadante de la célula que expresó el pé renadante se puede usar en una concentración oximadamente una dilución de 1 :10 a aproximadamente 1 :100 dalidad el sobrenadante se puede usar en una concentración oximadamente una dilución de 1 :10 a a roximadamente 1 :50 NMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECTGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCIPTKLRPMSMLYYDD NMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSD GACCVPTKLRPMSMLYYD ECDGKVNLCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFADMGACCIPTKLRP SMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDG VNYCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHAN CSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio ue contiene el si uiente En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD QNMIVEECGCS.

SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKC medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRP SMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCP SSLSFHSTVINHYR RGHSPFALMGACCIPTKLRP SMLYYDD NMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre luri otentes se t IQN IVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD IQN IVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCDGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANRGACCIPTKLRPMSMLYYDD ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGLC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSKMGACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNTCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio ue contiene el si uiente En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCTGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCVPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSD GSCCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCAGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCP medio que contiene el siguiente ECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSD GACCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMS LYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNTCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre luri otentes se t IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYD IQNMIVEECGCS.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD ECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQGMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQEFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQGMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFAQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio ue contiene el si uiente En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDD IQGMKVEECGCV.

SSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMS LYYD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFSQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQGMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQMFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRP S LYYD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQGMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre luri otentes se t IQGMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD QNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQRMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVN ICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVI NHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQGMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVN ICCKKQM FGKAKDIGWNDWI IAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPT LRPMSMLYYD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio ue contiene el si uiente En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYD IQN KVEECGCV.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECP SSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQRMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQGMKVEECGCT.

SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGEC medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDD IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANL SCCSPTKLRPMSMLYYD IQNMWEECGCT.

En una modalidad las células madre luri otentes se t IQNMKVEECGCT.

En una modalidad las células madre pluripotentes se t medio que contiene el siguiente ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGEC SSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYD IQRMVAEECGCT.

Detección de células que expresan marcadores característicos linaje del endodermo definitivo La formación de células que expresan m acterísticos del linaje del endodermo definitivo se puede deter dio de pruebas en presencia de los marcadores antes y después protocolo específico. Las células madre pluripotentes general resan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de la ripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.

La eficiencia de la diferenciación se uede determinar e subel y otros, suplemento de las ed, de 2001 )) e inmunoensayos, t nálisis inmunohistoquímico del material seccionado, transferencia \ a marcadores que son accesibles en células intactas, análisis por flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Anti oratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (19 Por ejemplo, las características de las célula ripotentes son del conocimiento de aquellos con experienc tería, y características adicionales de las células madre plur avía no han sido identificadas. Los marcadores de las célul ripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o má uientes: ABCG2, cripto, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT og, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, o Tra1 -81 Después de tratar las células madre pluripotentes todos de la presente invención, las células diferenciadas s ificar mediante la ex osición de una oblación de células tratad lquier método en la materia o cualquier método propuesto en esta i Por ejemplo, las células que expresan los m acterísticos del linaje del endodermo definitivo se pueden difer ulas que expresan los marcadores característicos del li odermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en S, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los m acterísticos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, ad ulas que expresan los marcadores característicos del li odermo pancreático al tratar las células que expresan los m acterísticos del linaje del endodermo definitivo con un f cimiento de fibroblastos y el inhibidor KAAD-ciclopamina de \ alización hedgehog, luego, al eliminar el medio que contiene el cimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina y, posteriorment células en un medio ue contiene ácido retinoico un f período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la p patente de tos EE.UU. núm. de serie 11/736,908 cedida a LifeSca En un aspecto de la presente invención las células que rcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se di emás, en células que expresan marcadores característicos del dodermo pancreático, por medio del tratamiento de las cé resan marcadores característicos del linaje del endodermo defi ido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblast período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la p patente de los EE.UU. núm. de serie 11/779,311 , cedida a LifeSc En un aspecto de la presente invención las cél resan marcadores característicos del linaje del endodermo de rencian, además, en células que expresan marcadores caracterí je del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de l e ex resan marcadores característicos del lina e del endodermo ado por los métodos de la presente invención. Además, por lo men or adicional puede aumentar la capacidad de las células que exp rcadores característicos del linaje del endodermo pancreático forma todos de la presente invención para formar otros tipos de células, o iencia de cualquier otra etapa adicional de diferenciación.

El por lo menos otro factor adicional puede ser, por tinamida, miembros de la familia TGF-ß, que incluyen TGF-ß úmina en suero, miembros de la familia de los factores de creci oblastos, factores de crecimiento -AA y -BB derivados de plaqueta en plaquetas, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I, II), renciación de crecimiento (por ejemplo, GDF-5, -6, -8, -10, -11), p el tipo glucagon (GLP-I y II), MIMETOBODY GLP-1 y GLP-2 ™, E o retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, a rocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de er dérmico EGF astrina I II uelantes de cobre tales como or ibidores hedgehog sónicos, o combinaciones de éstos.

El por lo menos otro factor adicional se puede pro diante medios condicionados obtenidos de lineas de células pa s como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC núm. CRL-1469), CAPAN m. HTB-79), BxPC-3 (ATCC núm. CRL-1687), HPAF-II (ATCC n 7), líneas de células hepáticas tales como, por ejemplo, Hep . HTB-8065), y líneas de células intestinales tales como, por s 74 (ATCC núm. CCL-241).

Detección de células que expresan marcadores característicos linaje del endodermo definitivo Los marcadores característicos del linaje del e creático son del conocimiento de aquellos con experiencia en la marcadores adicionales característicos del linaje del endodermo p avía no han sido identificadas. Estos marcadores se pueden firmar ue las células tratadas de acuerdo con la resente invenci je del endodermo pancreático.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadore teico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en l hos métodos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa tra rsa cuantitativa (RT-PCR), las técnicas membrana de Northern, h el lugar (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology ( suplemento de las ed. de 2001 )) e inmunoensayos, tales como unohistoquímico del material seccionado, transferencia Wester rcadores que son accesibles en células intactas, análisis por cito (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A nual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). mación de células que expresan marcadores característicos del l ócrino pancreático Las células que expresan los marcadores característicos endodermo ancreático se ueden diferenciar en células ue ex acteristicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, a ulas que expresan los marcadores característicos del linaje del e creático al cultivar las células que expresan los marcadores cara linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT uego al eliminar el medio que contiene DAPT y exendin 4 y, posterio tivar células en un medio que contiene exendin 1 , IGF-1 y HGF. Un e e método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006) Por ejemplo, las células que expresan los m acteristicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, ad ulas que expresan los marcadores característicos del linaje del e creático al cultivar las células que expresan los marcadores cara linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene e go al eliminar el medio que contiene exendin 4 y, posteriormente, células en un medio que contiene exendin 1 , IGF-1 y HGF. Un ej e método se describe en D' Amour coi, Nature Biotechnolo 20 acterísticos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, células que expresan los marcadores característicos del linaje creático, mediante el cultivo de las células que expresan m acterísticos del linaje del endodermo pancreático en un m tiene exendin 4. Un ejemplo de este método se describe en D' ., Nature Biotechnology, 2006.

En un aspecto de la presente invención las cél resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa más se diferencian en células que expresan marcadores carac linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las cé resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa un factor que inhibe la vía de señalización notch, de acuerd todos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. 736.908 cedida a LifeScan, Inc.

En un as ecto de la resente invención las cél resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa diferencian, además, en células que expresan marcadores carac linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las cé resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa un factor que inhibe la vía de señalización notch, de acuerd todos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. 953,178 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención, las cél resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa diferencian, además, en células que expresan marcadores carac linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las cé resan marcadores característicos del linaje del endodermo pa conformidad con los métodos descritos en la solicitud de paten .UU. núm. de serie 60/990,529.

En un as ecto de la resente invención la resente i receptor TGF-ß se selecciona del grupo que consiste de a ivina B, y activina C.

En una modalidad alterna el agonista del receptor TG una variante de péptido de activina A. Los ejemplos de tales var tidos se describen en la solicitud de patente de los Estados Uni serie 61/076,889, asignada a Centocor R&D, Inc.

Las células que expresan los marcadores caracterí je del endodermo pancreático se pueden tratar con por lo m tor adicional que aumenta la formación de células que rcadores característicos del linaje pancreático endocrino. Alternat lo menos el otro factor adicional puede aumentar la proliferaci ulas que expresan marcadores característicos del linaje p ocrino formado por los métodos de la presente invención. Adem nos el otro factor adicional puede aumentar la capacidad de las c resan marcadores característicos del lina e ancreático endocrin el tipo glucagon (GLP-I y II), MIMETOBODY GLP-1 y GLP-2 ™, o retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, rocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de er dérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, po ileno pentamina, forscolina, Na-Butirato, activina, betacelulina, IT tor de crecimiento de neuritas, nodal, ácido valproico, tricostatina sodio, factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), esfingosina 132 (EMD, CA), complementos N2 y B27 (Gibco, CA), esteroide como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de er ratinocita (KGF), proteínas de la familia Dickkopf, extracto de ina, proteína asociada a la neogénesis insular (INGAP), hedge gehog sónico, inhibidores de proteosomas, inhibidores de la ibidores hedgehog sónicos, o combinaciones de éstos.

El por lo menos otro factor adicional se puede pro diante medios condicionados obtenidos de líneas de células an conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y los m cionales característicos del linaje pancreático endocrino continú ntificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que l adas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado pa propiedades características del linaje pancreático endocrino. Los m ecíficos del linaje pancreático endocrino incluyen la expresión de u tores de transcripción tales como, por ejemplo, NGN3, NEUROD, o I Los marcadores característicos de las células del linaje del conocimiento de aquellos con experiencia en la mate rcadores característicos del linaje celular ß continúan siendo ide os marcadores se pueden usar para confirmar que las células tr erdo con la presente invención se han diferenciado para ad piedades características del linaje ß de células. Las cara ecíficas del linaje ß de células incluyen la expresión de uno o má transcri ción tales como or e em lo PDX1 en-1 ca a creático endocrino. Alternativamente, la eficacia de la difer de determinarse mediante la exposición de una población d adas a un agente (como un anticuerpo) que específicamente r marcador proteínico expresado por células que expresan m acterísticos del linaje celular ß.

Los métodos para evaluar la expresión de los marca o proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estánd tería. Dichos métodos incluyen la reacción en cadena de la p scriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern, h el lugar (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology ( , suplemento de las ed. de 2001)) e inmunoensayos, tales como unohistoquímico del material seccionado, transferencia Wester rcadores que son accesibles en células intactas, análisis por cito (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Anti orator Manual New York: Coid S rin Harbor Laborator Press 1 insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los méto sente invención producen aproximadamente 70 % de células posi ulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de l ención producen aproximadamente 60 % de células positivas a la i cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente ducen aproximadamente 50 % de células positivas a la insulina en o. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención oximadamente 40 % de células positivas a la insulina en un cultivo modalidad alterna los métodos de la presente invención oximadamente 30 % de células positivas a la insulina en un cultivo modalidad alterna los métodos de la presente invención oximadamente 20 % de células positivas a la insulina en un cultivo modalidad alterna los métodos de la presente invención oximadamente 10 % de células positivas a la insulina en un cultivo modalidad alterna los métodos de la resente invención una modalidad alterna las células producidas por los métodos de l ención producen aproximadamente 800 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 700 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 600 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la nción producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células producidas por los métodos de la nción producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de AD lalidad alterna las células roducidas or los métodos de la ención producen aproximadamente 80 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 70 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 60 ng.de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 50 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 40 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 30 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención producen aproximadamente 20 ng de péptido C/pg de AD dalidad alterna las células producidas por los métodos de la ención roducen a roximadamente 10 n de é tido C/ de ADN. o 2. Este método implica el cultivo de células madre pluripo renciación de células cultivadas in vitro en un linaje celula lementación en un paciente de células de un linaje celular ß.

Si fuese apropiado, el paciente puede, además, ser tr ntes farmacéuticos o bioactivos que facilitan la supervivencia y f células transplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo mbros de la familia de TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, rfogénicas del hueso (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -1 1 , -12 y -13), fa cimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento de quetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de er ulínico (IGF-I, II), factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial GF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farm dén incluir, por ejemplo, nicotinamida, péptido -I y -II del tipo gl LP-1 II GLP-1 2 MIMETOBODY™ Exendin-4 ácido retinoico receptor en un estado no diferenciado o parcialmente diferenci renciación puede ocurrir en el receptor.

Las células endodérmicas definitivas o bien la dodérmicas pancreáticas o bien las células ß pueden implanta ulas dispersas o formarse en grupos que puedan infundirse e rta hepática. Alternativamente, las células se pueden propor ortes poliméricos degradables biocompatibles, disposit gradabies porosos o encapsulados para protegerlas de la une del huésped. Las células se pueden implantar en un lugar un receptor. Los lugares de implante incluyen, por ejemplo, creas natural, espacio subcapsular renal, omento, peritoneo seroso, intestino, estómago o un bolsillo subcutáneo.

Para aumentar otra diferenciación, la supervivencia o ac células implantadas se pueden administrar factores adicionales t tores de crecimiento a entes antioxidantes o antiinflamatorios pia, y puede determinarla una persona con experiencia en la mat En un aspecto, esta invención proporciona un mét ar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar e método implica el cultivo de células madre pluripot renciación de células cultivadas in vitro en un linaje celula orporación de células en un soporte tridimensional. Las células s ntener in vitro en este soporte antes de su implante en el ernativamente, el soporte que contiene las células se puede ctamente en el paciente sin cultivo adicional in vitro. El soporte orporar opcionalmente con por lo menos un agente farmacé ilita la supervivencia y la función de las células transplantadas.

Los materiales de soporte adecuados para uso a los fi sente invención incluyen patrones de tejidos, conductos, barreras, y es para la reparación del tejido. En particular, los materiales n téticos en forma de es umas es on as eles hidro eles ente de los Estados Unidos núm. 6,306,424, patente de los Estad . 6,365,149, patente de los Estados Unidos núm. 6,599,323, pate ados Unidos núm. 6,656,488, solicitud de patente publicada de lo idos núm. 2004/0062753 A1 , patente de los Estados Unidos núm. 4, ente de los Estados Unidos núm. 6,333,029.

Para formar un soporte incorporado con un macéutico, este agente se puede mezclar con la solución polimé formar el soporte. Alternativamente, un agente farmacéutico ubrir sobre un soporte prefabricado, preferentemente, en presen rtador El agente farmacéutico puede estar presente como un lí lido dividido con precisión, o de cualquier otra forma física a ernativamente, los excipientes se pueden agregar al soporte par tasa de liberación del agente farmacéutico. En una modalidad orte se incorpora con por lo menos un compuesto farmacéutico puesto antiinflamatorio, tal como, or e em lo, los com uestos puesto farmacéutico que es capaz de aumentar la angiogé o, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud d licada de los Estados Unidos núm. 2004/0220393 y solicitud d licada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901.

Además el soporte se puede incorporar con por lo puesto farmacéutico que es un compuesto inmunosupresor, ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud de patente pub Estados Unidos núm. 2004/0171623.

El soporte puede también incorporarse a al menos un c acéutico que sea un factor de crecimiento tal como, por eje mbros de la familia TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, riogénicas del hueso (BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -1 1 , -12 y -13), fa cimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento de quetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento F-I, II factor de diferenciación crecimiento GDF-5 -6 -8 -10 -1 ??, tales como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud blicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y solicitud d licada de los Estados Unidos núm. 2004/0132729.

La incorporación de las células de la presente invenc ercóntigo se puede lograr mediante el depósito simple de las cél ercóntigo. Las células pueden entrar al supercóntigo por difusión diatr. Cirug. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Se han desarrollado otros enfo mentar la eficiencia de la propagación de la célula. Por ejemplo, l agitación se han usado en la propagación de condrocitos en sup ácidos poliglicólicos (BiotechnoL Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Otr ra la propagación de las células es el uso de la centrifugació duce un esfuerzo mínimo en las células sembradas y aumenta la la propagación. Por ejemplo, Yang y otros desarrollaron un nr brado de células (J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)), de o Centrifu ational Cell Immobilization CCI . racciones ligando receptor respectivas de los péptidos de activina tros miembros de la familia TGF-ß. El análisis de dos estructuras activina A (1 nyu y 1s4Y, ubicadas en el banco de datos de p://www.rcsb.org), identificaron un número de residuos de aminoá eden mutarse. Los residuos que se ubicaron en la interfase homo-leccionaron para mutación. Aunque una porción de los residuos es entación relativa de los monómeros en los cristales difiere significa r lo tanto, se escogieron dos grupos separados de residuos, uno a estructura cristalina. Los residuos de cisteína, glicina y proli iaron debido a que, frecuentemente, tienen roles estructurales di proteínas, tales como, por ejemplo, formación de enlaces de disul o de residuos de cisteína, o la adopción de ángulos de cadenas ccesibles por otros residuos, en el caso de residuos de glicina y pr Por medio del uso de la estructura cristalina del co ivina A con códi o db 1 n u los si uientes sitios se destin a uno de los 20 aminoácidos y exploró conformaciones f rgéticamente usando un procedimiento de Metrópolis Monte l de 93 diseños se seleccionaron junto con la secuencia de pé ivina A tipo silvestre. Estos se probaron de acuerdo con los méto sente invención. La Tabla 1 enumera las secuencias de amino péptidos de la presente invención. ACTN1 es la molécula de ac estre. ACTN 2 a ACTN 48 son secuencias de péptidos de la ención que se calcularon por medio del uso de la estructura crista ?? 49 a ACTN 94 son secuencias de péptidos de la presente se calcularon por medio del uso de la estructura cristalina 1 ieron dos secuencias de péptidos idénticas. La variabilida uencias de péptidos se muestra como un árbol filogenético en l a ACTN 2 a ACTN 48, y la Figura 2 para ACTN 49 a ACTN 94. mplo 2. Clonación y expresión de los péptidos de la presente inve diante la clonación de las secuencias codificantes que contiene ión de la proteína madura en el constructo de activin A tipo salva to, todos los constructos de expresión tienen activin A idéntica pro Las secuencias de aminoácidos para activin A tipo salvaj 93 variantes diseñadas en la Tabla 1 , se volvieron a traducir en s ADN por medio de la preferencia codónica humana, por medio del todos descritos en las patentes de los Estados Unidos núm. 6, 21 ,427, asignadas a Centocor R&D Inc. Las secuencias de meran en la Tabla 2. El aminoácido nativo y la secuencia de ADN er a traducir, para la pro región de activin A tipo salvaje se us meran en las Tablas 1 y 2, respectivamente. Cada secuencia de siste en el único pro dominio y en los 94 dominios de proteína m eró luego por el análisis de la secuencia en fragmentos más peque síntesis de estos como oligonucleótidos con el uso de la t NEWRITER™ Centocor R&D, US lue o se urificaron or álogo: V795-20) con el uso de los sitios Xbal y Notl (en cursiva, fragmento de ADN que codifica la proteína madura de activin go en este constructo pro región y se fundió en el marco p ión con el uso de SgrAI (en negrita subrayado) y los sitios de N para generar un precursor de construcción de expresión de cad gura 5). Los fragmentos de ADN que codifican la proteína m riantes ACTN 2 a ACTN 8 se clonaron luego de manera sim structo de la pro región para generar un precursor de construc presión de estas variantes. Como control positivo, una constr presión de activin A humana disponible en el mercado se iGene Technologies, Inc. (núm. de catálogo: TC118774). El n ceso para el ARNm de activin A humana en este clon es NM_00 ector de expresión de mamíferos es pCMV6-XL4.

Transfección y expresión de constructos génicos la e ividad de los recursores del constructo de activin A de ti o salv sfectaron en células HEK293-E en frascos de agitación sepa mi (Corning; núm. de catálogo: 431143) que contienen un medio diluyeron las células a 1.0 x 106 células por mi. El ADN total ( yó en 1.0 mi de Opti-Pro (Invitrogen; núm. de catálogo: 12309) ctivo de transfección FreeStyle Max (Invitrogen; núm. de catálog diluyó en 1.0 mi de Opti-Pro. El ADN diluido se adicionó al react x y se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Una alícuo ! complejo de ADN Max se adicionó a las células en el frasco y se a incubadora por 96 horas y se agitó a 125 RPM a 37 °C y 8 % C El sobrenadante se separó de las células por centrif 00 x g por 10 minutos y se filtró por medio de un filtro 0.2 pm m. de catálogo: 431153), luego se concentró 10 y 50 veces con Amicon Ultra Concentrator 10 K (núm. de catálogo: UFC9010 ntrifugó por aproximadamente 10 minutos a 3,750 x g.

Los sobrenadantes concentrados no concentrados se biar el constructo ACTN 1 de pcDNA3.1 (-) del vector de expresión expresión de mamífero pUnder de Centocor, que tiene acterísticas de expresión de manera consistente, probablemente d lusión de un promotor Intrón A contra corriente del núcleo CMV pror El gen precursor ACTN 1 de cadena larga se sub NA3.1(-) en pUnder con el uso de sitios en EcoRI y Hindlll (en n ura 7A y 7B). Tanto el constructo de activin A tipo salvaje ACTN 1 ju structo de OriGene se transfectaron de manera separada en células K293-F. Los sobrenadantes se prepararon como se indica anteriorir baron para actividad de activin A. Se encontró que los sobrenad structo ACTN 1 pUnder tienen una mayor actividad en el ensayo lar a juzgar por el número de células y el aumento de intensidad d los sobrenadantes del constructo OriGene tipo salvaje (Figura 8A y Debido a que la expresión de ACTN 1 del constructo p o resultado sobrenadantes con niveles más altos de activida sfectaron con el uso de células HEK293-F en frascos de arados de 125 mi (Corning; núm. de catálogo: 431143) con 20 mi diluyeron las células a 1.0 x 106 células por mi. El ADN total ( yó en 1.0 mi de Opti-Pro (Invitrogen; núm. de catálogo: 12309) y ctivo de transfección FreeStyle Max (Invitrogen; núm. de catálogo: yó en 1.0 mi de Opti-Pro. El ADN diluido se adicionó al reactivo dil e incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Una alícuota d plejo de ADN Max se adicionó a las células en el frasco y se colo ubadora por 96 horas y se agitó a 125 RPM, 37 °C y 8 % C02.

El análisis de membrana de Western se llevó a renadantes generados con el uso de constructos de la expresión p primeras siete variantes de activin A (ACTN 2 a ACTN 8). Se inclu troles de activin A tipo salvaje de OriGene y ACTN 1. La masa ente de estas dos proteínas de control fueron similares y consist masa molecular calculada de 26 kD. Se observó la ex resión de señal detectable se muestra en la Figura 10. El resto de varian lizaron para expresión en esta manera. tecedentes para los Ejemplos 3 y 4 rificación por afinidad de los péptidos de la presente invención El objetivo de esta sección es desarrollar un medio de p afinidad de las variantes de activin A. Este primer método, denom , consistió en introducir sitios de unión de metales en la sec inoácidos de los péptidos de la presente invención que permitier íante se uniera selectivamente a la matriz de afinidad del met íante bis-his que se una con alta afinidad a la matriz podía ser ¡de icaba a todas las variantes de activin A, este sitio bis-his orporado en el punto de ensamble de genes. Sin embargo, dado iantes se unen a una menor afinidad que las proteínas con etiquet tidina, la separación clara de otras proteínas endógenas con sitios metales similares era incierta. Para solucionarlo también se e mplo 3. Purificación de metal quelato de los péptidos de la presente i El primer método consiste en diseñar la molécula pa ctivamente a una cromatografía de matriz de afinidad del m eínas diseñadas se pueden etiquetar con una secuencia de pép ora la purificación de la proteina. La integración de una serie de re idina en la secuencia del péptido es un ejemplo por el cual la pr rés se puede purificar con el uso de una cromatografía de afinidad ovilizado (IMAC). IMAC se basa en la coordinación de enlace COV residuos de histidina con metales tales como, por ejemplo, cobalto . Después del enlace, la proteína de interés se puede extraer a tra bio de pH o al adicionar una molécula competitiva, tal como porcionando de esta forma un grado de purificación. Típicamente, lo histidina se introducen ya sea en la terminal N o C. Sin embargo, vin A se expresa como un péptido precursor, en donde ta N-te e, una eti ueta N-terminal se ierde durante el rocesamiento in ejemplo, Suh y otros, Protein Engineering, vol. 4, núm. 3, páginas 1. La Tabla 3 muestra la secuencia de aminoácido de los ccionados en los que se hicieron sustituciones de histidina.

Transfección de los péptidos de la presente inven tienen sustituciones de histidina: las secuencias del gen, que c tidos que se enumeran en la Tabla 3, se generaron e inserta tor pUnder de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemp ulas HEK293-F se transfectaron temporalmente como sigue: el sfección las células se diluyeron a 1 .0 x 106 células por mi en dio en frascos de agitación de 2 L separados (uno por vector) . de catálogo: 431255). El ADN total (937.5 µ?) se diluyó en ti-Pro (Invitrogen; núm. de catálogo: 12309) y 937.5 µ? de re sfección FreeStyle Max (Invitrogen; núm. de catálogo: 16447) 7.5 mi de Opti-Pro. El ADN diluido se adicionó al reactivo diluido ubó por 10 minutos a tem eratura ambiente. Una alícuota de sfectadas temporalmente se cultivaron cuatro días despué sfección, por centrifugación (30 min, 6000 rpm) y se filtraron mbrana PES, Corning). La cantidad relativa de proteína espe erminó con el uso de una activin A ELISA (R&D Systems; álogo: DY338) según las instrucciones del fabricante. Las mu centraron 4 veces con el uso de un concentrador LV Centramat verificaron por membrana de Western con el uso del anticuerpo d ivin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 3381 ) o anticuerpo pre i-activin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 1203) por dete ura 1 1 muestra un perfil representativo de diferentes variantes d pués de una concentración 4 veces de los sobrenadantes res muestras concentradas se diluyeron con 10x PBS a una conc l de 1x PBS, y otra vez 0.2 µ?t? filtradas. Los sobrenadantes se una columna equilibrada (20 mM a-fosfato, 0.5 M NaCI, pH7.4 Healthcare en una concentración relativa de a roximadamen centración de proteína específica se determino con el uso de u ELISA, como se estableció anteriormente. Cuando fue nece teínas purificadas se concentraron con el corte con un peso mol K (MWCO) en un concentrador centrifugo (Millipore). La calid teínas purificadas se evaluó con SDS-PAGE y membrana de We so de un anticuerpo de la anti activin A (R&D Systems; núm. de 1 ) o un precursor anti-activin A precursor (R&D Systems; álogo: 1203) para detección. Las Figuras 13A-13F muestran lo elución de membrana de Western para fracciones de imidazo ificaciones de péptido representativas. Las proteínas purifi acenaron a 4 °C.

Todos los constructos bis-his pares examinados se retr cromatografía de matriz de afinidad de metal, como se había pr bargo, debido a que estas mutaciones puntuales resultaron en un unión de metal la unión a la matriz fue no es ecífica las vari aración de proteínas no específicamente vinculadas. Sin emba écula no mostró una retención específica arriba del constructo bis- mplo 4: Purificación por folistatina de los péptidos de la presente i Un segundo método hacia la purificación de un ran iantes de activin A se tomó para explotar la alta interacción d re la folistatina y activin A. La folistatina es un antagonista natural que inhibe las interacciones del receptor tanto del tipo I y del tipo ue las variantes en la presente invención comprenden cambi rfaz del dímero y no el receptor de las superficies de unión, la una elección lógica para una matriz de afinidad ya que los camb ieron a las superficies de unión del receptor. La folistatina 2 iduos 1-288 y 1-315 de folistatina, respectivamente) se unen a ac afinidad muy elevada (aproximadamente 300 pM) mientra statina 12 y 123 (residuos 64-212 y residuos 64-288 de f ectivamente se unen con afinidad moderada a roximadamente a las variantes del gen de activin A en el ejemplo 2. L amblados se clonaron con el uso de los sitios de restricción dlll que preceden y siguen a cada una de las secuencias de ge tor de expresión mamifera Centocor pUnder (que se detalla en e usando los únicos sitios de restricción de EcoRI y Hindlll del vec Evaluación de la expresión de las variantes de la folist iantes (ACTA1 , ACTA2 y ACTA3) se transfectaron con el uso d K293-F en frascos de agitación de 2 L separados (uno po rning; núm. de catálogo: 431255) con un medio de 750 mi. Se células a 1.0 x 106 células por mi. El ADN total (937.5 µ?) se mi de Opti-Pro (Invitrogen; núm. de catálogo: 12309) y 93 ctivo de transfección FreeStyle Max (Invitrogen; núm. de catálog diluyó en 7.5 mi de Opti-Pro. El ADN diluido se adicionó al reacti x y se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Una al mi del com le o de ADN Max se adicionó a las células en el fr la variante de folistatina para el cultivo de sobrenadantes. Una ?? 3, se seleccionó para la expresión de extrapolación y purifica La extrapolación de ACTA 3: las células HEK sfectaron temporalmente en un biorreactor Applikon. El biorr bró a 4.0 x 106 células por mi el día antes de la transfe reactor se controló con el aire en el espacio de cabeza; O2 se i ontroló en un 50 % a través de la aspersión. El pH se controló arbonato sódico. Las células se agitaron con un impulsor RPM. Antes de la transfección el pH se mantuvo a 7.2 luego omento de la transfección.

Al momento de la transfección la concentración célul x 106 células por mi. El ADN total (1.25 mg /L) se diluyó en 5 ti-Pro, y 1.25 ml/L de reactivo de transfección FreeStyle Max se ml/L de Opti-Pro. El ADN diluido se adicionó al reactivo diluido ubó or 10 minutos a tem eratura ambiente. Una alícuota de 10 centración final de 1x PBS, y otra vez 0.2 pm filtradas. El sobren rgó en una columna equilibrada (20 mM Na-fosfato, 0.5 M Na Trap (GE Healthcare) en una concentración relativa de aproxim mg de proteína por mi de resina. Después de cargar se lavó la col rajo la proteína con una fase lineal de imidazol (10 mM, 50 mM, 0 mM y 500 mM). La Figura 15A muestra un perfil de purificación \ variante de folistatina ACTA3. La Figura 15B muestra la SDSPAG extracción para la purificación IMAC en la figura anterior. Las fracc e se extrajeron con 150 mM de Imidazol se agruparon y concentrar centrador centrífugo 10 K MWCO (Millipore). El material conce rgó en una columna equilibrada (PBS, pH7) 26/60 Superdex althcare) y se purificó mediante una cromatografía de exclusión p s fracciones que contienen ACTA3 se agruparon y concentrar centrador centrífugo 10 K MWCO (Millipore). La concentración de rificada se determinó or absorbencia a 280 nm en un es ectr proteína dializada. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo he a 4 °C. Al siguiente día, la resina folistatina-NHS-Sepharosa s erdo a las instrucciones del fabricante y se equilibró con PBS, pH7.

Purificación de los péptidos de la presente invención con cromatografía por afinidad ACTA 3: brevemente, los sobr ulares de las células HEK293-F temporalmente transfectadas se cos s después de la transfección, por centrifugado (30 min, 6000 rpm), (0.2 µ?? membrana PES, Corning). La cantidad relativa de ecífica se determinó por activin A ELISA (R&D Systems; núm. de 338) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se conc nos que o igual a 100 mi con el uso de un concentrador LV Céntram muestras concentradas se diluyeron con 10x PBS a una concentr 1x PBS y otra vez 0.2 pm filtradas. La resina de afinidad ACTA 3 e adicionó a los sobrenadantes diluidos y la mezcla se incubó durant °C. Al día si uiente la columna se lavó ia roteína se elu ificadas se concentraron con el corte con un peso molecular de 10 un concentrador centrifugo (Millipore). La calidad de las proteínas evaluó por SDSPAGE y membrana de Western. Las Figuras estran una purificación representativa de la variante de péptido ACT o de un anticuerpo anti activin A en la Figura 16A (R&D Systems álogo: 3381) o un anti-cuerpo anti-precursor en la Figura 16B (R&D . de catálogo: 1203) para detección por membrana de Western o ta en la Figura 16C. Las proteínas purificadas se almacenaron a 4 ° mplo 5. Cultivo celular de células madre embrionarias humanas Se obtuvieron las líneas H1 , H7 y H9 de célul brionarias humanas en el WiCell Research Institute, Inc., (Madi cultivaron de acuerdo con las instrucciones provistas por el in gen de las células. Las células madre embrionarias humanas ta braron en lacas recubiertas con factor de crecimiento mplo 6. Bioensavo de activin A El Activin A es un importante mediador de diferenciaci plio rango de tipos de células. Cuando se trata las célul brionarias humanas con una combinación de activin A y Wnt3a, var resentativos del endodermo definitivo se regulan en forma ascen ensayo que mide esta diferenciación en las células madre em anas fue adaptado en formato miniaturizado en placas de 96 po pósitos de evaluación. La validación se completó con el tratam ntes comerciales de proteínas recombinantes activin A y Wnt3a y la medición de la expresión de proteínas del factor de transcripció se considera un marcador representativo del endodermo definitivo Ensayo con células vivas: brevemente, se cultivaron ulas madre embrionarias humanas H1 o H9 sobre plástico de os recubierto con factor de crecimiento reducido MATRIGEL™ (I . de catálo o: 356231 . Las células recibieron asa es con trata El ensayo se inició lavando los pocilios de cada placa dos S seguido por la adición de una alícuota (100 µ?) de la muestra de dio basal de DMEM:F12 (Invitrogen; núm. de catálogo: 11330-03 ilio. Las condiciones de la prueba se realizaron por triplic entación en días alternos, aspiración y reemplazo del medio de ca muestras de prueba durante un periodo total de cuatro días de ens er y segundo día de ensayo, las muestras de prueba añadidas a I ensayo se diluyeron en DMEM:F12 con 0.5 % de FCS (HyClone; álogo:. SH30070.03) y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Systems; núm. de 4-WN). En el tercer y cuarto día del ensayo, las muestras de prueba s pocilios de ensayo se diluyeron en DMEM:F12 con 2 % de FCS, muestras de control positivo consistieron en activin A humano rec I protech; núm. de catálogo: 120-14) añadido a una concent ng/ml en todo el ensayo más Wnt3a (20 ng/ml) en los días 1 estras de control ne ativo omitieron el tratamiento con activin A W 924) se diluyó 1 :100 en suero de pollo al 4 % y se adicionó a ca una hora a temperatura ambiente. Se diluyó el anticuerpo s jugado Alexa Fluor 488 (chicken anti-goat IgG; Molecular Probes; álogo:) en una relación de 1 :200 en PBS y se añadió a cada estra después de lavarlo tres veces con PBS. Para la tinción de co ieos, se agregaron 4 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen; núm. de 570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas s vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para obtener ir La obtención de las imágenes se realizó mediante u alyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008 bs pa idas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exp imizaron a partir de pocilios de control positivo y a partir de p trol negativo no tratados teñidos con sólo anticuerpo secund genes a partir de 15 campos por pocilio se adquirieron para c cual uier erdida de célula durante el bioanálisis rocesos ltiplicada por el área de la célula. El antecedente se eliminó en ptación del criterio de los intervalos en la escala de grises en OO. Los datos totales de intensidad se normalizaron por medio d nsidad total de cada pocilio por la intensidad promedio tota trol positivo. Los datos normalizados se calcularon para el pro sviación estándar para cada conjunto duplicado.

Las Figuras 17A y 17B muestran la validación del e lección, que evalúa una curva de dilución doble de una fuente activin A (Peprotech) y mide el número de células (Figura nsidad de SOX17 (Figura 17B). Se observaron efectos óptimos or la inducción de la expresión de SOX17, generalmente, en el 100-200 ng/ml con un EC5o de 30-50 ng/ml. Excluir Wnt3a del tr días 1 y 2 del ensayo no produjo una expresión de SOX17 m sencia de activin A tampoco produjo ninguna expresión de SOX1 Estándares de rueba de activin A ti o salva e: dos c IE :F12 para crear una materia prima intermedia y lue icionalmente, dos veces en series antes de diluirlo finalmente 1 : cillo que contiene células y medio de ensayo (el rango de dilució sayo fue 1 :20 a 1 :640). Los resultados para la diferenciación d dre embrionarias para el endodermo definitivo según lo medid eles de expresión de SOX17 se muestran en la Figura 18. En es sistema de expresión de activin A tipo salvaje de OriGene, fue xpresión de ACTN 1. Concentrar el sobrenadante tipo salvaje d joró la actividad funcional aproximadamente 1.5-veces.

En un esfuerzo por mejorar el sistema de expresión, el ACTN 1 se movió posteriormente al vector de expresión mamífero precursor ACTN 1 de cadena larga se subclonó de pcDNA3.1(-) el uso de sitios EcoRI y Hindlll descritos en el Ejemplo 2. Tanto el activin A tipo salvaje ACTN 1 junto con el constructo de O nsfectaron de manera se arada en células CHO-S o HEK2 ura 19A, que mide los niveles de expresión de SOX17 como un m renciación del endodermo definitivo. Los resultados de compa ivin A OriGene y ACTN 1 en los diferentes sistemas de expresión e ensayo se muestran en la Figura 19B. La expresión de ACTN nificativamente con el uso del vector de expresión pUnder y células expresión de ACTN 1 en células CHOS mostró resultados ignificantes, incluso después de concentrar el sobrenadante. mplo 7. La capacidad de los péptidos de la presente invención p renciar células madre embrionarias humanas en células que exp rcadores característicos del linaje endodermo definitivo La alteración de determinados residuos de aminoáci uencia de activin A pueden tener efectos profundos s piedades funcionales de la molécula y, por lo tanto, puede rentes resultados biológicos. Los cambios pueden, or e em lo, dre embrionarias humanas H1 se cultivaron sobre plástico de os recubierto con factor de crecimiento reducido MATRIGEL™. L ibieron pasajes con tratamiento de colagenasa y raspado suave, a eliminar la enzima residual, y se plaquearon en una relación de superficie) en placas de 96 pocilios recubiertas con factor de er ucido MATRIGEL™. Se dejó que las células se unieran en gr go recuperar el crecimiento de la fase logarítmica en un período sf y se alimentaron diariamente con medio acondiciona lementado con 8 ng/ml de bFGF (R&D Systems; núm. de catálogo: El ensayo se inició con el lavado de los pocilios de cada es en PBS seguido por la adición de una alícuota (100 µ?) de la m eba en medio basal de DMEM:F12 (Invitrogen núm. de catálogo: 1 ada pocilio. Las condiciones de la prueba se realizaron por tripli entación en días alternos, aspiración y reemplazo del medio de ca muestras de rueba durante un eriodo total de cuatro días de e ativo omitieron el tratamiento con activin A y Wnt3a.

Los sobrenadantes de cada variante de péptido expr ibieron como materias primas concentradas, puras, 10x, o renadantes de prueba se diluyeron en 1 :4 o 1 :8 en DMEM:F12 ciones intermedias y luego diluir, adicionalmente, 1 :5 en cada sayo que contiene células y medio de ensayo (rango de dilució sayo 1 :20 ó 1 :40). Los sobrenadantes de los constructos de exp ¡Gene o ACTN 1 (cada uno correspondiente a una activin A tip ieron como controles positivos para estos ensayos.

Análisis de alto contenido: al concluir los cuatro días de cas de ensayo se lavaron dos veces con PBS, se fijaron co raformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, y aron tres veces con PBS y se permeabilizaron con 0.5 % de Tri rante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron s veces con PBS se blo uearon con suero de ollo al 4 % Invitro 570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas s vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para obtener i La obtención de la imagen se realizó mediante u alyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso del dicrotco 51008 bs pa idas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exp imizaron a partir de pocilios de control positivo y a partir de p trol negativo no tratados teñidos con sólo anticuerpo secund genes a partir de 15 campos por pocilio se adquirieron para c cualquier perdida de célula durante el bioanálisis y procesos teriores. Las mediciones para el número total de células e intens X17 se obtuvieron a partir de cada pocilio con el uso del rmático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La seg a los núcleos se determinó en función de los niveles de escalas ervalo de valores iniciales 100-300) y tamaño nuclear. Los pro viaciones estándar se calcularon ara cada con unto de du li Los resultados para la diferenciación de célula brionarias humanas para el endodermo definitivo, según lo medi eles de expresión de SOX17, se muestran en la Tabla 8. De la sel renadantes correspondientes a un subgrupo de variantes de p rían identificar como de actividad funcional significativa en el bioe odermo definitivo. En algunos casos, la actividad funcional d iantes del péptido mostró un efecto de valoración de la dosis, que ividad en la que el sobrenadante se concentró a 10x o 50x con rela estras puras, sin dilución; por ejemplo, las muestras de sobrenada TN 4 mostraron una potencia 2.6 veces más alta y ACTN 16 m ora 4 veces cuando se concentró en 10x con relación a sus sobr concentrados correspondientes. Algunas muestras no demostraro ividad funcional o tuvieron una actividad funcional marginal con r trol positivo. Esto puede reflejar diferencias en la expresión de la p rnativamente, uede refle ar un im acto ne ativo de las mutacione relación al estándar de tipo salvaje. mplo 8. Determinación de la concentración de proteína de los pé resente invención Fue importante poder medir las cantidades totales de pr ivin A en el cultivo de células sobrenadantes (puras o concentradas) muestras sujetas a varias estrategias de purificación. Esta fue esaría hacia la capacidad de comparar las variantes de los pépti s así como el control de tipo salvaje o de fuentes comerciales de a tal fin, un kit para activin A humana ELISA se validó con el kit e una fuente comercial diferente de activin A usada con el bioensay eriormente. En una etapa posterior, las muestras expresadas y puri ivin A más las variantes de péptidos de esta invención, se proba ayo ELISA para determinar una medida de la proteína total en cada Los sobrenadantes de cultivo celular muestras catálogo: 14190), Tween-20 (JT Baker; núm. de catálogo: X251-fúrico (JT Baker; núm. de catálogo: 9681-00), y urea (BioRad; álogo: 161-0731 ). El Activin A humano recombinante, según se el fabricante en el kit, se usó como un estándar de referenci idación de ELISA. Este material se diluyó dos veces en la serie par curva estándar de siete puntos con un estándar alto de 8 ng/ml, estra en la Figura 20A. Otra fuente comercial de activin A ombinante (Peprotech; núm. de catálogo: 120-14) también se alelo con el kit estándar y generó una curva estándar idéntica, tal estra en la Figura 20B, lo que indica el alto grado de reproducibilid ayo. Los sobrenadantes de cultivo celular (puros o concentra terial purificado (de las columnas de purificación por afinidad de TA 3) se diluyeron en series tales que las concentraciones s cular a partir de la parte lineal de la curva estándar. Los resultados todas las muestras se muestran en la Tabla 10. uido por la adición del complejo de ADN Max al frasco de cél o por 96 horas agitando a 125 RPM, 37 °C y 8 % C02. El sobr separó de las células por centrifugación a 5,000 x g por 10 min ó por medio de un filtro 0.2 µ?t? (Corning; núm. de catálogo: 4311 concentró 10 veces con el uso de un Amicon Ultra Concentrator 1 catálogo: UFC901096), y se centrifugó por aproximadamente 10 50 x g. Las muestras se almacenaron a 4 °C.

Los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron en se ñera que se pudieran calcular las concentraciones a partir de la p la curva estándar. Los resultados de ELISA de todas las mu estran en las Tablas 10 y 11. La Tabla 10 muestra un primer intent muestras a través de un amplio rango para encontrar la dilución a cada muestra dentro de la parte lineal de la curva estándar, ortante para poder calcular con precisión la concentración de la la 11 muestra un se undo ex erimento, con el uso de series d tiva de proteínas específicas. Un subgrupo de variantes de ntificados de la selección primaria en el Ejemplo 5 anterior eccionó para mutación bis-his adicional. Después de la ex centración de los cultivos de sobrenadantes correspondientes, las analizaron para la proteína total de activin A y los efectos funciona Transfección de los péptidos de la presente inven tienen inserciones de histidina Las secuencias de genes que co tidos bis-his ACTD 2 al ACTD 16 y sus respectivos constructos TN 1 , ACTN 16, y ACTN 34) como se indican en la Tabla 2, se ge ertaron en el vector pUnder de acuerdo con los métodos descri mplo 2. Las células HEK293-F se transfectaron temporalmente com de la transfección, las células se diluyeron a 1.0 x 106 células por mi un frasco de agitación. El ADN total se diluyó en Opti-Pro, y el r nsfección FreeStyle Max se diluyó en Opti-Pro. El ADN diluido se ctivo diluido Max se incubó or 10 minutos a tem eratura ambi tivo celular concentrado se analizaron para la proteína total de el uso de un kit DuoSet para activin A humana (R&D Systems; álogo: DY338) de acuerdo con las instrucciones proporcionad ricante, con la excepción de que las etapas de lavado se realizar es en cada etapa recomendada. Activin A humana reco inistrada por el fabricante del kit se usó como un estándar de r a la validación de ELISA. Las concentraciones de proteína de a ELISA calculadas para cada muestra, se muestran en la Tabla Ensayo con células vivas: brevemente, se cultivaron ulas madre embrionarias humanas H1 sobre plástico de cultivo ubierto con factor de crecimiento reducido MATRIGEL™ (BD BÍ . de catálogo: 356231) de acuerdo con los métodos descritos en Las células recibieron pasajes con tratamiento de colagenasa ve, se lavaron para eliminar la enzima residual, y se plaquearo ción de 1 :1 área de su erficie en lacas de 96 ocilios recubiertas mplazando el medio de cada pocilio con muestras de prueba d odo total de cuatro días de ensayo. En el primer y segundo día d muestras de prueba añadidas a los pocilios de ensayo se dil IEM:F12 con 0.5 % de FCS (HyClone; núm. de catálogo:. SH30 ng/ml de Wnt3a (R&D Systems; núm. de catálogo:. 1324-WN). E uarto día del ensayo, las muestras de prueba añadidas a los p sayo se diluyeron en DMEM:F12 con 2 % de FCS, sin Wnt3a. Las control positivo consistieron en activin A humana recombinante ( m. de catálogo:. 120-14) añadida a una concentración de 100 ng/ ensayo más Wnt3a (20 ng/ml) en los días 1 y 2. Las muestras gativo omitieron el tratamiento con activin A y Wnt3a.

Análisis de alto contenido: al concluir los cuatro días de cas de ensayo se lavaron dos veces con PBS, se fijaron co raformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, y aron tres veces con PBS se ermeabilizaron con 0.5 % de Tri estra después de lavarlo tres veces con PBS. Para la tinción de co leos, se agregaron 4 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen; núm. de 570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas s vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para obtener i La obtención de la imagen se realizó mediante u alyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008 bs pa idas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exp imizaron a partir de pocilios de control positivo y a partir de p trol negativo no tratados teñidos con sólo anticuerpo secund genes a partir de 15 campos por pocilio se adquirieron para c cualquier perdida de célula durante el bioanálisis y procesos teriores. Las mediciones para el número total de células e intens X17 se obtuvieron a partir de cada pocilio por medio del uso del rmático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La seg a los núcleos se determinó en función de los niveles de escalas l para el control positivo. Los ciatos normalizados se calcularo medio y la desviación estándar para cada conjunto duplicado. la Tabla 12 muestra los resultados de la actividad de las iantes de péptido de activin A, en donde los resultados para el n ulas y la expresión de SOX17 después de la formación del e nitivo en este ensayo se correlacionan con la concentración est ivin A de los resultados de ELISA. Es evidente que en el caso de la f vaje de las variantes del péptido (ACT 1 y sus variantes bis-his ACT tituyentes adicionales de histidina tuvieron poco o ningún im pecto a la formación del endodermo definitivo. Lo mismo también a las otras familias de variantes del péptido (ACTN16 y ACTN pectivas variantes bis-his (ACTD7-11 y ACTD12-16, respectiva de las cantidades adecuadas de proteína se adicionaron al ensayo f mplo 10. Análisis FACS de las células que expresan marcadores icionales de histidina incorporados para facilitar la depuración n acto en las propiedades de la molécula de activin A. En este ej ulas madre embrionarias humanas se sometieron al prot renciación del endodermo definitivo con el uso de una serie de -his del tipo salvaje nativo y dos moléculas de la variante.

Transfección de los péptidos de ¡a presente inve tienen inserciones de histidina: las secuencias del gen que c tidos ACTD3 y ACTD8 que se enumeran en la Tabla 3 se ge eriaron en el vector pUnder de acuerdo con los métodos descr mplo 2. Las células HEK293-F se transfectaron temporalme ue: El día de la transfección las células se diluyeron a 1.0 x 1 r mi en medio en frascos de agitación separados. El ADN total se ti-Pro, y el reactivo de transfección FreeStyle Max se diluyó en ADN diluido se adicionó al reactivo diluido Max y se incubó por 1 em eratura ambiente. Una alícuota del com le o de ADN Max s poralmente se cultivaron cuatro días después de la transfe trifugación (30 min, 6000 rpm) y se filtraron (0.2 pm membr ning). La cantidad relativa de proteína específica se determinó el uso de los métodos descritos en el Ejemplo 6. Las mu centraron 4 veces o 0 veces con el uso de un concentrador LV C ll) y se verificaron por membrana de Western con el uso del anticu i-activin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 3381) o anticuerpo pr i-activin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 1203) por detec uota de las muestras concentradas ACTD3 y ACTD8 se guar ificación adicional en este punto del ensayo con células vivas. Las centradas se diluyeron con 10x PBS a una concentración final de a vez 0.2 µ filtradas. Los sobrenadantes se cargaron en una uilibrada (20 mM Na-fosfato, 0.5 M NaCI, pH7.4) HisTrap (GE Heal concentración relativa de aproximadamente 10 mg de proteína ina. Des ués de car ar se lavó la columna se extra o la roteí logo: 1203) para detección. Cuando fue necesario, las proteínas p concentraron con el corte con un peso molecular de 10 K (MWC centrador centrifugo (Millipore). Las muestras se almacenaron a 4 ° Ensayo ELISA: sobrenadantes del cultivo ACTD3 (conc es), ACTD8 (concentrado 10 veces), y el material purificado de I a uno se analizaron en ELISA para medir la concentración to teína. Los sobrenadantes de cultivo celular concentrado se analiz roteína total de activin A con el uso de un kit DuoSet para activin D Systems; núm. de catálogo: DY338) de acuerdo con tas inst porcionadas por el fabricante, con la excepción de que las etapas realizaron cuatro veces en cada etapa recomendada. Se usó ana recombinante suministrada por el fabricante del kit como un referencia para la validación de ELISA. El sobrenadante conce ?3 estuvo presente en cantidad insuficiente para medición por E centraciones de roteína calculada ara el resto de muestras ción de 1 :1 (área de superficie) en placas de 96 pocilios recubiertas crecimiento reducido MATRIGEL™. Se dejó que las células se u pos para luego recuperar el crecimiento de la fase logarítmica en 1 a 3 días, y se alimentó diariamente con medio acondicion lementado con 8 ng/ml de bFGF (R&D Systems; núm. de catálogo: El ensayo se inició con el lavado de los pocilios de cada es en PBS seguido de la adición de una alícuota (100 µ?) de la eba en medio basal de DMEM:F12 a cada pocilio. Las condició eba se realizaron por triplicado en juegos de nueve pocilios, con ali días alternos, aspiración y reemplazo del medio de cada pocilio con prueba durante un periodo total de cuatro días de ensayo. En e undo día de ensayo las muestras de prueba añadidas a los p ayo se diluyeron en DMEM:F12 con 0.5 % de FCS (HyClone; álogo: SH30070.03) y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Systems; núm. de 4-WN . En el tercer cuarto día del ensa o las muestras dé rueba ino de cuatro días de cultivo los pocilios de ensayo se lavaron con las de nueve pocilios replicados para cada condición de trata lectaron como una suspensión de células individuales por un tr ve con TrypLE™ (Invitrogen; núm. de catálogo: 12604-013) por 3 a células se lavaron una vez en PBS antes del análisis FACS.

Análisis FACS: las células para análisis de FACS se bl una solución 1 :5 de 0.5 % de gamma-globulinas humanas (Sig catálogo: G-4386) en PBS (Invitrogen; núm. de catálogo: 14040- S amortiguador de tinción - BSA (BD; núm. de catálogo: 55465 utos a 4 °C. Las células se tiñeron con anticuerpos para CD9 . de catálogo: 555372), CD99 PE (Caltag, núm. de CD9904) y CXCR4 APC (R&D Systems; núm. de catálogo: FAB1 minutos a 4 °C. Luego de varias lavadas en amortiguador de ti S, la células se tiñeron para determinar la viabilidad con 7- . de catálo o: 559925 se evaluaron en una matriz BD FAC Era importante evaluar la actividad relativa y la pot a una de las variantes de péptidos comparadas con la molécula activin A tipo salvaje. En este ejemplo se seleccionaron y expré iantes de péptidos y los productos secretados se cua ividualmente por medio de ELISA a partir de los sobrenadantes centrado. Luego se analizó una valoración de la dosis de cad a actividad funcional en un protocolo de diferenciación de e initivo con el uso de células madre embrionarias humanas.

Transfección de los péptidos de la presente inven uencias del gen que codifica los bis-péptidos que se enumeran e se generaron e insertaron en el vector pUnder de acuerdo todos descritos en el Ejemplo 2. Las células HEK 293F se tran poralmente con el uso de un reactivo de transfección Free itrogen; núm. de catálogo: 16447). Las células se diluyeron a ulas or mi antes de la transfección ara 20 mi de volumen de tra mbrana PES, Corning). La cantidad relativa de proteína esp erminó por ELISA con el uso de los métodos descritos en el E ando fue necesario, los sobrenadantes de la proteína se conce .es con el uso de un Amicon Ultra Concentrator 3K (Millipore; álogo: UFC900396), centrifugado por aproximadamente 40 minut F, y se verificó por membrana de Western con el uso de un anticu ivin-A (R&D Systems; núm. de catálogo: 3381 ) o un anticuerpo i-activin-A (R&D Systems; núm. de catálogo: 1203) para dete rdaron alícuotas de las muestras concentradas ACTD3 y A rificación adicional en este punto para el ensayo con células vivas, adicionó a las muestras concentradas para una concentración fin go se pasaron a través de un filtro de 0.2 µ. Cuando fue nece teínas se concentraron 20 veces. Las muestras se almacenaron a El día de la transfección las células se diluyeron a ulas por mi en medio en frascos de agitación separados. El AD rning). La cantidad relativa de proteína específica se determinó n el uso de los métodos descritos en el Ejemplo 6. Las mu eentraron 4 veces o 10 veces con el uso de un concentrador LV C ll) y se verificaron por membrana de Western con el uso del anticu ti-activin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 3381) o anticuerpo pr ti-activin A (R&D Systems; núm. de catálogo: 1203) para detec uota de las muestras concentradas ACTD3 y ACTD8 se guar rtficación adicional en este punto del ensayo con células vivas. Las eentradas se diluyeron con 10x PBS a una concentración final de a vez 0.2 µ filtradas. Los sobrenadantes se cargaron en una uilibrada (20 mM Na-fosfato, 0.5 M NaCI, pH7.4) HisTrap (GE Heal a concentración relativa de aproximadamente 10 mg de proteína ina. Después de cargar, se lavó la columna y se extrajo la proteí díente lineal de imidazol (0-500 mM) más de 20 volúmenes de col cciones ico se a ru aron dializaron en contra de PBS H 7 centrador centrifugo (Millipore). Las muestras se almacenaron a 4 Ensayo ELISA: se probaron sobrenadantes de culti rentes péptidos ACTN, además de la molécula ACTN1 tipo s ISA para medir las concentraciones totales de proteína. Las mu lizaron con el uso de un kit DuoSet para activin A huma tems; núm. de catálogo: DY338) de acuerdo con las inst porcionadas por el fabricante, con la excepción de que las e ado se realizaron cuatro veces en cada etapa recomendada ivin A humana recombinante suministrada por el fabricante del estándar de referencia para la validación de ELISA. Los sobre centrados de ACTN56, ACTN65 y ACTN69 no estuvieron pre tidades suficientes para medirse por ELISA. Las concentrac teína calculada para el resto de muestras se muestran en la Tabl Ensayo con células vivas: se cultivaron brevemente, ulas madre embrionarias humanas H1 sobre lástico de cultivo uno a tres días, y se alimentó diariamente con medio acondicio lementado con 8 ng/ml de bFGF (R&D Systems; núm. de catálogo placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % CO2 durante todo el ensayo.

El ensayo se inició lavando los pocilios de cada placa PBS seguido por la adición de una alícuota (100 µ?) de la m eba a cada pocilio. Las condiciones del ensayo se realizaron por un período total del ensayo de cuatro días, la alimentación en el 3 por la aspiración y el reemplazo del medio de cada pocilio con eba nuevo. Con base en los resultados de ELISA para cada u renadantes concentrados de ACTN, una serie de dilución do rvalo de 3.1 ng/ml a 400 ng/ml, se construyó en un medio adec adición para el ensayo en el día 1 y el día 3. En el primer y segun sayo, las muestras de prueba añadidas a los pocilios de e yeron en DMEM:F12 suplementado con 0.5 % de FCS (HyClone álo o: SH30070.03 20 n /ml de Wnt3a R&D S stems; ensayo se lavaron una vez con PBS (Invitrogen; núm. de catálog do con paraformaldehido al 4 % (Alexis Biochemical; núm. de X-350-011) a temperatura ambiente por 20 minutos, luego se la es con PBS y se permeabilizaron con 0.5 % de tritón X-100 (Sig catálogo: T8760-2) por 20 minutos a temperatura ambiente. Las aron de nuevo tres veces con PBS y se bloquearon con suero d (Invitrogen; núm. de catálogo: 16110082) en PBS por 30 i peratura ambiente. El anticuerpo primario (goat anti-human SO stems; núm. de catálogo: AF1924) se diluyó 1 :100 en suero de p e agregó a cada pocilio durante dos horas a temperatura ambien lavar tres veces con PBS, un anticuerpo secundario Alexa jugado (chicken anti-goat IgG; Invitrogen; núm. de catálogo: ido 1 :200 en PBS se agregó a cada pocilio. Para los núcleos de añadió, 5 pg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen; núm. de catálogo: H minutos a tem eratura ambiente. Las lacas se lavaron una vez viaciones estándar se calcularon para cada conjunto de duplicados expresión de la proteína total se informó como la intensidad total o i grada, que se define como fluorescencia total de la célula por el ula. Los antecedentes se eliminaron sobre la base de criterios de a los rangos de escala de grises entre 200 y 4500. Los datos nsidad se normalizaron por medio de la división de la intensidad tot illo entre la intensidad promedio total para el control positivo.

En las Figuras 22A-22I, los resultados del ensayo m rcentaje de la expresión SOX17 frente a la concentración de pépti a una de las variantes de los péptidos ACTN, una curva de valo osis se muestra en relación con una curva similar del péptido A vaje. Los valores de ajuste de la curva (valores R2) también se in ultados de valoración de la dosis para todas las variantes de lo se combinan de cerca con la valoración de la dosis del péptid salva e, en donde la variabilidad en el cambio de la curva se mayor diferenciación hacia los linajes endodermo y endo ron dos péptidos ACTN representantes para diferenciar célul brionarias humanas en células que expresan marcadores cara linaje endodermo definitivo. A partir de entonces se aplicó un pr renciación por etapas a las células tratadas para pror renciación hacia los linajes del endodermo pancreático y end una muestra de control paralelo de células tratadas con el ti l péptido ACTN1 para comparación a través del proceso de difer r etapas. Se tomaron muestras en cada etapa de la diferencia erminar la aparición de las proteínas y el representante de biom ARNm de las diversas etapas de diferenciación Preparación de las células para el ensayo: se m tivos de materia prima de células madre embrionarias humanas SC) en estado diferenciado, pluripotencial en platos recubi TRIGEL™ con factor de crecimiento reducido acondicionado cultivo de mantenimiento rutinario o una relación 1 :1 para ediato. Todas las lineas celulares ES humanas se mantu tidades de pasajes menores que 50 y se evaluaron rutinariam probar el fenotipo cariotipico normal y la ausencia de contami oplasma.

Los grupos de células se volvieron a suspender unifor un medio MEF acondicionado y suplementado con 8 ng/ml brados en un factor de crecimiento reducido de MATRIGEL™ cultivo negras con 24 pocilios recubiertos (Arctic White; núm. de LS-303012) en volúmenes de 0.5 ml/pocillo. La alimentación ó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada mplazándolo con un volumen igual de medio nuevo. Las p ntuvieron a 37 °C, 5 % C02 durante todo el ensayo.

Ensayo: el ensayo se inició con la aspiración del tivo de cada ocilio la adición de una alícuota 0.5 mi del . de catálogo: 22400) con 2 % de albúmina bovina Fracción V os grasos (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc; núm. de catálogo: g/ml bFGF, y 20 ng/ml Wnt3a (R&D Systems; núm. de catálog /CF) y luego se adicionaron a los pocilios del ensayo. En el s er día del ensayo los péptidos ACTN se diluyeron en un me 0 suplementado con 2 % de BSA libre de ácidos grasos y 8 ng/ Wnt3a, y luego se adicionaron a los pocilios del ensayo. Una m trol positivo incluyó una fuente comercial de activin A (PeproTe catálogo: 12 0-14) diluido en medio de cultivo con factores de er o se indicó. Al término de los tres días de cultivo, las células d ilios se cosecharon para el análisis de citometría de flujo para e les de CXCR4, un marcador de la formación del endodermo pocilios adicionales se cosecharon para análisis de RT-PCR ? rcadores de diferenciación. Otros pocilios de cultivo se som lisis de alto contenido ara niveles de ex resión de la roteína S 330-032) suplementado con 2 % albúmina bobina Fracción idos grasos (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc; núm. de catálog ng/ml FGF7 (PeproTech; núm. de catálogo: 100-19), y 2 clopamina (Calbiochem; núm. de catálogo: 239804). El medi cillo se aspiró y reemplazó con una nueva alícuota (0.5 mi) en am La Etapa 3 del protocolo de diferenciación se lle rante cuatro días. Las células se alimentaron todos los días al edio de cada pocilio y reemplazarlo con una nueva alícuota ( MEM con alto contenido de glucosa (Invitrogen; núm. de catálo plementado con 1 % B27 (Invitrogen; núm. de catálogo: 1 ng/ml FGF7, 100 ng/ml Noggin (R&D Systems; núm. de catál G), 250 nM KAAD ciclopamina (Calbiochem; núm. de catálogo: mM ácido trans retinoico (RA) (Sigma-Aldrich; núm. de catálogo: rmino de la tercera etapa de diferenciación las células de algunos secharon ara el análisis de RT-PCR ara evaluar los mare ng/ml Netrin-4 (R&D Systems; núm. de catálogo:), 1 µ? DA ibidor M Alk 5 (Axxora; núm. de catálogo: ALX-270-445). Al tér rta etapa de diferenciación, las células de algunos pocilios se eo a el análisis de RT-PCR para evaluar los marcadores de diferenci Análisis FACS: las células para análisis de FACS se bloq solución 1 :5 de 0.5 % de gamma-globulinas humanas (Sigma; logo: G-4386) en PBS (Invitrogen; núm. de catálogo: 14040-133): ortiguadpr de tinción - BSA (BD; núm. de catálogo: 554657) por 15 . Las células se tiñeron con anticuerpos para CXCR4 APC (R&D . de catálogo: FAB173A) por 30 minutos a 4 °C. Luego de varias l ortiguador de tinción BD FACS, la células se tiñeron para dete ilidad con 7-AAD (BD; núm. de catálogo: 559925) y se evaluaro riz BD FACS. Como anticuerpo de control para APC se usó un i 1 k de ratón para determinar el porcentaje de células positivas.

Análisis RT-PCR: se purificaron muestras de ARN m Excepto que se afirme lo contrario, todos los rea praron de Applied Biosystems. Las reacciones de PCR en tiem arón a cabo usando el sistema de detección de secuencia ABI PRIS usó TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA) con N transcrito inverso en un volumen total de reacción de 20 µ?. Cad ADNc se realizó por duplicado para corregir errores de pipet iadores y las sondas TAQMAN® marcadas con FAM se centraciones de 200 nm. El nivel de expresión para cada gen malizó con el uso de gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa ano como control endógeno, desarrollado previamente po systems. Los conjuntos de iniciadores y sondas fueron como sigu plied Biosystems), FOXA2 (Hs00232764_m1 , Applied Biosystems 00751752_s1 , Applied Biosystems), CDX2 (Hs00230919_m1 , systems), PDX1 (Hs00236830_m1 , Applied Biosystems), 00360700 1 , A lied Bios stems , NKX6.1 Hs00232355 m1 dio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresi tiva se calcularon usando el método comparativo Ct. En resumen, estra de ADNc, el valor CT del control endógeno se sustrajo del CT rés para dar el valor delta Ct (ACt). La cantidad normalizada del culó como 2-ACt, asumiendo que la amplificación tiene una eficacia datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibració Análisis de alto contenido: al concluir los cuatro días de cas de ensayo se lavaron una vez con PBS (Invitrogen; núm. de 90), se fijaron con 4 % de paraformaldehído (Alexis Biochemical; álogo: ALX-350-011) a temperatura ambiente durante 20 minutos, ron tres veces con PBS y se permeabilizaron con 0.5 % de Trit ma; núm. de catálogo: T8760-2) durante 20 minutos a temperatura células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y se bloquearon pollo al 4 % (Invitrogen; núm. de catálogo: 16110082) en PBS por 3 m eratura ambiente. El anticuer o rimario oat anti-human SO ron para análisis incluyeron la dilución 1 :100 CDX2 de mouse a itrogen; núm. de catálogo: 397800), 1 :100 dilución de goat anti-hu nta Cruz Biotechnology; núm. de catálogo: SC-14664), 1 :200 d ulina rabbit anti-human (Cell Signaling; núm. de catálogo: C27C9), 500 glucagon de mouse anti-human (Sigma-Aldrich; núm. de 654). Los anticuerpos secundarios usados para el análisis ind ción 1 :400 de flúor Alexa 647 chicken anti-mouse IgG (Invitrogen álogo: A-21463), dilución 1:200 flúor Alexa 488 donkey anti vitrogen; núm. de catálogo: A11055), dilución 1 :1000 Alexa Fluor 6 i-rabbit IgG (Invitrogen; núm. de catálogo: A21443), y dilución 1 :1 or 488 chicken anti-mouse IgG (Invitrogen; núm. de catálogo: A2120 La obtención de la imagen se realizó mediante un IN Cel 00 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008 bs para células te echst 33342 y Alexa Fluor 488. Las imágenes se obtuvieron de 2 r pocilio. Las mediciones para densidad total se obtuvieron de ca nsidad se normalizaron al dividir la intensidad total de cada pocill nsidad promedio total para el control positivo.

Resultados: las Figuras 23A-23H muestran los result clusión de la primera etapa de diferenciación con el uso de cito , PCR, y la medida de alto contenido para varios marcad resentan el endodermo definitivo. La Figura 23A representa el análi a los niveles de CXCR4, que comparan el tratamiento con u ercial de activin A contra el tratamiento con ACTN1 tipo sa ultados demuestran una expresión de CXCR4 equivalente y s bos tratamientos. La Figura 23B muestra la expresión de CXCR4 iantes de péptidos (ACTN4 y ACTN48) comparada con el péptid salvaje; los resultados son equivalentes o comparables para amientos. La Figura 23C hasta la Figura 23F muestran el anális tenido para el número de células y la expresión de SOX17 al fi era etapa de diferenciación, para demostrar otra vez los r Las Figuras 24A-24H muestran resultados a la conclu cera etapa de diferenciación con el uso de PCR y la medida de a o contenido para varios marcadores representativos de e creático. El tratamiento con las variantes de péptidos ACTN4 y dujo un número equivalente de células y la expresión de la uivalente de PDX1 y CDX2, comparable a los resultados observ tamiento con el uso de activin A comercial o el péptido A lvaje. Los resultados de RT-PCR estuvieron en cumplimiento.

Las Figuras 25A y 25B muestran resultados de RT-P la primera etapa de diferenciación. Como antes, el tratamient riantes de péptidos ACTN4 y ACTN48 produjo una expresión co marcadores de diferenciación pancreática descendente con r tamiento con activin A comercial o el péptido ACTN1 tipo salvaje.

Estos resultados colectivos demuestran que las var tidos ACTN4 ACTN48 se ueden sustituir or Activin A d la 1 cuencias de aminoácidos de la pro región y regiones de proteína los péptidos de la presente invención Pro región: ctivin A tipo salvaje pro región (SwissProt/UniProt: P08476): . de ident. 1 LLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPN KXHILNMLHLKXRPDVTQPVPKAALLNAJRKLHVG VGEN EMTMELMEQTSEI1TFAESGTARKTLHFE1SKEGSDLSVVERAEVWLF TRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVD FPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRJACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEG EGGAGADEEKEQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRR Regiones de proteína madura: ctivin A tipo salvaje pro región (SwissProt/UniProt: P08476): . de ident. 2 CTN3: sec. con núm. de ident 4 ECDGKV LCCKKQDFVSFK IGWNDWIIAPSGYHA RCSGKCPSH SFHS INHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNII ECGCS CTN4: sec. con núm. de ident.5 ECDGKVNLCC KQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHA HCSGLCPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKIRPMSMLYYDDGQNIIKi ECGCS CTN5: sec. con núm. de ident.6 ECDG WT^CCK QNFVSFKDlGWNDWIIAPSGYHA ECSGKCPSHi SFHSTVI HYRMRGHSPFSNLGACCIPTTLRPMSMLYYDDGQNIIKX ECGCS CTN6: sec. con núm. de ident.7 ECDGKV LCCKKQWFVSFKJ)IG\\TNDWIIAPSGYHA RCSG CPSH ECDGKVNYCCKXQDFVSFK IGW DWIIAPSGYHANKCSG CPSHl SFHS INHYRMRGHSPFSD GSCCVPTi RPMSMLYYDDGQNnK ECGCS CTN9: sec. con núm. de ident.10 ECDGKV YCCKKQDFVSFKDIGW DWIlAPSGYHA KCTGKCPSHi SFHSWINHYRMRGHSPFADLGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCS CTN10: sec. con núm. de ident.11 ECDGKVOTCCKKQDFVSFKJDIGW DWIIAPSGYHA RCSGLCPSHI SFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIDK ECGCS CTN11: sec. con núm. de ident.12 ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGW DWIIAPSGYHANHCSGLCPSHI FHSTVI HYmRGHSPFAQMGACCIPTK-LRPMS LYYDDGQNIIKK ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDW1IAPSGYHANKCSGKCPSHI SFHSTVINHYR.MRGHSPFSDMGSCCIPTKLRP SMLYYDDGQNIIKK ECGCS CTN14: sec. con núm. de ident. 15 ECDGKVNLCCKKQHFVSF DIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHI SFHS TVINHYRMRGH SPFAQMG SCC VPTKLRPM SML YYDDGQNIII ECGCS CTN15: sec. con núm. de ident. 16 ECDGK\T^CCKKQDFVSFK IGW DWI]APSGYHANRCSGLCPSHI FHSTVmHYRMRGHSPFSNMGSCCIPT LRPMSMLYYDDGQNlIKKI) CGCS CTN16: sec. con núm. de ident. 17 ECDGKVNLCCK QLFVSFKDIGWNDW1IAPSGYHANHCSGLCPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFSQMGACCVPTKLRP SMLYYDDGQNIIKK ECDGKVWCCKKQNFVSFK IGWNDWIIAPSGYHA KCSGKCPSH SFHSTVmHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKIRPMSMLYYDDGQNIIK ECGCS CTN19: sec. con núm. de ident. 20 ECDGKV LCC QDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSH SFHSWINHYRMRGHSPFANMGSCCIPT 1RPMSMLYYDDGQNIIK ECGCS CTN20: sec. con núm. de ident. 21 ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGLCPSHI SFHSWINHYR RGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNDK ECGCS CTN21 : sec. con núm. de ident. 22 ECDGKVNYCC KQWFVSFKDIGW DWIIAPSGYHANKCSGKCPSH SFHST INHYRMRGHSPFA MGSCCIPTK RPMSMLYYDDGQNIIK ECDGKYNYCCI KQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCDGKCPSH SFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKIRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCS CTN24: sec. con núm. de ident. 25 ECDGKYNLCCKÍ QDFVSFKDIGWNDWJIAPSGYHANRCSGRCPSHI FHSTV1NHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKJ CGCS CTN25: sec. con núm. de ident. 26 ECDGKVNLCCKKQNFVSF DIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHJ FHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNII KD CGCS CTN26: sec. con núm. de ident. 27 ECDGKV LCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHI SFHSTV1NHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNII ECDGKVNYCC KQLFVSFKDTGWNDWlIAPSGYHANHCSGKCPSHi SFHSTVI HYRMRGHSPFANMGSra ECGCS CTN29: sec. con núm. de ident.30 ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGW DWIIAPSGYHANHCSGKCPSHI FHSTVI HYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK CGCS CTN30: sec. con núm. de ident.31 ECDGKV YCC KQNFVSF IGWNDWIIAPSGYHAmCSGLCPSHI SFHSTVI H YRMRGH SPFSKMG ACC VPTKLRPM SML YYDDGQN11K ECGCS CTN31 : sec. con núm. de ident.32 ECDGKVNTCC KQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHI FHSTVI HYRMRGHSPFSD GSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECMG CPSH SFHSTVINHYRMRGHSPFSD GACCIPTK1RPMSMLYYDDGQNIIK ECGCS CTN34: sec. con núm. de ident. 35 ECDGKVNYCCK QLFVSFK IGWNDWIIAPSGYHANHCTGKCPSHi SFHSWINHYRMRGHSPFSDLGSCCVPTKLRP SMLYYDDGQN1IK ECGCS CTN35: sec. con núm. de ¡dent. 36 ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHA RCSGKCPSHI SFHSWI HYRMRGHSPFSD GSCCVPT IRP SMLYYDDGQNIIK ECGCS CTN36: sec. con núm. de ¡dent. 37 ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWTIAPSGYHANRCSGKCPSHI SFHSWINHYRMRGHSPFA MGACCYPTKLRPMSMLYYDDGQNII ECDGKV LCCKKQDFVSFKDIGWNDWTIAPSGYHANKCGGKCPSHT FHS INHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCS TN39: sec. con núm. de ident. 40 ECDGKV LCC KQNFVSFKDIGWNDWTIAPSGYHANECSGLCPSHIA HSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKIRPMSMLYYDDGQNIIKK GCS TN40: sec. con núm. de ident. 41 ECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGW DWIIAPSGYHANHCAGLCPSHI FHSTVmHYRMRGHSPFSNMGSCCVPT IRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCS TN41 : sec. con núm. de ident. 42 ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIA HSTVTNHYRMRGHSPFSDRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKD ECDGKV YCCKKQDFVSF DIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSH SFHSTVI^HYRMRGHSPFSDMGACCVPTKIRPMSMLYYDDGQNII ECGCS CTN44: sec. con núm. de ident.45 ECDGKVh^CCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHI FHSTV1 HYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIK CGCS CTN45: sec. con núm. de ident.46 ECDGKV TCCKXQNFVSFK IGAVNDWIIAPSGYHANECSG CPSHI FHSTVI HYR RGHSPFA MGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK CGCS CTN46: sec. con núm. de ident.47 ECDGKVNLCC QNFVSF DIGWNDWIIAPSGYHANECGGLCPSHI. SFHSTVINHYRMRGHSPHA RGACCIPTKLRPMS LYYDDGQNIIK ECDGKVNLCCKKQNFVSF DIGWNDWI1APSGYHANECSGLCPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFA MGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNEKK CGCS CTN49: sec. con núm. de ident.50 ECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDW11APSGYHANRCDGLCPSHI SFHSTVINHYRMRGHSPFSD GSCCVPT LRPMSMLYYDDGQNIIK ECGCS CTN50: sec. con núm. de ident.51 ECDGKVN1CC KQLFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPVA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNI1KK ECGCT CTN51: sec. con núm. de ident.52 ECDGKVNICC KQSFGQTKDIGW DWTÍAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVI HYRMRGHSPFA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECDGKVNICCKKQEFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVI JHYRMRGHSPWA L SCCSPTKLRP SMLYYDDGQN]] K ECGCT CTN54: sec. con núm. de ident.55 ECDGKVNICCKKQSFAQT DIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFA LKJSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQN1IKKJ ECGCT CTN55: sec. con núm. de ident.56 ECDG VN1CCKKQSFGQT DIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVI HYRMRGHSPWA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNI1KK ECGCT CTN56: sec. con núm. de ident.57 ECDGKVNICCKKQSFGQA D1GWNDW1IAPSGYHGGSCTGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFA LK.SCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNI1KK ECDGKVNlCCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHJ HSTVINHYRMRGHSPWA LKSCCSPTKLRP SMLYYDDGQNnK ECGCT CTN59: sec. con núm. de ident.60 ECDGKV 1CC KQLFGQT DIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSH1 HSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCV CTN60: sec. con núm. de ident.61 ECDG VN1CCK QSFGQT J)IGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI HSTVINHYmRGHSPWA LKSCCAPTKIRPMS LYYDDGQNIIKK ECGCV CTN61: sec. con núm. de ident.62 ECDGKVNICCK QLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIA HSTVINHYRMRGHSPNA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECDGKV ICCKKQSFSQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVINHYRJV1RGHSPFA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN64: sec. con núm. de ident.65 ECDGKV ICCKXQSFGQTKDIGW DWIIAPSGYHGGGCSGECPSH1 FHSTVINHYRMRGHSPWA L SCCSPTKLRPMS LYYDDGQNIIKK ECGCT CTN65: sec. con núm. de ident.66 ECDGKWICCKJ QSFGQT IGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFANL JSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN66: sec. con núm. de ident.67 ECDGKVNICC KQMFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSH SFHSTVINHYRMRGHSPWA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIK ECDG VNICCKJ QSFGKAK IGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVI HYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN69: sec. con núm. de ident.70 ECDGKVNICCKKQSFG TKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVI HYRMRGHSPFANLK^CCSPTKiRP SMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN70: sec. con núm. de ident.71 ECDG V ICC1 KQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPVA L SCCSFTKLRPMSMLYYDDGQNIIKX ECGCT CTN71: sec. con núm. de ident.72 ECDGKV ICCKKQSFGQA DIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSH1 FHSTVI HYRMRGHSPFA LKSCCSPT IRPMSMLYYDDGQNIIKK ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDW1IAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFANLK5C ECGCT CTN74: sec. con núm. de ident. 75 ECDGKWICCKKQSFGRAKD1GW DWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN75: sec. con núm. de ident. 76 ECDGKVNICC KQSFGQA DIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPWANL SCCSPTKLRP SMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN76: sec. con núm. de ident. 77 ECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDW1IAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPNA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNII K ECDGKVNICCKL QLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRJViRGHSPVA LK^ ECGCT CTN79: sec. con núm. de ident.80 ECDG VNICC KQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVmHYRMRGHSPWANL SCCSPTKLRP SMLYYDDGQNllK ECGCT CTN80: sec. con núm. de ident.81 ECDGKV ICCK QSFGQTK IGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVmHYRMRGHSPWANLKSCCAPTlO.RPJVISMLYYDDGQNIIÍ ECGCV 3TN81 : sec. con núm. de ident.82 ECDG VNICCKKQLFG TKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIJK.K ECDGKVTsflCCKKQSFGRAKDIGW DWIIAPSGYHGGGCTGECPSHl FHSTVINHYRMRGHSPFA L SCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN84: sec. con núm. de ident. 85 ECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPFA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNII ECGCT CTN85: sec. con núm. de ident. 86 ECDGKVN1CCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPVA L SCCSPTK RPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN86: sec. con núm. de ident. 87 ECDGKV ICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVINHYRMRGHSPWA LKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECDGKV ICC KQSFGQTKDIGW DWIIAPSGYHGGGCSGECPSH1 FHSTVINHYRMRGHSPWA LKSCCSPTK1RPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN89: sec. con núm. de ident.90 ECDGKV ICC KQLFGQTKDIGWNDW1IAPSGYHGGGCSGECPSHI FHSTVI HYRMRGHSPNA LKSCCSPTKLRP SMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN90: sec. con núm. de ident.91 ECDGKV ICC KQSFGQTíDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHI FHSTVmHYRMRGHSPFA LKJSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN91 : sec. con núm. de ident.92 ECDG V ICC KQSFGRT DIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSH1 FHSTVINHYRMRGHSPWA LKSCCSPTKlRPMS LYYDDGQNni ECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI HSTVI HYRMRGHSPFANLKSCCSPTKIRPMSMLYYDDGQNIIKK ECGCT CTN94: sec. con núm. de ¡dent. 95 ECDGKVN1CCKKQSFGQAKD1GWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHI FHSTVmHYRMRGHSPWA LKSCCSPTKLRP SMLYYDDGQNIlKK ECGCT la 2 cuencias de ADN que codifican los péptidos de la presente invenci Pro región: ctivin A tipo salvaje pro región sec. con núm. de ident. 96 GCCCTTGCTTTGGCTGAGAGGATTTCTGTTGGCAAGTTGCTGGAT GGAGTTCCCCCACCCCAGGATCCGAGGGGCACAGCGCGGCCCCC GTCCTGTGCGCTGGCCGCCCTCCCAAAGGATGTACCCAACTCTCA ATGGTGGAGGCCGTCAAGAAGCACATTTTAAACATGCTGCACTT GACCCGATGTCACCCAGCCGGTACCCAAGGCGGCGCTTCTGAAC AAAGCTTCATGTGGGCAAAGTCGGGGAGAACGGGTATGTGGAG TGACATTGGAAGGAGGGCAGAAATGAATGAACTTATGGAGCAG GATCATCACGTTTGCCGAGTCAGGAACAGCCAGGAAGACGCTGC ATTTCCAAGGAAGGCAGTGACCTGTCAGTGGTGGAGCGTGCAGA TCTTCCTAAAAGTCCCCAAGGCCAACAGGACCAGGACCAAAGTC CCTCTTCCAGCAGCAGAAGCACCCGCAGGGCAGCTTGGACACAG GGCCGAGGAAGTGGGCTTAAAGGGGGAGAGGAGTGAACTGTTG AAAAGTAGTAGACGCTCGGAAGAGCACCTGGCATGTCTTCCCTG AGCATCCAGCGGTTGCTGGACCAGGGCAAGAGCTCCCTGGACGT CCTGTGAGCAGTGCCAGGAGAGTGGCGCCAGCTTGGTTCTCCTG CTN1 (Activin A tipo salvaje): sec. con núm. de ident. 97 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGT AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACTACTGCGAGGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN2: sec. con núm. de ident. 98 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACGAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCAGCGACCTGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAA CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN4: sec. con núm. de ident. 100 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGC AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN5: sec. con núm. de ident. 101 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGA CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGT AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN7: sec. con núm. de ident. 103 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGCTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN9: sec. con núm. de ident. 105 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCGACCTGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA JTN10: sec. con núm. de ident. 106 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCGCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN12: sec. con núm. de ident. 108 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN13: sec. con núm. de ident. 109 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN15: sec. con núm. de ident. 111 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN16: sec. con núm. de ident. 112 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN18: sec. con núm. de ident. 114 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN20: sec. con núm. de ident. 116 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGA AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCGGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN21 : sec. con núm. de ident. 117 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGT AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN23: sec. con núm. de ident. 1 19 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN24: sec. con núm. de ident. 120 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCAGGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN26: sec. con núm. de ident. 122 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN27: sec. con núm. de ident. 123 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN29: sec. con núm. de ident. 125 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN31 : sec. con núm. de ident. 127 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACACCTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA ???32: sec. con núm. de ident. 128 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN34: sec. con núm. de ident. 130 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACCTGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN35: sec. con núm. de ident. 131 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN37: sec. con núm. de ident. 133 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN38: sec. con núm. de ident. 134 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN40: sec. con núm. de ident. 136 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACCACTGCGCCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN42: sec. con núm. de ident. 138 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN43: sec. con núm. de ident. 139 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACAGGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN45: sec. con núm. de ident. 141 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACACCTGCTGCAAGAAGCAG GAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCA CACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGG GGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAG GCCACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACC GCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCA CATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN46: sec. con núm. de ident. 142 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGÁCATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACGAGTGCGGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGi CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA a CTN48: sec. con núm. de ident. 144 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG AGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA CTN49: sec. con núm. de ident. 145 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AGGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCGTGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN51 : sec. con núm. de ident. 147 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAGGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN53: sec. con núm. de ident. 149 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCA CACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGG GGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAG GCCACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACC GCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCA CATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN54: sec. con núm. de ídent. 150 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN56: sec. con núm. de ident. 152 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA CTN57: sec. con núm. de ident. 153 rCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN59: sec. con núm. de ident. 155 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA CTN60: sec. con núm. de ident. 156 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN62: sec. con núm. de ident. 158 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN64: sec. con núm. de ident. 160 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGA CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN65: sec. con núm. de ident. 161 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGA AGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN67: sec. con núm. de ident. 163 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC AGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN68: sec. con núm. de ident. 164 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGCAGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN70: sec. con núm. de ident. 166 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCGTGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN71 : sec. con núm. de ident. 167 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN73: sec. con núm. de ¡dent. 169 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN75: sec. con núm. de ident. 171 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAGGATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN76: sec. con núm. de ident. 172 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN78: sec. con núm. de ident. 174 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCGTGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG-CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN79: sec. con núm. de ident. 175 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCGCCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCGTGTAA CTN81 : sec. con núm. de ident. 177 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCGTGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAGGATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN82: sec. con núm. de ident. 178 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGA AGGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA ??84: sec. con núm. de ident. 180 CTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGA CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN86: sec. con núm. de ident. 182 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG AAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGG CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN87: sec. con núm. de ident. 183 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN89: sec. con núm. de ident. 185 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGG CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN90: sec. con núm. de ident. 186 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA \CTN92: sec. con núm. de ¡dent. 188 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGG CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA CACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA CTN93: sec. con núm. de ident. 89 CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAG CCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGA AGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAG ACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGC CAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGA ACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAA CATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAG CCAGAGGATGGTGGCCGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA l i l ! I X · I X : X bla 4 cuencias de aminoácidos de los péptidos de la presente invenció tienen sustitutos de histidina E3H/D5H + K7H/N9H + E3H/D5H ntal K7H/N9H K7H/N9H K13H/Q15H + K13H/Q N1 ACTD3 ACTD17 ACTD18 N16 ACTD8 ACTD19 ACTD20 N34 ACTD13 ACTD21 ACTD22 ACTD23 bla 5 scripción de variantes de folistatina usadas en la presente invenci W\TCLLFLMAAAOSIQAGSHHHHHHGSGSGSGNCWLRQAKNGR LSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLF WMIFNGGAPNCIPCKETCE KCRMNKKNK RCVCAPDCSNITWKGPVCGLDG TYRNECALL VQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCWDQTN AYCVTCNRJCPEPASSE VTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCL RCSLCDELCPDS SDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVK EDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW* TA2_pDR000001871 : sec. con núm. de ident 201 WVWTLLFLMAAAOSjQAGSHHfíHHHGSGSGSGNCWLROAKNGR LSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIF GGAPNCIPCKETCE KCR KKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDG TYR ECALLKA VQYQGRC TCRDWCPGSSTCWDQTO AYCVTCNRJCPEPASSE VTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCL RCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVK CTA3_pDR000001872: sec. con núm. de ident. 202 W V WTLLFLM A AA OS I O AGSHHHHHHGSGSG SETCENVDCGPGKK PRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYR ECALLKARCKEQPELEVQ TCRDVFCPGSSTCWDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGV RKATCLLGRSIGLAYEGKC1 * bla 7 cuencia de ácido nucleico de las variantes de folistatina usadas sente invención CTA2_pDR000001871: sec. con núm. de ident.204 GCT GGGTG GGA C GCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAG ATCCAAGCAGGCTCC CCACCATGGAAGCGGATCCGGGTCAGGGAACTGTTGGCTGAGGCAAGCGAAGAACGGCAG CTGTACAAGACCGAGCTGAGTAAGGAGGAATGCTGCAGTACGGGCAGGTTGAGCACTAGCT GGACGTCAACGACAACACGCTGTTCAAGTGGATGATCTTCAATGGCGGAGCTCCCAATTGC AGAGACCTGCGAAAACGTCGACTGTGGACCGGGCAAGAAATGCAGGATGAACAAGAAGA TGCGTGTGTGCTCCAGATTGCAGCAACATCACCTGGAAAGGCCCCGTGTGTGGCCTCGATG CCGCAATGAGTGCGCCCTTCTGAAGGCACGATGCAAGGAGCAGCCAGAACTGGAGGTGCAG GGTGCAAGAAGACCTGTAGGGACGTCTTCTGCCCTGGATCTTCCACTTGCGTGGTGGATC GCTTACTGCGTGACATGCAACCGTATCTGCCCAGAACCCGCCTCTAGCGAACAGTACCTGT CGGAGTCACCTACTCTAGTGCCTGCCACTTGAGGAAGGCCACATGTCTGCTCGGTAGGAGC CTTACGAGGGCAAGTGCATCAAGGCCAAGTCTTGCGAGGACATACAGTGTACGGGTGGGA TGGGACTTCAAAGTGGGGAGAGGGAGATGCAGTCTCTGTGACGAACTGTGTCCCGATTCC CCCGTGTGCGCGTCCGATAACGCGACCTATGCCTCAGAATGCGCCATGAAAGAGGCAGC GAGTTCTGCTCGAGGTTAAGCACAGCGGTAGCTGCAACTAA CTA3_pDR000001872: sea con núm. de ident.205 GGCTTGGGTGTGGACCTTGC AT CCTGA GGCAGCTGCCCAAAG ATCCAAGCAGGCTCC CCACCATGGAAGCGGATCCGGGTCAGAGACCTGCGAAAACGTCGACTGTGGACCGGGCAA ATGAACAAGAAGAACAAGCCCAGATGCGTGTGTGCTCCAGATTGCAGCAACATCACCTGGA GTGTGGCCTCGATGGGAAGACCTACCGCAATGAGTGCGCCCTTCTGAAGGCACGATGCAAG AACTGGAGGTGCAGTACCAGGGTAGGTGCAAGAAGACCTGTAGGGACGTCTTCTGCCCTGG TGCGTGGTGGATCAGACCAACAACGCTTACTGCGTGACATGCAACCGTATCTGCCCAGAAC CGAACAGTACCTGTGCGGTAATGACGGAGTCACCTAC CTAGTGCCTGCCACTTGAGGAAG TGCTCGGTAGGAGCATTGGTCTGGCTTACGAGGGCAAGTGCATCAAGTAA bla 8 tos de la selección primaria: efecto de los péptidos de la present ención en la diferenciación de células madre pluripotentes R&D Sys Activin 001 A 200 ng/ml 8767 984 3.847E+08M.955 R&D Sys Activin 001 A 400 ng/mt 7391 1950 3.627E+08 8.693 001 Mock SN 1x 1:20 390 236 K.642E+06U .732 001 OriGENE WT 1x 1:20 979 133 1.819E+071.010 001 OriGENE WT 10x 1:20 5548 1348 E.035E+085.765 001 ACTN1 1x 1:20 5466 1393 1.519E+082986 #001 ACTN1 10x 1:20 9254 3336 I4.640E+081.635 #001 ACTN2 1x 1:20 4057 3624 1.756E+079803 #001 ACTN2 10x 1:20 2965 484 £.299E+073753 001 ACTN2 10x 1:40 2232 420 1.280E+077.767 #001 ACTN4 1x 1:20 6380 1421 9.099E+071.591 #001 ACTN4 10x 1:20 8916 1861 2.385E+081.098 #001 ACTN4 10x 1:40 6548 16062.075E+08 111 #001 ACTN5 1x 1:20 1261 506 1.111E+076119 #001 ACTN5 10x 1:20 1396 875 1.031 E+077.316 #001 ACTN5 0x 1:40 1382 924 1.311E+075.980 #001 ACTN6 1x 1:20 939 605 1.234E+079.445 #001 ACTN6 10x 1:20 2359 454 I2.272E+073.667 #001 ACTN6 10x 1:40 1790 1521 1.426E+07W 185 #001 ACTN7 1x 1:20 1133 381 1.108E+071.755 #001 ACTN7 0x 1:20 2714 1393 1.904E+071.900 #001 ACTN7 10x 1:40 1387 1264 1 99?+077.438 #001 ACTN8 1x 1:20 363 194 I5.578E+063.202 #001 ACTN8 10x 1:20 1419 320 1.18 E+07K .791 ACTN9 1x 1:20 11391 2104 5.97E+05 5.90E ACTN9 10x 1:20 11456 4148 6.63E+05 1.56E ACTN9 10x 1:40 9608 1249 4.19E+05 4.91E ACTN10 1x 1:20 7417 1967 7.52E+05 3.65E ACTN10 10x 1:20 8942 522 1.08E+06 2.35E ACTN10 10x 1:40 7333 509 5.59E+05 5.48E ACTN11 1x 1:20 5239 602 3.47E+06 7.40E ACTN11 10x 1:20 10321 2388 4.06E+07 8.30E ACTN11 10x 1:40 9493 60 2.79E+07 1.25E ACTN12 1x 1:20 5420 2207 1.10E+06 9.64E ACTN12 10x 1:20 6633 666 7.65E+06 3.54E ACTN12 10x 1:40 6317 842 2.43E+06 1.27E ACTN14 1x 1:20 4968 1581 1.50E+06 1.??? ACTN14 10x 1:20 6278 1556 3.66E+06 2.47 ACTN14 10x 1:40 5584 744 4.73E+06 2.64 ACTN16 1x 1:20 7068 1332 1.36E+07 7.31 ACTN16 10x 1:20 11118 1179 5.55E+07 1.12E ACTN16 10x 1:40 11064 1156 6.46E+07 1.64E ACTN17 1x 1:20 10154 2103 1.21E+06 5.86E ACTN17 10x 1:20 12596 2314 2.83E+05 7.00 ACTN17 10x 1:40 10807 2683 4.38E+05 4.42 ACTN18 1x 1:20 6078 2117 5.68E+05 4.47 ACTN18 10x 1:20 9676 1357 1.22E+06 8.99 ACTN18 10x 1:40 11683 3408 2.22E+05 1.75 n Activin A NA NA 10933 4289 1.97E+04 1.84 003 ACTN19 10x 1:40 12549 1654 4.86E+03 8.41 E 003 ACTN20 1x 1:20 9000 3265 1.26E+04 1.09 003 ACTN20 10x 1:20 10217 1604 1.52E+05 1.43 003 ACTN20 10x 1:40 12284 5364 9.03E+03 1.56 003 ACTN21 1x 1:20 8072 1928 6.33E+03 1.10 003 ACTN21 10x 1:20 11102 4407 4.89E+05 7.86 003 ACTN21 10x 1:40 10458 2550 8.77E+04 8.56 #003 ACTN22 1x 1:20 9909 2201 1.32E+05 1.88 003 ACTN22 10x 1:20 8745 2985 3.69E+05 1.94 003 ACTN22 10x 1:40 9568 2146 3.76E+05 1.62 003 ACTN23 1x 1:20 6831 2235 2.89E+04 3.37 #003 ACTN23 10x 1:20 10482 1338 1.63E+05 1.83 #003 ACTN23 10x 1:40 8184 1000 1.47E+05 1.77 #003 ACTN28 1x 1:20 7411 753 3.70E+06 1.98 #003 ACTN28 10x 1:20 12587 194 4.87E+07 1.09 #003 ACTN28 10x 1:40 10116 613 3.57E+07 4.81 #003 ACTN32 1x 1:20 16166 1771 9.11E+04 7.58 #003 ACTN32 10x 1:20 14330 3723 3.97E+04 3.40 #003 ACTN32 10x 1:40 11619 2679 3.43E+05 4.41 #003 ACTN35 1x 1:20 8553 3509 7.94E+04 5.11 #003 ACTN35 10x 1:20 6805 877 1.26E+06 6.10 #003 ACTN35 10x 1:40 7926 807 6.76E+05 3.97 #004 Sin Activin A NA NA 2542 884 0.00E+00 O.OO R&D Sys Activin #004 A 6.25 ng/ml 815 456 5.68E+04 4.73 ACTN39 10x 1:20 3362 2213 1.31E+06 1.91E ACTN39 10x 1:40 1331 702 4.81 E+05 3.60E ACTN41 1x 1:20 6073 1507 1.42E+05 8.68E ACTN41 10x 1:20 1397 75 1.46E+05 2.20E ACTN41 10x 1:40 2643 1070 6.30E+04 2.44E ACTN43 1x 1:20 657 352 1.85E+04 1.62E ACTN43 10x 1:20 877 388 2.13E+05 1.93E ACTN43 10x 1:40 1251 1005 5.57E+04 5.99E ACTN44 1x 1:20 3657 2434 5.01 E+04 4.52E ACTN44 10x 1:20 1508 479 3.24E+05 1.47E ACTN44 10x 1:40 2272 242 1.58E+05 1.34E ACTN45 1x 1:20 4591 963 1.48E+05 7.47E ACTN45 10x 1:20 2058 1013 1.13E+05 7.26E ACTN45 10x 1:40 4482 1145 2.30E+04 2.04E ACTN47 1x 1:20 2624 1761 7.48E+05 8.86E ACTN47 10x 1:20 1399 1224 4.27E+06 3.08E ACTN47 10x 1:40 1610 904 1.09E+06 9.20E ACTN52 1x 1:20 3092 1154 1.17E+05 1.80E ACTN52 10x 1:20 4869 783 2.64E+04 1.80E ACTN52 10x 1:40 3900 1956 9.50E+04 1.10E Sin Activin A NA NA 4232 1414 8.01 E+05 5.56E R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 2175 647 8.53E+05 5.63E R&D Sys Activin A 12.5 ng/ml 1360 504 5.86E+05 3.36E R&D Sys Activin ACTN57 1x 1 :20 4485 891 9.99E+05 4.35E ACTN57 10x 1 :20 6471 379 1.74E+06 3.08E ACTN57 10x 1 :40 4594 2303 1.30E+06 7.33E ACTN59 1x 1 :20 2613 1680 1 09E+06 6.75E ACTN59 10x 1 :20 3304 316 2.11 E+06 3.62E ACTN59 10x 1 :40 1776 699 1.81 E+06 1.44E ACTN62 1x 1 :20 1661 757 1.05E+06 8.02E ACTN62 10x 1 :20 5728 3055 2.45E+05 3.32E ACTN62 10x 1 :40 3782 1515 1.33E+06 6.03E ACTN63 1x 1:20 3380 1583 1.07E+06 1.24E ACTN63 10x 1 :20 1935 512 2.28E+06 7.88E ACTN63 10x 1 :40 2718 266 2.01 E+06 1.00E ACTN64 1x 1 :20 2415 404 1.30E+06 5.48E ACTN64 10x 1 :20 2215 485 1.55E+06 5.55 ACTN64 10x 1 :40 2688 1645 1.12E+06 4.43 ACTN71 1x 1 :20 1621 760 2.45E+05 1.24 ACTN71 10x 1:20 3909 1450 3.61 E+05 3.60 ACTN71 10x 1 :40 1970 894 1.01 E+06 4.85 Sin Activin A NA NA 2066 824 5.62E+05 2.27 R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 1315 322 3.77E+05 1.30 R&D Sys Activin A 12.5 ng/ml 984 209 7.95E+05 6.47 R&D Sys Activin A 25 ng/ml 1445 475 2.03E+06 6.78 R&D Sys Activin ACTN76 10x 1 :40 7608 2666 7.54E+05 5.65E ACTN79 1x 1 :20 2958 885 4.07E+05 5.13E ACTN79 10x 1 :20 7704 1033 3.83E+05 1.24E ACTN79 0x 1 :40 2486 355 6.19E+04 8.10E ACTN84 1x 1 :20 1976 1370 3.37E+05 2.96E ACTN84 10x 1 :20 2272 656 2.65E+05 1.09E ACTN84 10x 1 :40 5228 1923 8.40E+05 2.60E ACTN87 1x 1 :20 1548 919 5.85E+05 5.88E ACTN87 10x 1 :20 3258 2198 7.89E+05 1.06E ACTN87 10x 1 :40 3613 1941 3.99E+05 2.80E ACTN89 1x 1:20 5495 714 3.63E+05 2.52E ACTN89 10x 1 :20 5558 2729 5.77E+05 4.83E ACTN89 10x 1 :40 4474 1027 7.23E+05 2.70E ACTN90 1x 1 :20 1727 908 1.34E+06 1.15E ACTN90 10x 1 :20 2819 603 4.13E+05 5.74E ACTN90 10x 1 :40 3042 1374 1.33E+06 8.60E Sin Activin A NA NA 10305 653 3.07E+05 8.60E R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 3824 408 8.05E+05 2.12E R&D Sys Activin A 12.5 ng/ml 3131 791 1.26E+06 5.03E R&D Sys Activin A 25 ng/ml 4462 414 3.68E+06 1.44E R&D Sys Activin A 50 ng/ml 5146 864 6.34E+06 4.04E R&D Sys Activin A 100 ng/ml 8684 721 2.21 E+07 3.64E ACTN34 10x 1:20 10063 2249 5.69E+07 1.71E ACTN37 10x 1:20 3957 336 1.35E+06 2.37E ACTN58 10x 1:20 11078 1555 6.70E+05 3.42E ACTN66 10x 1:20 13360 2677 4.84E+05 1.36E ACTN67 10x 1:20 12653 804 4.44E+05 1.18E ACTN68 10x 1:20 13395 960 1.43E+06 1.96E ACTN70 10x 1:20 12551 709 9.67E+05 4.90E ACTN73 10x 1:20 10569 1074 8.27E+05 1.69E ACTN80 10x 1:20 9898 1537 4.08E+05 9.53E ACTN83 10x 1:20 12084 2300 5.39E+05 1.59E ACTN86 10x 1:20 11821 328 7.45E+05 2.00E ACTN88 10x 1:20 11583 405 6.21 E+05 2.73E ACTN92 10x 1:20 14298 558 5.60E+05 1.41E ACTN93 10x 1:20 13409 1062 5.87E+05 3.82 Sin Activin A NA NA 10838 654 1.78E+06 9.81 R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 2383 504 2.25E+06 4.60 R&D Sys Activin A 12.5 ng/ml 3746 522 7.90E+06 1.70 R&D Sys Activin A 25 ng/ml 4706 2153 1.59E+07 9.77 R&D Sys Activin A 50 ng/ml 5714 403 2.14E+07 2.16 R&D Sys Activin A 100 ng/ml 7479 942 5.53E+07 6.25 R&D Sys Activin A 200 ng/ml 10212 30 1.49E+08 5.07 ACTN58 50x 1 :20 13214 2227 3.78E+06 5.20E ACTN66 50x 1 :20 16460 1132 3.39E+06 6.21 E ACTN67 50x 1 :20 14821 1839 3.50E+06 1.52E ACTN68 50x 1 :20 15926 1335 1.83E+06 4.47E ACTN70 50x 1 :20 16071 2209 3.20E+06 1.60E ACTN73 50x 1 :20 16351 910 3.13E+06 1.41 E ACTN80 50x 1 :20 14686 3087 3.52E+06 1.23E ACTN83 50x 1 :20 15829 2323 9.01 E+06 9.79E ACTN86 50x 1 :20 17034 2001 2.34E+06 3.56E ACTN88 50x 1 :20 15317 824 2.87E+06 7.89E ACTN92 50x 1 :20 15009 1821 3.32E+06 1.20E ACTN93 50x 1 :20 15900 2145 2.67E+06 1.38E Sin Activin A NA NA 13043 1790 6.93E+05 6.89E R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 9256 4615 1.71 E+06 2.46E R&D Sys Acttvin A 12.5 ng/ml 11386 458 1.30E+06 7.22E R&D Sys Activin A 25 ng/ml 6396 530 3.58E+06 1.95E R&D Sys Activin A 50 ng/ml 5600 568 4.70E+06 8.65E R&D Sys Activin A 100 ng/ml 5328 1582 2.49E+07 1.50E R&D Sys Activin A 200 ng/ml 9019 689 8.89E+07 1.52E R&D Sys Activin A 400 ng/ml 10913 1330 1.03E+08 2.89E ock SN 10x 1 :20 13022 1802 1.49E+06 1.40E San Diego WT 50x 1 :20 14552 1244 1.60E+08 1.31 E ACTN27 50x 1 :20 6857 823 2.82E+07 1.37E ACTN42 50x 1 :20 7805 1316 7.53E+06 5.02E ACTN48 50x 1 :20 8941 1394 3.93E+07 2.36E ACTN57 50x 1 :20 12697 2468 7.82E+06 4.81 E ACTN60 50x 1 :20 10603 2616 3.73E+06 4.98E ACTN61 50x 1 :20 15256 1820 7.18E+06 6.84E ACTN72 50x 1 :20 16810 1507 6.51 E+06 4.86E ACTN74 50x 1 :20 16143 1292 1.03E+07 3.56E ACTN78 50x 1 :20 16301 1056 5.64E+06 4.44E Sin Activin A NA NA 17442 2846 1.94E+07 2.13E R&D Sys Activin A 6.25 ng/ml 14185 2876 3.47E+07 7.27E R&D Sys Activin A 12.5 ng/ml 10762 420 6.32E+07 3.43E R&D Sys Activin A 25 ng/ml 10543 1503 6.20E+07 1.14E R&D Sys Activin A 50 ng/ml 9793 1 151 5.63E+07 4.97E R&D Sys Activin A 100 ng/ml 13013 558 1.41 E+08 1.66E R&D Sys Activin A 200 ng/ml 14629 1632 2.77E+08 5.08E R&D Sys Activin A 400 ng/ml 18418 393 4.91 E+08 4.91 E Mock SN 10x 1 :20 20032 567 1.83E+07 2.94E OriGENE WT 10x 1 :20 11356 449 1.27E+08 5.28E ACTN1 10x 1 :20 15112 1475 2.78E+08 9.18E 010 ACTN91 10x 1 :20 17043 1619 1.12E+07 1.71 E 010 ACTN94 10x 1 :20 20142 401 1.51 E+07 3.06E la 9 os del subgrupo de selección primaria: efecto de los péptidos de l sente invención en la diferenciación de células madre pluripotente TABLA 9 Muestra ACTN1 (tipo salvaje) ACTN2 ACTN4 ACTN6 ACTN7 ACTN11 ACTN12 ACTN14 ACT 16 ACTN24 ACTN25 ACTN27 ACTN28 ACTN72 ACTN74 ACTN77 ACTN83 de unión de metales ncentración de una selección de los péptidos de la presente

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. Un método para diferenciar células madre plu poten ulas que expresan marcadores característicos del linaje endodermo étodo comprende el tratamiento de las células madre pluripotent d\o que contiene un péptido que comprende la secuencia de amino ivin A que contiene al menos una mutación puntual, por un período iciente para que las células madre pluripotentes se diferencien en c resan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo. 2. El método de conformidad con la reivindic acterizado además porque las células madre pluripotentes so dre embrionarias. 3. El método de conformidad con la reivindic acterizado además porque por lo menos una mutación puntual nos uno de los residuos de aminoácidos en la secuencia de a la activin A seleccionada del grupo que consiste de: 16Ft 18V, , 38N, 39Y. 41 E, 74F, 82V, 107N, 1091, 1 10V, y 116S. 6. El método de conformidad con la reivindic acterizado además porque por lo menos una mutación puntual se s grupo que consiste de una deleción, una inserción y una sustitució 7. El método de conformidad con la reivindic acterizado además porque el péptido que comprende la secu inoácidos de activin A contiene por lo menos mutación cionalmente modificado para contener por lo menos una regió az de unirse específicamente a un ligando en un sustrato solid umna de purificación por afinidad. 8. El método de conformidad con la reivindic acterizado además porque por lo menos una región es capaz