JP5769965B2 - ヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents

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Description

開示の内容
〔技術分野〕
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進するための方法を提供する。詳細には、本発明は膵臓内胚葉、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞を形成するための改良された方法を提供する。本発明は更に、フィーダー細胞層を使用することなく多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。
〔背景技術〕
１型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞即ち、β細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの方法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
脊椎動物の胚の発生においては、多能性細胞は原腸胚形成として知られる過程において３つの胚細胞層（外胚葉、中胚葉、内胚葉）を含む細胞群を生ずる。甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は中間段階を経て内胚葉から発生する。この過程における中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７等の多くのマーカーを発現する。
胚体内胚葉が膵臓内胚葉に分化することによって膵臓が形成される。膵臓内胚葉の細胞は膵十二指腸ホメオボックス遺伝子Ｐｄｘ１を発現する。Ｐｄｘ１の非存在下では、膵臓の発生は腹側及び背側膵芽が形成された時点で停止してしまう。したがって、Ｐｄｘ１の発現は膵臓の臓器発生における重要なステップである。成熟した膵臓は異なる細胞種の中でも、特に外分泌組織及び内分泌組織を含んでいる。外分泌及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じるものである。
島細胞の特徴を有する細胞が、マウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、ルメルスキー等（Lumelsky et al. Science 292:1389, 2001）は、マウスの胚性幹細胞が膵島に似たインスリン分泌構造に分化したことを報告している。ソリア等（Soria et al. Diabetes 49:157, 2000）は、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおいて血糖症を正常化させたことを報告している。
１つの例として、ホリ等（Hori et al. PNAS 99: 16105, 2002）は、マウス胚性幹細胞をホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤で処理することによって、β細胞に似た細胞が生じたことを開示している。
別の例として、ブリスザック等（Blyszczuk et al. PNAS 100:998, 2003）は、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からインスリン産生細胞が発生したことを報告している。
ミカレフ等（Micallef et al.）は、レチノイン酸が、胚性幹細胞がＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉を形成する運命決定を調節しうることを報告している。レチノイン酸は、胚の原腸胚形成の終期に対応する期間に胚性幹細胞分化の４日目に細胞培養に添加した場合にＰｄｘ１の発現を誘導する効果が最も高くなる（Diabetes 54:301, 2005）。
ミヤザキ（Miyazaki）等は、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚性幹細胞を報告している。ミヤザキ等の結果は、外因性のＰｄｘ１の発現によって、得られた分化細胞におけるインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦの遺伝子の発現が明らかに高められたことを示すものである（Diabetes 53: 1030, 2004）。
スコウディー（Skoudy）等は、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）がマウス胚性幹細胞における外分泌性膵臓遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）及び内分泌性遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現をアップレギュレートすることを報告している。１ｎＭのアクチビンＡを使用した場合に、最大の効果が認められた。スコウディー等は更に、インスリン及びＰｄｘ１のｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸によって影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７で処理することによってＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことを観察している（Biochem. J. 379: 749, 2004）。
シラキ（Shiraki）等は、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に促進する増殖因子の効果を研究している。シラキ等は、ＴＧＦβ２によってＰｄｘ陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Genes Cells. 2005 Jun; 10（6）: 503-16）。
ゴードン（Gordon）等は、血清の非存在下及びアクチビンとＷｎｔシグナル伝達の阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からブラキュリ（brachyury）＋／ＨＮＦ−３β＋内胚葉細胞が誘導されることを示している（米国特許出願公開第２００６／０００３４４６８（Ａ１）号）。
ゴードン（Gordon et al. PNAS, Vol103, p16806, 2006）等は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ノーダル（nodal）／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
しかしながら胚性幹細胞の発生のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物における発生プログラムを正確に模倣していない可能性がある。
トムソン（Thomson）等はヒトの胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Science 282:114, 1998）。これと同時に、ギアハート（Gearhart）及び共同研究者等は、胎児の生殖腺組織からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞系を誘導した（Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）。単純に白血病阻害因子（ＬＩＦ）と培養することによって分化を妨げることが可能なマウス胚性幹細胞と異なり、ヒト胚性幹細胞は極めて特殊な条件下に維持しなければならない（米国特許第６，２００，８０６号、国際特許出願公開第９９／２０７４１号、同第０１／５１６１６号）。
ダムール（D’Amour）等は、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下でヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮された培養物が作製されたことを述べている（Nature Biotechnology 2005）。これらの細胞をマウスの腎臓カプセル下に移植すると、一定の内胚葉性臓器の特徴を有するより成熟した細胞に分化した。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞はＦＧＦ−１０の添加後、更にＰｄｘ１陽性細胞に分化させることができる（米国特許出願第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。
ダムール等（D’Amour et al. Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401（2006））は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆細胞に似た段階を経て、内分泌ホルモンを発現する細胞に細胞を誘導することによりインビボで膵臓の器官形成を模倣するものである。」と述べている。
別の例として、フィスク（Fisk）等は、ヒト胚性幹細胞から膵臓島細胞を作製するためのシステムを報告している（米国特許出願第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つの段階に分けられている。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化させる。次に細胞をノギン等のＴＧＦβアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰｄｘ１陽性細胞を作製する。最後の分化はニコチンアミドによって誘導する。
１つの例において、ベンベニストリー（Benvenistry）等は、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付けるものである。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930）。
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞への分化能を維持する一方で、今日の臨床的要求に応えるように拡張することが可能な多能性細胞系を樹立するための条件を開発することが依然、大きく求められている。本発明者等は、ヒト胚性幹細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる効率を高めることを目的として代替的な手法を取ったものである。
〔課題を解決するための手段〕
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法において、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法を提供する。
一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の方法のいずれか１つによって多能性幹細胞を処理することによって多能性幹細胞から分化させられる。即ち、
ａ．血清の非存在下、アクチビンＡを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養するか、
ｂ．血清の非存在下、アクチビンＡを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び別の濃度の血清と培養するか、
ｃ．血清の非存在下、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去して細胞をアクチビンＡ及び血清と培養するか、
ｄ．多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、この多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養するか、
ｅ．多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第１の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第２の培地中でアクチビンＡと培養するか、
ｆ．多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第１の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養し、次いでこの多能性幹細胞を、異なる濃度の血清を含む第２の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する。
一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の方法のいずれか１つによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から分化させられる。即ち、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理し、次いで繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で細胞を培養するか、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理するか、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸で処理し、次いでレチノイン酸を除去した後、細胞を少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する。
一実施形態では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の方法のいずれか１つによって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を処理することによって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から分化させられる。即ち、
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地を除去した後、細胞をエキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で培養するか、
ｂ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでエキセンジン４を含む培地を除去した後、細胞をエキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で培養するか、
ｃ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養するか、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養するか、
ｅ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理するか、
ｆ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのグルコース及びエキセンジン４を含む培地中で培養する。
一実施形態では、本発明は糖尿病を罹患した患者を治療するための方法において、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、β細胞系統の細胞に分化させる工程と、
ｅ．前記β細胞系統の細胞を前記患者に移植する工程と、を含む、方法を提供する。
パネルａ）は、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで２日間、５日間、及び８日間処理した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、Ｍｉｘｌ１、Ｓｏｘ−１７の発現。胚体内胚葉マーカーの発現はｍＲＮＡレベルでアッセイされ、非処理のヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネルｂは、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで３日間及び５日間処理した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における前方内胚葉マーカーＣｅｒｂｅｒｕｓ、Ｏｔｘ−１及びＨｅｘ遺伝子の発現。 １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで５日間処理した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉の発現は、免疫組織化学法によって検出した。パネル（ａ）は、Ｓｏｘ−１７の発現。パネル（ｂ）は、ＨＮＦ−３βの発現を示す。パネル（ｃ）は、Ｏｃｔ３／４の発現。 段階的分化プロトコールを行った後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉マーカーの発現はｍＲＮＡレベルでアッセイされ、非処理のヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、ＧＡＴＡ４の発現。パネル（ｂ）は、Ｓｏｘ−１７の発現。パネル（ｃ）は、ＨＮＦ−３βの発現。パネル（ｄ）は、Ｍｉｘｌ１の発現。「ＡＡ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたったアクチビンＡによる処理。「ＵＴ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたって培養した非処理のコントロール。 段階的分化プロトコールを行った後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における胚体外内胚葉マーカーの発現。胚体外内胚葉マーカーの発現はｍＲＮＡレベルでアッセイされ、非処理のヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、ＡＦＰの発現に対する１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの影響。パネル（ｂ）は、Ｓｏｘ７の発現に対する１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの影響。「ＡＡ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたったアクチビンＡによる処理。「ＵＴ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたって培養した非処理のコントロール。 段階的分化プロトコールを行った後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における中胚葉及び内胚葉マーカーの発現。中胚葉及び内胚葉マーカーの発現はｍＲＮＡレベルでアッセイされ、非処理のヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現に対する１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの影響。パネル（ｂ）は、Ｚｉｃ７の発現に対する１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの影響。「ＡＡ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたったアクチビンＡによる処理。「ＵＴ」で示されるデータポイントは、１日間（１ｄ）、３日間（３ｄ）、５日間（５ｄ）又は７日間（７ｄ）にわたって培養した非処理のコントロール。 １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで１日間、３日間、５日間、及び７日間処理した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ７における胚体内胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ（パネルａ）、ＣＸＣＲ４（パネルｂ）、Ｍｉｘｌ１（パネルｃ）、Ｓｏｘ１７（パネルｄ）、ＨＮＦ−３ｂｅｔａ（パネルｅ）、Ｏｃｔ４（パネルｆ）の発現。胚体内胚葉マーカーの発現はｍＲＮＡレベルでアッセイされ、非処理のヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。 分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における胚体内胚葉マーカーの発現。胚体内胚葉の発現は、免疫組織化学法によって検出した。パネル（ａ）及び（ｂ）は、Ｓｏｘ−１７の発現。パネル（ｃ）及び（ｄ）は、ＨＮＦ−３βの発現。パネル（ｅ）及び（ｆ）は、ＧＡＴＡ４の発現。パネル（ｂ）、（ｄ）及び（ｆ）は、ＤＡＰＩによる核の対比染色。「処理」で示される列は、５日間のアクチビンＡ処理（１００ｎｇ／ｍｌ）を行ったものである。「非処理」で示される列は、非処理のコントロール。 第２の分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現はＰＣＲによってアッセイされ、アクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、Ｐｄｘ１の発現。パネル（ｂ）は、ＧＬＵＴ−２の発現。パネル（ｃ）は、ＰＴＦ１ａの発現。 第２の分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉の発現を、免疫組織化学法によって検出した。パネル（ａ）は非処理のコントロールにおけるＰｄｘ１の発現を示し、パネル（ｂ）は段階的分化プロトコールによって処理した培養中でのＰｄｘ１の発現を示す。 第３の分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における膵臓内分泌マーカーの発現。膵臓内分泌マーカーの発現はＰＣＲによってアッセイされ、アクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、ＮｅｕｒｏＤ１の発現。パネル（ｂ）は、Ｎｇｎ３の発現。パネル（ｃ）は、インスリンの発現。パネル（ｄ）は、Ｈｅｓ−１の発現。発現レベルは膵臓内胚葉細胞に標準化してある。 分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における膵臓内胚葉マーカーの発現。膵臓内胚葉マーカーの発現はＰＣＲによってアッセイされ、アクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、Ｎｋｘ２．２の発現。パネル（ｂ）は、Ｐｄｘ１の発現。 培養の各継代（Ｐ０、Ｐ１及びＰ２）の細胞におけるＰＤＸ−１の発現。ＰＤＸ−１の発現はＰＣＲによってアッセイされ、アクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞Ｈ９における発現レベルに標準化された。 第３の分化プロトコールを適用した後のヒト胚性幹細胞系Ｈ９における肝細胞マーカーの発現。肝細胞マーカーの発現はＰＣＲによってアッセイされ、アクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞における発現レベルに標準化された。パネル（ａ）は、ＡＦＰの発現。パネル（ｂ）は、アルブミンの発現。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ９における多能性のマーカーの発現。多能性のマーカーの発現は免疫組織化学法によってアッセイされた。パネル（ａ）は、Ｏｃｔ−４の発現。パネル（ｂ）は、アルカリホスファターゼの発現。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ９の核型。核型はマウス胚性繊維芽フィーダー細胞上で培養した継代数Ｐ３６の細胞で判定した。 ヒト胚性幹細胞を無フィーダー系で胚体内胚葉に分化させる本発明の分化プロトコールの概要。 異なる濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養し、（０．５〜２％の）低濃度血清及び高濃度のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）に５日間曝露した継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ９のＦＡＣＳプロファイル。胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現をＹ軸に示し、ＥＳマーカーＣＤ９の発現をＸ軸に示す。 希釈率１：１０のＭＡＴＲＩＧＥＬ（■）、希釈率１：２０のＭＡＴＲＩＧＥＬ（□（グレーで表示））、又は希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ（□）上で培養し、実施例１４で開示する分化プロトコールに供した継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養から得られた胚体内胚葉のマーカーについてのリアルタイムＰＣＲの結果。発光量比（fold induction）は、マウス胚性繊維芽細胞を使用して調整した培地で培養した継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の未分化細胞に対するもの。 未分化の多能性幹細胞、及び分化している多能性幹細胞から得られた胚体内胚葉細胞における網羅的遺伝子発現の散布図。示されたデータは、マウス胚性繊維芽細胞上で培養した継代数４４（右パネル）及びＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した継代数８３（左パネル）のヒト胚性幹細胞系Ｈ９細胞系の培養から得られたもの。 マウス胚性繊維芽フィーダー細胞上で培養し、実施例４に開示される胚体内胚葉の分化プロトコールに供したヒト胚性幹細胞系Ｈ１（パネルａ）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルｂ）、及びヒト胚性幹細胞系Ｈ９（パネルｃ）について５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。 マウス胚性繊維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルａ）及びヒト胚性幹細胞系Ｈ９（パネルｂ）の培養における、図に示された胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲによる結果。結果を、未分化細胞に対する増加倍率として表わす。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ（希釈率１：３０）上で培養し、実施例４に開示される胚体内胚葉の分化プロトコールに供したヒト胚性幹細胞系Ｈ１（パネルａ）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルｂ）、及びヒト胚性幹細胞系Ｈ９（パネルｂ）について５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルａ）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ９（パネルｂ）及びヒト胚性幹細胞系Ｈ１（パネルｃ）の培養における、図に示された胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲによる結果。結果を、未分化細胞に対する増加倍率として表わす。細胞を実施例４に開示される方法に従って処理した。 １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（パネルａ）、又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（パネルｂ）の存在下で継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養の位相差顕微鏡画像。細胞を５日間処理した。 実施例４に開示される方法に従って処理した後の、継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルａ及びｂ）及び継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ９（パネルｃ及びｄ）の培養におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。パネルｂ及びｄは、ＣＸＣＲ４の発現への２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの影響。パネルａ及びｃは、Ｗｎｔ−３ａの非存在下におけるＣＸＣＲ４の発現。結果は処理後５日目に得られたもの。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（パネルａ）及びＨ９（パネルｂ）の培養で認められる遺伝子の発現についてリアルタイムＰＣＲのデータ。培養は、実施例４に開示される分化プロトコールによって処理した。各パネルに示すようにＷｎｔアゴニストであるＷｎｔ−３ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ−５ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＷｎｔ−７ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）の影響についても試験を行った。細胞を５日間処理した。結果は、未分化細胞に対する増加倍率として表わす。 ＦＡＣＳによる、処理後５日目の継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養におけるＣＸＣＲ４の発現。パネル（ａ）は、Ｗｎｔ−３ａの非存在下におけるＣＸＣＲ４の発現。パネル（ｂ）は、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４の発現。パネル（ｃ）は、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４の発現を示し、パネル（ｄ）は、５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａによる処理後のＣＸＣＲ４の発現を示す。 処理後５日目のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養中に認められる胚体内胚葉マーカーの発現。結果は、リアルタイムＰＣＲによって求められる非処理細胞に対する発現の増加倍率として示した。パネル（ａ）は、図に示される胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現に対する１０、２０、及び５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの影響。パネル（ｂ）は、処理後２日目（２ｄ）及び５日目（５ｄ）におけるｇｏｏｓｅｃｏｉｄ（■）及びＣＸＣＲ４（□）の発現に対する１、５、又は１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（ｘ軸上で１０、５、１として示す）の影響。パネル（ｃ）は、２日目（■）又は５日目（□）における細胞数に対する１、５、又は１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの影響。 実施例４に開示される分化プロトコールによる５日間の処理後の、ＦＡＣＳによるヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養におけるＣＸＣＲ４の発現。細胞を、Ｗｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の非存在下（パネルａ）、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａで５日間の全体（パネルｂ）、１０００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで５日間の全体（パネルｃ）、５００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで５日間の全体（パネルｄ）、１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで５日間の全体（パネルｅ）、１０ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで５日間の全体（パネルｆ）、１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで１〜２日目（パネルｇ）、１０ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸで１〜２日目（パネルｈ）、培養。 リアルタイプＰＣＲによる胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。結果を、非処理細胞に対する増加倍率として表わす。パネル（ａ）は、図に示される濃度及び時間でＷｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を含む、実施例４に開示される胚体内胚葉プロトコールに従って処理した、継代数４８のヒト胚性幹細胞系Ｈ９から得られたデータ。パネル（ｂ）は、図に示される濃度及び時間でＷｎｔ−３ａ又はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を含む、実施例４で開示する胚体内胚葉プロトコールに従って処理した、継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ９から得られたデータ。 本発明で使用する胚性幹細胞系についてＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。パネル（ａ〜ｄ）は、継代数４９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９から得られたデータ。パネル（ｅ〜ｆ）は、継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ１から得られたデータ。データは処理後５日目に得た。細胞を以下の条件で処理した。パネル（ａ）：１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、パネル（ｂ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、パネル（ｃ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、パネル（ｄ）：１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、パネル（ｅ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、パネル（ｆ）：１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間。 １０、５０、又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａで処理した、継代数４９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果を非処理細胞に対する増加倍率として表わす。 継代数５３の胚性幹細胞系Ｈ９についてＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。データは処理後５日目に得た。細胞を以下の条件で処理した。パネル（ａ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を３〜５日目、パネル（ｂ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、パネル（ｃ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、パネル（ｄ）：２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を５日間全体、パネル（ｅ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、並びに、パネル（ｆ）：１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を５日間全体。すべてのパネルについてＸ軸はＣＤ９の発現を表し、Ｙ軸はＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現を表す。 １０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。 ５０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１０又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代数４９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。 アクチビンＡ、Ｗｎｔ−３ａ、ＧＳＫ−３阻害剤、及びＢＭＰ−４の組み合わせで５日間処理した、継代数５３のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ及びＳＯＸ７の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。 実施例２２に列記した条件で処理したヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養において、ＦＡＣＳによって調べたＣＸＣＲ４の発現の比率。 フィブロネクチン（パネルａ）又はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（パネルｂ）上で培養したヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養において、ＦＡＣＳによって調べた胚体内胚葉マーカーの発現。 フィブロネクチン（□）又は希釈率１：１０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（■）上で培養したヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養においてリアルタイムＰＣＲによって求めた胚体内胚葉マーカーの発現。 低濃度の血清、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの存在下において異なる濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬがヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化に与える影響。細胞を実施例４に開示される方法に従って処理。示した結果はリアルタイプＰＣＲによって調べた、図に示される遺伝子の発現レベル。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で維持し、マウス胚性繊維芽細胞上で分化させたヒト胚性幹細胞による胚体内胚葉の形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、図に示される遺伝子についてリアルタイムＰＣＲのデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、図に示す条件についてＦＡＣＳのデータ。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で維持し、マウス胚性繊維芽細胞上で分化させたヒト胚性幹細胞による胚体内胚葉の形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、図に示される遺伝子についてリアルタイムＰＣＲのデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、図に示す条件についてＦＡＣＳのデータ。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で維持し、マウス胚性繊維芽細胞上で分化させたヒト胚性幹細胞による胚体内胚葉の形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、図に示される遺伝子についてリアルタイムＰＣＲのデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、図に示す条件についてＦＡＣＳのデータ。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で維持し、マウス胚性繊維芽細胞上で分化させたヒト胚性幹細胞による胚体内胚葉の形成におけるＷｎｔ−３ａの役割。パネル（ａ）〜（ｄ）は、図に示される遺伝子についてリアルタイムＰＣＲのデータ。パネル（ｅ）〜（ｇ）は、図に示す条件についてＦＡＣＳのデータ。 Ｗｎｔ阻害剤ＤＫＫ−１による処理後の、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされた組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化。示される結果は、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａ及び１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１（ＤＥ＋ＤＫＫ１）の存在下、又はＤＫＫ１（ＤＥ）の非存在下で実施例４に開示される方法に従って処理したＨ９細胞においてリアルタイムＰＣＲによって調べた、図に示される遺伝子の発現。 ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養し、低濃度血清及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを加えないもの（パネルａ）又は加えたもの（パネルｂ）で分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養における胚体内胚葉マーカーの免疫蛍光染色。Ｅｃａｄ＝Ｅ−カドヘリン、ＮＣＡＭ＝Ｎ−カドヘリン。 継代数３８のヒト胚性幹細胞系ＳＡ００２の胚体内胚葉への分化。細胞は図に示した条件で５日間処理し、各パネルに示した遺伝子について遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで調べた。 １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理（パネルａ）、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（パネルｂ）、又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（パネルｃ）による処理後の、継代数３８のヒト胚性幹細胞系ＳＡ００２における、ＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現。細胞を５日間処理。 ヒト血清でコーティングした組織培養基質上での継代数５５のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の胚体内胚葉への分化。細胞は図に示した条件で処理し、各パネルに示した遺伝子について遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで調べた。 ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした組織培養基質上での継代数Ｐ５４のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の培養の胚体内胚葉への分化。５日間のＤＥプロトコールの後、異なるＧＳＫ−Ｂ阻害剤の影響について試験を行った。以下のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤（ＧＳＫ−３Ｂ ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ及びＸＩＩ）を１００ｎＭにて処理の最初の２日間について評価を行った。 ２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの存在下で実施例４に開示される方法に従って培養及び処理した継代数４９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養における、処理の最初の２日間のＡＦＰ（パネルａ）、Ｐｄｘ−１（パネルｂ）、Ｃｄｘ−２及びＧｌｕｔ−２（パネルｃ）、並びに、ＨＮＦ−３β、ＨＮＦ−６及びソマトスタチン（パネルｄ）の発現。この処理の後、細胞を、２％ＦＢＳ及び１μＭのレチノイン酸、０．１〜１μＭのＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（アロチノイド酸））、又は０．１〜１０μＭのＡＭ−５８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸）で更に３日間処理。次いで、細胞を２％ＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ中で更に３日間処理。 図に示した時間及び濃度でアクチビンＡ及びＷｎｔ−１によって処理したヒト胚性幹細胞系Ｈ１の培養において、パネルａ及びｂに示す胚体内胚葉マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲによる結果。 膵臓内胚葉細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥＭ／低グルコース中で処理することによって形成された膵臓内分泌細胞の培養中におけるインスリン（パネルａ）及びグルカゴン（パネルｂ）のｍＲＮＡの発現。図に示されるデータは、２つの別々の実験で観察されたもの。 ＤＭＤＭ／低グルコース（パネルａ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（パネルｂ）中で処理した細胞において免疫細胞化学法によって調べたインスリンの発現。パネルｃは、ＰＤＸ−１及びインスリンの共染色。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ９から誘導された膵臓内分泌細胞における遺伝子発現に対するグルコース濃度の影響。各遺伝子はパネル中で特定される。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ９から誘導された膵臓内分泌細胞における遺伝子発現に対するグルコース濃度の影響。各遺伝子はパネル中で特定される。 ヒト胚性幹細胞系Ｈ９から誘導された膵臓内分泌細胞における遺伝子発現に対するグルコース濃度の影響。各遺伝子はパネル中で特定される。 ２、１０及び２０ｍＭのグルコース中で形成された膵臓内分泌細胞からのｃペプチドの放出。細胞をＩＢＭＸ又は２０ｍＭのグルコースで刺激した。
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明又は図示した以下の小項目に分ける。
用語の定義
幹細胞とは、１個の細胞レベルで自己再生し、かつ、自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような前駆細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、複数の胚細胞層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から異なる細胞系の機能性細胞へとインビトロで分化する能力、並びに、移植後に複数の胚細胞層の組織を生ずる能力、及び胚盤胞への注入後にすべての組織とまではいかないにしてもほぼ大部分の組織に分化する能力によっても特徴付けられる。
幹細胞は、発生上の能力によって、（１）すべての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）すべての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系統のサブセットを生ずる能力を有するが、それらがすべて特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分であるすべての細胞種及び要素（例、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系統（例、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。
分化とは、特化していない（「分化決定していない」）か又は完全には特化していない細胞が、例えば、神経細胞や筋細胞のような特化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞、又は分化誘導された細胞とは、細胞のその系統内においてより特化した（「分化決定した」）位置を占めるものである。分化のプロセスについて用いられる場合、「分化決定した」なる用語は、通常の条件下で特定の細胞種又は細胞種のサブセットにまで分化し続けるが、通常の条件下では異なる細胞種には分化できず、より分化の未熟な細胞種にも戻ることができない点にまで分化経路を進んだ細胞のことを指して言う。脱分化とは、細胞が細胞の系統においてより特化（又は分化決定）していない位置にまで戻るプロセスのことを指して言う。本明細書で言うところの細胞の系統とは、その細胞の遺伝、即ち、その細胞がどの細胞から生じたものであり、どのような細胞を生じうるか、ということを定義するものである。ある細胞の系統とは、発生及び分化の所定の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定していない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
培養中の細胞を述べるために異なる用語が用いられる。「維持」とは、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で増殖培地中に入れられた細胞のことを一般に指して言うものであり、より大きな細胞集団が形成される場合もそうでない場合もある。「継代」とは、１つの培養容器から細胞を取り出して、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下でこれらの細胞を第２の培養容器に入れるプロセスのことを指して言う。
特定の細胞集団又は細胞系は、しばしば継代された回数によって呼称されるか、又はそれによって特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、Ｐ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、即ち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と指定される。最初の継代培養の後、細胞は２次培養（Ｐ１又は継代数１）として述べられる。２回目の継代培養の後では細胞は３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加しうるものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことは理解されるであろう。各継代間の期間における細胞の増殖（即ち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、培養条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。
「β細胞系統」とは、転写因子ＰＤＸ−１、並びに以下の転写因子、即ち、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の内の少なくとも１つについて遺伝子発現が陽性である細胞を指して言う。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としてはβ細胞が挙げられる。
本明細書で言うところの「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
本明細書で言うところの「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞が挙げられる。
本明細書で言うところの「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１αを発現する細胞を指して言う。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系統の細胞が挙げられる。
本明細書で言うところの「胚体内胚葉」とは、原腸胚形成時に胚盤葉上層から生ずる細胞の特徴を有し、消化管及びその派生器官を形成する細胞を指して言う。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、即ち、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、ケルベロス（Cerberus）、ＯＴＸ２、グースコイド（goosecoid）、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。
本明細書で言うところの「胚体外内胚葉」とは、以下のマーカー、即ち、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣの内の少なくとも１つを発現する細胞の集団を指して言う。
本明細書で言うところの「マーカー」とは、対象とする細胞で発現の仕方が異なる核酸又はポリペプチド分子である。ここで言う異なる発現の仕方とは、陽性のマーカーでは発現レベルの上昇を、陰性のマーカーでは発現レベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で言うところの「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。
本明細書で言うところの「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンの内の少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指して言う。
本明細書で言うところの「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。
本明細書で言うところの「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ノーダル（Nodal）、又はＦＧＦ８の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。
本明細書で言うところの「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ブラキュリ（Brachiury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、及びＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現しうる（Thomson et al., Science 282:1145, 1998）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで製造業者（ベクターラボラトリーズ、カリフォルニア州バーリンゲーム所在）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるＯｃｔ−４及びＴＥＲＴを通常更に発現している。
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、外胚葉組織の３つの胚細胞層のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性を、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞種の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。また、多能性を、胚様体を形成し、３つの胚細胞層に関連したマーカーの存在について胚様体を評価することによって調べることもできる。
増殖させた多能性幹細胞系は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を得ることが望ましい。これは、細胞が、ヒトの染色体がすべて揃っていて、かつ目立った変化のない正倍数体であることを意味する。
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織等の、妊娠後に形成される組織に由来する多能性幹細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例としては、例えば、ヒト胚性幹細胞系Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の株化細胞系がある。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ブレサジェン社（BresaGen）、ジョージア州アテネ所在）等の変異型ヒト胚性幹細胞系も好適である。
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞をトムソン等（Thomson et al.）によって述べられるように調製する（米国特許第５，８４３，７８０号、Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995）。
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、通常、多能性幹細胞を、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持する培養システム中で培養する。分化をともなわない無フィーダー細胞培養中での多能性幹細胞の増殖は、別の細胞種と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー細胞培養中での多能性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。
例えば、ルービノフ等（Reubinoff et al. Nature Biotechnology 18: 399 - 404（2000））及びトンプソン等（Thompson et al. Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147）は、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞層を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。
リチャード等（Richards et al. Stem Cells 21: 546-556, 2003）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。リチャード等は、「成人の皮膚繊維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー細胞培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるか、あるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。
別の例として、ワン等（Wang et al. Stem Cells 23: 1221-1227, 2005）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
別の例として、ストイコビッチ等（Stojkovic et al. Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
更なる別の例として、ミヤモト等（Miyamoto et al. Stem Cells 22: 433-440, 2004）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
アミット等（Amit et al. Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003）は、ヒトの包皮由来のフィーダー細胞層を開示している。
別の例として、インズンザ等（Inzunza et al. Stem Cells 23: 544-549, 2005）は、ヒトの出生直後産児の包皮繊維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。
米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるか、あるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
別の例として、国際特許出願公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際特許出願公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって調整される」と述べている。
別の例として、スー等（Xu et al. Stem Cells 22: 972-980, 2004）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。
別の例として、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞の維持のための合成培地を開示している。
代替的な培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、チェオン等（Cheon et al. BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダー細胞かつ無血清の培養システムを開示している。
別の例として、リーベンシュタイン等（Levenstein et al. Stem Cells 24: 568-574, 2006）は、ｂＦＧＦを添加した培地を用い、繊維芽細胞又は馴化培地の非存在下でヒト胚性幹細胞を長期にわたって培養するための方法を開示している。
別の例として、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清の非存在下及び繊維芽フィーダー細胞の非存在下において合成培地中でヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示している。この方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種類のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１種類のインスリン又はインスリン代替物を含む培地中で幹細胞を培養する工程を含み、前記培地は、哺乳動物胎児血清を基本的に含まず、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの、繊維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化することが可能な繊維芽細胞増殖因子を含み、該増殖因子は、単に繊維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給され、前記培地は、フィーダー細胞又は馴化培地の非存在下で未分化状態の幹細胞の増殖を支持するものである。
別の例として、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞等の幹細胞を培養するうえで有用な合成培地を開示している。溶液中では、培地は培養される幹細胞と比較して実質的に等張である。与えられた培養中、この特定の培地は基礎培地、並びに始原幹細胞の実質的に未分化状態での増殖を支持するうえで必要とされるｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸のそれぞれの所定量を含む。
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくは、あらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される繊維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい一形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる」と述べている。
更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダー細胞かつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及び、ｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸を含む培地を開示している。
別の例として、国際特許出願公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、幹細胞を未分化状態に維持するのに充分な量の形質転換増殖因子β（transforming growth factor：ＴＧＦβ）のタンパク質ファミリーのメンバー、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間だけ、幹細胞を曝露することを含む方法を開示している。
多能性幹細胞は、適当な培養基質上に播種すればよい。一実施形態では、適当な培養基質は例えば、基底膜から誘導されるもの、又は接着分子の受容体／リガンド結合の一部を形成するもののような細胞外基質成分である。一実施形態では、適当な培養基質はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickenson））である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する、エンゲルブレス−ホルム・スワーム（Engelbreth-Holm Swarm）腫瘍細胞から得られる可溶性調製物である。
他の細胞外基質成分及び成分混合物も代替物として適している。増殖させられる細胞の種類に応じ、他の細胞外基質成分及び成分混合物は、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、硫酸ヘパリン等を、単独又は異なる組み合わせで含んでもよい。
多能性幹細胞は、適当な分布で、かつ細胞の生存率、増殖、及び所望の特性の維持を促進する培地の存在下で基質上に播種することができる。これらの特性はいずれも、播種密度に充分な注意を払うことによって利するところがあるものであり、当業者が容易に決定することができるものである。
好適な培地は、以下の成分、即ち、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ギブコ（Gibco）Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、ギブコＮｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、ギブコＮｏ．１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、ギブコＮｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、シグマ（Sigma）Ｎｏ．７５２２；ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ギブコＮｏ．１３２５６−０２９等から調製することができる。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化
本発明における使用に適した多能性幹細胞としては例えば、胚性幹細胞系Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞系ＳＡ００２（セラーティス社（Cellartis）、スウェーデン）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、即ち、ＡＢＣＧ２、クリプト（cripto）、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグ（Nanog）、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１の内の少なくとも１つを発現する細胞も本発明における使用に適している。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。代替的な態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。代替的な態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ニューロＤ（NeuroD）、アイレット−１（Islet-1）、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１αからなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを発現することが可能である。膵臓内分泌系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、即ち、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ニューロＤ（NeuroD）、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６の内の少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
多能性幹細胞を、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
例えば、多能性幹細胞を、ダムール（D’Amour）等により開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（D’Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541（2005））。
例えば、多能性幹細胞を、シノザキ（Shinozaki）等により開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662（2004））。
例えば、多能性幹細胞を、マクレーン（McLean）等により開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38（2007））。
例えば、多能性幹細胞を、ダムール（D’Amour）等により開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））。
例えば、多能性幹細胞を、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、（Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541（2005））に開示されている。
例えば、多能性幹細胞を、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）等により開示されている（D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2005）。
例えば、多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、（Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））に記載されている。
本発明の一態様では、多能性幹細胞は、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上に多能性幹細胞を播種し、次いでこの多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと、血清を含む第１の培地中で所定の時間培養し、次いでこの多能性幹細胞をアクチビンＡと、より高い濃度の血清を含む第２の培地中でおおよそ別の所定の時間培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
上記に開示される第１の培地中の血清の濃度は、約０〜約０．５％であってもよく、培養時間は約１〜約３日間であってもよい。上記に開示される第２の培地中の血清の濃度は、約０．５〜約２％であってもよく、培養時間は約１〜約４日間であってもよい。
本発明の代替的な一態様では、多能性幹細胞は、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上に多能性幹細胞を播種し、次いでこの多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと、血清を含む第１の培地中でおおよそ所定の時間培養し、次いでこの多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと、より高い濃度の血清を含む第２の培地中で別の所定の時間培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
上記に開示される第１の培地中の血清の濃度は、約０〜約０．５％であってもよく、培養時間は約１〜約３日間であってもよい。上記に開示される第２の培地中の血清の濃度は、約０．５〜約２％であってもよく、培養時間は約１〜約４日間であってもよい。
一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する多能性幹細胞を分化させる方法であって、
ａ．細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上に多能性幹細胞を播種する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する工程と、を含む、方法を提供する。
多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する工程は、１個の培地中で行うことが可能である。また、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する工程は、１個よりも多い培地中で別々に又は同時に行うことも可能である。一実施形態では、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する工程を２個の培地中で行う。
細胞外基質
本発明の一態様では、多能性細胞を、細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上で培養して分化させる。細胞外基質は、マウスの肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜の調製物（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）よりＭＡＴＲＩＧＥＬの商品名で販売されている）であってよい。また、細胞外基質は、増殖因子を低減させたＭＡＴＲＩＧＥＬであってもよい。また、細胞外基質はフィブロネクチンであってもよい。代替的な一実施形態では、多能性幹細胞を、ヒト血清でコーティングされた組織培養基質上で培養して分化させる。
細胞外基質は、組織培養基質をコーティングするのに先立って希釈してもよい。組織培養基質をコーティングするための細胞外基質を希釈するのに適した方法の例は、クラインマン（Kleinman）等（Kleinman, H.K., et al., Biochemistry 25:312（1986））、及びハドレイ（Hadley）等（Hadley, M.A., et al., J.Cell.Biol. 101:1511（1985））に見ることができる。
一実施形態では、細胞外基質はＭＡＴＲＩＧＥＬである。一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：１０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：１５のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：６０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。
一実施形態では、細胞外基質は増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬである。一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：１０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：１５の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：３０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。代替的な一実施形態では、組織培養基質を希釈率が１：６０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングする。
１個の培地を使用した、細胞外基質上での、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化
１個の培地を使用する場合、培地は、例えば（国際特許出願公開第２００６０２０９１９号に開示されるような）インスリン及びＩＧＦ等の特定の因子を、多能性幹細胞が胚体内胚葉に分化できるように充分に低い濃度で含有しなければならない。これは血清濃度を低下させるか、あるいはインスリン及びＩＧＦを含まない合成培地を使用することによって実現することが可能である。合成培地の例はワイルズ（Wiles）等によって開示されている（Wiles et al. Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247（1）: 241-8）。
前記培地は、約０％〜約１０％の範囲の血清濃度を有してもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約０％〜約５％の範囲であってもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約０％〜約２％の範囲であってもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約２％であってもよい。
アクチビンＡ及びＷｎｔリガンとの培養時間は約１日〜約７日であってもよい。代替的な一実施形態では、培養時間は約１日〜約３日であってもよい。代替的な一実施形態では、培養時間は約３日であってもよい。
アクチビンＡは、多能性幹細胞の分化を引き起こすのに適した任意の濃度で使用することができる。濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであってもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ｗｎｔリガンドの選択を最適化することによって分化プロセスの効率を高めることが可能である。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−１である。代替的な一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−３ａである。
Ｗｎｔリガンドは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
前記１個の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を更に含んでもよい。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
多能性幹細胞をＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する場合、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は約１ｎＭ〜約１０００ｎＭでもよい。代替的な一実施形態では、多能性幹細胞を約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する。
前記１個の培地は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の多能性細胞からの形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子を含んでもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、他の細胞種を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１）、グルカゴン様ペプチド−１及び−ＩＩ（ＧＬＰ−１及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞系、例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞系、及び始原又は形質転換内皮細胞から得られる馴化培地によって供給することが可能である。
２個の培地を使用した、細胞外基質上での、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化
多能性幹細胞の胚体内胚葉系統細胞への分化は、２個の培地を使用して多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養することによって実現することが可能である。即ち、多能性幹細胞の分化は以下のようにして実現することが可能である。
ａ．細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上に多能性幹細胞を播種し、
ｂ．前記多能性幹細胞を第１の培地中でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養し、
ｃ．前記多能性幹細胞を第２の培地中でアクチビンＡと培養する。
第１の培地は低濃度の血清を含んでもよく、第２の培地は第１の培地よりも高濃度の血清を含んでもよい。
第２の培地はＷｎｔリガンドを含んでもよい。
第１の培地：第１の培地は、例えば（国際特許出願公開第２００６０２０９１９号に開示されるような）インスリン及びＩＧＦ等の特定の因子を、多能性幹細胞が胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化できるように充分に低い濃度で含有しなければならない。これは血清濃度を低下させるか、あるいはインスリン及びＩＧＦを含まない合成培地を使用することによって実現することが可能である。合成培地の例はワイルズ（Wiles）等によって開示されている（Wiles et al. Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247（1）: 241-8）。
第１の培地では、第２の培地と比較してより低濃度の血清が存在してもよい。第２の培地の血清濃度を増大させると細胞の生存率が高まるか、あるいは細胞の増殖が促進される場合がある。第１の培地の血清濃度は約０％〜約１０％の範囲であってもよい。また、第１の培地の血清濃度は約０％〜約２％の範囲であってもよい。また、第１の培地の血清濃度は約０％〜約１％の範囲であってもよい。また、第１の培地の血清濃度は約０．５％であってもよい。
少なくとも２個の培地を使用して多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドと培養する場合、第１の培地中での培養時間は約１日〜約３日であってもよい。
アクチビンＡは、多能性幹細胞の分化を引き起こすのに適した任意の濃度で使用することができる。濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであってもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ｗｎｔリガンドの選択を最適化することによって分化プロセスの効率を高めることが可能である。Ｗｎｔリガンドを、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−１である。代替的な一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−３ａである。
Ｗｎｔリガンドは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
前記第１の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を更に含んでもよい。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第１の培地、第２の培地、又は第１及び第２の培地の両方に添加することができる。
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
多能性幹細胞をＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する場合、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は約１ｎＭ〜約１０００ｎＭでもよい。代替的な一実施形態では、多能性幹細胞を約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する。
前記第１の培地は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の多能性細胞からの形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子を含んでもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が他の細胞種を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１）、グルカゴン様ペプチド−１及び−ＩＩ（ＧＬＰ−１及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞系、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞系、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。
第２の培地：第２の培地は、例えば、（国際特許出願公開第２００６０２０９１９号に開示されるような）インスリン及びＩＧＦ等の特定の因子を培養細胞の生存を促すだけの充分な濃度で含有しなければならない。これは、血清濃度を増大させるか、あるいはインスリン及びＩＧＦの濃度が第１の培地と比較して高い合成培地を使用することによって実現することが可能である。合成培地の例はワイルズ（Wiles）等によって開示されている（Wiles et al. Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247（1）: 241-8）。
より高い血清濃度を有する第２の培地では、第２の培地の血清濃度は、約０．５％〜約１０％の範囲であってもよい。また、第２の培地の血清濃度は約０．５％〜約５％の範囲であってもよい。また、第２の培地の血清濃度は約０．５％〜約２％の範囲であってもよい。また、第２の培地の血清濃度は約２％であってもよい。多能性幹細胞を第２の培地と培養する場合、培養時間は約１日〜約４日であってもよい。
第１の培地と同様、アクチビンＡは、多能性幹細胞の分化を引き起こすのに適した任意の濃度で使用することができる。濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであってもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。別の代替的な一実施形態では、濃度は約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ｗｎｔリガンドは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でもよい。代替的な一実施形態では、濃度は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−１である。代替的な一実施形態では、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−３ａである。
前記第２の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を更に含んでもよい。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第１の培地、第２の培地、又は第１及び第２の培地の両方に添加することができる。
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群から選択することができる。一実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤はＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
多能性幹細胞をＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する場合、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は約１ｎＭ〜約１０００ｎＭでもよい。代替的な一実施形態では、多能性幹細胞を約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と培養する。
第１の培地と同様、第２の培地も、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の多能性細胞からの形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子を含んでもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が他の細胞種を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１）、グルカゴン様ペプチド−１及び−ＩＩ（ＧＬＰ−１及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子を、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞系、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞系、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が形成されたことは、特定のプロトコールを行う前後にマーカーの存在について試験を行うことによって判定することができる。多能性幹細胞は通常、こうしたマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がマーカーを発現し始めることで検出される。
分化の効率は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体等）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することができる。
培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）オウスベル（Ausubel）等編、２００１年度版補遺、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Harlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル」（Using Antibodies: A Laboratory Manual）ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）等の免疫アッセイが含まれる。
特定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例を表ＩＡに列記する。表ＩＡに列記した抗体によって認識されるものと同じマーカーを標的とする代替的な抗体も入手可能であるか、容易に開発が可能である点は注意を要する。こうした代替的な抗体を、本発明に基づいて単離した細胞におけるマーカーの発現を評価するために用いることもできる。
例えば、多能性幹細胞の特徴は当業者にはよく知られたものであり、多能性幹細胞の更なる特徴も次々に特定されている。多能性幹細胞のマーカーとしては、例えば、以下のもの、即ち、ＡＢＣＧ２、クリプト（cripto）、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグ（nanog）、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１の内の１つ以上の発現が挙げられる。
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるＣＸＣＲ４のようなタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体等）に処理細胞集団を曝露することによって、分化した細胞を精製することができる。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において提案されるいずれかの方法によって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ダムール（D’Amour）等により開示される方法に従って膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））。
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次いで繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地中で細胞を培養することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、（Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））に開示されている。
本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。その時間は、約１〜約６日でもよい。
本発明の代替的一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、細胞をレチノイン酸で所定の時間処理することによって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。その時間は、約１〜約３日でもよい。レチノイン酸を後で取り除き、細胞を少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で別の所定の時間処理する。その時間は、約１〜約３日でもよい。
一実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法であって、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。
一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で約１〜約６日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で約６日間処理する。
前記少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。
代替的な一実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法であって、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞をレチノイン酸で処理する工程と、
ｃ．レチノイン酸を取り除き、その後、細胞を少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。
一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸で約１〜約３日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸で約３日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で約１〜約３日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で約３日間処理する。
前記少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸で処理する。あるいは、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をＦＧＦ−２、又はＦＧＦ−４、又はＦＧＦ−１０で処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を以下の因子、即ち、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、又はＦＧＦ−１０の内の少なくとも１つで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸と、以下の繊維芽細胞増殖因子、即ち、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、又はＦＧＦ−１０の内の少なくとも１つと、で処理する。一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及びＦＧＦ−２で処理する。別の実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及びＦＧＦ−４で処理する。更なる実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及びＦＧＦ−１０で処理する。
レチノイン酸を約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、レチノイン酸を１μＭの濃度で使用する。
ＦＧＦ−２は約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−２を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。
ＦＧＦ−４は約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−４を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。
ＦＧＦ−１０は約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−１０を５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子で処理してもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、他の細胞種を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−１及びＩＩ（ＧＬＰ−１及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えばＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞系、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞系、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内胚葉系統に特徴的な更なるマーカーも次々に特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１β等、１以上の転写因子の発現が挙げられる。
分化の効率は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体等）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することができる。
培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）オウスベル（Ausubel）等編、２００１年度版補遺、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Harlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル」（Using Antibodies: A Laboratory Manual）ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）等の免疫アッセイが含まれる。
特定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例を表ＩＡに列記する。表ＩＡに列記した抗体によって認識されるものと同じマーカーを標的とする代替的な抗体も入手可能であるか、容易に開発が可能である点は注意を要する。こうした代替的な抗体を、本発明に基づいて単離した細胞におけるマーカーの発現を評価するために用いることもできる。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ダムール（D’Amour）等により開示される方法に従って膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））。
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地を取り除いた後、エキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で細胞を培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、（Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））に記載されている。
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでエキセンジン４を含む培地を取り除いた後、エキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で細胞を培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）等により開示されている（D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006）。
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）等により開示されている（D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006）。
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）等により開示されている（D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006）。
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、ノッチ細胞外受容体のアンタゴニストであってもよい。また、この因子は、ノッチ受容体の生物活性を阻害するものであってもよい。また、この因子は、細胞内におけるノッチシグナル伝達経路を阻害するか、ノッチシグナル伝達経路内の特定の要素のアンタゴニストであってもよい。
一実施形態では、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても知られる、１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
Ｌ−６８５，４５８は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約９０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約８０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約７０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約６０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約５０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約４０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約３０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約２０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約１０μＭの濃度で使用する。
一実施形態において、本発明は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法であって、
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で前記細胞を処理する工程と、を含む、方法を提供する。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。
一実施形態では、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても知られる、１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約１〜約５日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約３〜約５日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で約５日間処理する。
一実施形態では、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても知られる、１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
Ｌ−６８５，４５８は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約９０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約８０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約７０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約６０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約５０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約４０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約３０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約２０μＭの濃度で使用する。一実施形態では、Ｌ−６８５，４５８を約１０μＭの濃度で使用する。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子で処理してもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、他の細胞種を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−１及びＩＩ（ＧＬＰ−１及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。
前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞系、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞系、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。
一実施形態において、本発明は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための改良された方法であって、
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．グルコースを約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で含む培地中で、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることが可能な因子で前記細胞を処理する工程と、を含む、方法を提供する。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることが可能ないずれの方法も、本発明の改良に適している。
一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約１０ｍＭの濃度のグルコースを含む培地中で処理する。代替的な一実施形態では、約２０ｍＭの濃度のグルコースを含む培地中で細胞を処理する。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約２〜約３０日間処理する。一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約２〜約２０日間処理する。一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約２〜約１０日間処理する。一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約１０日間処理する。一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約４日間処理する。一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を約２日間処理する。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内分泌系統に特徴的な更なるマーカーも次々に特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が膵臓内分泌系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーとしては、例えば、ＮＧＮ−３、ニューロＤ（NeuroD）、Ｉｓｌｅｔ−１等、１以上の転写因子の発現が挙げられる。
β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、β細胞系統に特徴的な更なるマーカーも次々に特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞がβ細胞系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。β細胞系統に特徴的な性質としては、例えば、特にＰｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ニューロＤ（NeuroD）、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡ等、１以上の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、当該技術分野では内分泌細胞を同定する目的でよく確立されている。例として、エドルンド（Edlund）による（Nature Reviews Genetics 3: 524-632（2002））等を参照されたい。
分化の効率は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体等）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することができる。また、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体等）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することもできる。
培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）オウスベル（Ausubel）等編、２００１年度版補遺、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Harlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル」（Using Antibodies: A Laboratory Manual）ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）等の免疫アッセイが含まれる。
特定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例を表ＩＡに列記する。表ＩＡに列記した抗体によって認識されるものと同じマーカーを標的とする代替的な抗体も入手可能であるか、又は容易に開発が可能である点は注意を要する。こうした代替的な抗体を、本発明に基づいて単離した細胞におけるマーカーの発現を評価するために用いることもできる。
治療法
一態様において、本発明は、１型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、その多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。
更に別の一態様において、本発明は、２型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。
必要に応じて、移植細胞の生存率及び機能を高める医薬薬剤又は生理活性物質で患者を更に治療することができる。こうした薬剤としては例えば、特にインスリン、ＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン等が挙げられる。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤等が挙げられる。
多能性幹細胞は、レシピエントへの移植に先立ってインスリン産生細胞へと分化させることができる。特定の実施形態では、多能性幹細胞をレシピエントへの移植に先立ってβ細胞に完全に分化させる。また、多能性幹細胞は未分化又は部分的に分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエントの体内で起こりうる。
胚体内胚葉細胞、又は膵臓内胚葉細胞、又はβ細胞は、分散した細胞として移植するか、あるいは肝門脈に注入することが可能な細胞塊に形成することができる。また、細胞を、生体適合性分解性ポリマー支持体、多孔質の非分解性装置中で与えるか、あるいはカプセル化することによってホストの免疫反応から保護することもできる。細胞はレシピエントの適当な部位に移植することができる。移植部位としては、例えば、肝臓、天然膵臓、腎嚢下腔、網、腹膜、漿膜下腔、腸、胃、及び皮下ポケット等が挙げられる。
移植細胞の更なる分化、生存又は活性を促進する目的で、増殖因子等の更なる因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤を、細胞の投与の前、同時、又は後に投与することができる。特定の実施形態では、増殖因子を用いて投与細胞をインビボで分化させる。これらの因子は、内因性の細胞によって分泌され、投与細胞にインサイチューで曝露されるものでもよい。移植細胞は、当該技術分野で知られる内因性及び外因性の投与された増殖因子の任意の組み合わせによって分化を誘導することができる。
移植に用いられる細胞の量は、患者の状態、及び治療に対する患者の応答等の多くの異なる因子に依存し、当業者が決定できるものである。
一態様において本発明は、糖尿病を罹患しているか、あるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、その細胞を３次元的な支持体に組み込むことを含む。細胞は、患者への移植に先立ってインビトロでこの支持体上に維持することができる。また、細胞を含んだ支持体を、更なるインビトロ培養を行うことなく患者に直接移植することも可能である。場合により、支持体に、移植細胞の生存率及び機能を高める少なくとも１種類の医薬薬剤を取り込ませてもよい。
本発明の目的における使用に適した支持材料としては、組織修復に有用な組織テンプレート、導管、障壁、及びリザーバが挙げられる。特に、生物学的組織を再構築又は再生する目的で、及び組織の増殖を誘導するための走化性物質を送達する目的でインビトロ及びインビボで使用されてきた、発泡材、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物及び不織布構造の形態の合成及び天然の材料が、本発明の方法を実施するうえでの使用に適している。例として、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３（Ａ１）号、米国特許第４，５５７，２６４号、及び同第６，３３３，０２９号に開示される材料を参照されたい。
医薬薬剤を取り込んだ支持体を形成するには、支持体を形成するのに先立って医薬薬剤をポリマー溶液と混合することができる。また、医薬薬剤を、好ましくは医薬用担体の存在下で、製造された支持体上にコーティングしてもよい。医薬薬剤は、液体、微粉化した固体、又は他の任意の適当な物理的形態として存在してもよい。また、支持体に賦形剤を添加することによって医薬薬剤の放出速度を変化させることもできる。代替的な一実施形態では、例えば、米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物のような抗炎症性化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に取り込ませる。
例えば、米国特許第６，７９３，９４５号に開示される化合物のような抗アポトーシス性化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に取り込ませてもよい。
例えば、米国特許第６，３３１，２９８号に開示される化合物のような線維症の阻害剤である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。
例えば、米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号に開示される化合物のような血管新生を促進することが可能な化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。
例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７６２３号に開示される化合物のような免疫抑制化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。
例えば、特にＴＧＦ−β１、２及び３等のＴＧＦ−βファミリー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン等の増殖因子である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、低酸素症誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体、及びＩＩ、エキセンジン−４、ノーダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テナシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、ディフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチン等の接着細胞外基質タンパク質の細胞及びヘパリン結合ドメインを含む生物学的ペプチド、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物等のＭＡＰＫ阻害剤が挙げられる。
本発明の細胞は、足場上に細胞を単純に置くだけで足場中に取り込ませることができる。細胞は単純に拡散によって足場に入り込むことができる（J. Pediatr.Surg. 23（1 Pt 2）: 3-9（1988））。細胞の播種効率を高めるための他の幾つかの方法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸の足場上に播種するにはスピナーフラスコが使用される（Biotechnol.Prog. 14（2）: 193-202（1998））。細胞を播種するための別の方法は遠心を使用することであり、これにより播種細胞へのストレスが最小に抑えられ、播種効率が高められる。例えば、ヤン（Yang）等は遠心細胞固定法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種法を開発している（J.Biomed.Mater.Res. 55（3）: 379-86（2001））。
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。
背景
（実施例１）
ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をウィセル・リサーチ・インスティテュート社（WiCell Research Institute, Inc.）（ウイスコンシン州マディソン所在）より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、２０％ノックアウト血清リプレースメント、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ βメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと４ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてインビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO）より入手）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））からなるＥＳ細胞培地中、マウス胚繊維芽（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で細胞を培養した。ＭＥＦ細胞はＥ１３〜１３．５のマウス胚から誘導されたものをチャールズリバー社（Charles River）より購入した。ＭＥＦ細胞は、１０％ＦＢＳ（ハイクローン社（Hyclone））、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したＭＥＦ細胞培養を、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（シグマ社（Sigma）ミズーリ州セントルイス所在）で３時間処理して細胞分裂を停止させた後、トリプシン処理し、０．１％ウシゼラチンコートディッシュに２×１０４／ｃｍ２で播いた。継代数２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。コンフルエンスに達した時点（播種後約５〜７日後）で、ヒト胚性幹細胞を１ｍｇ／ｍｌ ＩＶ型コラゲナーゼ（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））で５〜１０分間処理した後、５ｍｌピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を９００ｒｐｍで５分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して新鮮な培地に１：３〜１：４の細胞比で再び播いた。
（実施例２）
胚体内胚葉細胞の形成
胚体内胚葉のマーカーの発現に対するアクチビンＡの影響を調べた。アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）をマウス胚繊維芽細胞上で培養したヒト胚性幹細胞の集団に添加した。細胞をアクチビンＡの存在下で継続的に培養し、示した時間において採取した。胚体内胚葉マーカーの発現レベルをＰＣＲ（図１）、ＦＡＣＳ（表ＩＩに結果をまとめる）、及び免疫組織化学法（図２）によって調べた。
アクチビンＡは、Ｈ９細胞系においてＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、Ｍｉｘｌ１及びＳｏｘ−１７のｍＲＮＡの発現を時間依存的に増大させた（図１、パネルａ）。前方内胚葉マーカーであるケルベロス（Cerverus）、Ｏｔｘ−１及びＨｅｘ遺伝子の顕著なアップレギュレーションも観察された（図１、パネルｂ）。アクチビンＡによる処理後ではＣＸＣＲ４タンパク質の増大がＦＡＣＳによって観察された。Ｅ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンの発現にはアクチビンＡによる処理後に変化は見られなかった（表ＩＩＡ）。ＣＸＣＲ４陽性細胞はＣ−ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９９についても顕著に陽性であり、ＣＤ９については陰性であった。これらのマーカーの発現パターンは、検討した３種類のｈＥＳ細胞系で一貫していた（Ｈ７については表ＩＩＢ、Ｈ１については表ＩＩＣ）。アクチビンＡで５日間処理した細胞で行った免疫細胞化学法によって、処理培養中の３０〜４０％の細胞がＳｏｘ１７及びＨＮＦ３βについて陽性であることが明らかとなった。同時に、分化した細胞のほぼ１００％が依然Ｏｃｔ４陽性であった（図２）。多能性の表面マーカーの発現の減少を、胚体内胚葉マーカーの発現の増大と考え合わせると、これらのデータは、アクチビンＡがヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化を促進することを示唆するものである。
（実施例３）
膵臓内胚葉細胞の形成
ヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉への分化を誘導することが知られている増殖因子を細胞培養に添加した。具体的には、膵臓内胚葉の形成を誘導することが知られているアクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びレチノイン酸を細胞培養に添加した。
第１の実験群では、０％〜２％の血清及びアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、マウス胚繊維芽細胞上で最大で７日間培養したヒト胚性幹細胞の集団にアクチビンＡを添加した。細胞を図３に示した時点で採取し、図に示した遺伝子の発現についてＰＣＲでアッセイされた（図３、４及び５）。図３のＰＣＲ分析により、アクチビン処理した細胞は、ＧＡＴＡ４（図３、パネルａ）、Ｓｏｘ−１７（図３、パネルｂ）、ＨＮＦ−３β（図３、パネルｃ）、及びＭｉｘｌ−１（図３、パネルｄ）を含む、内胚葉の発生に関連した広範な遺伝子を発現していることが示された。しかしながら、Ｐｄｘ１遺伝子の発現は認められなかった。内胚葉系統マーカーの同じ発現パターンが、アクチビンＡで処理したＨ７細胞で認められた（図６、パネルａ〜ｆ）。この段階では、Ｏｃｔ４の発現に有意な減少は認められなかった。
アクチビンＡは、胚体外内胚葉マーカーであるＳｏｘ７（図４、パネルａ）及びＡＦＰ（図４、パネルｂ）の発現を時間依存的に減少させた。アクチビンＡはブラキュリ（Brachyury）の発現を減少させた（図５、パネルａ）が、神経マーカーであるＺｉｃ１の発現には影響を及ぼさなかった（図５、パネルｂ）。
以上を考え合わせると、これらのデータは、Ｓｏｘ−１７、Ｍｉｘｌ１、Ｇａｔａ４及びＨＮＦ−３βの発現の増加が、前方内胚葉マーカーであるＯｔｘ１、Ｃｅｒ１及びＨｅｘ遺伝子がアップレギュレーションされていることと相まって、アクチビンＡ処理に応じた胚体内胚葉の形成を示していることを示唆するものである。免疫細胞化学法による胚体内胚葉マーカーの分析により、これらの遺伝子のタンパク質発現もｍＲＮＡ発現に認められた傾向を反映していることが明らかとなった。ＨＮＦ−３β、Ｓｏｘ−１７及びＧＡＴＡ４の発現レベルは、非処理細胞では全細胞の約１０〜２０％と低かった。５日間のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）処理により、ＨＮＦ−３β、Ｓｏｘ−１７及びＧＡＴＡ４の発現は、全細胞の約５０％〜９０％にまで増加した（図７）。
第２の実験群では、ヒト胚性幹細胞の培養を実施例１に述べた方法に従って２〜３日間未分化条件に維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエンスに達した後、アクチビンＡを１００ｎｇ／ｍｌとなるように加えた０〜２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を換え、３日、５日、又は７日間にわたってアクチビンＡの存在下で培養した。この時間間隔後、図８に示されるようなレチノイン酸とｂＦＧＦの組み合わせで細胞を５〜６日間更に処理した。培養物を採取し、ｍＲＮＡの試料を収集して分析に供した。アクチビンＡ単独で５日間処理した細胞からなるコントロール培養も含めた。
遺伝子発現分析により、アクチビンＡ又はレチノイン酸単独ではＰｄｘ１の発現を誘導しないことが示された。同様の結果が、アクチビンＡの存在下でレチノイン酸とＦＧＦの組み合わせにより処理した培養細胞で観察された（図８、パネルａ）。しかしながら、アクチビンＡの非存在下におけるレチノイン酸とＦＧＦの組み合わせによる細胞の処理により、Ｐｄｘ１の発現は更に増大した（図８、パネルａ）。アクチビンＡで３日間処理した後、アクチビンＡの非存在下で１μＭレチノイン酸及び５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２としても知られる）で５日間処理した細胞は、アクチビンＡ単独で５日間処理した試料で観察されたＰｄｘ発現レベルよりも約３５００倍高いＰｄｘ１の発現レベルを示した（図８、パネルａ）。免疫細胞化学分析法によれば、全細胞の５〜２０％がＰｄｘ１を発現していることが示された（図９）。
アクチビンＡの非存在下での１μＭレチノイン酸及びｂＦＧＦによる処理は、アクチビンＡ単独の存在下で処理された細胞では認められなかったＧＬＵＴ−２及びＰＴＦ１ａの発現の増大も引き起こした（図８、パネルｃ）。１μＭレチノイン酸及び５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦで処理した細胞においてＧＬＵＴ−２及びＰＴＦ１ａの発現の最大の増加が認められた。これらを考え合わせると、これらのデータは、胚体内胚葉が形成された後に細胞培養からアクチビンＡを除去することによって膵臓内胚葉の形成が更に促進されることを示唆するものである。
（実施例４）
膵臓内分泌細胞の形成
ヒト胚性幹細胞の培養を実施例１に述べた方法に従って３〜４日間未分化条件に維持した。細胞が５０〜６０％コンフルエンスに達した後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を換え、この培地中で細胞を１日間培養した。１日間の培養の後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを加えた０．５％ＦＢＳを含む培地と交換し、細胞を１日間培養した。この２回目の１日の培養の後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを加えた２％ＦＢＳを含む培地と交換し、細胞を１日間培養した。この時間間隔後、実施例２に概略を述べたように細胞をレチノイン酸とＦＧＦの組み合わせで６日間処理し、その後、培地を除去し、１０μＭのγ−セクレターゼ阻害剤Ｌ−６８５，４５８を含む、２％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる培地と交換し、３日間培養した。細胞を収穫し、ｍＲＮＡの試料を収集して分析に供した。アクチビンＡ単独で５日間処理した細胞からなるコントロール培養も含めた。
遺伝子発現分析により、アクチビンＡ単独、又はアクチビンＡをレチノイン酸及びＦＧＦと組み合わせた場合には、Ｎｇｎ３の発現もインスリンの発現も誘導しないことが明らかとなった（図１０、パネルａ、ｃ）。Ｌ−６８５，４５８による処理の後ではＨｅｓ−１の発現の減少も認められた。処理後３日目に最大の阻害が観察された（図１０、パネルｄ）。しかしながら、Ｌ−６８５，４５８による処理は、アクチビンＡ単独又はレチノイン酸とＦＧＦとの組み合わせで処理した試料で観察された発現レベルよりも約５０倍高いレベルでＮｇｎ３の発現を誘導した。γ−セクレターゼ阻害剤で処理した試料ではインスリンの発現に７０倍の増大が見られた。ニューロＤ１（NeuroD1）の発現もＬ−６８５，４５８による処理によって更に増大した（図１０、パネルａ）。以上を考え合わせると、これらのデータは、膵臓内胚葉が形成された後、レチノイン酸及びＦＧＦを細胞培養から除去し、γ−セクレターゼ阻害剤を添加することによって内分泌細胞の形成が更に促進されることを示唆するものである。
（実施例５）
Ｎｋｘ２．２を発現する膵臓内分泌細胞の形成
実施例２に概略を述べた方法に従って得られた胚体内胚葉細胞を以下のように処理した。即ち、５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍｌ塩基性ＦＧＦ及び１μＭのレチノイン酸を加えた２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる基本培地中で細胞を３〜５日間培養した。１μＭのレチノイン酸を単独で又はｂＦＧＦとともに含む基本培地中で細胞を更に３〜５日間引き続き培養した。方向付けされた細胞の分化の評価を助けるため、このプロセスに沿った異なる時点で細胞からＲＮＡ試料を採取した。更に、この分化プロトコールの全体を通じて培地及び各因子を定期的に除去して補充した。アクチビンＡの添加により、アクチビンＡを加えない試料と比較してＮｋｘ２．２の発現は約３５倍に増大した。培養の最初の３日間にアクチビンＡで処理した試料では、Ｐｄｘ１の発現はアクチビンＡを含まない試料と同等のレベルに維持された（図１１）。以上を考え合わせると、これらのデータは、膵臓内分泌マーカーであるＮｋｘ２．２の発現は、レチノイン酸及びｂＦＧＦによる処理の最初の３日間にアクチビンＡを添加することによって更に促進されることを示唆するものである。
（実施例６）
膵臓内胚葉細胞の培養における継代及び増殖
本実施例では、本願でヒト胚性幹細胞より誘導された膵臓内胚葉細胞を細胞培養中で維持し、更に分化させることなく継代することが可能であることを実証する。膵臓内胚葉細胞を低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で分化させた。低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、１日目には０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２日目には０．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、その後は毎日２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含有するものを使用した。４日間分化させた後、細胞を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１μＭのレチノイン酸、及び５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、全体で６日間更に培養した。６日間の分化の後、細胞を、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む低血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０の存在下で、全体で６日間、培養中で維持した。６日間の培養期間中、膵臓内胚葉細胞を２回継代した。細胞集団の倍加時間はこの６日間の培養期間で約３６〜４８時間であった。培養の０、３及び６日目において、Ｑ−ＰＣＲを用いて膵臓内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。図１２は、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０の存在下で増殖させた細胞が、誘導後の６日間の培養期間中、膵臓内胚葉マーカーであるＰｄｘ１の発現を維持したことを示している。
（実施例７）
ヒト胚性幹細胞からの肝細胞の誘導
ヒト胚性幹細胞の培養を実施例１で述べた方法に従って未分化培養条件に２〜３日間維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエンスに達した後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を換え、アクチビンＡの存在下で細胞を７日間培養した。７日間のアクチビンＡ処理の後、細胞を図１３に示す各条件で５日間処理した。この後、細胞を採取し、ｍＲＮＡの試料を収集して分析に供した。
アクチビンＡの非存在下で培養した細胞では、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びアルブミンの発現の増大が認められた（図１３、パネルＡ）。これはレチノイン酸及びＦＧＦ−４によって更に増大した（図１３、パネルｂ）。以上を考え合わせると、これらのデータは、ヒト胚性幹細胞の培養が、上記に述べた処理の後、肝細胞マーカーを発現することが可能であることを示唆するものである。更に、ヒト胚性幹細胞を肝細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることが可能である。
（実施例８）
Ｈ９ヒト胚性幹細胞系の特徴付け
未分化のＥＳ細胞が発現する幾つかのマーカーの発現を評価することにより、Ｈ９細胞の性質を経時的に監視した（Carpenter et al., 2001; Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998a）。Ｈ９細胞では、段階特異的胚抗原の交互発現が見られた（表ＩＩＩ）。Ｈ９細胞は、いずれも未分化のヒト胚性幹細胞に特徴的なＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＡＰ及びＣＤ９抗原に対して強力な免疫応答性を示す。
例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１、ＲＥＸ−１、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５、ＡＢＣＧ−２及びＴＥＲＴ等の胚性幹細胞に特徴的な遺伝子の発現を評価するためにリアルタイムＰＣＲを行ったところ、本実施例で増殖させた細胞は、既に述べられている未分化の胚性幹細胞と似ていることが確認された（表ＩＩＩ）。ＯＣＴ３／４タンパク質の発現及びアルカリホスファターゼ活性（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を免疫染色によって確認した。Ｈ９細胞の大部分はＯＣＴ３／４及びＡＰについて陽性であった（図１４）。以上をまとめると、これらの結果は、本実施例で使用したＨ９細胞が、他の研究機関からの報告と比較して、形態、抗原免疫染色、又は多能性マーカーの発現において大きく異ならないものであることを証明するものである。
（実施例９）
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
接着した細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州所在）と５分間インキュベートすることによって培養皿から剥がした。剥がした細胞をヒト胚性幹細胞培地に再懸濁し、遠心して回収した後、洗浄し、この細胞を２％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳからなる染色緩衝液（シグマ社（Sigma）ミズーリ州）に再懸濁した。必要に応じて、０．１％γグロブリン（シグマ社（Sigma））溶液を用いて１５分間、細胞のＦｃ受容体をブロックした。一定分量（約１０５個の細胞）を表Ｉに示されるようなフィコエリスリン（ＰＥ）若しくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を結合したモノクローナル抗体（１０６個の細胞毎に５μＬの抗体）、又は非結合一次抗体とインキュベートした。コントロールには、適当なアイソタイプ一致抗体、非染色細胞、及び二次結合抗体のみで染色した細胞を含めた。抗体とのインキュベートをすべて、４℃で３０分間行い、その後、細胞を染色緩衝液で洗った。非結合一次抗体で染色した試料を、ＰＥ又はＡＰＣ結合標識二次抗体と更に３０分間、４℃でインキュベートした。使用した二次抗体の一覧については表Ｉを参照されたい。洗った細胞はペレットとし、染色緩衝液に再懸濁した。細胞表面の分子をＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））装置を使用し、少なくとも１０，０００のイベントを収集して特定した。
（実施例１０）
免疫細胞化学法
０．１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社）でコーティングした培養皿に播種した細胞を室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を室温で１時間、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１０％正常ニワトリ血清／０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でブロックした後、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１０％正常ニワトリ血清中、４℃で一次抗体と一晩インキュベートした。一次抗体及びその実用希釈率を表ＩＢに示す。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で３回洗った後、ＰＢＳ中に１：１００の希釈率で希釈した蛍光二次抗体と細胞を室温で１時間インキュベートして結合させた。コントロール試料として、一次抗体を省略するか、一次抗体と同じ濃度の、対応する一致したネガティブコントロールとしての免疫グロブリンで一次抗体を置き換えた反応を含めた。染色した試料はすすいだ。ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）（インビトロジェン社（Invitrogen）カリフォルニア州所在）を、核を対比染色し、蛍光退色防止剤として機能するように各試料に１滴ずつ加えた。ニコンコンフォーカルＥｃｌｉｐｓｅＣ−１倒立顕微鏡（ニコン社、日本）及び１０〜６０倍の対物レンズを使用して画像を得た。
（実施例１１）
未分化細胞のＰＣＲ分析
ＲＮＡの抽出、精製及びｃＤＮＡの合成：エタノール含有高塩濃度緩衝液の存在下でシリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、キアゲン社（Qiagen）カリフォルニア州所在）に結合させた後、洗浄して夾雑物を除去することによりＲＮＡ試料を精製した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−Ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（アンビオン社（Ambion, Inc.））を使用してＲＮＡを更に精製し、高品質ＲＮＡを水で溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０の指示値によって評価した。ＡＢＩ（ABI、カリフォルニア州所在）製高容量ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔを使用して精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
リアルタイムＰＣＲ及び定量分析：特に断らないかぎり、試薬はすべてアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社より購入した。リアルタイムＰＣＲ反応を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システムを使用して行った。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ＰＣＲ ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ社、カリフォルニア州所在）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと全反応容量を２０μＬとして使用した。各ｃＤＮＡ試料はピペット操作による誤差を補正するために２重で流した。プライマー及びＦＡＭ標識ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは２００ｎＭの濃度で使用した。各標的遺伝子の発現レベルは、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem）によって以前に開発されているヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内因性コントロールを使用して標準化された。プライマー及びプローブの組は以下の通りである。Ｏｃｔ３／４（Ｈｓ００７４２８９６）、ＳＯＸ−２（Ｈｓ００６０２７３６）、ＵＴＦ−１（Ｈｓ００７４７４９７）、Ｒｅｘ−１（Ｈｓ００３９９２７９）、コネキシン（Connexin）４３（Ｈｓ００７４８４４５）、コネキシン（Connexin）４５（Ｈｓ００２７１４１６）、ＡＢＣＧ２（Ｈｓ００１８４９７９）、Ｔｅｒｔ（Ｈｓ００１６２６６９）、ＨＮＦ３β（Ｈｓ００２３２７６４）、ＧＡＴＡ−４（Ｈｓ００１７１４０３）、Ｍｉｘｌ１（Ｈｓ００４３０８２４）、Ｓｏｘ７（Ｈｓ００８４６７３１）、ＡＦＰ（Ｈｓ００１７３４９０）、ブラキュリ（Brachyury）（Ｈｓ００６１００８０）、ＧＳＣ（Ｈｓ００４１８２７９＿ｍ１）、Ｐｄｘ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、ＰＴＦ１ａ（Ｈｓ００６０３５８６）、Ｎｇｎ３（Ｈｓ００３６０７００）、ニューロ（Neuro）Ｄ１（Ｈｓ００１５９５９８）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）、及びＧｌｕ２（Ｈｓ００１６５７７５）。Ｓｏｘ１７プライマーはＰＲＩＭＥＲＳプログラム（ＡＢＩ社、カリフォルニア州所在）を使用して設計されたものであり、以下の配列である。Ｓｏｘ１７：ＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡ（配列番号１）、ＡＧＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧ（配列番号２）、及びＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＧ（配列番号３）。最初に５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間インキュベーションした後、試料を２段階（９５℃で１５秒間の変性ステップの後、６０℃で１分間のアニーリング／伸長ステップ）で４０サイクル反応させた。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００配列検出システムソフトウェアを使用してデータ分析を行った。各プライマー／プローブの組について、増幅が指数関数的に起こる領域の中央において蛍光強度が特定の値に達するサイクル数としてＣｔ値を求めた。比較Ｃｔ法を用いて相対的遺伝子発現レベルを計算した。簡単に述べると、各ｃＤＮＡ試料について、内因性コントロールのＣｔ値を対象遺伝子のＣｔ値から差し引くことによってΔＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。増幅の効率を１００％と仮定すると、標準化された標的の量は２ΔＣｔとして計算される。最終的なデータは、検量試料に対して表わした。
（実施例１２）
核型の分析
Ｈ９細胞の核型を、標準的なＧバンディング核型分析法によって調べた。全部で１００個の中期染色体展開像を評価した（アプライドジェネティクスラボラトリー社（Applied Genetics Laboratories, Inc.））。分析した１００個の細胞で染色体異常は見られなかった。細胞遺伝子分析により、常染色体の数は正常であり、染色体数（modal chromosome number）は４６本であることが示された。図１５は、ヒト胚性幹細胞系Ｈ９から得られる典型的な核型を示したものである。
（実施例１３）
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上でのヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をウィセル・リサーチ・インスティテュート社（WiCell Research Institute, Inc.）（ウイスコンシン州マディソン所在）より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、２０％ノックアウト血清リプレースメント、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ βメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと４ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））からなるＥＳ細胞培地中、マウス胚繊維芽（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で細胞を培養した。ＭＥＦ細胞はＥ１３〜１３．５のマウス胚から誘導されたものをチャールズリバー社（Charles River）より購入した。ＭＥＦ細胞は、１０％ＦＢＳ（ハイクローン社（Hyclone））、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したＭＥＦ細胞培養を、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（シグマ社（Sigma）ミズーリ州セントルイス所在）で３時間処理して細胞分裂を停止させた後、トリプシン処理し、０．１％ウシゼラチンコートディッシュに２×１０４／ｃｍ２で播いた。継代数２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。コンフルエンスに達した時点（播種後約５〜７日後）で、ヒト胚性幹細胞を１ｍｇ／ｍｌ ＩＶ型コラゲナーゼ（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））で５〜１０分間処理した後、５ｍｌのガラス製ピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を９００ｒｐｍで５分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して希釈率が１：３０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））でコーティングしたプレート上に１：３〜１：４の細胞比で再播種した。この後、細胞を、８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びコラゲナーゼを添加したＭＥＦ馴化培地中で培養し、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上で少なくとも５代にわたって継代した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞を、ＩＶ型コラゲナーゼ（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））、ディスパーゼ（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））、又はリベラーゼ酵素（ロシュ社（Roche）、インディアナ州）を用いて日常的に継代した。
（実施例１４）
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（Dec 2005）に既に記載されているようにして胚性幹細胞を胚体内胚葉に分化させた。簡単に述べると、約６０〜７０％コンフルエンスのＨ９培養を、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞は希釈率１：３０〜１：１０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上又は希釈率１：３０〜１：１０の通常のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した。各プレートは室温で１時間、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした。
５日目に、ＣＸＣＲ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ９、及びＮ−カドヘリンの発現についてはＦＡＣＳによって、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、ブラキュリ（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（gooscecoid）（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、及びＧＡＴＡ４についてはリアルタイムＰＣＲによって培養を分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７が臓側内胚葉マーカーとみなされるのに対して、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は胚体内胚葉マーカーを代表するものであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを代表するものである。図１７に、ＦＡＣＳにより分析したＣＸＣＲ４の発現を示す。低濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬと比較して、希釈率が１：１０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上で培養した細胞によるＣＸＣＲ４の発現は顕著に増大した。更に、増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬは、通常のＭＡＴＲＩＧＥＬと比較して胚体内胚葉細胞の形成に有効ではなかった。
図１８は、リアルタイムＰＣＲの結果を示したものであり、希釈率１：１０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上で培養した細胞では、希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した細胞と比較して胚体内胚葉が顕著にアップレギュレートされていることが実証された。
（実施例１５）
胚体内胚葉形成後のヒト胚性幹細胞における遺伝子発現の変化のマイクロアレイによる分析
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社（Qiagen））を使用して以下のヒト胚性幹細胞の培養から全ＲＮＡを単離した。即ち、ＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングしたプレート上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ８３細胞、及び、ＭＥＦ細胞上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ４４細胞。各群のコントロールには、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした培養皿に播種し、ＭＥＦ馴化培地中で培養した細胞、又はＭＥＦ上に播種し、ＥＳ培地中で培養した細胞を含めた。
試料の調製、ハイブリダイゼーション、及び画像分析は、アフィメトリックス社（Affymetrix）製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０ Ａｒｒａｙに従って行った。正規化及び対数変換を行った後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウェア（マサチューセッツ州所在）及びＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ビズエックスラブズ社（VizXLabs）、ワシントン州所在）を使用してデータ分析を行った。各処理群内及び異なる処理群間の変動は、ピアソン相関係数を用いて比較した。異なる処理群間の遺伝子発現プロファイルの分散を、グラフ間の相関係数とともに図１９に示す。試料間の遺伝子発現における有意差は、分散分析及び０．０５以下の調節ｐ値を用いたＦ検定（Benjamini and Hochberg相関）を用いて評価した。プレゼントコール（present call）が示された遺伝子のみが分析に含まれた。表ＩＶに、異なる試料間で発現量に少なくとも５倍の差が見られた遺伝子を示す。有意に発現された遺伝子の正規化された強度値を、各遺伝子の標準誤差（ＳＥＭ）とともに示した。
（実施例１６）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（Dec 2005）に既に記載されているようにして胚性幹細胞を胚体内胚葉に分化させた。簡単に述べると、約６０〜７０％コンフルエンスに達した増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈率１：３０）培養上に播いたＨ９、Ｈ７又はＨ１細胞を、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。以下のすべての実施例において、特に断らないかぎり、この処理レジメンを胚体内胚葉（ＤＥ）プロトコールと称する。
これと並行して、ＭＥＦフィーダー上で培養したＨ９、Ｈ７又はＨ１細胞も上記に述べた同じＤＥプロトコールに供した。
５日目に、ＣＸＣＲ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ９、ＣＤ９９及びＮ−カドヘリン（ＣＤ５６）の発現についてはＦＡＣＳによって、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、ブラキュリ（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（gooscecoid）（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、及びＧＡＴＡ４についてはリアルタイムＰＣＲによって培養を分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７が臓側内胚葉マーカーとみなされるのに対して、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は胚体内胚葉マーカーを代表するものであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを代表するものである。
マウスフィーダー細胞上で培養し、ＤＥプロトコールに供したＨ細胞系は、各胚体内胚葉（ＤＥ）マーカーを著明に発現し、ＦＡＣＳによってＣＸＣＲ４の発現が確認された（図２０）。ＤＥプロトコールによる処理後にはＥ−カドヘリンの発現の顕著な減少も認められた。最後に、ＣＸＣＲ４＋の集団はＣＤ１１７についても陽性に染色された。図２１は、非処理のＨ７（図２１、パネルａ）及びＨ９細胞（図２１、パネルｂ）と比較して、各胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションを示している。
ＭＥＦフィーダー上で培養したＨ細胞系と異なり、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈率１：３０）上で培養し、胚体内胚葉プロトコールで処理したＨ細胞系では、胚体内胚葉マーカーの著明な発現は認められなかった。特に、ＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲにより示される発現は、マウス胚繊維芽細胞上で培養した細胞と比較して、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞において大幅に低かった。胚体内胚葉マーカーの発現は、Ｈ１がＨ９よりも高く、Ｈ９がＨ７よりも高いという一般的な応答パターンにしたがっている（図２２及び２３）。図２２から分かるように、Ｈ１細胞はＨ７及びＨ９細胞系と比較して、ＣＸＣＲ４の発現に顕著な増大が認められた。いずれの場合においても、ＣＸＣＲ４の発現は、マウス胚繊維芽細胞上で培養した細胞と比較してＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈率１：３０）上で培養した細胞では低かった点に注意されたい。図２３（パネルａ〜ｃ）は、リアルタイムＰＣＲの結果を示したものであり、Ｈ７（図２３、パネルａ）及びＨ９（図２３、パネルｂ）細胞系において胚体内胚葉マ−カーのアップレギュレーションがある程度増大したことを示している。しかしながら、Ｈ１（図２３、パネルｃ）細胞系は、Ｈ７及びＨ９細胞系と比較してより顕著な胚体内胚葉マーカーのアップレギュレーションを示した。
（実施例１７）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Ｗｎｔリガンドの役割
Ｈ７Ｐ４４及びＨ９Ｐ４６胚性幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈度１：１０）でコーティングした培養皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。培養の一部のものには、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログＮｏ．１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−５ａ（カタログＮｏ．６５４−ＷＮ−０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）、２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−７ａ（カタログＮｏ．３００８−ＷＮ−０２５、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）、又は２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−５ｂ（カタログＮｏ．３００６−ＷＮ−０２５、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）を５日間の処理期間の全体を通じて加えた。図２４は、高濃度の（Ａ）ＡＡ、又は（Ｂ）ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの存在下でのＨ９Ｐ４６胚体内胚葉培養の位相差顕微鏡画像を示したものである。図２５は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈率１：３０）上で培養し、ＤＥプロトコール＋Ｗｎｔ−３ａ（図２５、パネルｂ及びｄ）、及び−Ｗｎｔ−３ａ（図２５、パネルａ及びｃ）に供したＨ７Ｐ４４及びＨ９Ｐ４６細胞系について、ＦＡＣＳにより調べた５日目のＣＸＣＲ４の発現を示したものである。Ｗｎｔ−３ａがＤＥ培養中に存在する場合、低血清及び高濃度のＡＡで処理したＤＥ培養と比較して、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の著明な発現が見られた。図２６は、低血清＋ＡＡ±Ｗｎｔリガンドで処理した、Ａ）Ｈ７及びＢ）Ｈ９の培養についてリアルタイムＰＣＲのデータを示したものである。いずれのＨ細胞系においても、Ｗｎｔ−３ａを添加することにより、胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションが認められた。これに対し、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ及びＷｎｔ−７ａは、胚体内胚葉マーカーの発現にほとんど影響を及ぼさなかった。
（実施例１８）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Ｗｎｔ−３ａの有効量
Ｈ９Ｐ４６胚性幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈度１：１０）でコーティングした培養皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）及び１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。コントロール培養はＷｎｔ−３ａで処理しなかった。図２７において、パネルａ）はＷｎｔ−３ａの非存在下、ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ、ｃ）２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ、及びｄ）５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの存在下における５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示したものである。Ｗｎｔ−３ａの非存在下ではＣＸＣＲ４の発現は極めて低かった。これに対し、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを添加することにより、ＣＸＣＲ４陽性細胞の数が顕著に増加した。更に、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの添加は、５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの添加と同様に効果的であった。リアルタイムＰＣＲの結果によってもこの知見が確認された（図２８、パネルａ）。
別の実験において、Ｈ９Ｐ５２細胞を１：３０に希釈した低増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に播種した。ＤＥプロトコールの最初の２日間において、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌの異なる用量のＷｎｔ−３ａを使用した。図２８のパネルｂは、処理の５日後のＤＥマーカーのＰＣＲ分析を示したものである。実験終了実施例における細胞数を図２８のパネルｃに示す。この結果は、高用量のＷｎｔ−３ａを使用した場合に細胞が増殖することを示している。Ｗｎｔ−３ａによる処理を５日間に延長することによって（５Ｄ）、ＰＣＲによるＤＥマーカーの結果にはほとんど影響は見られず、細胞数の大きな増加も認められなかった（図２８、パネルｃ）。これらのデータは、２日間の１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａによる処理が、細胞の最適な増殖及び胚体内胚葉分化に充分であることを示すものである。
（実施例１９）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の影響
Ｗｎｔ−３ａの影響がＷｎｔ経路を介したものであることを確認するため、ＧＳＫ−３阻害剤を使用してβカテニン等のＷｎｔの下流の標的分子を活性化した。Ｈ９Ｐ４６〜Ｐ４８胚性幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：１０）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１０〜１０００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）カリフォルニア州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）、及び０〜１０００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）カリフォルニア州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。コントロール培養は、低血清及び高用量のアクチビンＡ±Ｗｎｔ−３ａで処理した。図２９において、パネルａはＷｎｔ−３ａもＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も加えない場合、ｂ）＋２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ、ｃ）＋１０００ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｄ）＋５００ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｅ）＋１００ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｆ）＋１０ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、ｇ）＋１００ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを１〜２日目、及びｈ）＋１０ｎｇ／ｍｌのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを１〜２日目に加えた場合の５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示したものである。
Ｗｎｔ−３ａの非存在下又は１０ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の存在下では、ＣＸＣＲ４の発現は極めて低かった。これに対し、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ又は１００〜１０００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の添加により、ＣＸＣＲ４陽性細胞の数は顕著に増大した。更に、１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を１〜２日目に添加した場合、１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を５日間の期間全体にわたって添加した場合と同様に効果的であった。図３０は、Ｈ９Ｐ４８細胞（パネルａ）及びＨ９Ｐ４６細胞（パネルｂ）における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。
図１６は、無フィーダー系で胚性幹細胞を胚体内胚葉に分化させる本発明の分化プロトコールの概要を示す。
（実施例２０）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤又はＷｎｔ−３ａの存在下におけるアクチビンＡの有効量
Ｈ９Ｐ４９及びＨ１Ｐ４６胚性幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：１０）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）又は２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。コントロール培養は、低血清及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで処理した。図３１は、ａ）１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、ｂ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａを最初の２日間、ｃ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、ｄ）１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、ｅ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａを最初の２日間、並びに、ｆ）１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａを最初の２日間加えた場合の、５日目のＨ９Ｐ４９及びＨ１Ｐ４６におけるＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示したものである。図３１のパネルａ〜ｄはＨ９Ｐ４９細胞のものであり、パネルＥ〜ＦはＨ１Ｐ４６細胞のものである。図３２は、１０、５０、又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａで処理したＨ９Ｐ４９細胞における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示したものであり、パネルａはＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現を示し、パネルｂはＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現を示す。５０ｎｇ／ｍｌのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａ又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを使用することによって胚体内胚葉マーカーが著明に発現するようである。アクチビンＡを低用量で使用すると胚体外内胚葉が形成される。
（実施例１６）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Ｗｎｔ−３ａとＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の組み合わせ
Ｈ９Ｐ５３胚性幹細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）を添加し、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを加える（＋）か、加えない（−）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。これと並行して、Ｈ９Ｐ５３培地を、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４（カタログＮｏ．３１４−ＢＰ−０１０、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）±２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３Ａ±１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで処理した。コントロール培養は、低血清及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで処理した。図３３は、ａ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を３〜５日目、ｂ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを最初の２日間、ｃ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、ｄ）２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を５日間全体、ｅ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを５日間全体、及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸを最初の２日間、並びに、ｆ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を５日間全体にわたって加えた場合の、５日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示したものである。図３４は、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代数４６のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。図３５は、５０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１０又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤で処理した、継代数４９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の培養についてリアルタイムＰＣＲで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。パネル（ａ）：ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ及びＰＯＵ５Ｆ（Ｏｃｔ−４）の発現、並びに、パネル（ｂ）：ＳＯＸ−１７及びＧＡＴＡ４の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。図３６は、アクチビンＡ、Ｗｎｔ−３ａ、ＧＳＫ−３阻害剤、及びＢＭＰ−４の組み合わせで処理したＨ９Ｐ５３培養における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。Ａ）ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＨＮＦ−３Ｂ及びＳＯＸ７の発現、並びに、Ｂ）ＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ４の発現。ＤＥプロトコールにＢＭＰ−４を加えることにより、中胚葉マーカーであるＢＲＹの形成が誘導されるようであるが、Ｗｎｔ−３ＡとＧＳＫ−４Ｂ阻害剤の組み合わせでは、アクチビンＡの存在下で各物質を添加した場合と比較して、胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションは認められなかった。
（実施例２２）
ＭＥＦ上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−低血清中でのＷｎｔ−３ａ、アクチビンＡ、Ｗｎｔ−５ａ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＩＬ−４及びＳＤＦ−１の組み合わせ
Ｈ９Ｐ４４細胞を、マイトマイシン処理したマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）で予めコーティングした６穴プレート上に播種した。２０％ノックアウト血清リプレースメント、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ βメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（すべてインビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO）より入手）、及び８ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems））を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））からなるＥＳ細胞培地中で７０〜８０％コンフルエンスに達するまで細胞を培養した。
胚体内胚葉（ＤＥ）を形成するため、細胞をアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、更に下記に詳述する他の増殖因子で処理した。各増殖因子は、下記のレジメンに示されるように段階的に濃度を増加させたＦＢＳに添加した。
０日目：０％のＦＢＳをＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えた。
１日目：０．５％のＦＢＳをＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えた。
２日目：２％のＦＢＳをＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えた。
３日目：細胞を採取してＦＡＣＳ分析及びＲＴ−ＰＣＲに供した。
増殖因子はすべて、Ｒ＆Ｄシステムズ社（（R&D Systems）ミネソタ州所在）より購入した。各処理群における増殖因子の詳細な説明及び濃度を下記に示す。
１．コントロール：増殖因子を添加しなかった。
２．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）
３．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ５ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）
４．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ５ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍｌ）
５．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）
６．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）
７．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍｌ）
８．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍｌ）
９．ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）
１０．ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）
１１．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）
１２．ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ．ｍｌ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍｌ）
１３．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ．ｍｌ）＋ＢＭＰ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍｌ）
１４．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）
１５．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋（ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）
１６．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ−３ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ−５ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｗｎｔ−７ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）
１７．アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＤＦ１ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）
結果
ＤＥプロトコール処理の３日目に細胞を採取した。分析に際しては、処理細胞の一定分量をＲＴ−ＰＣＲ用のＲＮＡの調製に使用し、残りの細胞をＦＡＣＳ分析に使用した。ＣＸＣＲ４の出現頻度（％）を図３７に示す。上記の増殖因子の添加により、ＣＸＣＲ４の発現は、低血清中での１００ｎｇ／ｍｌのＡＡによる処理以上には促進されなかった。
ＲＴ−ＰＣＲ分析では、選択された一群の胚体内胚葉マーカーの発現について細胞を分析した。示した結果は、基本培地中で増殖させたがアクチビンＡ又は他の増殖因子のいずれによっても処理しない細胞に対して検量したものである。ＦＡＣＳのデータと一致するように、表Ｖは、低血清中で高用量のアクチビンＡで処理した培養にＷｎｔ−３ａ等の増殖因子を添加しても胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションが認められなかったことを示している。これは、アクチビンＡ、ＷＮＴ３Ａ、及び低血清の存在下で培養したＥＳ細胞においてＤＥマーカーの顕著な増大が認められた上記の実施例とは対照的である。
（実施例２３）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ又はヒトフィブロネクチンでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
Ｈ９Ｐ５５細胞を、ヒトフィブロネクチン又は通常の増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））上で増殖及び分化させた。１μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems））を含む１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））を組織培養処理した６穴培養皿の各ウェルに加えた。これとは別に、通常の増殖因子ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標名）をＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１：１０に希釈し、希釈したＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標名）を組織培養処理した６穴培養皿の各ウェルに１ｍｌずつ加えた。細胞を、コラゲナーゼを用いて継代した。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、以下のように処理した。即ち、１０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含む０．５％ＦＢＳ中で２日間処理した。この後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで３日間処理した。図３８のパネルａ及びｂは、それぞれ、フィブロネクチン及びＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した胚性幹細胞によるＣＸＣＲ４の発現を示したものである。リアルタイムＰＣＲの結果（図３９）により、フィブロネクチンでコーティングしたプレート及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングしたプレートで胚体内胚葉の形成は同等であることが確認された。
（実施例２４）
異なる濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
約６０〜７０％コンフルエンスのＨ９培養を、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞は希釈率１：６０〜１：１０の通常のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上で培養した。各プレートはＭＡＴＲＩＧＥＬで１時間、室温でコーティングした。
リアルタイムＰＣＲの結果を図４０に示す。低血清、アクチビンＡ、及びＷｎｔ−３ａによるヒト胚性幹細胞の処理により、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、グースコイド（Goosecoid）、ＨＮＦ−３β、及びＳＯＸ−１７遺伝子の発現が認められ、細胞が胚体内胚葉段階に分化していることが示唆された。しかしながら、Ｗｎｔ−３ａの存在下では、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングの濃度は分化において重要な役割を果たしてはいないようである。
（実施例２５）
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養した後、ＭＥＦ上で培養したヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Ｗｎｔ−３ａの役割
少なくとも５代にわたってＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養したヒト胚性幹細胞系Ｈ９から得た細胞をＥＳ培地中でＭＥＦフィーダー上に播いた。細胞が約６０〜７０％コンフルエンスに達した時点で、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露し、その後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。更なる処理群として、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａで５日間すべて、及び１０〜１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで処理した群を置いた。
３日目及び５日目に、培養をＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、ブラキュリ（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（gooscecoid）（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ４についてリアルタイムＰＣＲにより分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７が臓側内胚葉マーカーとみなされるのに対し、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は胚体内胚葉マーカーを代表するものであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを代表するものである。ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ−４はそれぞれ自己再生能及び多能性のマーカーである。リアルタイムＰＣＲの結果を図４１のパネルａ〜ｄに示す。３日目及び５日目にＦＡＣＳ分析も行った。ＣＸＣＲ４及びＣＤ９の発現レベルを分析し、図４１のパネルｅに示した。
Ｗｎｔ−３ａの非存在下では、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ中で培養した細胞のＡＦＰ発現レベルは非処理のコントロールにおける発現レベルと同様であった。しかしながら、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ中で培養した細胞にＷｎｔ−３ａを加えることによって、ＡＦＰの発現に経時的な増加が認められた。低濃度のアクチビンＡを使用した場合、Ｗｎｔ−３ａの存在に関わらずＡＦＰの発現は極めて高かった（図４１、パネルａ）。このことは、細胞の胚体外組織への分化を防止するには高濃度のアクチビンＡが必要であることを示唆するものである。
ＦＡＣＳ分析により、高濃度のアクチビンＡで処理したがＷｎｔ−３ａでは処理しない試料の集団ではＣＸＣＲ４陽性細胞が３２〜４２％であったのに対して、３日目に高濃度のアクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理した試料の集団では２３〜３３％であることが示された（図４１、パネルｅ）。処理５日目までには、高濃度のアクチビンＡで処理したがＷｎｔ−３ａでは処理しなかった細胞の２８〜３２％がＣＸＣＲ４を発現したのに対し、高濃度のアクチビンＡ及びＷｎｔ−３ａで処理した細胞では４３〜５１％であった（図４１、パネルｆ）。低濃度のアクチビンＡで処理した細胞では、Ｗｎｔ−３ａ処理群（３〜４％）と比較してＷｎｔ−３ａで処理しなかった処理群においてＣＸＣＲ４陽性細胞がより多かった（１１〜２０％）（図４１、パネルｇ）。以上まとめると、Ｗｎｔ−３ａは、ＭＥＦ上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化において重要な役割を果たしてはいないようである。このことは、フィーダー層が、アクチビンＡによって誘導される胚体内胚葉の形成を促進するうえで充分なＷｎｔ−３ａ又は類似のリガンドを恐らく分泌していることを示唆するものである。
（実施例２６）
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の、Ｗｎｔ阻害剤ＤＫＫ−１による処理後の胚体内胚葉への分化
Ｗｎｔ−３ａの添加によって分化の増大がもたらされるか否かを調べるため、Ｗｎｔ−３シグナル伝達の阻害剤を培養に加えた。約６０〜７０％コンフルエンスのＨ９培養を、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、１００ｎｇ／ｍｌのＤｉｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。Ｈ９細胞は希釈率１：３０の増殖因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプレート上で培養した。各プレートはＭＡＴＲＩＧＥＬで１時間、室温でコーティングした。
５日目に、培養を、ＳＯＸ−１７、ＳＯＸ−７、α胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＸＣＲ４、ブラキュリ（Brychyury）（Ｂｒｙ）、グースコイド（gooscecoid）（ＧＳＣ）、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ４についてリアルタイムＰＣＲにより分析した。ＡＦＰ及びＳＯＸ−７が臓側内胚葉マーカーとみなされるのに対し、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ−１７は胚体内胚葉マーカーを代表するものであり、ＧＳＣ、Ｂｒｙ、及びＣＸＣＲ４は原始線条のマーカーを代表するものである。ｈＴＥＲＴ及びＯｃｔ−４はそれぞれ自己再生能及び多能性のマーカーである。結果を図４２に示した。
Ｗｎｔ−３ａの存在下では、細胞はいずれも胚体内胚葉のマーカーであるＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β及びＳＯＸ１７を発現している。グースコイド（gooscecoid）等の原始線条形成のマーカーも、非処理のコントロールにおいて検出されるよりも高いレベルで検出された。ＤＫＫ１の添加により、上記の分化のマーカーの発現レベルは非処理の細胞における発現レベルと同等のレベルにまで劇的に減少した。
（実施例２７）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養し、低血清及びアクチビンＡ±Ｗｎｔ−３ａで分化させたＨ９胚性幹細胞におけるＤＥマーカーの免疫蛍光染色
５日目のＨ９細胞のＤＥ培養を、実施例１０に従ってＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３Ｂ、ＧＡＴＡ−４、Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンについて染色した。すべての核をＤＡＰＩで対比染色した。２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａにより、Ｗｎｔ−３ａの非存在下で分化させた培養と比較して大幅に多数の核がＳＯＸ−１７、ＨＮＦ−３β及びＧＡＴＡ−４について陽性に染色された。更に、Ｗｎｔ−３ａの添加により、Ｅ−カドヘリンの発現が著しく消失し、Ｎ−カドヘリンの発現が昂進した（図４３、パネルａ及び図４３、パネルｂ）。
（実施例２８）
ＭＥＦ又はＭＡＴＲＩＧＥＬ上での胚体内胚葉形成後の胚性幹細胞における遺伝子発現の変化のマイクロアレイによる分析
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社（Qiagen））を使用して以下の胚性幹細胞の培養から全ＲＮＡを単離した。即ち、Ａ）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングしたプレート（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ３３細胞、Ｂ）ＭＥＦ細胞上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ４４細胞、及びＣ）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標名）コーティングしたプレート（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理したＨ９Ｐ４８細胞。各群のコントロールには、ＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングした培養皿に播種し、ＭＥＦ馴化培地中で培養した細胞、又はＭＥＦ上に播種し、ＥＳ培地中で培養した細胞を含めた。すべての群で３つの生物学的複製物を用い、各生物学的複製物を２個の別々の遺伝子チップ上で繰り返し用いた。
試料の調製、ハイブリダイゼーション、及び画像分析は、アフィメトリックス社（Affymetrix）製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０ Ａｒｒａｙに従って行った。正規化及び対数変換を行った後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウェア（マサチューセッツ州所在）及びＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ビズエックスラブズ社（VizXLabs）、ワシントン州所在）を使用してデータ分析を行った。試料間の遺伝子発現における有意差は、分散分析及び０．０５以下の調節ｐ値を用いたＦ検定（Benjamini and Hochberg補正）を用いて評価した。少なくとも１つの群においてプレゼントコール（present call）が示された遺伝子のみが分析に含まれた。表ＶＩに、Ａ群、Ｂ群及びＣ群間で少なくとも５倍の差を示す平均正規化、対数変換した遺伝子のシグナル強度を、各遺伝子の調節ｐ値とともに示す。
（実施例２９）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたＳＡ００２ ＥＳ細胞系の胚体内胚葉への分化
８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ−ＣＭ中、ＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングしたプレート（希釈率１：３０）上で少なくとも３代にわたって予め培養したＳＡ００２ Ｐ３８細胞（セラーティス社（Cellartis）スウェーデン）を、０．５％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）±２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ又は１００ｎＭのＧＳＫ−３ＢＩＸ阻害剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。リアルタイムＰＣＲの結果を図４４のパネルａ及びｂに示す。Ｈ１、Ｈ７及びＨ９細胞系と同様、ＳＡ００２細胞系も、ＤＥマーカーの顕著な発現にはＷｎｔ−３Ａの添加をやはり必要とした。図４５にＣＸＣＲ４の発現を示す。ａ）ＡＡで処理、ｂ）ＡＡ＋Ｗｎｔ−３ａ、ｃ）ＡＡ＋ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤。
（実施例２５）
ヒト血清でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
継代数５５のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の培養をヒト血清（シグマ社（Sigma）Ｎｏ．Ｈ１３８８、ミズーリ州所在）でコーティングしたプレート上で増殖及び分化させた。０．５ｍｌのヒト血清を組織培養処理した６穴培養皿の各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、ヒト胚性幹細胞を加える前に吸引した。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、以下のように処理した。即ち、１０ｎｇ／ｍｌのマウス組み換えＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ）又は１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含む０．５％ＦＢＳ中で２日間処理した。この後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで３日間処理した。この後、培養をリアルタイムＰＣＲで分析した（図４６、パネルａ及びｂ）。アクチビンＡのみで処理した細胞と比較して、アクチビンＡ＋ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤又はＷｎｔ−３Ａで処理した細胞では胚体内胚葉マーカーの著明な発現が認められた。これらの所見は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はヒトフィブロネクチンでコーティングしたプレート上で培養したヒト胚性幹細胞における我々の発見に対応したものである。
（実施例３１）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−異なるＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の評価
ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉（ＤＥ）の形成における市販の多くのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の有効性を評価した。以下のＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を１００ｎＭで評価した。即ち、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＶＩＩＩ（カタログＮｏ．３６１５４９、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログＮｏ．３６１５５０、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩ（カタログＮｏ．３６１５５３、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩＩ（カタログＮｏ．３６１５５４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州所在）。Ｈ１Ｐ５４ ＥＳ細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標名）（希釈度１：３０）でコーティングした培養皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）±各種ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。コントロール培養を低血清及び高用量のＡＡで処理した。図４７のパネルａ及びｂは、５日目における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示したものである。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＸＩは、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＶＩＩＩ及びＸＩＩと比較してＤＥの形成を誘導するうえでいずれも有効であった。
（実施例３２）
無フィーダー条件下で培養されたヒト胚性幹細胞による膵臓内胚葉の形成−レチノイン酸類似体の評価
Ｈ９Ｐ４９胚性幹細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈度１：３０）でコーティングした培養皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログＮｏ．１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）、及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）ミネソタ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。５日目に細胞を回収してＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲによる評価を行った。上記の実施例において示したように、このプロトコールによりＣＸＣＲ４及びＳＯＸ−１７のような胚体内胚葉マーカーが顕著にアップレギュレートされた。得られた５日目の胚体内胚葉細胞を以下の培地条件に曝露して膵臓内胚葉の形成を誘導した。即ち、２％ＦＢＳ及び１μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）（カタログＮｏ．Ｒ２６２５、シグマ社（Sigma）、ミズーリ州所在）、又は０．１〜１０μＭのＡＭ−５８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸、カタログＮｏ．Ａ８８４３、シグマ社（Sigma）、ミズーリ州所在）、又は０．１〜１μＭのＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（アロチノイド酸）、カタログＮｏ．Ｔ３７５７、シグマ社（Sigma）、ミズーリ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で３日間培養した。ＡＭ−５８０及びＴＴＮＰＢは、レチノイン酸受容体に対する親和性を有するレチノイン酸類似体である。ＲＡ処理の後、２％ＦＢＳ及び２０〜５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（カタログＮｏ．Ｆ０２９１、シグマ社（Sigma）、ミズーリ州所在）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で更に３日間処理した。細胞を収穫し、ｍＲＮＡの試料を採取して分析に供した。
遺伝子発現分析（図４８パネルａ〜ｄ）により、１μＭのＲＡの添加後にｂＦＧＦに曝露することにより、ＰＤＸ−１等の膵臓内胚葉マーカーが顕著にアップレギュレートされることが示された。更にこのプロトコールにより、ＣＤＸ−１及びＡＦＰ等の前腸内胚葉マーカーの著明な発現が認められた。１μＭの濃度では、ＲＡ類似体の添加により、同等の膵臓内胚葉及び前腸内胚葉マーカーの発現が見られた。しかしながら、１μＭのＲＡ類似体の添加により、オールトランスレチノイン酸と比較してより顕著なＡＦＰの発現が認められた。しかしながら、１０μＭのＡＭ−５８０の添加によってＰＤＸ−１の発現レベルは高く維持されたままでＡＦＰ及びＣＤＸ−２の発現が抑制された。
（実施例３４）
ヒト胚性幹細胞におけるサイトカイン発現に対するＷｎｔ−３ａ処理の影響
Ｗｎｔ−３ａによる処理がサイトカイン発現に与える影響についてタンパク質アレイを用いて分析を行った。ヒト胚性幹細胞系Ｈ９の細胞を実施例１５で述べた方法に従って培養した。継代数５４において、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ±１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａの存在下で細胞を２日間分化させた。この後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で細胞を更に３日間培養した。５日目の終わりに、ＣＸＣＲ４の発現を各処理群についてＦＡＣＳにより調べた。アクチビンＡのみで処理した細胞ではＣＸＣＲ４を発現した細胞は１％に過ぎなかった。アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理した細胞では、７３％の細胞がＣＸＣＲ４の発現について陽性であった。
哺乳動物細胞溶解キット（シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州所在）を用いて各処理群の細胞から細胞溶解物を調製した。各処理群からの馴化培地を回収して濃縮した。レイ・バイオテック社（（RayBiotech）、ジョージア州所在）（http://www.raybiotech.com/）によって提供されるＣｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙパネルを使用してサイトカインアレイ分析を行った。表ＶＩＩに、サイトカイン、増殖因子、並びにデータの正規化及びバックグランド除去後の受容体の発現を示す。各パネルに対して、ポジティブ及びネガティブコントロールも含まれた。示したデータは、細胞処理群ごとに２つの独立した試料（１、２）のものである。
Ｗｎｔ−３ａ処理細胞で馴化した培地では、アンジオゲニン、ＩＧＦＢＰ−１及びＥＧＦの著明なアップレギュレーションが認められた。ＩＧＦＢＰ−１、ＴＧＦβ−１及びＴＧＦβ−３等の多くのタンパク質がＷｎｔ−３ａ処理細胞の溶解物中でアップレギュレートされた。これらのアップレギュレートされたタンパク質を分化培地に再び添加することにより、胚体内胚葉形成に対するＷｎｔ−３ａの効果を補充又は促進することが可能である。
（実施例３５）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化：Ｗｎｔ１の役割
Ｈ１Ｐ５５ ＥＳ細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（希釈度１：３０）でコーティングした培養皿上で培養し、０．５％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ±１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−１（ペプロテック社（PeproTech）、ニュージャージー州所在、カタログＮｏ．１２０−１７）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＡＡ）±１０又は２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。以下のＷｎｔ１＋ＡＡの組み合わせについて試験を行った。
ａ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで３日目、ｂ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで３〜５日目、ｃ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、１０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで３日目、ｄ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、１０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで３〜５日目、ｅ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌ＋のＡＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１で３日目、ｆ）０．５％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２中、２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡで１〜２日目の後、２％ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍｌのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１で３〜５日目。図４９のパネルａ及びｂに、Ｈ１細胞を低血清、ＡＡ及びＷＮＴ１で処理した後の胚体内胚葉マーカーについてのリアルタイムＰＣＲのデータを示す。１００ｎｇ／ｍｌのＡＡの存在下で２０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ１を添加することにより、胚体内胚葉マーカー（Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ−３Ｂ及びＧＡＴＡ−４）の顕著なアップレギュレーションが認められた。
（実施例３６）
膵臓内分泌分化に対するグルコースの影響
膵臓内胚葉細胞の膵臓内分泌細胞への分化の効率は、例えば基本培地の選択、又はグルコースの濃度等の多くの因子に依存する。胚性幹細胞から誘導された膵臓内胚葉細胞の膵臓内分泌細胞への分化に対するグルコース濃度の影響を調べた。
基本培地を変更することによるグルコース濃度の変化：未分化のヒト胚性幹細胞（Ｈ１及びＨ９）の培養物を、膵臓内胚葉細胞への分化に先立って、実施例１に述べた方法に従って培養した。胚性幹細胞を、血清の非存在下、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含むＲＰＭＩ中で１日培養することによって膵臓内胚葉細胞に分化させた。この期間の後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び０．２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で細胞を更に２日間培養した。この処理の後、２％ＦＢＳ、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（２５０ｎＭ）を含むＲＰＭＩで培地を置き換えた。この培地中で細胞を４日間培養した。この期間の後、１ｘＢ２７を添加した、オールトランスレチノイン酸（２μＭ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含む培地に４日間置き換えて膵臓内胚葉細胞の形成を誘導した。膵臓内胚葉細胞の収率は、低グルコースＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２で処理した培養で有意な差は見られなかった。
膵臓内胚葉細胞をエキセンジン４及びＨＧＦで処理することによって膵臓内分泌細胞に分化させた。エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は低グルコースＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０日間加えた。両培地に１ｘＢ２７を添加した。培養を収穫し、ｍＲＮＡの試料を採取して分析に供した。試料は、（Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401（2006））に開示される方法に従って得られた膵臓内胚葉に対して標準化された。
インスリンの発現をリアルタイムＰＣＲにより分析した。図５０のパネルａ及びｂに示されるように、インスリン及びグルカゴン遺伝子の発現は、ＤＭＥＭ−低グルコース中で処理した細胞と比較してＤＭＥＭ／Ｆ１２中で処理した細胞においていずれも大きく増大した。インスリンの発現を更に免疫組織化学法によって分析した（図５１）。ＤＭＥＭ／Ｆ１２中での処理により、ＤＭＥＭ−低グルコースと比較してインスリン陽性細胞の比率が大きくなった（図５１、パネルａ及びｂ）。インスリン陽性細胞はＰＤＸ−１についても陽性であった（パネルｃ）。
グルコース濃度の変化：未分化のヒト胚性幹細胞（Ｈ１及びＨ９）の培養物を、膵臓内胚葉細胞への分化に先立って、実施例１に述べた方法に従って培養した。胚性幹細胞を、血清の非存在下、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含むＲＰＭＩ中で１日培養することによって膵臓内胚葉細胞に分化させた。この期間の後、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び０．２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で細胞を更に２日間培養した。この処理の後、２％ＦＢＳ、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（２５０ｎＭ）を含むＲＰＭＩで培地を置き換えた。この培地中で細胞を４日間培養した。この期間の後、１ｘＢ２７を添加した、オールトランスレチノイン酸（２μＭ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含むＣＭＲＬに４日間置き換えて膵臓内胚葉細胞の形成を誘導した。この培地に５、１０又は２０ｍＭのグルコースを添加した。膵臓内胚葉細胞の収率は、５、１０又は２０ｍＭのグルコースで処理したＨ９胚性幹細胞から誘導された培養で有意な差は見られなかった（図５２、パネルａ）。
膵臓内胚葉細胞を、１ｘＢ２７、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＣＭＲＬで、５、１０又は２０ｍＭグルコース中、２、４又は１０日間細胞を処理することによって膵臓内分泌細胞に分化させた。細胞を収穫し、ｍＲＮＡの試料を採取して分析に供した。試料は、（Nature Biotechnology 24, 1392-1401（2006））に開示される方法に従って得られた膵臓内胚葉に対して標準化された。
図５２のパネルｂ〜ｇは、ヒト胚性幹細胞系Ｈ９から誘導された細胞におけるＮｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤ−１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ−４、インスリン及びグルカゴンの発現に対するグルコースの影響を示したものである。Ｎｇｎ３は、膵臓の内分泌細胞の運命決定に関与する最初の転写因子であり、ＮｅｕｒｏＤ１はＮｇｎ３の直接的な標的である。グルコース刺激はＮｇｎ３及びＮｅｕｒｏＤ１の両方のｍＲＮＡレベルを用量依存的に増大させた。別の２つの重要な膵臓マーカーであるＮｋｘ２．２及びＰａｘ−４もやはり同様の発現パターンを示した（図５２、パネルｄ及びｅ）。１０ｍＭのグルコースで１０日間処理した細胞において最適なインスリン及びグルカゴンの発現が観察された（図５２、パネルｆ及びｇ）。
Ｎｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤ−１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ−４について同様の結果が、ヒト胚性幹細胞系Ｈ１から誘導された培養において観察された（表ＶＩＩＩ）。しかしながら、２０ｍＭのグルコースで１０日間処理した細胞において最適なインスリン及びシナプトフィシンの発現が観察された（表ＶＩＩＩ）。
本発明の方法によって形成されたインスリン発現細胞から放出されるＣ−ペプチド：グルコース介在Ｃ−ペプチド放出を、２、１０又は２０ｍＭのグルコースで処理したＨ１細胞から誘導されたインスリン陽性細胞で観察した。Ｃ−ペプチド放出を引き起こすため、細胞をまず、重炭酸塩及びＨＥＰＥＳを含むクレブス・リンゲル液（ＫＲＢＨ；１２９ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ）と１時間インキュベートした。培地を捨て、２ｍＭのＤ−グルコースを含むクレブス・リンゲル液で置き換えた。細胞を２０ｍＭグルコース又は０．５ｍＭのＩＢＭＸ（すべてシグマ（Sigma）社より購入）で１時間刺激した。刺激上清中のＣ−ペプチド濃度を基本上清中のＣ−ペプチド濃度で割ることによって各培養について刺激倍数（fold stimulation）を計算した。
ＢＭＸは、Ｃ−ペプチドの放出を１．２〜３倍に刺激した（図５３）。２０ｍＭグルコースはＣ−ペプチド放出を刺激しなかった。２、１０及び２０ｍＭグルコース中で形成されたインスリン陽性細胞間で、Ｃ−ペプチド分泌に有意な差は認められなかった。
以上まとめると、我々のデータは、グルコースが内分泌マーカーであるＮｇｎ３及びＮｅｕｒｏＤ１の用量依存的なアップレギュレーションを誘導することを示唆するものであり、このことは、グルコースが、ヒト胚細胞の膵臓内分泌細胞への用量依存的な分化を誘導することを示唆している。インスリンの発現もまた、グルコースによって用量依存的に調節される。
本文書の全体を通じて引用した刊行物はそれらの全容を本明細書に援用するものである。本発明の様々な態様を実施例及び好適な実施形態を参照することで上記に説明したが、本発明の範囲は上記の記載によって規定されるものではなく、以下の特許請求の範囲を特許法の原則に則って適切に解釈することによって定義されるものであることは認識されるであろう。
〔実施態様〕
（１） 膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成するための方法において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させること、を含む、方法。
（２） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から分化させられる、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から誘導される、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から誘導される、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記多能性幹細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させられる前に胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させられる、実施態様２に記載の方法。
（６） 前記グルコースが約１０ｍＭの濃度で使用される、実施態様１に記載の方法。
（７） 前記グルコースが約２０ｍＭの濃度で使用される、実施態様１に記載の方法。
（８） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（９） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約２０日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（１０） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約１０日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（１１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約１０日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（１２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約４日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（１３） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間処理する、実施態様１に記載の方法。
（１４） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様６に記載の方法。
（１５） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様７に記載の方法。
（１６） 多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法において、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（１７） 前記グルコースが約１０ｍＭの濃度で使用される、実施態様１６に記載の方法。
（１８） 前記グルコースが約２０ｍＭの濃度で使用される、実施態様１６に記載の方法。
（１９） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２０） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約２０日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間〜約１０日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約１０日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２３） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約４日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２４） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって約２日間処理する、実施態様１６に記載の方法。
（２５） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様２１に記載の方法。
（２６） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約２日間〜約３０日間処理する、実施態様２２に記載の方法。
（２７） 糖尿病を有する患者に実施態様１に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
（２８） 糖尿病を有する患者に実施態様１６に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
（２９） 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、実施態様１６に記載の方法。
（３０） 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、実施態様２９に記載の方法。
（３１） 前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１及びＨ９からなる群の細胞系から誘導される、実施態様３０に記載の方法。

Claims (26)

  1. 膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞を生成するための方法において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞を、グルコースを添加した、ニコチンアミドを含まない培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２〜３０日の間処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させること、を含み、前記グルコースの濃度は、１０ｍＭ〜２０ｍＭの間で調整する、方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞が、ヒトの多能性幹細胞から分化させられる、方法。
  3. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から誘導される、方法。
  4. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞が、ヒトの多能性幹細胞から誘導される、方法。
  5. 請求項２に記載の方法において、前記ヒトの多能性幹細胞が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に更に分化させられる前に胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に分化させられる、方法。
  6. 請求項１に記載の方法において、前記グルコースが１０ｍＭの濃度で使用される、方法。
  7. 請求項１に記載の方法において、前記グルコースが２０ｍＭの濃度で使用される、方法。
  8. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間〜２０日間処理する、方法。
  9. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間〜１０日間処理する、方法。
  10. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって１０日間処理する、方法。
  11. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって４日間処理する、方法。
  12. 請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間処理する、方法。
  13. 請求項６に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、グルコースによって２日間〜３０日間処理する、方法。
  14. 請求項７に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、グルコースによって２日間〜３０日間処理する、方法。
  15. ヒトの多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に分化させるための方法において、
    ａ．前記ヒトの多能性幹細胞を培養する工程と、
    ｂ．前記ヒトの多能性細胞をアクチビンＡで処理することによって、前記ヒトの多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に分化させる工程と、
    ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも１種類の繊維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に分化させる工程と、
    ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、グルコースを添加した、ニコチンアミドを含まない培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２〜３０日の間処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現するヒトの細胞に分化させる工程と、を含み、前記グルコースの濃度は、１０ｍＭ〜２０ｍＭの間で調整する、
    方法。
  16. 請求項１５に記載の方法において、前記グルコースが１０ｍＭの濃度で使用される、方法。
  17. 請求項１５に記載の方法において、前記グルコースが２０ｍＭの濃度で使用される、方法。
  18. 請求項１５に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間〜２０日間処理する、方法。
  19. 請求項１５に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間〜１０日間処理する、方法。
  20. 請求項１５に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって１０日間処理する、方法。
  21. 請求項１５に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって４日間処理する、方法。
  22. 請求項１５に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン４、又はエキセンジン４及びＨＧＦによって２日間処理する、方法。
  23. 請求項１９に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、グルコースによって２日間〜３０日間処理する、方法。
  24. 請求項２０に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記ヒトの細胞を、グルコースによって２日間〜３０日間処理する、方法。
  25. 請求項１５に記載の方法において、前記ヒトの多能性幹細胞がヒトの胚性幹細胞である、方法。
  26. 請求項２５に記載の方法において、前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１及びＨ９からなる群の細胞系から誘導される、方法。
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