KR20080056182A - 간엽 줄기 세포의 유도 방법 - Google Patents

간엽 줄기 세포의 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 세포 배양물을 수득하는 방법으로서, 인간 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니를 분산시킴으로써 수득한 세포 또는 이의 후손세포를 제공하는 단계, 및 FGF2 및 경우에 따라 PDGF AB를 포함하는 무혈청 배지 중에서 영양세포 층의 부재 하에 상기 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 방법을 기술한다. 바람직하게는, 상기 인간 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니는 트립신인 분산제로 분산된다.

Description

간엽 줄기 세포의 유도 방법{METHOD OF DERIVING MESENCHYMAL STEM CELLS}
2005년 9월 2일자로 출원된 미국 가출원 제60/713,992호를 참고한다.
상기 출원, 본원 및 상기 출원 각각의 권리요구 과정 동안에 인용되었거나 언급된 것을 비롯한 본원 및 상기 출원 각각에서 인용되었거나 언급된 각각의 문헌 ("출원 및 인용된 논문"), 상기 출원 및 논문 각각 및 상기 출원 및 인용된 논문 중 임의의 것에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다. 나아가, 본문에서 인용된 모든 문헌, 및 본문에서 인용된 문헌에서 인용되었거나 참조된 모든 문헌, 및 본문 또는 본문에 도입된 임의의 문헌에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다. 본문에 참고로 도입된 문헌 및 이 문헌의 임의의 교시는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 본문에 참고로 도입된 문헌들을 선행기술로 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 발생학, 세포생물학, 분자생물학 및 유전학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 배아 줄기 세포로부터 간엽 줄기 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
분화된 세포와 달리 줄기 세포는 분열하는 능력, 및 표현형적으로 그리고 기 능적으로 상이한 딸세포로 재생되거나 분화하는 능력을 가진다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993; 225:900-918; Choi et al., Methods Mol. Med. 2005; 105:359-368).
마우스 배아 줄기 세포(ESC)는 그들의 다능성(pluripotency) 및 모든 3개 배엽층으로부터 유래된 세포로 분화하는 그들의 능력으로 인해 많은 질환 및 조직 손상에 대한 재생 요법을 위한 세포의 이상적인 공급원이 된다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678). 그러나, 배아 줄기 세포의 이러한 성질은 독특한 도전, 즉 치료 효능을 보장하는 충분한 양 및 동종성으로 특정한 병든 또는 손상된 조직의 치료에 적합한 세포 유형을 발생시키고 조직 회복 및 재생에 대한 유해한 효과를 가질 수 있는 다른 세포 유형의 발생을 억제하는 것을 가능하게 한다. 현재, 특정한 계통(lineage)을 향한 배아 줄기 세포의 분화를 증강시키고/시키거나 특정한 조직 세포 유형을 풍부하게 하는 프로토콜은 너무 비효율적이며 통상적으로 종양형성능을 가지질 수 있는 이종성 세포 집단을 발생시킨다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus andBoheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678).
간엽 줄기 세포(MSC)는 근골격 손상을 치료하고, 심혈관 질환에서 심장 기능을 개선시키고 GVHD의 심각도를 완화시키는 데 있어서 치료 효능이 있음이 입증된 다중능성(multipotent) 줄기 세포이다(Le Blanc and Pittenger, 2005). 계통이 한정되어 있지만, 간엽 줄기 세포는 간엽세포 유형, 예를 들면, 지방세포, 연골세포 및 골세포로 분화하는 한정된 강력한 잠재력을 가지며, 기형종 형성이라는 무시할만한 위험을 가진다. 이식된 MSC의 숙주 면역 거부반응은 통상적으로 자가 이식 또는 동종이형 이식을 통해 회피된다. MSC는 골수(BM), 지방 조직(ad) 및 제대혈을 비롯한 여러 성체 조직으로부터 단리되어 생체 외에서 증식될 수 있다. 그러나, 이들의 단리를 위한 조직의 이용가능성은 한정되어 있으며, 위험한 침윤 절차를 요구하고, MSC의 생체 외 증폭은 상당히 유한하다.
MSC의 대체 공급원은 잠재적으로 위험한 침윤 기법을 불필요하게 할 무한 증폭가능한 다능성 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 무한정한 공급원이다. hESC-유래의 MSC(hESC-MSC)의 숙주 면역 거부반응은 hESC 세포주 은행이 충분히 커질 경우 치료적 클로닝에 의해 발생된 자가 hESC 또는 면역적합성 동종이형 hESC에 의해 잠재적으로 회피될 수 있었다.
hESC로부터 MSC 또는 MSC-유사 세포를 단리하는 것은 이미 보고되어 있다. 문헌(Barberi, et al. (2005) PLoS Med 2, e161)에는 전체 세포 집단의 약 5%를 구성하는 CD73+ 세포에 대해 분류하기 전에 혈청의 존재 하에 hESC를 마우스 OP9 세포와 40일 동안 공-배양하는 단계를 포함하는 프로토콜이 기재되어 있다. 문헌(Xu, C. et al. (2004) Stem Cells 22, 972-80)에는 hTERT(Xu et al.)를 발현하는 레트로바이러스로 hESC-유래의 배상체(embryoid body)를 감염시키는 단계를 포함하는 프로토콜이 기재되어 있다. 그러나, 이 프로토콜의 중요한 요소, 즉 외인성 DNA의 바이러스 감염, 마우스 세포에의 노출 및 혈청의 사용은 종양유발성 및 외래물질 감염이라는 허용불가능한 위험을 도입하고 임상적 적용을 위한 이들 MSC의 사용을 방해한다.
본 발명은 당업계에서 이 문제점 및 다른 문제점을 해결하는 방법을 찾고자 한다.
발명의 개요
본 발명자들은 본 발명에 따라 청구의 범위에 기재된 바와 같은 간엽 줄기 세포(MSC), 간엽 줄기 세포주, 분화된 간엽 줄기 세포, 이들을 수득하는 방법 및 이들의 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태는 청구의 범위에 기재되어 있고, 발명의 상세한 설명에 개시되어 있다.
달리 명시하지 않은 한, 본 발명의 실시는 당업계에서 통상의 기술을 가진 자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 분야의 통상적인 기법을 사용한다. 이러한 기법은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌(J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3)을 참조한다. 이 일반 교재들 각각은 본 명세서에 참고로 도입되어 있다.
도 1A-1G: hESC-MSC 배양물의 특징규명.
도 1A: 상 대조(phase contrast) 하의 세포 형태.
도 1B: hESC-MSC에서 다능성-관련 유전자의 발현. 전사체 수준은 택만(Taqman)-기초 정량 RT-PCR에 의해 측정되고 hESC의 전사체 수준으로 표준화된다. hESC에서의 전사체 수준은 HuES9와 H1 hESC 세포주의 평균으로부터 유도된다.
도 1C: HuES9 및 H1 hESC 세포주, HuES9.E1 HuES9.E3 및 H1.E2 hESC-MSC 배양물 및 E14 마우스 ESC 세포주에서 다능성-관련 유전자에 대한 웨스턴 블롯 분석.
도 1D: HuES9 및 HuES9.E1의 신장 낭하(subcapsular) 이식. HuES9.E1(상부) 또는 HuES9(하부)로 이식한 지 4개월 후 파라핀-포매되고 H&E로 염색된 신장의 횡단면.
도 1E: 인간 HuES9 ESC 세포주, 마우스 E14 ESC 세포주, 마우스 배아 섬유모세포성(MEF) 영양세포 및 HuES9.E1에서의 알칼리성 포스파타제 활성.
도 1F: 인간 Alu 및 마우스 c- mos 반복 서열의 존재에 대한 PCR에 의한 게놈 DNA 분석.
도 1G: G-밴딩(상부 패널) 및 분광 핵형분석(Spectral Karyotyping; SKY)(중앙 패널)에 의한 HuES9.E1의 염색체 분석. 9번 염색체의 역위가 하부 패널에서 보여진다.
도 2A-2B: FACS 분석에 의한 표면 항원 프로파일링.
도 2A: HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2 hESC-MSCs, HuES9 hESC 및 뮤린 배아 섬유모세포성 영양세포를 염색하고 WinMDI 소프트웨어를 사용하는 시안(Cyan) LX(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 장치 상에서 분석한다. 유사한 세포 분취액을 이소타입이 일치된 마우스 단일클론 항체와 함께 항온처리하여 비특이적 형광도를 측정한다.
도 2B: FACS 분석에 의해 BM-MSC와 동시에 분석되기 전에 HuES9.E1 및 HuES9.E3 hESC-MSC를 혈청 함유 BM-MSC 배지 중에서 2회 계대배양한다.
도 3A-3C: HuES9.E1의 분화. 표준 프로토콜을 이용하여 HuES9.E1 세포가 지방형성, 연골형성 및 골형성을 일으키도록 유도한다.
도 3A: 지방형성. i) 지방형성을 유도한 지 14일 후, 세포를 오일 레드(oil red)로 오일 소적에 대해 염색한다. ii) 7일 및 14일째 날에 PPARγ mRNA를 택만 정량 RT-PCR로 측정한다. 모든 값은 HuES9.E1의 값으로 표준화한다. iii) 택만 정 량 RT-PCR에 의해 측정된, HuES9 및 H1 hESC, 이들의 유도체 MSC 세포 배양물(HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2) 및 성체 조직-유래의 MSC(BM-MSC 및 ad-MSC)에서의 상대적인 PPARγ mRNA 수준. 모든 값은 HuES9.E1의 값으로 표준화한다.
도 3B. 연골형성. i) 연골형성을 유도한 지 21일 후, 세포를 알시안 블루(alcian blue)로 프로테오글리칸에 대해 염색하고(좌측) 및 HRP-기초 가시화 분석법을 이용하여 콜라겐 타입 II에 대한 면역반응성에 대해 염색한다. ii) 7일 및 14일째 날에 아그레칸(Aggrecan) 및 PPARγ mKNA를 택만 정량 RT-PCR로 측정한다. 모든 값은 HuES9.E1의 값으로 표준화한다. iii) 택만 정량 RT-PCR에 의해 측정된, HuES9 및 H1 hESC, 이들의 유도체 MSC 세포 배양물(HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2) 및 성체 조직-유래의 MSC(BM-MSC 및 ad-MSC)에서의 상대적인 PPARγ mRNA 수준. 모든 값은 HuES9.E1의 값으로 표준화한다.
도 3C: 골형성. i) 골형성을 유도한 지 21일 후, 세포를 본 코사 염색(von Kossa 염색)으로 미네랄화에 대해 염색하고, ii) 7일 및 14일째 날에 골-특이적 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 골 시알로단백질(BSP) mRNA를 택만 정량 RT-PCR로 측정한다. 모든 값은 HuES9.E1의 값으로 표준화된다.
도 4A-4D: 유전자 발현 분석.
도 4A: HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2로 구성된 3개의 hESC-MSC 배양물, 3개의 BM-MSC 샘플, 3개의 ad-MSC 샘플, 및 HuES9, H1 및 Hes3으로 구성된 3개의 hESC 세포주에서 발현된 유전자들의 계층적 분류(Hierarchical clustering).
도 4B: hESC-MSC와 BM-MSC 사이(좌측)의 유전자 발현 및 hESC-MSC와 hESC 사 이의 유전자 발현(우측)의 쌍 비교.
도 4C: hESC-MSC 및 BM-MSC에서 공통으로 발현되는 유전자들의 분석(<2배 차이). 상기 유전자들은 팬서(Panther) 분류 시스템을 이용하여 생물학적 과정으로 분류된다. NCBI에서의 유전자들의 예상된 빈도와 유전자들의 실측 빈도를 비교함으로써 각각의 생물학적 과정이 유의하게 과다하게 나타나는지 아니면 과소하게 나타나는지 결정한다(p<0.01): 각각의 생물학적 과정에 대해 23481개의 유전자들의 호모 사피엔스 유전자 데이타베이스. 유의하게 과다하게 나타나거나 과소하게 나타난 과정은 분류되어 그래프로 제시된다.
도 4D: hESC-MSC 및 BM-MSC에서 구별가능하게 발현되는 유전자들의 분석(>2배 차이). hESC-MSC 또는 BM-MSC에서 고도로 발현된 유전자들에 의해 유의하게 과다하게 나타나거나 과소하게 나타난(p<0.1) 생물학적 과정들은 분류되어 그래프로 제시된다.
도 5A-5D: hESC-MSC의 발생에 대한 양성 및 음성 분류.
도 5A: FACS 분석. HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2 hESC-MSC, HuES9 hESC, 및 뮤린 배아 섬유모세포성 영양세포가 염색되고 WinMDI 소프트웨어를 사용하는 시안 LX(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 장치 상에서 CD24의 존재에 대해 분석된다. 유사한 세포 분취액을 이소타입이 일치된 마우스 단일클론 항체와 함께 항온처리하여 비특이적 형광도를 측정한다.
도 5B: 트립신으로 처리되고 1주일 동안 PDGF 및 FGF2로 보충된 배지 중에서 영양세포 없이 증식된 HuES9 세포로부터의 CD105+, CD24- 세포에 대한 분류. Q4에 서 나타낸 CD105+, CD24- 세포는 배양을 위해 선별된다.
도 5C: Q4.1과 다른 Q4 배양물, 즉 Q4.2 내지 Q4.5 중 하나 사이의 유전자 발현의 쌍 비교.
도 5D: HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2로 구성된 hESC-MSC와 모든 Q4 배양물 사이의 유전자 발현, 및 모든 Q4 배양물과 BM-MSC 사이의 유전자 발현의 쌍 비교; e) Q4.3의 SKY 분석.
도 6: HuES9.E1 MSC 배양물에 의해 조건(conditioned) 배지의 단백질 분석. 80% 전면생장(confluent) HuES9.E1 세포 배양물을 PBS로 3회 세척하고, ITS, 5 ng/㎖ FGF2, 5 ng/㎖ PDGF AB 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-머캡토에탄올로 보충된, 페놀 레드 무함유 DMEM 배지로 구성된 합성 배지 중에서 밤새 배양한다. 그 다음, 배양물을 PBS로 3회 린싱한 후, 새로운 합성 배지로 교체하였다. 배지의 일부를 0, 24, 48 및 72시간에서 제거하고, 500 x g에서 원심분리하고, 상청액을 0.2 μ 필터로 여과하였다. 10 ㎕의 배지를 4 내지 12% SDS-PAGE 상에서 분리하고 은으로 염색하였다.
도 7: 항체 어레이. 1 ㎖의 조건 배지 (CM) 또는 비-조건 배지(NCM)를 제조자(RayBio Norcross, GA)의 지시에 따라 RayBio® 사이토카인 항체 어레이와 함께 항온처리한다. 각각의 어레이에 대한 항체 맵(map)은 실시예에 나열되어 있다. 특이적 항체와 리간드의 결합은 HRP-기초 화학발광 분석법을 이용하여 가시화한다. 각각의 막의 상이한 노출이 분석된다. 신호가 CM과 혼성화된 막 상에 존재하지만 NCM과 혼성화된 막 상에서는 존재하지 않는 경우 항원은 존재하는 것으로 기록된다. 4개의 독립적인 CM 및 NCM 회분의 분석으로부터 얻은 데이타는 실시예에 요약되어 있다.
도 8: 201개 유전자 생성물의 생물학적 과정으로의 분류. 201개 유전자를 GO 분류 시스템에서 상이한 생물학적 과정으로 분류한다. 유니진(Unigene), 엔트레즈(Entrez) 및 진뱅크(GenBank)로부터 조회된 데이타 베이스에서의 유전자의 빈도에 비해 분비 프로테옴(proteome)에서의 유전자의 빈도에 의해 과다하게 나타난 (p-값 <0.05) 58개의 생물학적 과정을 하기 3개의 주요 군으로 분류한다: 대사, 방어 반응 및 조직 분화.
도 9: 201개 유전자 생성물의 경로로의 분류. 201개 유전자를 GO 분류 시스템에서 상이한 경로로 분류한다. 유니진, 엔트레즈 및 진뱅크로부터 조회된 데이타 베이스에서의 유전자의 빈도에 비해 분비 프로테옴(proteome)에서의 유전자의 빈도에 의해 과다하게 나타난 (p-값 <0.05) 30개의 생물학적 과정을 하기 여러 개의 주요 군으로 분류한다: 수용체 결합, 신호 전달도입, 세포-세포 상호작용, 세포 이동, 면역 반응 및 대사.
간엽 줄기 세포( MSC )의 수득
hESC로부터 간엽 줄기 세포(MSC) 또는 MSC-유사 세포를 수득하는 선행 기술 방법은 인간 텔로머라제(telomerase) 역전사효소(hTERT) 유전자를 분화하는 hESC 내로 형질감염시키는 단계(Xu et al., 2004), 또는 마우스 OP9 세포주와 함께 공-배양하는 단계(Barberi et al., 2005)를 포함한다. 이 유도 프로토콜에서 외인성 유전 물질 및 마우스 세포의 사용은 종양형성 또는 감염성 외래물질의 감염이라는 허용불가능한 위험을 도입한다.
대조적으로, 본 발명자들의 방법은 분화하는 hESC로부터 유사하거나 동일한 (바람직하게는 동종성을 갖는) MSC 집단을 단리하기 위한 임상적으로 관련된 재현가능한 프로토콜을 제공한다. 일반적으로, 본 발명자들의 방법은 배아 줄기(ES) 세포 콜로니를 세포로 분산시키는 단계를 포함한다. 그 후, 상기 세포를 도말하고(plating) 증식시킨다. 간엽 줄기 세포(MSC)를 수득하기 위해, 상기 세포를 섬유모세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 무혈청 배지 중에서 공-배양물의 부재 하에 증식시킨다.
따라서, 본 발명자들의 프로토콜은 혈청, 마우스 세포의 사용 또는 유전학적 조작을 필요로 하지 않으며 조작 및 시간이 덜 필요하므로 고도의 스케일 조정이 가능하다. 본 실시예는 2가지 상이한 hESC 세포주인 HuES9 및 H-1, 및 세번째 세포주 Hes-3(참고문헌 23)으로부터 MSC를 단리하는 것을 기술하고 있으며, 상기 프로토콜의 우수성을 입증한다. 본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물에 의해 수득된, 인간 ES 세포 유래의 MSC(hESC-MSC)는 골수 유래의 MSC(BM-MSC)와 현저히 유사하다.
바람직한 실시양태에서, 배아 줄기 세포 배양물은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 배양물을 포함한다.
한 실시양태에서, 간엽 줄기 세포(MSC)를 발생시키는 방법은 트립신처리 단계, 및 CD105+ 및 CD24- 세포에 대해 분류하기 전에 FGF2 및 경우에 따라 PDGF AB로 보충된 배지 중에서 영양세포의 지지 없이 hESC를 증식시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, FGF2 및 경우에 따라 PDGF AB로 보충된 배지 중에서 영양세포의 부재 하에 증식시킨지 1주일 후 트립신으로 처리된 hESC로부터 CD105+, CD24- 세포에 대해 분류하는 단계를 포함하는 본 방법은 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모든, 보다 바람직하게는 모든 세포가 서로 유사하거나 동일한 (바람직하게는 동종성인) hESC-MSC 세포 배양물을 발생시킬 것이다.
BM-MSC와 물리적, 생물학적 및 기능적으로 유사한 임상적으로 관련된 hESC-MSC 배양물을 발생시키는, 본 명세서에 기재된 방법은 많은 임상적 및 예비임상적 동물 연구에서 치료 효능이 입증된 BM-MSC를 단리하는 데 있어서 BM의 한정된 공급을 잠재적으로 경감할 수 있다(참고문헌 10 및 25). 또한, 이 방법은 위험한 침윤성 BM 흡입 절차의 필요성을 제거할 것이고, 환자 1명을 기준으로 한 BM-MSC를 대기하는 시간 및 제조 비용을 감소시킬 것이고, 회분 사이의 편차를 감소시킬 것이다. 더욱이, hESC와 같은 정의된 세포 유형으로부터의 MSC의 강한 유도는 현재 임상적 및 예비임상 적용분야에서 널리 사용되고 있음에도 불구하고 미지의 상태로 남아있는 MSC의 유도 및 생물학적 특성을 연구하고 더 잘 이해하는 데 유용한 모델을 제공한다(참고문헌 9).
상기 방법에 의해 발생된 간엽 줄기 세포의 추가 용도는 임상적 또는 치료적 적용분야에서 성체 조직-유래의 MSC의 대체; 인간 ESC와 같은 다른 세포 유형의 증식, 제대혈의 증폭 또는 골수 줄기 세포 집단의 증폭을 위한 영양세포로서 성체 조직-유래의 MSC의 대체; 및 심혈관 질환의 치료를 위한 MSC-조건 배지의 제조를 포함한다.
배아 줄기 세포 콜로니의 분산
간엽 줄기 세포를 생성하는 본 발명자들의 방법은 배아 줄기 세포 콜로니를 세포들로 분산시키거나 해체시키는 단계를 포함한다.
배아 줄기 세포 콜로니는 huES9 콜로니(Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al., (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356) 또는 H1 ESC 콜로니(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al., (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145-1147)를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 콜로니 중의 세포들은 상당한 정도, 즉 적어도 덩어리로 해체되거나 분산된다. 보다 바람직하게는, 상기 콜로니는 콜로니 중의 모든 세포들이 단일 세포인 정도, 즉 콜로니가 완전히 해체된 정도까지 해체되거나 분산된다.
해체는 분산제를 사용하여 달성할 수 있다.
분산제는 콜로니 중의 적어도 일부 배아 줄기 세포들을 서로 탈착시킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 바람직하게는, 분산제는 콜로니 중의 세포들 사이의 부착, 또는 세포와 기질 사이의 부착 또는 이들 둘다를 파괴하는 시약을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분산제는 프로테아제를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 분산제는 트립신을 포함한다. 트립신을 사용한 처리는 예를 들면 3분 동안 또는 약 37℃에서 지속될 수 있다. 그 후, 세포는 중화되고, 원심분리되고 배지 중에 재현탁된 후 도말될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 인간 배아 줄기 세포의 전면생장 플레이트를 트립신으로 분산시키고 세포를 도말하는 단계를 포함한다.
해체는 하기 순서의 단계들 중 적어도 일부를 포함할 수 있다: 흡입, 린싱, 트립신처리, 항온처리, 탈착, 켄칭, 재-시딩 및 분취. 하기 프로토콜은 헨드릭 랩(drick Lab, UC San Diego)(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)에 의해 개조된 것이다.
흡입 단계에서, 배지는 흡입되거나 통상적으로 용기 예컨대, 플라스크로부터 제거된다. 린싱 단계에서, 세포는 바람직하게는 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하지 않은 일정 부피, 예컨대 5 내지 10 ㎖의 완충 배지로 린싱된다. 예를 들면, 세포는 칼슘 및 마그네슘 무함유 PBS로 린싱될 수 있다. 트립신처리 단계에서, 완충제 중의 일정량의 분산제를 상기 용기에 첨가하고, 용기를 롤링하여 분산제 용액으로 생장 표면을 피복한다. 예를 들면, 행크(Hank) BSS 중의 1 ㎖의 트립신을 플라스크에 첨가할 수 있다.
항온처리 단계에서, 세포를 유지된 온도에서 일정 시간 동안 방치한다. 예를 들면, 세포를 37℃에서 수분(예를 들면, 2 내지 5분) 동안 방치할 수 있다. 탈착 단계에서, 세포는 물리적 작용, 예를 들면, 스크래핑(scraping)에 의해 탈착될 수 있거나 용기의 측면을 손으로 세게 침으로써 탈착될 수 있다. 세포는 시트에서 탈착되어 표면을 활주하면서 하강할 것이다.
켄칭 단계에서, 일정 부피의 배지를 상기 플라스크에 첨가한다. 상기 배지는 바람직하게는 분산제의 작용을 중단시키기 위한 중화제를 함유한다. 예를 들면, 분산제가 트립신과 같은 프로테아제인 경우, 배지는 프로테아제의 활성을 종결시킬 혈청 단백질과 같은 단백질을 함유할 수 있다. 구체적인 예에서, 3 ㎖의 혈청 함유 세포 배양 배지를 상기 플라스크에 첨가하여 총 4 ㎖가 되게 한다. 세포를 피펫팅하여 세포를 탈착시키거나 분산시킬 수 있다.
재-시딩 단계에서, 세포를 새로운 배양 용기 내로 재-시딩하고 새로운 배지를 첨가한다. 다수의 재-시딩물이 상이한 분할 비로 만들어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 1/15 희석 및 1/5 희석 비로 재시딩될 수 있다. 구체적인 예에서, 세포는 1 방울의 세포를 25 cm2 플라스크 내로 첨가하고 3 방울의 세포를 또 다른 플라스크 내로 첨가하여 배양물을 재-시딩함으로써 재시딩된 후, 7-8 ㎖의 배지를 각각의 플라스크에 첨가하여 예를 들면, 75 cm2 플라스크로부터 1/15 희석 및 1/5 희석을 제공한다. 분취 단계에서, 세포는 새로운 디쉬 내로 분취될 수 있거나 원하는 분할 비에 따라 배지가 첨가될 수 있다.
세포 배양물로서의 유지
해체된 세포들은 도말되고 세포 배양물로서 유지된다.
세포는 젤라틴처리 플레이트와 같은 배양 용기 또는 기판 상에 도말될 수 있다. 중요하게는, 세포는 공-배양물이 없는 상태에서, 예를 들면, 영양세포의 부재 하에 생장되고 증식된다.
세포 배양물 중의 세포는 예를 들면, 5 ng/㎖의 섬유모세포 성장 인자 2(FGF2) 및 경우에 따라 혈소판-유래의 성장 인자 AB(PDGF AB)와 같은 하나 이상의 성장 인자에 의해 보충되는 무혈청 배지 중에서 생장된다. 바람직하게는, 세포 배양물 중의 세포는 전면생장에 도달한 때 트립신을 사용한 처리, 세척 및 재도말에 의해 1:4로 분할되거나 하위배양된다.
공-배양물의 부재
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명자들의 방법은 공-배양물의 부재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 용어 "공-배양물"은 예를 들면, 기질 영양세포와 함께 생장하는 2종 이상의 상이한 세포의 혼합물을 지칭한다.
따라서, 전형적인 ES 세포 배양물에서, 배양 디쉬의 내면은 통상적으로 분열하지 않도록 처리된 마우스 배아 피부 세포로 이루어진 영양세포 층으로 피복된다. 상기 영양세포 층은 ES 세포가 부착하여 생장할 수 있게 하는 부착 표면을 제공한다. 또한, 영양세포는 ES 세포 생장에 필요한 배양 배지 내로 영양분을 방출한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서, ES 및 MSC 세포는 이러한 공-배양물의 부재 하에 배양된다.
바람직하게는, 세포는 단일층으로서 배양되거나 영양세포의 부재 하에 배양된다. 본 명세서에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 배아 줄기 세포는 양양세포의 부재 하에 배양되어 간엽 줄기 세포(MSC)를 확립시킨다.
바람직한 실시양태에서, 분산된 또는 해체된 배아 줄기 세포는 배양 기판 상에 직접 도말된다. 배양 기판은 페트리 디쉬와 같은 조직 배양 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기는 전처리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 젤라틴처리 조직 배양 플레이트 상에 도말되어 상기 플레이트 상에서 생장된다.
디쉬의 젤라틴 피복을 위한 예시적 프로토콜은 다음과 같다. 증류수 중의 0.1% 젤라틴 용액을 만들어 고온고압멸균(autoclave)한다. 이를 실온에 저장할 수 있다. 조직 배양 디쉬의 바닥을 상기 젤라틴 용액으로 덮고, 5 내지 15분 동안 항온처리한다. 젤라틴을 제거하고 플레이트를 사용할 준비를 한다. 저장성 용해(hypotonic lysis)를 방지하기 위해, 배지는 세포를 첨가하기 전에 첨가되어야 한다.
무혈청 배지
분산된 또는 해체된 배아 줄기 세포는 바람직하게는 무혈청 배지인 배지 중에서 배양된다.
용어 "무혈청 배지"는 혈청 단백질, 예컨대, 태아 소 혈청을 함유하지 않은 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 무혈청 배지는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제5,631,159호 및 제5,661,034호에 기재되어 있다. 무혈청 배지는 예를 들면, Gibco-BRL(Invitrogen)로부터 시판된다.
무혈청 배지는 단백질, 가수분해물, 및 조성이 공지되어 있지 않은 성분들을 함유하지 않을 수 있다는 점에서 단백질 무함유 배지일 수 있다. 무혈청 배지는 모든 성분들이 공지의 화학적 구조를 가진 합성 배지를 포함할 수 있다. 합성 무혈청 배지는 변동가능성을 제거하는 완전히 정의된 시스템을 제공하기 때문에 개선된 재현가능성 및 보다 더 일관된 성능을 허용하고 외래물질에 의한 오염의 가능성을 감소시킨다는 이점을 가진다.
바람직한 실시양태에서, 무혈청 배지는 넉아웃 DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)를 포함한다.
무혈청 배지는 예를 들면, 5%, 10%, 15% 등의 농도로 하나 이상의 성분 예컨대, 혈청 대체 배지로 보충될 수 있다. 무혈청 배지는 바람직하게는 인비트로겐-깁코(Grand Island, New York)로부터의 10% 혈청 대체 배지로 보충된다.
성장 인자
분산된 또는 해체된 배아 줄기 세포가 배양되는 무혈청 배지는 바람직하게는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. PDGF, EGF, TGF-α, FGF, NGF, 에리쓰로포이에틴, TGF-β, IGF-I 및 IGF-II를 비롯한 다수의 성장 인자가 당업게에 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함한다. 배지는 혈소판-유래의 성장 인자 AB(PDGF AB)와 같은 다른 성장 인자를 함유할 수도 있다. 이 성장 인자들 둘다가 당업계에 공지되어 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 FGF2 및 PDGF AB 둘다를 포함하는 배지 중에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
FGF2는 많은 조직 및 세포 유형에서 낮은 수준으로 발현되며 뇌 및 뇌하수체에서 높은 농도에 도달하는 광범위한 스펙트럼의 분열촉진성, 혈관신생성 및 신경영양성 인자이다. FGF2는 사지 발달, 혈관신생, 상처 치유 및 종양 성장을 비롯한 많은 생리학적 과정 및 병리학적 과정에 관여한다. FGF2는 예를 들면, 인비트로겐-깁코(Grand Island, New York)로부터 구입할 수 있다.
혈소판 유래의 성장 인자(PDGF)는 섬유모세포, 평활근 및 결합 조직을 비롯한 광범위한 세포 유형에 대한 강력한 분열촉진자(mitogen)이다. A 쇄 및 B 쇄로 불리는 2개의 쇄로 이루어진 이량체로 구성된 PDGF는 AA 또는 BB 동종이량체로서 또는 AB 이종이량체로서 존재할 수 있다. 인간 PDGF-AB는 13.3 kDa의 A 쇄 및 12.2 kDa의 B 쇄로 구성된 25.5 kDa의 동종이량체 단백질이다. PDGF AB는 예를 들면, 펩프로테크(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)로부터 구입할 수 있다.
성장 인자(들), 바람직하게는 FGF2 및 경우에 따라 PDGF AB는 약 100 pg/㎖, 바람직하게는 약 500 pg/㎖, 바람직하게는 약 1 ng/㎖, 바람직하게는 약 2 ng/㎖, 바람직하게는 약 3 ng/㎖, 바람직하게는 약 4 ng/㎖, 가장 바람직하게는 약 5 ng/㎖의 농도로 배지 중에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 약 5 ng/㎖의 농도로 FGF2를 함유한다. 배지는 바람직하게는 약 5 ng/㎖의 농도로 PDGF AB를 함유할 수도 있다.
세포의 분할
배양물 중의 세포는 접촉 억제가 세포 분열 및 생장의 중단을 야기하는 경우 전면생장까지 일반적으로 계속 생장할 것이다. 그 다음, 이러한 세포는 기판 또는 플라스크로부터 분리될 수 있고, 조직 배양 배지로의 희석 및 재도말에 의해 "분할(split)"되거나, 하위배양되거나 계대배양될 수 있다.
그러므로, 본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물은 배양 과정 동안의 계대배양 또는 분할을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포 배양물 중의 세포는 1:2 이상, 바람직하게는 1:3, 보다 바람직하게는 1:4, 1:5 또는 그 이상의 비율로 분할된다. 용어 "계대배양"은 세포주의 전면생장 배양물의 분취액을 얻는 단계, 이를 새로운 배지 내로 접종하는 단계, 및 전면생장 또는 포화가 달성될 때까지 상기 세포주를 배양하는 단계로 구성된 과정을 의미한다.
선별, 검색 또는 분류 단계
매우 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 간엽 줄기 세포를 더 단리하거나 선별하기 위한 선별 또는 분류 단계를 추가로 포함한다.
선별 또는 분류 단계는 하나 이상의 표면 항원 마커를 사용하여 세포 배양물로부터 간엽 줄기 세포(MSC)를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 선별 또는 분류 단계의 사용은 MSC에 대한 분류 및 선별 특이성의 엄격도를 더 상승시키고, hESC와 같은 배아 줄기 세포 및 출발 물질로부터의 다른 hESC-유도체에 의한 오염 가능성을 더욱 잠재적으로 감소시킨다. 이는 기형종 형성의 위험을 더 감소시키고 본 발명자들에 의해 기술된 프로토콜의 임상적 관련성을 더 증가시킬 것이다.
항원 발현에 기초한 선별 또는 분류에 대한 다수의 방법들이 공지되어 있고, 이들 중 임의의 방법이 본 명세서에 기재된 선별 또는 분류 단계에서 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 선별 또는 분류는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 달성된다. 따라서, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, FACS는 세포에 의해 발현된 항원에 결합하여 이를 표지하는 표지된 항체와 같은 레포터에 상기 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 항체를 제조하여 이를 표지함으로써 레포터를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌에 기재되어 있다. 그 후, 상기 세포는 표지화에 기초하여 세포를 서로로부터 분류시키는 FACS 장치를 통과한다.
본 발명자들은 다수의 후보 표면 항원들, 예컨대, CD105, CD73, ANPEP, ITGA4(CD49d), PDGFRA가 MSC와 관련되어 있는 것으로 공지되어 있지만, MSC 관련 표면 항원들 중 일부, 예컨대, CD29 및 CD49e는 hESC와 같은 ES 세포에서도 고도로 발현되고 이들의 발현은 FACS 분석에 의해 입증된다는 것을 확인하였다. 표면 항원과 MSC의 관련성은 상기 항원이 hESC와 같은 ES 세포로부터 MSC를 단리하기 위한 선별 마커로서 자격을 얻기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, 선별 또는 분류 단계는 바람직하게는 MSC 세포와 ES 세포 사이에서 구별가능하게 발현되는 항원을 사용한다.
본 발명자들의 방법의 선별 또는 분류 단계는 항원의 발현에 기초하여 간엽 줄기 세포를 양성적으로 선별할 수 있다. 이러한 항원들은 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 hESC의 유전자 발현 프로파일과 hESCMSC의 유전자 발현 프로파일을 비교함으로써 확인할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 선별 또는 분류 단계는 구체적으로 하기 표 E1A 및 E1B에 나타낸 항원들 중 임의의 항원을 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들의 선별 또는 분류 단계는 MSC 상에서는 발현되나 hESC와 같은 ES 세포 상에서는 발현되지 않는 것으로서 확인된 항원들의 발현에 기초하여 간엽 줄기 세포를 양성적으로 선별할 수 있다.
따라서, 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 CD73이 MSC 상에서는 고도로 발현되지만(참고문헌 3) hESC 상에서는 고도로 발현되지 않는다는 것을 입증한다(도 4A). 더욱이, 실시예가 CD73 및 CD105 둘다가 MSC에서 고도로 발현되는 표면 항원이고 hESC에 비해 상대적으로 hESC-MSC에서 고도로 발현되는 상위 20개의 표면 항원들에 속한다는 것을 입증하기 때문에(도 3, 표), 추정상의 MSC에 대한 선별 마커로서의 CD73 또는 CD105 (또는 이들 둘다)의 사용은 hESC를 구별함으로써 발생된 추정상의 MSC에 대한 분류에 있어서 동등하게 효과적일 것이다.
별법으로 또는 추가로, 선별 또는 분류 단계는 hESC와 같은 배아 줄기 세포(ES 세포) 상에서는 고도로 발현되나 간엽 줄기 세포 예컨대, hESC-MSC 상에서는 표면 항원으로서 고도로 발현되지 않는 표면 항원에 기초하여 항원에 대해 음성적으로 선별할 수 있다. 선별 또는 분류 단계는 공지되어 있거나 이미 확인되어 있는 hESC-특이적 표면 항원 예컨대, MIBP, ITGB1BP3 및 PODXL(참고문헌 22), 및 CD24에 기초할 수 있다 .
실시예는 FACS 분석이 hESC 상에서는 CD24가 발현되나 hESC-MSC 상에서는 CD24가 발현되지 않는다는 것을 확인시켜 준다는 것을 보여준다. 따라서, CD24는 그 자체가 음성 선별 또는 분류 마커로서 사용될 수 있거나, 구별가능한 hESC 배양물로부터 추정상의 MSC를 단리하기 위한 양성 선별 마커로서 CD105와 함께 사용될 수 있다.
중요하게는, 간엽 줄기 세포는 형질전환을 요구하지 않으면서 자가-재생을 유지할 수 있다. 따라서, 공지된 형질전환 처리 예를 들면, 종양 세포 또는 종양 세포주와 같은 불멸화된 세포와의 융합; SV40, EBV, HBV 또는 HTLV-1과 같은 형질전환 바이러스를 사용한 세포주의 바이러스 감염; 특별히 개조된 벡터 예컨대, 큰 T 항원(R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988) 또는 텔로머라제(Bodnar-A-G. et al., Science (1998) 279: p. 349-52)의 서열을 포함하는 SV40 벡터, 또는 인간 파필로마바이러스(미국 특허 제5,376,542호)의 DNA 서열을 포함하는 벡터를 사용한 형질감염; 우성 종양유전자(oncogene)의 도입; 또는 돌연변이유발은 본 명세서에 기재된 간엽 줄기 세포의 제조 방법에서 요구되지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 간엽 줄기 세포 및 세포주(또는 이들로부터 유래한 분화된 세포)는 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특성을 나타내지 않는다. 바람직한 이러한 특성에는 OCT4 유전자 및 알칼리성 포스파타제 활성의 발현이 포함된다. 바람직하게는, 간엽 줄기 세포는 하나 이상의 특징적인 다능성 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 이러한 다능성 마커는 하기에 더 자세히 기재되어 있으나, Nanog, BMP 4, FGF5, Oct4, Sox -2 및 Utfl을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 방법에 의해 제조된 간엽 줄기 세포는 바람직하게는 종양형성능을 갖지 않는다. 바람직하게는, 간엽 줄기 세포는 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물 내로 이식된 경우 종양 형성을 야기하는 모 배아 줄기 세포의 이식에 비해 종양을 야기하지 않는다. 바람직하게는, 상기 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물은 SCID 마우스 또는 Rag1 -/- 마우스이다. 바람직하게는, 간엽 줄기 세포는 이식으로부터 장기간 경과 후, 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 가장 바람직하게는 9개월 후 종양을 형성하지 않는다. 종양형성 시험에 대한 상세한 프로토콜은 본 실시예에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 방법에 의해 제조된 간엽 줄기 세포는 바람직하게는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성 또한 나타낸다. 이들은 바람직하게는 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 염색체 수에 의한 평가 시 실질적으로 안정한 핵형을 가진다. 또한, 이들은 바람직하게는 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이를 통해 본 발명자들은 선택된 유전자 세트의 하나 이상, 바람직하게는 실질적으로 모든 유전자들의 발현 수준이 한 세대에서의 간엽 줄기 세포와 다음 세포에서의 간엽 줄기 세포 사이에 유의하게 달라지지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 상기 유전자 세트는 하기 유전자들 중 하나 이상, 하기 유전자들로 구성된 하위세트 또는 하기 유전자들 전부를 포함한다: cerberus(진뱅크 수탁 번호: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP(진뱅크 수탁 번호: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2(진뱅크 수탁 번호: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1(진뱅크 수탁 번호: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4(진뱅크 수탁 번호: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1(진뱅크 수탁 번호: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a(진뱅크 수탁 번호: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit(진뱅크 수탁 번호: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα(NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4(진뱅크 수탁 번호: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1(진뱅크 수탁 번호: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17(진뱅크 수탁 번호: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2(진뱅크 수탁 번호: NM_011443, U31967, AB 108673), Brachyury(NM_009309, X51683), TDGF1(진뱅크 수탁 번호: NM_011562, M87321) 및 Tie-2(진뱅크 수탁 번호: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824).
본 명세서에 기재된 본 방법은 간엽 줄기 세포뿐만 아니라 간엽 줄기 세포의 클론 후손세포들을 포함하는 분화된 세포의 생성을 가능하게 한다. 용어 세포의 "클론 후손세포"는 실질적으로 어떠한 형질전환 처리 또는 유전적 변이를 받지 않은 세포의 후손세포를 지칭한다. 이러한 클론 후손세포는 실질적인 게놈 변화를 받지 않아 모세포 또는 선조세포, 바람직하게는 배아 줄기 세포(감소된 효능을 가짐)와 실질적으로 유전적으로 동일하다. 용어 "간엽 줄기 세포"는 바람직하게는 간엽 줄기 세포로부터 유래한 세포주, 즉 간엽 줄기 세포주를 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 이와 반대로 용어 "간엽 줄기 세포주"는 간엽 줄기 세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
전구 세포의 유도
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 본 방법은 간엽 줄기 세포를 선별하거나 검색하는 단계를 추가로 이용할 수 있다.
이러한 추가 단계는 전술한 단계들 전에, 이러한 단계들 사이에 또는 이 단계들 후에 일어날 수 있다. 상기 추가 단계는 사실상 독립적으로 수행될 수 있고, 구체적으로 ES 세포로부터 하나 이상의 전구 세포 또는 세포주를 유도하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 간엽 줄기 세포를 유도하는 별법을 개시한다. 이 방법은 (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 배아 줄기 세포로부터 전구 세포주를 확립하는 단계를 포함하며, 이때 전구 세포주는 그의 자가-재생능에 기초하여 선별된다.
그러나, 바람직하게는, 본 방법들은 함께 수행된다. 따라서, 예를 들면, 본 발명자들의 방법은 분산 단계 또는 증식 단계 전에, 도중에 또는 후에 배아 줄기 세포로부터 전구 세포 또는 전구 세포주를 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 그러므로, 본 방법은 예를 들면, 배아 줄기(ES)세포 콜로니를 분산시킴으로써 수득한 세포 또는 이의 후손세포를 제공하는 단계, 상기 배아 줄기 세포로부터 하나 이상의 전구 세포 또는 전구 세포주를 유도하는 단계, 및 이 세포를 FGF2를 포함하는 무혈청 배지 중에서 공-배양물의 부재 하에 증식시킴으로써 간엽 줄기 세포(MSC)를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 전구 세포주는 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되거나, 상기 방법은 체세포의 자가-재생불능에 기초하여 체세포로부터 전구 세포주를 선별할 수 있거나, 이들 둘다를 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 공-배양물의 부재 하에, 바람직하게는 영양세포의 부재 하에 유도되거나 확립된다. 바람직하게는, 공-배양물의 부재는 배아 줄기 세포로부터 전구 세포주를 선별한다.
바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 형질전환 없이 확립된다. 전구 세포주는 배아 줄기 세포 또는 이의 후손세포들을 추정상의 전구 세포의 자가-재생을 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 확립될 수 있다. 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 배아 줄기 세포의 증식을 저해한다.
자가-재생 촉진 조건은 풍부 배지 중에서의 생장을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 LIF의 부재 하에 세포를 생장시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 연속적 계대배양을 포함한다. 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 12회 이상의 연속적 계대배양을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 배아 줄기 세포에 비해 감소된 잠재력을 가진다. 바람직하게는, 전구 세포주는 한정된, 바람직하게는 비-다능성 계통이다. 바람직하게는, 전구 세포주는 종양을 형성하지 않는다.
바람직하게는, 전구 세포주를 유도하는 단계는 배아 줄기 세포를 특정한 계통으로의 분화를 상승시키는 조건에 노출시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 분화 상승-조건은 배아 줄기 세포로부터 배상체를 발생시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 다능성이 상실된 후 분화 상승-조건으로부터 제거된다.
바람직하게는, 계통 한정-촉진 조건으로부터 상기 세포를 제거하는 단계는 배상체를 분산시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 방법은 약 3 내지 6일 동안 생장한 배상체를 분산시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다의 감소된 발현을 나타내거나 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다를 실질적으로 발현하지 않는다.
바람직하게는, 전구 세포주는 그가 유래한 배아 줄기 세포에 비해 다능성 마커의 감소된 발현을 나타내고, 이때 상기 다능성 마커는 바람직하게는 Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox -2 및 Utfl로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 나타낸다: (a) 40 초과의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지될 수 있는 특성; (b) 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 실질적으로 안정한 핵형 또는 염색체 수를 가지는 특성; 및 (c) 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 가지는 특성.
바람직하게는, 전구 세포주는 수용자 동물, 바람직하게는 면역 손상 수용자 동물에 이식된 경우 바람직하게는 3주 후, 보다 바람직하게는 2 내지 9개월 후 기형종의 형성을 실질적으로 유도하지 않는다.
바람직하게는, 배아 줄기 세포 또는 전구 세포주는 포유동물, 바람직하게는 마우스 또는 인간 배아 줄기 세포 또는 전구 세포주이다.
바람직하게는, 전구 세포주는 내피 전구 세포주, 바람직하게는 E-RoSH 세포주를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 전구 세포주는 간엽 전구 세포주, 바람직하게는 huES9.E1 세포주를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (d) 전구 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 전구 세포주는 분화 전에 5 이상의 세대 동안 증식된다.
본 발명자들은 배아 줄기(ES) 세포로부터 분화된 세포를 발생시키는 방법으로서, (a) 상기 배아 줄기 세포로부터 전구 세포주를 유도하는 단계; (b) 상기 전구 세포주를 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 전구 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함한다.
(a) 배아 줄기(ES) 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기 세포로부터 전구 세포를 유도하는 단계; 및 (c) 상기 전구 세포로부터 전구 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 방법으로서, 이때 전구 세포가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 방법이 제공된다.
상기 방법은 구체적으로, 배아 줄기(ES) 세포로부터 분화된 세포를 발생시키는 데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 분화된 세포는 내피세포 또는 간엽세포이다. 보다 바람직하게는, 상기 분화된 세포는 지방세포 또는 골세포이다.
본 발명자들은 본 발명의 임의의 상기 양태에 따른 방법에 의해 생성된 전구 세포주를 제공한다.
본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물은 선별 또는 검색 또는 이들 둘다에서 다른 인자 또는 상기 MSC의 특성을 사용하는 추가 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
편향 분화
바람직한 실시양태에서, 특정한 계통의 배아 줄기 세포-유래의 전구 세포주를 발생시키는 방법은 바람직하게는 특정한 소정의 계통 또는 관심있는 계통을 향하여 배아 줄기 세포를 편향 분화시키는 제1 단계를 추가로 포함한다. 본 발명자들의 방법은 추정상의 전구 세포의 자가-재생을 촉진하고 배아 줄기 세포의 증식을 저해하는 제2 단계도 포함할 수 있다.
상기 제1 단계는 관심있는 특정한 계통의 생장 또는 증식을 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 관심있는 특정한 계통의 상이한 전구 세포주는 세포를 관심있는 계통의 분화를 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 배아 줄기 세포는 성장 인자 또는 소분자 예컨대, 분화를 촉진하거나 가능하게 하는 리간드에 노출될 수 있다.
따라서, 특정한 계통의 배아 줄기 세포-유래의 세포주를 확립하기 위한, 본 명세서에 기재된 본 방법은 바람직하게는 그 특정한 계통을 향하여 배아 줄기 세포의 분화를 상승시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 분화-상승 단계는 예정된 기간 동안 수행된다. 따라서, 바람직하게는, 배아 줄기 세포 또는 이의 후손세포는 분화-상승 환경에 일시적으로 노출된다.
분화를 상승시키거나 편향시키는 방법의 선택은 전구 세포를 생성하도록 요구되는 관심있는 특정한 세포 계통에 달려 있을 것이다. 당업자라면 상이한 세포들에 대해 이용될 수 있는 다양한 방법을 알 것이다.
내배엽 전구 세포
조직의 내배엽 유형을 향하여 배아 줄기 세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 예를 들면, 배상체를 형성하여 분산시킬 수 있다(하기 참조). 분산된 배상체를 내배엽 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 액티빈 A, FGF4, 덱사메타손 및 레티노산이 있다.
조혈 및 내피 전구 세포
다른 한편으로, 조혈 또는 내피 계통을 향하여 배아 줄기 세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 해체된 배상체를 조혈 또는 내피 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 GM-CSF, G-CSF, SCF, PDGF, IL-3, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, TNFα 및 라파마이신이 있다.
심장 중배엽 및 골격 근모세포 전구 세포
다른 한편으로, 심장 중배엽 및 골격 근모세포 계통을 향하여 배아 줄기 세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 해체된 배상체를 심장 중배엽 또는 골격 근모세포 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 덱사메타손, PPARγ 억제제 및 테스토스테론 또는 이의 유사체가 있다.
상기 제2 단계는 풍부한 배지 중에서 분화 세포를 도말하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 계속된 증식은 전구 세포를 선별적으로 풍부하게 할 것이고, 그 후, 상기 전구 세포는 클로닝될 수 있다.
배상체의 형성
일부 실시양태에서, 분화-상승 단계는 배아 줄기 세포로부터의 배상체의 형성을 포함한다. 배상체 및 이의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "배상체"는 현탁액 중에서의 배아 줄기 세포의 생장에 의해 생성된 배양물 중에서 관찰되는 타원형 콜로니를 말한다. 배상체는 혼합된 세포 유형들로 이루어져 있고, 특정한 세포 유형의 분포 및 출현 시기는 배아 내에서 관찰된 분포 및 출현 시기에 상응한다. 바람직하게는, 배상체는 배아 줄기 세포를 반-고체 배지, 바람직하게는 문헌(Lim et al., Blood. 1997; 90:1291-1299)에 기재된 바와 같은 메틸셀룰로스 배지 상에 도말함으로써 발생된다. 바람직하게는, 배상체는 3 내지 6일 된 것이다.
이러한 실시양태에서, 세포들이 계통 한정-촉진 조건으로부터 제거되도록 하기 위해, 배상체를 예를 들면, 콜라게나제 또는 트립신 처리로 분산시킨다. 즉, 구성 세포들을 서로 분리시킨다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 원하는 특정한 계통에 대한 추정상의 전구 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 상기 선택은 세포의 형태에 기초하여 수행될 수 있거나, 발현 또는 마커 등에 의해 수행될 수 있다. 유전자 발현 프로파일링 또는 항원 프로파일링은 원하는 계통인 특정한 전구 세포를 선택하는 데 사용될 수도 있다. 그 다음, 원하는 특정한 계통에 대해 선택된 추정상의 전구 세포는 배양될 수 있거나, 상기 추정상의 전구 세포에 대해 추가 선택 단계를 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 분화-상승 단계 후, 분화하는 세포는 추정상의 전구 세포의 자가-재생을 촉진하고 배아 줄기 세포의 증식을 저해하는 조건에 노출된다. 이러한 조건은 바람직하게는 공-배양물 또는 영양세포의 부재 하에서의 배양을 포함할 수 있다(상기 참조).
풍부 배지
별법으로 또는 추가로, 이러한 조건은 풍부 배지 중에서의 도말을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "풍부 배지"는 영양분이 풍부한 배지를 지칭한다. 바람직하게는 이러한 배지는 관련 세포의 생장에 필요한 필수 영양분을 포함한다. 바람직하게는, 풍부 배지는 혈청을 함유한다. 보다 바람직하게는, 풍부 배지는 이러한 생장에 필요한 실질적으로 모든 영양분을 포함한다. 가장 바람직하게는, 풍부 배지는 관련 세포의 생장을 지지하고, 촉진하고 상승시킨다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 관련 세포는 관심있는 전구 세포 또는 추정상의 전구 세포이다. 풍부 배지의 예는 20% 태아 소 혈청, 비 필수 아미노산, L-글루타민 및 β-머캡토에탄올로 보충된, 4500 mg/ℓ D-글루코스를 함유하는 DMEM이다.
바람직한 실시양태에서, 이러한 풍부 배지는 배아 줄기 세포의 생장을 허용하거나, 촉진하거나 상승시키는 추가 성장 조절자 또는 호르몬, 예컨대, 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하지 않는다.
이러한 실시양태에 따르면, 계속된 증식은 전구 세포를 선택적으로 풍부하게 할 것이고, 그 후, 상기 전구 세포는 클로닝될 수 있다.
배양물 중에서의 장기간 유지
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 방법은 1 이상의 세대 동안 배아 줄기 세포 또는 이의 후손세포를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상 또는 800 이상의 세대 동안 배양된다. 특히, 세포주는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 500 또는 그 이상의 세대 동안 유지될 수 있다.
배양물 중의 세포는 일반적으로 접촉 억제가 세포 분열 및 성장의 중단을 야기할 경우 전면생장까지 계속 생장할 것이다. 그 다음, 이러한 세포는 기판 또는 플라스크로부터 분리될 수 있고, 조직 배양 배지로의 희석 및 재도말에 의해 "분할" 또는 계대배양될 수 있다. 그러므로, 전구 세포는 배양 과정 동안에 계대배양되거나 분할될 수 있고; 바람직하게는, 전구 세포는 1:2 이상, 바람직하게는 1:3, 보다 바람직하게는 1:4, 1:5 또는 그 이상의 비율로 분할된다. 용어 "계대배양"은 세포주의 전면생장 배양물의 분취액을 얻는 단계, 이를 새로운 배지 내로 접종하는 단계, 및 전면생장 또는 포화가 달성될 때까지 상기 세포주를 배양하는 단계로 구성된 과정을 의미한다.
그러나, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 유도된 전구 세포는 그의 자가-재생능에 기초하여 다수의 세대 동안 유지될 수 있다. 다른 한편으로, 유기체로부터 직접 유래한 "정상" 세포(즉, 형질전환되지 않은 체세포)는 불멸 세포가 아니라는 것이 확립되어 있다. 다시 말해, 이러한 체세포는 배양 시 유한한 수명을 가진다(이들은 사멸하게 된다). 이들은 무한히 계속 생장하지 않을 것이고, 궁극적으로 일정한 수의 세대 후에 증식하거나 분열하는 능력을 상실할 것이다. "위기 주기(crisis phase)"에 도달할 때, 이러한 세포는 약 50세대 후에 사멸한다. 따라서, 이러한 체세포는 유한한 회수로 계대배양될 수 있을 뿐이다.
중요하게는, 전구 세포는 형질전환을 필요로 하지 않으면서 자가-재생을 유지할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 공지된 형질전환 처리, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 세포주와 같은 불멸화된 세포와의 융합; SV40, EBV, HBV 또는 HTLV-1과 같은 형질전환 바이러스를 사용한 세포주의 바이러스 감염; 특별히 개조된 벡터 예컨대, 큰 T 항원(R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988) 또는 텔로머라제(Bodnar-A-G. et.al, Science (1998) 279: p. 349-52)의 서열을 포함하는 SV40 벡터, 또는 인간 파필로마바이러스(미국 특허 제5,376,542호)의 DNA 서열을 포함하는 벡터를 사용한 형질감염; 우성 종양유전자의 도입; 또는 돌연변이유발은 본 명세서에 기재된 전구 세포주의 제조 방법에서 요구되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 전구 세포는 50 이상의 세대 동안 형질전환 없이 증식될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 전구 세포는 형질전환 없이도 전구 세포주로서 무한히 증식될 수 있다. 전구 세포 및 전구 세포주는 바람직하게는 이들의 모 배아 줄기 세포에 비해 한정된 계통이다. 특히, 이들은 모든 3개의 배엽층을 발생시킬 수 없다. 특히 바람직한 실시양태에서, 전구 세포주는 바람직하게는 비-다능성 세포이다.
전구 세포의 특성
바람직한 실시양태에서, 전구 세포 및 세포주(또는 이들로부터 유래한 분화된 세포)는 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특성을 나타내지 않는다. 바람직한 이러한 특성에는 OCT4 유전자 및 알칼리성 포스파타제 활성의 발현이 포함된다. 바람직하게는, 전구 세포주는 하나 이상의 특징적인 다능성 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 이러한 다능성 마커는 하기에 더 자세히 기재되어 있으나, Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox -2 및 Utfl을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 전구 세포는 바람직하게는 종양을 형성하지 않는다. 바람직하게는, 전구 세포는 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물 내로 이식된 경우 종양 형성을 야기하는 모 배아 줄기 세포의 이식에 비해 종양을 야기하지 않는다. 바람직하게는, 상기 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물은 SCID 마우스 또는 Rag1 -/- 마우스이다. 바람직하게는, 전구 세포는 이식으로부터 장기간 경과 후, 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 가장 바람직하게는 9개월 후 종양을 형성하지 않는다. 종양형성 시험에 대한 상세한 프로토콜은 실시예에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 전구 세포는 바람직하게는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성도 나타낸다. 이들은 바람직하게는 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 염색체 수에 의한 평가 시 실질적으로 안정한 핵형을 가진다. 또한, 이들은 바람직하게는 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이를 통해 본 발명자들은 선택된 유전자 세트의 하나 이상, 바람직하게는 선택된 유전자 세트의 실질적으로 모든 유전자들의 발현 수준이 한 세대에서의 전구 세포와 다음 세포에서의 전구 세포 사이에 유의하게 달라지지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 상기 유전자 세트는 하기 유전자들 중 하나 이상, 하기 유전자들로 구성된 하위세트 또는 하기 유전자들 전부를 포함한다: cerberus(진뱅크 수탁 번호: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP(진뱅크 수탁 번호: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2(진뱅크 수탁 번호: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1(진뱅크 수탁 번호: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4(진뱅크 수탁 번호: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1(진뱅크 수탁 번호: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a(진뱅크 수탁 번호: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit(진뱅크 수탁 번호: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα(NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4(진뱅크 수탁 번호: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1(진뱅크 수탁 번호: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17(진뱅크 수탁 번호: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2(진뱅크 수탁 번호: NM_011443, U31967, AB 108673), Brachyury(NM_009309, X51683), TDGF1(진뱅크 수탁 번호: NM_011562, M87321) 및 Tie-2(진뱅크 수탁 번호: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824).
본 명세서에 기재된 방법은 전구 세포 및 전구 세포주뿐만 아니라 전구 세포의 클론 후손세포들을 포함하는 분화된 세포의 생성을 가능하게 한다. 용어 세포의 "클론 후손세포"는 실질적으로 어떠한 형질전환 처리 또는 유전적 변이를 받지 않은 세포의 후손세포를 지칭한다. 이러한 클론 후손세포는 실질적인 게놈 변화를 받지 않아 모세포 또는 선조세포, 바람직하게는 배아 줄기 세포(감소된 효능을 가짐)와 실질적으로 유전적으로 동일하다. 용어 "전구 세포"는 바람직하게는 전구 세포로부터 유래한 세포주, 즉 전구 세포주를 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 이와 반대로 용어 "전구 세포주"는 전구 세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
자가-재생 및 분화의 조절자
본 발명자들의 방법은 자가-재생 또는 분화의 추정상의 조절자를 확인하는 데 사용될 수도 있다. 본 방법은 후보 분자의 존재 및 부재 하에서 전구 세포주 또는 분화된 세포의 생성에 대해 기재된 과정을 수행하는 단계, 및 상기 분자의 존재가 상기 과정에 임의의 영향을 주는지를 확인하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 전구 세포 또는 분화된 세포의 생성을 가속화시키는 분자는 분화의 양성 조절자로서 (또는 별법으로 자가-재생의 억제자로서) 사용될 수 있다. 반대로, 상기 과정을 지연시키는 분자는 분화의 억제자 또는 자가-재생의 촉진자로서 간주될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 본 방법에 따라 얻어질 수 있는, 선별된 계통의 세포, 바람직하게는 전구 세포 또한 제공한다. 지금까지, 전구 세포 제제는 임의의 선택된 세포가 전구 세포인지에 대해 확신하기에는 너무 불순하였다. 실질적으로 100% 순수한 전구 세포 제제를 생성할 수 있는 본 발명에 따른 배양을 이용하면 단일 전구 세포의 단리가 달성된다.
본 발명자들은 바람직한 실시양태에서 복수개의 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포의 대다수가 선별된 계통의 전구 세포인 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 60% 이상의 세포가 선별된 계통의 전구 세포이다. 보다 바람직하게는, 60% 이상의 세포가 전구 세포이다. 또한, 본 발명은 단리된 전구 세포를 제공한다. 용어 "세포주"는 바람직하게는 배양물 중에서 유지되고 생장될 수 있으며 불멸의 또는 무한한 수명을 나타내는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 제60/609,216호에 기재된 바와 같이 분화를 촉진하는 mTOR의 활성을 감소시키는 데 병용될 수 있다.
전구 세포의 용도
본 발명자들의 방법은 다양한 유형의 전구 세포 및 세포주를 생성할 수 있다.
예를 들면, 본 발명자들은 말초 혈액 전구 세포(PBPC), 신경 전구 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 상피 전구 세포, 골수 기질세포, 골격근 전구 세포, 이자섬(pancreatic islet) 전구 세포, 간엽 전구 세포, 심장 중배엽 줄기 세포, 폐 상피 전구 세포, 간 전구 세포, 및 내배엽 전구 세포의 제조 방법을 개시한다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 전구 세포는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다. 이들 용도는 당업계에 일반적으로 잘 공지되어 있으나, 본 명세서에서 간략하게 기재될 것이다.
예를 들면, 줄기 세포는 재생 요법을 위한 전구 세포 집단을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 전구 세포들은 생체 외 팽창에 의해 제조될 수 있거나 환자 내로 직접 투여될 수 있다. 이들은 외상 후 손상된 조직의 재생을 위해서도 사용될 수 있다.
따라서, 조혈 전구 세포는 골수 교체를 위해 사용될 수 있지만, 심장 전구 세포는 심부전 환자를 위해 사용될 수 있다. 피부 전구 세포는 환자를 위한 피부 이식편을 생장시키는 데 사용될 수 있고, 내피 전구 세포는 부목 또는 인공 심장과 같은 인공 보철의 내피화(endothelization)를 위해 사용될 수 있다.
배아 줄기 세포 및 이의 조직 줄기 세포 유도체는 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 치료를 위한 전구 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포는 암에 대한 면역요법을 위한 NK 또는 수상 세포에 대한 전구 세포의 공급원으로서 사용될 수 있고, 이때 상기 전구 세포는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분화시킬 수 있는 전구 세포의 생성을 가능하게 한다는 것은 분명할 것이다. 따라서, 분화된 세포의 임의의 용도는 이들의 공급원인 전구 세포와 동등하게 중요할 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 전구 세포는 질환의 치료에 사용될 수 있거나 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암을 비롯한, 재생요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 (a) 배아 줄기(ES) 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기 세포로부터 전구 세포주를 확립시키는 단계로서, 이때 상기 전구 세포주가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 단계; (d) 경우에 따라 상기 전구 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계; 및 (e) 전구 세포주 또는 분화된 세포를 환자 내로 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 개시한다.
수득된 MSC 의 특성
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 MSC는 바람직하게는 당업계에 공지된 바와 같은, MSC를 확인하는 데 통상적으로 사용되는 형태학적, 표현형적 및 기능적 기준(참고문헌 9)을 만족시킨다. 용이하게 지칭하기 위해, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 간엽 줄기 세포, 특히 인간 배아 줄기 세포로부터 유래한 간엽 줄기 세포는 "hESC-MSC"로서 지칭될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 MSC는 바람직하게는 간엽 줄기 세포의 하나 이상의 형태학적 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 수득된 MSC는 섬유모세포성 표현형을 가진 부착 단일층을 형성할 수 있다.
나아가, 수득된 MSC는 간엽 줄기 세포와 유사하거나 동일한 표면 항원 프로파일을 나타낼 수 있다. 따라서, 수득된 MSC의 표면 항원 프로파일은 CD29+, CD44+, CD49a 및 e+, CD105+, CD 166+ 및 CD34-, CD45-(참고문헌 9 내지 11) 중 하나 이상, 바람직하게는 전부를 포함할 수 있다.
수득된 MSC는 당분야에 공지되어 있으며 하기에 기재되어 있는 방법을 이용하여 임의의 간엽 계통으로 분화시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 MSC는 지방형성, 연골형성 및 골형성(참고문헌 9)을 포함하는 분화 잠재력을 나타낼 수 있다.
기재된 바와 같이 수득된 간엽 줄기 세포 예컨대, hESC-MSC는 시험관 내에서 실질적인 증식 능력을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 수득된 간엽 줄기 세포는 정상 이배수체((diploid) 핵형을 유지하면서 10회 이상의 집단 배가(doubling)를 경험할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, MSC는 정상 이배수체 핵형을 유지하면서 20 내지 30회 이상의 집단 배가를 경험할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, MSC는 이 기간 전체에 걸쳐 안정한 유전자 발현 및 표면 항원 프로파일을 나타낸다.
바람직하게는, 수득된 MSC는 임의의 결함 예컨대, 염색체 비정상화 및/또는 유전자 발현에서의 변경을 나타내지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 결함은 10회 계대배양 후, 바람직하게는 13회 계대배양 후, 보다 바람직하게는 15회 계대배양 후까지 분명하지 않다.
HESC - MSC 프로테옴
실시예에는 인간 ESC 유래의 MSC(hESC-MSC)의 프로테옴을 분석하기 위한 실험이 기재되어 있다.
실시예 7 내지 15에 나타낸 바와 같이, hESC-MSC는 성체 골수 유래의 MSC(BM-MSC)의 발현 프로파일과 유사한 발현 프로파일을 가진다. 이 결과는 본 발명자들의 방법에 의해 유도된 MSC가 예를 들면, 측분비 인자를 분비하는 그들의 능력에 있어서 그들의 골수 유래 MSC와 상당한 생물학적 유사성을 가진다는 것을 입증한다. 따라서, hESC-MSC는 BM-MSC가 적합한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명자들은 hESC-MSC의 배양물에 의한 조건 배지를 제공한다. 이러한 조건 배지는 201개의 고유한 유전자 생성물을 비롯한, hESC-MSC에 의해 분비된 분자들을 포함한다. 이러한 조건 배지; 및 특히 단백질 또는 폴리펩티드를 비롯한, 상기 배지 내에 포함된 분자들 중 임의의 분자들의 조합물은 예를 들면, 질환을 치료하거나 예방하기 위한 목적으로 hESC-MSC의 활성을 보충하는 데 사용될 수 있거나 hESC-MSC 대신에 사용될 수 있다.
hESC-MSC의 프로테옴의 분석은 발현된 단백질들이 하기 3가지 생물학적 과정에 관여한다는 것을 보여준다: 대사; 방어 반응; 및 혈관형성, 조혈 및 골격 발달을 비롯한 조직 분화. 따라서, hESC-MSC는 이들 기능이 일정한 역할을 할 수 있는 질환, 또는 그 회복 또는 치료가 이들 생물학적 과정 중 임의의 하나 이상을 이용하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, hESC-MSC에 의해 발현된 단백질은 바람직하게는 조건 배지의 형태로 단독으로 또는 조합되어, 예를 들면, 상기 질환을 치료하거나 예방하기 위한 목적으로 hESC-MSC의 활성을 보충하는 데 사용될 수 있거나 hESC-MSC 대신에 사용될 수 있다.
hESC-MSC에 의해 발현된 201개의 유전자 생성물은 심혈관 생물학, 골 발달 및 조혈에 있어서 중요한 신호전달 경로 예컨대, Jak-STAT, MAPK, Toll-유사 수용체, TGF-베타 신호전달 및 mTOR 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, hESC-MSC, 및 이에 의해 발현된 단백질 등은 이 신호전달 경로들 중 임의의 경로가 관여하거나 그 병인이 상기 신호전달 경로들 중 임의의 하나 이상의 신호전달 경로에 있어서 하나 이상의 결함을 수반하는 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있다.
더욱이, 조건 배지의 형태를 비롯한, 본 명세서에 기재된 MSC로부터 분비된 임의의 하나 이상의 단백질은 본 명세서에 기재된 BM-MSC와 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다.
hESC-MSC는 실시예 10 내지 14, 특히 상기 실시예 내의 표에 나열된 바와 같은, 그에 의해 분비되거나 발현된 단백질들 중 임의의 단백질에 대한 공급원으로서 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명자들은 실시예 10 내지 14 중 임의의 실시예에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서, 기재된 바와 같이 간엽 줄기 세포를 수득하는 단계, 상기 간엽 줄기 세포를 배양하는 단계, 및 상기 간엽 줄기 세포, 바람직하게는 이 간엽 줄기 세포가 생장하는 배지로부터 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
동종성
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 간엽 줄기 세포는 성질 면에서 유사하거나 동일하다(바람직하게는 동종성을 갖는다). 다시 말해, 본 프로토콜에 의해 단리된 간엽 줄기 세포(MSC)는 표현형에서든 다른 성질에서든 서로 간에 고도의 유사성 또는 동일성을 보여준다.
유사성 또는 동일성은 다수의 방식으로 측정될 수 있고, 하나 이상의 특성에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 클론은 유전자 발현에 있어서 유사하거나 동일하다. 바람직하게는, 본 방법은 그에 의해 선별된 임의의 2개 이상의 간엽 줄기 세포가 실질적으로 동일하거나 유사한 유전자 발현 프로파일, 즉 발현된 유전자의 본질과 이들이 발현되는 수준의 조합을 나타내도록 한다. 바람직하게는, 단리된 간엽 줄기 세포들의 실질적으로 전부가 실질적으로 동일하거나 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
유전자 발현의 동종성은 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 게놈-범위 유전자 프로파일링은 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같은 추출된 RNA의 어레이 혼성화를 이용하여 수행한다. 전체 RNA는 추출되어 cDNA로 전환될 수 있고, 상기 cDNA는 관련 게놈으로부터의 복수개의 유전자 서열을 포함하는 어레이 칩에 혼성화된다. 바람직하게는, 상기 어레이는 미국 국립생명공학센터(NCBI) 직원 및 협력자들에 의해 검증되고 해석되고 지속적으로 보충되는, 특징이 잘 규명되어 있는 유전자들인 NCBI 기준 서열(RefSeq) 유전자들을 포함한다.
그 다음, 샘플들 사이의 유전자 발현은 분석 소프트웨어를 사용하여 비교한다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 발현의 유사성 또는 동일성은 "상관계수"로서 표현된다. 이러한 측정치에서, 2개 샘플 사이의 높은 상관계수는 2개 샘플에서의 유전자 발현의 패턴 사이에 고도의 유사성이 있음을 나타낸다. 반대로, 2개 샘플 사이의 낮은 상관계수는 2개 샘플에서의 유전자 발현의 패턴 사이에 낮은 수준의 유사성이 있음을 나타낸다. 표준화는 데이타 분석 전에 전반적인 편차 또는 편향(강도 편향, 공간 편향, 플레이트 편향 및 배경 편향을 포함함)을 제거하기 위해 수행될 수 있다.
상관관계 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(Hill, T. & Lewicki, P. (2006). Statistics: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, ISBN: 1884233597 (also StatSoft, Inc. (2006) Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. WEB: http://www.statsoft.com/textboolc/stathome.html))에 기재된 바와 같은 T-검정 및 피어슨 검정을 포함한다. 문헌(Khojasteh et al., 2005, A stepwise framework for the normalization of array CGH data, BMC Bioinformatics 2005, 6:274)을 참고한다. 부류 내 상관계수(ICC) 또한 상기 문헌(Khojasteh et al.)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 피어슨 검정은 피어슨 상관계수를 발생시키기 위해 수행된다. 1.0의 상관계수는 동일한 유전자 발현 패턴을 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, cDNA를 센트릭스(Sentrix) 인간 Ref-8 발현 비드칩에 혼성화시키고 일루미나 비드 스테이션(Illumina BeadStation) 500x를 사용하여 스캐닝한다. 바람직하게는, 데이타를 추출하고, 표준화시키고 일루미나 비드스튜디오(Illumina, Inc, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석한다. 그러나, 임의의 적합한 칩 및 스캐닝 하드웨어 및 소프트웨어(상관관계 측정을 산출함)를 사용하여 유전자 발현 프로파일의 유사성을 분석할 수 있다는 것은 본 명세서를 읽는 자에게 명백할 것이다.
바람직하게는, 상기 수단에 의해 측정된 경우 임의의 2개 단리물 사이의 유전자 발현 상관계수는 0.65 이상, 바람직하게는 0.70 이상, 보다 바람직하게는 0.80 이상, 보다 바람직하게는 0.85 이상, 보다 바람직하게는 0.90 이상, 가장 바람직하게는 0.95 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 간엽 줄기 세포를 발생시키며, 이로써 수득된 간엽 줄기 세포의 임의의 2개 이상의 단리물 사이의 유전자 발현 상관계수는 일정한 기간, 예컨대, 1개월 간격으로 수행된 동일한 RNA 샘플의 기술적 복제물 사이의 상관계수와 동일한 차수 또는 이 상관계수보다 약간 작은 차수를 가진다. 다른 실시양태에서, 간엽 줄기 세포의 임의의 2개 이상의 단리물 사이의 유전자 발현 상관계수는 0.90 이상, 바람직하게는 0.95 이상이다.
바람직하게는, 전술한 선별 또는 분류 절차를 거치는 세포들에 대한 유전자 발현 상관계수는 이러한 범위 내에 있다. 바람직하게는, 단리물의 대부분, 바람직하게는 모든 단리물 사이의 유전자 발현 상관계수는 이러한 범위 내에 있다.
따라서, 실시예에 나타낸 바와 같이, 상관계수는 수득된 5개의 간엽 줄기 세포 배양물 사이에 고도의 유사성을 보여주는데, 이때 4개의 세포주 사이의 상관계수는 0.96이며, 1개의 세포주의 상관계수는 0.90이고; 반대로, 1개월 간격을 두고 분석된 RNA 샘플의 기술적 복제물 사이의 상관계수는 0.97 내지 0.98이다.
따라서, 본 발명자들은 서로 간에 실질적으로 유사하거나 동일한 (바람직하게는 동종성인) 간엽 줄기 세포를 발생시키는 방법을 제공한다. 단리물은 바람직하게는 거의 동일한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
전술한 "내부" 동종성(즉, 본 방법으로부터 얻은 MSC의 단리물 사이의 동종성) 뿐만 아니라, 이러한 단리물과 다른 세포 또는 세포 유형 사이의 동종성도 평가될 수 있다. 특히, 다른 방법에 의해 유도된 간엽 줄기 세포 예컨대, 골수 유래의 간엽 줄기 세포(BM-MSC)를 비교할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 MSC는 BM-MSC와의 유사성, 상동성 또는 동일성을 가진 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 따라서, 수득된 MSC는 BM-MSC와의 사이에 0.5 이상, 바람직하게는 0.6 이상, 바람직하게는 0.7 이상의 유전자 발현 상관계수를 보여줄 수 있다.
따라서, 실시예에 나타낸 바와 같이, 독립적으로 유도된 3개의 hESC-MSC 집단과 3개의 개별 BM-MSC 샘플 사이의 유전자 발현의 쌍 비교는 0.72의 상관계수를 보여 상기 집단과 상기 샘플은 유사한 것으로 밝혀졌다.
간엽 줄기 세포 형성의 조절자
본 발명자들의 방법은 간엽 줄기 세포가 배아 줄기 세포로부터 형성되는 것을 조절하는 추정상의 조절자를 확인하는 데 사용될 수도 있다. 본 방법은 후보 분자의 존재 및 부재 하에 간엽 줄기 세포의 생성에 대해 기재된 과정을 수행하는 단계, 및 상기 분자의 존재가 상기 과정에 임의의 영향을 주는지를 확인하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 간엽 줄기 세포의 생성을 가속화시키는 분자는 간엽 줄기 세포 형성의 양성 조절자로서 사용될 수 있다. 반대로, 상기 과정을 지연시키는 분자는 간엽 줄기 세포 형성의 억제자로서 간주될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 본 방법에 따라 얻어질 수 있는 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포도 제공한다. 지금까지, 간엽 줄기 세포 제제는 너무 불순하거나, (예를 들면, 유전자 발현에 대하여) 실질적으로 표현형적으로 유사하거나 동일하지 않거나, 이들이 공-배양물 또는 혈청의 존재를 수반하는 방법에 의해 생성되기 때문에 임상적 목적으로는 적합하지 않았다. 본 발명에 따른 배양물을 이용하면 서로 유사하거나 동일한 (바람직하게는 동종성인) 간엽 줄기 세포로 구성된 실질적으로 100% 순수한 제제를 발생시킬 수 있다.
또한, 본 발명자들은 분화된 세포를 생성하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 간엽 줄기 세포를 수득하는 단계, 및 상기 간엽 줄기 세포를 분화시키는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 예를 들면, 본 발명자들은 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명자들은 이러한 방법에 의해 수득가능한 분화된 세포를 제공한다. 이러한 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포로부터 제조된 세포주도 제공된다. 용어 "세포주"는 바람직하게는 배양물 중에서 유지되고 생장될 수 있으며 불멸의 또는 무한한 수명을 나타내는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 제60/609,216호에 기재된 바와 같이 분화를 촉진하는 mTOR의 활성을 감소시키는 데 병용될 수 있다.
용도
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 세포의 간엽 또는 내피 마커의 발현을 상향조절하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 본 방법 및 조성물은 줄기 세포 또는 세포의 다능성 마커의 발현을 하향조절하는 데 사용될 수도 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 줄기 세포의 자가-재생 또는 분화를 촉진하거나 지연시킬 수 있는 물질을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 후보 분자의 존재 하에 본 발명의 상기 임의의 양태에 따른 방법을 수행하고 그에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하기 질환들 중 어느 한 질환을 치료하기 위한, 또는 하기 질환들 중 어느 한 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 전구 세포주 또는 분화된 세포를 생성하는 데 사용될 수도 있다: 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환, 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 암.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다. 이들 용도는 당업계에 일반적으로 잘 공지되어 있으나, 본 명세서에서 간략하게 기재될 것이다.
예를 들면, 줄기 세포는 재생 요법을 위한 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포 집단을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 생체 외 증폭에 의해 제조될 수 있거나 환자 내로 직접 투여될 수 있다. 이들 세포는 외상 후 손상된 조직의 재생을 위해서도 사용될 수 있다.
따라서, 지방세포 또는 이들로부터 형성된 지방 조직은 재구성 또는 성형 수술 동안에 함몰부위(cavity) 또는 강하부위(depression)를 채우는 데 사용될 수 있다. 연골세포는 연골 복구를 위해 사용될 수 있고, 골세포는 골 복구를 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 간엽 줄기 세포는 이들 세포 유형들 중 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있고 본 명세서에 기재된 목적으로 사용될 수 있다.
배아 줄기 세포 및 이의 조직 줄기 세포 유도체는 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 치료를 위한 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포는 암에 대한 면역요법을 위한 NK 또는 수상 세포에 대한 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 공급원으로서 사용될 수 있고, 이 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분화시킬 수 있는 간엽 줄기 세포의 생성을 가능하게 한다는 것은 명백할 것이다. 따라서, 분화된 세포의 임의의 용도는 이들의 공급원인 간엽 줄기 세포와 동등하게 중요할 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 질환의 치료에 사용될 수 있거나 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암을 비롯한, 재생요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기 세포로부터 간엽 줄기 세포를 확립하는 단계로서, 이때 간엽 줄기 세포가 배아 줄기(ES)세포 콜로니 또는 이의 후손세포를 분산시키고 FGF2를 포함하는 무혈청 배지 중에서 공-배양물의 부재 하에 상기 세포를 증식시킴으로써 수득하는 것인 단계; (d) 경우에 따라 상기 간엽 줄기 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계; 및 (e) 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 세포를 환자 내로 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 개시한다. 상기 배지는 경우에 따라 PDGF AB를 함유할 수 있다.
본 발명자들의 방법은 세포의 간엽 또는 내피 마커의 발현을 상향조절하는 데 통상적으로 사용될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 본 방법은 세포의 줄기 세포 마커 또는 다능성 마커의 발현을 하향조절하는 데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 하기 질환들 중 어느 한 질환을 치료하기 위한, 또는 하기 질환들 중 어느 한 질환의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 전구 세포주 또는 분화된 세포의 생성을 위한 본 발명의 임의의 상기 측면에 따른 방법을 추가로 제공한다: 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환, 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 암.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 임의의 상기 측면에 따른 방법에 의해 생성된 분화된 세포를 제공한다.
분화된 세포
분화된 세포 예컨대, 최종적으로 분화된 세포는 기재된 본 방법에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 또는 세포주로부터 유도될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 분화된 세포를 발생시키는 방법으로서, 전술한 바와 같이 간엽 줄기 세포 또는 세포주를 발생시키는 단계, 및 이들로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 간엽 줄기 세포는 이들 세포 유형들 중 임의의 세포 유형으로 분화되어 기재된 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 분화된 세포는 하기 세포들 중 임의의 세포 또는 하기 세포들 전부를 포함할 수 있다:
i) 지방세포: 신체 전체, 특히 피부 밑에서 발견되는 지방 또는 지방조직의 기능성 세포 유형. 지방세포는 에너지, 체온 조절, 및 물리적 충격에 대한 쿠션 역할을 위한 지방을 합성하고 저장한다.
ii) 심근세포: 심장이 연속적 및 규칙적으로 박동하게 하는 심장의 기능성 근육 세포 유형.
iii) 연골세포: 관절, 외이도, 기관, 후두덮개, 후두, 척추골과 늑골 단부 사이의 디스크를 위한 연골을 만드는 기능성 세포 유형.
iv) 섬유모세포: 신체의 대부분의 조직 내에서 발견되는 결합 또는 지지 세포. 섬유모세포는 특정한 기관의 기능성 세포 유형이 정확하게 수행하도록 돕는 유익한 지지 골격을 제공한다.
v) 간세포: 대사 폐기물을 해독시키고 적혈구 세포를 파괴하고 이들의 성분들을 재활용하며, 혈장용 단백질을 합성하기 위한 효소를 제조하는 간의 기능성 세포 유형.
vi) 조혈 세포: 혈액을 만드는 기능성 세포 유형. 조혈 세포는 성체의 골수 내에서 발견된다. 태아에서, 조혈 세포는 간, 비장, 골수, 및 자궁 내에서 태아를 둘러싸는 지지 조직 내에서 발견된다.
vii) 근세포: 근육의 기능성 세포 유형.
viii) 신경: 흥분을 전달하는 데 있어서 전문화된 뇌의 기능성 세포 유형.
ix) 조골세포: 골을 만드는 것을 담당하는 기능성 세포 유형.
x) 섬 세포: 인슐린, 글루카곤, 가스트린 및 소마토스타틴의 분비를 담당하는 췌장의 기능성 세포. 이들 분자들은 함께 탄수화물 및 지방 대사, 혈당 수준 및 위 내로의 산 분비를 비롯한 다수의 과정을 조절한다.
간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 용도
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다.
예를 들면, 분화된 세포로 구성된 집단은 분화된 표현형에 특이적인 항체 및 cDNA 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 항체를 발생시키고, 정제하고 변형시키는 데 사용되는 일반적인 기법, 및 면역분석법 및 면역단리법에서의 이들의 용도는 문헌(Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, eds.)); 문헌(Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds.)); 및 문헌 (Methods of Immunological Analysis (Masseyeff et al., eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH))에 기재되어 있다. mRNA 및 cDNA 라이브러리의 제조에 이용되는 일반적인 기법은 문헌(RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (R. E. Farrell, Academic Press, 1998)); 문헌(cDNA Library Protocols (Cowell & Austin, eds., Humana Press)); 및 문헌(Functional Genomis (Hunt & Livesey, eds., 2000))에 기재되어 있다. 비교적 동종성을 갖는 세포 집단은 약물 검색 및 치료 용도에서 사용하기에 특히 적합하다.
간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 이들 및 다른 용도는 하기 및 이 명세서의 다른 곳에 더 상세히 기재되어 있다. 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 특히 질환의 치료를 위한 약학 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암을 비롯한 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 간엽 줄기 세포는 골수 유래의 간엽 줄기 세포(BM-MSC)와 유사하거나 동일한 성질을 가진다. 그러므로, 간엽 줄기 세포, 및 이로부터 제조된 임의의 분화된 세포는 BM-MSC가 사용되는 것으로 공지되어 있거나 BM-MSC가 사용될 수 있는 임의의 적용분야에서 사용될 수 있다.
약물 검색
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 간엽 줄기 세포 또는 분화된 세포의 특성에 영향을 주는 인자(예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 환경 조건(예컨대, 배양 조건 또는 조작)을 검색하는 데 사용될 수도 있다.
일부 적용분야에서, 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 장기간의 배양 시 상기 세포들의 성숙 또는 증식 및 유지를 촉진하는 인자들을 검색하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 후보 성숙 인자 또는 성장 인자는 이들을 상이한 웰 내의 간엽 줄기 세포 또는 분화된 세포에 첨가한 후, 발생된 임의의 표현형적 변화를 상기 세포의 추가 배양 및 사용에 대한 바람직한 기준에 따라 측정함으로써 시험한다.
더욱이, 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 유전자 발현 프로파일링은 이 세포들에서 유일하거나 고도로 발현되는 수용체, 전사 인자 및 신호전달 분자를 확인하는 데 사용될 수 있다. 상기 수용체, 전사 인자 및 신호전달 분자에 대한 특이적 리간드, 소분자 억제제 또는 활성화제는 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포의 분화 및 성질을 조절하는 데 사용될 수 있다.
구체적인 검색 분야는 약물 연구에서 약학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 본 명세서를 읽는 자는 본 명세서의 다른 곳에 있는 약물 검색에 대한 일반적인 설명뿐만 아니라 일반적으로 표준 교재("In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997) 및 미국 특허 제5,030,015호도 참조할 것이다. 후보 약학적 화합물의 활성 평가는 일반적으로 분화된 세포와 후보 화합물을 조합시키는 단계, 형태, 마커 표현형, 또는 (미처리된 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교할 때) 상기 화합물에 기인하는 세포의 대사 활성에서의 임의의 변화를 측정하는 단계, 및 상기 화합물의 효과와 관찰된 변화를 상호관련시키는 단계를 포함한다.
검색은 예를 들면, 상기 화합물이 특정한 세포 유형에 대한 약리학적 효과를 가지도록 디자인되기 때문에, 또는 다른 경우 효과를 가지도록 디자인된 화합물이 의도하지 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행될 수 있다. 가능한 약물--약물 상호작용 효과를 검출하기 위해 2개 이상의 약물을 (동시에 또는 순차적으로 세포와 조합함으로써) 조합하여 시험할 수 있다. 일부 분야에서, 화합물은 잠재적 독성에 대해 먼저 검색된다(Castell et al., pp. 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997). 우선, 세포독성은 세포 생존가능성, 생존, 형태, 및 특정한 마커, 수용체 또는 효소의 발현 또는 방출에 대한 효과에 의해 결정될 수 있다. 염색체 DNA에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 복구를 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히, 세포 주기에서 예정되지 않은 회수의 [3H]티미딘 또는 BrdU 혼입 또는 세포 복제에 필요한 수준을 초과한 [3H]티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치 않은 효과는 중기 퍼짐에 의해 결정되는, 시스터 염색분체 교환의 비정상적인 속도를 포함할 수도 있다. 본 명세서를 읽은 자는 추가 상세한 설명을 위해 문헌(A. Vickers (PP 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997))을 참조할 수 있다.
조직 재생
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 조직 재구성 또는 재생을 필요로 하는 인간 환자 내에서 조직 재구성 또는 재생을 위해 사용될 수도 있다. 상기 세포들은 이들이 의도된 조직 부위로 이식되어 기능적으로 결핍된 영역을 재구성하거나 재생시키는 방식으로 투여된다.
예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 줄기 세포의 분화를 조절하는 데 사용될 수 있다. 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 조직 개조 예컨대, 피부 이식편의 성장을 위해 사용될 수 있다. 줄기 세포 분화의 조절은 인공 기관 및 조직의 생체공학, 또는 부목과 같은 보철을 위해 사용될 수 있다.
암
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 생장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 말하거나 지칭한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평 세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 아교세포 종양 예컨대, 아교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포 암종, 및 다양한 유형의 두경부암이 있다. 추가 예는 결장암, 유방암, 폐암 및 전립선암을 비롯한 고형 종양 암, 백혈병 및 림프종을 비롯한 조혈 악성 종양, 호치킨병, 재생불량성 빈혈, 피부암 및 가족성 선종성 폴립증(familial adenomatous polyposis)이 있다. 추가 예로는 뇌 신생물, 결장직장 신생물, 유방 신생물, 자궁 신생물, 눈 신생물, 간 신생물, 폐 신생물, 췌장 신생물, 난소 신생물, 전립선 신생물, 피부 신생물, 정소 신생물, 신생물, 골 신생물, 영양막 신생물, 자궁관 신생물, 직장 신생물, 결장 신생물, 신장 신생물, 위 신생물 및 부갑상선 신생물이 있다. 유방암, 전립선암, 췌장암, 결장직장암, 폐암, 악성 흑색종, 백혈병, 림프종, 난소암, 자궁암 및 담관암종도 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포는 엔도스타틴 및 엔지오스타틴과 같은 항암제 또는 화학독성제 또는 화학요법제와 함께 사용될 수도 있다. 예를 들면, 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플라티늄, 에토포사이드, 탁솔, 탁소테르 및 알칼로이드 예컨대, 빈크리스틴, 및 항대사물질 예컨대, 메토트렉세이트와 같은 약물이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예를 들면, I, Y, Pr), 화학요법제, 및 독소 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편을 포함하는 것이다.
또한, 상기 용어는 국제특허출원 공보 제WO 94/22867호에 개시된 이환 안사마이신; 유럽 특허 제600832호에 개시된 1,2-비스(아릴아미노) 벤조산 유도체; 유럽 특허 제600831호에 개시된 6,7-디아미노-프탈라진-1-온 유도체; 유럽 특허 제516598호에 개시된 4,5-비스(아릴아미노)-프탈이미드 유도체; 또는 SH2-함유 기질 단백질과 티로신 키나제의 결합을 억제하는 펩티드(예컨대, 국제특허출원 공보 제WO 94/07913호 참조)와 같은 종양유전자 생성물/티로신 키나제 억제제를 포함한다. "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학물질이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노사이드(Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 부설판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 마이토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, VP-16, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 니코틴아미드, 에스퍼라미신(예컨대, 미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드, 및 내분비 요법(예컨대, 디에틸스틸베스트롤(DES), 타목시펜, LHRH 길항 약물, 프로게스틴, 항-프로게스틴 등)이 있다.
줄기 세포
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 분열 시 하기 2가지 발달 선택안에 직면하는 세포를 말한다: 딸세포가 모세포와 동일할 수 있거나(자가-재생), 딸세포가 더 전문화된 세포 유형의 전구 세포일 수 있다(분화). 그러므로, 줄기 세포는 한 경로 또는 다른 경로(각각의 세포 유형 중 하나가 형성될 수 있는 추가 경로가 존재함)를 채택할 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 최종적으로 분화되지 않으며 다른 유형의 세포를 생성할 수 있는 세포이다.
본 명세서에서 지칭되는 줄기 세포는 전능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 및 다중능성 줄기 세포를 포함할 수 있다.
전능성 줄기 세포
용어 "전능성" 세포는 성체 내에서 임의의 세포 유형이 될 수 있거나 배아외 막(예컨대, 태반)의 임의의 세포가 될 수 있는 잠재력을 가진 세포를 지칭한다. 따라서, 전능성 세포만이 수정란, 및 이의 분할에 의해 생성된 처음 4개 정도의 세포이다.
다능성 줄기 세포
"다능성 줄기 세포"는 체내에서 임의의 분화된 세포를 만드는 잠재력을 가진 진정한 줄기 세포이다. 그러나, 이들은 영양막으로부터 유래한 배아외 막을 만드는 데 기여할 수 없다. 다능성 줄기 세포의 여러 유형이 발견되었다.
배아 줄기 세포
배아 줄기(ES) 세포는 이식이 일어날 때 배아 발달의 단계인 배반포의 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 단리될 수 있다.
배아 생식 세포
배아 생식(EG) 세포는 유산된 태아의 성선(gonad)에 대한 전구세포로부터 단리될 수 있다.
배아 암종 세포
배아 암종(EC) 세포는 태아의 성선에서 종종 발생하는 종양인 기형암종으로부터 단리될 수 있다. 처음 2개와 달리, 상기 세포는 통상적으로 홀배수체이다. 이러한 유형의 모든 3가지 다능성 줄기 세포들은 배아 또는 태아 조직으로부터만 단리될 수 있고 배양물 중에서 생장될 수 있다. 이 다능성 세포들이 분화하는 것을 방지하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
성체 줄기 세포
성체 줄기 세포는 골수 이식에 있어서 활성 성분인 신경, 피부 및 조혈 줄기 세포를 비롯한 매우 다양한 유형을 포함한다. 상기 조혈 줄기 세포 유형은 제대-유래의 줄기 세포의 주요 특징이기도 하다. 성체 줄기 세포는 세포 유형의 정확한 수가 선택된 줄기 세포의 유형에 의해 한정된다 하더라도 실험실 및 체내 둘다에서 보다 전문화된 기능성 세포 유형으로 성숙할 수 있다.
다중능성 줄기 세포
다중능성 줄기 세포는 한정된 수의 유형으로만 분화될 수 있는 진정한 줄기 세포이다. 예를 들면, 골수는 모든 혈액 세포를 발생시키지만 다른 유형의 세포를 발생시키지 못하는 다중능성 줄기 세포를 함유한다. 다중능성 줄기 세포는 성체 동물에서 발견된다. 체내의 모든 기관(뇌, 간)은 상기 다중능성 줄기 세포가 사멸한 세포 또는 손상된 세포를 대체할 수 있는 곳에 상기 다중능성 줄기 세포를 함유한다고 추측된다.
줄기 세포의 특징을 규명하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 클론 분석, 유세포분류, 장기간 배양 및 분자생물학적 기법 예컨대, PCR, RT-PCR 및 써던 블롯팅과 같은 표준 분석법의 사용을 포함한다.
형태학적 차이점 이외에, 인간 및 뮤린 다능성 줄기 세포는 다수의 세포 표면 항원(줄기 세포 마커)의 발현에 있어서 상이하다. 단계-특이적 배아 항원 1 및 4(SSEA-1 및 SSEA-4) 및 종양 거부 항원 1-60 및 1-81(TRA-1-60, TRA-1-81)을 비롯한 줄기 세포 마커의 확인을 위한 항체는 예를 들면, 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)로부터 구입될 수 있다. 단일클론 항체를 사용한 이들 항원의 면역학적 검출은 다능성 줄기 세포를 특징규명하는 데 널리 사용되어 왔다(Shamblott M.J. et al., (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et al., (2000). PNAS 97: 11307-11312; Thomson J.A. et al., (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et al., (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et al., (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et al., (2000). J. Cell Science 113: 5-10).
줄기 세포의 공급원
하기 비-제한적 실시예를 포함할 수 있는 다양한 유형의 줄기 세포는 간엽 줄기 세포 및 분화된 세포를 생성하기 위한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
미국 특허 제5,851,832호는 뇌 조직으로부터 수득된 다중능성 신경 줄기 세포를 보고한다. 미국 특허 제5,766,948호는 신생아의 대뇌 반구로부터 신경모세포를 생성하는 것을 보고한다. 미국 특허 제5,654,183호 및 제5,849,553호는 포유동물 신경 능선 세포의 사용을 보고한다. 미국 특허 제6,040,180호는 포유동물 다중능성 CNS 줄기 세포의 배양물로부터 분화된 신경의 시험관 내 발생을 보고한다. 국제특허출원 공보 제WO 98/50526호 및 제99/01159호는 신경상피 줄기 세포, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)-성상세포(astrocyte) 전구세포, 및 계통-한정된 신경 전구세포의 발생 및 단리를 보고한다. 미국 특허 제5,968,829호는 배아 전뇌로부터 수득하여, 글루코스, 트랜스페린, 인슐린, 셀레늄, 프로게스테론 및 여러 다른 성장 인자를 포함하는 배지로 배양시킨 신경 줄기 세포를 보고한다.
일차 간 세포 배양물은 콜라게나제와 히알루로니다제의 적절한 조합물을 사용한 관류에 의해 인간 생검 또는 수술로 절개한 조직으로부터 수득될 수 있다. 별법으로, 유럽 특허출원 제0 953 633 A1호는 잘게 썬 인간 간 조직을 준비하고, 농축된 조직 세포를 생장 배지 중에 재현탁시키고 상기 세포를 배양물 중에서 증폭시킴으로써 간 세포를 단리하는 것을 보고한다. 상기 생장 배지는 글루코스, 인슐린, 트랜스페린, T3, FCS, 및 간세포가 악성 형질전환 없이 생장될 수 있게 하는 다양한 조직 추출물을 포함한다. 간 내의 세포는 간 실질세포, 쿱퍼(Kupffer) 세포, 동굴모양 내피세포(sinusoidal endothelium) 및 담관 상피세포를 비롯한 전문화된 세포뿐만 아니라, 성숙 간세포 또는 담 상피세포 둘다로 분화하는 능력을 가진 전구세포("간모세포" 또는 "타원 세포"로 지칭됨) 또한 포함하는 것으로 생각된다(L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998).
미국 특허 제5,192,553호는 인간 신생아 또는 태아 조혈 줄기 또는 전구 세포를 단리하는 방법을 보고한다. 미국 특허 제5,716,827호는 Thy-1 양성 전구 세포인 인간 조혈 세포, 및 이를 시험관 내에서 재생시키기에 적합한 생장 배지를 보고한다. 미국 특허 제5,635,387호는 인간 조혈 세포 및 이의 전구세포를 배양하는 방법 및 장치를 보고한다. 미국 특허 제6,015,554호는 인간 림프계 세포 및 수지상 세포를 재구성하는 방법을 개시한다.
미국 특허 제5,486,359호는 하나 이상의 결합 조직 유형 예컨대, 골, 연골, 힘줄, 인대 및 진피의 세포로 분화할 수 있는 인간 간엽 줄기 세포로 구성된 동종성을 갖는 집단을 보고한다. 이 집단은 골수 또는 골막으로부터 수득된다. 또한, 간엽 줄기 세포를 증폭시키는 데 사용되는 배양 조건도 보고되어 있다. 국제특허출원 공보 제WO 99/01145호는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 성장 인자로 처리된 개체의 말초 혈액으로부터 단리된 인간 간엽 줄기 세포를 보고한다. 국제특허출원 공보 제WO 00/53795호는 지방세포 및 적혈구 세포가 실질적으로 존재하지 않는, 지방-유래의 줄기 세포 및 격자를 보고한다. 보고에 의하면, 이 세포는 호르몬 및 조건 배양 배지를 생성하도록 증폭되고 배양될 수 있다.
임의의 척추동물 종의 줄기 세포가 사용될 수 있다. 인간뿐만 아니라 비-인간 영장류, 애완 동물, 가축, 및 다른 비-인간 포유동물 예컨대, 설치류, 마우스, 래트 등으로부터 유래한 줄기 세포가 포함된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 줄기 세포 중에는 잉태 후 형성된 조직 예컨대, 배반포, 또는 잉태 기간 동안 임의의 시기에 채취된 태아 또는 배아 조직으로부터 유래한 영장류 다능성 줄기(pPS) 세포이다. 비-제한적 예는 배아 줄기 세포의 일차 배양물 또는 확립된 세포주이다.
배지 및 영양세포
다능성 줄기 세포를 단리하고 증식시키기 위한 배지는 수득된 상기 세포가 원하는 특성을 갖고 더 증식될 수 있는 한 여러 상이한 조성 중 임의의 조성을 가질 수 있다.
적합한 공급원은 다음과 같다: 둘베코의 변형 이글스 배지(DMEM), Gibco#11965-092; 넉아웃 둘베코의 변형 이글스 배지(KO DMEM), Gibco#10829-018; 200 mM L-글루타민, Gibco#15039-027; 비-필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; 베타-머캡토에탄올, Sigma#M7522; 및 인간 재조합 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF), Gibco#13256-029. 예시적 혈청-함유 배아 줄기(ES) 배지는 80% DMEM(전형적으로 KO DMEM), 열 불활성화되지 않은 정의된 20% 태아 소 혈청(FBS), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 베타-머캡토에탄올로 만들어진다. 상기 배지는 여과되어 2주 이하의 기간 동안 4℃에서 저장된다. 혈청 무함유 배아 줄기(ES) 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM 베타-머캡토에탄올로 만들어진다. 효과적인 혈청 대체물은 Gibco#10828-028이다. 상기 배지는 여과되어 2주 이하의 기간 동안 4℃에서 저장된다. 사용 직전, 인간 bFGF는 4 ng/㎖의 최종 농도로 첨가된다(Bodnar et al., Geron Corp, 국제특허출원 공보 제WO 99/20741호).
바람직한 실시양태에서, 상기 배지는 10% 혈청 대체 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5 ng/㎖ FGF2(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 및 5 ng/㎖ PDGF AB(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)로 보충된 넉아웃 DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)를 포함한다.
영양세포(사용된 경우)는 90% DMEM(Gibco#11965-092), 10% FBS(Hyclone#30071-03) 및 2 mM 글루타민을 함유하는 mEF 배지 중에서 증식된다. mEF를 T150 플라스크(Coming#430825) 내에서 증식시키고, 트립신을 사용하여 2일마다 1:2로 상기 세포를 분할하고, 상기 세포를 서브-전면생장(sub-confluent) 상태로 유지시킨다. 영양세포 층을 준비하기 위해, 증식을 억제하지만 인간 배아 줄기 세포를 지지하는 중요한 인자들의 합성을 허용하는 양(약 4000 라드(rad)의 감마 방사선조사)으로 세포를 방사선조사한다. 6개-웰 배양 플레이트(예컨대, Falcon#304)는 웰 당 1 ㎖의 0.5% 젤라틴과 함께 37℃에서 밤새 항온처리함으로써 피복하고, 웰 당 375,000의 양으로 방사선조사된 mEF로 도말한다. 영양세포 층은 전형적으로 도말 후 5시간 내지 4일 동안 사용된다. pPS 세포를 시딩하기 직전에 배지를 새로운 인간 배아 줄기(hES) 배지로 교체한다.
다른 줄기 세포를 배양하기 위한 조건은 공지되어 있고, 세포 유형에 따라 적절하게 최적화될 수 있다. 전 단락에서 언급된 특정한 세포 유형을 위한 배지 및 배양 기법은 인용된 참고문헌에 제공되어 있다.
배아 줄기 세포
배아 줄기 세포는 영장류 종의 구성원의 배반포로부터 단리될 수 있다(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기(hES) 세포는 문헌(Thomson et al., 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 문헌(Reubinoff et al., Nature Biotech. 18:399, 2000)에 기재된 기법을 이용하여 인간 배반포 세포로부터 제조될 수 있다.
요약하면, 인간 배반포를 인간 생체 내 이식전 배아로부터 수득한다. 별법으로, 시험관 내에서 수정된 (IVF) 배아를 사용할 수 있거나, 단일 세포 인간 배아를 배반포 단계까지 증식시킬 수 있다(Bongso et al., Hum Reprod 4:706, 1989). 인간 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 중에서 배반포 단계까지 배양한다(Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발달 중인 배반포를 배아 줄기 세포 단리에 대해 선별한다. 투명대는 프로나제(pronase)(Sigma)에의 짧은 노출에 의해 배반포로부터 제거된다. 내부 세포 덩어리를 면역외과적 기법으로 단리하는데, 이때 배반포를 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청의 1:50 희석물에 30분 동안 노출시킨 후, DMEM 중에서 5분 동안 3회 세척하고, 기니아 피그 보체(Gibco)의 1:5 희석물에 3분 동안 노출시킨다(문헌(Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975) 참조). DMEM 중에서 2회 더 세척한 후, 용해된 영양막배엽 세포를 약한 피펫팅으로 온전한 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 제거하고, ICM을 mEF 영양세포 층 상에 도말한다.
9 내지 15일 후, 내부 세포 덩어리-유래의 부산물을 1 mM EDTA가 함유된 칼슘 및 마그네슘 무함유 인산염-완충 식염수(PBS)에 노출시키거나, 디스파제(dispase) 또는 트립신에 노출시키거나, 마이크로피펫을 사용하여 물리적으로 분리함으로써 덩어리로 분리한 후, 새로운 배지 중의 mEF 상에 재도말한다. 분리된 세포를 새로운 배아 줄기(ES) 배지 중의 mEF 영양세포 층 상에 재도말하고, 콜로니 형성에 대해 관찰한다. 분화되지 않은 형태를 나타내는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선별하고, 덩어리로 물리적으로 분리하고, 재도말한다. 배아 줄기 세포-유사 형태는 명백히 높은 핵 대 세포질 비 및 현저한 핵소체(nucleoli)를 가진 압축된 콜로니인 것을 특징으로 한다. 그 다음, 생성된 배아 줄기 세포는 짧은 트립신처리, 둘베코의 PBS(칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않고 2 mM EDTA를 함유함)에의 노출, 타입 IV 콜라게나제에의 노출(약 200 U/㎖; Gibco) 또는 마이크로피펫에 의한 개별 콜로니의 선별에 의해 1-2주 마다 정기적으로 분할한다. 약 50 내지 100개의 세포로 이루어진 크기의 덩어리가 최적이다.
배아 생식 세포
인간 배아 생식(hEG) 세포는 마지막 월경 기간 후 약 8 내지 11주째에서 채취된 인간 태아 물질에 존재하는 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 적절한 제조 방법은 문헌(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998) 및 미국 특허 제6,090,622호에 기재되어 있다.
요약하면, 생식능선을 등장성 완충제로 린싱한 후, 0.1 ㎖의 0.05% 트립신/0.53 mM 나트륨 EDTA 용액(BRL) 내에 넣고 1 ㎣ 미만의 덩어리로 절단한다. 그 후, 상기 조직을 100/㎕ 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 더 해체시킨다. 이를 37℃에서 약 5분 동안 항온처리한 후, 약 3.5 ㎖의 EG 생장 배지를 첨가한다. EG 생장 배지는 4500 mg/ℓ D-글루코스, 2200 mg/ℓ mM 중탄산나트륨; 15% 배아 줄기(ES) 정성화 태아 소 혈청(BRL); 2 mM 글루타민(BRL); 1 mM 피루브산나트륨(BRL); 1000 내지 2000 U/㎖ 인간 재조합 백혈병 억제 인자(LIF, Genzyme); 1-2 ng/㎖ 인간 재조합 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF, Genzyme); 및 (10% DMSO 중의) 10 μM 포르스콜린을 함유하는 DMEM이다. 별법에서, EG 세포를 히알루로니다제/콜라게나제/DNAase를 사용하여 단리한다. 격막을 가진 생식원기 또는 생식능선을 태아 물질로부터 절개하고, 생식능선을 PBS로 린싱한 후, 0.1 ㎖ HCD 분해 용액(모두 시그마로부터 구입된, EG 생장 배지 중에서 제조된 0.01% 히알루로니다제 타입 V, 0.002% DNAse I, 0.1% 콜라게나제 타입 IV) 중에 넣어 둔다. 조직을 잘게 절단하고 37℃에서 1시간 동안 또는 밤새 항온처리하고, 1 내지 3 ㎖의 EG 생장 배지 중에 재현탁시키고, 영양세포 층 상에 도말한다.
5000 라드 y-방사선조사로 불활성화된, LIF, bFGF 또는 포르스콜린 무함유 변형 EG 생장 배지 중에서 3일 동안 배양된 영양세포로 이루어진 서브-전면생장 층을 가진 96-웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 적합한 영양세포는 STO 세포(ATCC 기탁번호 CRL 1503)이다. 0.2 ㎖의 일차 생식 세포(PGC) 현탁액을 상기 웰 각각에 첨가한다. EG 생장 배지 중에서 7 내지 10일 동안 배양한 후 제1 계대배양을 수행하고, 각각의 웰의 배양물을 방사선조사된 ST0 마우스 섬유모세포로 미리 준비한 24-웰 배양 디쉬의 한 웰로 옮긴다. EG 세포와 일치하는 세포 형태가 전형적으로 7 내지 30일 또는 1 내지 4회 계대배양 후 관찰될 때까지 배지를 매일 교체하면서 세포를 배양한다.
자가-재생 및 분화
자가-재생
자가-재생 줄기 세포는 당업계에서 공지된 다양한 수단, 예를 들면, 형태학적, 면역조직화학적, 분자생물학적 수단 등에 의해 확인될 수 있다.
이러한 줄기 세포는 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-1의 증가된 발현을 나타낸다. 바람직하게는, Flk-1, Tie-2 및 c-kit 중 임의의 하나 이상의 발현이 감소된다. 자가-재생하는 줄기 세포는 바람직하게는 자가-재생하지 않는 줄기 세포에 비해 단축된 세포 주기를 나타낸다.
예를 들면, 표준 현미경 이미지의 2차원에서, 인간 배아 줄기 세포는 이미지의 평면에서 높은 핵/세포질 비율, 현저한 핵소체, 및 약간 분리된 세포 접합부를 가진 압축 콜로니 형성을 나타낸다. 세포주는 표준 G-밴딩 기법(통상의 핵형분석 서비스를 제공하는 많은 임상적 진단 실험실 예컨대, 캘리포니아 오클랜드에 소재하는 사이토제네틱스 랩(Cytogenetics Lab)에서 이용가능함)을 이용하여 핵형분석되고 공개된 인간 핵형에 비교될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포 및 인간 배아 생식 세포는 발현된 세포 마커를 특징으로 할 수도 있다. 일반적으로, 본 개시내용에서 논의된 조직-특이적 마커는 적절한 면역학적 기법 예컨대, 막-결합 마커에 대한 유세포분류, 세포내 마커에 대한 면역조직화학적 기법, 및 배지 내로 분비된 마커에 대한 효소-결합 면역분석법을 이용하여 검출할 수 있다. 단백질 마커의 발현은 마커-특이적 프라이머를 사용한 역전사-PCR에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수도 있다. 예를 들면, 더 상세한 설명에 대해서는 미국 특허 제5,843,780호를 참조한다.
단계-특이적 배아 항원(SSEA)은 일부 배아 세포 유형의 특징이다. SSEA 마커에 대한 항체는 발달 연구 하이브리도마 은행(the Developmental Studies Hybridoma Bank; Bethesda Md.)으로부터 입수가능하다. 다른 유용한 마커는 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 명명된 항체를 사용하여 검출될 수 있다(Andrews et al., Cell Lines from Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra). 인간 배아 줄기 세포는 전형적으로 SSEA-1 음성 및 SSEA-4 양성을 나타낸다. hEG 세포는 전형적으로 SSEA-1 양성을 나타낸다. 시험관 내에서의 pPS 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 상실 및 SSEA-1의 증가된 발현을 초래한다. pPS 세포는 제조자(Vector Laboratories, Burlingame Calif.)에 의해 기재된 바와 같이 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 사용하여 현상시킴으로써 검출할 수 있는 알칼리성 포스파타제 활성의 존재를 특징으로 할 수도 있다.
배아 줄기 세포는 전형적으로 텔로머라제 양성 및 OCT-4 양성을 나타낸다. 텔로머라제 활성은 시판되는 키트(TRAPeze.RTM. XK Telomerase Detection Kit, Cat. s7707; Intergen Co., Purchase N. Y.; or TeloTAGGG.TM. Telomerase PCR ELISA plus, Cat. 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis)를 사용하여 TRAP 활성 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. hTERT 발현은 RT-PCR에 의해 mRNA 수준에서 평가될 수도 있다. 라이트사이클러(LightCycler) TeloTAGGG.TM. hTERT 정량화 키트(Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics)를 연구 목적으로 구입할 수 있다.
분화
간엽 줄기 세포 및 이로부터 유래한 분화된 세포를 비롯한 분화하는 세포는 바람직하게는 4E-BP1 및/또는 S6K1의 상승된 탈인산화를 나타낸다. 상기 세포는 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-1의 감소된 발현을 나타낸다. 바람직하게는, Flk-1, Tie-2 및 c-kit 중 임의의 하나 이상의 발현이 증가된다. 바람직하게는, Brachyury, AFP, nestin 및 nurr1 발현 중 어느 하나 이상의 발현이 증가된다. 자가-재생하는 줄기 세포는 바람직하게는 자가-재생하지 않는 줄기 세포에 비해 길어진 세포 주기를 나타낸다.
분화하는 줄기 세포, 즉 분화 경로를 시작하거나 분화 경로에 구속된(committed) 세포는 특히 전사체 변화를 비롯한 다수의 표현형적 기준에 따라 특징규명될 수 있다. 상기 기준은 형태학적 특징의 특징규명, 발현된 세포 마커 및 효소적 활성의 검출 또는 정량화, 유전자 발현 및 생체 내 세포의 기능적 성질의 결정을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일반적으로, 분화하는 줄기 세포는 분화 과정의 최종 생성물인 세포 유형, 즉 분화된 세포의 하나 이상의 특징을 가질 것이다. 예를 들면, 표적 세포 유형이 근세포인 경우, 이러한 세포로 분화하는 과정에 있는 줄기 세포는 예를 들면, 미요신 발현이라는 특징을 가질 것이다.
그러므로, 많은 측면에서, 상기 기준은 분화하는 줄기 세포의 운명에 달려 있을 것이고, 다양한 세포 유형의 일반적인 설명은 하기에 제공되어 있다.
분화된 또는 분화하는 신경 세포에 대한 관심있는 마커에는 신경의 특징인 베타-튜불린 EⅢ 또는 신경필라멘트; 성상세포에 존재하는 신경교원섬유 산성 단백질(GFAP); 희소돌기아교세포의 특징인 갈락토세레브로사이드(GaIC) 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP); 비분화된 인간 배아 줄기 세포의 특징인 OCT-4; 및 신경 전구세포 및 다른 세포의 특징인 nestin이 포함된다. A2B5 및 NCAM은 신경교 전구 세포 및 신경 전구 세포 각각의 특징이다. 세포는 특징적인 생물학적 활성 물질의 분비에 대해 시험될 수도 있다. 예를 들면, GABA-분비 신경은 글루탐산 데카르복실라제 또는 GABA의 생성에 의해 확인될 수 있다. 도파민성 신경은 도파 데카르복실라제, 도파민 또는 티로신 히드록실라제의 생성에 의해 확인될 수 있다.
분화된 또는 분화하는 간세포에 대한 관심있는 마커에는 알파-태아단백질(간 전구 세포); 알부민, α1-항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 사이토크롬 p450 활성, 트랜스페린, 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체, 및 글리코겐 저장물(간세포); CK7, CK19, 및 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(담 상피)가 포함된다. 간세포 분화가 전사 인자 BNF-4 알파를 필요로 한다는 것이 보고되어 있다(Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000). HNF-4 알파 발현과 관계없는 마커에는 α1-항트립신, 알파-태아단백질, apoE, 글루코키나제, 인슐린 성장 인자 1 및 2, IGF-1 수용체, 인슐린 수용체, 및 렙틴이 포함된다. HNF-4 알파 발현에 의존하는 마커에는 알부민, apoAI, apoAⅡ, apoB, apoCⅢ, apoCⅡ, 알돌레이즈 B, 페닐알라닌 히드록실라제, L-타입 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질 및 에리쓰로포이에틴(EPO)이 포함된다.
pPS 세포로부터 유래한 혼합된 세포 집단 중의 세포 유형은 특징적인 형태 및 이들이 발현하는 마커에 의해 인식될 수 있다. 골격근의 경우: myoD, 미오게닌, 및 myf-5. 내피세포의 경우, 페캄(혈소판 내피세포 부착 분자), Flk-1, tie-1, tie-2, 혈관 내피(VE) 캐드린, MECA-32 및 MEC-14.7. 평활근 세포의 경우, 특이적 미요신 중쇄. 심근세포의 경우, GATA-4, Nkx2.5, 심장 트로포닌 I, 알파-미요신 중쇄 및 ANF. 췌장 세포의 경우, pdx 및 인슐린 분비. 조혈 세포 및 이의 전구 세포의 경우, GATA-1, CD34, AC133, β-주요 글로불린, 및 β-주요 글로불린 유사 유전자 PH1.
본 명세서에 나열되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 일부 조직-특이적 마커는 면역학적 기법 예컨대, 세포-표면 마커의 경우 유동 면역세포화학적(flow immunocytochemistry) 기법, 세포내 또는 세포-표면 마커의 경우 (예컨대, 고정된 세포 또는 조직 절편의) 면역조직화학적 기법, 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석, 및 세포 추출물 또는 배지 내로 분비된 생성물의 경우 효소-결합 면역분석법에 의해 검출될 수 있다. 조직-특이적 유전자 생성물의 발현은 노던 블롯 분석, 도트-블롯 혼성화 분석, 또는 표준 증폭 방법에서 서열-특이적 프라이머를 사용한 역전사효소-개시 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수도 있다. 본 명세서에 나열된 특정한 마커에 대한 서열 데이타는 진뱅크(URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)와 같은 공개된 데이타베이스로부터 입수할 수 있다.
실시예 1. 방법
hESC - MSC ( 간엽 줄기 세포)의 유도
Hues9 및 H1 hESC는 이미 보고된 바와 같이 생장시켰다(참고문헌 6 및 7).
hESC를 분화시키기 위해, hESC의 전면생장 6 cm 플레이트를 37℃에서 3분 동안 트립신으로 처리하고, 중화시키고, 원심분리하고, 젤라틴으로 처리된 10 cm 플 레이트 상에서 10% 혈청 대체 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5 ng/㎖ FGF2(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 및 5 ng/㎖ PDGF AB(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)로 보충된 넉아웃 DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 중에 재현탁시켰다. 상기 세포를 전면생장에 도달한 때 트립신으로 처리하고 1:4로 분할하였다. CD105+ 및 CD24-에 대한 분류는 hESC를 트립신으로 처리한지 1주일 후 수행하였다. 분화하는 hESC를 3분 동안 트립신으로 처리하고, 중화시키고, 원심분리하고, 상기 배양 배지 중에 재현탁시킨 후, 박테리아 배양 디쉬 상에 도말하였다. 37℃, CO2 항온처리기 내에서 2시간 동안 항온처리한 후, 상기 세포를 수거하고, PBS로 세척하고, 실온에서 CD24-PE 및 CD105-FITC(PharMingen, San Diego, California)와 함께 90분 동안 항온처리하였다.
이어서, 상기 세포를 PBS로 세척하고, FACS 디바 소프트웨어(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 사용한 FACS 아리아(Aria) 상에서 분류하였다. BM-MSC를 이미 보고된 바와 같이 준비하였다(참고문헌 26). 상기 세포를 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 비-필수 아미노산 및 10% 태아 소 혈청(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)으로 보충된 DEME 중에서 배양하였다.
지방세포, 연골세포 및 골세포로의 분화는 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(참고문헌 3). 오일 레드, 알시안 블루 및 본 코사 염색은 표준 기법을 이용하여 수행하였다. 콜라겐 타입 II에 대한 면역반응성은 염소 항-콜라겐 a1 타입 II, 및 HRP에 접합된 당나귀 항-염소 IgG 항체(Santa Cruz, Santa Cruz, California)를 사 용하여 파라포름알데히드로 고정시킨 파라핀-포매 절편에 대해 수행하였다.
핵형분석
세포는 페트리 디쉬 내에서 약 80% 전면생장에 도달한 때에 제공받았다. 유사분열 정지를 위해 세포를 콜세미드(colcemid)로 처리하고 표준 저장성 처리 및 메탄올:아세트산 (3:1) 고정으로 수거하였다. 슬라이드를 표준 공기 건조 방법으로 준비하고 SKY 페인트 프로브(ASI)와 혼성화시켰다. 혼성화 후, 제조자에 의해 제공되며 본 발명자들의 실험실에서 확립된 프로토콜에 따라 세척을 수행하였다. 배양물 당 20 내지 30개의 중기 세포가 존재하였다. 각각의 배양물의 핵형은 >80% 중기 세포를 대표하였다.
이식 연구
2 X 106 세포를 30 ㎕의 식염수 중에 재현탁시키고 이미 보고된 바와 같이 신장 낭하 공간 내로 이식하였다(참고문헌 27). 4개월 후, 마우스를 희생시키고, 신장을 분리하여 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 파라핀으로 포매하고, 절편으로 절개하고 4 μM H&E로 염색하였다.
웨스턴 블롯 분석
표준 절차를 이용하였다(참고문헌 28). 요약하면, 세포를 RIPA 완충제 중에서 용해시키고 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 20 ㎍의 상청액을 변성시키고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막 상으로 전기-블롯팅하고, 막을 1차 항체에 이어서 HRP 접합-2차 항체 또는 바이오 티닐화 2차 항체와 함께 순차적으로 항온처리한 후, 뉴트로아비딘-HRP 및 최종적으로 HRP-상승 화학발광성 기질인 ESC(Pierce, Rockford, IL)와 함께 항온처리하였다.
사용된 1차 항체는 항-OCT4, 항-SOX-2 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, CA)의 1:200 희석물이었고, 2차 항체는 HRP-접합 염소 항-토끼, 토끼 항-염소 및 토끼 항-마우스이었다.
PCR
마우스-특이적 반복 서열 및 인간-특이적 반복 서열에 대한 게놈 PCR을 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(참고문헌 8). 마우스-특이적 반복 서열 및 인간-특이적 반복 서열에 대한 게놈 PCR을 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(참고문헌 8). 실시간 RT-PCR은 고성능 cDNA 아치브(Archive) 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 1 ㎍의 전체 RNA를 역전사함으로써 수행하였다. cDNA를 물 중에 10x 희석하고 택만 프라이머(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 40 주기 동안 증폭시켰다.
표면 항원 분석
hESC-MSC 및 hESC 상의 세포 표면 항원을 FACS를 사용하여 분석하였다. 상기 세포들을 5분 동안 트립신으로 처리하고, 원심분리하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 37℃의 5% CO2 항온처리기 내에서 2 내지 3시간 동안 박테리아 배양 디쉬 내에서 항온처리하였다. hESC-MSC 및 hESC 상의 세포 표면 항원을 FACS로 분석하였 다.
세포를 1분 동안 트립신으로 처리하고, 원심분리하고, PBS로 세척하고, 실온에서 0.5시간 동안 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 세척하고, 교반하면서 실온에서 0.5 시간 동안 2% FCS 중에서 블로킹하였다. 그 다음, 1.5 x 105 세포를 실온에서 90분 동안 하기 접합된 단일클론 항체들 각각과 함께 항온처리하였다: CD24-PE, CD29-PE, CD44-FITC, CD49a-PE, CD49e-PE, CD105-FITC, CD166-PE, CD34-FITC, CD45-FITC(PharMingen, San Diego, CA).
항온처리 후, 세포를 세척하고 PBS 중에 재현탁시켰다. 비특이적 형광은 이소타입이 일치하는 마우스 단일클론 항체(PharMingen, San Diego, CA)와 함께 유사한 세포 분취액을 항온처리함으로써 측정하였다. 데이타는 WinMDI 소프트웨어를 사용하는 시안 LX(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 장치 상에서 20,000 이벤트를 수집함으로써 분석하였다. 비특이적 형광은 이소타입이 일치하는 마우스 단일클론 항체(PharMingen, San Diego, CA) 또는 2차 항체와 함께 유사한 세포 분취액을 항온처리함으로써 측정하였다.
일루미나 유전자 칩 분석
1차 BM 및 지방-유래의 MSC 각각의 3개 샘플; HuES9의 2가지 생물학적 복제물인 HuES9.E3 및 HuES9.E1; 및 3가지 미분화된 hESC 세포주 H1, Hes3 및 HuES9로부터 얻은 전체 RNA(2 ㎍)를 제조자의 지시에 따라 일루미나 RNA 증폭 키트(Ambion, Inc., Austin, TX)를 사용하여 바이오티닐화 cRNA로 전환시켰다.
샘플을 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다. 센트릭스 인간 Ref-8 발현 비드칩(Sentrix Human Ref-8 Expression BeadChip)(Illumina, Inc., San Diego, CA)과의 혼성화, 세척 및 스캐닝을 일루미나 비드스테이션(BeadStation) 500x 메뉴얼에 따라 수행하였다. 데이타를 추출하고, 표준화하고, 제조자에 의해 제공된 일루미나 비드스튜디오(Illumina BeadStudio)를 사용하여 분석하였다. 99% 신뢰도에서 검출 한계(LOD) 미만인 전사체 신호를 발현되지 않는 유전자로서 제거하였다.
실시예 2. 인간 ES 세포주로부터의 MSC 배양물의 발생
hESC 콜로니를 트립신으로 분산시킨 후, 혈청 대체 배지, FGF2 및 경우에 따라 PDGF AB로 보충된 무혈청 배지 중에서 영양세포의 부재 하에 젤라틴처리 조직 배양 플레이트 상에서 계대배양한 경우, 서로 유사하거나 동일한 (바람직하게는 동종성인) 섬유모세포-유사 세포의 배양물이 2주 이내에 발생되었다.
상기 배양물은 BM-MSC와 유사한 섬유모세포의 세포 형태를 가진다(도 1A). 콜라게나제에 의한 hESC 콜로니의 분산은 이 섬유모세포-유사 세포를 발생시키는 데 있어서 효율적이지 않았다.
2가지 폴리클론 배양물, 즉 HuES9.E1 및 huES9.E3은 huES9 ESC 세포주로부터 독립적으로 발생되었지만, 세 번째 H1.E2는 H1 ESC 세포주로부터 발생되었다. 여러 다능성-관련 유전자들의 발현은 일반적으로 감소되었다. 예를 들면, HESX1, POUFL5, SOX -2, UTF -1 및 ZFP42의 전사체 수준은 hESC에서의 전사체 수준보다 >101- 5 배 더 낮았다(도 1B). OCT4, NANOG 및 SOX2의 단백질 수준도 감소되었다(도 1C). HuES9.E1에 의해 예시되는 바와 같이, 이 세포들은 검출가능한 알칼리성 포스파타제 활성을 갖지 않았다(도 1D).
면역 손상된 SCID 마우스에서 1 x 106 HuES9.E1 세포의 신장 낭하 이식은 상기 세포의 모세포인 HuES9 세포와 달리 4개월의 관찰 기간 동안 기형종의 형성을 유도하지 않았다(도 1E). 이 세포들이 마우스 영양세포로 오염되거나 마우스 영양세포와 융합되었을 가능성을 평가하기 위해(참고문헌 8), 이 배양물들을 시험한 결과 마우스-특이적 c- mos 반복 서열에 대해서는 음성을 나타내지만 인간 특이적 alu 반복 서열에 대해서는 양성을 나타낸다는 것을 밝혔다(도 1F).
HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2의 평균 집단 배가 시간은 각각 72, 72 및 120시간이었다. 집단 배가 시간은 세포 밀도에 많이 의존하고 30 내지 80% 전면생장도에서 가장 최적이었다. 약 80회의 집단 배가 후, HuES9.E1은 46 XX inv(9)(pl3ql2) 핵형을 가졌다. 9번 염색체 역위는 모세포주인 huES9 hESC로부터 유래한다(참고문헌 6). HuES9.E3 또한 46 XX inv(9)(pl3ql2) 핵형을 가졌지만, H1.E1은 36회 및 32회의 집단 배가 후 46 XY 핵형을 가졌다. 본 발명자들은 상기 세포가 약 35회의 집단 배가 후 세포의 ~10 내지 30%에서 비정상적인 비클론성 염색체 변이를 나타내기 시작한다는 것을 관찰하였고(데이타는 나타내지 않음) 상기 세포를 35회의 집단 배가 후에는 사용하지 않았다.
실시예 3. 표면 항원 프로파일
FACS 분석에 의한 HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2의 표면 항원 프로파일링은 BM-MSC에 대해 정의된 표면 항원 프로파일과 정성적으로 유사한 표면 항원 프로파일, 즉 CD29+, CD44+, CD49a 및 e+, CD105+, CD166+ 및 CD34-, CD45-를 나타내었다(참고문헌 9 내지 11)(도 2 A). 형광 표지의 강도 및 표지된 세포의 분포는 hESC-MSC 배양물 각각에서 상이하였다(도 2A).
이 세포들의 표면 항원 프로파일을 BM-MSC의 표면 항원 프로파일과 비교하기 위해, HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E1을 10% 태아 소 혈청으로 보충된 동일한 BM-MSC 배양 배지 중에서 2회 계대배양 동안 생장시켰다. 배양 조건에서의 변화에도 불구하고, HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E1의 표면 항원 프로파일은 계속 CD29+, CD44+, CD49a+, CD105+, CD166+ 및 CD34-, CD45- 이었고(도 2B; H1.E1에 대한 데이타는 나타내지 않음), BM-MSC의 표면 항원 프로파일과 상당히 유사하였다. 예외는 BM-MSC에서 훨씬 더 낮은 발현을 나타내는 CD49a이었다. 이 데이타는 hESC-MSC가 그의 미세환경에서의 변화에 의해 유의하게 영향을 받지 않는 안정한 특징적인 BM-MSC 표면 항원 프로파일을 나타낸다는 것을 의미한다.
실시예 4. hESC - MSC 의 분화 잠재력: 지방형성, 연골형성 및 골형성
MSC와 관련된 표면 항원의 전부가 많은 다른 세포 유형 상에서도 발현되고 이 표면 항원의 발현이 변동가능하기 때문에, 추정상의 MSC의 확인은 전통적으로 기능성 파라미터에 의존한다(참고문헌 9). 지방형성 및 연골형성의 정도를 달리할 경우 배양물 중의 MSC의 디폴트(default) 분화 경로가 골형성이라는 것은 이미 보고되어 있다(참고문헌 9).
그러므로, HuES9.E1 세포의 분화 잠재력은 공개된 프로토콜(참고문헌 3)을 이용하여 지방형성, 연골형성 및 골형성에 대한 표준 분화 조건을 사용하여 시험하였다.
오일 소적이 세포의 >99%에서 관찰되어 지방세포 분화가 매우 효율적임을 알 수 있었다(도 3 A). 지방형성에 있어서 중요한 전사 인자로서의 PPARγ의 역할과 일치하여, 모세포주인 ESC 각각에서의 PPARγ mRNA보다 약 10 내지 100배 더 높은, hESC 유래의 MSC에서의 PPARγ mRNA는 2배 더 증가되었다(도 3A).
알시안 블루 염색에 의해 검출된 경우 90% 초과의 세포가 세포외 매트릭스 내에서 프로테오글리칸을 생성하고(도 3B), 세포의 ~20%가 콜라겐 II에 대해 면역반응성을 나타내어, 연골형성 또는 연골의 형성도 효율적임을 알 수 있었다. 연골-특이적 세포외 매트릭스 단백질인 아그레칸(aggrecan)의 전사체 수준도 증가되었다(참고문헌 13)(도 3B). 그러나, 또 다른 연골-특이적 세포외 매트릭스 단백질인 콜라겐 II의 전사체 수준은 매트릭스 내의 콜라겐 II 면역반응성의 존재에도 불구하고 감소되었다. 이유는 알려져 있지 않지만, 일부 mRNA 특히, AU-풍부 요소를 가진 mRNA가 번역 시 불안정화되는 것으로 공지되어 있다(참고문헌 14 및 15).
HuES9.E1 세포가 골발생 또는 골형성을 일으키도록 유도되는 경우, 골-특이적 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 골 시알로단백질(BSP)(참고문헌 16)의 발현은 2 내지 3배까지 상향조절되었다(도 3C). 그러나, 본 코사 염색에 의해 확인된 미네랄화, 즉 골 형성의 보다 진행된 단계(참고문헌 17)는 약하다(도 3C). 분화된 배양물 중에 1% 미만의 양성 염색이 있었다.
실시예 5. 유전자 발현 프로파일
hESC-MSC의 유전자 발현 프로파일링은 1) 3개의 상이한 개체로부터의 BM-MSC 및 지방 유래 (ad)-MSC, 및 3개의 인간 ESC 세포주를 사용하여 hESC-MSC 배양물과 성체 조직-유래의 MSC의 관계를 평가하기 위해; 2) 3개의 hESC-MSC 배양물 각각 사이의 관계를 평가하기 위해; 3) hESC로부터 유래한 MSC와 BM으로부터 유래한 MSC 사이의 유사성과 차이점을 비교하기 위해 수행하였다.
전체 RNA로부터 제조된 표지된 cDNA는 약 24,000개의 독특한 특징을 함유하는 일루미나 비드어레이에 혼성화시켰다. 3개의 hESC-MSC 배양물, 즉 HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2, 3가지 BM-MSC 샘플 및 3개의 지방 유래 (ad)-MSC 샘플에서 발현된 유전자의 계층적 분류는 hESC-MSC의 유전자 발현 프로파일이 이의 모 hESC의 유전자 발현 프로파일보다 성체 조직-유래의 MSC, 즉 BM-MSC 및 ad-MSC의 유전자 발현 프로파일에 더 밀접하게 관련되어 있다는 것을 보여주었다(도 4A).
흥미롭게는, MSC는 그가 유래한 조직에 따라 분류되고, 이것은 hESC-MSC와 상이한 군으로서의 ad-MSC 및 BM-MSC의 분류에 의해 제안된 바와 같이 성체와 배아 조직으로 더 분리될 수 있다. hESC-MSC와 BM-MSC 사이의 유전자 발현의 쌍 비교는 hESC-MSC 및 BM-MSC 둘다에서 유전자 발현의 유의한 보전이 있지만 유의한 차이도 있다는 것을 시사하는 0.72의 상관계수를 나타내었다(도 4B). hESC-MSC와 hESC 사이의 쌍 비교는 0.65의 낮은 상관계수로 hESC-MSC와 hESC의 상이함을 확인시켜 주었다(도 4C).
3개의 hESC-MSC 배양물 각각의 사이의 관계를 평가하기 위해, HuES9.E1, H1.E2 및 HuES9.E3 각각을 HuES9.E1, H1.E2 및 HuES9.E3으로 구성된 동일한 기준물과 비교하였다. 상기 동일한 기준물에 대한 HuES9.E1, H1.E2 및 HuES9.E3의 상관계수는 사실상 동일하였고, 즉 각각 0.93, 0.95 및 0.93이었고, 이는 HuES9.E1, H1.E2 및 HuES9.E3이 매우 유사함을 시사한다(도 4C).
hESC-MSC 및 BM-MSC 각각에서 99% 신뢰 수준에서 검출 한계를 초과하여 발현되는 8699개 및 8505개의 유전자들 중에서, 6376개의 유전자들이 2.0배 미만의, 차이로 hESC-MSC 및 BM-MSC 둘다에서 발현되었다. 이 유전자들이 MSC의 기본 생물학적 특성을 이해할 수 있게 할 것이기 때문에, 본 발명자들은 이 유전자들에 의해 유도되는 생물학적 과정을 조사하였다. 통상적으로 발현되는 6,376개의 유전자들 중에서, 4,064개의 유전자가 판터 분류 유전자 목록에서 발견되었다(March 2006; http://www.pantherdb.org/).
이 유전자들을 상이한 생물학적 과정으로 분류한 결과, 생물학적 과정 중 일부에서의 유전자 빈도가 NCBI의 호모 사피엔스 유전자 데이타베이스에 있는 23481개의 유전자들로 구성된 기준 목록과 비교할 때 유의하게 과다하게 나타났거나 과소하게 나타났다(p<0.01). 예를 들면, 추정상의 줄기 세포의 생장 및 자가-재생에 중요할 것으로 보이는 대사 과정에 있어서 유전자들이 과다하게 나타나 있었다. 이 과정들은 이화 및 동화 활성, 광범위한 번역 후 변형 예를 들면, 글리코실화를 필요로 하는 분비 생성물의 생합성, 및 세포 증식에 대한 기본 대사 과정들을 포함한다(도 4C).
외배엽 분화, 특히 신경 발달에 관여하는 유전자들이 과소하게 나타나 있는 데, 이는 상기 유전자들의 간엽 잠재력과 일치한다. 유전자 발현 분석은 MAPKKK 신호전달이 BM-MSC 및 hESC-MSC 둘다에서 현저하다는 것도 시사하였다. 3개 이상의 하위족(subfamily), 즉 고전적 MAPK(ERK로도 공지되어 있음), 스트레스-활성화 단백질 키나제/c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 p38 키나제로 구성된 MAPKKK 신호전달은 증식, 분화, 발달, 세포 스트레스에 대한 반응의 조절, 세포 주기, 사멸 및 생존과 관련되어 있다(참고문헌 18 내지 21).
hESC-MSC 및 BM-MSC의 유전자 발현 프로파일의 추가 분석은 1142개 및 1134개 유전자들이 hESC-MSC 및 BM-MSC 각각에서 2.0배 초과의 수준으로 발현된다는 것을 보여주었다. 이들 중에서, 738개 및 880개 유전자들 각각이 판터 분류 유전자 목록(March 2006; http://www.pantherdb.org/)에 기재되어 있고 생물학적 과정으로 분류된다. NCBI의 호모 사피엔스 유전자 데이타베이스에 있는 23481개의 유전자들로 구성된 기준 목록과 비교할 때 유의하게 과다하게 나타났거나 과소하게 나타난(p<0.01) 생물학적 과정이 선별되었다.
BM-MSC에서 우세하게 발현된 유전자들은 대사 과정, 세포 구조, 분화 및 신호전달에 관여하는 생물학적 과정으로 분류되는 반면, 우세하게 발현된 hESC-MSC 유전자들은 증식, 분화, 면역 및 신호 전달도입에 관여하는 생물학적 과정으로 분류되었다(도 3C). 증식과 관련된 생물학적 과정에서 유전자들이 과다하게 나타났다는 것은 BM-MSC에 비해 hESC-MSC의 더 높은 증식 능력과 일치한다.
hESC-MSC 또는 BM-MSC에서 고도로 발현된 유전자들이 분화 및 신호전달의 일반적인 카테고리에서 과다하게 나타났다 하더라도, 각 카테고리 내의 특정한 생물 학적 과정은 hESC-MSC 및 BM-MSC에서 상이하게 나타났다. 예를 들면, 배아형성 및 난할과 같은 초기 배아 발달과 관련된 분화 과정은 hESC-MSC에서 과다하게 나타난 반면, 후기 배아 발달, 예를 들면, 골격 발달 및 근육 발달과 관련된 분화 과정은 BM-MSC에서 과다하게 나타난다. 유사하게, 세포외 매트릭스 단백질-매개 신호전달 및 MAPKKK 케스케이드는 BM-MSC에서 과다하게 나타났다. 또한, 이 관찰결과는 hESC-MSC 및 BM-MSC에서 분화 잠재력 및 신호전달 경로 활용이 동일하지 않을 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5. 단일 세포-유래의 MSC 집단의 단리를 위한 hESC 및 hESC -유래의 MSC에 대한 표면 마커의 구별
분화하는 hESC로부터 MSC를 용이하게 단리하기 위해, 막 단백질을 코딩하는, hESC-MSC 또는 hESC에서 고도로 발현되는 유전자에 대해 게놈-범위 유전자 발현을 검색하였다. hESC-MSC 또는 hESC에서 추정상의 막 단백질을 코딩하는 고도로 발현되는 상위 20개 유전자로 구성된 목록으로부터의 후보 유전자들을 이들의 유전자 생성물에 대한 시판되는 항체에 대해 선별하였다(하기 표 E1A 및 E1B). 후보 유전자들 중에서 hESC 유래의 MSC에서 고도로 발현되는 후보 유전자는 다음과 같다.
[표 E1A]
Figure 112008023615379-PCT00001
Figure 112008023615379-PCT00002
[표 E1B]
Figure 112008023615379-PCT00003
Figure 112008023615379-PCT00004
상기 표 E1A 및 E1B는 hESC-유래의 MSC(표 E1A) 또는 이의 모 hESC(표 E1B)에서 고도로 발현되는 표면 항원 코딩 유전자들을 보여준다. 마이크로어레이 혼성화에 의한 유전자 발현 분석에 기초하여, hESC(HuES9, H1 및 Hes3 hESC)에 비해 hESC-유래의 MSC(HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2)에서 고도로 발현되는 상위 20개 유전자(표 E1A), 및 반대로 hESC-유래의 MSC(HuES9.E1, HuES9.E3 및 H1.E2)에 비해 hESC(HuES9, H1 및 Hes3 hESC)에서 고도로 발현되는 상위 20개 유전자(표 E1B).
MSC는 성체 조직으로부터 유래한 MSC의 특징적인 표면 마커인 ENG(CD105), ITGA4(CD49d), PDGFRA, NT5E(CD73)을 고도로 발현하며(참고문헌 9 내지 11), 후보 유전자들 중에서 hESC에서 고도로 발현되는 유전자는 고도로 발현되는 hESC-특이적 유전자인 ITGB1BP3 및 PODXL(참고문헌 22)과, 그 발현이 hESC와 관련되어 있지 않은 CD24인 것으로 이미 확인되어 있다. 본 발명자들은 CD24가 hESC-MSC에 비해 hESC에서 고도로 발현된다는 것을 확인하였다(도 5A).
실시예 6. 동종성인 hESC - MSC 집단의 유도
다음으로, 본 발명자들은 hESC-MSC의 동종성을 상승시키기 위한 상기 마커들의 이용가능성을 시험하였다. 트립신으로 처리하고, 혈청 대체 배지, FGF2 및 경우 에 따라 PDGF AB로 보충된 배지 중에서 배양한 지 1주일 후, 배양물 중의 세포를 FACS로 CD105 및 CD24에 대해 분류하였다.
CD105+ 및 CD24- 세포는 상기 배양물의 ~5%를 차지하였다(도 5B). 분류된 세포를 웰 당 1개 세포의 농도로 10 x 96 웰 플레이트 상에 도말하고, 웰 당 100개 세포의 농도로 1 x 24 웰 플레이트 상에 도말하고, 웰 당 1000개 세포의 농도로 3 x 6 웰 플레이트 상에 도말하였다. 이들 중에서 웰 당 1000개 세포를 함유하는 18개의 웰 중 5개의 웰만이 MSC-유사 배양물을 발생시켰고, 이는 이 배양물들이 단일 세포로부터 발생된 것일 수 있음을 시사한다.
약 24,000개의 독특한 특징을 함유하는 일루미나 비드어레이를 사용한, 상기 5개 배양물, 즉 Q4.1 내지 Q4.5의 게놈-범위 유전자 발현 프로파일링은 상기 5개 배양물 사이에 고도의 유사성을 보여주는데, 이때 4개 세포주는 0.96의 상관계수를 가지며 남은 1개 세포주는 0.90의 상관계수를 가진다(도 5C). 본 발명자들의 연구에 있어서, 동일한 RNA 샘플을 사용하여 1개월 이상의 기간을 두고 수행한 기술적 복제물 사이의 상관계수는 통상적으로 0.97 내지 0.98이었다. 또한, Q4.1 내지 Q4.5는 HuES9.E1, H1.E2 및 huES9.E3으로 구성된 hESC-MSC, 및 BM-MSC와 각각 0.87 및 0.81의 상관계수를 가지면서 고도로 유사하였다(도 5D).
반대로, Q4.1 내지 Q4.5와 이들의 모세포주인 HuES9.E1 hESC의 상관계수는 0.55로 낮았다(도 5D). G 밴딩 및 SKY를 사용한 염색체 분석은 무작위로 선택된 Q4.3 배양물에 대해 수행되었다. Q4.3은 이의 모세포주인 HuES9 hESC로부터 유래한 9번 염색체 역위를 가진 정상적인 핵형을 가졌다(도 5E)(참고문헌 6). 이 관찰결과 는 고도로 동종성을 갖는 MSC 배양물이 bFGF2 및 경우에 따라 PDGF BB로 보충된 배지 중에서 1주일 동안 증식된 후 트립신으로 처리된 hESC 배양물로부터 CD105+ 및 CD24- 세포를 분류함으로써 발생될 수 있다는 것을 보여준다.
양성 및 음성 선별 마커를 이 유도 프로토콜에 도입함으로써 서로 거의 동일한 게놈-범위 발현 프로파일을 가진 5개의 단일클론 단리물을 유도하였고 선별 또는 분류 기준의 특이성을 확인하였다. 상기 5개의 단리물 사이의 전반적인 쌍 유전자 발현 비교는 동일한 RNA 샘플을 사용한 기술적 복제물에 대해 관찰된 유전자 발현 프로파일에 필적할만한 거의 동일한 유전자 발현 프로파일을 보여주었다.
실시예 7 내지 15는 인간 ESC-유래의 MSC(hESC-MSC)의 프로테옴을 분석하기 위한 실험을 기술한 것이다. 이 실험에서, 임상적으로 적합한 프로토콜을 사용하여 분석된 인간 ESC-유래의 MSC(hESC-MSC)로 무혈청 합성 배양 배지를 컨디셔닝하였다. 이 조건 배지를 다차원적 단백질 동종 기술(MuDPIT) 및 사이토카인 항체 어레이 분석으로 분석하여, 201개의 유니크 유전자 생성물의 존재를 확인하였다.
이 유전자 생성물들의 86 내지 88%가 마이크로어레이 또는 qRT-PCR 분석에 의해 검출가능한 전사체 수준을 가졌다. 컴퓨터 분석은 이 유전자 생성물들이 하기 3가지 주요 생물학적 과정 군을 유의하게 유도할 것임을 예측한다: 대사, 방어 반응, 및 혈관형성, 조혈 및 골격 발달을 비롯한 조직 분화. 또한, 상기 분석은 상기 201개의 유전자 생성물이 심혈관 생물학, 골 발달 및 조혈에서 중요한 신호전달 경로 예컨대, Jak-STAT, MAPK, Toll-유사 수용체, TGF-베타 신호전달 및 mTOR 신호전달 경로를 활성화시킨다는 것을 예측한다.
실시예 7. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴 분석:
재료 및 방법
조건 배지의 제조
HuES9.E1 세포를 전술한 바와 같이 배양하였다. 80% 전면생장 HuES9.E1 세포 배양물을 PBS로 3회 세척하고, ITS(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5 ng/㎖ FGF2(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5 ng/㎖ PDGF AB(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-머캡토에탄올로 보충된 페놀 레드 무함유 DEME 배지로 구성된 합성 배지 중에서 밤새 배양하였다. 이어서, 배양물을 PBS로 3회 린싱한 후, 새로운 합성 배지로 교체하였다. 3일 후, 상기 배지를 수거하고, 500 x g에서 원심분리하고, 상청액을 0.2 μ 필터로 여과하였다. LC MS/MS 분석을 위해, 조건 배지를 3500의 MW 컷오프를 가진 투석 카세트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 내에 넣고, 10 부피 0.9% NaCl의 3회 교환에 대하여 투석한 다음, 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 농축 용액을 사용하여 20배 농축시키고, 이어서 100 부피 0.9% NaCl의 10회 교환에 대하여 투석한 후, 0.2 μ 필터로 여과하였다. 컨디셔닝되지 않은 동일 부피의 배지를 투석하고 조건 배지와 동시에 농축하였다.
사이토카인 항체 블롯 분석
조건 배지 또는 비조건 배지 1 ㎖를, 제조자의 지시(RayBio Norcross, GA)에 따라 RayBio® 사이토카인 항체 어레이를 사용하여 사이토카인 및 다른 단백질들의 존재에 대해 분석하였다.
LC MS / MS 분석
투석된 조건 배지(CM) 또는 비조건 배지(NCM) 2 ㎖ 중의 단백질을 공지된 바와 같이 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 분해하였다(Washburn, 2001 #2997). 이어서, 분해된 혼합물을 조건화된 Sep-Pak C-18 SPE 카트리지(Waters, Milford, MA, USA)에 통과시켜 샘플을 탈염시키고, 3% 아세토니트릴(ACN)(JT Baker, Phillipsburg, NJ) 및 0.1% 포름산(FA) 완충제로 2회 세척하고, 70% ACN 및 0.1% FA 완충제로 용출하였다. 그 다음, 용출된 샘플을 이의 최초 부피의 약 10%까지 스피드백(speedvac)으로 탈수키고, 0.1% 포름산으로 50 ㎕로 조절하였다. LC-MS/MS 분석 전에 샘플을 4℃에 보관하였다.
탈염된 펩티드 혼합물을 LC-MS/MS 시스템을 갖춘 MudPIT(LTQ, ThermoFinnign, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. 샘플을 강한 양이온 교환(SCX) 컬럼(Biobasic SCX, 5 ㎛, Thermo Electron, San Jose, USA)에 로딩하고, 50 ㎕의 완충제(5% ACN 및 0.1% FA 중의 0, 2, 5, 10, 100 및 1000 mM의 염화암모늄)를 연속적으로 사용한 6개의 염 단계로 분획화하였다. SCX 컬럼으로부터 용출된 펩티드를 농축하고 조박스(Zorbax) 펩티드 트랩(Agilent, Pola Alto, CA, USA) 중에서 탈염시켰다. 피코-프릿 나노스프레이 팁(pico-frit nanospray tip)(New Objective, Wubrun, MA, USA) 내로 직접 로딩된, 200 nℓ/분의 유속에서 작동하는 홈-팩킹 나노보레드 C18 컬럼(75 ㎛, i.d x 10 cm, 5 μm 입자)을 사용하여 120분 구배로 2차원적 크로마토그래피 분리를 수행하였다.
LTQ는 각각의 MS 스캔으로부터의 가장 강한 피크들 중 3개의 피크에 대한 MS/MS 스캔을 수행함으로써 데이타-의존적 모드로 작동되었다. 각각의 실험에 있어서, 6개의 염 단계의 ms/ms(dta) 스펙트럼은 사내-기록(home-wrriten) 프로그램에 의해 단일 마스코트 일반 파일로 조합되었다. 단백질 확인은 사내 마스코트 서버를 통해 IPI 인간 단백질 데이타베이스에 대해 조합된 데이타를 검색함으로써 달성되었다. 검색 파라미터는 트립신을 사용한 2회 실패 절단의 최대치이었고, 고정된 변형은 카르브아미노메틸화이었으며, 변동가능한 변형은 메티오닌 및 단백질 N-말단 아세틸화의 산화이었다. 펩티드 전구세포 및 단편 이온 각각에 대한 질량 내성은 2.0 및 0.8 Da로 설정되었다. 단백질 확인은 2가지 상이한 펩티드가 스코어 50 이상에서 발견되는 경우 진정한 양성으로 인정되었다. 많은 성장 인자 및 사이토카인이 작은 단백질/펩티드이고 소량으로 분비되기 때문에, 상응하는 MS/MS 스펙트럼은 약할 것이고, 단백질 당 1개의 펩티드만이 확인될 것이다. 마스코트 스코어가 20 내지 50인 펩티드의 경우, MS/MS 스펙트럼의 수동 검증이 수행되었다.
생물정보학( Bioinformatics )
검증된 단백질은 컨디셔닝되지 않은 배지에서 확인된 배경 단백질들을 제거함으로써 모았다. 그 후, 각 단백질의 IPI 식별자를 단백질 상호-기준표를 사용하여 유전자 기호로 전환시켰다. 유전자 생성물을 진스프링(GeneSpring) GX7.3 발현 분석기(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 상에서 GO(Gene Ontology) 분류 시스템의 다양한 생물학적 과정 또는 경로로 분류한 후, 각각의 과정 또는 경로에서의 유전자의 빈도를 진뱅크 인간 게놈 데이타베이스에서의 유전자 빈도와 비교한 경우, 유의하게 더 높은 유전자 빈도(p<0.05)를 가진 과정 또는 경로는 MSC의 분비에 의해 유의하게 조절된다고 추정되었다.
qRT - PCR
제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 트라이졸 시약(Gibco-BRL)을 사용하여 HuES9.E1 세포로부터 추출하고 스핀 컬럼(Nucleospin RNA II System, Macherey-Nagel GmbH & Co., Duren, Germany) 상에서 정제하였다. 고성능 cDNA 어치브 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 1 ㎍의 전체 RNA를 50 ㎕ 반응 부피 중에서 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. cDNA를 증류수로 100 ㎕의 부피까지 희석하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 경로-특이적 RT2 프로파일러(Profiler) PCR 어레이(SuperArray, Frederick, USA)에서 각각의 프라이머에 대해 1 ㎕의 cDNA를 사용하였다. 이 분석에 사용된 플레이트는 다음과 같다: 케모카인 & 수용체 PCR 어레이(카달로그 번호 APH-022), NFκB 신호전달 경로 PCR 어레이(카달로그 번호 APH-025), 염증성 사이토카인 & 수용체 PCR 어레이(카달로그 번호 APH-011), 공통된 사이토카인 PCR 어레이(카달로그 번호 APH-021), 및 JAK/STAT 신호전달 경로 PCR 어레이(카달로그 번호 APH-039).
실시예 8. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴의 분석:
조건 배지( CM ) 및 비조건 배지( NCM )의 제조
조건 배지가 혈청 대체 배지와 같은 배지 보충물에 의해 오염되는 것을 최소화하기 위해, HuES9.E1 MSC를 약 80% 전면생장까지 생장시키고, PBS로 3회 세척하 고, ITS(인슐린, 트랜스페린 및 셀로노단백질), 5 ng/㎖ FGF2, 5 ng/㎖ PDGF AB, 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-머캡토에탄올로 보충된 DMEM으로 구성된 합성 배지 중에서 밤새 항온처리하였다. HuES9.E1 MSC는 1주일 이상 동안 상기 최소 배지 중에서 증식할 수 있었다. 다음날, 세포 배양물을 PBS로 3회 다시 세척하고, 새로운 합성 배지와 함께 항온처리하였다.
상기 배지를 3일간의 컨디셔닝 후 모았다. 조건 배지(CM)는 항상 동등한 부피의 컨디셔닝되지 않은 배지(NCM)와 동시에 분석되거나 처리되었다. LC MS/MS 분석의 경우, 배지는 상기 재료 및 방법 단락에서 기재한 바와 같이 0.9% 식염수에 대한 광범위한 투석 전에 ~10x로 농축되었다. 농축된 CM 및 NCM의 평균 단백질 농도는 각각 98.0 ± 17.9 ㎍/㎖ 및 41.6 ± 1.2 ㎍/㎖이었다(n=3). MSC에 의한 배지의 컨디셔닝은 단백질 겔 상에서 상기 배지의 분취액을 런닝시킴으로써 모니터링하였다. 배지의 단백질 조성은 시간 경과에 따라 점점 더 복잡해졌다(도 6). CM은 NCM보다 더 복잡한 단백질 조성을 가졌다.
실시예 9. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴의 분석:
LC MS / MS 및 항체 어레이에 의한 MSC 조건 배지의 분석
LC MS/MS 분석은 독립적으로 제조된 2개의 CM 회분에는 존재하나 유사하게 처리된 NCM에는 존재하지 않는 250개의 단백질을 확인시켜주었다. 이들은 다음과 같다:
1. IPI00021428 액틴, 알파 골격근; 2. IPI00414057 액틴 알파 1 골격근 단백질; 3. IPI00008603 액틴, 대동맥 평활근; 4. IPI00021439 액틴, 세포질 1; 5. IPI00023006 액틴, 알파 심장; 6. IPI00021440 액틴, 세포질 2; 7. IPI00025416 액틴, 감마-장 평활근; 8. IPI00479925 아그린; 9. IPI00015102 CD166 항원 전구체; 10. IPI00007423 산성 류신-풍부 핵 인단백질 32 족 구성원 B; 11. IPI00413331 36 kDa 단백질; 12. IPI00412577 34 kDa 단백질; 13. IPI00413506 33 kDa 단백질; 14. IPI00418169 가상 단백질 DKFZp686P03159; 15. IPI00003815 Rho GDP-분리 억제제 1; 16. IPI00004656 베타-2-마이크로글로불린 전구체; 17. IPI00218042 골 형태형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 이소폼 BMP1-5; 18. IPI00009054 골 형태형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 이소폼 BMP1-3; 19. IPI00014021 골 형태형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 이소폼 BMP1-1; 20. IPI00218040 골 형태형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 이소폼 BMP1-4; 21. IPI00006980 단백질 C14orf166; 22. IPI00296165 보체 C1r 하위성분 전구체; 23. IPI00152540 OTTHUMP00000016748; 24. IPI00305064 CD44 항원 전구체의 스플라이스 이소폼 CD44; 25. IPI00297160 가상 단백질 DKFZp451K1918; 26. IPI00293539 캐드린-11 전구체의 스플라이스 이소폼 2; 27. IPI00304227 캐드린-11 전구체의 스플라이스 이소폼 1; 28. IPI00386476 캐드린 11, 타입 2, 이소폼 1 전구단백질; 29. IPI00024046 캐드린-13 전구체;
30. IPI00290085 신경-캐드린 전구체; 31. IPI00029739 보체 인자 H 전구체의 스플라이스 이소폼 1; 32. IPI00012011 코필린, 비-근육 이소폼; 33. IPI00007257 칼신테닌 1 이소폼 2; 34. IPI00218539 콜라겐 알파-1(XI) 쇄 전구체의 스플라이스 이소폼 B; 35. IPI00477350 콜라겐, 타입 XI, 알파 1; 36. IPI00329573 콜라겐 알파-1(XII) 쇄 전구체의 긴 스플라이스 이소폼; 37. IPI00221384 콜라겐 알파-1(XII) 쇄 전구체의 짧은 스플라이스 이소폼; 38. IPI00400935 콜라겐 알파-1(XVI) 쇄 전구체; 39. IPI00297646 콜라겐 알파-1(1) 쇄 전구체; 40. IPI00164755 전구-알파2(I) 콜라겐 전구체; 41. IPI00304962 콜라겐 알파-2(I) 쇄 전구체; 42. IPI00021033 콜라겐 알파-1(III) 쇄 전구체; 43. IPI00167087 COL3A1 단백질; 44. IPI00021034 콜라겐 알파-1(IV) 쇄 전구체; 45. IPI00479324 알파 2 타입 IV 콜라겐 전구단백질; 46. IPI00306322 콜라겐 알파-2(IV) 쇄 전구체; 47. IPI00303313 콜라겐 알파-1(V) 쇄 전구체; 48. IPI00477611 184 kDa 단백질; 49. IPI00293881 COL5A2 단백질; 50. IPIOOO18279 콜라겐 알파-3(V) 쇄 전구체; 51. IPI00291136 콜라겐 알파-1(VI) 쇄 전구체; 52. IPI00304840 콜라겐 알파-2(VI) 쇄 전구체의 스플라이스 이소폼 2C2; 53. IPI00220613 콜라겐 알파-2(VI) 쇄 전구체의 스플라이스 이소폼 2C2A; 54. IPI00022200 알파 3 타입 VI 콜라겐 이소폼 1 전구체; 55. IPI00072918 알파 3 타입 VI 콜라겐 이소폼 4 전구체; 56. IPI00220701 콜라겐 알파-3(VI) 쇄 전구체의 스플라이스 이소폼 2; 57. IPI00072917 알파 3 타입 VI 콜라겐 이소폼 3 전구체; 58. IPI00021828 시스타틴 B; 59. IPI00007778 디-N-아세틸키토비아제 전구체; 60. IPI00295741 카셉신 B 전구체;
61. IPI00299219 단백질 CYR61 전구체; 62. IPI00514900 42 kDa 단백질; 63. IPI00333770 세포질분열의 기여자인 단백질 10과 유사함; 64. IPI00478332 세포질분열의 기여자인 단백질 9와 유사함; 65. IPI00000875 연신 인자 1-감마; 66. IPI00465248 알파-에놀라제; 67. IPI00013769 알파-에놀라제, 폐 특이적임; 68. IPI00216171 감마-에놀라제; 69. IPI00218803 피불린(Fibulin)-1 전구체의 스플라이스 이소폼 B; 70. IPI00296537 피불린-1 전구체의 스플라이스 이소폼 C; 71. IPI00328113 피브릴린-1 전구체; 72. IPI00019439 피브릴린-2 전구체; 73. IPI00385645 섬유모세포 성장 인자 17 전구체의 스플라이스 이소폼 2; 74. IPI00216602 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 전구체의 스플라이스 이소폼 5; 75. IPI00216604 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 전구체의 스플라이스 이소폼 8; 76. IPI00034099 가상 단백질 FLJ21918; 77. IPI00333541 필라민(Filamin)-A; 78. IPI00302592 필라민 A, 알파; 79. IPI00339227 가상 단백질 DKFZp686O1166; 80. IPI00414283 피브로넥틴 전구체(FN)(저온-불용성 글로불린)(CIG)의 스플라이스 이소폼 3; 81. IPI00339225 피브로넥틴 전구체의 스플라이스 이소폼 5; 82. IPI00339319 피브로넥틴 전구체의 스플라이스 이소폼 11; 83. IPI00556632 피브로넥틴 전구체의 스플라이스 이소폼 12; 84. IPI00411462 가상 단백질 DKFZp686B 18150; 85. IPI00029723 폴리스타틴(Follistatin)-관련 단백질 1 전구체; 86. IPI00005401 폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 5; 87. IPI00219025 글루타레독신(Glutaredoxin)-1; 88. IPI00171411 골기 인단백질 2; 89. IPI00026314 겔솔린(Gelsolin) 전구체;
90. IPI00219757 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P; 91. IPI00027569 이종 핵 리보핵산단백질 C-유사 1; 92. IPI00003881 HNRPF 단백질; 93. IPI00442294 뉴로트리민 전구체의 스플라이스 이소폼 1; 94. IPI00003865 열충격 동족체 71 kDa 단백질의 스플라이스 이소폼 1; 95. IPI00037070 열충격 동족체 71 kDa 단백질의 스플라 이스 이소폼 2; 96. IPI00220362 10 kDa 열충격 단백질, 미토콘드리아; 97. IPI00024284 기저막-특이적 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 전구체; 98. IPI00297284 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 전구체; 99. IPI00297284 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 전구체; 100. IPI00029236 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 전구체; 101. IPI00029236 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 전구체; 102. IPI00029235 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6 전구체; 103. IPI00029235 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6 전구체; 104. IPI00016915 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 7 전구체; 105. IPI00016915 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 7 전구체; 106. IPI00328163 K-알파-1 단백질; 107. IPI00021396 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 전구체; 108. IPI00298281 라미닌 감마-1 쇄 전구체; 109. IPI00219219 갈렉틴(Galectin)-1; 110. IPI00023673 갈렉틴-3 결합 단백질 전구체; 111. IPI00021405 라민-A/C의 스플라이스 이소폼 A; 112. IPI00216953 라민-A/C의 스플라이스 이소폼 ADelta1O; 113. IPIOO180173 추정됨: 트로포미요신 4와 유사함; 114. IPI00401614 추정됨: FKSG30과 유사함; 115. IPI00374397 추정됨: 트로포미요신 4와 유사함; 116. IPI00374732 추정됨: PPIA 단백질과 유사함; 117. IPI00402104 추정됨: 펩티딜프롤릴 이소머라제 A 이소폼 1과 유사함; 시클로필린 A; 펩티딜-프로; 118. IPI00455415 추정됨: 불균일 핵 리보핵산단백질 C-유사 dJ845O24.4와 유사함; 119. IPI00454722 추정됨: 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질과 유사함; 120. IPI00454852 추정됨: 기형암종-유래의 성장 인자 1과 유사함;
121. IPI00002802 단백질-라이신 6-옥시다제 전구체; 122. IPI00410152 잠복 형질전환 성장 인자 베타 결합 단백질 1 이소폼 LTBP-1L; 123. IPI00220249 잠복 형질전환 성장 인자 베타 결합 단백질, 이소폼 1L 전구체; 124. IPI00220249 잠복 형질전환 성장 인자 베타 결합 단백질 이소폼 1L 전구체; 125. IPI00410152 잠복 형질전환 성장 인자 베타 결합 단백질 1 이소폼 LTBP-1L; 126. IPI00020986 루미칸 전구체; 127. IPI00291006 말레이트 데히드로게나제, 미토콘드리아 전구체; 128. IPI00005707 마크로파지 만노스 수용체 2 전구체; 129. IPI00020501 미요신-11; 130. IPIOOO19502 미요신-9; 131. IPI00604620 뉴클레올린(Nucleolin); 132. IPI00220740 뉴클레오포스민의 스플라이스 이소폼 2; 133. IPI00219446 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질; 134. IPI00299738 전구콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 1 전구체; 135. IPI00015902 베타 혈소판-유래의 성장 인자 수용체 전구체; 136. IPI00216691 프로필린(Profilin)-1; 137. IPI00169383 포스포글리세레이트 키나제 1; 138. IPI00219568 포스포글리세레이트 키나제, 정소 특이적; 139. IPI00296180 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성화제 전구체; 140. IPI00215943 플렉틴(Plectin) 1의 스플라이스 이소폼 3; 141. IPI00215942 플렉틴 1의 스플라이스 이소폼 2; 142. IPI00014898 플렉틴 1의 스플라이스 이소폼 1; 143. IPI00398777 플렉틴 1 이소폼 8; 144. IPI00398776 플렉틴 1 이소폼 7; 145. IPI00186711 플렉틴 1 이소폼 6; 146. IPI00420096 플렉틴 1 이소폼 3; 147. IPI00398779 플렉틴 1 이소폼 11; 148. IPI00398778 플렉틴 1 이소폼 10; 149. IPI00398002 플렉틴 1 이소폼 1; 150. IPI00419585 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 A;
151. IPI00472718 펩티딜프롤릴 이소머라제 A 이소폼 2; 152. IPI00000874 퍼록시레독신-1; 153. IPI00024915 퍼록시레독신-5, 미토콘드리아 전구체; 154. IPI00375306 퍼록시레독신 5 전구체, 이소폼 b; 155. IPI00012503 전구활성화제 폴리펩티드 전구체의 스플라이스 이소폼 Sap-mu-0; 156. IPI00374179 프로테아좀 활성화제 서브유니트 1 이소폼 2; 157. IPI00030154 프로테아좀 활성화제 복합체 서브유니트 1; 158. IPI00168812 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 이소폼 d 전구체; 159. IPI00419941 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 이소폼 a 전구체; 160. IPI00003590 퀴에신(Quiescin) Q6, 이소폼 a; 161. IPI00015916 골-유래의 성장 인자(단편); 162. IPI00015916 골-유래의 성장 인자; 163. IPI00298289 레티큘론(Reticulon)-4의 스플라이스 이소폼 2; 164. IPI00021766 레티큘론-4의 스플라이스 이소폼 1; 165. IPI00013895 칼기자린(Calgizzarin); 166. IPI00010402 가상 단백질; 167. IPI00218733 수퍼록사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase); 168. IPI00014572 SPARC 전구체; 169. IPI00005614 스펙트린(Spectrin) 베타 쇄의 긴 스플라이스 이소폼, 뇌 1; 170. IPI00008780 스탄니오칼신(Stanniocalcin)-2 전구체; 171. IPI00301288 SEL-OB 단백질; 172. IPI00216138 트랜스겔린; 173. IPIOOO 18219 형질전환 성장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3 전구체; 174. IPI00304865 형질전환 성장 인자, 베타 수용체 III; 175. IPI00296099 트롬보스판딘(Thrombospondin)-1 전구체; 176. IPI00032292 메탈로프로테이나제 억제제 1 전구체; 177. IPI00027166 메탈로프로테이나제 억제제 2 전구체; 178. IPI00220828 티모신(Thymosin) 베타-4; 179. IPI00180240 티모신-유사 3;
180. IPI00299633 OTTHUMP00000031270(단편); 181. IPI00465028 트리오세포 스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase) 1 변이체(단편); 182. IPI00451401 트리오세포스페이트 이소머라제의 스플라이스 이소폼 2; 183. IPIOOO 10779 트로포미요신(Tropomyosin) 4; 184. IPI00216975 트로포미요신 알파-4 쇄의 스플라이스 이소폼 2; 185. IPIOO180675 튜불린 알파-3 쇄; 186. IPI00218343 튜불린 알파-6 쇄; 187. IPI00216298 티오레독신(Thioredoxin); 188. IPI00472175 CDNA FLJ46672 fis, 클론 TRACH3009008, 티오레독신 리덕타제와 매우 유사함; 189. IPI00450472 유비퀴틴(Ubiquitin)-접합 효소 E2I; 190. IPI00018352 유비퀴틴 카르복실-말단 히드롤라제 이소자임 L1; 191. IPI00010207 유비퀴틴-폴드 변형제 1 전구체; 192. IPI00260630 URB; 193. IPI00021263 14-3-3 단백질 제타/델타; 194. IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686F10164; 195. IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; 196. IPI00719088 콜라겐, 타입 VI, 알파 1 전구체; 197. IPI00654685 SPARC 전구체와 유사함; 198. IPI00641961 콜라겐, 타입 XII, 알파 1; 199. IPI00645849 세포외 매트릭스 단백질 1; 200. IPI00554786 티오레독신 리덕타제 1; 201. IPI00645018 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제; 202. IPI00552339 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제; 203. IPI00642997 액틴, 세포질 2; 204. IPI00719778 아넥신(Annexin) A2와 유사함; 205. IPI00647915 트랜스겔린(Transgelin) 2; 206. IPI00552815 콜라겐, 타입 V, 알파 1; 207. IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, 클론 NT2RP3003649, 호모 사피엔스 피불린-1D mRNA와 매우 유사함; 208. IPI00180776 29 kDa 단백질; 209. IPI00552416 필라민 A, 알파;
210. IPI00640698 액틴, 감마-장 평활근; 211. IPI00514530 액틴, 알파 1, 골격근; 212. IPI00556442 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 변이체(단편); 213. IPI00513782 겔솔린; 214. IPI00478731 29 kDa 단백질; 215. IPI00396479 24 kDa 단백질; 216. IPI00334627 39 kDa 단백질; 217. IPI00555762 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 이소폼 변이체(단편); 218. IPI00658202 97 kDa 단백질; 219. IPI00006273 CYR61 단백질; 220. IPI00719405 TMSL6 단백질; 221. IPI00658096 티모신 베타-4; 222. IPI00376163 5 kDa 단백질; 223. IPI00556217 피브릴린 1 변이체(단편); 224. IPI00514817 라민 A/C와 유사함; 225. IPI00644087 프로게린; 226. IPI00655812 횡문근육종 항원 MU-RMS-40.12; 227. IPI00604517 뉴클레올린과 유사함; 228. IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 뉴클레올린과 매우 유사함; 229. IPI00412473 단백질; 230. IPI00414489 단백질; 231. IPI00411463 단백질; 232. IPI00556415 트랜스겔린 변이체(단편); 233. IPI00718825 칼모듈린; 234. IPI00478156 17 kDa 단백질; 235. IPI00386621 CALM3 단백질; 236. IPI00647001 산성; 237. IPI00642650 스탄니오칼신 2 전구체와 유사함; 238. IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; 239. IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부 단백질 유사 3; 240. IPI00719422 트리오세포스페이트 이소머라제(단편); 241. IPI00003734 추정상의 S100 칼슘-결합 단백질 H_NHO456N16.1; 242. IPI00029574 11 kDa 단백질; 243. IPI00641047 겔솔린; 244. IPI00647556 겔솔린; 245. IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 이소폼 1; 246. IPI00647572 딕콥프(Dickkopf) 관련 단백질-3 전구체; 247. IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA와 유사함; 248. IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 기여자와 유사함; 249. IPI00555993 혈관 내피 성장 인자 수용체 3 변이체; 250. IPI00552545 세포질분열 단백질 8의 기여자.
더불어, 이 250개 단백질들은 공지된 하기 132개 유니크 유전자들에 의해 코딩된다: ACTA1; COL5A2; HSPA8; PSAP; ACTA2; COL5A3; HSPE1; PSME1; ACTB; COL6A1; HSPG2; PTK7; ACTC; COL6A2; IGFBP2; QSCN6; ACTG1; COL6A3; IGFBP5; RTN4; ACTG2; CSTB; IGFBP6; S1OOA11; AGRN; CTBS; IGFBP7; SH3BGRL3; ALCAM; CTSB; K-알파-I; SOD1; ANP32B; CYR61; KDR; SPARC; ANXA2; DOCK1O; LAMC1; SPTBN1; ARHGDIA; DOCK8; LGALS1; STC2; B2M; ECM1; LGALS3BP; SVEP1; BMP1; EEF1G; LMNA; TAGLN; C14orf166; ENO1; LOX; TAGLN2; C1R; ENO1B; LTBP1; TGFBI; CALM1; ENO2; LUM; TGFBR3; CD109; FBLN1; MDH2; THBS1; CD44; FBNl; MRC2; TIMP1; CDH11; FBN2; MYH11; TIMP2; CDH13; FGF17; MYH9; TMSB4X; CDH2; FGFR2; NCL; TMSL3; CFH/HF1; FLJ21918; NPM1; TMSL6; CFL1; FLNA; PBP; TPI1; CLSTN1; FN1; PCOLCE; TPM4; COL11A1; FSTL1; PDGFRB; TUBA3; COL12A1; GALNT5; PFN1; TUBA6; COL16A1; GLRX; PGK1; TXN; COL1A1; GOLPH2; PGK2; TXNRD1; COL1A2; GSN; PLAU; UBE2I; COL3A1; GSTP1; PLEC1; UCHL1; COL4A1; HNRPCL1; PPIA; UFM1; COL4A2; HNRPF; PRDX1; URB; COL5A1; HNT; PRDX5; 및 YWHAZ.
다음과 같은 공지되지 않은 32개 단백질이 있다: IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686F10164; IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; IPI00654685 SPARC 전구체와 유사함; IPI00719778 아넥신 A2와 유사함; IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, 클론 NT2RP3003649, 호모 사피엔스 피불린-1D mRNA와 매우 유사함; IPIOO180776 29 kDa 단백질; IPI00478731 29 kDa 단백질; IPI00396479 24 kDa 단백질; IPI00334627 39 kDa 단백질; IPI00658202 97 kDa 단백질; IPI00376163 5 kDa 단백질; IPI00514817 라민 A/C와 유사함; IPI00644087 프로게린; IPI00655812 횡문근육종 항원 MU-RMS-40.12; IPI00604517 뉴클레올린과 유사함; IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 뉴클레올린과 매우 유사함; IPI00412473 단백질; IPI00414489 단백질; IPI00411463 단백질; IPI00478156 17 kDa 단백질; IPI00386621 CALM3 단백질; IPI00647001 산성; IPI00642650 스탄니오칼신 2 전구체와 유사함; IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부 단백질 유사 3; IPI00003734 추정상의 S1OO 칼슘-결합 단백질 H_NH0456N16.1; IPI00029574 11 kDa 단백질; IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 이소폼 1; IPI00647572 딕콥프 관련 단백질-3 전구체; IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA와 유사함; IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 기여자와 유사함; 및 IPI00555993 혈관 내피 성장 인자 수용체 3 변이체.
그러므로, 본 명세서에 기재된 MSC는 이 단백질들 중 임의의 단백질 또는 이 단백질들 전부, 또는 이들에 의해 분비되거나 발현되는 임의의 단백질들 또는 다른 분자들의 공급원으로서 사용될 수 있다.
MSC가 근처에 있는 세포에 영향을 주는 광범위한 사이토카인 및 성장 인자들을 분비하는 것은 밝혀져 있다(참고문헌 8). 이 인자들 중 대다수가 숏-건(shot-gun) LC MS/MS 분석 과정에서 용이하게 검출될 수 없는 소분자들이다. 따라서, CM 및 NCM은 101개의 사이토카인/성장 인자들에 대한 항체를 보유하는 5개의 상이한 항체 어레이에의 혼성화에 의해서도 분석되었다(도 7 참조).
항체 어레이의 레이아웃
RayBio® 혈관신생 어레이 I
Figure 112008023615379-PCT00005
RayBio® 인간 케모카인 항체 어레이 I
Figure 112008023615379-PCT00006
RayBio® 매트릭스 메탈로프로테이나제 항체 어레이 I
Figure 112008023615379-PCT00007
RayBio® 인간 사이토카인 항체 어레이 I
Figure 112008023615379-PCT00008
RayBio® 인간 사이토카인 항체 어레이 V
Figure 112008023615379-PCT00009
상기 사이토카인/성장 인자들 중 72개가 독립적으로 제조된 4개의 CM 중 적어도 3개에서 HuES9.E1 MSC에 의해 재현가능하게 분비되나, NCM에서는 그러하지 않다는 것이 발견되었다. 항체 어레이(Name GeneSymbol GeneID)에 의해 확인된 72개의 단백질은 다음과 같다: 1. MDC ADAM11 GI_11496997-A; 2. 안지오제닌 ANG GI_42716312-S; 3. BDNF BDNF GI_34106709-A; 4. I-309 CCL1 GI_4506832-S; 5. 에오탁신(Eotaxin) CCL11 GI_22538399; 6. MIP-1δ CCL15 GI_34335180-A; 7. HCC-4 CCL16 GI_22538800; 8. MCP-1 CCL2 GI_22538812-S; 9. Ckβ8-1 CCL23 GI_22538807-A; 10. 에오탁신-2 CCL24 GI_22165426-S; 11. 에오탁신-3 CCL26 GI_22547151-S; 12. RANTES CCL5 GI_22538813; 13. MCP-3 CCL7 GI_13435401-S; 14. MCP-2 CCL8 GI_22538815-S; 15. MCSF CSF1 GI_27262666-I; 16. GM-CSF CSF2 GI_27437029-S; 17. GCSF CSF3 GI_27437048; 18. 프랙탈킨(Fractalkine) CX3CL1 GI_4506856-S; 19. GRO-a CXCL1 GI_4504152-S; 20. I-TAC CXCL11 GI_14790145-S; 21. SDF-1 CXCL12 GI_40316923; 22. BLC CXCL13 GI_5453576-S; 23. ENA-78 CXCL5 GI_41872613-S; 24. IP-10 CXCR3 GI_4504098-S; 25. EGF EGF GI_6031163-S; 26. FGF-4 FGF4 GI_4503700; 27. FGF-6 FGF6 GI_10337586; 28. FGF-7 FGF7 GI_15147344; 29. FGF-9 FGF9 GI_4503706-S; 30. Fit 3 리간드 FLT3LG GI_38455415-S; 31. GDNF GDNF GI_40549410; 32. GCP-2 G0LGA4 GI_45359854-S; 33. HGF HGF GI_33859834-S; 34. IFN-γ IFNG GI_10835170-S; 35. IGF-I IGF1 GI_19923111-S; 36. IGFBP-1 IGFBP1 GI_4504614-S; 37. IGFBP-2 IGFBP2 GI_10835156-S; 38. IGFBP-4 IGFBP4 GI_10835020-S; 39. IL-1O ILlO GI_24430216-S; 40. IL-12p40p70 IL12B GI_24497437-S; 41. IL-13 IL13 GI_26787977-S; 42. IL-16 IL16 GI_27262654-A; 43. IL-1a IL1A GI_27894329-S; 44. IL-1β IL1B GI_27894305-S; 45. IL-2 IL2 GI_28178860-S; 46. IL-3 IL3 GI_28416914-S; 47. IL-6 IL6 GI_10834983-S; 48. IL-7 IL7 GI_28610152-S; 49. IL-8 IL8 GI_28610153-S; 50. SCF KITLG GI_4580419-A; 51. LEPTIN LEP GI_4557714-S; 52. LIF LIF GI_6006018-S; 53. MIF MIF GI_4505184-S; 54. MMP-1 MMP1 GI_13027798-S; 55. MMP-1O MMP1O GI_4505204-S; 56. MMP-13 MMP13 GI_13027796-S; 57. MMP3 MMP3 GI_13027803-S; 58. MMP-9 MMP9 GI_4826835-S; 59. PARC PARC GI 24307990; 60. PDGF-BB PDGFB GI_15451785-A; 61. PIGF PIGF GI_27894289-A; 62. TGF-β1 TGFB1 GI_10863872; 63. TGF-β2 TGFB2 GI_4507462-S; 64. 트롬보포이에틴 THPO GI_40805871-S; 65. TIMP-1 TIMP1 GI_4507508-S; 66. TIMP-2 TIMP2 GI_9257247-S; 67. TIMP-3 TIMP3 GI_21536431-S; 68. TIMP-4 TIMP4 GI_4507514-S; 69. TNF-α TNF GI_25952110; 70. 오스테오프로테 게린 TNFRSF11B GI_22547122-S; 71. VEGF VEGF GI_30172563-S; 및 72. 림포택틴 XCL1 GI_4506852-S.
다음과 같은 29개의 단백질은 항체 어레이(Name GeneSymbol GeneID)에 의해 검출되지 않았다: bFGF CCL23 GI_22538807-A; MCP-4 CCL13 GI_22538799-S; TARC CCL17 GI_22538801-S; MIP-3b CCL19 GI_22165424-S; MIP-3a CCL20 GI_4759075-S; MPIF-1 CCL23 GI_22538807-A; TECK CCL25 GI_22538797-A; CTACK CCL27 GI_22165428-S; CCL28 CCL28 GI_22538810-A; MIP-1b CCL4 GI_4506844-S; SDF-1a CXCL12 GI_40316923-I; SDF-1b CXCL12 GI_40316923-I; CXCL16 CXCL16 GI_11545764-S; MIG CXCL9 GI_4505186-S; MIP-1a CXCR6 GI_5730105-S; IGFBP-3 IGFBP3 GI_19923 11O-S; IL-15 IL15 GI_26787979-A; IL-4 IL4 GI_27477091-A; IL-5 IL5 GI_28559032-S; TNF-b LTA GI_6806892-S; MMP-2 MMP2 GI_11342665-S; MMP-8 MMP8 GI_4505220-S; NAP-2 NAP1L4 GI_21327711-S; NT-3 NTF3 GI_45359869-S; NT-4 NTF5 GI_34328933-S; 온코스타틴(Oncostatin) M OSM GI_28178862-S; TGF-b1 TGFB1 GI_10863872-S; LIGHT TNFSF14 GI_25952146-A; 및 VEGF-D VEGFD GI_19924297-S.
그러나, 3개의 유전자 생성물, 즉 IGFBP2, TIMP1 및 TIMP2만이 LC MS/MS 분석에 의해서도 검출되었는데, 이는 아마도 사이토카인 및 성장 인자들의 대다수가 소분자이고 통상적인 LC MS/MS 분석 과정에서 검출될 수 없기 때문이다.
LC MS/MS 및 항체 어레이 분석 각각에 의해 확인된 132개의 유전자 생성물 및 72개의 유전자 생성물의 목록은 3개의 공통된 유전자들, 즉 IGFBP2, TIMP1 및 TIMP2를 가진다. 따라서, 최종 목록에서, 총 201개의 유니크 유전자 생성물이 확인 되었다(하기 표 E2).
[표 E2]
LC-MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인된 201개 유니크 유전자 생성물의 알파벳순 목록
Figure 112008023615379-PCT00010
LC-MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인된 단백질들은 조합되어 이들의 유전자 기호로 표시되어 있다. 각각의 유전자에 대한 전사체 수준은 고 처리 일루미나 비드어레이를 사용하여 평가하였다.
이 유전자 생성물들 중 29개의 유전자 생성물, 즉 ENA-78, FGF-4, FGF-7, FGF-9, GCP-2, G-CSF, GM-CSF, GRO-a, HCC-4, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IL-1β, IL-6, IL-8, IP-1O, LIF, MCP-1, MCSF, MIF, 오스테오프로테게린, PARC, PIGF, SCF, TGF-β2, TIMP-1, TIMP-2 및 VEGF는 성체 조직 유래의 MSC에 의해 분비되는 것으로 이미 보고되어 있다(참고문헌 13, 16 및 19 내지 21). 성체 조직 유래의 MSC에 의해 분비되는 것으로 보고된 4개의 다른 단백질, 즉 IGFBP-3, MIP-3α, 온코스타틴 M 및 TGF-β3(상기 참조)은 본 발명자들의 201개 유전자 생성물의 목록에 기재되어 있지 않다.
실시예 10. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴의 분석:
게놈 범위-유전자 발현 분석에 의한 검증
전체 RNA를 일루미나 비드어레이에 혼성화함으로써 발생시킨 hESC-MSC의 게놈-범위 유전자 발현 프로파일과 201개의 유전자 생성물의 비교는 상기 유전자 생성물들 중 134개 또는 67%가 99% 신뢰 수준에서 검출 한계(LOD)를 초과하여 존재하는 유전자 전사체 수준을 가진다는 것을 보여주었다(표 E2). LC MS/MS에 의해 확인된 132개의 유전자 생성물들 중 115개 또는 88%가 검출가능한 전사체 수준(표 E2)을 가진 반면, 항체 어레이에 의해 확인된 72개의 유전자 생성물들 중 27개 또는 38%가 검출가능한 전사체 수준을 가지며, 45개 또는 62%는 검출가능한 전사체 수준을 갖지 않았다(표 E2). 상기 유전자 생성물들 중 2개, 즉 ENO1B 및 SVEP1에 대한 프로브는 일루미나 비드어레이 상에 존재하지 않았다. 72개 유전자들의 대다수에 대한 전사체 수준은 사이토카인/케모카인을 코딩하는 mRNA가 번역 과정에서 mRNA의 빠른 분해를 초래하는 AU-풍부 요소를 함유하는 것으로 공지되어 있기 때문에 일루미나 비드어레이에 의해 검출되기에는 그 존재도가 너무 낮을 가능성이 있다(참고 문헌 22 및 23).
그러므로, 보다 민감한 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 72개 유전자 생성물들 중 42개 유전자 생성물들을 무작위로 선별하여 시험하였다. 42개 유전자 생성물 중 36개 또는 86%가 35 미만의 표준화된 Ct 값을 가진 것으로서 정의된 검출가능한 전사체 수준을 가졌다(하기 표 E3). 이 빈도는 LC MS/MS에 의해 확인된 유전자 생성물들에 대해 관찰된 88% 빈도와 유사하였고, 이의 유전자 전사체는 일루미나 비드어레이에 의해 검출가능하였다. 또한, 일루미나 비드어레이에 의해 검출가능한 전사체 수준을 가진 모든 15개 유전자 생성물들은 qRT-PCR에 의해 검출가능한 전사체 수준도 가졌다(표 E3). 일루미나 비드어레이에 의해 검출가능한 전사체 수준을 갖지 않은 27개(78%) 유전자 생성물들 중 21개 유전자 생성물은 qRT-PCR에 의해 검출가능한 전사체 수준을 가졌다(표 E3).
[표 E3]
Figure 112008023615379-PCT00011
Figure 112008023615379-PCT00012
항체 어레이에 의해 확인된 72개 유전자 생성물들 중 42개 유전자 생성물이 qRT-PCR 분석을 위해 무작위로 선택되었다. 12개의 유전자 생성물은 고 처리 게놈-범위 유전자 발현 어세이인 일루미나 비드어레이 상에서 99% 신뢰 수준에서 검출 한계(LOD)를 초과하는 전사체 수준을 가졌다. 각각의 유전자에 대한 Ct 값은 β-액틴에 대해 표준화되었다.
실시예 11. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴의 분석:
분비된 단백질에 의해 조절되는 생물학적 과정
분비된 생성물들이 손상된 조직 또는 기관을 복구시킬 잠재력을 가지고 있는지를 조사하기 위해, 유전자 생성물들을 먼저 유전자 온톨로지(GO)에 따라 이들의 생물학적 과정 및 경로로 분류하였다. 그 다음, 각각의 과정 또는 경로와 관련된 분비된 MSC 프로테옴에서의 유니크 유전자들의 빈도를 유니진, 엔트레즈 및 진뱅크로부터 모은 데이타베이스에서의 각각의 경로 또는 과정에 대한 유전자-빈도와 비교하였다. 유의하게 더 높은 빈도의 유전자들(p<0.05)은 58개의 생물학적 과정 및 30개의 경로와 관련되어 있었다.
201개의 유니크 유전자 생성물들에 의해 조절되는 GO에 의해 분류된 생물학적 과정
Figure 112008023615379-PCT00013
Figure 112008023615379-PCT00014
Figure 112008023615379-PCT00015
58개의 생물학적 과정은 대사, 방어 반응 및 조직 분화라는 3가지 주요 군으로 넓게 분류될 수 있는 반면, 30개의 경로는 수용체 결합, 신호 전달도입, 세포-세포 상호작용, 세포 이동, 면역 반응 및 대사로 넓게 분류될 수 있었다(도 8 및 9). 추정상의 생물학적 과정 및 경로 둘다는 분비된 단백질들이 에너지 생성, 분해, 거대분자의 생합성 및 분비, 손상된 조직의 제거에 필수적인 과정, 및 새 조직의 재생을 조절할 세포 대사에 대해 주로 영향을 미친다는 것을 시사한다(도 8 및 9).
상기 분석은 분비된 인자들이 외부 자극, 예를 들면, 화학주성, 주성 및 많은 면역 반응에 의존하는 많은 세포 반응을 불러일으킬 수 있다는 것도 예측하였는데(도 8), 이는 MSC-조건 배지 중의 사이토카인 및 케모카인의 우세한 존재와 일치한다. 특히, 컨디셔닝 배지는 조직 분화, 특히 혈관형성, 조혈 및 골 발달을 촉진하는 과정에서 중요한 생물학적 과정을 유도할 수도 있었다(도 8). 분비된 프로테옴에 의해 조절되는 것으로 예측된 경로에서, 사이토카인 및 ECM 경로의 수용체-매개 결합은 분비된 프로테옴 중의 사이토카인 및 ECM 성분들의 우세함과 일치한다(도 9). 분비된 프로테옴에 의해 활성화될 수 있는 주요 신호 전달도입 경로는 Jak-STAT 신호전달 경로, MAPK 신호전달 경로, Toll-유사 수용체 신호전달 경로, TGF-베타 신호전달 경로, mTOR 신호전달 경로, Fc 엡실론 RI 신호전달 경로 및 헬리코박터 파이롤리 감염에 있어서의 상피 세포 신호전달을 포함한다. 분비된 프로테옴의 컴퓨터 분석도 MSC 분비가 세포-세포 상호작용, 이동 및 면역 반응을 상승시킬 수 있다는 것을 시사하였다.
실시예 12. 인간 ESC -유래의 MSC ( hESC - MSC )의 프로테옴의 분석:
논의
MSC는 무수한 질환을 치료하기 위한 임상-전 및 임상 시험에서 사용되어 왔 다(참고문헌 3 내지 5 및 24 내지 27). 그러나, 기초가 되는 기작은 정확히 파악되지 않은 상태로 남아있다. MSC가 손상된 조직을 잠재적으로 회복시키거나 재생시킬 수 있는 다수의 세포 유형, 예를 들면, 내피세포, 심근세포, 연골세포로 분화하는 잠재력을 가진다고 하더라도, MSC의 치료 효과는 MSC-유래의 회복 세포 유형의 발생에 의해서만 매개될 수는 없는데, 이는 MSC의 분화가 일반적으로 조직 회복을 매개하거나 조직 기능을 복구시키기에 너무 불충분하기 때문이다. MSC의 치료 효과 중 일부가 MSC에 의해 분비된 측분비 인자들에 의해 매개될 수 있다는 것이 점진적으로 제안되고 있다(참고문헌 8). 여기서, 본 발명자들은 2가지 기법, 즉 LC-LC-MS와 항체 어레이의 조합을 통해 hESC-MSC의 분비된 프로테옴의 조성을 개시한다.
LC-LC-MS에 의한 숏-건 단백질체(proteomic) 분석이 민감한 기법이며 고 처리 능력을 가지고 있다 하더라도, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자들의 대부분을 포함하는 작은 단백질/펩티드를 검출하기 어렵다. 이것은 항체 어레이의 사용에 의해 부분적으로 완화된다. 상기 2 기법을 사용한 MSC 분비의 정성적 단백질체 프로파일은 고도로 재현가능하다. LC MS/MS에 의해 확인된 단백질은 독립적으로 제조된 2개의 CM 회분에 존재하지만, 항체 어레이에 의해 확인된 단백질은 독립적으로 제조된 4개의 CM 회분 중 3개 이상의 CM 회분에 존재하였다. 얻어진, hESC-MSC에 의한 분비의 단백질체 프로파일은 성체 조직-유래의 MSC에 의해 분비되는 것으로 이미 보고된 거의 모든 인자들뿐만 아니라(참고문헌 13, 16 및 19 내지 21), 보고되지 않은 많은 다른 인자들도 포함하였다. 단백질체 프로파일링의 확실성은 고 처리 마이크로어레이-기재 유전자 발현 분석을 사용하여 단백질체 프로파일에서 유전 자 생성물의 86 재지 88%에 대한 전사체를 검출함으로써 더 입증되었다.
전체적인 스케일에 대한 MSC 분비의 잠재적 기능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 번역 후 변형된 단백질보다는 유전자 생성물에 기초한 유전자 발현 분석을 위해 보다 용이하게 입수가능한 컴퓨터 분석 수단을 사용하였다. 컴퓨터 분석은 사이토카인 및 케모카인의 기능 예컨대, 화학주성, 주성, 외부 자극에 대한 세포 반응, 분해, 거대분자의 생합성 및 분비, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, 세포-세포 상호작용, 및 기초 대사 예를 들면, 글루코스 및 아미노산 대사와 일반적으로 관련되어 있는 많은 과정 및 경로를 예측하였는데, 이는 사이토카인 및 케모카인이 분비물 중에 우세하게 존재한다는 점과 일치한다. 본 명세서에 기재된 MSC는 이 기능들이 일정할 역할을 할 수 있는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
상기 과정 및 경로가 임의의 특정한 세포 또는 조직 유형에서 손상, 회복 및 재생의 과정에 특이적이지 않을지라도, 손상 부위로의 면역 세포 이동의 촉진, ECM 리모델링 및 세포 대사의 증가는 대부분의 손상된 또는 병든 조직에 대한 회복 효과를 나타낼 것이다.
사이토카인 및 케모카인과 관련된 이 일반적인 경로와 별도로, 컴퓨터 분석은 분비된 단백질들이 혈관형성, 조혈 및 골격 발달에 관여하는 많은 과정을 조절한다는 것도 예측하였다. 동시에, 대부분의 보고된 MSC-매개 조직 회복 또는 재생은 심혈관, 조혈 및 골격근 조직과 관련되어 있다(참고문헌 3 내지 5 및 24 내지 27). 경로 분석은 MSC의 측분비 효과 중 일부 효과를 매개하는 데 관여할 수 있는 후보 경로들을 더 보여주었다. 사실상, 이 후보 경로들 중 대다수가 심혈관, 조혈 및 골격근 생물학의 많은 측면에 이미 관련되어 있었다. 예를 들면, Jak-STAT 신호전달은 심장보호(참고문헌 28), 조혈(참고문헌 29 및 30), 및 골격 회복 및 리모델링(참고문헌 31 및 32)과 관련되어 있고; MAPK 신호전달은 심혈관 반응(참고문헌 33 및 34), 골격 회복 및 리모델링(참고문헌 32 및 35), 및 조혈(참고문헌 36)의 많은 측면에서 중요한 역할을 수행하고; Toll-유사 수용체 신호전달은 심혈관 질환의 개시 및 진행(참고문헌 37), 및 선천성 및 후천성 면역의 조절(참고문헌 38)에 관련되어 있으며; TGF-베타 신호전달은 정확한 심장 발달, 심장 리모델링, 심부전으로의 진행 및 혈관형성(참고문헌 39-41), 조혈(참고문헌 42), 골 및 연골의 형성 및 리모델링(참고문헌 27 및 43)뿐만 아니라 일반적인 상처 치유(참고문헌 44)에서 중요한 역할을 수행하고; 세포 생장 및 증식의 중요한 조절자로서의 mTOR은 정상적인 생리기능 및 질환 둘다에서 비-특이적이지만 중요한 역할을 수행한다(참고문헌 45 내지 47).
결론적으로, 성체 조직-유래의 MSC에 의해 분비되는 것으로 보고된 사이토카인들 중 대다수를 포함하는 hESC-유래의 MSC에서 분비된 프로테옴에 대한 본 발명자들의 분석은 분비된 프로테옴이 조직 회복 및 재생, 특히 심혈관, 조혈 및 골격근 조직에 대한 조절 효과를 잠재적으로 발휘할 수 있으므로, MSC 이식 연구에서 조직 회복 및 재생에 대한 MSC-매개 측분비 효과에 대한 분자적 지지를 제공한다는 것을 시사한다. 이 분비된 프로테옴은 MSC-매개 조직 회복에서 분자적 기작에 대한 용이하게 시험될 수 있는 많은 가설뿐만 아니라, 조직 회복 및 재생을 조절하기 위한 잠재적인 "약물이 될 수 있는" 표적도 보여주었다. hESC-유래의 MSC와 성체 조 직-유래의 MSC 사이의 상당한 유사성은 MSC 배양물의 조건 배지가 유사한 생물학적 활성을 가질 것임을 시사한다.
따라서, 이것은 본 방법에 의해 유도된 MSC가 이의 골수 유래의 MSC와 상당한 생물학적 유사성을 가진다는 것을 입증한다. 이 발견은 측분비 인자들을 분비하는 MSC의 능력에 있어서 hESC-MSC와 성체 BM-유래의 MSC의 유사성을 입증한다. 나아가, 조건 배지의 형태를 비롯한, 본 명세서에 기재된 MSC로부터 분비된 임의의 하나 이상의 단백질은 본 명세서에 기재된 MSC와 동일한 목적으로 사용될 수 있다.
그러나, hESC-유래의 MSC는 성체 조직-유래의 MSC보다 여러 이점을 가진다. MSC의 조직 공급원으로서의 hESC 세포주의 사용은 무한히 재생가능하고 증폭가능한 조직 공급원을 구성하며, MSC의 재현가능한 일관된 회분 대 회분 제조를 상승시켜 임상적 순응 방식으로의 CM의 재현가능한 일관된 회분 대 회분 제조를 상승시킨다. 또한, 상기 사용은 CM 제조의 확장성 및 저비용 출하 대기 치료제의 개발 가능성을 증가시킨다. 또한, hESC-유래의 MSC CM의 제조를 위한 무혈청 합성 배지의 개발은 복합 배지 보충물 예컨대, 혈청 또는 혈청 대체 배지와 관련된 유해한 변동가능한 오염물질을 감소시킨다. 그러므로, CM에 대한 본 발명자들의 설명은 임상적 적용에 대한 MSC-기초 생물학의 해석에 매우 적절하다.
실시예 13. 58개 생물학적 과정 각각에서 201개 유전자의 목록
Figure 112008023615379-PCT00016
Figure 112008023615379-PCT00017
Figure 112008023615379-PCT00018
Figure 112008023615379-PCT00019
Figure 112008023615379-PCT00020
Figure 112008023615379-PCT00021
Figure 112008023615379-PCT00022
Figure 112008023615379-PCT00023
Figure 112008023615379-PCT00024
Figure 112008023615379-PCT00025
실시예 14. 30개 경로 각각에서 201개 유전자의 목록
Figure 112008023615379-PCT00026
Figure 112008023615379-PCT00027
Figure 112008023615379-PCT00028
Figure 112008023615379-PCT00029
Figure 112008023615379-PCT00030
Figure 112008023615379-PCT00031
Figure 112008023615379-PCT00032
실시예 15. 실시예 7 내지 14에 대한 참고문헌
Figure 112008023615379-PCT00034
Figure 112008023615379-PCT00035
일반 참고문헌
Figure 112008023615379-PCT00036
Figure 112008023615379-PCT00037
Figure 112008023615379-PCT00038
본 명세서에 기재된 출원 및 특허 각각, 및 상기 출원 및 특허 각각의 권리요구 과정 동안에 인용되었거나 언급된 것을 포함하는, 상기 출원 및 특허 각각에서 인용되었거나 언급된 각 문헌("인용된 출원 문헌"), 상기 출원 및 특허 각각, 및 상기 출원에서 인용된 문헌 중 임의의 문헌에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다. 나아가, 본문에서 인용된 모든 문헌, 및 본문에서 인용된 문헌에서 인용되었거나 참조된 모든 문헌, 및 본문에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다.
기재된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되어 있다 하더라도, 청구된 본 발명이 이러한 특정한 실시양태로 과도하게 한정되어서는 안 되며, 본 발명에 대한 많은 변형 및 부가가 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 사실상, 분자생물학 및 관련 분야에서 숙련된 자에게 자명한, 본 발명을 실시하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 청구범위 내에 포함된다. 더욱이, 독립항의 특징과 함께 하기 종속항의 특징의 다양한 조합이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다.

Claims (54)

  1. 간엽 줄기 세포(MSC)를 수득하는 방법으로서, 배아 줄기(ES) 세포 콜로니를 분산시켜 수득한 세포 또는 이의 후손 세포를 제공하는 단계, 및 FGF2를 포함하는 무혈청 배지에서 공-배양물(co-culture)의 부재 하에 상기 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배아 줄기 세포 콜로니는 인간 배아 줄기 세포 콜로니(hESC)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배아 줄기 세포 콜로니는 트립신으로 분산시키는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 플레이트에서 회수하기 전에 상기 세포의 전면생장 플레이트를 트립신으로 처리하여 분산시키는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공-배양물의 부재는 영양세포 층이 없는 세포의 배양을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 배양 기판 상에서 증식하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 기판은 젤라틴 처리된 플레이트를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지는 약 5 ng/㎖의 농도로 FGF2를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지는 바람직하게 약 5 ng/㎖의 농도로 PDGF AB를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지는 혈청 대체 배지로 보충된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 전면생장되면 트립신 처리하여 1:4로 분할하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 마커의 발현을 기초로, 증식된 세포로부터 간엽 줄기 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 간엽 줄기 세포는 하기 표면 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 마커의 발현이 상승된 세포를 선별하여 수득하는 것인 방법: ANPEP(CD13;LAP1;PEPN;gp150: NM_0O1150.1); ENG(END;ORW;HHT1;ORW1;CD105: NM_0OO118.1); SCN9A(PN1;NE-NA: NM_002977.1); TRPV2(VRL;VRL1;VRL-1;MGC12549: NM_016113.3); RAMP1(: NM_005855.1); F2RL2(PAR3: NM_004101.2); NTSR1(NTR: NM_002531.1); GABRA2(: NM_000807.1); SLC16A4(MCT4: NM_004696.1); ITGA4(CD49D: NM_000885.2); NCAM2(NCAM21;MGC51008: NM_004540.2); IL1R1(P80;IL1R;IL1RA;CD121A;D2S1473;IL-1R-알파: NM_000877.2); PDGFRA(CD140A;PDGFR2: NM_006206.2); VCAM1(INCAM-100: NM_080682.1); SSFA2(CS1;CS-1;KRAP;SPAG13;KIAA1927: NM_006751.3); TRHDE(PAP-II: NM_013381.1); EDG2(LPA1;edg-2;vzg-1;Gpcr26;Mrec1.3;rec.1.3: NM_001401.3); NT5E(eN;NT5;NTE;eNT;CD73;E5NT: NM_002526.1); 및 FLRT2(KIAA0405: NM_013231.2); FAP(FAPA;DPPIV;SEPRASE: NM_004460.2).
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 표면 마커는 CD105(수탁 번호 NM_0OO118.1)를 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 표면 마커는 CD73(수탁 번호 NM_002526.1)을 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽 줄기 세포는 하기 표면 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 마커의 발현이 감소된 세포를 선별하여 수득하는 것인 방법: ITGB1BP3(MIBP: NM_014446.1); PTPRZ1(PTPZ;HPTPZ;PTP18;PTPRZ;RPTPB: NM_002851.1); CNTN1(F3;GP135: NM_175038.1); PCDH1(PC42;PCDH42;MGC45991: NM_002587.3); PODXL(PCLP;Gp200: NM_005397.2); GPR64(HE6;TM7LN2: NM_005756.1); PROM1(AC133;CD133;PROML1: NM_006017.1); GPRC5C(RAIG3;RAIG-3: NM_022036.2); CD24(CD24A: NM_013230.1); CLDN3(RVP1;HRVP1;CPE-R2;CPETR2: NM_001306.2); TACSTD1(EGP;KSA;M4S1;MK-1;EGP40;MIC18;TROP1;Ep-CAM;hEGP-2;CO17-1A;GA733-2: NM_002354.1); HTR3A(HTR3: NM_000869.1); FGFR4(TKF;JTK2: NM_022963.1); ADCY1(: NM_021116.1); FGFR3(ACH;CEK2;JTK4;HSFGFR3EX: NM_022965.1); IL17RB(CRL4;EVI27;IL17BR;IL17RH1;MGC5245: NM_018725.2); SORL1(LR11;LRP9;SORLA;gp250;SorLA-1: NM_003105.3); GPM6B(M6B: NM_005278.2); KCNS3(KV9.3;MGC9481: NM_002252.3); 및 FZD3(Fz-3;hFz3: NM_017412.2).
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 마커는 CD24(수탁 번호 NM_013230.1)를 포함하는 것인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽 줄기 세포는 CD105+ CD24-인 세포에 대해 선별하여 수득하는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽 줄기 세포는 표면 항원에 대한 항체로 세포를 표지시켜 선별하는 것인 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽 줄기 세포는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 선별하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 35 세대 미만으로 계대 배양하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 약 14일, 바람직하게는 약 7일 동안 증식하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니는 huES9 콜로니를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니는 H1 ESC 콜로니를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 CD29+, CD44+, CD49a+, CD49e+, CD105+, CD166+, CD34- 및 CD45- 중 하나 이상, 바람직하게는 전부인 표면 항원 프로파일을 나타내는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 HESX1, POUFL5, SOX -2, UTF -1 및 ZFP42 중 하나 이상, 바람직하게는 전부의 발현 감소를 나타내는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 OCT4, NANOG 및 SOX2 중 하나 이상, 바람직하게는 전부의 발현 감소를 나타내는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 검출가능한 알칼리성 포스파타제 활성을 나타내지 않는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 SCID 마우스에 이식된 경우 기형종을 형성하지 않는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 세포 배양물은 마우스-특이적 c- mos 반복 서열에 대해 음성이고, 인간 특이적 alu 반복 서열에 대해 양성 인 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 간엽 줄기 세포(MSC)는 골형성, 지방형성 또는 연골형성이 일어날 수 있고, 바람직하게는 골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화할 수 있는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 세포 배양물은 huES9.E1, huES9.E3 또는 H1.E2를 포함하는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 선별된 임의의 2개 이상, 바람직하게는 모든 간엽 줄기 세포는 실질적으로 동일한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 수득된 간엽 줄기 세포 중 2개 이상의 임의 단리물 사이의 유전자 발현 상관 계수는 0.9 보다 큰 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 수득된 간엽 줄기 세포 중 임의의 2개 이상, 바람직하게는 전부가 서로 실질적으로 유사하거나 동일한(바람직하게는 동종성인) 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 수득된 간엽 줄기 세포와 모 배양물 세포 사이의 유전자 발현 상관 계수가 0.8 보다 큰 것인 방법.
  37. 간엽 줄기 세포주를 수득하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 이로부터 선별된 세포로부터 세포주를 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 분화된 간엽 세포를 수득하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 간엽 줄기 세포를 수득하는 단계, 또는 제37항에 따른 방법으로 간엽 줄기 세포주를 수득하는 단계, 및 세포 배양물, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포주를 분화시키는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 분화된 간엽 줄기 세포는 골세포, 지방세포 또는 연골세포인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 세포 또는 세포주.
  41. 배아 줄기 세포로부터 세포 배양물을 유도하는 방법으로서, (a) 배아 줄기 세포(hESC) 콜로니를 제공하는 단계; (b) 상기 hESC 콜로니를 분산시키는 단계; (c) (i) 영양세포 층의 부재 하에 (ii) FGF2의 존재 하의 무혈청 배지 중에서 분산된 세포를 증식시키는 단계; 및 (d) 이로부터 세포 배양물을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 특징을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따라 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포를 수득하는 단계, 경우에 따라 간엽 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계, 및 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법.
  44. 개체에서 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있는 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포의 용도.
  45. 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있는 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포를 포함하는 약학 조성물.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 질환이 심부전; 골수 질환; 피부 질환; 화상; 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 퇴행성 질환; 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  47. 세포 배양 배지의 조건화 방법으로서, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득한 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포를 세포 배양 배지 중에서 배양하는 단계, 및 경우에 따라 상기 세포 배양 배지를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 따른 방법으로 수득할 수 있는 조건 배지.
  49. 실시예 10 내지 14 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 수득하는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따라 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포를 수득하는 단계, 및 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 개체에서 질환을 치료하는 방법에 있어서의 제48항에 따른 조건 배지의 용도.
  51. 실질적으로 첨부된 도면의 도 1 내지 9와 관련하여 기술하고 이들 도면에 나타낸 바와 같이 세포 배양물을 수득하는 방법.
  52. 실질적으로 첨부된 도면의 도 1 내지 9와 관련하여 기술하고 이들 도면에 나타낸 바와 같이 간엽 줄기 세포를 수득하는 방법.
  53. 실질적으로 첨부된 도면의 도 1 내지 9와 관련하여 기술하고 이들 도면에 나타낸 바와 같이 세포 배양물을 수득하는 방법.
  54. 실질적으로 첨부된 도면의 도 1 내지 9와 관련하여 기술하고 이들 도면에 나타낸 바와 같은 세포 배양물, 간엽 줄기 세포, 간엽 줄기 세포주 또는 분화된 간엽 줄기 세포.
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