KR20100065307A - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 췌장 내배엽, 췌장 호르몬 발현 세포 및 췌장 호르몬 분비 세포의 형성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 영양 세포층(feeder cell layer)을 사용하지 않고 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{Differentiation of human embryonic stem cells}
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 췌장 내배엽, 췌장 호르몬 발현 세포 및 췌장 호르몬 분비 세포의 형성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 영양 세포층(feeder cell layer)을 사용하지 않고 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(three germ layers)(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF-3베타, GATA4, Mixl1, CXCR4 및 Sox-17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재하에서, 췌장은 복측아(ventral bud) 및 배측아(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발생하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포 유형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 함유한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린-분비 구조로 분화한 것을 보고한다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고한다.
한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(SLY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시한다.
다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생산 세포를 생성하는 것을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 Pdx1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고한다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스코우디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGFβ 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 그들은 TGFβ2가 재현성있게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든(Gordon) 등은 혈청의 부재하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재하에서 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키우리(brachyury)+/HNF-3베타+ 내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건하에서 유지되어야 한다(미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로 분화되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드' 아무르등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"라고 진술한다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에는, 분화 경로가 세 단계로 나뉘어졌다. 먼저, 인간 배아 줄기 세포는 부티르산나트륨과 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화되었다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGFβ 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서는, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로 분화하는 잠재력을 보유하는 한편, 현재의 임상적 필요성에 대처하도록 확장될 수 있는 만능 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것에 대한 상당한 필요성이 여전히 남아있다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키기 위해 대안적인 접근법을 취하였다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 하기 방법 중 임의의 하나에 의해 만능 줄기 세포를 처리함으로써 만능 줄기 세포로부터 분화된다:
a. 혈청의 부재하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 상기 세포를 액티빈 A 및 혈청을 이용하여 배양하고, 이어서 상기 세포를 상이한 농도의 혈청 및 액티빈 A를 이용하여 배양하거나, 또는
b. 혈청의 부재하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 상기 세포를 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 배양하거나, 또는
c. 혈청의 부재하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 상기 세포를 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 배양하거나, 또는
d. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하거나, 또는
e. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 혈청을 함유한 제1 배양 배지에서 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 혈청을 함유한 제2 배양 배지에서 액티빈 A를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하거나, 또는
f. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 혈청을 함유한 제1 배양 배지에서 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 혈청을 함유하는 제2 배양 배지에서 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양함.
일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 하기 방법 중 임의의 하나에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로부터 분화된다:
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그(hedgehog) 시그널링 경로 억제제로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제를 함유하는 배지를 제거하고, 후속적으로 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양하거나, 또는
b. 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리하거나, 또는
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 레틴산으로 처리하고, 이어서 레틴산을 제거하고, 후속적으로 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 상기 세포를 처리함.
일 실시 형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 하기 방법 중 임의의 하나에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리함으로써 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로부터 분화된다:
a. DAPT 및 엑센딘(exendin) 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 후속적으로 상기 세포를 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 배양하거나, 또는
b. 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 후속적으로 상기 세포를 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 배양하거나, 또는
c. DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 배양하거나, 또는
d. 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 배양하거나, 또는
e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 노치(Notch) 시그널링 경로를 억제하는 인자로 처리하거나, 또는
f. 약 10 mM 내지 약 20 mM의 글루코스 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 당뇨병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 β-세포 계통의 세포로 분화시키는 단계, 및
e. β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계.
<도 1>
도 1의 패널 a는 2, 5 및 8일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A로 처리한 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 완성 내배엽 마커들인 CXCR4, GATA4, HNF-3베타, Mixl1, Sox-17의 발현을 보여준다. 완성 내배엽 마커들의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였으며 미처리 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 b는 3 및 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A로 처리한 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 전방 내배엽 마커들인 세르베루스(Cerberus), Otx-1 및 Hex 유전자의 발현을 보여준다.
<도 2>
도 2는 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A로 처리한 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 완성 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 완성 내배엽 마커들의 발현을 면역조직화학에 의해 검출하였다. 패널 (a)는 Sox-17 발현을 보여준다. 패널 (b)는 HNF-3베타 발현을 보여준다. 패널 (c)는 Oct3/4 발현을 보여준다.
<도 3>
도 3은 단계적인 분화 프로토콜 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 완성 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 완성 내배엽 마커들의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였으며 미처리 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 GATA4 발현을 보여준다. 패널 (b)는 Sox-17 발현을 보여준다. 패널 (c)는 HNF-3베타 발현을 보여준다. 패널 (d)는 Mixl1 발현을 보여준다. 'AA'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안의 액티빈 A 처리를 나타낸다. 'UT'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안 배양된 미처리 대조군을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 단계적인 분화 프로토콜 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 배아외(extra-embryonic) 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 배아외 내배엽 마커들의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였으며 미처리 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 AFP 발현에 대한 100 ng/㎖ 액티빈 A의 효과를 보여준다. 패널 (b)는 Sox7 발현에 대한 100 ng/㎖ 액티빈 A의 효과를 보여준다. 'AA'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안의 액티빈 A 처리를 나타낸다. 'UT'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안 배양된 미처리 대조군을 나타낸다.
<도 5>
도 5는 단계적인 분화 프로토콜 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 중배엽 및 외배엽 마커들의 발현을 보여준다. 중배엽 및 외배엽 마커들의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였으며 미처리 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 브라키우리 발현에 대한 100 ng/㎖ 액티빈 A의 효과를 보여준다. 패널 (b)는 Zic1 발현에 대한 100 ng/㎖ 액티빈 A의 효과를 보여준다. 'AA'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안의 액티빈 A 처리를 나타낸다. 'UT'로 표시된 데이터점은 1일(1d), 3일(3d), 5일(5d), 또는 7일(7d) 동안 배양된 미처리 대조군을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 1, 3, 5, 및 7일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A로 처리한 후 인간 배아 줄기 세포주 H7에서 완성 내배엽 마커들인 브라키우리 (패널 a), CXCR4 (패널 b), Mixl1 (패널 c), Sox17 (패널 d), HNF-3베타 (패널 e), Oct4 (패널 f)의 발현을 보여준다. 완성 내배엽 마커들의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였으며 미처리 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다.
<도 7>
도 7은 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 완성 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 완성 내배엽 마커들의 발현을 면역조직화학에 의해 검출하였다. 패널 (a) 및 (b)는 Sox-17 발현을 보여준다. 패널 (c) 및 (d)는 HNF-3베타 발현을 보여준다. 패널 (e) 및 (f)는 GATA4 발현을 보여준다. 패널 (b), (d) 및 (f)는 DAPI를 이용하여 핵을 대조염색한 것을 보여준다. '처리'로 표시된 컬럼은 5일 동안의 액티빈 A 처리 (100 ng/㎖)를 나타낸다. '미처리'로 표시된 컬럼은 미처리 대조군을 나타낸다.
<도 8>
도 8은 두 번째의 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 췌장 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 췌장 내배엽 마커들의 발현을 PCR에 의해 분석하였으며 액티빈 A 처리된 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 Pdx1 발현을 보여준다. 패널 (b)는 GLUT-2 발현을 보여준다. 패널 (c)는 PTF1a 발현을 보여준다.
<도 9>
도 9는 두 번째의 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 췌장 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 췌장 내배엽 마커들의 발현을 면역조직화학에 의해 검출하였다. 패널 (a)는 미처리 대조군에서 Pdx1 발현을 보여주며, 패널 (b)는 단계적인 분화 프로토콜에 의해 처리된 배양물에서 Pdx1 발현을 보여준다.
<도 10>
도 10은 세 번째의 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 췌장 내분비 마커들의 발현을 보여준다. 췌장 내분비 마커들의 발현을 PCR에 의해 분석하였으며 액티빈 A 처리된 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 뉴로D1(NeuroD1) 발현을 보여준다. 패널 (b)는 Ngn3 발현을 보여준다. 패널 (c)는 인슐린 발현을 보여준다. 패널 (d)는 Hes-1 발현을 보여주며, 발현 수준은 췌장 내배엽 세포에 대해 정상화된다.
<도 11>
도 11은 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 췌장 내배엽 마커들의 발현을 보여준다. 췌장 내배엽 마커들의 발현을 PCR에 의해 분석하였으며 액티빈 A 처리된 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 Nkx2.2 발현을 보여준다. 패널 (b)는 Pdx1 발현을 보여준다.
<도 12>
도 12는 배양에서 각각의 계대(P0, P1 및 P2)를 가진 세포에서 PDX-1의 발현을 보여준다. PDX-1의 발현을 PCR에 의해 분석하였으며 액티빈 A 처리된 인간 배아 줄기 세포 H9에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다.
<도 13>
도 13은 세 번째 분화 프로토콜의 적용 후 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 간세포 마커들의 발현을 보여준다. 간세포 마커들의 발현을 PCR에 의해 분석하였으며 액티빈 A 처리된 인간 배아 줄기 세포에서의 발현 수준에 대해 정상화시켰다. 패널 (a)는 AFP 발현을 보여준다. 패널 (b)는 알부민 발현을 보여준다.
<도 14>
도 14는 인간 배아 줄기 세포주 H9에서 만능성의 마커들의 발현을 보여준다. 만능성의 마커들의 발현은 면역조직화학에 의해 분석하였다. 패널 (a)는 Oct-4 발현을 보여준다. 패널 (b)는 알칼라인 포스파타아제 발현을 보여준다.
<도 15>
도 15는 인간 배아 세포주 H9의 핵형을 보여준다. 핵형은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포 상에서 배양된 계대수(passage number) P36의 세포에서 결정하였다.
<도 16>
도 16은 본 발명에서의 분화 프로토콜의 개요를 도시하며, 여기서는 인간 배아 줄기 세포는 영양 세포가 없는 시스템에서 완성 내배엽으로 분화된다.
<도 17>
도 17은 다양한 농도의 매트리젤(MATRIGEL) 상에서 배양되고 5일 동안 (0.5-2%의) 저 혈청 및 고 액티빈 A (100 ng/㎖)에 노출된, 계대수 44의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 FACS 프로파일을 도시한다. 완성 내배엽 마커 CXCR4 (CD184)의 발현은 Y-축 상에 나타내며 ES 마커 CD9의 발현은 X-축 상에 나타낸다.
<도 18>
도 18은 1:10 희석의 매트리젤(■), 1:20 희석의 매트리젤(■), 또는 1:30 희석의 매트리젤(□) 상에서 배양되고 실시예 14에 개시된 분화 프로토콜에 노출된 계대 44의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물로부터의, 완성 내배엽의 마커에 대한 실시간 PCR 결과를 보여준다. 유도 배수는 생쥐 배아 섬유아세포를 이용하여 조절된 배지에서 배양된 계대수 44의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 미분화된 세포에 대한 것이다.
<도 19>
도 19는 미분화된 만능 줄기 세포 및 분화 중인 만능 줄기 세포로부터 얻은 완성 내배엽 세포에서의 전체적인(global) 유전자 발현에 대한 산점도를 보여준다. 나타낸 데이터는 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 배양된 계대 44의 인간 배아 줄기 세포주 H9(우측 패널) 및 매트리젤 상에서 배양된 계대 83의 인간 배아 줄기 세포주 H9(좌측 패널)의 배양물로부터의 데이터이다.
<도 20>
도 20은 실시예 4에서 개시된 완성 내배엽 분화 프로토콜에 노출된 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주 H1(패널 a), 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 b), 및 인간 배아 줄기 세포주 H9(패널 c)에 대한 5일에서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다.
<도 21>
도 21은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 a)과 인간 배아 줄기 세포주 H9(패널 b)의 배양물에서 표시된 완성 내배엽 마커들의 발현의 실시간 PCR 결과를 보여준다. 결과는 미분화된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다.
<도 22>
도 22는 매트리젤 (1:30 희석) 상에서 배양되고 실시예 4에서 개시된 완성 내배엽 분화 프로토콜에 노출된 인간 배아 줄기 세포주 H1(패널 a), 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 b), 및 인간 배아 줄기 세포주 H9(패널 c)에 대한 5일에서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다.
<도 23>
도 23은 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 a)과 인간 배아 줄기 세포주 H9(패널 b) 및 인간 배아 줄기 세포주 H1(패널 c)의 배양물에서 표시된 완성 내배엽 마커들의 발현의 실시간 PCR 결과를 보여준다. 결과는 미분화된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다. 세포는 실시예 4에 개시된 방법에 따라 처리하였다.
<도 24>
도 24는 100 ng/㎖의 액티빈 A(패널 a) 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖ Wnt-3a(패널 b)의 존재하에서 계대 46의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물의 위상차 이미지를 도시한다. 세포를 5일 동안 처리하였다.
<도 25>
도 25는 실시예 4에 개시된 방법에 따른 처리 후, 계대 44의 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 a 및 b)과 계대 46의 H9(패널 c 및 d)의 배양물에서 FACS에 의한 CXCR4 의 발현을 도시한다. 패널 b와 d는 CXCR4 발현에 대한 20 ng/㎖의 Wnt-3a의 효과를 보여준다. 패널 a와 c는 Wnt-3a의 부재하에서 CXCR4 발현을 보여준다. 결과는 처리 후 5일에 얻었다.
<도 26>
도 26은 인간 배아 줄기 세포주 H7(패널 a) 및 H9(패널 b)의 배양물에서 표시된 유전자들의 발현에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 배양물은 실시예 4에 개시된 분화 프로토콜로 처리하였다. Wnt 작용제 Wnt-3a (20 ng/㎖), Wnt-5a (20 ng/㎖) 및 Wnt-7a (20 ng/㎖)의 효과도 패널에 표시된 바와 같이 시험하였다. 세포를 5일 동안 처리하였다. 결과는 미분화된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다.
<도 27>
도 27은 처리 후 5일째에 FACS에 의한, 계대 46의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서의 CXCR4의 발현을 도시한다. 패널 (a)는 Wnt-3a의 부재하에서 CXCR4 발현을 도시한다. 패널 (b)는 10 ng/㎖ Wnt-3a로 처리한 후 CXCR4 발현을 도시한다. 패널 (c)는 20 ng/㎖ Wnt-3a로 처리한 후 CXCR4 발현을 도시하며, 패널 (d)는 50 ng/㎖ Wnt-3a로 처리한 후 CXCR4 발현을 도시한다.
<도 28>
도 28은 5일의 처리 후 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서 표시된 완성 마커들의 발현을 도시한다. 결과는 실시간 PCR에 의해 결정할 때, 미처리 세포에 대한 발현의 증가 배수로 나타낸다. 패널 (a)는 표시된 완성 내배엽 마커 유전자들의 발현에 대한 10, 20 및 50 ng/㎖ Wnt-3a의 효과를 보여준다. 패널 (b)는 처리 후 2일(2d)과 5일(5d)에, 구스코이드(goosecoid) (■) 및 CXCR4 (□) 발현에 대한 1, 5 또는 10 ng/㎖ Wnt-3a(x-축 라벨: 10, 5, 1)의 효과를 보여준다. 패널 (c)는 2일 (■) 또는 5일 (□)에, 세포 수에 대한 1, 5 또는 10 ng/㎖ Wnt-3a의 효과를 보여준다.
<도 29>
도 29는 실시예 4에 개시된 분화 프로토콜로 5일 처리한 후, FACS에 의한 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서의 CXCR4의 발현을 도시한다. 세포를 Wnt-3a 또는 GSK-3B 억제제의 부재하에서(패널 a), 전체 5일 기간 동안 20 ng/㎖ Wnt-3a(패널 b), 전체 5일 기간 동안 1000 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 c), 전체 5일 기간 동안 500 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 d), 전체 5일 기간 동안 100 nM GSK-3B 억제제 IX(패널 e), 전체 5일 기간 동안 10 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 f), 1-2일 동안 100 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 g), 1-2일 동안 10 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 h)에서 배양하였다.
<도 30>
도 30은 실시간 PCR에 의한 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다. 패널 (a)는 표시된 농도와 시간으로 Wnt-3a 또는 GSK-3B 억제제를 함유한, 실시예 4에 개시된 완성 내배엽 프로토콜로 처리된, 계대수 48의 인간 배아 세포주 H9로부터 얻은 데이터를 보여준다. 패널 (b)는 표시된 농도와 시간으로 Wnt-3a 또는 GSK-3B 억제제를 함유한, 실시예 4에 개시된 완성 내배엽 프로토콜로 처리된, 계대수 46의 인간 배아 세포주 H9로부터 얻은 데이터를 보여준다.
<도 31>
도 31은 본 발명에서 사용된 배아 줄기 세포주에 있어서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다. 패널 (a-d)은 계대수 49의 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터 얻은 데이터를 보여준다. 패널 (e-f)은 계대수 46의 인간 배아 줄기 세포주 H1로부터 얻은 데이터를 보여준다. 데이터는 처리 후 5일에 얻었다. 세포를 하기 조건으로 처리하였다: 패널 (a): 5일 동안 내내 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a; 패널 (b): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a; 패널 (c): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM의 GSK-3B 억제제 IX; 패널 (d): 5일 동안 내내 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM GSK-3B IX 억제제, 패널 (e): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a, 및 패널 (f): 5일 동안 내내 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a.
<도 32>
도 32는 10, 50, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 Wnt-3a로 처리된, 계대 49의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 POU5F (Oct-4)의 발현 및 패널 (b): SOX-17 및 GATA4. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다.
<도 33>
도 33은 계대 53의 배아 줄기 세포주 H9에 있어서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다. 데이터는 처리 후 5일에 얻었다. 세포를 하기 조건으로 처리하였다: 패널 (a): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a 및 3-5일 동안 25 ng/㎖ BMP-4; 패널 (b): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a; 패널 (c): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM의 GSK-3B 억제제 IX; 패널 (d): 5일 동안 내내 20 ng/㎖ Wnt-3a+ 25 ng/㎖ BMP-4; 패널 (e): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a + 100 nM GSK-3B 억제제 IX, 및 패널 (f): 5일 동안 내내 100 ng/㎖ 액티빈 A + 25 ng/㎖ BMP-4. 모든 패널에 있어서, X-축은 CD9의 발현을 나타내며 Y-축은 CXCR4(CD184)의 발현을 나타낸다.
<도 34>
도 34는 10, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 Wnt-3a 또는 100 nM GSK-3B 억제제로 처리된, 계대 46의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, 및 POU5F (Oct-4)의 발현 및 패널 (b): SOX-17, HNF-3B, 및 GATA4. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다.
<도 35>
도 35는 50, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 10 또는 100 nM GSK-3B 억제제로 처리된, 계대 49의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 POU5F (Oct-4)의 발현 및 패널 (b): SOX-17 및 GATA4. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다.
<도 36>
도 36은 5일 동안 액티빈 A, Wnt-3a, GSK-3 억제제, 및 BMP-4의 조합으로 처리된, 계대 53의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 SOX7의 발현 및 패널 (b): SOX-17, HNF-3B 및 GATA4.
<도 37>
도 37은 실시예 22에 열거된 조건으로 처리한, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서, FACS에 의해 결정한, CXCR4 발현 백분율을 도시한다.
<도 38>
도 38은 피브로넥틴 (패널 a) 또는 매트리젤™ (패널 b) 상에서 배양한, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서 FACS에 의해 결정한 완성 내배엽 마커들의 발현을 도시한다.
<도 39>
도 39는 피브로넥틴 (□) 상에서 또는 성장 인자 감소된 매트리젤의 1:10 희석물(■) 상에서 배양한, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서 실시간 PCR에 의해 결정한 완성 내배엽 마커들의 발현을 도시한다.
<도 40>
도 40은 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화에 대한, 저 혈청, 100 ng/㎖의 액티빈 A 및 20 ng/㎖의 Wnt-3a의 존재하에서의 다양한 농도의 매트리젤의 효과를 도시한다. 세포는 실시예 4에 개시된 방법에 따라 처리하였다. 나타낸 결과는 실시간 PCR에 의해 결정한, 표시된 유전자의 발현 수준이다.
<도 41>
도 41은 매트리젤 상에서 유지되지만 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 분화된 인간 배아 줄기 세포에 의한 완성 내배엽 형성에서 Wnt-3a의 역할을 도시한다. 패널 (a-d)은 표시된 유전자에 대한 실시간 PCR 데이터를 보여준다. 패널 (e-g)는 표시된 조건에 대한 FACS 데이터를 보여준다.
<도 42>
도 42는 Wnt 억제제 DKK-1로 처리한 후, 매트리젤™로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포가 완성 내배엽으로 분화하는 것을 보여준다. 나타낸 결과는 20 ng/㎖의 Wnt-3A + 100 ng/㎖의 DKK1 (DE + DKK1)의 존재하에서, 또는 DKK1 (DE)의 부재하에서 실시예 4에 개시된 방법에 따라 처리된 H9 세포에서 실시간 PCR에 의해 결정한, 표시된 유전자들의 발현이다.
<도 43>
도 43은 매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 20 ng/㎖의 Wnt-3a가 없거나(패널 a) 있는(패널 b) 100 ng/㎖ 액티빈 A가 더해진 저 혈청에서 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서 완성 내배엽 마커들의 면역형광 염색을 보여준다. Ecad = E-카드헤린, NCAM=N-카드헤린,
<도 44>
도 44는 계대 38의 인간 배아 줄기 세포주 SA002의 완성 내배엽으로의 분화를 보여준다. 표시된 조건으로 5일 동안 세포를 처리하였으며 유전자 발현은 패널에 표시된 유전자에 대해 실시간 PCR에 의해 결정하였다.
<도 45>
도 45는 100 ng/㎖ 액티빈 A 처리 (패널 a), 100 ng/㎖ 액티빈 A + 20 ng/㎖ Wnt-3a (패널 b), 또는 100 ng/㎖ 액티빈 A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX (패널 c)로 처리한 후, 계대 38의 인간 배아 줄기 세포주 SA002에서 FACS에 의해 CXCR4의 발현을 보여준다. 세포를 5일 동안 처리하였다.
<도 46>
도 46은 인간 혈청으로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 계대 55의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 완성 내배엽으로의 분화를 보여준다. 표시된 조건으로 세포를 처리하였으며 유전자 발현은 패널에 표시된 유전자에 대해 실시간 PCR에 의해 결정하였다.
<도 47>
도 47은 매트리젤™로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 P54의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 배양물의 완성 내배엽으로의 분화를 보여준다. 다양한 GSK-B 억제제의 효과를 5-일간의 DE 프로토콜 후 시험하였다. 하기 GSK-3B 억제제를 처음 2일의 처리 동안 100 nM에서 평가하였다: GSK-3B VIII, IX, XI, 및 XII.
<도 48>
도 48은 배양되고 처음 2일의 처리 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a의 존재하에서 실시예 4에 개시된 방법에 따라 처리된, 계대 49의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에서 AFP (패널 a), Pdx-1 (패널 b), Cdx-2 및 Glut-2 (패널 c) 및 HNF-3베타, HNF-6 및 소마토스타틴 (패널 d)의 발현을 보여준다. 처리 후, 추가 3일 동안 세포를 2% FBS + 1μM 레틴산, 0.1 내지 1μM TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 아로티노이드 산), 또는 0.1-10μM AM-580 (4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복스아미도]벤조산)으로 처리하였다. 이어서 추가 3일 동안 세포를 2% FBS + 20 ng/㎖의 bFGF에서 처리하였다.
<도 49>
도 49는 표시된 시간과 농도에 있어서 액티빈 A와 Wnt-1로 처리된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 배양물에서 패널 a와 b에서 표시된 완성 내배엽 마커들의 발현의 실시간 PCR 결과를 보여준다.
<도 50>
도 50은 DMEM/F12 또는 DMEM-저 글루코스에서 췌장 내배엽 세포를 처리하는 것에 의해 형성된 췌장 내분비 세포의 배양물에서 인슐린 (패널 a) 및 글루카곤 (패널 b) mRNA 발현을 도시한다. 예시된 데이터는 별도의 두 실험으로부터 관찰된 결과이다.
<도 51>
도 51은 DMDM-저 글루코스 (패널 a), DMEM/F12 (패널 b)에서 처리된 세포에서 면역세포화학적 방법에 의해 결정되는 인슐린 발현을 도시한다. 패널 c는 PDX-1과 인슐린의 공동-염색을 보여준다..
<도 52>
도 52는 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터 유래되는 췌장 내분비 세포에서의 유전자 발현에 대한 글루코스 농도의 효과를 보여준다. 유전자는 패널에서 식별되어 있다.
<도 53>
도 53은 2, 10 및 20 mM 글루코스에서 형성되는 췌장 내분비 세포로부터의 c-펩티드 방출을 보여준다. 세포를 IBMX 또는 20 mM 글루코스로 자극하였다.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가-재생하고 분화하여 자가-재생 조상세포(progenitors), 비-재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cells)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가 재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
다양한 용어가 배양 중인 세포를 설명하기 위하여 사용된다. "유지"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어질 수도 있고 이어지지 않을 수도 있다. "계대"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 세포를 하나의 배양 용기로부터 꺼내어 이 세포를 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.
세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양물, 즉, 조직으로부터의 세포의 단리 후 첫 번째 배양물은 P0으로 표기된다. 첫 번째 계대배양(subculture) 후, 세포를 2차 배양물(P1 또는 계대 1)로서 기재한다. 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대들 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기질, 배지, 성장 조건, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 의존적이다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대해 양성(positive) 유전자 발현을 가진 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix 유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(eomesodermin) (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, HNF-3베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽"은 낭배형성동안 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관 및 그 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구스코이드, c-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "배아외 내배엽"은 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin).
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, 또는 FGF4.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra- 1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재한다면)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사(미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 현상함으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체(embryoid bodies)의 형성 및 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정할 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 그러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양 세포의 부재하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 아텐스 소재의 브레사젠(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 루비노프(Reubinoff) 등 (문헌[Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]) 및 톰슨등 (문헌[Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147])은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 이용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등, (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다. "라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다."
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/㎖의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다. "고 서술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 서술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드(NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 매트리젤(등록상표)(벡톤 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특징들은 접종 분포에 대해 신중한 주의를 기울이는 것으로부터 이익을 얻으며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화
본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FoxD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX-17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004 )]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 만능 줄기 세포는 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에 만능 줄기 세포를 도말하고, 이어서 소정 기간 동안 혈청을 함유한 제1 배양 배지에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 대략 다른 기간 동안 더 큰 농도의 혈청을 함유한 제2 배양 배지에서 액티빈 A를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
상기에 개시된 제1 배양 배지에서 혈청의 농도는 약 0 내지 약 0.5%일 수 있으며, 배양 시간은 약 1 내지 약 3일일 수 있다. 상기에 개시된 제2 배양 배지에서 혈청의 농도는 약 0.5% 내지 약 2%일 수 있으며, 배양 시간은 약 1 내지 약 4일일 수 있다.
본 발명의 대안적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에 만능 줄기 세포를 도말하고, 이어서 소정 기간 동안 혈청을 함유한 제1 배양 배지에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 대략 다른 기간 동안 더 큰 농도의 혈청을 함유한 제2 배양 배지에서 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
상기에 개시된 제1 배양 배지에서 혈청의 농도는 약 0 내지 약 0.5%일 수 있으며, 배양 시간은 약 1 내지 약 3일일 수 있다. 상기에 개시된 제2 배양 배지에서 혈청의 농도는 약 0.5% 내지 약 2%일 수 있으며, 배양 시간은 약 1 내지 약 4일일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에 만능 줄기 세포를 도말하는 단계, 및
b. 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하는 것은 단일 배양 배지에서 실시될 수 있다. 대안적으로, 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하는 것은 별도로 또는 함께 하나보다 많은 배양 배지에서 실시될 수 있다. 일 실시 형태에서, 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하는 것은 두 가지의 배양 배지에서 실시된다.
세포외 매트릭스
본 발명의 일 태양에서, 만능 줄기 세포는 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 분화된다. 세포외 매트릭스는 생쥐 육종 세포로부터 추출된 가용화된 기저막 제제일 수 있다(상표명 매트리젤로 BD 바이오사이언시즈(Biosciences )에서 판매함). 대안적으로, 세포외 매트릭스는 성장 인자-감소된 매트리젤일 수 있다. 대안적으로, 세포외 매트릭스는 피브로넥틴일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 혈청으로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 분화된다.
세포외 매트릭스는 조직 배양 기재를 코팅하기 전에 희석될 수 있다. 세포외 매트릭스를 희석하고 조직 배양 기재를 코팅하기 위한 적합한 방법의 예는 문헌[Klei nMan, H.K., et al., Biochemistry 25:312 (1986)],및 문헌[Hadley, M.A., et al., J.Cell.Biol. 101:1511 (1985)]에서 찾을 수 있다.
일 실시 형태에서, 세포외 매트릭스는 매트리젤이다. 일 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:10 희석의 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:15 희석의 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:30 희석의 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:60 희석의 매트리젤로 코팅된다.
일 실시 형태에서, 세포외 매트릭스는 성장 인자-감소된 매트리젤이다. 일 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:10 희석의 성장 인자-감소된 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:15 희석의 성장 인자-감소된 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:30 희석의 성장 인자-감소된 매트리젤로 코팅된다. 대안적 실시 형태에서, 조직 배양 기재는 1:60 희석의 성장 인자-감소된 매트리젤로 코팅된다.
단일 배양 배지를 이용한, 세포외 매트릭스 상에서의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화
단일 배양 배지가 사용될 때, 배지는 완성 내배엽으로의 만능 줄기 세포의 분화를 허용하기에 충분히 낮은 농도의 소정의 인자들, 예를 들어, 인슐린 및 IGF를 함유해야 한다(국제특허 공개 WO2006020919호에 개시된 바와 같음). 이것은 혈청 농도를 낮추거나, 또는 대안적으로 인슐린과 IGF가 결핍된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스(Wiles) 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.
배양 배지는 약 0% 내지 약 10% 범위의 혈청 농도를 가질 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 0% 내지 약 5% 범위일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 0% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 2%일 수 있다.
액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 배양하는 시간은 약 1 내지 약 7일 범위일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 배양 시간은 약 1 내지 약 3일 범위일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 배양 시간은 약 3일일 수 있다.
액티빈 A는 만능 줄기 세포의 분화를 야기하기에 적합한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
Wnt 리간드의 선택은 분화 과정의 효율을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1000 ng/㎖의 농도일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다.
단일 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX 및 GSK-3B 억제제 XI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX이다.
GSK-3B 억제제로 만능 줄기 세포를 배양할 경우, GSK-3B 억제제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 nM일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 GSK-3B 억제제를 이용하여 배양된다.
단일 배양 배지는 또한 만능 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 형성하는 것을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디(mimetobody), 엑센딘(Exendin)-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (미국 캘리포니아주 소재의 이엠디(EMD)), N2 및 B27 보충물(미국 캘리포니아주 소재의 깁코), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민(미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 딕코프(Dickkopf) 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(islet neogenesis-associated protein)(INGAP), 인디안 헤지호그(Indian hedgehog), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog), 프로테아좀 억제제, 노치(notch) 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241), 및 일차 또는 형질전환 내피 세포로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
두 가지 배양 배지를 이용한, 세포외 매트릭스 상에서의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화는 두 가지 배양 배지를 이용하여 액티빈 A 및 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 만능 줄기 세포의 분화는 하기와 같이 달성될 수 있다:
a. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에 만능 줄기 세포를 도말하고,
b. 제1 배양 배지에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양하고,
c. 제2 배양 배지에서 액티빈 A를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양함.
제1 배양 배지는 저 농도의 혈청을 함유할 수 있으며, 제2 배양 배지는 제1 배양 배지보다 더 높은 농도의 혈청을 함유할 수 있다.
제2 배양 배지는 Wnt 리간드를 함유할 수 있다.
제1 배양 배지: 제1 배양 배지는 만능 줄기 세포가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화되도록 하기에 충분히 낮은 농도의 소정의 인자들, 예를 들어, 인슐린 및 IGF를 함유해야 한다(국제특허 공개 WO2006020919호에 개시된 바와 같음). 이것은 혈청 농도를 낮추거나, 또는 대안적으로 인슐린과 IGF가 결핍된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스(Wiles) 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.
제1 배양 배지에서는 제2 배양 배지에 비하여, 더 낮은 농도의 혈청이 있을 수 있다. 제2 배양 배지에서 혈청 농도를 증가시키면 세포의 생존을 증가시키거나, 또는 대안적으로는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 10% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 1% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0.5%일 수 있다.
적어도 두 가지의 배양 배지를 이용하여 액티빈 A와 Wnt 리간드를 이용하여 만능 줄기 세포를 배양할 때, 제1 배양 배지에서의 배양 시간은 약 1 내지 약 3일 범위일 수 있다.
액티빈 A는 만능 줄기 세포의 분화를 야기하기에 적합한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
Wnt 리간드의 선택은 분화 과정의 효율을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1000 ng/㎖의 농도일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다.
제1 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 제1 배양 배지에, 제2 배양 배지에, 또는 제1 및 제2 배양 배지 둘 모두에 첨가될 수 있다.
GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX 및 GSK-3B 억제제 XI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX이다.
GSK-3B 억제제로 만능 줄기 세포를 배양할 경우, GSK-3B 억제제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 nM일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 GSK-3B 억제제를 이용하여 배양된다.
제1 배양 배지는 또한 만능 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), N2 및 B27 보충물(미국 캘리포니아주 소재의 깁코), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민(미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
제2 배양 배지: 제2 배양 배지는 배양된 세포의 생존을 촉진하기에 충분한 농도로, 소정의 인자들, 예를 들어, 인슐린 및 IGF(국제특허 공개 제WO2006020919호에 개시된 바와 같음)를 함유해야 한다. 이것은 혈청 농도를 증가시키거나, 또는 대안적으로, 제1 배양 배지에 비하여 인슐린과 IGF의 농도가 증가된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스(Wiles) 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.
보다 높은 농도의 혈청을 가진 제2 배양 배지에서는, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5% 내지 약 10% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5 % 내지 약 5% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 2% 일 수 있다. 제2 배양 배지로 만능 줄기 세포를 배양할 경우, 배양 시간은 약 1 내지 약 4일 범위일 수 있다.
제1 배양 배지와 유사하게, 액티빈 A는 만능 줄기 세포의 분화를 야기하기에 적합한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1000 ng/㎖의 농도일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖일 수 있다.
Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
제2 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 제1 배양 배지에, 제2 배양 배지에, 또는 제1 및 제2 배양 배지 둘 모두에 첨가될 수 있다.
GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX 및 GSK-3B 억제제 XI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX이다.
GSK-3B 억제제로 만능 줄기 세포를 배양할 경우, GSK-3B 억제제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 nM일 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 GSK-3B 억제제를 이용하여 배양된다.
제1 배양 배지와 유사하게, 제2 배양 배지는 또한 만능 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), N2 및 B27 보충물(미국 캘리포니아주 소재의 깁코), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민(미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 따르기 전과 후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
분화의 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯(Northern blots), 원위치 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면(sectioned) 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포분석(flow cytometry analysis, FACS) (예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는 데 유용한 항체의 예는 표 IA에 열거된다. 표 IA에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
본 발명의 방법으로 만능 줄기 세포를 처리한 후, 분화된 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 그 기간은 약 1 내지 약 6일일 수 있다.
본 발명의 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산으로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 그 기간은 약 1 내지 약 3일일 수 있다. 그 후 레틴산이 제거되고 당해 세포는 추가의 기간 동안 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리된다. 그 기간은 약 1 내지 약 3일일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및
b. 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하는 단계를 포함한다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1 내지 약 6일 동안 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 6일 동안 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리된다.
적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자는 FGF-2, FGF-4 및 FGF-10로 이루어진 군으로부터 선택된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
대안적 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계,
b. 레틴산으로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하는 단계, 및
c. 레틴산을 제거하고 그 후 상기 세포를 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리하는 단계를 포함한다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1 내지 약 3일 동안 레틴산으로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 3일 동안 레틴산으로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1 내지 약 3일 동안 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 3일 동안 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리된다.
적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자는 FGF-2, FGF-4 및 FGF-10로 이루어진 군으로부터 선택된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산으로 처리된다. 대안적으로, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 FGF-2로, 또는 대안적으로 FGF-4로, 또는 대안적으로 FGF-10으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 인자 중 적어도 하나로 처리된다: 레틴산, FGF-2, FGF-4 또는 FGF-10. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산 및 하기 섬유아세포 성장 인자 중 적어도 하나로 처리된다: FGF-2, FGF-4 또는 FGF-10. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산 및 FGF-2로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산 및 FGF-4로 처리된다. 추가 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 레틴산 및 FGF-10으로 처리된다.
레틴산은 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 레틴산은 1 μM의 농도로 사용된다.
FGF-2는 약 50 pg/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-2는 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
FGF-4는 약 50 pg/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-4는 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
FGF-10은 약 50 pg/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-10은 50 ng/㎖의 농도로 사용된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자로 처리될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), N2 및 B27 보충물(미국 캘리포니아주 소재의 깁코), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민(미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화의 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포분석(FACS) (예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는 데 유용한 항체의 예는 표 IA에 열거된다. 표 IA에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자는 노치 세포외 수용체에 대한 길항제일 수 있다. 대안적으로, 상기 인자는 노치 수용체의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 대안적으로, 상기 인자는 세포내의 노치 신호 전달 경로에서 요소를 억제하거나 요소의 길항제일 수 있다.
일 실시 형태에서, 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자는 γ-시크리타아제(secretase) 억제제이다. 일 실시 형태에서, γ-시크리타아제 억제제는 1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-펜에틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-하이드로지-5-페닐펜틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르이며, 이는 L-685,458로도 알려져 있다.
L-685,458은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 90 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 80 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 70 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 60 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 50 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 40 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 30 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 20 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 10 μM의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및
b. 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 상기 세포를 처리하는 단계를 포함한다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자는 γ-시크리타아제 억제제이다. 일 실시 형태에서, γ-시크리타아제 억제제는 1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-펜에틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-하이드로지-5-페닐펜틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르이며, 이는 L-685,458로도 알려져 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 약 1 내지 약 5일 동안 처리된다. 대안적으로, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 약 3 내지 약 5일 동안 처리된다. 대안적으로,췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 약 5일 동안 처리된다.
일 실시 형태에서, 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자는 γ-시크리타아제 억제제이다. 일 실시 형태에서, γ-시크리타아제 억제제는 1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-펜에틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-하이드로지-5-페닐펜틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르이며, 이는 L-685,458로도 알려져 있다.
L-685,458은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 90 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 80 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 70 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 60 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 50 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 40 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 30 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 20 μM의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 10 μM의 농도로 사용된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자로 처리될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), N2 및 B27 보충물(미국 캘리포니아주 소재의 깁코), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민(미국 캘리포니아주 소재의 이엠디), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 개선된 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및
b. 약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도의 글루코스를 함유하는 배지에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시킬 수 있는 인자로 세포를 처리하는 단계를 포함한다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시킬 수 있는 임의의 방법이 본 발명의 개선에 적합하다.
일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 10 mM의 농도의 글루코스를 함유하는 배지에서 처리된다. 대안적인 실시 형태에서, 세포는 약 20 mM의 농도의 글루코스를 함유하는 배지에서 처리된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 2 내지 약 30일 동안 처리된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 2 내지 약 20일 동안 처리된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 2 내지 약 10일 동안 처리된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 10일 동안 처리된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 4일 동안 처리된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 2일 동안 처리된다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN-3, NeuroD, Islet-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업계에 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징적인 추가 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 β-세포 계통의 특징적인 특성을 획득했는지를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. β 세포 계통 특이적 특징은 예를 들어, 다른 것들 중에서도 Pdx1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3베타, 및 MafA와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에서 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002))]을 참고한다.
분화의 효율은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화의 효율은 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅, 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포분석(FACS) (예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는 데 유용한 항체의 예는 표 IA에 열거된다. 표 IA에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
치료법
일 태양에서, 본 발명은 제I형 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약학 제제 또는 생물활성제로 추가로 처리될 수 있다. 이들 제제는 예를 들어 다른 것들 중에서도 인슐린, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 구체적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수령체 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.
완성 내배엽 세포 또는 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥내로 주입될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 캡슐화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 성장 인자는 생체 내에서투여된 세포를 분화시키기 위해 사용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되어 원위치에서 투여된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료법에 대한 반응을 비롯한 다양한 많은 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 시험관 내에서 배양된 세포를 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 단계를 포함한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약학 제제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.
약학 제제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약학 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약학 제제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약학 제제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,509,369호에 개시된 화합물과 같은 항염증 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입된다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 성장 인자, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II) 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
스캐폴드(scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]). 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)]). 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양(Yang) 등은 원심분리 세포 고정화(Centrifugational Cell Immobilization, CCI)로 불리는 세포 접종 방법을 개발하였다 (문헌[J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]).
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
배경기술
실시예 1
인간 배아 줄기 세포 배양
인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9를 위셀 리서치 인스티튜트, 인크.(WiCell Research Institute, Inc.)(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 넉아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐(Invitrogen)/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타 메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포 상에서 배양하였다. E13 내지 13.5 생쥐 배아로부터 유래된 MEF 세포를 찰스 리버로부터 구매하였다. MEF 세포를 10% FBS (하이클론), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM 배지에서 확장시켰다. 서브-융합성 MEF 세포 배양물을 3시간 동안 10 ㎍/㎖ 마이토마이신 C (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하고 0.1% 소과 젤라틴-코팅된 디쉬에 2x104/㎠로 도말하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양 세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양 세포층 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 융합성일 때(도말 후 약 5-7일), 인간 배아 줄기 세포를 5-10분 동안 1 ㎎/㎖의 제IV형 콜라게나아제 (인비트로겐/깁코)로 처리하고 이어서 5 ㎖ 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분 동안 900 rpm에서 회전시키고, 펠렛을 재현탁시키고 신선한 배양 배지에서 1:3 내지 1:4 비의 세포로 재도말하였다.
실시예 2
완성 내배엽 세포의 형성
완성 내배엽의 마커의 발현에 대한 액티빈 A의 효과를 조사하였다. 액티빈 A (100 ng/㎖)를 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 집단에 첨가하였다. 액티빈 A의 존재하에서 세포를 연속하여 배양하고 표시된 시간에 수확하였다. 완성 내배엽 마커의 발현 수준을 PCR (도 1), FACS (표 II에 결과가 요약됨), 및 면역조직화학(도 2)에 의해 조사하였다.
액티빈 A는 H9 세포주에서 CXCR4, GATA4, HNF-3베타, Mixl1 및 Sox-17 mRNA의 발현에서 시간-의존적 증가를 야기하였다(도 1, 패널 a). 전방 내배엽 마커들인 세르베루스, Otx-1 및 Hex 유전자의 유의한 상향 조절이 또한 관찰되었다(도 1, 패널 b). CXCR4 단백질의 증가를 액티빈 A 처리 후 FACS 분석에 의해 관찰하였다. E-카드헤린 및 N-카드헤린의 발현은 액티빈 A 처리 후 변하지 않았다(표 IIA). CXCR4 양성 세포는 또한 고도로 C-kit, EPCAM, CD99에 대해 양성이었으며, CD9에 대해서는 음성이었다. 이들 마커의 발현 패턴은 조사된 모든 세 가지 hES 세포주에서 일치하였다(H7에 대해서는 표 IIB 그리고 H1에 대해서는 표 IIC). 5일 동안 액티빈 A로 처리된 세포에서 실시된 면역세포화학적 방법은 처리된 배양물에서 30-40% 세포가 Sox17 및 HNF-3베타에 대해 양성임을 밝혔다. 이와 함께, 분화된 세포의 거의 100%가 여전히 Oct4 양성이었다(도 2). 완성 내배엽 마커의 발현에서의 증가와 조합된, 만능성의 표면 마커의 발현에서의 감소에 의하면, 이들 데이터는 액티빈 A가 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화를 촉진함을 시사한다.
실시예 3
췌장 내배엽 세포의 형성
인간 배아 줄기 세포의 췌장 내배엽으로의 분화를 유도하는 것으로 알려진 성장 인자를 세포 배양물에 첨가하였다. 구체적으로, 췌장 내배엽의 형성을 유도하는 것으로 알려진 액티빈 A, bFGF, 및 레틴산을 세포 배양물에 첨가하였다.
첫 번째 실험 시리즈에서, 액티빈 A를 0% 내지 2% 혈청 및 액티빈 A(100 ng/㎖)로 보충된 DMEM/F12에서 최대 7일 동안 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 집단에 첨가하였다. 세포를 도 3에 표시된 시점에서 수확하고 나타난 유전자들의 발현에 대해 PCR에 의해 분석하였다(도 3, 4 및 5). 도 3에서, PCR 분석은 액티빈 처리된 세포가 GATA4 (도 3, 패널 a), Sox-17 (도 3, 패널 b), HNF-3베타 (도 3, 패널 c), 및 Mixl-1 (도 3, 패널 d)을 비롯한 내배엽 발생과 관련된 광범위한 유전자들을 발현하였음을 나타냈다. 그러나, Pdx1 유전자 발현은 관찰되지 않았다. 내배엽 계통 마커의 동일한 발현 패턴이 액티빈 A 처리된 H7 세포에서 관찰되었다(도 6, 패널 a 내지 f). 이 단계에서, Oct4 발현의 유의한 감소는 없었다.
액티빈 A는 배아외 내배엽 마커인 Sox7 (도 4, 패널 a) 및 AFP (도 4, 패널 b)의 발현에서 시간-의존적 감소를 야기하였다. 액티빈 A는 브라키우리의 발현을 감소시켰으나 (도 5, 패널 a) 신경 마커 Zic1의 발현에는 영향을 주지 않았다 (도 5, 패널 b).
종합하면, 이들 데이터는 Sox-17, Mixl1, Gata4, 및 HNF-3베타의 발현 증가가 전방 내배엽 마커 Otx1, Cer1 및 Hex 유전자의 상향조절과 함께, 액티빈 A 처리에 대하여 반응하여 완성 내배엽이 형성되는 것에 상응함을 시사한다. 면역세포화학에 의한 완성 내배엽 마커의 분석은 이들 유전자에 대한 단백질 발현이 또한 mRNA 발현에서 관찰된 경향을 반영함을 밝혔다. HNF-3베타, Sox-17, 및 GATA4에 대한 발현 수준은 미처리 세포에서는 낮아서, 모든 세포의 약 10 내지 20%였다. 5일 동안의 액티빈 A (100 ng/㎖) 처리는 HNF-3베타, Sox-17, 및 GATA4의 발현을 모든 세포의 약 50% 내지 90%로 증가시켰다 (도 7).
두 번째 실험 시리즈에서는, 인간 배아 줄기 세포의 배양물을 실시예 1에 개시된 방법에 따라 2-3일 동안 미분화 배양 조건에서 유지하였다. 세포가 70-80% 융합성이 된 후, 100 ng/㎖의 액티빈 A가 첨가된, 0 내지 2% FBS를 가진 DMEM/F12로 배지를 바꾸고 3일, 5일 또는 7일 동안 액티빈 A의 존재하에서 배양하였다. 이 시간 간격 후에, 이어서 도 8에 나타낸 바와 같이 레틴산과 bFGF의 조합으로 5 내지 6일 동안 세포를 추가로 처리하였다. 배양물을 수확하고 mRNA의 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 5일 동안 액티빈 A만으로 처리된 세포로 이루어진 대조 배양물을 또한 포함시켰다.
유전자 발현 분석은 액티빈 A 또는 레틴산 단독은 Pdx1의 발현을 유도하지 않았음을 밝혔다. 유사한 결과가 액티빈 A의 존재하에서 FGF와 조합된 레틴산으로 처리된 세포 배양물에서 관찰되었다 (도 8, 패널 a). 그러나, 액티빈 A의 부재하에서 레틴산과 FGF로 세포를 처리하면 Pdx1의 발현이 여전히 더 증가되었다 (도 8, 패널 a). 액티빈 A로 3일 동안 처리되고, 이어서 액티빈 A의 부재하에서 1 μM 레틴산 및 50 ng/㎖ bFGF (FGF-2로도 알려짐)로 5일 동안 처리된 세포는 5일 동안 단지 액티빈 A로 처리된 샘플에서 관찰된 것보다 약 3500-배 더 높은 Pdx1 발현 수준을 나타냈다 (도 8, 패널 a). 면역세포화학은 모든 세포의 5 내지 20%가 Pdx1을 발현함을 보여주었다 (도 9).
액티빈 A의 부재하에서 1 μM 레틴산과 bFGF로 처리하면 또한 GLUT-2 및 PTF1a의 발현 증가를 야기하였으며 (도 8, 패널 c) 이러한 증가는 액티빈 A만의 존재하에서 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. GLUT-2 및 PTF1a의 발현에서의 최대 증가는 1 μM 레틴산과 50 ng/㎖ bFGF로 처리된 세포에서 관찰되었다. 종합하면, 이들 데이터는 췌장 내배엽의 형성이 완성 내배엽이 형성된 후 세포 배양물로부터 액티빈 A를 제거함으로써 더 향상됨을 시사한다.
실시예 4
췌장 내분비 세포의 형성
인간 배아 줄기 세포의 배양물을 실시예 1에 개시된 방법에 따라 3-4일 동안 미분화 배양 조건에서 유지하였다. 세포가 50-60% 융합성이 된 후, 배지를 100 ng/㎖의 액티빈 A를 함유한, FBS가 없는 DMEM/F12로 바꾸고, 세포를 하루 동안 이 배지에서 배양하였다. 하루 배양 후, 배지를 제거하고 100 ng/㎖ 액티빈 A를 가진 0.5% FBS를 함유하는 배지로 대체하고, 세포를 하루 동안 배양하였다. 두 번째 하루 배양 후, 배지를 제거하고 100 ng/㎖ 액티빈 A를 가진 2% FBS를 함유하는 배지로 대체하고, 세포를 하루 동안 배양하였다. 이 시간 간격 후, 실시예 2에 약술된 바와 같이 레틴산과 FGF의 조합으로 6일 동안 세포를 처리하고, 이어서 배양 배지를 제거하고 γ-시크리타아제 억제제 L-685,458를 10 μM 로 함유한, 2% FBS를 가진 DMEM/F12를 포함한 배지로 3일 동안 대체하였다. 배양물을 수확하고 mRNA 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 5일 동안 액티빈 A만으로 처리된 세포로 이루어진 대조 배양물을 또한 포함시켰다.
유전자 발현 분석에 의하면 단독의 또는 레틴산 및 FGF와 조합된 액티빈 A는 Ngn3 또는 인슐린의 발현을 유도하지 않았음이 밝혀졌다 (도 10, 패널 a, c). Hes-1 발현의 감소가 또한 L- 685,458로 처리한 후 관찰되었다. 최대 억제는 처리 후 3일에 관찰되었다(도 10, 패널 d). 그러나, L-685,458로 세포를 처리하면 액티빈 A 단독 또는 FGF를 포함하는 레틴산과 조합된 액티빈 A로 처리된 샘플에서 관찰된 것보다 약 50배 더 높은 수준으로 Ngn3의 발현을 유도하였다. 인슐린 발현의 70-배 증가는 γ-시크리타아제 억제제로 처리된 샘플에서 관찰되었다. 뉴로D1 발현이 또한 L-685,458 처리에 의해 추가로 증가하였다(도 10, 패널 a). 종합하면, 이들 데이터는 내분비 세포의 형성이, 췌장 내배엽이 형성된 후 세포 배양물로부터 레틴산과 FGF를 제거하고 γ-시크리타아제 억제제를 첨가함으로써 추가로 향상됨을 시사한다.
실시예 5
Nkx2.2를 발현하는 췌장 내분비 세포의 형성
실시예 2에 약술된 방법에 따라 얻은 완성 내배엽 세포를 하기와 같이 처리하였다: 세포를 2% FBS + 50 ng/㎖ 액티빈 A를 가진 DMEM/F12, 50 ng/㎖ 염기성 FGF 및 1 μM 의 레틴산을 포함하는 기본 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하였다. 세포를 단독의 또는 bFGF를 포함하는, 1 μM의 레틴산을 가진 기본 배지에서 추가로 3 내지 5일 동안 연속하여 배양하였다. 이 과정을 따라 다양한 시점에서 RNA 샘플을 세포로부터 수확하여 세포의 유도된 분화를 평가하는 것을 도왔다. 또한, 배양 배지 및 인자들을 분화 프로토콜 전체에 걸쳐 규칙적으로 제거하고 재충전하였다. 액티빈 A의 첨가는 액티빈 A가 없는 샘플에 비하여 Nkx2.2 발현이 약 35배 증가함을 보여주었다. 처음 3일의 배양 동안 액티빈 A로 처리된 샘플은 액티빈 A를 함유하지 않은 샘플과 유사한 수준에서 Pdx1 발현을 유지하였다(도 11). 종합하면, 이들 데이터는 췌장 내분비 마커 Nkx2.2의 발현이 레틴산과 bFGF의 처리의 처음 3일에 액티빈 A를 첨가함으로써 추가로 향상됨을 시사한다.
실시예 6
배양 중인 췌장 내배엽 세포의 계대 및 확장
이 실시예는 인간 배아 줄기 세포로부터 유도된 췌장 내배엽 세포가 추가 분화 없이 세포 배양에서 유지되고 계대될 수 있음을 증명한다. 췌장 내배엽 세포를 저 혈청 DMEM/F12에서 100 ng/㎖ 액티빈 A의 존재하에서 분화시켰다. 저 혈청 DMEM/F12는 1일에 0% (v/v) 소과 태아 혈청 (FBS)을, 2일에 0.5 % (v/v) FBS를 그리고 그 후 매일 2% (v/v) FBS를 함유하였다. 4일의 분화 후에, 세포를 2% (v/v) FBS, 1 μM 레틴산 및 50 ng/㎖ bFGF를 함유한 저 혈청 DMEM/F12에서 추가로 총 6일 동안 배양하였다. 6일의 분화 후에, 세포를 50 ng/㎖ FGF10의 존재하에서 2%(v/v) FBS를 함유한 저 혈청 DMEM/F12에서 총 6일 동안 배양에서 유지하였다. 6일 배양 기간 동안, 췌장 내배엽 세포를 두 번 계대하였으며 세포 집단-배가(doubling) 시간은 이 6일 배양 동안 약 36 내지 48시간이다. 0, 3, 및 6일의 배양일에, Q-PCR을 이용하여 췌장 내배엽을 나타내는 마커 유전자들의 발현을 측정하였다. 도 12는 50 ng/㎖ FGF10의 존재하에서 성장한 세포가 그들의 유도 후 6일의 배양 기간 동안 췌장 내배엽 마커 Pdx1의 발현을 유지하였음을 보여준다.
실시예 7
인간 배아 줄기 세포로부터 간세포의 유도
인간 배아 줄기 세포의 배양물을 실시예 1에 개시된 방법에 따라 2-3일 동안 미분화 배양 조건에서 유지하였다. 세포가 70-80% 융합성이 된 후, 배지를 100 ng/㎖의 액티빈 A를 함유한 2% FBS를 가진 DMEM/F12로 바꾸고, 세포를 7일 동안 액티빈 A의 존재하에서 배양하였다. 액티빈 A로 처리한지 7일 후, 이어서 세포를 도 13에 나타낸 조건으로 5일 동안 처리하였다. 이 기간 후, 세포를 수확하고, 분석을 위해 mRNA 샘플을 수집하였다.
α-태아 단백질 (AFP) 및 알부민의 발현의 증가가 액티빈 A의 부재하에서 배양된 세포에 대해 관찰되었다(도 13, 패널 a). 이것은 레틴산과 FGF-4에 의해 추가로 증가되었다 (도 13, 패널 b). 종합하면, 이들 데이터는 인간 배아 줄기 세포의 배양물이 상기한 처리 후 간세포 마커를 발현할 수 있음을 시사한다. 더욱이, 인간 배아 줄기 세포는 간세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
실시예 8
H9 인간 배아 줄기 세포주의 특성화
미분화 ES 세포에 의해 발현된 몇몇 마커의 발현을 평가함으로써 H9 세포의 품질을 시간이 지남에 따라 모니터하였다(문헌[Carpenter et al., 2001; Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998a]). H9 세포는 단계-특이적 배아 항원의 역비례 발현을 나타냈다(표 III). H9 세포는 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, AP 및 CD9 항원에 대해 강한 면역반응성을 나타내며, 이들은 모두 미분화 인간 배아 줄기 세포의 특징이다.
예를 들어, OCT3/4, SOX-2, UTF-1, REX-1, Cx43, Cx45, ABCG-2 및 TERT와 같은 배아 줄기 세포의 특징적인 유전자의 발현을 평가하기 위하여 실시간 PCR을 실시하여, 이 실시예에서 성장한 세포가 앞서 개시한 미분화 배아 줄기 세포와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 III). OCT3/4 단백질 발현 및 알칼라인 포스파타아제 활성(케미콘(Chemicon))을 면역염색에 의해 확인하였다. 대다수의 H9 세포는 OCT3/4 및 AP에 대해 양성이었다 (도 14). 전체적으로, 이들 결과는 이 실시예에 사용된 H9 세포가 다른 실험실들로부터의 보고와 비교할 때 형태, 항원 면역염색, 또는 만능성 마커 발현에 있어서 유의하게 상이하지 않았음을 증명한다.
실시예 9
형광-활성화 세포 분류( Fluorescence - Activated Cell Sorting , FACS ) 분석
트리플(TrypLE)™ 익스프레스(Express) 용액(미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)을 이용하여 5분간 인큐베이션하여 배양 플레이트로부터 부착 세포를 제거하였다. 유리된 세포를 인간 배아 줄기 세포 배양 배지에 재현탁시키고 원심분리에 의해 회수하고, 이어서 세척하고 PBS 중의 2% BSA, 0.05% 소듐 아자이드로 이루어진 염색 완충액(미국 미주리주 소재의 시그마)에 세포를 재현탁시켰다. 적절할 경우, 세포를 0.1% γ-글로불린(시그마) 용액을 이용하여 15분 동안 Fc-수용체를 차단하였다. 분취물 (약 105개의 세포)을 표 I에 표시된 바와 같이, 피코에리티린(PE) 또는 알로피코시아닌(APC) 콘쥬게이션된 단일클론 항체 (5 ㎕의 항체/106개의 세포)와, 또는 비콘쥬게이션된 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 대조군은 적절한 아이소타입(isotype) 매치된 항체, 비염색 세포, 및 이차 콘쥬게이션 항체만으로 염색된 세포를 포함하였다. 항체를 이용한 모든 인큐베이션은 4℃에서 30분 동안 실시하였으며 그 후 세포를 염색 완충액으로 세척하였다. 비콘쥬게이션 일차 항체로 염색된 샘플을 이차 콘쥬게이션 PE 또는 -APC 라벨링된 항체로 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 이차 항체의 목록에 대해서는 표 I을 참고한다. 세척된 세포를 펠렛화하고 염색 완충액에 재현탁시키고, 세포 표면 분자를 FACS 어레이(Array) (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 기기를 사용하여 적어도 10,000 경우를 수집하여 확인하였다.
실시예 10
면역세포화학
0.1% 매트리젤 (BD) 코팅된 디쉬에 접종된 세포를 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포를 PBS/0.1%BSA/10% 정상 병아리 혈청 /0.5% 트리톤 X-100으로 실온에서 1시간 동안 차단하고 이어서 4℃에서 PBS/0.1%BSA/10% 정상 병아리 혈청 중의 일차 항체를 이용하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 일차 항체 및 그들의 작업 희석도의 목록을 표 IB에 나타낸다. PBS/0.1% BSA에서 세 번 세척 후, PBS에서 1:100으로 희석된 형광성 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하여 결합시켰다. 대조 샘플은 일차 항체가 생략되거나 또는 일차 항체가 일차 항체와 동일한 농도의 상응하는 매치되는 음성 대조 면역글로불린으로 대체된 반응물을 포함하였다. 염색된 샘플을 헹구었으며; 다이아미디노-2-페닐인돌, 2염산염(DAPI)을 함유한 프로롱(PROLONG)(등록상표)(미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 한 방울을 각 샘플에 첨가하여 핵을 대조-염색하고 빛바램-방지(anti-fade) 시약으로서 기능하도록 하였다. 니콘 컨포컬 이클립스(Nikon Confocal Eclipse) C-1 역상 현미경(일본 소재의 니콘) 및 10-60X 대물렌즈를 이용하여 이미지를 얻었다.
실시예 11
미분화 세포의 PCR 분석
RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성: 에탄올-함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카겔 막(알엔이지 미니 키트(Rneasy Mini Kit), 미국 캘리포니아주 소재의 퀴아젠)에 결합시킨 후 세척하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보(TURBO) DNA-프리(free) 키트(앰비온, 인크.(Ambion, INC))를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에서 용출시켰다. 수율과 순도는 분광 광도계에서 A260 및 A280 판독치에 의해 평가하였다. cDNA 카피(copy)는 에이비아이(ABI) (미국 캘리포니아주 소재의 에이비아이) 고용량 cDNA 아카이브 키트(high capacity cDNA archive kit)를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
실시간 PCR 증폭 및 정량 분석: 달리 명시되지 않으면, 모든 시약은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 구매하였다. 실시간 PCR 반응은 ABI 프리즘(PRISM)(등록상표) 7900 서열 탐지 시스템을 이용하여 실시하였다. 택맨(TAQMAN)(등록상표) 유니버살(UNIVERSAL) PCR 마스터 믹스(MASTER MIX)(등록상표) (미국 캘리포니아주 소재의 에이비아이)를 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 20 ㎕의 전체 반응 부피로 이용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 두벌씩 실행하여 피펫팅 오류에 대해 보정하였다. 프라이머와 FAM-라벨링된 택맨(등록상표) 프로브를 200 nM의 농도로 이용하였다. 각 표적 유전자의 발현 수준은, 어플라이드 바이오시스템에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH) 내인성 대조군을 이용하여 정상화하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 하기와 같이 열거된다: Oct3/4 (Hs00742896), SOX-2 (Hs00602736), UTF-1 (Hs00747497), Rex-1 (Hs00399279), 커넥신(Connexin) 43 (Hs00748445), 커넥신 45 (Hs00271416), ABCG2 (Hs00184979), Tert (Hs00162669), HNF 3β (Hs00232764), GATA-4 (Hs00171403), Mixl1 (Hs00430824), Sox7 (Hs00846731), AFP (Hs00173490), 브라키우리 (Hs00610080), GSC (Hs00418279_m1), Pdx-1 (Hs00426216), PTF1a (Hs00603586), Ngn3 (Hs00360700), 뉴로D1 (Hs00159598), 인슐린 (Hs00355773) 및 Glu2 (Hs00165775). Sox17 프라이머는 프라이머스(PRIMERS) 프로그램(미국 캘리포니아주 소재의 에이비아이)을 이용하여 디자인하였으며 하기 서열이었다: Sox17: TGGCGCAGCAGATACCA (서열 번호 1), AGCGCCTTCCACGACTTG (서열 번호 2) 및 CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG (서열 번호 3). 50℃에서 2분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안 초기 인큐베이션 후, 샘플을 두 단계로 40회 사이클링시켰다 - 95℃에서 15초 동안 변성화 단계, 이어서 60℃에서 1분 동안 어닐링/연장 단계. 데이터 분석은 진앰프(GENEAMP)(등록상표) 7000 서열 탐지 시스템 소프트웨어를 이용하여 실시하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 요약하면, 각각의 cDNA 샘플에 대하여, 내인성 대조 Ct 값을 관심있는 유전자의 Ct로부터 차감하여 델타 Ct 값 (ΔCt)을 얻었다. 증폭이 100% 효율이라고 가정하고, 표적의 정상화된 양을 2-ΔCt로서 계산하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 표현하였다.
실시예 12
핵형 분석
H9 세포의 핵형을 표준 G-밴딩 핵형 분석에 의해 결정하였다. 총 100개의 중기상 스프레드(metaphase spread)를 평가하였다(어플라이드 제네틱스 래보러토리즈, 인크.(Applied Genetics Laboratories, Inc.)). 염색체 이상은 분석된 100개의 세포에서 발견되지 않았다. 세포유전학적 분석은 세포가 정상적인 수의 상염색체와 46개의 모달 염색체(modal chromosome) 수를 가짐을 보여주었다. 도 15는 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터 얻은 전형적인 핵형을 도시한다.
실시예 13
세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서의 인간 배아 줄기 세포 배양
인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9를 위셀 리서치 인스티튜트, 인크.(WiCell Research Institute, Inc.)(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 넉아웃 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타 메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - 으로 이루어진 ES 세포 배지에서 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포 상에서 배양하였다. E13 내지 13.5 생쥐 배아로부터 유래된 MEF 세포를 찰스 리버로부터 구매하였다. MEF 세포를 10% FBS (하이클론), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM 배지에서 확장시켰다. 서브-융합성 MEF 세포 배양물을 3시간 동안 10 ㎍/㎖ 마이토마이신 C (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하고 0.1% 소과 젤라틴-코팅된 디쉬에 2x104/㎠로 도말하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양 세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양 세포층 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 융합성일 때(도말 후 약 5 내지 7일), 인간 배아 줄기 세포를 5 내지 10분 동안 1 ㎎/㎖의 제IV형 콜라게나아제 (인비트로겐/깁코)로 처리하고 이어서 5 ㎖ 유리 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분 동안 900 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 재현탁하고 성장 인자 감소된 매트리젤 ™ (BD 바이오사이언시즈)의 1:30 희석물로 코팅된 플레이트에 1:3 내지 1:4 비의 세포로 다시 도말하였다. 그 후 세포를 8 ng/㎖ bFGF 및 콜라게나아제로 보충된 MEF-조절된 배지에서 배양하고 적어도 5회 계대 동안 매트리젤 코팅된 플레이트 상에서 계대시켰다. 매트리젤™ 상에서 배양된 세포를 콜라게나아제 IV (인비트로겐/깁코), 디스파아제(Dispase) (비디 바이오사이언시즈) 또는 리베라아제(Liberase) 효소 (미국 인디애나주 소재의 로쉐(Roche))를 이용하여 일상적으로 계대시켰다.
실시예 14
세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (Dec 2005)]에 앞서 개시된 바와 같이 실시하였다. 요약하면, 약 60 내지 70% 융합성의 H9 배양물을 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM:/F12 배지에 2일 동안 노출시키고, 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. H9 세포를 1:30 내지 1:10 희석으로 성장 인자 감소된 매트리젤로 코팅된 플레이트 상에서 또는 1:30 내지 1:10 희석의 정규 매트리젤 상에서 배양하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 매트리젤로 코팅하였다.
5일째에, 배양물을 CXCR4, E-카드헤린, CD9, 및 N-카드헤린 발현에 대해 FACS에 의해, 그리고 SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질 (AFP), CXCR4, 브리키우리 (Bry), 구스코이드 (GSC), HNF-3 베타, 및 GATA4에 대해 실시간 PCR에 의해 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로 간주되는 한편, GATA4, HNF-3 베타 및 SOX-17은 완성 내배엽 마커를 나타내며, GSC, Bry, 및 CXCR4는 원시선의 마커를 나타낸다. 도 17은 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 나타낸다. 1:10 희석의 매트리젤로 코팅된 플레이트 상에서 배양된 세포에 의한 CXCR4의 발현은, 보다 낮은 농도의 매트리젤에 비하여 유의하게 증가하였다. 더욱이, 성장 인자 감소된 매트리젤은 정규 매트리젤에 비하여 완성 내배엽 세포의 형성에서 효과적이지 않았다.
도 18은 1:10 희석의 매트리젤로 코팅된 플레이트 상에서 배양된 세포가 1:30 희석의 매트리젤에서 배양된 세포에 비하여 완성 내배엽 마커의 유의한 상향조절을 나타냈음을 입증하는 실시간 PCR 결과를 보여준다.
실시예 15
완성 내배엽 형성 후 인간 배아 줄기 세포에서의 유전자 발현 변화의 마이크로어레이 분석
알엔이지(RNeasy) 미니 키트(퀴아젠)를 이용하여 하기의 인간 배아 줄기 세포 배양물로부터 전체 RNA를 단리하였다: 매트리젤-코팅된 플레이트 상에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출된 후 추가 3일 동안 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 처리된 H9P83 세포; MEF에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출된 후 추가 3일 동안 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지로 처리된 H9P44 세포. 각 군을 위한 대조군은 매트리젤-코팅된 디쉬에 도말되고 MEF-조절된 배지에서 배양된 세포 또는 MEF 상에 도말되고 ES 배지에서 배양된 세포를 포함하였다.
샘플 준비, 혼성화, 및 이미지 분석은 아피메트릭스 휴먼 게놈 U133 플러스 2.0 어레이에 따라 실시하였다. 정상화 및 로그 환산 후, 데이터 분석을 옴니비즈(OmniViz)(등록상표) 소프트웨어(미국 매사추세츠주) 및 진시프터(GENESIFTER) (미국 워싱턴주 소재의 비즈랩스(VizXLabs))를 이용하여 실시하였다. 각각의 처리 내에서 그리고 상이한 처리들 사이에서의 변이도를 피어슨(Pearson) 상관 계수를 이용하여 비교하였다. 세포주들 사이의 상관 계수와 함께 상이한 처리들 사이의 유전자 발현 프로파일에서의 변이가 도 19에 도시된다. 샘플들 사이에서 유전자 발현의 유의한 차이를 변이의 분석 및 0.05 이하의 조정된 P-값(벤자미니 및 호치버그 보정(Benjamini and Hochberg correction))을 이용한 F-검정을 이용하여 평가하였다. 프레즌트 콜(present call)을 가진 유전자만을 분석에 포함시켰다. 표 IV는 다양한 샘플 사이에서 적어도 5배의 차이로 차등적으로 발현되는 유전자를 열거한다. 각 유전자에 대한 평균치의 표준 오차(SEM)와 함께 유의하게 발현되는 유전자들의 정상화된 강도 값이 열거된다.
실시예 16
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (Dec 2005)]에 앞서 개시된 바와 같이 실시하였다. 요약하면, 약 60 내지 70% 융합성의 성장 인자 감소 매트리젤™ (1:30 희석) 배양물에 접종된 H9, H7 또는 H1 세포를 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알엔디 시스템즈(R&D Systems))로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 달리 표시되지 않으면 모든 후속 실시예에서, 이 처리 요법은 완성 내배엽(DE) 프로토콜로 불릴 것이다.
이와 함께, MEF 영양 세포 상에서 배양된 H9, H7, 또는 H1 세포를 또한 상기에 약술한 동일한 DE 프로토콜에 노출시켰다.
5일째에, 배양물을 CXCR4, E-카드헤린, CD9, CD99, 및 N-카드헤린(CD56) 발현에 대해 FACS에 의해, 그리고 SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질 (AFP), CXCR4, 브리키우리 (Bry), 구스코이드 (GSC), HNF-3 베타, 및 GATA4에 대해 실시간 PCR에 의해 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로 간주되는 한편, GATA4, HNF-3 베타 및 SOX-17은 완성 내배엽 마커를 나타내며, GSC, Bry, 및 CXCR4는 원시선의 마커를 나타낸다.
생쥐 영양 세포 상에서 배양되고 DE 프로토콜에 노출된 H-주는 FACS에 의하면 강한 DE 마커의 발현 및 CXCR4의 발현으로 이어졌다(도 20). 또한 DE 프로토콜로 처리한 후 E-카드헤린의 발현에서 유의한 감소가 있었다. 마지막으로, CXCR4+ 집단은 또한 CD117에 대해 양성 염색되었다. 도 21은 미처리 H7 (도 21, 패널 a) 및 H9 세포 (도 21, 패널 b)에 비하여 완성 내배엽 마커의 유의한 상향조절을 나타낸다.
MEF 영양 세포 상에서 배양된 H-주와 달리, 매트리젤™ (1:30 희석) 상에서 배양되고 완성 내배엽 프로토콜로 처리된 H-주는 완성 내배엽 마커의 강한 발현을 나타내지 못했다. 구체적으로, FACS에 의한 그리고 실시간 PCR에 의한 CXCR4의 발현은 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 배양된 세포에 비하여 매트리젤™ 상에서 배양된 세포에 대해 유의하게 더 낮았다. 완성 내배엽 마커의 발현은 일반적인 반응 패턴을 따르는데, H1은 H9보다 크고, H9는 H7보다 크다(도 22 및 23). 도 22로부터, H1 세포는 H7 및 H9주에 비하여 CXCR4 발현에서 유의한 증가를 나타냈다. 모든 경우에, CXCR4의 발현이 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 배양된 세포에 비하여 매트리젤™ (1:30 희석) 상에서 배양된 세포에 대하여 더 낮았음이 주목된다. 도 23 (패널 a-c)은 H7 (도 23, 패널 a) 및 H9 (도 23, 패널 b) 주에서 완성 내배엽 마커의 상향조절에서의 온건한 증가가 있었음을 보여주는 실시간 PCR 결과를 보여준다. 그러나, H1 (도 23, 패널 c) 주는 H7 및 H9 주에 비하여 완성 내배엽 마커의 보다 강한 상향조절을 나타냈다.
실시예 17
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - Wnt 리간드의 역할
H7P44 및 H9P46 배아 줄기 세포를 매트리젤™ (1:10 희석) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알엔디 시스템즈)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 일부 배양물에서는 20 ng/㎖ Wnt-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 20 ng/㎖ Wnt-5a (카탈로그 번호 654-WN-010, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 25 ng/㎖ Wnt-7a (카탈로그 번호 3008-WN-025, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 또는 25 ng/㎖ Wnt-5b (카탈로그 번호 3006-WN-025, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 5일간의 처리 전체에 걸쳐 첨가하였다. 도 24는 고 농도의 (a) AA 또는 (b) AA+ 20 ng/㎖ Wnt-3a의 존재하에서 H9P46 완성 내배엽 배양물의 위상차 이미지를 도시한다. 도 25는 매트리젤™ (1:30 희석) 상에서 배양되고 DE 프로토콜 + Wnt-3a (도 25, 패널 b 및 d) 및 -Wnt-3a (도 25, 패널 a 및 c)에 노출된 H7P44 및 H9P46 주에 있어서의 5일에서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다. DE 배양물에서 Wnt-3a의 존재는 저 혈청 + 고농도 AA로 처리된 DE 배양물에 비하여 CXCR4 (CD184)의 강한 발현으로 이어졌다. 도 26은 저혈청 + AA +/- Wnt 리간드로 처리된 a) H7 및 b) H9 배양물에 대한 실시간 PCR 데이터를 보여준다. 둘 모두의 H 주에 있어서, WNT-3a의 첨가는 완성 내배엽 마커의 유의한 상향조절로 이어졌다. 대조적으로, Wnt 5a, Wnt-5b 및 Wnt-7a는 완성 내배엽 마커의 발현에 대해 최소의 영향을 미쳤다.
실시예 18
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - Wnt -3a의 유효 용량
H9P46 배아 줄기 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬(1:10 희석) 상에서 배양하고 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A(AA) 및 10-50 ng/㎖ WNt-3a ( 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA), 및 10-50 ng/㎖ Wnt-3a로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 대조 배양물은 Wnt-3a로 처리하지 않았다. 도 27, 패널 a는 Wnt-3a의 부재하, b) 10 ng/㎖ Wnt-3a, c) 20 ng/㎖ Wnt-3a 및 d) 50 ng/㎖ Wnt-3a에서 5일에 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다. Wnt-3a의 부재하에서 CXCR4의 발현은 매우 낮았다. 대조적으로, 10-50 ng/㎖의 Wnt-3a의 첨가는 CXCR4 양성 세포의 수를 유의하게 증가시켰다. 더욱이, 10 ng/㎖의 Wnt-3a의 첨가는 50 ng/㎖의 Wnt-3a의 첨가만큼 효과적이었다. 실시간 PCR 결과 (도 28, 패널 a) 또한 이 발견을 확인한다.
별도 연구에서, H9p52 세포를 1:30의 저 성장 인자 매트리젤™에 도말하였다. DE 프로토콜의 처음 2일 동안 일련의 Wnt-3a 용량, 즉, 10 ng/㎖, 5 ng/㎖ 및 1 ng/㎖을 사용하였다. 도 28, 패널 b는 5일 처리 후 DE 마커의 PCR 분석을 보여준다. 실험의 마지막에 세포의 수가 도 28, 패널 c에 나타내어져 있다. 이것은 더 높은 용량의 Wnt-3a가 사용될 경우 세포가 증식 중임을 나타낸다. Wnt-3a 처리를 5일(5D)로 연장하는 것은 PCR에 의할 때 DE 마커에 거의 영향이 없었으며 세포 수를 유의하게 증가시키지 않았다(도 28, 패널 c). 이들 데이터는 2일 동안의 10 ng/㎖ Wnt3a가 최적의 세포 확장 및 완성 내배엽 분화에 도달하기에 충분함을 나타낸다.
실시예 19
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - GSK -3B 억제제의 효과
Wnt-3a의 효과가 Wnt 경로를 통해서임을 확인하기 위하여, GSK-3 억제제를 사용하여 베타 카테닌과 같은, Wnt의 하류 표적을 활성화시켰다. H9P46-P48 배아 줄기 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬(1:10 희석) 상에서 배양하고 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈-A (AA), 및 10-1000 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐(Calbiochem))로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA), 및 0-1000 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 대조 배양물은 저혈청 + 고 용량의 액티빈 A +/- Wnt-3a로 처리하였다. 도 29, 패널 a는 Wnt-3a 또는 GSK-3B 억제제의 부재하, b) +20 ng/㎖ Wnt-3a, c) +1000 nM GSK-3B 억제제 IX, d) +500 nM GSK-3B 억제제 IX, e) +100 nM GSK-3B 억제제 IX, f) +10 nM GSK-3B 억제제 IX, g) 1-2일 동안 +100 nM GSK-3B 억제제 IX, 및 h) 1-2일 동안 +10 nM GSK-3B 억제제 IX에서 5일에서의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다.
Wnt-3a의 부재하에서 또는 10 nM GSK-3B 억제제에서 CXCR4의 발현은 매우 낮았다. 대조적으로, 20 ng/㎖의 Wnt-3a 또는 100-1000 nM GSK-3B 억제제의 첨가는 CXCR4 양성 세포의 수를 유의하게 증가시켰다. 더욱이, 1-2일 동안 100 nM GSK-3B 억제제의 첨가는 전체 5일 기간 동안 100 nM GSK-3B 억제제의 첨가만큼 효과적이었다. 도 30은 (패널 a) H9P48 세포 및 (패널 b) H9P46 세포에 있어서 완성 내배엽 마커의 유전자 발현을 도시한다.
도 16은 본 발명에서의 분화 프로토콜의 개요를 도시하며, 여기서는 배아 줄기 세포는 영양 세포가 없는 시스템에서 완성 내배엽으로 분화된다.
실시예 20
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - GSK-3B 억제제 또는 Wnt-3a의 존재하에서 액티빈 A의 유효 용량
H9P49 및 H1P46 배아 줄기 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬(1:10 희석) 상에서 배양하고 0.5% FBS, 10-100 ng/㎖ 액티빈-A (AA) 및 100 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐) 또는 20 ng/㎖ Wnt-3a로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 10-100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 대조 배양물은 저 혈청 + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 처리하였다. 도 31은 a) 전체 5일 동안 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A, b) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A, c) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM의 GSK-3B 억제제 IX d) 전체 5일 동안 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM의 GSK-3B 억제제 IX, e) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A, 및 f) 전체 5일 동안 10 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A를 이용한 5일에서의 H9P49 및 H1P46에 있어서의 CXCR4의 발현을 FACS에 의해 도시한다. 도 31 패널 a-d는 H9P49 세포에 대한 것이며 패널 e-f는 H1P46 세포에 대한 것이다. 도 32는 10, 50, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 Wnt-3a로 처리된 H9P49 배양물에 있어서 완성 내배엽 마커의 유전자 발현을 도시한다: 패널 a: AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 POU5F (Oct-4)의 발현, 및 패널 b: SOX-17 및 GATA4. 완성 내배엽 마커의 강한 발현은 50 ng/㎖의 AA + 20 ng/㎖의 Wnt-3A 또는 100 nM GSK-3B 억제제 IX를 사용함으로써 얻을 수 있다. 보다 낮은 용량의 액티빈 A는 배아외 내배엽을 형성시킨다.
실시예 16
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - Wnt-3a 및 GSK-3B 억제제의 조합
H9P53 배아 줄기 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬(1:30 희석) 상에서 배양하고 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈A (AA) 및 100 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐) +/- 20 ng/㎖ Wnt-3a로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 10-100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 이와 함께, H9P53 배양물을 25 ng/㎖ BMP-4 (카탈로그 번호 314-BP-010, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) +/- 20 ng/㎖ Wnt-3A +/- 100 ng/㎖ 액티빈 A로 처리하였다. 대조 배양물은 저 혈청 + 100 ng/㎖의 액티빈 A로 처리하였다. 도 33은 a) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A 및 3-5일 동안 25 ng/㎖ BMP-4, b) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A c) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 100 nM의 GSK-3B 억제제 IX d) 전체 5일 동안 20 ng/㎖ Wnt-3a + 25 ng/㎖ BMP-4, e) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 처음 2일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX, 및 f) 전체 5일 동안 100 ng/㎖ 액티빈 A + 25 ng/㎖ BMP-4를 이용한 5일에서의 CXCR4의 발현을 FACS에 의해 도시한다. 도 34는 10, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 20 ng/㎖의 Wnt-3a 또는 100 nM GSK-3B 억제제로 처리된, 계대 46의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, 및 POU5F (Oct-4)의 발현 및 패널 (b): SOX-17, HNF-3B, 및 GATA4. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다. 도 35는 50, 또는 100 ng/㎖의 액티빈 A + 10 또는 100 nM GSK-3B 억제제로 처리된, 계대 49의 인간 배아 줄기 세포주 H9의 배양물에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정한, 완성 내배엽 마커들의 유전자 발현을 도시한다: 패널 (a): AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 POU5F (Oct-4)의 발현 및 패널 (b): SOX-17 및 GATA4. 결과는 미처리된 세포에 대한 증가 배수로 표현된다. 도 36은 액티빈 A, Wnt-3a, GSK-3 억제제, 및 BMP-4의 조합으로 처리된 H9P53 배양물에 있어서 완성 내배엽 마커의 유전자 발현을 도시한다: a) AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, 및 SOX7의 발현 및 b) SOX-17, HNF-3B 및 GATA4. DE 프로토콜에의 BMP-4의 첨가는 중배엽 마커 BRY의 형성을 유도하는 것으로 보이며 Wnt-3A와 GSK-4B 억제제의 조합은 액티빈 A의 존재하에서 각 제제 단독의 첨가에 비하여 완성 내배엽 마커의 유의한 상향조절을 유도하지 않았다.
실시예 22
MEF 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - 저 혈청 중의 Wnt-3a, 액티빈 A, Wnt-5a, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IL-4, 및 SDF-1의 조합
H9P44 세포를 마이토마이신 처리된 생쥐 배아 섬유아세포(MEF)로 앞서 코팅된 6웰 플레이트 상에 도말하였다. 세포를 20% 넉아웃 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민(모두 인비트로겐/깁코로부터) 및 8 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) (알앤디 시스템즈)로 이루어진 ES 세포 배지에서 70 내지 80% 융합성일 때까지 성장시켰다.
DE 형성을 위해, 하기에 상술한 다른 성장 인자에 더하여 액티빈 A (100ng/㎖)의 존재 또는 부재하에서 세포를 처리하였다. 성장 인자를 하기 요법에서 표시된 바와 같이 단계적 방식으로 증가하는 농도의 FBS에 첨가하였다:
0일: DMEM/F12 중에 0% FBS
1일: DMEM/F12 중에 0.5% FBS
2일: DMEM/F12 중에 2% FBS.
3일: FACS 분석 및 RT-PCR을 위해 세포를 수확하였다.
모든 성장 인자는 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈로부터 구매하였다. 각 처리군에 있어서 성장 인자의 상세한 설명 및 농도를 하기에 나타낸다.
1. 대조군- 성장 인자 무첨가
2. 액티빈 A (100 ng/㎖)
3. 액티빈 A (100ng/㎖) + Wnt-3a (10ng/㎖) + Wnt5a (10ng/㎖)
4. 액티빈 A (100ng/㎖) + Wnt-3a (10ng/㎖) + Wnt5a (10ng/㎖) +
BMP2 (100ng/㎖)
5. 액티빈 A (100 ng/㎖) + BMP-4 (100 ng/㎖)
6. 액티빈 A (100 ng/㎖) + BMP-6 (100 ng/㎖)
7. 액티빈 A (100 ng/㎖) + BMP-7 (100 ng/㎖)
8. 액티빈 A (100 ng/㎖) + BMP-4 (100 ng/㎖) +BMP-6 (100 ng/㎖) + BMP-7 (100 ng/㎖)
9. IL-4 (10 ng/㎖)
10. SDF1a (20ng/㎖)
11. 액티빈 A (100 ng/㎖) + IL-4 (10 ng/㎖) + SDF1a (20ng/㎖)
12. BMP2 (100ng/㎖) + BMP-4 (100ng.㎖) + BMP-6 (100ng/㎖) + BMP-7 (100ng/㎖)
13. 액티빈 A (100 ng/㎖) BMP-2 (100ng/㎖) + BMP-4 (100ng.㎖) + BMP-6 (100ng/㎖) + BMP-7 (100ng/㎖)
14. 액티빈 A (100 ng/㎖) + IL-4 (10 ng/㎖)
15. 액티빈 A (100 ng/㎖) + (SDF1a (20 ng/㎖)
16. 액티빈 A (100 ng/㎖) + Wnt-3a (10 ng/㎖) + Wnt-5a (10 ng/㎖) + Wnt-7a (10 ng/㎖)
17. 액티빈 A (100 ng/㎖) + IL-4 (10 ng/㎖) + SDF1a (20ng/㎖) + BMP-4 (100 ng/㎖)
결과:
DE 프로토콜 처리 3일째에 세포를 수확하였다. 분석을 위하여, 처리된 세포의 분취물을 RT-PCR을 위한 RNA 준비에 사용하였으며 나머지 세포를 FACS 분석을 위해 사용하였다. CXCR4의 빈도(%)가 도 37에 나타내어져 있다. 상기 성장 인자(들)의 첨가는 저 혈청 중의 100 ng/㎖ AA를 이용한 상기 처리에서 CXCR4의 발현을 향상시키지 않았다.
RT-PCR 분석을 위하여, 세포를 완성 내배엽 마커의 선택된 패널의 발현에 대해 분석하였다. 나타낸 결과는 기본 배지에서 성장된 그러나 액티빈 A 또는 임의의 다른 성장 인자로 처리되지 않은 세포에 대해 보정하였다. FACS 데이터와 일치하여, 표 V는 Wnt-3a와 같은 성장 인자를 저 혈청 중의 고 용량의 액티빈 A로 처리된 배양물에 첨가함에 의해서는 완성 내배엽 마커의 유의한 상향조절이 없었음을 보여준다. 이것은 액티빈 A, WNT3A, 및 저 혈청의 존재하에서 영양 세포가 없는 조건에서 배양된 ES 세포에 있어서 DE 마커의 유의한 증가를 보여주는 이전 실시예와 대조된다.
실시예 23
매트리젤 또는 인간 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
H9P55 세포를 인간 피브로넥틴 또는 정규 성장 인자 매트리젤™ (BD 바이오사이언시즈) 상에서 성장시키고 분화시켰다. 1 ug/㎖의 인간 피브로넥틴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)을 함유한 1 ㎖의 DMEM/F12(인비트로겐/깁코)를 6웰 조직 배양용 처리 디쉬의 각 웰에 첨가하였다. 대안적으로, 정규 성장 인자 매트리젤™을 DMEM/F12에서 1:10으로 희석하고 1 ㎖의 희석된 매트리젤™을 6웰 조직 배양용 처리 디쉬의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 콜라게나아제를 이용하여 계대하였다. 세포가 80% 융합성에 도달한 후, 하기와 같이 처리하였다: 10 ng/㎖ 생쥐 재조합 Wnt3a (알앤디) 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (알앤디)를 함유한 0.5% FBS로 2일. 이것 후에 2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A로 3일 처리하였다. 도 38, 패널 a-b는 각각 피브로넥틴과 매트리젤 상에서 배양된 배아 줄기 세포에 의한 CXCR4의 발현을 도시한다. 실시간 PCR 결과 (도 39)는 완성 내배엽의 형성이 피브로넥틴과 매트리젤 ™ 코팅된 플레이트 상에서 동등하였음을 확인한다.
실시예 24
다양한 농도의 매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
약 60 내지 70% 융합성의 H9 배양물을 0.5% FBS, 20 ng/㎖ Wnt-3a 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고, 이어서 2% FBS, 20 ng/㎖ Wnt-3a 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. H9 세포를 1:60 내지 1:10 희석의 정규 매트리젤로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 매트리젤로 코팅하였다.
실시간 PCR 결과가 도 40에 나타내어져 있다. 저 혈청, 액티빈 A 및 Wnt-3a를 이용하여 인간 배아 줄기 세포를 처리하면 CXCR4, GATA4, 구스코이드, HNF-3베타, 및 SOX-17 유전자의 발현을 유도하며, 이는 세포가 완성 내배엽 단계로 분화중임을 시사한다. 그러나, Wnt-3A의 존재하에서 매트리젤™의 농도가 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이지는 않는다.
실시예 25
세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 그 후 MEF 상에서 배양되는 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - Wnt -3a의 역할
적어도 5 계대 동안 매트리젤™ 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주 H9 유래의 세포를 ES 배지 중의 MEF 영양 세포 상에 접종하였다. 세포가 60 내지 70% 융합성에 도달하였을 때 세포를 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 추가 처리 군은 전체 5일 동안 20 ng/㎖의 Wnt-3a + 10-100 ng/㎖의 액티빈 A를 포함한다.
3일과 5일에, SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질(AFP), CXCR4, 브리키우리(Bry), 구스코이드(GSC), HNF-3 베타, GATA4, hTERT 및 Oct4에 대해 실시간 PCR에 의해 배양물을 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로 간주되는 한편 GATA4, HNF-3베타 및 SOX-17은 완성 내배엽 마커를 나타내며 GSC, Bry, 및 CXCR4는 원시선의 마커를 나타낸다. hTERT 및 Oct-4는 각각 자가 재생 및 만능성에 대한 마커이다. 실시간-PCR 결과가 도 41, 패널 a-d에 나타내어져 있다. FACS 분석을 또한 3일과 5일에 실시하였다. CXCR-4, 및 CD9의 발현 수준을 분석하여 도 41, 패널 e에 보고한다.
Wnt-3a의 부재하에서, 100 ng/㎖ 액티빈 A에서 배양된 세포의 AFP 발현 수준은 미처리 대조군에서 나타난 것과 유사하다. 그러나, 100 ng/㎖ 액티빈 A에서 배양된 세포에 Wnt-3a를 첨가하면, 시간이 지남에 따라 증가하는 AFP 발현의 증가가 있다. 보다 낮은 농도의 액티빈 A가 사용되면, Wnt3a의 존재와 무관하게, AFP 발현이 매우 높다(도 41, 패널 a). 이것은 세포가 배아외 조직으로 분화하는 것을 방지하기 위하여 고농도의 액티빈 A가 필요함을 시사한다.
FACS 분석에 의하면, CXCR4 양성 세포는 3일에서 고농도의 액티빈 A와 Wnt-3a로 처리된 샘플에서 집단의 23-33%에 비하여, 고농도의 액티빈 A로 처리되지만 Wnt3a로 처리되지 않은 샘플에서의 집단의 32-42% 범위였다 (도 41, 패널 e). 처리 5일까지, 고농도의 액티빈 A와 Wnt-3a로 처리된 세포의 43-51%에 비하여, 고농도의 액티빈 A로 처리되지만 Wnt-3a로 처리되지 않은 세포의 28-32%가 CXCR4를 발현하였다(도 41, 패널 f). 저 농도의 액티빈 A로 처리된 세포에서, Wnt-3a 처리 군(3 내지 4%)에 비하여 Wnt-3a가 없는 처리군에서 더 많은 CXCR4 양성 세포가 있었다(11 내지 20%) (도 41, 패널 g). 전체적으로, Wnt-3a는 MEF 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화에서 상당한 역할을 하지 않는 것으로 보인다. 이것은 영양 세포층이 아마도 액티빈 A 유도된 완성 내배엽의 형성을 향상시키기 위하여 충분한 Wnt-3a 또는 유사 리간드를 분비함을 시사한다.
실시예 26
Wnt 억제제 DKK-1로 처리한 후, 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
Wnt-3a의 첨가가 분화 증가를 야기하였는지를 결정하기 위하여, Wnt-3 시그널링의 억제제를 배양물에 첨가하였다. 약 60 내지 70% 융합성의 H9 배양물을 0.5% FBS, 20 ng/㎖ Wnt3a, 100 ng/㎖ 딕코프-1(DKK-1) 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고, 이어서 2% FBS, 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. H9 세포를 1:30 희석의 성장 인자 감소된 매트리젤로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 매트리젤로 코팅하였다.
5일에, SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질(AFP), CXCR4, 브리키우리(Bry), 구스코이드(GSC), HNF-3 베타, GATA4, hTERT 및 Oct4에 대해 실시간 PCR에 의해 배양물을 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로 간주되는 한편 GATA4, HNF-3베타 및 SOX-17은 완성 내배엽 마커를 나타내며 GSC, Bry, 및 CXCR4는 원시선의 마커를 나타낸다. hTERT 및 Oct-4는 각각 자가 재생 및 만능성에 대한 마커이다. 결과는 도 42에 나타내어져 있다.
Wnt-3a의 존재하에서, 세포는 모두 완성 내배엽의 마커인 CXCR4, GATA4, HNF-3베타 및 SOX17을 발현한다. 구스코이드와 같은 원시선 형성의 마커가 또한 미처리 대조군에서 검출된 것보다 높은 수준으로 검출되었다. DKK1의 첨가로, 전술한 분화 마커의 발현 수준은 미처리 세포와 유사한 수준으로 극적으로 감소한다.
실시예 27
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 저 혈청 + 액티빈 A 및 ± Wnt -3a에서 분화된 H9 배아 줄기 세포에 있어서 DE 마커의 면역형광 염색
5일에 H9 세포의 DE 배양물을 SOX-17, HNF-3B, GATA-4, N-카드헤린, 및 E-카드헤린에 대해 실시예 10에 따라 염색하였다. 모든 핵을 DAPI로 대조 염색하였다. 20 ng/㎖ Wnt-3a는 Wnt-3a의 부재하에서 분화된 배양물에 비하여 SOX-17, HNF-3베타 및 GATA-4에 대해 양성으로 염색된 핵의 수가 유의하게 더 많아지게 하였다. 더욱이, Wnt-3a의 첨가는 e-카드헤린의 발현을 유의하게 손실되게 하였으며 N-카드헤린의 발현을 향상시켰다 (도 43, 패널 a 및 도 43, 패널 b).
실시예 28
MEFS 또는 매트리젤 상에서의 완성 내배엽의 형성 후 배아 줄기 세포에서의 유전자 발현 변화의 마이크로어레이 분석
알엔이지 미니 키트(퀴아젠)를 이용하여 하기 배아 줄기 세포 배양물로부터 전체 RNA를 단리하였다: A) 매트리젤™-코팅된 플레이트 (1:30 희석) 상에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출된 후 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리된 H9P33 세포; B) MEF에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출되고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리된 H9P44 세포, 및 C) 매트리젤™-코팅된 플레이트(1:30 희석) 상에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A로 보충된 DMEM/F12 배지 + 20 ng/㎖ Wnt-3a에 2일 동안 노출되고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리된 H9P48 세포. 각 군을 위한 대조군은 매트리젤-코팅된 디쉬에 도말되고 MEF -조절된 배지에서 배양된 세포 또는 MEF 상에 도말되고 ES 배지에서 배양된 세포를 포함하였다. 모든 군은 세 가지 생물학적 반복을 포함하였으며 각 생물학적 반복은 두 가지 별도의 유전자 칩 상에서 반복되었다.
샘플 준비, 혼성화, 및 이미지 분석은 아피메트릭스 휴먼 게놈 U133 플러스 2.0 어레이에 따라 실시하였다. 정상화 및 로그 환산 후, 데이터 분석을 옴니비즈(OmniViz)(등록상표) 소프트웨어(미국 매사추세츠주) 및 진시프터(GENESIFTER) (미국 워싱턴주 소재의 비즈랩스(VizXLabs))를 이용하여 실시하였다. 샘플들 사이에서 유전자 발현의 유의한 차이를 변이의 분석 및 0.05 이하의 조정된 P-값(벤자미니 및 호치버그 보정)을 이용한 F-검정을 이용하여 평가하였다. 적어도 하나의 군에서 프레즌트 콜을 가진 유전자만을 분석에 포함시켰다. 표 VI는 각 유전자에 있어서 P-값과 함께 A 군, B 군, 및 C 군 사이에 적어도 5배 차이를 나타내는 유전자의 정상화되고 로그 환산된 평균 강도를 열거한다.
실시예 29
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 SA002 ES 주의 완성 내배엽으로의 분화
8 ng/㎖의 bFGF로 보충된 MEF-CM에서 매트리젤-코팅된 플레이트(1:30 희석) 상에서 적어도 3 계대 동안 앞서 배양된 SA002 P38 세포(스웨덴 소재의 셀라르티스 (Cellartis))를 0.5% FBS, 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) +/- 20 ng/㎖의 Wnt-3a 또는 100 nM GSK-3B IX 억제제로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 실시간 PCR 결과가 도 44, 패널 a 및 b에 나타내어져 있다. H1, H7, 및 H9 주와 유사하게, SA002 주도 DE 마커의 강한 발현을 위해 Wnt-3A의 첨가를 또한 필요로 하였다. CXCR4의 발현은 도 45에 도시된다: a) AA 처리 b) AA + Wnt-3a c) AA + GSK-3B 억제제.
실시예 25
인간 혈청으로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화
계대 55의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 배양물을 인간 혈청(시그마, #H1388, 미주리주) 코팅된 플레이트 상에서 성장시키고 분화시켰다. 0.5 ㎖의 인간 혈청을 6웰 조직 배양용 처리 디쉬의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 흡인한 후 인간 배아 줄기 세포를 첨가하였다. 세포가 80% 융합성에 도달한 후, 세포를 하기와 같이 처리하였다: 10 ng/㎖ 생쥐 재조합 Wnt3a (알앤디) 또는 100 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 칼바이오켐) 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (알앤디)를 함유한 0.5% FBS로 2일. 이것 후에 2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A로 3일 처리하였다. 이어서 배양물을 실시간 PCR에 의해 분석하였다(도 46, 패널 a 및 b). 완성 내배엽 마커의 강한 발현이 액티빈 A만으로 처리된 세포에 비하여 액티빈 A + GSK-3B 억제제 또는 Wnt-3A로 처리된 세포에 있어서 주목되었다. 이들 발견은 매트리젤™ 또는 인간 피브로넥틴 코팅된 플레이트 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포에 대한 본 발명자의 발견과 유사하다.
실시예 31
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화 - 다양한 GSK-3B 억제제의 평가
많은 구매가능한 GSK-3B 억제제의 유효성을 인간 배아 줄기 세포로부터의 DE의 형성에서 평가하였다. 하기 GSK-3B 억제제를 100 nM에서 평가하였다: GSK-3B 억제제 VIII (카탈로그 번호 361549, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐), GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐), GSK-3B 억제제 XI (카탈로그 번호 361553, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐), GSK-3B 억제제 XII (카탈로그 번호 361554, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐). H1P54 ES 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 (1:30 희석) 상에서 배양하고 0.5% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA) +/- 다양한 GSK-3B 억제제로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 대조 배양물은 저 혈청 + 고 용량의 AA로 처리하였다. 도 47, 패널 a 및 b는 5일에서의 완성 내배엽 마커의 유전자 발현을 도시한다. GSK-3B 억제제 IX 및 XI은 둘 모두 GSK-3B 억제제 VIII 및 XII에 비하여 DE 형성을 유도함에 있어서 효과적이었다.
실시예 32
영양 세포가 없는 조건하에서 배양된 인간 배아 줄기 세포에 의한 췌장 내배엽의 형성 - 레틴산 유사체의 평가
H9P49 배아 줄기 세포를 매트리젤™ (1:30 희석) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 0.5% FBS, 20 ng/㎖ Wnt-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12로 추가 3일 동안 처리하였다. 5일에, 세포를 FACS 및 실시간 PCR에 의한 평가를 위해 수집하였다. 이전 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이 프로토콜은 CXCR4 및 SOX-17과 같은 완성 내배엽 마커의 강한 상향조절로 이어졌다. 5일에 생성된 완성 내배엽 세포를 췌장 내배엽 형성을 유도하기 위하여 하기 배지 조건에 노출시켰다: 2% FBS 및 1 μM의 전부-트랜스(all-trans) 레틴산(RA) (카탈로그 번호 R2625, 미국 미주리주 소재의 시그마), 또는 0.1-10 μM AM-580 (4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복스아미도]벤조산, 카탈로그 번호 A8843, 미국 미주리주 소재의 시그마), 또는 0.1-1 μM TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 아로티노이드 산, 카탈로그 번호 T3757, 미국 미주리주 소재의 시그마)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 3일 동안 배양. AM-580 및 TTNPB는 레틴산 수용체에 대해 친화성을 가진 레틴산 유사체이다. RA 처리 후 2% FBS 및 20-50 ng/㎖ bFGF (카탈로그 번호 F0291, 미국 미주리주 소재의 시그마)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 추가 3일 동안 처리하였다. 배양물을 수확하고 mRNA 샘플을 분석을 위해 수집하였다.
유전자 발현 분석에 의하면 (도 48, 패널 a-d) 1 μM RA의 첨가 후 bFGF에의 노출이 PDX-1과 같은 췌장 내배엽 마커를 유의하게 상향조절함이 밝혀졌다. 더욱이, 이 프로토콜은 CDX-2 및 AFP와 같은 전장(foregut) 내배엽 마커의 강한 발현으로 이어졌다. 1 μM 농도의 RA 유사체의 첨가는 등가의 췌장 내배엽과 전장 마커로 이어졌다. 그러나, 1 μM RA 유사체의 첨가는 전부-트랜스 레틴산에 비하여 보다 강한 AFP 발현으로 이어졌다. 그러나, 10 μM AM-580의 첨가는 PDX-1의 고 발현을 유지하면서 AFP 및 CDX-2 발현을 억제하였다.
실시예 34
인간 배아 줄기 세포에서 사이토카인 발현에 대한 Wnt-3a 처리의 효과
Wnt-3a 처리가 사이토카인 발현에 갖는 영향을 단백질 어레이를 이용하여 분석하였다. 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포를 실시예 15에 개시된 방법에 따라 배양하였다. 계대 54에서, 세포를 0.5% FBS DMEM/F12에서 2일 동안 100 ng/㎖액티빈A +/- 10 ng/㎖Wnt3a의 존재하에서 분화시켰다. 그 후 100 ng/㎖ 액티빈 A 및 2% FBS DMEM/F12에서 추가 3일 동안 세포를 배양하였다. 5일째의 마지막에, CXCR4 발현을 각 처리군에 대하여 FACS에 의해 결정하였다. 액티빈 A만으로 처리된 세포는 1%의 세포가 CXCR4를 발현하였다. 액티빈 A 및 Wnt3a로 처리된 세포는 73%의 세포가 CXCR4 발현에 대해 양성이었다.
포유류 세포 용해 키트(미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 이용하여, 세포 용해물을 각 처리 군의 세포로부터 제조하였다. 각 처리군으로부터의 조절된 배지를 수집하여 농축시켰다. 사이토카인 어레이 분석은 미국 조지아주 레이바이오텍(RayBiotech) (http://www.raybiotech.com/)에 의해 제공된 사이토카인 어레이 패널을 이용하여 완료하였다. 표 VII은 데이터 정상화 및 배경(background) 차감 후 사이토카인, 성장 인자, 및 수용체 발현을 열거한다. 각 패널에 있어서, 양성 및 음성 대조군이 또한 포함된다.나타낸 데이터는 세포 처리 군 당 두 개의 독립적인 샘플이다(1,2).
안지오제닌, IGFBP-1 및 EGF의 주목할만한 상향조절이 Wnt-3a 처리 세포 조절 배지에서 나타난다. IGFBP-1, TGF베타-1 및 TGF베타-3을 비롯한 많은 단백질이 Wnt-3a 처리된 세포 용해물에서 상향조절된다. 이들 상향조절된 단백질은 완성 내배엽 형성에 대한 Wnt-3a 효과를 대체하거나 향상시키기 위하여 분화 배지에 다시 첨가될 수 있다.
실시예 35
매트리젤로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽으로의 분화: Wnt1의 역할
H1P55 ES 세포를 매트리젤™ (1:30 희석) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 0.5% FBS, 및 100 ng/㎖ 액티빈 A +/- 10-20 ng/㎖의 WNT-1 (미국 뉴저지주 소재의 페프로테크(PeproTech), 카탈로그 번호 120-17)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (AA) 및 +/- 10 또는 20 ng/㎖의 WNT-1로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. WNT1 + AA의 하기 조합을 시험하였다:
a) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 20 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3일에 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA, b) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 20 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3-5일 동안 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA, c) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 10 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3일에 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA, d) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 10 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3-5일 동안 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA, e) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 20 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3일에 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA + 20 ng/㎖의 WNT1, f) 1-2일 동안 0.5% FBS + DM-F12 중의 20 ng/㎖의 WNT1 + 100 ng/㎖ AA 및 이어서 3-5일 동안 2% FBS +DM-F12 + 100 ng/㎖ AA + 20 ng/㎖의 WNT1. 도 49, 패널 a 및 b는 H1 세포를 저 혈청, AA 및 Wnt-1로 처리한 후 완성 내배엽 마커에 대한 실시간 PCR 데이터를 도시한다. 100 ng/㎖의 AA의 존재하에서 20 ng/㎖의 Wnt1의 첨가는 완성 내배엽 마커 (Bry, CXCR4, GSC, SOX17, HNF-3B, 및 GATA-4)를 유의하게 상향조절하였다.
실시예 36
췌장 내분비 분화에 대한 글루코스의 효과
췌장 내배엽 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화의 효율은 예를 들어 글루코스의 농도, 또는 기본 배지의 선택을 비롯한 많은 인자에 의존적이다. 배아 줄기 세포로부터 유래되는 췌장 내배엽 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화에 대한 글루코스 농도의 효과를 조사하였다.
기본 배지의 변화에 의한 글루코스 농도의 변경: 미분화 인간 배아 줄기 세포(H1 및 H9)의 배양물을, 췌장 내배엽 세포로의 분화 이전에, 실시예 1에 설명된 방법에 따라 배양하였다. 배아 줄기 세포를 혈청의 부재 하에 100 ng/㎖의 액티빈 A를 함유하는 RPMI에서 1일 동안 배양함으로써 배아 줄기 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시켰다. 이 시간 후에, 세포를 100 ng/㎖의 액티빈 A 및 0.2% FBS를 함유하는 RPMI에서 추가로 2일 동안 배양하였다. 이 처리 후에, 배지를 2% FBS , FGF10 (50 ng/㎖) 및 KAAD-사이클로파민 (250 nM)을 함유하는 RPMI로 대체하였다. 세포를 이 배지에서 4일 동안 배양하였다. 이 시간 후에, 배지를 전부-트랜스인 레틴산 (2 μM), FGF10 (50ng/㎖) 및 KAAD-사이클로파민 (0.25 μM)을 함유하는, 1x B27이 보충된 배지로 4일 동안 대체하여 췌장 내배엽 세포의 형성을 유도하였다. 췌장 내배엽 세포의 수율은 저-글루코스 DMEM 또는 DMEM/F12로 처리된 배양물에서 유의하게 상이하지 않았다.
췌장 내배엽 세포를 엑센딘 4 및 HGF로 처리함으로써 상기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시켰다. 10일 동안, 엑센딘 4 (50 ng/㎖) 및 HGF (50 ng/㎖)를 저-글루코스 DMEM 또는 DMEM/F12 중 어느 하나 중에 10일 동안 첨가하였다. 둘 모두의 배지는 1 x B27로 보충되었다. 배양물을 수확하고 mRNA 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 샘플을 얻어진 췌장 내배엽에 대하여 정상화하였다.
인슐린 발현을 실시간 PCR로 분석하였다. 도 50, 패널 a 및 패널 b에 예시된 바와 같이, 인슐린 유전자 발현 및 글루카곤 유전자 발현 둘 모두는 DMEM-저 글루코스에서 처리된 세포에 비하여 DMEM/F12에서 처리된 세포에서 강하게 증가하였다. 인슐린 발현을 면역조직화학적 방법에 의해 또한 분석하였다 (도 51). DMEM/F12에서 처리하면 DMEM-저 글루코스에 비하여 인슐린 양성 세포의 백분율이 더 커졌다 (도 51, 패널 a 및 패널 b). 인슐린 양성 세포는 PDX-1에 대해서도 양성이었다 (패널 c).
글루코스 농도의 변경: 미분화 인간 배아 줄기 세포 (H1 및 H9)의 배양물을, 췌장 내배엽 세포로의 분화 이전에, 실시예 1에 설명된 방법에 따라 배양하였다. 혈청의 부재 하에 100 ng/㎖의 액티빈 A를 함유하는 RPMI에서 배아 줄기 세포를 1일 동안 배양함으로써 배아 줄기 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시켰다. 이 시간 후에, 세포를 100 ng/㎖의 액티빈 A 및 0.2% FBS를 함유하는 RPMI에서 추가로 2일 동안 배양하였다. 이 처리 후에, 배지를 2% FBS , FGF10 (50 ng/㎖) 및 KAAD-사이클로파민 (250 nM)을 함유하는 RPMI로 대체하였다. 세포를 이 배지에서 4일 동안 배양하였다. 이 시간 후에, 배지를 전부-트랜스인 레틴산 (2 μM), FGF10 (50ng/㎖) 및 KAAD-사이클로파민 (0.25 μM)을 함유하는, 1x B27이 보충된 CMRL로 4일 동안 대체하여 췌장 내배엽 세포의 형성을 유도하였다. 배지는 5, 10 또는 20 mM 글루코스로 보충되었다. 췌장 내배엽 세포의 수율은 5, 10 또는 20 mM 글루코스로 처리된 H9 배아 줄기 세포로부터 유래된 배양물에서 유의하게 상이하지 않았다 (도 52, 패널 a).
5, 10 또는 20 mM 글루코스에서 1x B27, 엑센딘 4 (50 ng/㎖) 및 HGF (50 ng/㎖)가 보충된 CMRL로 2일, 4일 또는 10일 동안 췌장 내배엽 세포를 처리함으로써 췌장 내배엽 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시켰다. 배양물을 수확하고 mRNA 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 샘플을 얻어진 췌장 내배엽에 대하여 정상화하였다.
도 52, 패널 b-g는 인간 배아 줄기 세포주 H9으로부터 유래된 세포에서 Ngn-3, NeuroD-1, Nkx2.2, Pax-4, 인슐린 및 글루카곤의 발현에 대한 글루코스의 효과를 보여준다. Ngn3은 췌장 내분비 운명을 결정하는 데 연루된 첫 번째 전사 인자이며, 뉴로D1은 Ngn3의 직접적인 표적이다. 글루코스는 Ngn3 및 뉴로D1 mRNA 수준 둘 모두의 용량-의존적 증가를 촉진한다. 다른 두 가지 주요 췌장 마커인 Nkx2.2 및 Pax4가 또한 유사한 발현 패턴을 보였다 (도 52, 패널 d 및 패널 e). 최적의 인슐린 및 글루카곤 발현은 10mM 글루코스로 10일 동안 처리한 세포에서 관찰되었다 (도 52, 패널 f 및 패널 g).
Ngn-3, NeuroD-1, Nkx2.2, Pax-4에 있어서 유사한 결과가 인간 배아 줄기 세포주 H1으로부터 유래된 배양물에서 관찰되었다 (표 VIII). 그러나, 최적의 인슐린 및 시냅토피신 발현은 20 mM 글루코스로 10일 동안 처리한 세포에서 관찰되었다 (표 VIII).
본 발명의 방법에 의해 형성된 인슐린 발현 세포로부터의 C-펩티드 방출: 2, 10 또는 20 mM 글루코스에서 처리한, H1 세포로부터 유래된 인슐린 양성 세포에서 글루코스-매개된 C-펩티드 방출을 모니터링하였다. C-펩티드 방출을 일으키기 위하여, 먼저 중탄산염 및 HEPES (KRBH; 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.1% BSA)를 포함하는 크렙스-링거액(Krebs-Ringer solution)을 이용하여 1시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 배지를 버리고, 2 mM D-글루코스를 함유하는 크렙스-링거액으로 대체하였다. 세포를 20 mM 글루코스 또는 0.5 mM IBMX (모두 시그마로부터 구매)로 1시간 동안 자극하였다. 모조 상청액 중 C-펩티드의 농도를 기본 상청액 중 C-펩티드 농도로 나눔으로써 각각의 배양물에 대하여 자극 배수를 계산하였다.
BMX는 C-펩티드 방출을 1.2 내지 3배 촉진하였다 (도 53). 20 mM 글루코스는 C-펩티드 방출을 촉진하지 않았다. 2, 10 및 20 mM 글루코스에서 형성된 인슐린 양성 세포들 사이에서는 C-펩티드 분비에 있어서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
종합하면, 본 출원인의 데이터는 글루코스가 내분비 마커인 Ngn3 및 뉴로D1의 용량-의존적 상향조절을 유도함을 시사하는 것인데, 이는 글루코스가 인간 배아 세포의 췌장 내분비 세포로의 용량-의존적 분화를 유도함을 시사한다. 인슐린의 발현도 용량-의존적 방식으로 글루코스에 의해 조절된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양이 실시예와 바람직한 실시 형태를 참고로 하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원리하에서 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정됨이 이해될 것이다.
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Claims (31)

  1. 약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도의 글루코스가 보충된 배지에서 감마 시크리타아제(secretase) 억제제, 또는 엑센딘(Exendin)-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통(endocrine lineage)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell)로부터 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 완성 내배엽 계통(definitive endoderm lineage)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로부터 유래되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 만능 줄기 세포로부터 유래되는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시킨 후 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 글루코스를 약 10 mM의 농도로 사용하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 글루코스를 약 20 mM의 농도로 사용하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 20일 동안 처리하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 10일 동안 처리하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 10일 동안 처리하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 4일 동안 처리하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 동안 처리하는 방법.
  14. 제6항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 글루코스로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  15. 제7항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 글루코스로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  16. a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
    b. 만능 줄기 세포를 액티빈 A로 처리함으로써, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
    c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로, 또는 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 처리함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
    d. 약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도의 글루코스가 보충된 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4 또는 엑센딘-4와 HGF로 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 글루코스를 약 10 mM의 농도로 사용하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 글루코스를 약 20 mM의 농도로 사용하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 20일 동안 처리하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 내지 약 10일 동안 처리하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 10일 동안 처리하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 4일 동안 처리하는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 감마 시크리타아제 억제제, 또는 엑센딘-4, 또는 엑센딘-4와 HGF로 약 2일 동안 처리하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 글루코스로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 글루코스로 약 2일 내지 약 30일 동안 처리하는 방법.
  27. 제1항의 세포를 당뇨병에 걸린 환자 내로 이식하는 단계에 의해 당뇨병에 걸린 환자를 치료하는 방법.
  28. 제16항의 세포를 당뇨병에 걸린 환자 내로 이식하는 단계에 의해 당뇨병에 걸린 환자를 치료하는 방법.
  29. 제16항에 있어서, 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 배아 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 인간 배아 줄기 세포가 H1 및 H9로 이루어진 군의 세포주로부터 유래되는 방법.
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