MX2007014566A - Arabinofuranosidasa de penicillium capsulatum. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con polipeptidos aislados que tienen actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa y con secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican los polipeptidos. La invencion tambien se relaciona con las construcciones de acidos nucleicos, vectores y celulas huesped que comprenden las secuencias de acidos nucleicos, asi como con los metodos para la produccion y uso de los polipeptidos.

Description

sorprendentemente una alfa-L-arabinofuranosidasa de una cepa de Pejp icillium capsula tum . La alfa-L-arabinofuranosidasa tiene un tamaño de aproximadamente 35 kDa. La secuencia de aminoácido madura de la invención tiene 76% de homología con la aira))inofuranosidasa de Aspergillus niger de WO 9606935.

Los inventores también aislaron el gen que codifica la nueva alfa-L-arabinofuranosidasa . Pcr lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una arabinofuranosidasa que es: a) un polipéptido que tie¡ne una secuencia de aminoácido como el péptido maduro en la SEC ID NO: 2, o que puede obtenerse del mismo por sustitu ción, eliminación e/o inserción de uno o más aminoác idos; b) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) qué : i) tiene por lo menos 80% de homología con tal poli .péptido, ii) una variante alélica de tal polipéptido, c) un polipééppttido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de alta severidad con una het.ra complementaria de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2, que codifica el polipéptido maduro o una subsec encia de la misma, que tiene por lo menos 100 nucleót idos. Er un segundo aspecto, la invención proporciona una secuenc ia de ácido nucleico que comprende una secuencia de áqido nucleico que codifica la arabinofuranosidasa del primer aspectc En un tercer aspecto la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende: a) la secuencia de ADN que codifica la arabinofuranosidasa mostrada en la SEC ID NO: 2, b) una secuencia de ADN análoga que i) tiene por lo menos 80% de homología con tal secuencia de ADN o ii) híbrida a alta severidad con una hebra complementaria de tal secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma, que tiene por lo menos 100 nucleótidos, iii) es una variante alélica de la misma o una hebra Complementaria a a) o b) . EEnn un cuarto aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 80% de homología con la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 1, o a) híbrida a alta severidad con una hebra complementaria de la secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma que ttiieennee por lo menos 100 nucleótidos, b) es una variante alélica de la misma, o una hebra complementaria a a) o b) Er. un quinto aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico del segundo, tercer y cuarto aspecto, enlazada operablemente a una o más secuencias de control capaces de dirigii- la expresión de la arabinofuranosidasa en un huésped de expresión apropiado. En un sexto aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico del quinto aspecto.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico del sexto aspecto. En un octavo aspecto, la invención proporciona un método para prjoducir una arabinofuranosidasa que comprende cultivar la célula huésped del séptimo aspecto bajo condiciones convenientes a la producción de la arabinofuranosidasa y recuperar la arabinofuranosidasa. En un noveno aspecto, la invención proporciona un uso de la arabinofuranosidasa del primer aspecto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN E? una primera modalidad de la presente invención, el polipéptido aislado tiene una secuencia de aminoácido que tiene oor lo menos 80% de identidad con la secuencia de aminoásido mostrada como los aminoácidos 1 a 328 de la SEC ID NO: 2 (es decir, el polipéptido maduro) . En una modalidad intereáante de la invención el polipéptido tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácido mostrada como los aminoácidos 1 a 328 de la SEC ID NO: 2 (posteriormente polipéptidos homólogos") . En una modalidad preferida, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácido que difiere por cinco Una variante alélica representa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosÓTiico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en el polimorfismo dentro de las psblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar los polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. En una segunda modalidad de la invención, el polipéptido aisladc se codifica por una secuencia de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de baja severidad, de preferencia bajo condiciones de severidad media, más preferentemente bajo condiciones de alta severidad con (i) una hebra complementaria de la secuencia de ácido nucleico mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1, o (ii) una subsec encia de (i) por lo menos 100 nucleótidos (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Labora tory Manual , 2da. edición, Cold Spring Harbor, New York) L subsecuencia de la hebra complementaria de la secuencia de ácido nucleico mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1 puede ser de por lo menos 100 nucleó1jidos o, de preferencia, de por lo menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia debería codificar un fragmento de polipéptido que tiene actividad de glucotransferasa. Los polipéptidos también pueden ser variant BS alélicas o fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de glucotransferasa. La secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma, puede usarse para designar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar los polipéptidos que codifican el ADN que tienen actividad de arabinofuranosidasa de las cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con los métodos bien conocidos en la tjécnica. En particular, tales sondas pueden usarse para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o espec?e| de interés, siguiendo los procedimientos de Southern blotti?g estándares, para identificar y aislar el gen correspondiente en la presente. Estas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deberían ser de por lo menos 15, de preferencia por lo menos 25 y más preferentemente por lo menos 35 nucleótidos de longitud. También pueden usarse las sondas más grandes. Pueden usarse las sondas de ADN y ARN. Las sondas se marcan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . Tales sondas se abarcan por la presente invención. De esta manera, una biblioteca de ADN o ADNc genómica preparada de estos otros organismos puede seleccionarse para el ADN que híbrida con las sondas descritas anteriormente y que codifica un polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa. El ADN genómico u otro de estos otros organismos puede separarse por electroforesis de agarosa o en gel de: poliacrilamida u otras técnicas de separación conocidas por la persona experimentada. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado pueden transferirse e inmovilizarse en nitrocelulosa u otros materiales de vehículo apropiados. Para identificar un clon o ADN que es homólogo con la SEC ID NO: l o una subsecuencia de la misma, el material de vehículo se usa en una Southern blot. Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácido nucleico híbrida a una sonda de ácido nucleico marcada que corresponde a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NO: 1, su hebra complementaria o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de severidad baja a alta. Las moléculas a las que la sonda de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones se detectan usando una película de rayos X. En otra modalidad interesante, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido (maduro) de la SEC ID NO: 2, o una subsecuencia de la misma. En una tercera modalidad interesante, la sonda de ácido nucleico es la SEC ID NO: 1. En una cuarta modalidad interesante, la sonda de ácido nucleico es el polipéptido maduro que codifica la región de la SEC ID NO: 1. Para sondas grandes de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de severidad baja a alta se definen como lc. prehibridación y la hibridación a 42°C en SSPE 5X, 0.3% de SDS, 200 µg/mL de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 25% de formamida para baja severidad, 35% de formamida para severidad media ó 50% de formamida para severidad alta, siguiendo los procedimientos estándares de Southern blotting. Para sondas largas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, el material de vehículo se lava finalmente tres veces cada 15 minutos usando 2 x SSC, 0.2% de SDS, de preferencia por lo menos a 50°C (baja severidad) , más preferentemente por lo menos a 55°C (severidad media) aún más preferentemente por lo menos a 65°C (severidad alta) . P=.ra sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones se severidad se definen como la prehibridación, hibridcLción y post-hibridación de lavado de 5°C a 10°C debajo de la Tm calculado usando el cálculo de acuerdo con Bolton and McZarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M, pH 7.6, EDTA 6 mM, 0.5% de NP-40, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por mL, siguiendo los procedimientos estándares de Southern blotting. Para las sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material de vehículo se lava una vez en 6X SSC más 0.1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C debajo de la Tp calculada. Como se indicó anteriormente, el polipéptido de la invención puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoaqido de la SEC ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la misma, en donde uno o más aminoácido (s) se ha sustituido por otro aminoácido o aminoácidos, en donde uno o más aminoácidos se ha eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se ha insertado. De preferencia, los cambios del aminoácido son de una naturaleza menor, que son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente el doblez y/o actividad de la proteína; eliminaciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxi.lo terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina amino terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigéraico o un dominio de unión.

Ejemplos de las sustituciones conservadoras están dentro del grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidipa), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoacidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminc'ácidos pequeños (glicina, alanina, serina treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que en general no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath and R.L, Hill, 11979, In , The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que se presentan más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly así como éstos a la inversa. En general, se prefiere que los polipéptidos de la invención tengan por lo menos 20% de la actividad de arabinofuranosidasa del polipéptido que tiene la secuencia de aminoáqido mostrada como los aminoácidos 1 a 328 de la SEC ID NO: 2. En particular, se prefieren los polipéptidos que tienen por lo menos 30%, tal como por lo menos 40%, por ejemplq, por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, tal coplo por lo menos 70%, por ejemplo, por lo menos 80%, más preferído por lo menos 90%, o por lo menos 95% de la significará que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico se produce por la fuente o por una célula en la que se ha insertado la secuencia de ácido nucleico de la fuente. En una modalidad preferida, el polipéptido se secreta extracelularmente . Um polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido fúngico y más preferentemente un polipéptido fúngico filamentoso, tal como un polipéptido de Acre/nonium, Aspergí llus, Aureobasidium , Cryptococcus, Filibasidium, Fusari u , Humicola , Magnaporthe, Mucor, Myceliophtora , Neocall imastix, Neurospora , Paecilomyces , Penicillium , Pi .romyces Schizophyllum , Talaromyces, Thermoascus, Thiela vi a , tolypocladium o Trichoderma . En otra modalidad preferida, el polipéptido es un poli Lpéptido de Aspergillus aculea tus , Aspergillus awamori , Aspergí llus foetidus , Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulan s, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae , Fusarium bactri ai oides , Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusari um culmorum, Fusarium graminearum , Fusarium graminum , Fusari üm heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusari um reticula tum , Fusarium roseum, Fusarium sambucinum , Fusari vm sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulph ure um, Fusarium torulosum , Fusarium trichothecioides , Fusari um venena tum, Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor m iehei , Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicil lium capsula tum, Penicillium purpurogenum , Trichoderma harzían um, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachia tum , Trich oaerma reesei o Trichoderma viride . Enl una modalidad más preferida, el polipéptido se deriva de una cepa dentro de la familia de Trichocomaceae; por ejemplo , dentro del género Penicillium, por ejemplo, tal como dentro de las especies P. capsula tum en particular de la cepa de Peni cillium capsula tum CBS 292.62. Se entenderá que para las especies mencionadas anteriqrmente, la invención abarca los estados perfecto e imperfecto y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamórfc s, con respecto al nombre de las especies por las cuales se conocen. Los experimentados en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropíad?s£. Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al públicc en un número de colecciones de cultivo, tales como American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammiung von ikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmecultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . La cepa específica de Penicillium capsula tum de la que el pres ente polipéptido se aisló se obtiene de Centraalbureau Voor Schimmecultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Holanda (alternativamente P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, Holanda como número de acceso CBS 292.62. Además, tales polipéptidos pueden identificarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, composta, agua, €itc.) usando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar los microorganismos de los hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. La secuencia de ácido nucleico después puede derivarse seleccionando de manera similar una biblioteca genómica o ADNc de otro microorganismo. Una vez que una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido se ha detectado con la o las sondas, la secuencia puede aislarse o clonarse usando las técnicas cono se conocen por un experimentado en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook, et al., 1989, supra ) . Les polipéptidos codificados por las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen los pdipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión dividic.os en los que se fusiona otro polipéptido en el término N o el término C del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce fusionando una secuencia de ácido nucleico (o una porción del mismo) que codifica otro polipéptido a una secuencia de ácido nucleico (o una porción del mismo) de la presente invención. Las técnicas para producir los polipéptidos de fusión son conocí.das en la literatura, e incluyen ligar las secuencias de codi ficación que codifican los polipéptidos, de modo que estén en el marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo o mismos promotores y terminador.

Secuencias de ácidos nucleicos Ld presente invención también se relaciona con las secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipépjtido de la presente invención. En| una modalidad interesante, la secuencia de ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de ácico nucleico mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico mostraca como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad interesante de la invención la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de aminoácido mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1, una variante alélica de la misma o un fragmento de la misma capaz de codificar un polipéptido de acuerdo con la invención. Obviamente, la secuencia de ácido nucleico puede consistir de la secuencia de aminoácido mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1. La presente invención también abarca las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o| el polipéptido maduro de la misma, que difieren de la SEC ID NO: 1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se relaciona con las subsecuencias de la SEC ID NO: 1 que codifican los fragmentos de la SEC ID NO: 2 que tienen actividad de arabinofuranosidasa . Una subsecuencia de la SEC ID NO: 1 es una secuencia de ácido nucleico abarcada por los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1 excepto que se han eliminado uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' . La presente invención también se relaciona con las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención, que hibridan bajo condiciones de baja severidad, de preferencia bajo condiciones de severidad media, más preferentemente bajo condiciones de alta severicad, con (i) una hebra complementaria de la secuencia de ácico nucleico mostrada como los nucleótidos 1 a 987 de la SEC ID NO: 1 o (ii) una subsecuencia de (i) de por lo menos 100 nucleótidos. La presente invención también se relaciona con hekras complementarias de (i), (ii) y (iii). Les técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido son conocidas lf en la literatura e incluyen el aislamiento del ADN genómico, preparación del ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención de tal ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o selección del anticuerpo de las bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos de ADN clonados con las características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Applica tion, Academic Press, New York. Pueden usarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como reacción en cadena de ligasa (LCR) , transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) . La secuencia de ácido nucleico puede clonarse de una cepa de Penicillium capsula tum u otro organismo relacionado y, por ejemplo, puede ser una variante alélica o especie del polipéptido que codifica la región de la secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico aislada, por ejemplo, puede obtenerse por los procedimientos clonados estándares usados en la ingeniería genética para trasladar la secuencia de ácido nucleico de su localización natural hacia un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden involucrar el corte y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, inserción del fragmento en una molécula de vector e incorporación del vector recombinante en una célula huésped en donde serán replicadas múltiples copias o clones de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintética, sintética, o cualesquiera combinaciones de las mismas. Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se determina como se describió anteriormente. La modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de los polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a las formas que no se presentan naturalmente del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna manera diseñada del poi.ipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similares. La secuencia variante puede construirse sobre la base de la secuencia de ácido nucleico presentada como el polipéptido que codifica parte de la SEC ID NO: 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma ¡y/o mediante la introducción de las sustituciones nucleotídicas que no dan origen a otra secuencia de también pueden determinarse por el análisis de estructura tridimensional como se determina por tales técnicas, como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcadf de fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64) Constr cciones de ácidos nucleicos La. preeente invención también ee relaciona con construcciones de ácidos nucleicos, que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la presente invención enlazada operablemente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del polipéptido en una célula huéeped apropiada. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede manipularse en una variedad de formas, para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácido nucleico antes de su inserción en un vector puede ser deeeable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de las secuenciae de ácidos nucleicos que usan los métodos de ADN recombinantes eon bien conocidas en la literatura. Las secuencias de control incluyen todos loe componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia de ácido nucleicjo que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, poliadenilación, secuencia de propéptido, promotora, secuencia de péptido de señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de paro transcripcionales o traducción. Las secuencias de control pueden proporcionar con enlazadores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. La. secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional, que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección, que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de los genes que codifican los polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped Ej emplos de tales promotores apropiados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón de E. coli lac, gen de agarosa de Streptoiiiyces coelicolor ( dadA) , gen de lavansucrasa de Bacillus subtilis ( sacB) , gen de alfa-amilasa! de Bacillus licheniformis ( amyL) , gen de amilasa maltogenica de Bacillus stearothermophilus ( amyM) , gen de alfa-airilasa de Bacillus amyloliquefaciens ( amyQ) , gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y gen de beta-lactamasa procanjótica (Villa-Kamaroff et al . , 1978, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotdr tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the Na tioná 1 Academy of Sciences USA 80: 21-25). Los promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteri in Scientific American, 1980, 242: 74-94; Sambroók et al., 1989, supra . Ejemplos de los promotores apropiados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son loi promotores obtenidos de los genes de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspeirgilius niger o Aspergillus awamori ( glaA) , lipasa de P izojnu \cor miehei , proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa |fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspkrgillus nidulans y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor Na2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) y los promotores mutantes, truncados e híbridos de las mismas, En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , deshidrogenasa alcohólica/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para las células de huésped de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488 La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción apropiada, una secuencia reconocida por una célula huésped a la transcripción terminal. La secuencia terminadora se enlaza operablemente al término 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invencípn. Los terminadores preferidos para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA die Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum . Lo >s terminadores preferidos para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo de Saccharomyces cerevis iae C (CYC1) y gliceraldehído--3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huésped de levadura se describen por Romanos et al., 1992. supra . La secuencia de control también puede ser una secuencia líder apropiada, una región no traducida de un ARNm que es importa.nte para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder se enlaza operablemente al término 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped de elección puede usarse en la presente invención. Los líderes preferidos para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Asperg?llus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidula s . codificación del péptido de señal que codifica una secuencia de aminoácido enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la ruta de secreción de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico puede contener inherentemente un péptido de señal que codifica la región enlazada naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido secretado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido de señal que es extraño a la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido de señal extraño puede requerirse cuando la secuencia de codificación no contiene naturalmente una región de codificación del péptido de señal. De manera alternativa, la región de codificación del péptido de señal extraño puede reemplazar simplemente la región de codificación del péptido de señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin emtargo, puede usarse en la presente invención cualquier región de codificación del péptido de señal que dirige el polipéptido expresado en la ruta secretora de una célula huésped de elección. Las regiones de codificación efectivas del péptido de señal para las células huésped bacterianas son las regiones de codificación del péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de NCIB 11837 de Bacillus, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus , subtilisina de Bacill s licheniformis , beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasa neutra de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis . Los péptidos de señal adicionales se describen por Simonen and Palva, 1993, icrobiological Reviews 57: 109-137. Las regiones de codificación del péptido de señal efectivas para las células huésped fúngicas filamentosas son las regiones de codificación del péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , celulosa de Humicoj'.a insolens y lipasa de Humicola lanuginosa . Los péptidos de señal útiles para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones de codificación de los péptidos de señal útiles se describen por Romanos et al., 1192. supra . La secuencia de control también puede ser una región de codificación de propéptido que codifica una secuencia de aminoácido colocada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propoi:.péptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propoi:.péptido en general es inactivo y puede convertirse a un polipéptido activo maduro por división catalítica o autocatalítica del propéptido del prepolipéptido. La región de codificación del propéptido puede obtenerse de los genes de proteasa alcalina de Bacillus subtilis ( aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , alfa-factor de Sacchazomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) .

Cuando las regiones del péptido y propéptido de señal están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido se coloca próxima al término amino de un pol.péptido y la región del péptido de señal se coloca próxima al término amino de la región del propéptido. También es deseable agregar las secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido con reíación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de los sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procaríotas incluyen los sistemas del operador lac, tac y trp. En la levadura, puede usarse el sistema ADH2 o sistema GAL1. En los hongos filamentosos, el promotor de alfa-amilasa TAKA promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae puede usarse como las secuencias reguladoras. Otros ejemplos de las secuencias reguladoras son aquellos que permiten la amplificación del gen. En los sistemas eucarióticos, éstos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneina que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido sería enlazada operablemente con la secuencia reguladora.

Vectores expresxon La presente invención también se relaciona con los vectores de expresión recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, un promotor y las señales de paro de transcripción y traducción. Las di ferentes secuencias de ácido nucleico y control descritas anteriormente pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en tales sitios. De manera alternativa, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede expresarse insertando la secuencia de ácido nucleico o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creacion del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector, de modo que la secuencia de codificación se enlaza operablemente con las secuencias de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a los procedimientos de ADN recombinantes y puede llevar a cabo la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector va a introducirse. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónomamente, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmiqo, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas, en el que se ha integrado. Además, puede usarse un vector o plásmido simple o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que va a introducirse en el genoma de la célula huésped o un transposón. Los vectores de la presente invención contienen de preferencia uno o más marcadoree seleccionados que permiten la selección fácil de las células transformadas. Un marcador seleccionado es el producto de un gen que proporciona una resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y similares. Ejemplos de los marcadores seleccionados bacterianos son los genes dai de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis o los marcadores que confieren una resietencia antibiótica, tales como una resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores apropiadoe para lae célulae huéeped de levadura son ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2 , ME 3 , TRPl y URA3. los marcadores seleccionadoe para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no ee limitan a, amdS (cicetamidaea) , argB (carbamoiltraneferaea de ornitina) , bar ( fosfonotricin acetiltransferasa), hygB (higromicin fosfotrasferasa) , niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5' -fosfato descarbcxilasa) , sC (eulfato adeniltransferasa) , trpC (antranilato sintaea) , aeí como los equivalentes de las mismas. Se prefieren para el uso en una célula de Aspergill us los genes de amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptcmyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención contienen de preferencia un elemento o elementoe que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula indeper.diente del genoma. P ra la integración en el genoma de la célula huésped, el vec :or puede depender de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De manera alteirnaitiva, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleiso!s adicionales para dirigir la integración por recomb nación homologa en el genoma de la célula huésped. Las secuenaias de ácidos nucleicos adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una locali ación o localizaciones precisas en el o los cromoscj>mas. Para aumentar la probabilidad de integración a una 1 icalización precisa, los elementos integracionales deberí, n contener de preferencia un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 1,500 pares de bases, de prefer ncia 400 a 1,500 pares de bases y más preferentemente 800 a 1,500 pares de bases, que son altamente homólogos con la s cuencia blanco correspondiente para mejorar la probab lidad de la recombinación homologa. Los elementos integfracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped Además, los elementos integracionales pueden ser secuenqias de ácidos nucleicos no codificantes o codificanrtes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el seleccionado y, de esta manera, las copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico, pueden seleccionarse cultivando las células en presencia del agente seleccionado apropiado. Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son muy conocidos por los experimentados en la técnica (ver, por ejemplf, Sambrook, et al., 1989, supra ) .

Célula? huésped Lá presente invención también se relaciona con células huéspel recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nuclei o de la invención, que se usan ventajosamente en la producáion recombinante de los polipéptidos. Uf vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención se introduce en una célula huésped, de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosfmico o como un vector de auto-replicación o extracromossómico como se describió anteriormente. La elección de una célula huésped dependerá en un alto grado del gen que codififa el polipéptido y su fuente. Lá célula huésped puede ser un microorganismo unicel UlJar, por ejemplo, procariota o un organismo no unicelulJar, por ejemplo, eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas, tales como bacterias Gram positivas, que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis ? Bacillus mega terium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus o bacterias Gram negativas, tales como E. col i y Pseudomonas sp. En una modalidad preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis . En otra modalidad preferida, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana, por ejemplo, puede efectuarse por transformación de prctoplasto (ver, por ejemplo, Chang and Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por ejemplo, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5571-5278) La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo. En una modalidad preferi .da, la célula huésped es una célula de hongo. "Hongo" como se usa en la presente incluye la clase Ascomycota, Basidifmycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como se define por Ha ksworth et al., In , Ainsworth and Bisby' s Dictionary of Th e Fungi , 8th edition, 1995, CAB International, Univer ity Press, Cambridge, UK) , así como la Oomycota (como se cit . en Hawksworth et al., 1995, supra , página 171) y los hongos mitospóricos (Hawsworth et al., 1995, supra ) . E?)? una modalidad más preferida, la célula huésped fúngicá es una célula de levadura. "Levadura" como se usa en la presente, incluye una levadura ascosporogenosa (Endomycetales) , levadura basidiosporogenosa y la levadura que pefrtenece al hongo Imperfecti (Blastomicetos) . Dado que la cía sificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para J os propósitos de esta invención, la levadura será definí <}ia como se describe en Biology and Activi ties of Yeast (Skinn r, F.A., Passmore, S.M. and Davenport, R.R. eds. Soc . App . Bb cteriol . Symposium Series No. 9, 1980). Ejj una modalidad aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida , Hansenula , Kluyveromyces, Pichia , Saccharomyces , Schizosaccharomyces o Yarrowia . Eh. una modalidad más preferida, la célula huésped de levadu::a es una célula de Saccharomyces carisbergensis , E? una modalidad más preferida, la célula huésped fúngicaí filamentosa es una célula de Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra modalidad más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides , Fusarium cereal?s , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum , Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticula tum , Fusarium roseum , Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum , Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum , Fusarium torulosum , Fusarium trichothecioides o Fusarium venena tum . En una mc'dalidad aún más preferida, la célula madre fúngica filamentosa es una célula de Fusarium venena tum (Nirenberg sp. nov.). En otra modalidad más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei , Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicillium capsula tum, Penicillium purpurogenum , Thielavia terrestris , Trichoderma harzia.ium, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachia tum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride . Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que involucra la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos apropiados para la transformación de las células huésped de Aspergí llus se describen en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos apropiados para la transformación de las especiéis de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede transformarse usando los procedimientos descritos por Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simón, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción La presente invención también se relaciona con los métodos para producir un polipéptido de la presente invención, comprendiendo el método (a) cultivar una cepa del género Penicillium, para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. De preferencia, la cepa es de la especie Penicillium capsula tum .

La presente invención también se relaciona con un método para producir un polipéptido de la invención, comprendiendo el método (a) cultivar una célula huésped recombinante como se describió anteriormente bajo las condiciones que conducen uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimatico o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplcj), una prueba enzimática puede usarse para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente. El polipéptido resultante puede recuperarse por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede Recuperarse del medio nutriente por los procedimientos convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por atomización, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención pueden purififarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatfgrafia (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidroffbico, cromato-enfoque y exclusión de tamaño) , proced mientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléftrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejempl , precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE o extra ICCion (ver, por ejemplo, Protein Purifica tion, J.C.

Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) .

Expresión de las encimas en las plantas Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interé.3, tal como una arabinofuranosidasa de la presente invenc ón, puede transformarse y expresarse en plantas transgenicas como se describe a continuación, La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocot:iledónea, por un dicotiledón o monocotiledón corto, Ejemplqs de las plantas monocotiledóneas son los céspedes, tales fomo césped de la pradera (césped azul, Poa) , césped de forraj tal como Festuca , Lolium , césped templado, tal como Agros t s y cereales, por ejemplo, trigo, avenas, centeno, cebada arroz, sorgo y planta del maíz (maíz) .

Ej emplos de las planta dicotiledóneas son el tabaco, legumb es, tales como altramuz, papa, remolacha azucarera, chicha o, frijol y soya, y plantas cruciferas (familia Brassi aceae) , tales como coliflor, aceite de semilla de colza el modelo del organismo estrechamente relacionado de Ara b i dbps is thaliana . Ejjemplos de las partes de las plantas son el tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejempl ), epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristfmos . En el presente contexto, también los compartimientos celulares de plantas específicas, tales como clorop asto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citopl sma se consideran que son parte de una planta. Además, cualqu er célula de planta, cualquiera que sea el origen del tejido se considera que es una parte de la planta. Asimismo, las partes de la planta, tales como los tejidos específicos y las células aisladas para facilitar el uso de la invención tambiér. se consideran partes de la planta, por ejemplo, embrior.es, endospermas, aleurona y tegumentos. También se incluyen dentro del alcance de la invención la progenie de tales plantas, partes de la planta y células de la p.lanta. Leí célula de la planta o planta transgénica que expresa el polipéptido de interés puede construirse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula de la planta se construye incorporando una o más construcciones de expresión que codifican el polipéptido de interés en el genoma huésped de la planta y propagando la planta modificada resultante o célula de la planta en una planta transgénica o célula de planta. De manera conveniente, la construcción de expresión es una construcción de ADN que comprende un gen que codifica el polipéptido de interés en asociación operable con las secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o parte de la planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionado útil para identificar las células huésped en las que la construcción de expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (lo almacenamiento, tales como semillas, tubérculos de papa y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303) q de tejidos de hundimiento metabólicos, tales como merist mos (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un proiaotor específico de semilla, tales como un promotor de gluteli.na, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), un promotor de Vicia faba de la avenina B4 y el gen de la proteína desconocido de Vicia faba descrito por Conrad U. et al., Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp, 708-71Í (1998), un promotor de una proteína corporal de aceite de semilla (Chen et al., Plant and cell physiology vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1998), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de Bassica napus o cualquier otro promotor específico conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hojas, tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp. 991-1000 (1993), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de Chlorella (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1 pp. 85-93 (1994) o el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp. 668-674 (1995) o un promotor inductor de heridas, tales como el promotor pin2 de papa (Xu et al., Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp. 573-588 (1993). Asimismo, el promotor puede ser inducible por los tratamientos abióticos, tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias aplicadas de manera exógena que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de plantas como etileno y ácido abscísico y ácido giberélico y metales pesados. Un elemento mejorador del promotor puede usarse para activar la expresión superior de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento del mejorador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al., op ci t describen el uso del primer intrón de actina 1 de arroz para mejorar la expresión. El gen marcador seleccionado y cualesquiera otras partes de la construcción de expresión pueden elegirse de las disponibles en la técnica. La construcción de ADN se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con las técnicas convencionales conocidas en la literatura, que incluyen transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediadas por virus, micro inyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y ele troporación (Gasser et al., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989) .

Enzimas Lá alfa-L-arabinofuranosidasa se clonó usando las técnicas moleculares básicas (Sambrook et al., 1989, Molecu ar Cloning, A Labora tory Manual , 2d edition, Cold Spring Harbor, New York, Christgau et al., 1995, Curr. Genet. 27, 1 35 141, Ausubel et al., 2003, Curr. Prot. Mol. Biol., John W:.ley & Sons, Cambridge, USA) . LÍs preparaciones de Shearzyme (GH10) y Pentopan Mono (GH11) endo-1, 4-ß-xilanasa producidas por Aspergillus aculea us y Thermomyces lanuginosus, respectivamente, fueron los p|roductos comerciales de Novozymes A/S (Bagsvaerd, Dinama ca) . ción de oligosacáridos de arabinoseilano ospecificos Los oligosacáridos que contienen los grupos arabinosilo enlazaqos a la terminal (1?3) se prepararon incubando el arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1 g) en amorti uador de acetato 0.1 M (100 mL) , pH 6.0 con 6.67 g de Shearzyme (xilanasa GHlOJ'kg"1 de arabinoxilano de trigo insoluble en agua durante 2 horas a 30°C. Los oligosacáridos que contienen grupos arabinosilo enlazados al interno (1?3) se prepararon incubando el arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1 g) en amortiguador de acetato 0.1 M (100 mL) , pH 6.0 con 0.03 g de Pentopan Mono (xilanasa GH11)- kg"1 de arabinoxilano de trigo insoluble en agua durante 2 horas a 30°C ?os oligosacáridos que contienen los grupos arabinosilo enlaza los al interno (1?2) se prepararon incubando el arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1 g) en amortiecuador de acetato 0.1 M (100 mL) , pH 6.0 con 0.03 g de Pentop n Mono (xilanasa GH11) • kg"1 de arabinoxilano de trigo inso )luble en agua y alfa-L-arabinofuranosidasa de H. insolens (GH43) kg"1 de arabinoxilano de trigo soluble en agua durante 2 hora a 30°C. Para detener las reacciones enzimáticas, las mezcla se calentaron a 100°C durante 10 minutos. Los arabinoxilo-oligosacáridos se concentraron en un rotavapor y se eva..uaron por 1H-RMN.

Determinación de las condiciones de reacción óptimas Las condiciones de reacción óptimas para la a-L-arabinofuranosidasa GH62 de P. capsula tum se evaluó en moldes de diseño de superficie de respuesta Box-Behnken de dos factores (Montgomery, 2001) . Cada molde comprendió 11 combinaciones diferentes de pH (3-7) y temperatura de reacción (30-70°C) con 3 puntos centrales. El arabinoxilano de trigo soluble en agua (0.002 g) se disolvió en agua desionizada (2 mL) . La solución después se incubó con 0.1 g de proteína de enzima • kg"1 de arabinoxilano de trigo DM soluble en agua por prueba. Las muestras se retiraron exactamente después de 24 horas de reacción y se calentaron inmediatamente a 100 °C durante 10 minutos para detener la reaccion de la enzima. Las muestras después se centrifugaron a 20,0 00 g durante 10 minutos y el nivel de arabinosa se determinó en los sobrenadantes por análisis de HPAEC. Los valores reportados están en mg-g"1 de arabinoxilano de trigo DM.

Modo de acción de a-L-ara inofuranosidasas a L-arabinofuranosidasa GH62 de P. capsula tum se adiciono5 al arabinoxilano de trigo soluble en agua (0.01 g) , oligos cáridos que contienen ya sea grupos arabinosilo enlazafos a terminal (1?3) (0.01 g) , oligosacáridos que contienen grupos arabinosilo enlazados internamente a (1?3) (0.01 g) u oligosacáridos que contienen grupos arabinosilo enlazados internamente a (1?2) (0.01 g) en amortiguador de acetat 0.1 M (1 mL) , durante 2 horas, pH 6.0, 40°C. Las reacci<t>nes enzimáticas se inactivaron a 100°C durante 10 minuto . Las muestras se concentraron en un rotavapor y se analiz ron por 1H-RMN.

HPAEC Lqs hidrolisados (10 µl) se aplicaron en un sistema Dionex BioLC ajustado con una columna de guardia Dionex CarboPác™ PA1 (4 x 250 mm) (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, ÜS h ) combinado con una precolumna CarboPac™ PA1 (4 x 50 mm) . La arabinosa se separó de manera isocrática con KOH 10 mM durante 15 minutos, flujo: 1 mL-min"1. La arabinosa se detectó por un detector electroquímico pulsado en el modo de detección amperiométrico pulsado. El potencial del electrodo se programó para +0.1 V (t = 0-0.4 s) a -2.0 V (t = 0.41-0.42 s) a 0.6 V (t = 0.43 s) y por último -0.1 V (t = 0.44-0.50 s) , mientras que se integra la señal resultante de t = 0.2- 0.4 s La arabinosa (concentración de cada componente; 0.0025+0.1 g'L"1) se usó como el estándar, Análisis de ^-R Todos los productos de degradación se liofilizaron dos veces con D20 al 99.9% y se redisolvieron en D20 al 99.9%. Algunos hidrolisados se dializaron (corte del peso molecular de membrana Spectra/Por de 1000) para remover la arabinosa libre antes del análisis espectral. Los espectros de 1H-RMN se registraron a 30 °C en un instrumento Mercury-VX de Varian operado a 400 MHz y equipado con una sonda auto-interrumpida de 4 núcleos. Los datos se colectaron durante 128-512 exploraciones y la señal HDO se usó como una señal de referencia (4.67 ppm) EJEMPLOS Ejemplo 1 El arabinoxilano de trigo comprende arabinofuranosida como u monoconstituyente enlazado a la posición 3 de xilosa interna (A) y arabinofuranosida enlazada en la posición 3 (B) y 2 (C) en la xilosa disustituida, respectivamente. Se produjeron los sustratos se produjeron, cada uno comprendiendo sólo uno de los 3 tipos de enlaces de arabinófuranosida. La actividad de las arabinofuranosidasas hacia éstos sustratos se investigó usando XH RMN.

Tabla 1: Actividad de arabinofuranosidasa de P. capsula tum (GH62) en polímeros de arabinoxilano seleccionados, incuba ion a pH 6, 40°C durante 2 horas.

Sust ato Enlace Actividad Monosustituido (1?3) XX Arabinoxilano Disustituido (1?2) intacto Disustituido (1?3¡ Monosustituido ( l?2 ) inte? Arabinoxilano Monosustituido ( l?3 ) inte? XX monfsustituido MonOSUStituidO ( 1?3 ) terminal XX xx se refiere a más de 75% de hidrólisis, x(x) a 50-75% de hidról .sis, x a 25-50% de hidrólisis y (x) a 5-25% hidról .sis. - Se refiere a hidrólisis no detectable.

Ejemplo 2 El arabinoxilano de trigo soluble se incubó con 0.1 g de la proteína de enzima por kg DM de alfa-L-arabinofuranosidasa de P. capsula tum (GH62) a pH 6, 40°C durante 24 horas. La arabincsa liberada se determinó que era de 139 mg de arabincsa por g de arabinoxilano de trigo soluble en agua como el promedio de las determinaciones triplicadas. La s condiciones de reacción óptimas de pH y temperatura se determinaron que estaban entre pH 4 y 6 y entre 30 y 50°C, respectivamente. No se detectó una variación significativa en la actividad dentro de estos intervalos. Se: hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 4. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque comprende: a) la secuencia de ADN que codifica la arabinffuranosidasa mostrada en la SEC ID NO: 2, b) una secuencia de ADN análoga que tiene il) por lo menos 80% de homología con tal secuencia de ADN o iii) híbrida a alta severidad con una hebra complementaria de tal secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma, que tiene por lo menos 100 nucleótidos, iv) es una variante alélica de la misma o una hebra complementaria a a) o b) . 5 , Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque tiene por lo menos 80% de homología con la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 1, o híbrida a alta severidad con una hebra complementaria de la secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma que tiene ror lo menos 100 nucleótidos, b) es una variante alélica de la misma, o una hebra complementaria a a) o b) . 6 , Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 5, enlazada operablemente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la arabinofuranosidasa en un huésped de expresión apropiado. 7. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 9. Un método para producir una arabinofuranosidasa, caract rizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 8 bajo condiciones que conducem a la producción de la arabinofuranosidasa y recuperar la arabinofuranosidasa. 10. Una composición, caracterizada porque comprende la arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 11. Uso de la arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en una pasta. 12. Uso de la arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en un proceso de etanol. 13. Uso de la arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en un proceso de trituración. 14. Uso de la arabinofuranosidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4 en un proceso para la producción de una composición de alimentación. RESUMES? DE LA INVENCIÓN L presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa y con sequencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los poli Lppééptidos. La invención también se relaciona con las constriceiones de ácidos nucleicos, vectores y células huéspec que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, así como con los métodos para la producción y uso de los poli -peptidos .