CN109641973B - Gh10木聚糖酶、gh62阿拉伯呋喃糖苷酶、研磨方法以及其他应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了处理作物籽粒的改进方法，以提供适合于将淀粉转化成单糖和寡糖、乙醇、甜味剂的高品质的淀粉产品。本发明还提供了具有GH10木聚糖酶活性的多肽、具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽及其用途。

Description

GH10木聚糖酶、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、研磨方法以及其他 应用

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。本发明涉及具有GH10木聚糖酶活性的多肽和具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。本发明还涉及用于提取或分离粗棕榈油的方法。另外，本发明还涉及包含一种或多种适于本发明的方法的酶活性的酶组合物。

发明背景

相关技术的描述

通常使用湿磨将玉米籽粒(kernels)分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小时，以开始使淀粉和蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨(coarse grind)，以破坏果皮并使胚芽与剩余的籽粒分离。将由纤维、淀粉和蛋白质组成的剩余的浆液细磨并筛选，以将纤维与淀粉和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆或醇，或干燥并以玉米淀粉销售，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。

已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品

(可得自Novozymes A/S)适于湿磨方法的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。

最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种修改的湿磨方法，该方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。Johnston et al.,Cereal Chem,81,p.626-632(2004)。

US 6,566,125公开了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并用酶(例如，蛋白酶)孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。

US 5,066,218公开了一种研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洗谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。

WO 2002/000731公开了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。

WO 2002/000911公开了一种分离淀粉谷蛋白的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。

WO 2002/002644公开了一种洗涤自研磨方法的淀粉谷蛋白分离步骤获得的淀粉浆液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。

棕榈油是一种可食用的植物油，其获自棕榈果实的中果皮。棕榈果实或小果实生长成大束。在灭菌后，将棕榈小果实从果实束中剥离。高温导致棕榈果实中天然存在的酶变性并促进果实从束秆中剥离。将棕榈小果实排放到通常称为消化器(digester)的容器中，由此在受控温度下产生经消化的棕榈果实的糊状物(mash)。然后压榨经消化的糊状物，例如，通过使用螺旋压榨机(screw press)用于随后回收棕榈油。粗棕榈油可以进行筛选，例如，以去除粗纤维，然后进行澄清过程，以将油与水、细胞碎片和任何剩余的纤维材料分离。

棕榈果实中果皮含有大量的油，其作为中果皮细胞内的油滴存在。通常，油提取率(OER)(其是相对于棕榈果实的重量的提取油量的量度)在20-24％的范围内，这取决于例如果实品质，并受季节变化的影响。一般而言，棕榈油研磨方法在每个磨坊都经过精心优化以尽可能减少油损，但仍有强烈的动力来改进OER。

WO 2012/011130公开了用于棕榈油提取的方法中的酶组合物(具有外纤维素水解、果胶水解、乳酸水解(mammanolytic)和葡聚糖水解活性)。

仍然需要改进用于湿磨或棕榈油提取的方法。

发明概述

本发明提供了用于处理作物籽粒的方法，所述方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨所述浸泡的籽粒；c)和在有效量的具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽和/或具有GH10木聚糖酶活性的多肽的存在下处理所述浸泡的籽粒或所述玉米籽粒的级份；其中在步骤b)之前、期间或之后进行步骤c)。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括纤维洗涤步骤。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括淀粉谷蛋白分离步骤和淀粉洗涤步骤。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中步骤c)在纤维洗涤步骤期间进行。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中在0.01％-1％，优选0.05％-0.3％之间，尤其是0.1％SO₂和/或NaHSO₃的存在下进行所述浸泡。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述作物籽粒来自玉米(玉蜀黍)、稻、大麦、高粱大豆或果壳(fruit hull)或小麦。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，所述方法进一步包括在一种或多种纤维素水解酶的存在下处理所述浸泡的作物籽粒或所述作物籽粒的级份，优选所述一种或多种水解酶在生物体例如里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述作物籽粒或所述作物籽粒的级份与所述一种或多种水解酶混合，优选所述一种或多种水解酶在生物体例如里氏木霉中表达。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中包括在具有GH30木聚糖酶活性的多肽的存在下处理所述浸泡的作物籽粒或所述作物籽粒的级份。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，所述方法进一步包括在选自由以下各项组成的组的酶的存在下处理所述浸泡的作物籽粒或所述作物籽粒的级份：纤维素水解酶或纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61多肽，或其组合。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽衍生自曲霉(Aspergillus)属的菌株，例如黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有GH10木聚糖酶活性的多肽衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉的菌株。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有GH10木聚糖酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有GH30木聚糖酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述具有GH30木聚糖酶活性的多肽衍生自芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株。

在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述纤维洗涤步骤包括配置成在纤维洗涤系统中提供至少0.5小时，优选至少2小时，最优选至少4小时的总保留时间的空间。

本发明还提供了具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽，所述多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入；

c)由与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方案中，本发明的具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉的菌株。

本发明还提供了具有GH10木聚糖酶活性的多肽，所述多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入；

c)由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方案中，本发明的具有GH10木聚糖酶活性的多肽衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉的菌株。

本发明还提供了用于提取或分离粗棕榈油的方法，所述方法包括以下步骤：使包含棕榈油的底物与酶组合物接触，提取或分离所述粗棕榈油；其中所述酶组合物包含GH10木聚糖酶和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶。

在一个实施方案中，本发明的GH10木聚糖酶和本发明的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶在前述实施方案的任一项中定义。

本发明还提供了具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽、具有GH10木聚糖酶活性的多肽或具有GH30木聚糖酶活性的多肽，用于在如前述实施方案的任一项中定义的方法中改进来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率，或用于在如前述实施方案的任一项中定义的方法中改进来自粗棕榈油的油产率的用途，其中，优选所述多肽在前述实施方案的任一项中定义。

本发明还提供了包含以下各项或由以下各项组成的酶组合物：GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、GH10木聚糖酶和/或GH30木聚糖酶，优选地，所述GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、所述GH10木聚糖酶和/或所述GH30木聚糖酶在前述实施方案的任一项中定义。

在一个实施方案中，本发明的酶组合物进一步由一种或多种水解酶组成，优选一种或多种纤维素水解酶，优选地，所述一种或多种纤维素水解酶在生物体例如里氏木霉中表达。

定义

阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“阿拉伯呋喃糖苷酶”是指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,2)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用总体积200μl中100mM乙酸钠pH 5的5mg中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme InternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)/ml，在40℃下30分钟，然后通过

HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3组成的列表的一个或多个多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

含阿拉伯木聚糖的材料：术语“含阿拉伯木聚糖的材料”是指含有阿拉伯木聚糖的任何材料。阿拉伯木聚糖是在植物(包括木材和谷物颗粒)的初生和次生细胞壁两者中发现的半纤维素，由两种戊糖阿拉伯糖和木糖的共聚物组成。阿拉伯木聚糖链含有大量的1,4-连接的木糖单元。许多木糖单元由2-、3-或2,3-取代的阿拉伯糖残基取代。

含阿拉伯木聚糖的材料的实例是草料、粗饲料(roughage)、种子和谷物(来自例如玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或者通过粉碎、研磨等制备)、树木或硬木(例如杨树、柳树、桉树、棕榈、枫树、桦树)、竹子、草本和/或木本能源作物、农业食品和饲料作物、动物饲料产品、木薯皮、可可豆荚、甘蔗、甜菜、刺槐豆浆(locustbean pulp)、蔬菜或水果果渣、木材废料、树皮、刨花、锯末、木浆、制浆液、废纸、纸板、建筑和拆除木材废料、工业或城市废水固体或污泥、粪肥、酿造和/或发酵过程中的副产品、湿酒糟(wet distillers grain)、干酒糟、废谷物(spent grain)、酒糟(vinasse)和甘蔗渣。

如本文所定义的草料还包括粗饲料。草料是新鲜植物材料,例如来自草料植物的干草和青贮饲料、草和其他草料植物、草和其他草料植物、海藻、发芽谷物和豆类、或其任何组合。草料植物的实例是苜蓿(Alfalfa)(苜蓿(Lucerne))、百脉根(birdsfoot trefoil)、芸苔(brassica)(例如羽衣甘蓝(kale)、油菜籽(rapeseed)(芥花(canola))、大头菜(rutabaga)(芜菁(swede))、萝卜)、三叶草(clover)(例如杂三叶草(alsike clover)、红三叶草(red clover)、地下三叶草(subterranean clover)、白三叶草(white clover))、草(例如百慕大草(Bermuda grass)、雀麦(brome)、假燕麦草(false oat grass)、羊茅(fescue)、荒地草(heath grass)、草地草(meadow grasses)、芒草(miscanthus)、果园草(orchard grass)、黑麦草(ryegrass)、柳枝稷(switchgrass)、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、大麻、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦以及蔬菜例如甜菜。适合饲料青贮的作物是普通的草、三叶草、苜蓿、紫菜、燕麦、黑麦和玉蜀黍。草料进一步包括来自谷物生产的作物残留物(例如玉米秸秆；小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)；来自蔬菜的残留物，例如甜菜根顶(beet top)；来自油籽生产的残留物例如大豆、油菜籽和其他豆科植物的茎和叶；以及用于动物或人类消费或来自燃料生产或其他行业的谷物精炼的级份。

粗饲料通常是具有高水平纤维的干燥植物材料，例如来自种子和谷物的纤维、麸皮、皮壳(husk)和作物残留物(例如秸秆、椰干(copra)、稻草、谷壳、甜菜废物)。

含阿拉伯木聚糖的材料的优选来源是草料、粗饲料，种子和谷物、甘蔗、甜菜和木浆。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％

X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0μmole天青精(azurine)。

在一方面，本发明的GH10木聚糖酶具有至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NO:4的成熟多肽的木聚糖酶活性。

在一方面，本发明的GH30木聚糖酶具有至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NO:6的成熟多肽的木聚糖酶活性。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何包含β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends in Biotechnology15:160-167；Teeri et al.,1998,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。可以根据Lever etal.,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh et al.,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh and Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288；and Tommeet al.,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。

纤维素水解酶或纤维素酶：术语“纤维素水解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素水解酶活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素水解酶活性，以及(2)测定单独的纤维素水解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang et al.,2006,Biotechnology Advances24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素水解酶活性。最常用的总纤维素水解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.59:257-68)。

可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素水解酶蛋白的对照水解相比，在一种或多种纤维素水解酶对纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来测定纤维素水解酶活性：1-50mg的纤维素水解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃或60℃，72小时，通过

HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维二糖(anyhdrocellobiose)的均聚物，并且因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如在具有一系列取代基的复杂支链结构中的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自相同的基因)或外源的(即，来自不同的基因)，或者彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接的特定的限制性位点，可以给控制序列提供接头。

作物籽粒：术语“作物籽粒”包括来自例如玉米(玉蜀黍)、稻、大麦、高粱大豆、果壳和小麦的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、条纹玉蜀黍(striped maize)、甜玉米、蜡质玉米等。在实施方案中，玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外层覆盖，其保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气，并且对昆虫和微生物不利。“果皮”未覆盖的籽粒的唯一区域是“尖端帽(Tip Cap)”，其是籽粒至穗轴的附着点。

干固体：术语“干固体”是在干重基础上的浆液的全固体(以百分比计)。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang et al.,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)。还可以根据Ghose,1987,Pure andAppl.Chem.59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。

蛋白酶：术语“蛋白水解酶”或“蛋白酶”意指一种或多种(例如，若干种)酶，其通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而分解蛋白质的酰胺键。蛋白酶可以包括例如金属蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且与提供用于其表达的控制序列可操作地连接。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有酶活性。在一方面，片段包含酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。

胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米(yellow dent corn)中，约25％的胚芽是玉米油。胚芽覆盖或包围的胚乳构成约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白质的来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。

碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”意指破坏果皮并打开作物籽粒的任何方法。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易感于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其在自然界中相关的一种或多种或所有天然存在的成分中取出；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

研磨的：术语“研磨的”是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被分解成更小的颗粒。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

在一方面，SEQ ID NO:1的成熟多肽由氨基酸27至332组成，SEQ ID NO:1的氨基酸1至26为信号肽。

在一方面，SEQ ID NO:3的成熟多肽由氨基酸27至332组成，SEQ ID NO:3的氨基酸1至26为信号肽。

在一方面，SEQ ID NO:4的成熟多肽由氨基酸20至319组成，SEQ ID NO:4的氨基酸1至19为信号肽。

在一方面，SEQ ID NO:6的成熟多肽由氨基酸27至417组成，SEQ ID NO:6的氨基酸1至26为信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。

在一方面，GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:2的核苷酸79至996或其cDNA序列。

在另一方面，GH10木聚糖酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸58至244、301至341、401至449、511至632、685至830、884至972、1029至1052、1129至1217、1280至1345、1406至1492或其cDNA序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离或以在其他情况下在自然界中不会存在或合成的方式修饰以包含核酸的区段的单链或双链的核酸分子，其包含一个或多个控制序列。

寡糖：术语“寡糖”是具有2至10个单糖单位的化合物。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指下述结构，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列位于适当位置，使得控制序列指导编码序列的表达。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联性通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标注为“最长的同一性”的Needle输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标注为“最长的同一性”的Needle输出(使用-非简化选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉构成并且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。

浸渍(steep或steeping)：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO₂浸泡作物籽粒。

子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有阿拉伯呋喃糖苷酶或木聚糖酶活性的片段。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％(以重量计)的与其天然或重组相关的其他多肽材料的制剂。优选地，多肽为制剂中存在的总多肽材料的至少92％纯，例如至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％、至少99.5％纯和100％纯(以重量计)。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。这可以通过例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽来实现。

变体：术语“变体”意指包含在一个或多个(若干个)位置处的改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有木聚糖酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。取代意指将占据位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据位置的氨基酸；而插入意指邻近占据位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

湿磨益处：术语“湿磨益处”意指改进的淀粉产率和/或纯度，改进的谷蛋白品质和/或产率，改进的纤维、谷蛋白或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。

木聚糖降解活性或木聚糖水解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖水解活性”意指水解含木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖水解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖水解活性，和(2)测量单独的木聚糖水解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖水解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括Biely andPuchard,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova and Biely,2006,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann et al.,1997,Biochemical Journal 321:375-381。

总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oatspelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖，或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。常见的总木聚糖水解活性测定是基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如描述于Bailey et al.,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal ofBiotechnology 23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％

X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0μmole天青精。

木聚糖降解活性可以是通过测量由一种或多种木聚糖降解酶在以下典型条件下的桦树木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来测定：1ml反应、5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖水解蛋白质/g底物、50mM乙酸钠(pH 5)、50℃、24小时，如Lever,1972,Anal.Biochem.47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。

粗制油(crude oil)：术语“粗制油”(也称为非脱胶油)是指压榨或提取的油或其混合物。在本上下文中，应理解油是棕榈油，特别是未精制的棕榈油。特别地，术语“粗制油”是指来自棕榈油磨坊的螺旋压榨机的流出物；即，是指在进行澄清并将油与水分离之前，从棕榈果实的糊状物中压出的油和水的混合物。粗棕榈油也命名为CPO。粗棕榈油包含水。

消化：术语“消化”是指其中将包含棕榈油的底物保持在范围65-85℃的温度下，以使底物分解并从中果皮释放棕榈油的方法。消化可以在消化罐和/或配有挡板的预煮罐中进行。在消化期间，包含棕榈油的底物例如棕榈小果实得以分解并且油从中果皮释放出来。根据本发明，可以在消化之前或期间使包含棕榈油的底物与酶组合物接触。

油提取率(OER)：可以如Chang et al.,oil palm Industry economic journal,volume 3,2003[9]定义“油提取率(OER)”。Chang et al.将油提取率定义为回收的油和新鲜果枝(Fresh fruit branch,FFB)的比率乘以100，数学公式是：

OER＝(回收的油的重量/处理的FFB的重量)×100

棕榈油磨坊流出物(POME)：棕榈油磨坊流出物(POME)是例如从灭菌过程、粗制油澄清过程排放的废水。

棕榈压榨液：术语“棕榈压榨液”是指从压制包含棕榈油的底物中排出的液体。棕榈压榨液不是粗棕榈油，并且水尚未从棕榈压榨液中分离出来。

命名法

出于本发明的目的，命名法[Y/F]意指该位置处的氨基酸可以是酪氨酸(Try，Y)或苯丙氨酸(Phe，F)。同样，对于本文所述的其他组合，命名法[V/G/A/I]意指该位置处的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)等。除非另外进一步限制，否则定义氨基酸X使得它可以是20种天然氨基酸中的任何一种。

发明详述

研磨方法

本发明的目的在于提供处理作物籽粒的改进方法，以提供高品质的淀粉。

在一个实施方案中，有用于本发明的方法的酶组合物提供以下益处，包括改进淀粉产率和/或纯度，改进谷蛋白品质和/或产率，改进纤维、谷蛋白或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约。

此外，出人意料地，本发明人发现，由于淀粉和蛋白质级分两者与纤维级分的更好分离，根据本发明有用的酶提供纤维质量的减少和纤维的蛋白质含量的降低。将淀粉和谷蛋白与纤维分离对于工业而言是有价值的，因为纤维是湿磨方法中价值最低的产品，并且较高纯度的淀粉和蛋白质是合乎需要的。

出人意料地，本发明人已经发现，替换酶组合物中的一些蛋白酶活性可以提供相对于仅主要包含蛋白酶活性的其他方面类似的组合物的改进。这可以例如在成本和易用性的基础上为工业提供益处。

研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

在一个实施方案中，使用湿磨方法。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于平行生产糖浆的场所。

本发明的发明人已经出人意料地发现，可以通过在如本文所述的方法中处理作物籽粒而改进淀粉终产物的品质。

本发明的方法与传统方法相比，产生了更高的淀粉品质，因为淀粉终产物更纯和/或获得了更高的产率和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少或甚至完全除去需要使用的化学品(例如SO2和NaHSO3)的量。

湿磨

淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形式而形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。有待根据本发明加工的颗粒状淀粉可以是包含粗淀粉的材料，该材料包括(例如，研磨的)全谷物，这些全谷物包括非淀粉级分，如胚芽残余物和纤维。可以例如通过湿磨将原料(如全谷物)的粒度减少，以便打开结构并允许进一步加工。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。

在一个实施方案中，粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。

更特别地，将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉基本由四个步骤组成：

1.浸渍和胚芽分离，

2.纤维洗涤和干燥，

3.淀粉谷蛋白分离，和

4.淀粉洗涤。

1.浸渍和胚芽分离

通过在约50℃的温度(例如约45℃至60℃之间)下，在水中浸泡约30分钟至约48小时之间(优选30分钟至约15小时，例如约1小时至约6小时)而软化玉米籽粒。在浸渍过程中，籽粒吸水，从而将其水分含量从15％增加至45％并使大小增加超过一倍。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中过多生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的谷蛋白键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，它们裂开来，以释放胚芽。胚芽包包含价值的玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、外壳和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。

在本发明的实施方案中，于范围在40℃与60℃之间的温度(优选大约50℃)下，将籽粒在水中浸泡2-10小时，优选约3-5小时。

在一个实施方案中，在浸泡过程中可以添加0.01％-1％，优选0.05％-0.3％，尤其是0.1％SO₂和/或NaHSO₃。

2.纤维洗涤和干燥

为了得到最大的淀粉回收，期间将终产物中的任何纤维保持至绝对最小值，在加工过程期间必须从纤维中清洗游离淀粉。收集纤维，并使其成浆并过筛，以回收任何残留的淀粉或蛋白质。

3.淀粉谷蛋白分离

将来自纤维洗涤步骤的淀粉-谷蛋白悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和谷蛋白。与淀粉相比，谷蛋白具有较低的密度。通过使研磨淀粉通过离心机而容易地旋出谷蛋白。

4.淀粉洗涤

来自淀粉分离步骤的淀粉浆液包含一些不溶性蛋白质和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其除去。在水力旋流器中，将仅仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以除去最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。

产物

可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浆、玉米谷蛋白饲料、胚芽、玉米油、玉米谷蛋白粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。

棕榈油提取

本发明还提供了从包含棕榈油的底物中酶辅助提取粗棕榈油的方法。包含棕榈油的底物可以选自由以下各项组成的组：棕榈小果实、压榨棕榈果实液、捣碎或部分捣碎的棕榈小果实。发明人发现，通过在包含棕榈油的底物上使用GH10木聚糖酶，可以提高油提取率(OER)。

本发明涉及用于提取或分离粗棕榈油(CPO)的方法，包括以下步骤：

i)使包含棕榈油的底物与酶组合物接触，

ii)提取或分离所述粗棕榈油；

其中所述酶组合物包含GH10木聚糖酶和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶。

本发明的一个实施方案中，包含棕榈油的底物是棕榈小果实，其在果实的中果皮中包含油。使棕榈小果实与酶组合物接触。在一个实施方案中，底物是棕榈小果实，其被捣碎或部分捣碎并与酶组合物接触。这增加了中果皮细胞的可用性，并从而增强了对中果皮细胞的酶活性。在一个实施方案中，包含棕榈油的底物是粗棕榈油，其与酶组合物接触。本发明的多个方面和实施方案中，包含棕榈油的底物可以是还包含纤维的底物，特别是来自棕榈小果实的中果皮的纤维。

本发明的一个实施方案中，包含棕榈油的底物在与酶组合物接触之前进行灭菌。棕榈果实以大束生长，并需要在与酶组合物接触之前从束秆上剥离。新鲜果实束的蒸汽灭菌有利于从束中剥离果实以产生棕榈小果实。灭菌步骤具有若干优势，一个是它使果实中果皮软化以用于随后的消化。另一个优势是如果将棕榈果实从束秆上剥离，最终棕榈油产品的品质会更好。

灭菌可以是分批灭菌或连续灭菌。灭菌过程可以在100℃-150℃的温度下进行。本发明的一个实施方案中，在灭菌过程期间降低压力。

灭菌后，将棕榈小果实从茎秆上剥离。剥离或脱粒可以在具有旋转滚筒或配有旋转搅拌棒(rotary beater bar)的固定滚筒的机械化系统中进行，所述旋转搅拌棒将果实从束上分离并将小穗留在茎上。剥离的棕榈小果实可以与根据本发明的酶组合物接触。

本发明的一个实施方案中，在提取粗棕榈油之前，将包含棕榈油的底物进行消化。剥离的棕榈小果实可以通过一种或多种运输手段(例如传送带)运输到消化器中。在消化器中，进一步加热小果实以松散果皮。消化器通常是蒸汽加热容器，其具有附接有搅拌臂或配备有挡板的旋转轴。将小果实旋转，导致果皮从坚果(nut)上松散和中果皮降解。消化器是一个连续的过程，其中消化器保持充满，当经消化的果实被抽出时，新鲜剥离的果实被带入。

本发明的一个实施方案中，消化的第一部分在预煮器(pre-cooker)中进行。可以将底物保持在65-85℃范围内的温度下一段时间，然后转移至消化罐中。

具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽

下文中公开涉及具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽的本发明的方面的优选实施方案。

在实施方案中，本发明的具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入；

c)由与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

在实施方案中，本发明的具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

b)SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。

在一方面，多肽与成熟多肽差异在于至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施方案中，本发明涉及成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(例如若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在实施方案中，引入成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的氨基酸的数目至多为10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸变化可以是次要性质的，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1-30个氨基酸；小氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一个功能促进纯化的小延伸。

具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文使用的与给定来源相关的术语“获自”应意指由多核苷酸编码的多肽由来源或其中已插入来自来源的多核苷酸的菌株产生。在一方面，获自给定来源的多肽在细胞外分泌。

多肽可以是真菌多肽。在一个实施方案中，多肽来自散囊菌目(Eurotiales)的真菌，或来自曲霉科(Aspergillaceae)，或来自曲霉属的菌株，或来自棒曲霉(Aspergillusclavatus)或温特曲霉(Aspergillus wentii)或黑曲霉种。

在一个实施方案中，GH62阿拉伯呋喃糖苷酶衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉的菌株。

在一个实施方案中，多肽来自散囊菌目的真菌，或来自曲霉科，或来自新萨托菌(Neosartorya)属或来自费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)种。

在一个实施方案中，多肽来自散囊菌目的真菌，或来自发菌科(Trichocomaceae)，或来自踝节菌属(Talaromyces)或来自嗜松踝节菌(Talaromyces pinophilus)种。

多肽可以是细菌多肽。在一个实施方案中，多肽来自放线菌目(Actinomycetales)的细菌，或来自链霉菌科(Streptomycetaceae)，或来自链霉菌属(Streptomyces)或来自硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)或北疆链霉菌(Streptomyces beijiangensis)种。

在一个实施方案中，多肽来自放线菌目的细菌，或来自链孢子囊菌科(Streptosporangiaceae)，或来自链孢子囊菌(Streptosporangium)属或来自链孢子囊菌sp-60756种。

应当理解，对于上述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段，以及其他分类学等同物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域技术人员将容易地识别适当等同物的身份。

在许多培养物保藏中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和北方区域研究中心农业研究服务专利培养物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)中，公众易得到这些物种的菌株。

可以从其他来源鉴定和获得多肽，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或使用上述探针直接从天然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。直接从自然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见例如Sambrook et al.,1989,同上)。

具有GH10木聚糖酶活性的多肽

下文中公开涉及具有木聚糖酶活性的GH10多肽的示例性实施方案。

在实施方案中，具有GH10木聚糖酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入；

c)由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。

在一方面，多肽与成熟多肽差异在于至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施方案中，本发明涉及成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(例如若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在实施方案中，引入成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的氨基酸的数目至多为10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸变化可以是次要性质的，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1-30个氨基酸；小氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一个功能促进纯化的小延伸。

本发明的具有木聚糖酶活性的多肽(GH10木聚糖酶)可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文使用的与给定来源相关的术语“获自”应意指由多核苷酸编码的多肽由来源或其中已插入来自来源的多核苷酸的菌株产生。在一方面，获自给定来源的多肽在细胞外分泌。

多肽可以是踝节菌多肽。

在另一个实施方案中，多肽是Talaromyces leycettanus多肽，例如获自Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68的多肽。

多肽可以是曲霉属多肽。在另一个实施方案中，多肽是黑曲霉多肽。

在一个实施方案中，GH10木聚糖酶衍生自曲霉属的菌株，例如黑曲霉的菌株。

应当理解，对于上述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段，以及其他分类学等同物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域技术人员将容易地识别适当等同物的同一性。

在许多培养物保藏中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究服务专利培养物保藏中心(NRRL)中，公众易得到这些物种的菌株。

可以从其他来源鉴定和获得多肽，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或使用上述探针直接从天然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。直接从自然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见例如Sambrook et al.,1989,同上)。

具有GH30木聚糖酶活性的多肽

GH30多肽是指具有酶活性的多肽，该多肽在糖类活性酶(CAZymes)数据库(http://www.cazy.org/)中被分类为糖苷水解酶家族30的成员。

在实施方案中，具有GH30木聚糖酶活性的多肽选自下组其中具有GH30木聚糖酶活性的多肽选自由以下各项组成的组：

a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

b)SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。

在一方面，多肽与成熟多肽差异在于至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施方案中，本发明涉及成熟多肽的变体，其包含在一个或多个(例如若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在实施方案中，引入成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的氨基酸的数目至多为10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸变化可以是次要性质的，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1-30个氨基酸；小氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一个功能促进纯化的小延伸。

本发明的具有木聚糖酶活性的多肽(GH30木聚糖酶)可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文使用的与给定来源相关的术语“获自”应意指由多核苷酸编码的多肽由来源或其中已插入来自来源的多核苷酸的菌株产生。在一方面，获自给定来源的多肽在细胞外分泌。

在一个实施方案中，具有GH30木聚糖酶活性的多肽衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株。

多肽可以是细菌多肽。在一个实施方案中，多肽可以是芽孢杆菌多肽。在另一个实施方案中，多肽是枯草芽孢杆菌多肽。

应当理解，对于上述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段，以及其他分类学等同物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域技术人员将容易地识别适当等同物的同一性。

在许多培养物保藏中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究服务专利培养物保藏中心(NRRL)中，公众易得到这些物种的菌株。

可以从其他来源鉴定和获得多肽，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或使用上述探针直接从天然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。直接从自然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见例如Sambrook et al.,1989,同上)。

纤维素水解组合物

示例性纤维素水解组合物如例如WO 2015/081139和PCT/US2015/034179中所述。

在实施方案中，纤维素水解组合物衍生自木霉属(Trichoderma)的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，例如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株，和/或金小孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，例如勒克瑙金小孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)的菌株。

在优选实施方案中，纤维素水解组合物衍生自里氏木霉的菌株。

在优选实施方案中，纤维素水解组合物是里氏木霉纤维素酶制剂。

在实施方案中，纤维素水解组合物包含含有米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制剂。

在实施方案中，纤维素水解组合物包含里氏木霉纤维素水解酶组合物，进一步包含具有纤维素水解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在另一个实施方案中，纤维素水解组合物包含里氏木霉纤维素水解酶组合物，进一步包含具有纤维素水解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的序列号2)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的序列号2)。

在另一个实施方案中，纤维素水解组合物包含里氏木霉纤维素水解酶组合物，进一步包含WO 2011/041397中公开的具有纤维素水解增强活性的埃默森青霉(Penicilliumemersonii)GH61A多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的序列号2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在实施方案中，纤维素水解组合物衍生自里氏木霉RutC30。

在实施方案中，纤维素水解组合物包含含有囊状长毛盘菌(Trichophaeasaccata)GH10木聚糖酶(WO 2011/057083)和埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)β-木糖苷酶的里氏木霉纤维素酶制剂。

酶组合物

本发明还提供了由GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、GH10木聚糖酶和/或GH30木聚糖酶构成的酶组合物。

在实施方案中，本发明的酶组合物进一步包含一种或多种水解酶，优选一种或多种纤维素水解酶，优选地，所述一种或多种纤维素水解酶在生物体例如里氏木霉中表达。

在实施方案中，本发明的酶组合物进一步包含纤维素水解组合物。

优选地，组合物富集根据本发明的有用的多肽。术语“富集”表明组合物的酶活性已经增加，例如具有至少1.1的富集因子，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。在实施方案中，组合物包含本发明的第一方面的多肽和一种或多种配制剂，如下文“配制剂”小节中所述。

组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。此类组合物可以进一步包含配制剂，如下文“配制剂”小节中所述。或者，组合物可以包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自由以下各项组成的组的酶：植酸酶、木聚糖酶、半乳糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、葡萄糖醛酸酶(glucoronidase)、溶血磷脂酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、内切-1,4-β-木聚糖酶乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-糖苷酶、支链淀粉酶或其任何混合物。如下文进一步概述的，特别考虑了另外的纤维素水解活性。

在考虑阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶活性的情况下，目前考虑木聚糖酶以下列一种或多种量(剂量范围)使用：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10，其中所有这些范围是每kg底物的mg木聚糖酶蛋白(ppm)。目前考虑阿拉伯呋喃糖苷酶以下列一种或多种量(剂量范围)施用：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10，其中所有这些范围是每kg底物的mg阿拉伯呋喃糖苷酶蛋白(ppm)。进一步考虑GH10木聚糖酶与GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的比例在100:1至1:100木聚糖酶：阿拉伯呋喃糖苷酶的范围内，例如范围50:1至1:50、50:1至1:10、25:1至1:5、10:1至1:2或例如10:1至1:50、5:1至1:25、2:1至1:10木聚糖酶：阿拉伯呋喃糖苷酶。

配制剂

本发明的酶可以配制成液体或固体。对于液体制剂，配制剂可以包含多元醇(诸如例如甘油、乙二醇或丙二醇)，盐(诸如例如氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(诸如例如糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇)。因此，在一个实施方案中，组合物是液体组合物，其包含本发明的多肽和选自由以下各项组成的列表的一种或多种配制剂：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇。

对于固体制剂，制剂可以是例如颗粒、喷雾干燥的粉末或团块(agglomerate)。配制剂可以包含盐(有机或无机锌、钠、钾或钙盐例如诸如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、山梨酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(诸如例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)。

在实施方案中，固体组合物为颗粒形式。颗粒可以具有基质结构，其中组分均匀混合。然而，颗粒通常包含核心颗粒和一种或多种涂层材料，其通常是盐和/或蜡涂层材料。核心颗粒可以是本发明的木聚糖酶的均匀混合物，任选地与一种或多种另外的酶组合，并且任选地与一种或多种盐一起，或者是具有本发明的木聚糖酶的惰性颗粒，任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合。

在实施方案中，核心颗粒的材料选自由以下组成的组：无机盐(例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(诸如例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、糖或糖衍生物(诸如例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、小有机分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质。

盐涂层材料通常至少1μm厚，并且可以是一种特定的盐或盐的混合物，例如Na₂SO₄,K₂SO₄,MgSO₄和/或柠檬酸钠。其他实例是描述于例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034中的那些或例如WO 2001/00042中所述的聚合物涂层材料。

酶量

在湿磨方法中可以以有效量添加酶，所述有效量可以根据从业者和具体过程需要进行调节。通常，酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/gDS籽粒的量存在。在具体的实施方案中，酶可以按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

在棕榈油提取的一些实施方案中，相对于包含棕榈油的底物的量，酶以对应于10-1000ppm的量配量(dose)，例如20-1000ppm、30-1000ppm、40-1000ppm、50-1000ppm、100-1000ppm、200-1000ppm、100-500ppm，例如200-500ppm、250-400ppm或350-1000ppm。

通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

酶

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A：衍生自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:1)。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B：衍生自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:3)。

GH10木聚糖酶：衍生自黑曲霉的GH10木聚糖酶(SEQ ID NO:4)。

GH30木聚糖酶：衍生自枯草芽孢杆菌的GH30木聚糖酶(SEQ ID NO:6)。

Celluclast 1.5L：包含纤维素酶的商业产品，可在Novozymes A/S获得。

实施例1：来自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的克隆和重组表达

使用基因特异性引物(其也包括紧接起始密码子5’的Kozak翻译起始序列“CACC”)从分离自爱尔兰的黑曲霉菌株分离的基因组DNA中PCR扩增具有SEQ ID NO:2的阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因。将PCR扩增产物克隆到已经用限制酶BamHI和XhoI消化的曲霉表达载体pMStr57(WO 04/032648)中。

证实了克隆在表达载体中的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因的序列，并且通过描述于Christensen et al.,1988,Biotechnology 6,1419-1422和WO 04/032648的方法将表达构建体转化到米曲霉菌株MT3568中。基于由表达载体中的选择标志物赋予的利用乙酰胺作为氮源的能力，在从原生质体再生期间选择转化体。通过将转化体在96孔深孔微量滴定板中在30℃下在YPG培养基(WO 05/066338)中培养4天并通过SDS-PAGE监测阿拉伯呋喃糖苷酶表达来评估重组阿拉伯呋喃糖苷酶的产生。选择在微量滴定板培养物中显示最高表达水平的转化体，并在选择下再分离两次。

为了更大规模生产重组阿拉伯呋喃糖苷酶，将选择的转化体在含有150ml DAP-4C-1培养基(WO 12/103350)的500ml带挡板的烧瓶中培养。将培养物在旋转台上以150RPM摇动4天。随后通过0.22μm过滤单元将培养液与细胞材料分离。

实施例2：来自黑曲霉的重组阿拉伯呋喃糖苷酶的色谱纯化

将经过滤的样品的pH调节至约pH 7.5并加入1.8M硫酸铵。将样品施加至

Explorer上的5ml HiTrap^TM Phenyl(HS)柱。在上样之前，已将柱在5个柱体积(CV)的50mMHEPES+1.8M AMS(硫酸铵)pH 7中平衡。为了除去未结合的材料，用5CV的50mM HEPES+1.8MAMS pH 7洗涤柱。使用50mM HEPES+20％异丙醇pH 7将目标蛋白质从柱洗脱到10ml环中。从环中，将样品加载到脱盐柱(HiPrep^TM 26/10Desalting)上，该柱已经用3CV的50mM HEPES+100mM NaCl pH 7.0平衡。用50mM HEPES+100mM NaCl pH 7.0洗脱目标蛋白质，并基于色谱图选择相关级分并合并。流速为5ml/分钟。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶编码序列和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的全长氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。N端序列的测定是：KCSLPSS，其通过N端Edman降解测序测定。

实施例3：从黑曲霉NN053297中提取基因组DNA

从2010年从云南省采集的温泉土壤样品中分离出黑曲霉菌株NN053297。

将黑曲霉菌株NN053297接种在PDA平板上并在37℃下温育4天。收集菌丝体并在无菌研钵中在液氮中冷冻，并用研杵碾磨成细粉。然后遵循制造商的说明用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit)(Bioer TechnologyCo.Ltd.,Hangzhou,China)提取基因组DNA。

实施例4：将黑曲霉GH10木聚糖酶基因克隆到米曲霉表达载体中

基于来自公共数据库的DNA信息，设计如下所示的寡核苷酸引物以扩增黑曲霉GH10木聚糖酶的编码序列。GH10木聚糖酶编码序列和全长氨基酸序列显示为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4。引物由Invitrogen，Beijing，China合成。

引物1	ACACAACTGGGGATC<u>CACC</u>atggttcagatcaaggtagctgcac
		引物2	CCCTCTAGATCTCGAGctagagagcatttgcgatagcagtgta

引物1和引物2的小写字符代表基因的编码区。而粗体字符代表与如WO2013029496中描述的米曲霉表达载体pCaHj505的插入位点同源的区域。引物1中的4个带下划线的字母表示作为翻译过程的起始的Kozark序列。

在实施例1中制备基因组DNA。Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Phusion^TM High-Fidelity DNA Polymerase)(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)用于PCR扩增。使用In-fusionCF Dry-down PCR克隆试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)将片段克隆到表达载体pCaHj505中。表达载体pCaHj505含有衍生自米曲霉的TAKA-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子元件。此外，pCaHj505具有用于在大肠杆菌中选择和增殖的pUC19衍生序列，和amdS基因，其编码衍生自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的乙酰胺酶基因，用于选择amds+曲霉转化体。通过用Bam I和Xho I消化使质粒pCaHj505线性化，使用TBE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用illustra GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GelBand Purification Kit)(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)遵循制造商的说明进行纯化。

对于基因扩增，进行PCR反应，其包含引物对、引物1和2以及黑曲霉NN053297的基因组DNA作为模板。简而言之，20皮摩尔的每个引物对用于PCR反应中，PCR反应由2μl基因组DNA，10μl 5X

GC缓冲液(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，1μl 2.5mM每种dATP、dTTP、dGTP和dCTP和0.6单位PHUSION^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)构成，最终体积为50 μl(用去离子水)。使用Peltier热循环仪(MJ Research Inc.,South SanFrancisco,CA,USA)进行扩增，程序设定用于在98℃下变性1分钟；10个循环，每个在98℃变性15秒，在68℃退火30秒，每个循环减少1℃，并在72℃延伸3分钟；25个循环，每个在98℃下15秒，58℃下30秒，并在72℃下3分钟；并且最后在72℃下延伸7分钟。然后加热块进入4℃的浸泡(soak)循环。

通过使用ILLUSTRA^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒从溶液中纯化PCR产物(～1.5kb)。

然后通过使用Fusion^TM Dry-down PCR克隆试剂盒将经纯化的PCR产物连接至线性化的载体pCaHj505，产生p505-GH10_AnNz，其中黑曲霉GH10木聚糖酶基因的转录受到来自米曲霉α-淀粉酶基因的启动子的控制。简而言之，对于连接反应，将In-Fusion Dry Down混合物的沉淀物悬浮于2 μl双蒸H2O中，并取1μl加入管中的0.3μl线性化载体pCaHj505和3.7μlPCR产物中。连接反应在50℃温育15分钟。

所有5μl连接溶液用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TIANGEN Biotech(Beijing)Co.Ltd.,Beijing,China)。将连接溶液加入50μl冷冻-解冻感受态细胞中并在冰上保持30分钟。然后将细胞在42℃热激1分钟，并置于冰上2分钟。接下来，将200μl LB培养基加入至细胞，并在37℃下在热混合器中以350rpm振荡温育60分钟。最后，将所有细胞涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下温育过夜。

挑取2个菌落以使用3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems Inc,Foster City,CA,USA)测序。确认序列后，接种具有正确插入的菌落用于使用

SpinMiniprep试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)通过遵循制造商的说明进行质粒DNA提取。因此，制备了p505-GH10_AnNz的质粒DNA用于实施例5中的米曲霉转化。

实施例5：米曲霉MT3568中黑曲霉GH10木聚糖酶基因的表达

根据Christensen et al.,1988,Bio/Technology 6:1419-1422的方法制备米曲霉MT3568原生质体。对于转化，使用3μg p505-GH10_AnNz的质粒DNA来转化米曲霉MT3568。转化产生了若干个转化体。分离四个转化体并接种到24孔板中的3ml Dap4C培养基中，并在30℃，150rpm温育。温育3天后，在NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶w/MES(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)上根据制造商的说明分析来自每种培养物的20μl上清液。用Instant Blue(Expedeon Ltd.,Babraham Cambridge,UK)染色所得的凝胶。培养物的SDS-PAGE概况(profile)显示所有4个转化体均具有35kDa处的蛋白质条带。将每个基因具有最高表达水平的转化体命名为O34EQ8。

实施例6：黑曲霉GH10木聚糖酶的制备

2个斜面的表达菌株O34EQ8用于接种12个2升的烧瓶，每个烧瓶含有400ml Dap4C培养基。详细地，将每个斜面用10ml Dap4C培养基洗涤并接种到6个烧瓶中，在30℃，80rpm振荡。在第4天收获培养物并使用0.22μm DURAPORE膜(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤。纯化后，得到黑曲霉GH10木聚糖酶。

实施例7：在湿磨方法中酶的用途

在用酶和不用酶温育后，通过10-g纤维测定测量从纤维中分离的淀粉和谷蛋白的量。10-g纤维测定通常描述为，其在酶的存在下，在与该方法相关的条件(pH 3.5至4，温度约52℃)下和在1至4小时之间的时间段内温育湿纤维样品，所述湿纤维样品在纤维压制后从湿磨厂获得并在乳酸缓冲液中重悬至含有5％干固体纤维(其等于来自100克玉米干物质的纤维含量)的200-g浆液中。温育后，将浆液转移并压过筛子(通常为100微米或更小)，期间收集通过的滤液。使用刮刀压制保留在筛子上的纤维以尽可能多地回收滤液。然后将压制的纤维转移到含有200-ml水的烧杯中并搅拌。使浆液通过75微米筛子，并将收集的滤液与第一个合并。再次重复上述压制、洗涤和过滤步骤，以便回收最终的滤液并与前两者合并。然后将合并的滤液真空过滤，这次通过玻璃微滤纸(Whatman)，其保留从纤维释放并通过75微米筛网的不溶性固体。在滤纸上通过200ml水以除去任何痕量的可溶物后，将保留在滤纸上的总不溶性固体干燥并称重。干重报告为释放的淀粉+谷蛋白，以起始底物的纤维干物质的百分比(w/w)计。

实施例8：GH10木聚糖酶和/或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的用途

在pH 3.8下进行10-g纤维测定，使用包括Celluclast和GH10木聚糖酶A的混合物，与GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B组合，以35μg酶蛋白每克玉米的剂量在52℃温育1小时。混合物由5％GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B、15％GH10木聚糖酶A和来自Celluclast的剩余80％组成。用于比较，包括仅含有Celluclast和GH10木聚糖酶A的混合物(无GH62阿拉伯呋喃糖苷酶)。在纤维测定中使用具有13.63％残余淀粉和10.44％残余蛋白质的玉米纤维作为底物。对以下指定剂量从玉米纤维中释放的淀粉+谷蛋白(干物质)进行测量。

表1

如表1中所示，在Celluclast+GH10木聚糖酶A之上添加GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B可以显著提高玉米湿磨方法中淀粉+谷蛋白的产率。

实施例9：GH10木聚糖酶和/或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的用途

在pH 3.8下进行10-g纤维测定，使用包括Celluclast和GH10木聚糖酶A的混合物，与GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B组合，以30μg酶蛋白每克玉米的剂量在52℃温育1小时。混合物由5％GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B、15％GH10木聚糖酶A和来自Celluclast的剩余80％组成。用于比较，包括仅含有Celluclast和GH10木聚糖酶A的混合物(无GH62)。在纤维测定中使用具有16.67％残余淀粉和10.77％残余蛋白质的玉米纤维作为底物。对以下指定剂量从玉米纤维中释放的淀粉+谷蛋白(干物质)以及单独的淀粉和蛋白质进行测量。

表2

如表2中所示，在Celluclast+GH10木聚糖酶A之上添加GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B可以显著提高玉米湿磨方法中淀粉+谷蛋白的产率。

实施例10：GH10木聚糖酶、GH30木聚糖酶和/或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的用途

在pH 3.8下进行10-g纤维测定，使用含有GH10木聚糖酶A、GH30木聚糖酶A、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A和Celluclast的酶混合物(具有35μg EP/g玉米的详细比例，如下表所示)，以35μg酶蛋白每克玉米的剂量在52℃温育1小时。

表3

用于比较，包括仅含有Celluclast的酶组合物。在纤维测定中使用纤维中具有15.52％残余淀粉和12.00％残余蛋白质的玉米纤维作为底物。对指定剂量从玉米纤维中释放的淀粉+谷蛋白(干物质)进行测量；结果提供于以下表4中。

表4

如表4中所示，在Celluclast+GH10木聚糖酶A之上添加GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A+GH30木聚糖酶A可以显著提高玉米湿磨方法中淀粉+谷蛋白的产率。

实施例11：经灭菌的棕榈果实中果皮的制备

实施例12：底物的制备

压制灭菌的棕榈果实中果皮：

实施例13：用于棕榈底物的10克测定方案

1.将10g制备的糊状物在间歇混合的情况下等分到50ml Falcon管中，以确保底物均匀性。记下称重的底物的确切重量；

2.另外，记下要用于收集提取的油的塑料培养皿(petriplate)的空重；

3.用底物对管预条件化(pre-condition)，将它们保持在90℃下5分钟；

4.将管转移至相应的温育温度(55℃)水浴并将它们预条件化10分钟；

5.在对照的情况下用500μL的水接种管，而在其他酶处理的情况下用500μL的酶溶液接种；

6.加入酶/水后，将内容物用微型刮刀按顺时针方向混合5次，并且按逆时针方向混合5次，以确保适当混合；

7.温育指定时间(15分钟/30分钟)，温育每隔15分钟用刮刀间歇混合，如步骤6中所规定；

8.在温育结束时，向每个管中加入20ml水并充分混合；

9.为了澄清，将管转移到90℃水浴中并允许其澄清30分钟；

10.在台式离心机中以7000rpm、30℃将管离心10分钟，以在顶部获得油层；

11.将油层移出到预先称重的培养皿中。使用热水从每个管中完全提取游离油；

12.记下具有提取的油的培养皿的重量；

13.油产率可以计算为：油产率＝含有提取的油的培养皿的重量-空培养皿的重量。

表5

如表5中所示，添加GH10木聚糖酶A和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A可以增加来自10克棕榈中果皮的油产率。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> GH10木聚糖酶、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、研磨方法以及其他应用

<130> 14402-WO-PCT[2]

<150> PCT/CN2016/107281

<151> 2016-11-25

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 1

Met Lys Phe Phe Asn Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr

1 5 10 15

Leu Ile Ala Leu Thr Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ser Leu Pro Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly

35 40 45

Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His

50 55 60

Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met

65 70 75 80

Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Gln

85 90 95

Thr Ala Thr Pro Phe Asn Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys

100 105 110

Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe

115 120 125

Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser

130 135 140

Glu Gln Ala Leu Phe Thr Gly Lys Leu Ser Asp Ser Ser Thr Gly Ala

145 150 155 160

Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe

165 170 175

Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu

180 185 190

Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala

195 200 205

Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly

210 215 220

Glu Gly Asn Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr

225 230 235 240

Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu

245 250 255

Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Lys Pro Phe Ala Gly Lys Ala

260 265 270

Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Glu Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val

275 280 285

Arg Asn Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln

290 295 300

Leu Leu Tyr Gln Gly His Asp Pro Asn Ser Ser Gly Asp Tyr Asn Leu

305 310 315 320

Leu Pro Trp Lys Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln

325 330

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 2

atgaagttct tcaatgccaa aggcagcttg ctgtcatcag gaatttacct cattgcatta 60

accccctttg ttaacgccaa atgctctctt ccatcgtcct atagttggag ttcaaccgat 120

gctctcgcaa ctcctaagtc aggatggacc gcactgaagg actttactga tgttgtctcg 180

gacggcaaac atatcgtcta tgcgtccact actgatgaag cgggaaacta tggctcgatg 240

acctttggcg ccttctcaga gtggtcgaac atggcatctg ctagccagac agccaccccc 300

ttcaatgccg tggctcctac cctattctat ttcaagccga aaagcatctg ggttctggcc 360

taccaatggg gttccagtac attcacctac cgcacctccc aagatcccac caatgtcaat 420

ggctggtcgt cggagcaggc gcttttcacc ggaaaactca gcgactcaag caccggtgcc 480

attgaccaga cggtgattgg cgacgatacg aatatgtatc tcttctttgc cggcgacaac 540

ggcaagatct accgatccag catgtccatc gatgaatttc ccggaagctt cggcagccag 600

tacgaggaaa ttctgagtgg tgccaccaac gacctattcg aggcggtcca agtgtacacg 660

gttgacggcg gcgagggcaa cagcaagtac ctcatgatcg ttgaggcgat cgggtccact 720

ggacatcgtt atttccgctc cttcacggcc agcagtctcg gtggagagtg gacagcccag 780

gcggcaagtg aggataaacc cttcgcaggc aaagccaaca gtggcgccac ctggaccgaa 840

gacattagcc atggtgactt ggttcgcaac aaccctgatc aaaccatgac tgtcgatcct 900

tgcaacctcc agttgctcta tcagggccat gaccccaaca gcagtggcga ctacaacctc 960

ttgccatgga agccgggcgt ccttaccttg aagcagtga 999

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 3

Met Lys Phe Leu Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr

1 5 10 15

Leu Ile Ala Leu Ala Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro Ser

20 25 30

Thr Tyr Ser Trp Thr Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly

35 40 45

Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asn Gly Lys His

50 55 60

Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Thr Gln Gly Asn Tyr Gly Ser Met

65 70 75 80

Gly Phe Gly Ala Phe Ser Asp Trp Ser Asp Met Ala Ser Ala Ser Gln

85 90 95

Thr Ala Thr Ser Phe Ser Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe

115 120 125

Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser

130 135 140

Glu Gln Ala Leu Phe Thr Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ser Thr Gly Ala

145 150 155 160

Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe

165 170 175

Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asn Asp

180 185 190

Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala

195 200 205

Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly

210 215 220

Glu Gly Asp Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr

225 230 235 240

Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu

245 250 255

Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Gln Pro Phe Ala Gly Lys Ala

260 265 270

Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asp Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val

275 280 285

Arg Asn Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Gln

290 295 300

Leu Leu Tyr Gln Gly His Asp Pro Asn Ser Asn Ser Asp Tyr Asn Leu

305 310 315 320

Leu Pro Trp Lys Pro Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln

325 330

<210> 4

<211> 319

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 4

Met Val Gln Ile Lys Val Ala Ala Leu Ala Met Leu Phe Ala Ser Gln

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Pro Ile Glu Pro Arg Gln Ala Ser Val Ser Ile Asp

20 25 30

Thr Lys Phe Lys Ala His Gly Lys Lys Tyr Leu Gly Asn Ile Gly Asp

35 40 45

Gln Tyr Thr Leu Thr Lys Asn Ser Lys Thr Pro Ala Ile Ile Lys Ala

50 55 60

Asp Phe Gly Ala Leu Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr

65 70 75 80

Glu Pro Ser Arg Gly Gln Phe Ser Phe Ser Gly Ser Asp Tyr Leu Val

85 90 95

Asn Phe Ala Gln Ser Asn Asn Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val

100 105 110

Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Gln Ser Ile Thr Asp Lys Asn

115 120 125

Thr Leu Ile Glu Val Met Glu Asn His Ile Thr Thr Val Met Gln His

130 135 140

Tyr Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ile Phe Asn

145 150 155 160

Glu Asp Gly Ser Leu Arg Asp Ser Val Phe Tyr Lys Val Ile Gly Glu

165 170 175

Asp Tyr Val Arg Ile Ala Phe Glu Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn

180 185 190

Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro

195 200 205

Lys Leu Thr Gly Met Val Ser His Val Lys Lys Trp Ile Ala Ala Gly

210 215 220

Ile Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Ala Leu

225 230 235 240

Asn Ala Leu Ala Gly Ala Gly Thr Lys Glu Ile Ala Val Thr Glu Leu

245 250 255

Asp Ile Ala Gly Ala Ser Ser Thr Asp Tyr Val Glu Val Val Glu Ala

260 265 270

Cys Leu Asn Gln Pro Lys Cys Ile Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala

275 280 285

Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ser Ser Ser Thr Pro Leu Leu Phe Asp Ser

290 295 300

Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Ala Tyr Thr Ala Ile Ala Asn Ala Leu

305 310 315

<210> 5

<211> 1495

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 5

atggttcaga tcaaggtagc tgcactggcg atgcttttcg ctagccaggt actttctgag 60

cccattgaac cccgtcaggc ttcagtgagt attgatacca aattcaaggc tcacgggaag 120

aaatatcttg gaaacattgg tgatcagtac accttgacca agaactcgaa gactccggcc 180

attatcaagg ccgattttgg cgcgttgact ccagagaaca gcatgaagtg ggatgctact 240

gaacgtaagt acaatcccct catcattatc attgcgactc agactaaatc agaagtatag 300

ccagccgtgg acagttctct ttctcaggat cggactacct ggtacgtaca gcacttctca 360

acccttcact atagtcgtgc tcgaggctta cataacttag gtcaactttg cccagtctaa 420

caacaagctg atccgcggac atactctcgg tgagtttttg acgtactagc gtgggaagca 480

taccaagaca gtgaagctaa actcaaccag tgtggcactc gcagctcccc tcctgggtcc 540

aatccatcac ggacaagaat acactgatcg aagtcatgga gaatcacatc accacagtga 600

tgcaacacta taagggcaag atttatgcct gggtaggctg tcacccatca acttctcaaa 660

agtgttatta ttaatcgtct taaggatgtt gtcaatgaaa tcttcaacga agacggctcc 720

ctacgcgaca gcgtctttta caaggtcatc ggcgaggact acgtgcggat cgccttcgag 780

actgctcggg ctgcagatcc caatgcaaag ctctacatca atgattacaa gtaagtcata 840

tttgcctctc tcctgttacc aattggatac taaatttgaa aagcctggat tccgcctcct 900

accctaaatt gaccggcatg gttagccatg tcaagaagtg gatcgcagct ggcatcccta 960

tcgatggaat cggtaagccc cttgtgatca gatgttcccg gctattattt ctcatctttc 1020

ttcaaaaggt tcccaaaccc acttgagcgc tggtggaggt gctggaattt ctggataagt 1080

accccctccc ctttattctg gttgacgata gctgatagtc ccttacagct ctcaatgctc 1140

tcgcaggtgc cggcaccaag gagattgctg tcaccgagct tgacatcgct ggcgccagct 1200

cgaccgacta cgtggaggta agtcgcgaca agccaagtac atagtgtgat taactgatac 1260

caattctcca aatctacagg tcgtcgaagc ctgcctgaac cagcccaagt gtatcggtat 1320

caccgtttgg ggagttgctg acccggtaat tacccctgca gtccggatga tgtcttgcct 1380

taaaacatga gctaatttca atcaggattc ctggcgctcc agctccactc ctctgctgtt 1440

cgacagcaac tacaacccga agcctgcata cactgctatc gcaaatgctc tctag 1495

<210> 6

<211> 417

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 6

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr

20 25 30

Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly Met

35 40 45

Asn Trp Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg Glu Thr

50 55 60

Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Ile

65 70 75 80

His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys Glu Val Glu Thr Ala

85 90 95

Lys Ser Ala Leu Lys Leu Gly Ala Ile Val Phe Ala Ser Pro Trp Asn

100 105 110

Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn Arg Asn Gly Asp Thr Ser

115 120 125

Ala Lys Arg Leu Lys Tyr Asn Lys Tyr Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu

130 135 140

Asn Asp Phe Val Thr Phe Met Lys Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp

165 170 175

Thr Pro Gln Glu Met Leu Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile

180 185 190

Asn Ala Arg Val Ile Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Leu Lys Asn Leu

195 200 205

Ser Asp Pro Ile Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Ala Asn Met Asp Ile

210 215 220

Leu Gly Thr His Leu Tyr Gly Thr Gln Leu Ser Gln Phe Pro Tyr Pro

225 230 235 240

Leu Phe Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Asp Leu Trp Met Thr Glu Val

245 250 255

Tyr Tyr Pro Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala

260 265 270

Leu Asp Val Ser Gln His Ile His Asn Ala Met Val Glu Gly Asp Phe

275 280 285

Gln Ala Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro Met Lys

290 295 300

Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala His Phe Ser

305 310 315 320

Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Ile Asp Ala Thr Lys Asn Pro

325 330 335

Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly Asp Asn Lys Val Val

340 345 350

Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly Val Asn Gln Asn Phe Val

355 360 365

Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Asn Val Ser Arg Trp Ile Thr Ser Ser

370 375 380

Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Gly Asn His

385 390 395 400

Phe Trp Ala His Leu Pro Ala Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Val Asn

405 410 415

Arg

Claims (4)

1.用于处理玉米籽粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b)碾磨所述浸泡的籽粒；和

c)在有效量的纤维素水解酶、具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽和具有GH10木聚糖酶活性的多肽的存在下处理所述浸泡的籽粒或所述籽粒的级份；

其中，在步骤b)之后进行步骤c)，所述方法进一步包括纤维洗涤步骤_，步骤c)在纤维洗涤步骤期间进行。

2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括淀粉、谷蛋白分离步骤和淀粉洗涤步骤。

3.权利要求1的方法，其中在0.01～1％的SO₂和/或NaHSO₃的存在下进行所述浸泡。

4.权利要求1的方法，其中，所述纤维素水解酶在里氏木霉中表达。