RO116211B1

RO116211B1 - Polipeptida cu activitate de degradare a arabinoxilanului, adn recombinant, ce o codifica, procedeu de obtinere si compozitie alimentara cu aceasta

Info

Publication number: RO116211B1
Application number: RO96-00873A
Authority: RO
Inventors: Der Wouw Monique Josina An Van; Ooijen Albert Johannes Jos Van; Marcus Matheus Cathar Gielkens; Graaff Leendert Hendrik De; Jacob Visser
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-28
Publication date: 2000-11-30
Also published as: AU692595B2; ATE239083T1; CN101525605A; DE69530568D1; PL314105A1; HU9601087D0; NO961663D0; WO1996006935A2; KR960705920A; EP0730653B1; BR9506332A; FI961622A; NO961663L; FI961622A0; CN1134727A; WO1996006935A3; CA2174844A1; CN100415889C; MX9601430A; SI9520013A

Abstract

Prezenta inventie se refera la o polipeptida avand activitate de degradare a arabinoxilanului, o secventa de ADN recombinant, care o codifica, la procedeul de obtinere al polipeptidei avand activitate de degradare a arabinoxilanului in celulele in care se introduce ADN-ul recombinant, care cuprinde un fragment de ADN, care codifica polipeptida, avand activitate de degradare a arabinoxilanului sau o polipetida precursor a acesteia, prin tehnici de recombinare si la o compozitie alimentara cu polipeptida care prezinta activitate de degradare a arabinoxilanului.

Description

Invenția se referă la o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului, o secvență ADN recombinant care o codifică, un procedeu de obținere a polipeptidei și o compoziție alimentară cu polipeptidă care prezintă activitate de degradare a arabinoxilanului. Polipeptidă prezintă activitate enzimatică de degradare a arabinoxilanului și este adecvată pentru a fi folosită în procese industriale, cum ar fi producerea pâinii, prelucrarea hârtiei și celulozei, și în prepararea hranei și alimentelor (aditivi).

Sunt cunoscute, din EP 463706, izolarea, caracterizarea și donarea genei unei endo-xilanaze din Aspergillus tubigensis. Această enzimă nu este capabilă să atace catenele laterale ale structurii de arabinoxilan.

Este, de asemenea, cunoscută compoziția peretelui celular a plantei, iar aceasta este complexă și variabilă. Polizaharidele sunt găsite, în principal, sub formă de catene lungi de celuloză (principalul component structural al peretelui celular al plantei), hemiceluloză (cuprinzând diverse catene β-xilan) și pectină. întâlnirea, distribuția și trăsăturile structurale ale polizaharidelor peretelui celular la plantă sunt determinate de:

(1) specia de plantă;

(2) varietate;

(3) tipul țesutului;

(4) condițiile de creștere;

(5) vârstă;

(6) prelucrarea plantei înainte de alimentare.

Există diferențe de bază între monocotiledonate (de exemplu, cereale și ierburi) și dicotiledonate (de exemplu, trifoi, rapiță de sămânță și soia) și între sămânță și părțile vegetative ale plantei (Chesson, A., 1987, “Recent Advances in Animal Food Nutrition: Carre, B. și Brillouet, J.M., 1986, “J. Science and Food Agric. 37: 314351).

Monocotiledonatele sunt caracterizate prin prezența unui complex de arabinoxilan ca suport hemicelulozic principal. Structura principală a hemicelulozei în dicotiledonate este un complex de xiloglucan. Mai mult, concentrații mai ridicate de pectină sunt găsite în dicotiledonate față de monocotiledonate. Semințele sunt, în general, bogateJn substanțe pectice, dar relativ sărace în material celulozic.

în peretele celular pot fi distinse trei structuri polizaharidice care interacționează mai mult sau mai puțin:

(1) lamela medie formează exteriorul peretelui celular. Ea servește, de asemenea, ca punct de atașare pentru celulele individuale una de alta în matricea țesutului plantei. Lamela medie constă din săruri de calciu ale pectinelor puternic esterificate;

(2) peretele primar este situat chiar în interiorul lamelei medii. El are o structură bine organizată de microfibrile de celuloză îmbibate într-o matrice amorfă de pectină, hemiceluloză, esteri fenolici și proteine;

(3) peretele secundar este prezent la plantele mature, în timpul creșterii plantei și fazei de îmbătrânire, se depozitează microfibrile de celuloză, hemiceluloză și lignină.

Peretele celular primar al celulelor de plante mature metabolic active (de exemplu, mezofil și epidermă) este mai susceptibil pentru hidroliză enzimatică decât peretele celular secundar, care de la acest stadiu devine puternic lignificat.

RO 116211 Bl în peretele celular exista un grad ridicat de interacțiune între celuloză, hemiceluloză și pectină. Degradarea enzimatică a acestei structuri polizaharidice intens reticulate nu este un proces simplu. De exemplu, pentru degradarea completă a unui arabinoxilan sunt necesare cel puțin cinci enzime diferite. Endoclivarea este efectuată prin folosirea unei endo^(1-4)-D-xilanaze. 50

Εχο-β(1 -4)-D-xilanaza eliberează unități de xiloză la capătul nereducător al polizaharidei. Alte trei enzime (ce-glucuronidaza, α-L-arabinofuranozidaza și acetil esteraza] sunt folosite pentru a ataca substituenții de pe structura xilanului. Alegerea enzimelor specifice este dependentă, desigur, de hemiceluloza specifică care trebuie degradată (McCIeary, B.V. și Matheson, N.K., 1986, “Adv. Carb. Chem, and 55 Biochem. 44: 147-276).

Enzimele care atacă cățelele laterale ale structurii de xilan pot fi de interes, deoarece ele schimbă caracteristicile polimerului, făcându-l mai potrivit pentru unele aplicații. Mai mult decât atât, aceste enzime pot acționa sinergie cu unele endoxilanaze care clivează catena principală (Kormelink, 1992, “Teză Phd’, Universitatea 60 din Wageningen).

Este cunoscut un fragment ADN care codifică o activitate de degradare a arabinoxilanului. în cererea de brevet european EP 463706 este descrisă izolarea, caracterizarea și donarea genei endo-xilanaze din Aspergillus tubigensis; această enzimă nu este capabilă să atace catenele laterale ale structurii de arabinoxilan. 65

Activități enzimatice capabile să atace catene laterale sunt cunoscute, de asemenea, de la Aspergillus niger (Kormelink, 1991, de mai sus, capitolele 6 și 7). O enzimă denumită arabinofuranozidază A (ArafurA) este caracterizată prin capacitatea de a elibera resturi de arabinoză din structuri oligozaharidice obținute din arabinoxilani. Cu toate acestea, Arafur A nu este activă pe substraturi de greutate 70 moleculară mare. Suplimentar, Aspergillus niger produce o enzimă numită Arafur B care este activă asupra oligozaharidelor, precum și pe structuri de arabinoxilan de greutate moleculară ridicată. Activitatea enzimatică a Arafur B este limitată la eliberarea resturilor de arabinoză de la terminalul substituit cu resturi unice de xiloză.

Deocamdată nu se cunosc fragmentele ADN. 75

O activitate capabilă să elibereze resturi de arabinoză de la non-terminalul substituit cu resturi unice de xiloză, atât la oligozaharide, cât și la structuri de arabinoxilan cu greutate moleculară ridicată, s-a izolat din Aspergillus awamori. Această enzimă este numită arabinoxilan arabinofuranoză hidrolază (AXH). Până acum, nu sunt accesibile fragmente ADN și/sau date de secvență. Este clar că încă 8o nu s-au detectat toate enzimele implicate în degradarea arabinoxilanului (Kormelink, 1990). De exemplu, nu s-a găsit încă nici o enzimă care să atace molecule de xiloză dublu substituite cu arabinoză. Motivul pentru aceasta este faptul că aceste enzime sunt secretate adesea în cantități mici. Clonarea moleculară și supraproducerea într-o gazdă corespunzătoare a acestor enzime, deși nu ușoară, este o cale de a se obține 85 cantități suficiente de enzime pure, care, în schimb, permite să se cerceteze semnificația lor în diverse aplicații.

Prezenta invenție se referă la o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului, o secvență de ADN recombinant care o codifică, la procedeul de obținere a unei polipeptide având activitate de degradare a arabinoxilanului în celule 90 în care se introduce ADN-ul recombinant și la o compoziție alimentară cu polipeptidă care prezintă activitate de degradare a arabinoxilanului.

RO 116211 Bl

Polipeptidă cu activitate de degradare a arabinoxilanului, conform invenției, are secvența de aminoacizi dată în secvența nr. 6 sau secvența nr. 8 precum și porțiuni ale acesteia, care au activitate de degradare a arabinoxilanului.

ADN-ul recombinant, cuprinzând un fragment ADN care codifică o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului sau o polipeptidă conform invenției, are fragmentul ADN precursor al acesteia, ales dintre:

(a) un fragment ADN care codifică o polipeptidă având secvența aminoacidă reprezentată prin aminoacizii 1-306 din Secvența nr. 5, sau o polipeptidă precursoare a polipeptidei menționate, reprezentată prin aminoacizii 27-306 din Secvența nr. 5;

(b) un fragment ADN care codifică o polipeptidă având secvența aminoacidă reprezentată prin aminoacizii 1-306 din Secvența nr. 7 sau un precursor al polipeptidei menționate, reprezentat prin aminoacizii 27-306 din Secvența nr. 7;

(c) un fragment ADN care codifică o porțiune a polipeptidelor reprezentate prin resturile de aminoacizi de la 1-306, ilustrate în Secvența nr. 5 sau 7, care au încă activitate de degradare a arabinoxilanului, sau o polipeptidă precursoare a acestora;

(d) un fragment ADN codificând o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului și având secvența nucleotidică reprezentată prin nucleotidele 7841779 din Secvența nr. 5 sau nucleotidele 823-1818 din Secvența nr. 7;

(e) un fragment ADN care codifică o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului sau o parte a unei astfel de polipeptide, fragment ADN care este capabil să hibridizeze la un fragment ADN, precum cel reprezentat prin nucleotidele 784-1779 în secvența nr. 5 sau nucleotidele 823-1818 din secvența nr. 7;

iar respectivul ADN recombinant poate cuprinde, în plus, secvențe ADN regulatoare necesare pentru expresia fragementului ADN într-o celulă procariotă sau eucariotă, reprezentate prin secvențele de nucleotide 1-783 din secvența nr. 5 sau un subfragment al acestuia, capabil să regleze expresia unei secvențe AND atașată de el sau secvențele de nucleotide reprezentate prin nucleotidele 1-822 din Secvența nr.7 sau un fragment al acestuia, capabil să regleze expresia unei secvențe ADN atașată de el.

Procedeul de obținere a unei polipeptide având activitatea de degradare a arabinoxilanului, în celule în care se introduce ADN-ul recombinant care cuprinde un fragment de ADN~care codifică o polipeptidă având activitatea de degradare a arabinoxilanului, sau o polipeptidă precursor al acesteia, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că el cuprinde următoarele etape:

- celulele obținute prin introducerea ADN-ului recombinant sunt selectate, apoi crescute în mediu de fermentație nutritiv convențional, conținând o sursă de carbon, o sursă de azot, o sursă de azot organic, surse nutritive anorganice și opțional un inductor (arabinoxilan);

- celulele se lasă să fermenteze pe o perioadă de 0,5-20 zile într-un procedeu discontiuu sau discontinuu cu alimentare, la temperatura de O...45°C și un pHcuprins între 2 și 10;

- se îndepărtează celulele prin centrifugare sau filtrare;

- se recuperează enzima și, opțional, se purifică;

Compoziția cu polipeptidă care prezintă activitate de degradare a arabinoxilanului, conform invenției, cuprinde polipeptidă care prezintă activitate de degradare a arabinoxilanului, ca aditiv alimentar.

RO 116211 Bl

Invenția prezintă următorul avantaj:

- prezintă posibiliatea de a degrada complet arabinoxilanul, făcându-l mai potrivit pentru unele aplicații, cum ar fi, prepararea pâinii.

ADN-ul recombinant, se obține, de preferință, de la un fung filamentos, mai precis, de la o specie de Aspergillus. Secvențele ADN recombinant preferate în mod deosebit cuprind fragmente ADN care codifică AXDA de la Aspergillus niger sau A. tubigensis.

Conform altei realizări, ADN-ul recombinant cuprinde secvențe ADN reglatoare 5'și 3' necesare pentru expresia fragmentului ADN într-o celulă gazdă procariotă sau eucariotă în care este prezent. Secvențele ADN reglatoare sunt, de preferință, heteroloage față de secvența care codifică polipeptida numitului fragment ADN, astfel încât să sporească expresia fragmentului ADN în gazdă, față de cazul în care fragmentului ADN este legat la secvențe omoloage de ADN regulator.

Conform unei alte realizări, numitul ADN recombinant este sub forma unui vector.

Pentru realizarea invenției se asigură suplimentar o celulă gazdă eucariotă sau procariotă transformată, cuprinzând ADN-ul recombinant conform invenției, ca referință a genului Aspergilius, precum și un procedeu pentru obținerea unei celule gazdă capabile să sporească expresia unei enzime care degradează arabinoxilanul. Acest fapt se realizează prin tratarea unei celule gazdă în condiții de transformare cu ADN recombinant, conform invenției, și selecția, pentru o expresie sporită, a numitei enzime care degradează arabinoxilanul.

Sunt furnizate, de asemenea, metode pentru folosirea unei polipeptide pentru asigurarea degradării arabinoxilanului pentru hrană sau ca aditiv al alimentelor, în procese de prelucrare a hârtiei și celulozei, și în producerea pâinii.

Invenția furnizează molecule ADN purificate și izolate, cuprinzând secvența genelor enzimei care degradează arabinoxilanul și variantele genetice ale acesteia. Moleculele ADN pot include regiunea care codifică enzima care degradează arabinoxilanul, precum și regiunile regulatoare 5'și 3' alăturate lor. Variantele genetice includ moleculele ADN proteine arabinoxilan mutante și molecule ADN degenerate, în care activitatea dorită a enzimei exprimate de către acestea este menținută.

Invenția asigură, de asemenea, constructe ADN pentru expresia enzimelor care degradează arabinoxilanul într-o gazdă de expresie dorită. Aceste constructe de expresie includ molecule ADN hibride conținând regiuni care codifică enzime de degradare a arabinoxilanului lincate operațional la regiuni regulatoare, cum ar fi promotor, semnale de secreție și de stop originare de la organisme omoloage și heteroloage, aceste regiuni regulatoare fiind capabile să dirijeze expresia sporită a enzimei codificate de către molecula ADN care codifică enzima care degradează arabinoxilanul într-o gazdă corespunzătoare. De preferință, constructul de expresie va fi integrat în genomul gazdei de expresie alese.

Invenția asigură suplimentar vectori, de preferință plasmizi, pentru donare și/sau transformarea gazdelor bacteriene prin intermediul introducerii în gazdă bacteriană a constructelor ADN pentru expresia enzimelor care degradează arabinoxilanul.

Suplimentar, invenția de față asigură gazde omoloage sau heteroloage, transformate cu vectori care conțin constructele ADN descrise mai sus. Gazde heteroloage pot fi alese de la bacterii, drojdii sau fungi.

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

RO 116211 Bl în contextul invenției de față, termenul “omolog” acoperă tot ce este nativ la molecula ADN care codifică enzimă care degradează arabinoxilanul de interes, inclusiv secvențele sale regulatoare. O gazdă omoloagă este definită ca specia de la care pot fi izolate astfel de molecule ADN.

Termenul “heterolog” este definit drept tot ceea ce nu este nativ pentru molecula ADN care codifică enzimă care degradează arabinoxilanul, inclusiv regiunea regulatoare. O gazdă “heteroloagă” este definită ca orice specie bacteriană, alta decât cea de la care s-au izolat genele care codifică enzimă care degradează arabinoxilanul.

în contextul prezentei invenții expresia expresia sporită a enzimei de interes care degradează arabinoxilanul” este definită ca expresia enzimei de interes care degradează arabinoxilanul la niveluri peste cele care sunt observate în mod obișnuit în organismul omolog de tip sălbatic. în acest context, expresia sporită acoperă, de asemenea, formularea expresia enzimelor de interes care degradează arabinoxilanul într-un organism heterolog care, în mod normal, nu produce asemenea enzime care degradează arabinoxilanul, cu excepția introducerii moleculei ADN sau constructului de expresie care codifică enzimele de interes care degradează arabinoxilanul în gazda de expresie heteroloagă. Urmașii acestor gazde de expresie sunt desigur, de asemenea înțeleși, ca fiind cuprinși în această invenție.

Invenția include, de asemenea, secvențe ADN care hibridizează la secvențe ADN care se pot obține de la fungii descriși mai sus, dar care diferă în secvența de codoni datorită degenerării codului genetic sau variației dintre specii. Astfel, invenția include fragmente ADN care codifică enzime care degradează arabinoxilanul, care se pot obține de la alte specii decât Aspergillus. De obicei, procedurile pentru obținerea fragmentelor ADN similare implică cercetarea bacteriilor sau plăcilor bacteriofage, transformate cu plasmizi recombinând care conțin fragmente ADN, de la un organism cunoscut sau așteptat să producă o enzimă care degradează arabinoxilanul conform invenției. După replicarea in situ a ADN-ului, ADN-ul este eliberat din celule sau plăci și imobilizat pe filtre (în general, nitrocelulozice). Apoi, filtrele pot fi cercetate pentru fragmente ADN complementare, folosind o sondă de acid nucleic marcat, bazată pe orice secvență determinată pentru genele Aspergillus axdA. în funcție de faptul că organismul de cercetat este înrudit mai de departe sau mai de aproape, hibridizarea și condițiile· de spălare^e vor adapta în scopul recuperării pozitivilor adevărați și pentru a reduce cantitatea de falși pozitivi. O procedură tipică pentru hibridizarea ADN-ului mobilizat pe filtru este descrisă în capitolul 5, tabelul 3, paginile 120 și 121 din “Nucleic Acid hybridisation - a practicai approach, B.D. Hames & Higgins EDS., 1985, IRL Press, Oxford). Deși condițiile optime sunt de obicei determinate empiric, se pot da câteva reguli utile pentru secvențele înrudite strâns sau mai puțin strâns.

în scopul identificării fragmentelor ADN foarte strâns înrudite la sondă, hibridizarea se realizează așa cum s-a descris în tabelul 3, Hames & Higgins, (ale cărui principii de bază sunt reproduse mai jos) cu o etapă finală de spălare la stringență ridicată în 0,1 *tampon set (de 20 ori SET = 3 mM NaCI, 20 = mM EDTA, 0,4 M TrisHCI, pH 7,8), 0,1%SDS) la 68°C.

Pentru identificarea secvențelor omoloage limitate la sondă, procedura de urmat este cea indicată în tabelul 3, Hames & Higgins, supra, dar cu temperatură redusă de hibridizare și spălare. 0 spălare finală de 2*SET tampon, 50°C de exemplu, va permite identificarea segmentelor care au circa 75% omologie.

RO 116211 Bl

Așa cum este bine cunoscut pentru specialistul având pregătire obișnuită în domeniu, relația exactă dintre omologie și condițiile de hibridizare depinde de lungimea sondei, de compoziția de bază (% de G + C) și de distribuția împerecherilor; o distribuție întâmplătoare având un efect descrescător mai puternic asupra T_m decât o imagine neîntâmplătoare sau grupată, a împerecherilor.

Condițiile de mai sus se aplică pentru sonde care au o lungime de cel puțin 3OO bp, de preferință, cel puțin 500 bp, mai preferat circa 1 kbp și un conținut GC al ADN-ului de sondat de circa 50+10%. Dacă conținutul GC al unui organism dat este cunoscut, atunci condițiile se pot optimiza empiric, luând în considerare următoarea ecuație (la 1M NaCI, în domeniul 35% < % (G+C) < 75%); T_m=81,5°C + 0,41 * (G +C). în mare, aceasta înseamnă că, dacă conținutul GC (%G + C) este cu 10% mai mare decât media, condițiile de hibridizare (stringentă) pot fi corectate prin creșterea temperaturii de hibridizare și spălare cu circa 4%C.

Pentru scopurile acestei descrieri, un fragment ADN care este numit că hibridizează la fragmentul ADN conform invenției, se difinește ca dând un semnal pozitiv pe ADN imobilizat după hibridizare cu o sondă de cel puțin 300 bp, de preferință 500 bp, mai preferat 1 kbp al oricărei secvențe prezentate în SECV.ID NR:5 sau 7, și urmând procedura de spălare din tabelul 3 din capitolul 5, Hamens & Higgins (așa cum este reprodus în esență, mai jos) la o temperatură de 50°C, 2* tampon SET (adică, 0,3 M NaCI).

Principiile procedurii descrise în tabelul 3, capitolul 5, Hamens & Higgins sunt cele care urmează:

(1) prehibridizarea filtrelor în absența sondei, (2) hibridizarea la o temperatură între 5 + -68°C între 0,1-4* tampon SET (depinzând de stringență), 10* soluție Denhardt (100* soluție Denhardt conține 2% albumină serică bovină, 2% Ficoll 2% polivinilpirolidonă), 0,1% SDS, 0,1% pirofosfat de sodiu, 50 pg/ml ADN spermatic de somon (dintr-un stoc care se obține dizolvând 1 mg/ml ADN spermatic de somon, sonificat până la o lungime de 200 până la 500 bp, lăsat să stea în baie de apă 20 min și diluat cu apă până la o concentrație finală de 1 mg/ml); timpul de hibridizare nu este foarte critic și poate fi uneori între 1 și 24 h, de preferință, circa 16 h (o/n); sonda este de obicei marcată prin translație în fantă folosind ³²P ca marcaj radioactiv până la o activitate specifică de între 5x10⁷și 5 χ 10⁸ c.p.m./pg;

(3) (repetat) spălarea filtrului cu 3 x SET, 0,1% SDS, 0,1% pirofosfat de sodiu la 68°C la o temperatură între 50 și 68°C (în funcție de stringența dorită), spălare repetată scăzând în același timp concentrația SET până la 0,1 %, spălare o dată timp de 20 min în 4 x SET la temperatura camerei, uscarea filtrelor pe hârtie 3MM, expunerea filtrelor la film raze X într-o casetă la -70°C, timp de între 1...96 h (depinzând de tăria semnalului) și developarea filmului).

în general, volumele amestecurilor de prehibridizare și hibridizare vor fi menținute la minimum. Toate etapele “ude vor fi realizate în recipiente mici, sigilate într-o baie de apă preîncălzită.

Procedura de mai sus servește la definirea fragmentelor ADN numite a hibridiza conform invenției. Evident, pot fi aduse numeroase modificări procedurii pentru identificarea și izolarea fragmentelor ADN conform invenției. Se va înțelege că fragmentele ADN astfel obținute intră în termenii revendicărilor; oricând ele pot fi

235

240

245

250

255

260

265

270

275

RO 116211 Bl detectate urmând procedura de mai sus, indiferent dacă ele au fost identificate în prezent și/sau izolate folosind această procedură.

Numeroase protocoale, care pot fi folosite adecvat pentru identificarea și izolarea fragmentelor ADN conform invenției, au fost descrise în literatură și în manuale, inclusiv cel notat Hamens & Higgins.

Procedura de mai sus este folosită pentru sonde polinucleotidice. Când urmează să fie folosite sonde oligonucleotidice, relația dintre T_d, temperatura la care un hibrid de împerechere perfectă este jumătate disociat, se estimează prin relația: T_d=4°C per GC bp + 2°C per AT bp. Pe baza protocoalelor existente și folosind această regulă, se pot desemna, de asemenea, sonde oligonucleotidice pentru izolarea eficientă de fragmente ADN care codifică enzimele care degradează arabinoxilanul, conform invenției, de la organisme înrudite și mai departe. Procedura folosind oligonucleotide este utilă în mod deosebit dacă o enzimă s-a purificat de la o sursă diferită și s-a determinat parțial secvența de aminoacizi. Folosind această secvență, se poate face un set de sonde degenerate pentru cercetarea unei bănci ADN sau Southern bloot, în esență, așa cum s-a descris mai sus.

Candidații buni pentru căutare sunt alți fungi filamentoși precum Trichoderma, Penicillum, Dichotomitus squalus, Desporotrichum dimorphosporum, și bacterii precum specii de Bacillus și alte asemenea.

Dacă rezultatele cercetării inițiale în clone par să conțină fragmente hibridizate, astfel de fragmente pot fi izolate și, dacă se dorește, secvențate, pentru determinarea similarităților secvențelor.

□ dată ce s-a identificat o enzimă de interes care degradează arabinoxilanul, secvența ADN care codifică o astfel de enzimă se poate obține din fungul filamentos care o produce în mod natural prin cultivarea fungului într-un mediu care conține arabinoxilan, izolarea enzimei dorite care degradează arabinoxilan, folosind metode cunoscute asemenea celor evidențiate în exemplul 1, și determinarea cel puțin a unei porțiuni a secvenței aminoacide a proteinei purificate.

Sonde ADN pot fi obținute după aceea, prin desemnarea secvențelor oligonucleotidice bazate pe secvența aminoacidă dedusă parțial. Secvențele aminoacide se pot determina de la N-terminal al proteinei complete și/sau de la N-terminal al fragmentelor peptidice interne, obținute prin digestia proteolitică sau chimică a proteinei complete. O dată obținute, sonda(le) ADN se folosește (folosesc) apoi pentru cercetarea unei bănci genomice sau cADN.

□ bancă genomică se poate prepara digerând parțial ADN cromozomial fungic cu o enzimă de restricție care recunoaște o secvență de 4 nucleotide succesive, de exemplu Sau3A, și donarea fragmentului rezultat într-un plasmid adecvat sau vectori fag lambda, de exemplu, lambda GEM-11.

Alternativ, o bancă cADN se poate prepara prin donarea ADN sintetizat de la mARN izolat din celule fungice induse pentru sinteza unei enzime care degradează arabinoxilanul într-un vector fag, corespunzător, de exemplu, lambda gt 10.

în continuare, după etalarea unei cantități suficiente de colonii sau plăci, banca genomică sau cADN poate fi cercetată cu o sondă ADN adecvată.

Dacă această metodă nu reușește, banca genomică sau cADN poate fi cercetată diferențial cu sonde cADN obținute din mARN de la celule neinduse și induse.

Se prepară mARN indus din celule cunoscute, pe medii care conțin arabinoxilan ca

RO 116211 Bl

325 sursă de carbon, în timp ce mARN neindus trebuie să fie izolat de la celule crescute pe o sursă de carbon alta decât arabinoxilan, de exemplu, glucoză. Dintre clonele care hibridizează numai cu sonda cADN indusă, poate fi recuperată o clonă care conține gene care codifică enzima dorită care degradează arabinoxilan. Alternativ, o genă de enzimă care degradează arabinoxilan se poate identifica prin hibridizare încrucișată cu o secvență înrudită.

De preferință, sondele oligonucleotidice sunt obținute de la secvența aminoacidă N-terminală (vezi, exemple) a unei enzime care degradează arabinoxilan având o greutate moleculară aparentă de 32 kDa purificată dintr-un filament de cultură Aspergillus niger și/sau de la secvența aminoacidă a unui fragment peptidic intern (vezi exemple) obținut prin digestia enzimei CNBr.

Amestecurile oligonucleotidice dezvoltate astfel pot fi folosite pentru a hibridiza cu ambele bănci, genomică și cADN. Alternativ, așa cum s-a ilustrat aici, enzima purificată AXDA se folosește pentru a provoca anticorpi. Anticorpii se utilizează în imunocercetarea băncilor de expresie. Astfel, se identifică expresia clonelor AXDA. Ar fi de remarcat că proteina se izolează din A. Niger, varietatea tubigensis și cADN se izolează din A. niger N40D ilustrând că activitatea AXDA este conținută în diverse Aspergillus.

dată cu apariția a noi tehnici de amplificare ADN cum ar fi direct sau invers, de asemenea, este posibil să se doneze fragmente ADN in vitro, o dată ce sunt cunoscute regiunile de decodificare ale secvențelor terminale.

Accesibilitatea unei secvențe ADN care codifică o enzimă care degradează arabinoxilanul face posibilă construcția moleculelor de enzime mutante prin mutageneză directă în sit. Dacă structura terțiară a enzimei care degradează arabinoxilanul este cunoscută și sunt localizate domeniile sale catalitice și de legare la substrat, pot fi aleși pentru mutageneză aminoacizii (de exemplu, cu ajutorul modelării pe computer) care afectează cel mai puțin funcțiile catalitice și/sau legare la substrat. Dacă structura terțiară a proteinei nu este accesibilă, pot fi generați mutanți oarecare fie împreună cu întreaga secvență de codificare, fie cu structura terțiară a proteinei care poate fi propusă prin comparație cu enzime similare cunoscute, izolate de la alt microorganism.

Pentru a facilita inserția fragmentului ADN conținând secvența care codifică AXDA în constructe de expresie cuprinzând una sau mai multe regiuni regulatoare heterogene, se poate folosi reacția polimerazică de catenă (PCR) (PCR Technology; Principles and Applicatins for DNA Amplification, (1989)H.A. Ehrlich, ed., Stockton Press, New York) pentru introducerea situsurilor enzimatice de restricție adecvate în capetele 5' și 3' ale secvenței care codifică AXDA. Alegerea situsurilor de restricție depinde de secvența ADN a vectorului de expresie, adică de prezența altor situri de restricție în molecula ADN.

Pentru obținerea expresiei mărite a proteinelor AXDA în specii productive inițial (omoloage) sau alternativ, într-o tulpină fungică heteroloagă, regiunile ADN care codifică AXDA, inclusiv propria lor regiune de control, se induc într-o gazdă de expresie selectată pentru a crește numărul de copii ale genei și, prin urmare, expresia proteinei.

Dacă este preferată, o gazdă de expresie heteroloagă, și se alege o tulpină de drojdie sau o tulpină bacteriană, se folosește o moleculă ADN neîntreruptă pentru

330

335

340

345

350

355

360

365

RO 116211 Bl construcția unui vector de expresie heterolog în scopul de a evita posibilitatea ca semnalele de conexiune directă, situate pe fragmentul genomic, să nu fie recunoscute de către gazda hețgfoloagă. Această moleculă neîntreruptă de ADN poate fi obținută de la o bancă cADN construită de la mARN izolat din celule induse pentru sinteza AXDA. Această bancă poate fi cercetată cu o sondă oligonucleotidică sau sondă cADN obținută cum s-a descris mai sus. Alternativ, o moleculă de ADN neîntrerupt poate fi obținută prin aplicarea unei reacții polimerazice de catenă, folosind oligonucleotide 5' și 3' corespunzătoare, pe prima bandă cADN sintetizată de la ARN-ul celulelor induse arabinoxilan.

Expresia sporită a AXDA de interes poate fi obținută, de asemenea, prin selectarea regiunilor regulatoare heteroloage, de exemplu, promotor, lider de secreție și regiuni terminatoare care servesc pentru creșterea expresiei și, dacă se dorește, a nivelurilor secreției proteinei de interes din gazda de expresie aleasă, și/sau a asigura controlul inducător al expresiei AXDA de interes.

Exceptând promotorul nativ al AXDA de interes se pot folosi alți promotori pentru dirijarea expresiei sale. Promotorul se poate selecta pentru eficiența sa în dirijarea expresiei AXDA de interes în gazda de expresie dorită.

într-o altă realizare, se poate selecta un promotor constructiv pentru a dirija expresia AXDA dorită, relativ lipsită de alte enzime. Un astfel de construct de expresie este mai mult decât avantajos, deoarece el ocolește necesitatea de a cultiva gazdele de expresie pe un mediu conținând arabinoxilan ca substrat de inducere.

Exemple de promotori constructivi puternici și/sau inductori care sunt preferați pentru utilizare în gazde de expresie fungice sunt promotorii ATP/sintetază, subunitate (nouă) 9 (olic), triozofosfatizomerază (tpi) alcool dezidrogenază (adhA), aamilază (amy), glucoamilază (gam), acetamidă (amdS) și gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenază (gpd).

Exemplele de promotori puternici de drojdie sunt: alcooldehidrogenaza, lactoza, 3-fosfogliceratkinaza și triofosfatizomeraza.

Exemplele de promotori bacterieni puternici sunt promotorii α-amilază și Soo2.precum și promotori de la genele proteazei extracelulare.

Pentru îmbunătățirea reglării de inducere a constructului de expresie pot fi, de asemenea, folosiți avantajos promotorii hibrizi.

Adesea, este de dorit ca AXDA de interes să fie secretată din gazda de expresie în mediu de cultură.

Conform prezentei invenții, pentru a exprima secreția AXDA, se poate folosi secvența lider de secreție a AXDA de interes nativ.

Totuși, o creștere în expresia enzimei rezultă uneori în producerea proteinei la un nivel peste cel la care gazda de expresie este capabilă să o prelucreze și să o secrete, creând o strangulare, astfel că produsul proteic se acumulează în celulă. Pentru conformitate, prezenta invenție furnizează, de asemenea, secvențe lider heteroloage, pentru a asigura cea mai eficientă secreție a enzimei din gazda de expresie aleasă.

Conform prezentei invenții, liderul de secreție se poate alege pe baza gazdei de expresie dorită. Un lider de secreție heterolog poate fi ales astfel, încât să fie omolog altor regiuni regulatoare ale constructului de expresie. De exemplu, liderul proteinei glucoamilază puternic secretate se poate folosi în combinație cu, chiar,

RO 116211 Bl promotorul glucoamilază, precum și în combinație cu alți promotori. De asemenea, se pot folosi în mod avantajos secvențe semnal hibride în contextul invenției de față.

Exemplele de secvențe lider de secreție, heteroloage, preferate, sunt cele originare de la gena glucoamilază (fungi) gena α-factor (drojdii) sau gena a-amilaza (Bacillus}.

în general, terminatorii nu se consideră a fi elemente critice pentru expresia sporită a genelor. Dacă se dorește, se poate selecta un terminator, un promotor de la aceleași gene sau alternativ, poate fi folosit terminatorul omolog.

în plus, la fragmentul genomic menționat mai sus, ADN-ul de transformare poate conține un marker de selecție, pentru a putea diferenția celulele care au încorporat gena dorită din masa de celule netransformate. Acest marker de selecție, asigurat de secvențe regulatoare 5' și 3' corespunzătoare poate să fie situat pe aceeași moleculă ADN care conține gena dorită sau poate fi prezent pe o moleculă separată, în ultimul caz, trebuie să se realizeze o co-transformare. Raportul vector de expresie/vector de selecție trebuie să fie ajustat într-un astfel de mod, încât un procent ridicat al transformaților selectați să aibă, de asemenea, încorporat vectorul care conține constructul de expresie al AXDA de interes. Cele mai potrivite sisteme de selecție pentru microorganismele industriale sunt cele formate de către grupul de marker de selecție care nu necesită o mutație în organismul gazdă. Exemple de markeri de selecție fungici sunt genele pentru acetamidaza (amdS), ATP-sintetaza, subunitatea 9 (oliC) și de rezistență binomil (benA). Markeri de selecție non-fungici exemplificatori sunt gena bacteriană de rezistență G418 (aceasta se poate folosi, de asemenea, la drojdii, dar nu și la fungi), gena de rezistență la ampicilină (E, Coli} și gena de rezistență la neomicină (Bacillus).

O dată ce constructul de expresie dorit a fost asamblat, el se trasformă într-o gazdă de donare corespunzătoare cum ar fi E. coli, pentru a propaga constructul. După aceea, constructul de expresie se introduce într-o gazdă de expresie adecvată, în care constructul de expresie este, de preferință, integrat în genom. Anumite gazde ca specii de Bacillus pot fi folosite atât ca gazde de expresie, cât și ca gazde de donare, evitând astfel o etapă în plus de transformare.

Conform prezentei invenții, se pot folosi ca gazde pentru producerea AXDA de interes o varietate de organisme.

într-un mod preferat de realizare, se poate folosi o gazdă de expresie omoloagă. Aceasta implică introducerea constructului de expresie înapoi la tulpina de la care s-a izolat secvența ADN care codifică AXDA fie într-o genă cu număr crescut de copii, fie sub controlul regiunilor de reglare heteroloagă, așa cum s-a descris mai sus, sau în ambele.

în alt mod de realizare preferat, o AXDA de interes poate fi produsă și prin introducerea expresiei constructului ADN care codifică gena de interes care degradează arabinoxilanul sub controlul regiunilor regulatoare corespunzătoare, în gazde heteroloage precum bacterii, drojdii sau fungi. Pentru acest scop, secvențele ADN care codifică AXDA de interes se exprimă, de preferință, sub controlul promotorului și secvențelor reglatoare originare de la gazda heteroloagă. în plus, poate fi necesar să se înlocuiască secvența lider de secreție nativă cu o secvență lider omoloagă pentru expresia gazdei, în scopul atingerii celei mai eficiente expresii și secreții a produsului.

420

425

430

435

440

445

450

455

460

RO 116211 Bl

Factori precum mărimea (greutate moleculară), necesitatea pentru glicozilare proprie sau dorința unei secreții extracelulare a AXDA de interes, joacă un rol important în alegerea gazdei de expresie.

Bacteria gram-negativă este folosită pe larg ca o gazdă pentru expresia genei heteroloage. Totuși, cantități mari de proteină heteroloagă tind să se acumuleze în interiorul celulei. Purificarea ulterioară a proteinei dorite din masa de proteine intracelulare E. coli poate fi uneori dificilă.

Spre deosebire de E. coli, bacteriile din genul Bacillus sunt foarte potrivite ca gazde heteroloage, datorită capacității lor de a secreta proteine în mediul de cultură.

în funcție de natura moleculei ADN care codifică AXDA și/sau dorința de a prelucra ulterior proteina exprimata, pot fi preferate gazde eucariote ca drojdii sau fungi. în general, sunt preferate celulele de drojdie față de celulele fungice, deoarece ele sunt mai ușor de manipulat. Cu toate acestea, unele proteine sunt fie puțin secretate din celulele de drojdie, fie, în unele cazuri, nu sunt prelucrate corespunzător (de exemplu, hiperglicozilarea de la drojdie). în aceste situații, va fi ales un organism gazdă fungic.

De asemenea, poate fi aleasă o gazdă heteroloagă pentru a exprima AXDA de interes, lipsită, în principal, de alte enzime care degradează polizaharide, alegând o gazdă care nu produce, în mod normal, asemenea enzime, cum ar fi Kluyveromyces lactis.

Exemple de gazdă de expresie preferată în întinderea invenției de față sunt fungi precum specii de Aspergillus (descrise în EP 18443 și EP 284603) și specii Trichoderma, bacterii precum specii de Bacillus (descrise în EP 134048) și drojdii ca specii Klyveromyces (descrise în EP 96430 și EP 301670) și specii de Saccharomyces.

Gazde de expresie preferate în mod deosebit pot fi alese dintre Aspergillus niger, Aspergillus niger var. Awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Klyveromyces lactis și Saccharomyces cerevisiae.

Expresia enzimei AXDA de interes este efectuată prin cultivarea gazdelor de expresie care s-au transformat cu constructul de expresie adecvat, într-un mediu nutritiv de fermentație convențional.

Mediul de fermentație constă dintr-un mediu ce cultură obișnuit, care conține o sursă de carbon (de exemplu, glucoză, maltoză, melasă etc.), o sursă de azot (de exemplu, sulfat de amoniu, azotat de amoniu, clorură de amoniu etc.), o sursă de azot organic (de exemplu, extract de drojdie, extract de malț, peptonă etc.) și surse nutritive anorganice (de exemplu, fosfat, magneziu, potasiu, zinc, fier etc.). Opțional, se poate include un inductor (arabinoxilan).

Selectarea mediului corespunzător se poate baza pe alegerea gazdelor de expresie și/sau pe baza cerințelor regulatoare ale constructului de expresie. Astfel de medii sunt binecunoscute pentru cei cu pregătire în domeniu. Mediul poate conține, dacă se dorește, componente suplimentare care să favorizeze gazdele de expresie transformate față de alte microorganisme potențial contaminante.

Fermentația se realizează pe o perioadă de 0,5-20 de zile într-o baie, sau printr-un procedeu baie, alimentată la o temperatură în domeniul cuprins între O și

45°C și la un pH între 2 și 10.

RO 116211 Bl

Condițiile de fermentare preferate sunt: o.temperatură în domeniul dintre 2O...37°C și un pH între 3...9. Condițiile corespunzătoare se aleg pe baza gazdei de expresie.

După fermentație, celulele sunt îndepărtate din bulionul de fermentație prin intermediul centrifugării sau filtrării. După îndepărtarea celulelor, enzima poate fi recuperată și, dacă se dorește, purificată și izolată prin mijloace convenționale.

Produsul este formulat stabil, fie în formă lichidă, fie în formă uscată. Pentru anumite aplicații, poate fi preferată imobilizarea enzimei pe o matrice solidă.

Enzimele produse prin mijloacele prezentei invenții pot fi aplicate fie singure, fie împreună cu alte enzime selectate într-o diversitate de procese care necesită acțiunea unei enzime care degradează arabinoxilan.

Enzima care degradează arabinoxilan, a prezentei invenții, se folosește în tratamentul sau prepararea alimentelor (de exemplu, pâine), hrană și băuturi (de exemplu, bere și sucuri din fructe).

Enzima care degradează arabinoxilan se folosește, de asemenea, în prepararea și tratamentul hârtiei și celulozei, în special în combinație cu endoxilanazele.

Așa cum s-a ilustrat în prezenta invenție, enzima care degradează arabinoxilan se adaugă la hrana animalelor, care este bogată în arabinoxilan. Când s-a adăugat la hrană (inclusiv furaje însilozate) pentru animale monogastrice (de exemplu, pui sau porci), care conține cereale, cum ar fi, orz, grâu, porumb, orez sau ovăz sau subproduse de cereale precum tărâțe de grâu și porumb, enzima îmbunătățește semnificativ degradarea pereților celulari de la plante, ceea ce conduce la utilizarea mai bună a nutrienților plantei de către animal. Ca o consecință, sunt îmbunătățite rata de creștere și/sau conversia hranei. Mai mult, enzimele care degradează arabinoxilan se pot folosi pentru reducerea viscozității alimentelor care conțin arabinoxilan.

enzimă care degradează arabinoxilan poate fi adăugată la alimente înainte sau la însilozare, în funcție de preferința pentru regimuri alimentare preumede sau umede. Mai avantajos, AXDA produsă prin intermediul prezentei invenții continuă să hidrolizeze in vivo arabinoxilanul din alimente.

Enzimele care degradează arabinoxilan sunt utile, de asemenea, în prepararea pâinii, așa cum s-a ilustrat în exemplul 8.

în continuare se prezintă 8 exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1...5, care reprezintă:

- fig. 1, profilul eluției activității care degradează arabinoxilanul (OD28O) pe HPLC.

-fig. 2, diagrama care prezintă AXDA asupra solidelor insolubile în apă (WIS), fracție a porumbului ca o funcție a pH-ului.

- fig. 3, procentul digestiei in vitro al WIS de porumb ca o funcție a cantității de enzimă AXDA brută.

- fig. 4, harta de restricție a siturilor din plM3OO1.

- fig. 5, harta de restricție a siturilor din plM3OO2.

în exemplele de realizare se folosesc următoarele tulpini și vectori: Tulpini

E. coli BB4 (Silvay, T.J., Berman, M.L., Enquist, L.W., 1984, “Experimente with gene fusions”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p.xi-xii):

510

515

520

525

530

535

540

545

550

RO 116211 Bl e14 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, LacY1, sau A(lac1ZY)6, galK2, gal)22, metB1, trpR55, A(argF-lac)U169 [F, proAB, lacl^qZAM15, Tn1O, (tet^r)J

E. coliDH5 a (Hanahan.D., 1983, “J.Mol.Biol.” 166: 557):

supE44, AlaclJ169, (<j>80lacZAM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1. E. coli LE 392 (Murray.N., 1977, “Mol.Gen.Genet. 150: 53-58):

e14 (mcrA) hsdR514, supE44, supF59, lacY1, sau A(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55

E. coli XL1-Blue MRF (Jerseth.B. etal., 1992, “Strategies” 5: 81-83) A(mcrA)13, A(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, GyrA96, relA1, lac, [F, proAB, lacl^qZM15, ΔΤη1Ο, (tet^r)]

Aspergillus niger n400 (CBS 120,49) Aspergillus niger N400 (cspA1) Goosen et al., 1987 Aspergillus niger NW219 (leuA1, nicA1, pyrA6) Vectori pBluescript SK+/-(Short, J.M. etal., 1988, “Nucleic Acids Res.” 16: 7583-7600) pUC19 (Yanish-Peron.C. etal., 1985, “Gene” 33: 103-119)

Următoarele soluții s-au preparat conform cu Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’, ed. a 2-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY:

Tampoane: TE, 50*TAE, 20*SSC; hibridizare, 100*Dendardt, SM, încărcare ADN

Medii: NZYCM, LB și mediu minimal.

Soluția Visniac s-a preparat conform lui Visniac, W., Santer, M., (1957), “Bact.Rev.” 21: 195-213.

Exemplul 1. Izolarea enzimei

Exemplul 1.1: Purificarea și caracterizarea activității A care degradează arabinoxilan (AXDA) A. niger var. tubigensis.

A. niger var. tubigensis DS 16183 se crește, așa cum s-a descris în EP 0463706, fără extract de drojdie și 2% fracțiune arabinoxilan de grâu brut în loc de xilan de ovăz. Celulele se îndepărtează prin filtrare și supernatantul se usucă prin ultrafiltrare.

Pentru purificarea AXDA se diluează 5 g de preparat enzimatic brut în 100 ml 10 mM Tris/HCI pH 8,0. Soluția de enzimă se filtrează (Seith/supro nr. 250 și Seith/supro EKS) și se diluează până la o concentrație proteică finală (analiză proteică Biorad) de 5,2 g/l. Enzima brută se fracționează prin HPLC (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System) pe o coloană de schimb anionic DEA TSK 650 (M) (600 ml) (rată 25 ml/min). Coloana se echilibrează cu 25 mM Tris/HCI (pH 8,0). Proba (3 g de proteină) se aplică la o coloană și se eluează cu un gradient de tampon de echilibrare conținând 100 mM NaCI. Enzima AXDA se eluează la o concentrație NaCI de 53 mM, așa cum s-a prezentat în fig. 1.

Exemplul 1.2. pH optim

Pentru determinarea pH-ului optim al preparatului enzimatic brut AXDA, se folosește ca substrat fracțiunea polimerică de solide insolubile în apă de la porumb (WIS). Se adaugă 1,6 mg de preparat enzimatic brut la 0,5 g WIS și se diluează până la 5 ml cu tampon (100 mM NaAc) de p/r\ variind de la 3,40 până la 7,65. Probele se incubează 60 min la 39°C și se centrifughează timp de 15 min (2800 g). Se măsoară zaharurile reducătoare din supernatant folosind reactiv Sumner.

RO 116211 Bl

Prepararea reactivului Sumner: se adaugă 10 g fenol la 22 ml de NaOH 10%, apoi volumul se aduce la 100 ml cu apă demineralizată. Se adaugă 10 g de NaHS0₃. La 70 ml din această soluție se adaugă 300 ml NaOH 4,5% urmat de 255 g tartrat K/Na și 800 ml acid 3,5-dinitrosalicilic 1%. Amestecul se agită apoi la temperatura camerei până când se dizolvă substanțele.

Se adaugă 0,5 ml de reactiv Sumner la 200 pl probă și se fierbe 10 min. După răcire, se adaugă 5 ml apă demineralizată. Se măsoară extincția la 515 nm. Conținutul de zahăr reducător al probelor se calculează folosind o curbă de calibrare a xilozei.

pH-ul optim pentru enzimă este 5,0, așa cum se arată în fig. 2.

Exemplul 1.3. Compoziția aminoacidă

Din fracțiunile AXDA ale coloanei DEAE se măsoară compoziția aminoacidă pe o coloană PICO-TAG 150 MM (detecție la 254 nm). Se găsește următoarea compoziție:

600

605

610

Compoziția aminoacidă a AXDA

Aminoacid	mM	mol calculat (%)
ASP	1,11	13,43
GLU	0,66	8,13
SER	1,00	12,13
GLN	0,00	0,00
GLY	0,84	10,25
HIS	0,12	1,30
ARG/ASN	0,18	2,12
THR	0,71	8,48
ALA	0,74	8,83
PRO	0,34	4,00
TYR	0,46	5,54
VAL	0,43	5,06
MET	0,11	1,30
ILE	0,29	3,42
LEU	0,52	6,12
pHE	0,43	5,18
LYS	0,38	4,59

Pompă HPLC: CM 4000; detecție M440, 254 nm; injectare 4 pl, Gilson 232; coloană PICO-TAG 150 MM; sistem de date Maxima.

615

620

625

630

Exemplul 1.4. Caracterizarea biochimică (IEP și greutate moleculară)

Se determină IEP al AXDA pe un minigel Pharmacia pH 3-9. Proteina se colorează cu o soluție de colorare argint Pharmacia. Se estimează IEP al enzimei

AXDA ca fiind 3,6.

635

RO 116211 Bl

Greutatea moleculară a AXDA se determină pe un minigradient gel SDS

Pharmacia (10...15%] și se detectează proteinele prin colorație argint (Pharmacia).

Greutatea moleculară a AXDA se estimează a fi 32 kDa.

Exemplul 1.5. Secvențarea proteinei activității A care degradează arabinoxilan (AXDA) a A. Niger var. tubigensis

Exemplul 1.5.1. Secvențarea aminoacizilor de la capătul N-terminal a activității A care degradează arabinoxilan din A. Niger var. tubigensis

Se supune aproximativ 1 nmol (circa 30 pg) AXDA la electroforeză pe un gel 15% poliacrilamidă SDS urmat de electrobloting pe membrană Immobilon-P (Millipore), conform metodei descrise de către Matsudaira, P. (1987), “J.Biol.Chem.”, 262: 10035-10038. Fragmentul de membrană care conține banda principală având o greutate moleculară aparentă (SDS-PAGE) de 32 kDa se supune la analiza secvenței prin secvențareîn fază gazoasă (Amons, R., 1987, “FEBS /ett.”,212: 68-72) (SOM facility, Leiden). Se determină următoarea secvență:

Lys-?-Ala-Leu-Pro-Ser-Ser-Tyr (Secvența nr. 1)

Exemplul 1.5.2. Determinarea secvenței aminoacizilor unei peptide CNBr a activității A care degradează arabinoxilan (AXDA)

Se supun la clivaj chimic prin CNBr aproximativ 2 nmoli AXDA. Aproximativ 2 nmol (circa 60 pg] AXDA se usucă prin înghețare și se resuspendă în 60 pl acid formic 70% conținând 125 pg CNBr (2,5 mg/ml). Acest amestec de reacție se incubează la întuneric la temperatura camerei 48 h. Lichidul se evaporă într-un Speedvac, se spală cu apă bidistilată sterilă și se evaporă din nou. Această etapă de spălare se repetă de două ori. Amestecul de reacție se supune apoi la electroforeză pe un gel SDS-poliacrilamidă 15% urmat de electrobloting pe o membrană Immobilon-P (Millipore) conform metodei descrise de către Matsudaira, P. (1987), J.Biol.Chem”, 262: 10035-10038. Fragmentul de membrană care conține banda principală având o greutate moleculară aparentă (SDS-page) de 9 kDa se supune analizei secvenței prin secvențare în fază gazoasă (Amons, R., 1987, “FEBS fett.”,212: 68-72) (SON facility, Leiden). Se determină următoarea secvență:

Peptidă CNBr: lle-Val-Glu-Ala-lle-Gly-Ser-Thr-Gly-His-Arg-Tyr-pHe-(Arg/Asn)-(Ser)-(pHe)-(Thr) (Secvența nr. 2)

Aminoacizii neclari sunt dați între paranteze.

Exemplul 2. Profilul enzimatic al AXDA

Activitatea α-arabinofuranozidazică se măsoară pe un substrat para-nitrofenil arabinofuranozidă (Sigma). Se adaugă la 1 ml substrat 300 pl soluție de enzimă. După 15 min de incubare, la 30°C, reacția se oprește cu 5 ml Na₂C0₃ (5M). Se măsoară extincția la 402 nm. Se calculează activitatea α-arabinofuranozidazică (volum* extincție)/(E * timp).

Preparatul enzimatic pur conține o activitate α-arabinofuranozidazică de 0,30 pNPAF U/mg. Se testează pentru activitate fracțiunile de la coloana DEAE. Depozitul arabinofuranozidază activă conține 3,0 pNPAF U/mg (vezi fig.1). Nu se găsesc alte fracțiuni cu activitate α-furanozidazică. Depozitul α-arabinofuranozidază activă se testează mai târziu pe o fracțiune de polimer a porumbului insolubil în apă și pe acest substrat nu se măsoară nici o activitate.

Aceasta arată că AXDA nu are activitate α-arabinofuranozidazică pe substrat paranitrofenil.

RO 116211 Bl

685 într-o încercare ulterioara de a identifica activitatea AXDA, filtratele unei culturi Aspergillus niger transformate cu gena axdA Aspergillus tubigensis se cercetează pentru activitate pe un substrat constând din arabinoxilan de grâu. Gena tubigensis se plasează sub controlul promotorului piruvatchinază (un glicolitic) și condițiile de creștere se aleg astfel, încât să favorizeze expresia transgenei, evitând expresia enzimelor endogene care degradează arabinoza.

Pentru conformitate, se determină că AXDA are activitate de eliberare a arabinozei pe substrate arabinoxilanice de greutate moleculară mare. Conținutul de proteină se determină folosind metoda Sedmak. Activitatea AXDA se determină adăugând 100 pl de diferite diluții (în tampon 10 mM acetat de sodiu pH 5,0] a filtratelor culturii la 150 pl acetat de sodiu 50 mM (pH 5,0) și 250 pl arabinoxilan de grâu 0,4% (Megazyme) și incubare la 40°C timp de 1 h. Reacția se oprește prin încălzirea amestecurilor pe durata a 10 min la 100°C. Produsele degradării arabinoxilanului se urmăresc folosind HPAEC (cromatografie de schimb anionic de înaltă performanță), folosind ca probe incubările inactivate termic.

Rezultatele sunt cele care urmează:

Activitatea AXDA a Aspergillus tubigensis pe arabinoxilan de grâu.

690

695

700

Tabelul 1

Probă	Conținut proteină (mg/100 mg)	Unități AXDA/ml	Activitate specifică
A 3003 12 (conc.)	0,057	22,4	191,5
B 3003 15 (conc.)	0,064	31,48	233,2
C 3003 12 (perm.)	*	0,028	-
D 3003 15 (perm.)	*	0,032	-

705

710

O unitate de activitate arabinofuranohidrolază se definește ca fiind cantitatea de enzimă capabilă să elibereze 1 pmol de arabinoză din arabinoxilan per minut.

Se ajunge la concluzia că enzima AXDA de Aspergillus tubigensis are activitate arabinofuranohidrolazică (AXH).

Activitatea arabinază se măsoară cu o trusă de testare arabinază de la Megazyme și se execută urmând instrucțiunile. în experiment depozitul AXDA de la coloana DEAE nu a prezentat activitate asupra arabinanului liniar.

Aceasta arată că AXDA nu este o arabinază.

Activitatea endoxilanază se măsoară pe xilan de ovăz. Se fierb 10 ml de suspensie xilan 5% (100 mM NaAc pH 3,5) timp de 10 min. După coborârea temperaturii, suspensia se incubează la 39°C timp de 10 min. Reacția se începe prin adăugarea a 0,5 ml soluție de enzimă. După câteva perioade de incubare (5, 10, 15, 20 și 25 min) se adaugă 1,5 ml probă de la incubarea la 39°C la 1,5 ml apă demineralizată și se fierb 10 min. Probele se centrifughează 15 min. (2800 g). Se detectează zaharuri reducătoare pe supernatant cu reactivul Sumner (vezi exemplul 1.2).

în depozitul fracțiunii AXDA se găsește o activitate endoxilanază de 339,0 U/mg. Endoxilanază și AXDA se testează mai târziu într-un sistem de digestie in vitro (vezi exemplul 6).

715

720

725

RO 116211 Bl

De aici se ajunge la concluzia că activitatea endoxilanază din depozitul fracțiunii ADXA este o activitate asociată cu o activitate polipeptidică diferită. O indicație suplimentară este găsită de către Kormelink (1992, pHD. Thesis, Chapter 6, p.1O7, ultimele două paragrafe și p. 108) și anume aceea conform căreia o polipeptidă având activitate endoxilanază co-eluează cu o enzimă similară AXDA. Se ajunge la concluzia că AXDA în sine nu are activitate endoxilanază.

Exemplul 3. Construcția unei bănci de expresie cADN

Exemplul 3.1. Inducerea și izolarea mARN

Se crește o cultură A. niger N400 timp de 69 h și, respectiv, 81 h, așa cum s-a descris în EP 0463706 fără extract de drojdie și 2% fracțiune arabinoxilan de grâu brut în loc de xilan de ovăz, după care miceliul se recoltează prin filtrare și apoi se spală cu soluție salină sterilă. Miceliul este, în continuare, înghețat în azot lichid, după care se transformă în pudră folosind un Microdismembrator (Braun). Se izolează ARN total din pudra de miceliu, în conformitate cu protocolul tiocianat de guanidină / CsCI descris în Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), în “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’, ed. a 2-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, cu excepția faptului că ARN-ul se centrifughează de două ori folosind un gradient CsCI. Se izolează poliA⁺ mARN din 5 mg de ARN total prin cromatografie oligo(dT)-celuloză (Aviv și Leder, 1972, Sambroock et al., 1989) cu următoarele modificări: se omite SDS din toate soluțiile și tamponul de încărcare se suplimentează cu 9% dimetilsulfoxid (v/v).

Exemplul 3.2. Construcția băncii cADN

Se sintetizează cADN din 7 pg poliA⁺mARN și se leagă în bacteriofagul Lambda λ Uni-ZAP XR folosind trusa de sinteză ZAP™-cDNA (Stratagene) urmând instrucțiunile fabricantului. După ligarea cADN-ului în vectorul Uni-ZAP XR, fagul ADN se împachetează folosind extracte Packagene™ (Promega) conform instrucțiunilor fabricanților. Ligarea a 120 ng cADN în 1,2 pg vector ramificat și împachetarea ulterioară a amestecului de reacție are ca urmare o primă bancă constând din 3,5 x 10⁴ fagi recombinanți. Această bancă inițială se amplifică folosind E. coli XL1-Blue MRF’, se titrează și se depozitează la 4°C.

Exemplul 4. Cercetarea băncii cADN de A. niger N400 pentru (axdA) cu anticorpi Împotriva AXDA și izolarea clonelor cADN

Exemplui 4.1. Prepararea anticorpilor împotriva AXDA pe un iepure

Se dializează 500 pg AXDA contra tampon fosfat 1 mM pH 7,0 și se liofilizează. Proteina se resuspendă în 1 ml PBS steril (0,136 M NaCI; 2,7 mM Kcl; 8 mM Na₂HP0₄; pH 7,4). La acest amestec de proteină se adaugă 1 ml de adjuvant Freunds complet și se barbotează timp de 30 min pentru a obține o emulsie stabilă. Acest amestec se injectează subcutanat la iepure. După 6 săptămâni, se face un rapel prin injectarea a 250 pg AXDA în 0,5 ml PBS steril la care se adaugă 0,5 ml de adjuvant Freunds incomplet. Se ia sânge de la iepure în săptămâna 7 și se testează serul. în săptămâna 13 iepurele primește un al doilea rapel de 250 pg, urmat de o prelevare de sânge în săptămâna 14. Această procedură de rapeluri cu un interval de 6 săptămâni, urmat de o prelevare de sânge poate fi repetată de câteva ori.

Sângele colectat se incubează 30 de min la 37°C și, în continuare, se păstrează la 4°C timp de 16 h. După centrifugare la 5000 rpm într-o centrifugă Sorwall High Speed se colectează serul.

RO 116211 Bl

780

Exemplul 4.2. Imunocercetarea băncii cADN A. niger N4OO cu anticorpi provocați împotriva AXDAnjg

Pentru a cerceta banca cADN A. niger N400, construită cum s-a descris în exemplul 3.2, pentru axdA, clone cADN 5x10³ pfu/placă se etalează în topagaroză NZYCM conținând 0,7% agaroză pe plăci NZYCM de 85 mm diametru (1,5% agar), așa cum s-a descris (Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook, 1982, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual¹; Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p.64), folosind ca bacterii de etalare E. coli BB4.

Se fac două replici de la fiecare placă pe filtre de nitroceluloză (Schlecher și Schull BA85), așa cum s-a descris de către Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. [1989], ^ Molecular Cloning: A Laboratory Manual', ed. a 2-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, p. 12.16-12.17). AXDA_NIGse vizualizează folosind anticorpi provocați contra AXDA_TUB purificată (exemplul 4.1) după imunocolorare cum s-a descris în EP 91205944.5 (WO 0463706 A1). Se identifică plăcile imunocolorate care apar în duplicat pe filtrele replici; se selectează 8 plăci pozitive. Fiecare placă pozitivă se ridică de pe placă folosind o pipetă Pasteur și fagii se eluează de pe tamponul de agar în 1 ml tampon SM care conține 20 pl cloroform, așa cum s-a descris în Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook, 1982, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual'; Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p.64. Fagii obținuți se purifică prin repetarea procedurii descrise mai sus, folosind replici filtru de la plăcile care conțin 5-10 plăci ale fagilor izolați.

După purificare, fagii se propagă prin etalarea 5 χ 10³ fagi pe mediu NZYCM. După incubare peste noapte la 37°C, se obțin plăci confluente din care se eluează fagii prin adăugarea a 5 ml tampon SM și păstrarea plăcii 2 h la 4°C cu agitare intermitentă. După colectarea supernatantului folosind o pipetă se îndepărtează bacteriile din soluție prin centrifugare la 4000 x g timp de 10 min la 4°C. Se adaugă la supernatant 0,3% cloroform și se determină numărul de pfu. Aceste stocuri de fagi conțin aproximativ 1O¹⁰ pfu/ml.

Exemplul 4.3. Analiza de restricție pe clone cADN axdA

Clonele recombinante Uni-ZAP XR conținând cADN axdA se convertesc la fagemizi Bluescript, folosind suprainfectarea cu fagul filamentos ajutător ExAssist™, care este inclus în trusa de sinteză ZAP™-cADN de la Stratagene, urmând instrucțiunile fabricantului.

Fagemidul ADN se izolează în continuare cum s-a descris în Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’, ed. a 2-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, p. 1.25-1.28.

ADN-ul izolat al celor 8 clone cADN axdA se supune la analiză de restricție folosind următoarele enzime de restricție: EcoRI și Xhol. Se digeră ADN-ul 2 h la 37°C într-un amestec de reacție compus din următoarele soluții: 2 pl (circa 1 pg) soluție ADN; 2 pl de tampon corespunzător 10*React. (BRL); 10 U din fiecare enzimă de restricție (BRL) și apă distilată sterilă pentru a obține un volum final de 20 pl. După adăugarea a 4 pl tampon de încărcare ADN, probele se încarcă pe un gel TAE-agaroză 0,7%. Fragmentele ADN se separă prin electroforeză la 80 V timp de 1,5 h.

Analiza de restricție arată că clonele cADN axdA au o mărime moleculară de aproximativ 1,2 kb.

785

790

795

800

805

810

815

820

RO 116211 Bl

Exemplul 4.4, Analiza secvenței pe clone cADN axdA A. niger

Structura primară a clonelor cADN se determină prin analiza secvenței combinate cu folosirea oligonucleotidelor specifice ca primeri în reacțiile de secvențare.

Secvențele nucleotidice se determină prin procedura dideoxinucleotidă terminatoare de catenă (Sânger, F., Nickelen, S.,Coulson, A.R. (1977), “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Voi. 74: 5463-5467), folosind trusa de secvențare ADN polimerază T7, Pharmacia. Analiza pe computer se face folosind programul PC/GENE.

Exemplul 4.5. Marcarea ³²P a fragmentului

Fragmentul clonei cADN axdA A. niger se izolează și se marchează așa cum s-a descris în EP 91205944.5 (WO 463709 A1, exemplele 2.2 și 7.1 .incluse aici ca referințe).

Exemplul 4.6. Cercetarea băncii genomice a A. niger var. niger pentru gena axdA și izolarea genei

Pentru cercetarea băncii genomice A. niger var. niger, construită așa cum s-a descris de către Harmsen, J.A.M. et al., 1990, “Curr. Genet 18:161-166, pentru gena axdA 3x10³ pfu/placă se etalează în top-agaroză NZYCM care conține 0,7% agaroză pe 5 plăci NZYCM de 85 mm diametru (1,5% agar) așa cum s-a descris (Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook, 1982, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’: Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p.64), folosind ca bacterii de etalare E. coli LE392.

După incubarea peste noapte a plăcilor la 37°C, se fac două replici ale fiecărei plăci pe filtru HybondN (Amersham) așa cum s-a descris în Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook, 1982, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’: Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p. 320-321.

După umezirea filtrelor în 3 x SSC, filtrele se spală 60 min la temperatura camerei în 3 x SSC. Filtrele se prehibridizează la 65°C timp de 2 h în tampon de prehibridizare care conține: 6 x SSC, 0,5% SDS, 10 x soluție Denhardt, 0,01 M EDTA și 100 pg/ml ADN spermatic de hering denaturat termic (Boehringer Mannheim). După 2 h de prehibridizare, tamponul de prehibridizare se înlocuiește cu tampon de hibridizare, care este identic cu tamponul de prehibridizare, dar conține fragmentul care conține clona cADN axdA A. niger de 1,2 kb marcat ³²P (vezi exemplul 4.3) și preparat așa cum s-a descris în exemplul 4.5. Filtrele se hibridizează 18 h la o temperatură de 65°C.

După hibridizare, filtrele sunt inițial spălate la 65°C, timp de 30 min în 5 x SSC /0,1% SDS; urmează o a doua spălare la 65°C timp de 30 de min în 2 x SSC / 0,1% SDS. Filtrele sunt spălate apoi la 65°C timp de 30 min cu 0,1 x SSC /0,1% SDS; urmează o ultimă spălare la 65°C timp de 30 de min în 0,1 x SSC. Filtrele se usucă la aer și se așază pe o fâșie de hârtie Whatman 3MM, se fac semne cu cerneală radioactivă și hârtia Whatman și filtrele se acoperă cu Saran Wrap. Plăcile hibridizate se identifică prin expunerea filmului Kodak XAR la raze X timp de 72 h la -70°C, folosind un ecran de intensificare.

Se găsesc 10 plăci pozitive hibridizate care apar în duplicat pe filtrele replici.

Se ridică de pe placă 4 plăci pozitive folosind o pipetă Pasteur și fagii se eluează de pe tamponul de agar în 1 ml tampon SM conținând 20 pl cloroform așa cum s-a descris în Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook, 1982, Molecular Cloning: A

Laboratory Manual': Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p.64.

RO 116211 Bl

870

Fagii obținuți se purifică repetând procedura descrisă mai sus, folosind filtre replici care conțin 50-100 plăci de fagi izolați.

După purificare, fagii se propagă prin întinderea a 5 x 10³ fagi pe mediu NZYCM. După incubare peste noapte la 37°C, se obțin plăci confluente, din care fagii se eluează adăugând 5 ml tampon SM și păstrarea plăcii timp de 2 h la 4°C cu agitare intermitentă. După colectarea supernatantului folosind o pipetă, se îndepărtează bacteriile din soluție prin centrifugare la 4000 x g timp de 10 min, la 4 °C. La supernatant se adaugă 0,3% cloroform și se determină numărul de pfu. Aceste stocuri de fag conțin circa 10⁷ pfu/ml.

Exemplul 4.7. Izolarea ADN-ului din bacteriofagul lambda

Fiecare din fagii izolați se propagă combinând 5 x1ο⁹ bacterii E. coli LE392 în 300 pl tampon SM cu 2 x 10⁶ fagi și incubare la 37°C timp de 15 min. După perioada de incubare, bacteriile infectate se folosesc pentru a inocula 100 ml mediu NZYCM preîncălzit (37°C) și, în continuare se incubează 9-12 h la 37°C într-un agitator rotativ New Brunswick la 250 rpm perioadă după care bacteriile se lizează. Deșeurile bacteriene se îndepărtează prin centrifugare 10 min la 10000 rpm la 4°C într-o centrifugă Sorvall High Speed. Fagii se precipită din supernatantul obținut (100 ml] prin adăugarea a 10 g polietilenglicol-6000 și 11,7 g NaCI și păstrarea soluției peste noapte la 4°C. Fagii precipitați se colectează prin centrifugare la 14000 x g la 4°C timp de 20 de min. Supernatantul se îndepărtează prin aspirare, ultimele urme de lichid îndepărtându-se prin tamponare cu hârtie. Fagii se resuspendă atent în 4 ml tampon SM și se extrag o dată cu un volum egal de cloroform.

înainte să se extragă ADN-ul din particulele fagice, ADN-ul și ARN-ul originar din bacteriile lizate se îndepărtează prin incubarea suspensiei fagice cu DNA-ază I și RNA-ază A (ambele 100 pg/ml) timp de 30 min la 37°C. ADN-ul fagic s-a eliberat ulterior din fagi prin adăugare de EDTA până la o concetrația finală de 20 mM în același timp îndepărtându-se proteina din soluție prin extragere de 2 ori cu un volum egal de fenol / cloroform / alcool izoamilic (25:24:1). După separarea fazelor prin centrifugare folosind o centrifugă Solvall (14000 x g, 10 min), faza apoasă s-a extras o dată cu un volum egal cloroform / alcool izoamilic (24:1). Fazele s-au separat prin centrifugare după care ADN-ul s-a precipitat din faza apoasă prin adăugare a 0,1 voi. 5M perclorat de sodiu și 0,1 voi. izopropanol și incubare pe,gheață 30 min. Se recuperează ADN-ul prin centrifugare 10 min. la 4°C (14000 x g). Supernatantul se îndepărtează prin aspirare după care ADN-ul se resuspendă în 400 pl tampon TE. Se precipită ADN-ul încă o dată din această soluție, prin adăugarea a 0,1 voi. 3M acetat de sodiu și 2 voi. etanol. Se colectează ADN-ul prin centrifugare 10 min. la 4°C (14000 x g). Supernatantul se îndepărtează prin aspirare, peleta rămasă se usucă sumar la vid, după care ADN-ul se resuspendă în 125 pl tampon TE care conține 0,1 pg/ml RNA-ază A. Această procedură de purificare are ca rezultat izolarea a aproximativ 50-100 pg ADN din fiecare fag.

Exemplul 4.8. Analiza Southern a fagilor care conțin ADN axdA A. niger var. niger

Se analizează ADN-ul izolat de la fagii Â_nigaxd1 până la Â_nigaxd4 prin analiză Southern folosind următoarele enzime de restricție: Kpnl; Sall; Sstl; Xbal; și Xhol și combinațiile

Kpnl + Xbal; Kpnl + Sstl; și Kpnl + Xhol timp de 5 h la 37°C într-un amestec de reacție compus din următoarele soluții: 5 pl (circa 1 pg) soluție ADN; 2 pl de tampon

875

880

885

890

895

900

905

910

RO 116211 Bl corespunzător 10 x React. (BRL); 10 U enzimă de restricție (BRL) și apă distilată sterilă, pentru a da un volum final de 20 pl. După digestie, ADN-ul se precipită prin adăugarea a 0,1 voi. 3M NaAc și 2 voi. etanol. Se colectează ADN-ul prin centrifugare 10 min la temperatura camerei (14000 x g). Supernatantul se îndepărtează prin aspirație, peleta care rămâne se usucă sumar la vid și se resuspendă în apă distilată sterilă. După adăugarea a 4 pl tampon de încărcare ADN, probele se incubează 10 min la 65°C și se răcesc rapid pe gheață înaintea încărcării probelor pe un gel de agaroză 0,6% în tampon TAE. Fragmentele ADN se separă prin electroforeză la 25 V timp de 15-18 h.

După electroforeză, ADN-ul se transferă și se denaturează prin pătare alcalină la vid (VacuGene XL, pHarmacia LKB) la membrană de nylon (HybondN, Amersham) așa cum este descris în manualul de instrucțiuni (p.25-26) și, ulterior, se prehibridizează și hibridizează folosind clona cADN axdA A. niger marcată așa cum s-a descris în exemplul 4.6 și în condițiile de hibridizare descrise în exemplul 3.3. îmaginea hibridizării se obține prin expunere a filmului Kodak XAR-5 la raze X timp de 18 h la -7O°C folosind un ecran de intensificare.

Din rezultatele obținute, se trage concluzia că ADN-ul tuturor celor patru clone izolate a hibridizat cu cADN axdA A. niger. în toate cele 4 clone se găsesc fragmente originare din aceeași regiune genomică.

Exemplul 4.9. Subclonarea genei axdA a A. niger var. niger.

Fragmentul Xhol de 3,7 kb din Â_njgaxd1 se izolează din gelul de agaroză 0,7% prin metoda comprimării la rece; după electroforeză banda corespunzătoare este desprinsă și agitată cu grijă timp de 30 min în 1 ml soluție FS1 (0,3 M NaAc pH 7,0; 1 mM EDTA). Fragmentul de agaroză se transferă într-o eprubetă Eppendorf de 0,5 ml care conține un tampon mic de vată de sticlă tratat cu silicon și un orificiu în bază și se congelează în azot lichid. Eprubetă de 0,5 ml se transferă apoi într-o eprubetă Eppendorf de 1,5 ml și, în continuare, se centrifughează 10 min. Se adaugă la supernatant 1/50 volume de soluție FS2 (0,5 M MgCI₂; acid acetic 5%) și 2,5 volume etanol 100%. După 20 min de incubare la -70°C, se colectează ADN-ul prin centrifugare 15 min la 14000 x g la 4°C. După îndepărtarea supernatantului, peletul ADN se usucă folosind o centrifugă cu vid Savant Speedvac. Se dizolvă ADN-ul în 10 pl tampon TE și se determină concentrația prin electroforeză în agaroză folosind ADN lambda cu o concentrație cunoscută ca referință și colorație bromură de etidiu pentru detectarea ADN-ului.

Vectorul pBluescript SK se digeră cu Xhol și se defosforilează cu fosfataza alcalină preparată după cum urmează: 1 pl (1 pg/μΙ) pBluescript se amestecă cu 2 pl 10 * React 2 (BRL), 1 pl (1 U/μΙ) Xhol și 16 μΙ apă distilată sterilă. Se digeră ADNul 2 h la 37°C după care se adaugă 0,5 μΙ fosfatază alcalină (1 U/μΙ) (pHarmacia) urmat de o incubare suplimentară la 37°C pentru încă 30 de min. Vectorul linearizat se izolează din gelul de agaroză 0,7% așa cum s-a descris mai sus.

Fragmentul Xhol de 3,7 kb se leagă în vectorul pBluescript SK digerat Xhol și defosforilat prin intermediul următoarei proceduri: se amestecă 40 ng fragment pBluescript cu 300 ng fragment Xhol 3,7 kb, 4 μΙ 5 * tampon de ligare (500 mM

Tris-HCI, pH 7,6; 100 mM ATP, 10 mM ditiotreitol; 25% PEG-6000) și 1 μΙ (1 U/μΙ)

ADN ligază T4 (BRL) se adaugă la acest amestec, rezultând un volum final de 20 μΙ.

Plasmidul rezultat este denumit plM3002.

RO 116211 Bl

960

După incubare 16 h la 16°C, amestecul se diluează la 1DO pl cu Ca-HEPES pH 7,0. Se folosesc 10 pl de amestec diluat pentru a transforma celule competente E. coli DH5a preparate după cum urmează: 200 pl dintr-o cultură E. coli DH5a precrescută peste noapte în mediu LB (mediu LB per 100 ml: 10 g peptonă tripticază (BBL), 5 g extract de drojdie (BBL), 10 g NaCI, 0,5 mM Tris-HCI pH 7,5). Această cultură se incubează la 37°C într-un agitator orbital până când densitatea sa corespunde la O.D.gQQ de 0,15-0,2. Apoi, bacteriile se colectează prin centrifugare la 5000 rpm la 4°C. După îndepărtarea supernatantului, celulele se mențin constant pe gheață. Peletul bacterian se spală în 100 ml, 100 mM MgCI₂, 5 mM Tris-HCI, pH 7,4 prin resuspendarea acestor celule urmată de centrifugare, așa cum s-a descris mai sus. Aceasta se repetă cu 100 ml, 100 mM CaCI₂, 5 mM Tris-HCI, pH 7,4. în final, celulele se resuspendăîn 2 ml 100 mM CaCI₂, 5 mM Tris-HCI, pH 7,4, 14% giicerol. Alicote (50 pl) se folosesc fie imediat pentru transformare, fie se îngheață la -70°C.

Celulele competente E. coli DH5a se folosesc în experimentul de transformare combinând 50 pl suspensie de celule cu 4,5 μΙ amestec de ligare. După o incubare de 30 de min, pe gheață, celulele se incubează 2 min la 42°C. Apoi, se adaugă 1 ml mediu LB și celulele se incubează la 37°C timp de 1 h. Apoi bacteriile se colectează prin centrifugare la 14000 x g 30 de sec. După îndepărtarea supernatantului, celulele se resuspendă în 200 pl mediu LB. Suspensia bacteriană rezultată se întinde pe mediu LB conținând 100 pg/ml ampicilină, 50 pg/ml X-gal și 60 pg/ml IPTG.

Din coloniile rezultate se cresc 12 peste noapte în mediu LB care conține 100 pg/ml ampicilină. Din culturi, se izolează plasmidul ADN prin metoda lizei alcaline descrise se către Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982), în Molecular Cloning: 4 Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p.368369, care este folosit în analiza de restricție așa cum s-a descris în exemplul 4.3 pentru a selecta o clonă care adăpostește plasmidul dorit. Plasmidul ADN se izolează pe scară mare din culturi E. coli DH5a de 250 ml care conțin plasmidul plM3OQ2 crescute în mediu LB conținând 100 pg/ml ampicilină folosind trusa Nucleobond PC500 (Nagel) conform instrucțiunilor producătorului. Plasmidul plM3002 se analizează ulterior prin enzime de restricție, rezultând harta de restricție prezentată în fig. 4. O mostră a E. coli care conține plM3002 s-a depozitat pe 28 August 1995 la CBS, Baarn, Olanda, sub numărul CBS 637.95.

Exemplul 4.10. Supraexpresia genei clonate În A. niger NW219

Exemplul 4.10.1, Introducerea axdA A. niger var. niger în A. niger prin cotransformare.

Plasmidul plM3002, obținut în exemplul 4.9, se introduce în A. niger prin cotransformarea lui A. niger NW219 folosind A. niger pyrA ca marker de selecție pe plasmidul pGW635 (Goosen, T. et al., 1987, “Curr Genet’, 11: 499-503) și plasmidul plM3002 ca plasmid de cotransformare. O mostră a A. niger NW219 s-a depozitat pe 25 August 1995, la CBS, Baarn, Olanda, sub numărul CBS 635.95.

Se prepară protoplaști din miceliu prin creșterea A. niger NW219 pe mediu minimal suplimentat cu 0,5% extract de drojdie, 0,2% casaminoacizi, 50 mM glucoză, mM nicotinamidă și 10 mM uridină timp de 18 h la 30°C. Prepararea protoplaștilor de A. niger NW219 și procedura de transformare se realizează așa cum s-a descris de către Goosen, T. et al., 1987, “Curr Genet', 11: 499-503. Transformanții rezultați PYR⁺ se analizează pentru expresia genei axdA A. niger var. niger prin analiză

Western blot.

965

970

975

980

985

990

995

1000

1005

RO 116211 Bl

Exemplul 4.10.2. Căutarea transformanților pentru expresia genei axdA A. niger var. niger.

Transformanții obținuți în exemplul 4.10.1 se analizează pentru formarea produsului genei axdA a A. niger var. niger, proteina AXDA^g. Se folosesc 19 din acești transformanți într-un experiment de creștere pentru a analiza expresia AXDA_NIG. Ca tulpină de control se folosește tulpina de tip sălbatic A. niger N402. Transformanții se cresc așa cum s-a descris în exemplul 3.1 timp de 24, 40, 48 și 68 h. După creștere, miceliul se îndepărtează prin filtrare și filtratul de cultură se analizează prin Western blot folosind anticorpii provocați împotriva AXDA_TUB pe un iepure (exemplul 4.1). Prin această procedură se detectează că 8 din cei 19 transformanți analizați supraproduc proteina AXDA_N(G.

Exemplul 4.11. Analiza secvenței și descrierea genei axdA A. niger var. niger.

Secvența genei axdA A. niger var. niger, regiunea sa promotor/reglatoare, partea structurală a genei și regiunea terminatoare se determină prin subclonarea fragmentelor din plM3DO2 în pBluescript SK‘ și pUC19 în combinație cu folosirea oligonucleotidelor specifice ca primeri în reacțiile de secvențare. Secvența nucleotidică se determină așa cum s-a descris în exemplul 4.4 (Secvența nr. 5).

Secvența obținută cuprinde 2101 bp, 783 bpîn regiunea necodificatoare 5' și 322 bp în regiunea necodificatoare 3'. în regiunea necodificatoare 5' se găsește o căsuță TATA la pozițiile 665-670. Partea codificatoare a genei axdA A. niger este în lungime de 996 bp și nu este întreruptă prin introni. Gena codifică o proteină în mărime de 332 aminoacizi. Secvența N-terminală, așa cum s-a determinat în exemplul 1.5.1 bazat pe proteina AXDA A. niger var. tubigensis, este precedată de o prepeptidă în lungime de 26 aminoacizi. Proteina matură este în mărime de 306 aminoacizi și are o greutate moleculară presupusă de 33101 kDa și un punct izoelectric teoretic de 4,07.

Exemplul 5.1. Clonarea fragmentului cADN care conține secvențele axdA A. niger var. tubigensis obținut prin PCR.

Exemplul 5.1.1. Generarea fragmentelor cADN prin PCR.

Secvența aminoacidă parțială a fragmentului intern CNBr (Secvența nr. 2) așa cum s-a determinat pentru AXDA_ȚUB se folosește pentru a determina amestecul de oligonucleotide. Derivă următorul amestec: 5'-ATG ATK GTI GAR GCI ATK GG-3' (20meră) (Secvența nr. 3), în care I este pentru o inozină, K pentru o A, T sau C și R pentru o A sau G. Această oligonucleotidă derivă din secvența aminoacidă internă a AXDA^ așa cum s-a descris mai sus, în exemplul 1.4.2 de la aminoacidul 1 (I) până la aminoacidul 6 (G). ATG-ul derivă de la metionină care este cunoscută a fi prezentă la capătul N-terminal al fragmentului peptidic datorită mecanismului de clivaj CNBr.

Amestecul oligonucleotidic se folosește în PCR (Saiki, R.K. et al., 1988, “Science”, 239, 487-491) în combinație cu oligonucleotidă T7 (Stratagene) 5-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3' (17-meră) (Secvența nr. 4) folosind cADN care se izolează așa cum s-a descris în exemplul 4.7.

Pentru PCR se combină 2 pl din λ-cADN rezultat cu 5 pl 10 x tampon de reacție (100 mM Tris-HCI, pH 8,3; 500 mM KCI; 15 mM MgCI₂; 0,01% gelatină),

4,0 pl 1,25 mM din fiecare dintre cele 4 deoxinucleotide trifosfate și 0,5 pg de oligonucleotide într-un volum final de 50 pl. Amestecul de reacție se amestecă și se adaugă 0,5 pl polimerază TAQ (5 U/μΙ) (HT Biotechnology, Cambridge UK).

RO 116211 Bl

1055

Se încălzește ADN-ul și se denaturează prin incubare 3 min la 95°C urmat de 25 de cicluri de 1 min la 95°C, 1 min la 42°C și 1 min la 72°C. După aceste 25 cicluri, amestecul se incubează 5 min la 72°C. Analiza produșilor de reacție arată doi produși distincți de circa 500 bp și 600 bp. Pe baza unei greutăți moleculare aparente de 32 kDa pentru AXDA și greutăți moleculare aparente de 9 kDa pentru peptide CNBr, fragmentul este în limitele așteptate.

Exemplul 5.1.2, Clonarea și analiza fragmentelor PCR de 500 bp și 600 bp.

Exemplul 5.1.2.1. Clonarea fragmentelor PCR de 500 bp și 600 bp.

Ambele fragmente de 500 bp și 600 bp se leagă într-un vector pGEM™-T (Promega) conform instrucțiunilor fabricantului. După incubare 16 h la 14°C, 4,5 pl amestec de ligare se folosește pentru a transforma celule competente E. coli DH5a. Câte 6 dintre coloniile rezultate de la fiecare ligare se cresc peste noapte în mediu LB care conține 100 pg/ml ampicilina. Se izolează ADN din culturile de plasmîd prin metoda lizei alcaline așa cum s-a descris de Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.Sambrook [Ί 982]:” Molecular Cloning:A Laboratory Manual’, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p.368-369.

Exemplul 5.1.2.2. Analiza secvenței fragmentelor PCR de 500 bp și 600 bp.

Structurile primare ale ambelor fragmente PCR de 500 bp și 600 bp se determină prin secvențarea fragmentelor așa cum s-a descris în exemplul 4.4.

Analiza pe computer a secvenței nucleotidice a ambelor fragmente PCR arată că fragmentul PCR de 600 bp nu are nici o similaritate cu genele cunoscute care degradează arabinoxilan și, prin urmare, se consideră ca un artefact PCR. Secvența nucleotidică a fragmentului PCR de 600 bp este foarte asemănătoare secvenței nucleotidice a clonei cADN prezentate în fig. 4 de la nucleotida 706 până la 1204.

Exemplul 5.2, Marcarea ^3SP a fragmentului PCR de 500 bp.

Fragmentul de 500 bp obținut prin PCR se izolează și se marchează așa cum s-a descris în EP 912059445 (WO 0463706 A1, exemplele 2.2 și 7.1 incluse aici ca referințe).

Exemplul 5.3. Cercetarea băncii genomice a A. niger var. tubigensis pentru gena axdA.

Pentru cercetarea băncii genomice a A. niger var. tubigensis, construită așa cum s-a descris în EP 912059445 (WO 0463706 A1), exemplul 2, pentru gena axdA 3 χ 10³ pfu/placă se întind așa cum s-a dscris în exemplul 4.6 cu fragmentul PCR de 500 bp marcat ³²P, preparat așa cum s-a descris în exemplul 5.1.1, ca sondă.

Se identifică 3 plăci de hibridizare care apar în duplicat pe filtrele replici și se desemnează Ă_tubaxh1 până la ^_baxh3. Fagii se izolează și se propagă așa cum s-a descris în exemplul 4.6.

Exemplul 5.4, Analiza Southern a fagilor care conțin ADN axdA de A. niger var. tubigensis.

Se izolează ADN de la bacteriofagi lambda așa cum s-a descris în exemplul 4.7.

se analizează ADN-ul izolat al fagilor Ă_țuba)(d1 până la prin analiză Southern folosind următoarele enzime de restricție: BamHI; EcoRI; Hindlll; Kpnl; Sall; Sstl și

Xhol. Analiza Southern se dirijează așa cum s-a descris în exemplul 4.8.

Din rezultatele obținute se ajunge la concluzia că ADN-ul tuturor celor 3 clone a hibridizat cu cADN axdA A. niger var. tubigensis. în toate cele 3 clone se găsesc fragmente originare din aceeași regiune genomică.

1060

1065

1070

1075

1080

1085

1090

1095

RO 116211 Bl

Exemplul 5.5, Subclonarea genei axdA a A. niger var. tubigensis.

Se izolează fragmentul Sstl de 5,5 kb de la λ_ω&8Χά3 și se leagă în vectorul pBluescript SK’ digerat Sstl și defosforilat așa cum s-a descris în exemplul 4.9, rezultând un plasmid denumit ca plM3001. Plasmidul plM3OO1 se analizează ulterior prin enzime de restricție rezultând harta de restricție prezentată în fig. 6. 0 mostră a E. coli DH5a care adăpostește plM3001 s-a depozitat pe 28 august 1995, la CBS, Baarn, Olanda, sub numărul CBS 636.95.

Exemplul 5.6. Expresia genei axdA donate A. niger var. tubigensis În A. niger NW219.

Exemplul 5.6.1. Introducerea genei axdA A. niger var. tubigensis în A. niger NW219 prin o transformare.

Plasmidul plM3001, obținut în exemplul 5.5, se introduce în A. niger prin cotransformarea lui A. niger NW219, așa cum s-a descris în exemplul 4.10.1. Transformanții PYFT rezultați se analizează apoi prin analiză Western blot pentru expresia genei axdA A. niger var. tubigensis.

Exemplul 5.6.2. Cercetarea transformanților pentru expresia genei axdA a A. niger var. tubigensis.

Transformanții obținuți în exemplul 5.6.1 se analizează pentru formarea produsului genei axdA A. niger var. tubigensis, proteina AXDA_TUB. Din acești transformând, 19 se folosesc într-un experiment de creștere pentru a analiza expresia pentru AXDA-njg. Tulpina A. niger N4O2 se folosește ca un control de tip sălbatic. Transformanții se cresc așa cum s-a descris în exemplul 3.1 timp de 20, 41, 60 și 86 h. După creștere, miceliul se îndepărtează prin filtrare și filtratul de cultură se analizează prin Western blot folosind anticorpii provocați împotriva AXDA_TUB pe un iepure (exemplul 4.1). Din cei 19 transformanți analizați, 12 produc proteina AXDA_TUB așa cum s-a detectat prin această procedură.

Exemplul 5.7. Analiza secvenței și descrierea genei axdA a A. niger var. tubigensis

Secvența genei axdA a A. niger var. tubigensis, regiunea sa promotor/ reglatoare, partea structurală a genei și regiunea terminatoare se determină prin subclonarea fragmentelor din plM3OO1 în pBluescript SK' și pUC19m combinație cu folosirea oligonucleotidelor specifice ca primeri în reacțiile de secvențare. Secvența nucleotidică se determină așa cum s-a descris în exemplul 4.4 (vezi secvența nr. 7).

Secvența obținută cuprinde 2859 bp, 823 bp în regiunea necodificatoare 5' și 1041 bpîn regiunea necodificatoare 3'. în regiunea 5' necodificatoare se găsește o căsuță CAAT la pozițiile 651-655 și căsuța TATA se găsește la pozițiile 713-720. Partea codificatoare a genei axdA A. niger var. tubigensis este în lungime de 996 bp și nu este întreruptă prin introni. Gena codifică o proteină în mărime de 332 aminoacizi. Secvența N-terminală determinată ca în exemplul 1.5.1 este precedată de o prepeptidă în lungime de 26 aminoacizi. Proteina matură este în mărime de 306 aminoacizi și are o greutate moleculară presupusă de 33250 kDa și un punct izoelectric teoretic de 4,20.

Exemplul 6. Digestia in vitro a porumbului cu AXDA

Exemplul 6.1. Izolarea solidelor insolubile în apă (WIS)

Pentru sistemul de digestie in vitro se izolează fracțiunea polimerică insolubilă.

Se macină porumb (3 mm) într-o moară Retsch și se degresează cu hexan (construcție Soxlet pentru distilare) timp de 6 h.

RO 116211 Bl

1150

După degresare, porumbul se usucă la 1O5°C și se macină din nou (1 mm, moară Retsch). La 400 g porumb degresat se adaugă 1,511,5% SDS / 0,05% β-mercaptoetanol și se agită la temperatura camerei 1 h (pentru degradarea proteinelor) după care se centrifughează 15 min la 24000 x g. După denaturarea proteinei, peletul se spală de trei ori cu 1 I SDS / β-mercaptoetanol și de 2 ori cu 1 I de apă demineralizată. Peletul se resuspendă în 4 I apă demineralizată și se sitează pe 32 pm. Procedura de spălare și sitare se repetă. Peletul fracțiunii WIS brut (mai mare de 32 pm) se dizolvă într-un litru tampon maleat (pH 6,5) și se incubează la 90°C, 50 min. Se adaugă 2 mg α-amilază (Maxamyl™ Gist-brocades) și se incubează 16 h la 30°C, după care se centrifughează 15 min (24000 x g). Digestia enzimatică se repetă, după care peletul se spală de 3 ori cu apă demineralizată de 65°C. Peletul (WIS) se liofilizează. WIS-ul conține 30% xiloză, 29% arabinoză, 23% glucoză și 7% galactoză. Se determină că glucoza nu este amidon (trusă de testare amidon Boehringer Mannheim).

Exemplul 6.2, Sistem de digestie in vitro la păsări domestice

Se determină conținutul de substanță uscată al WIS (95,73%) prin determinarea greutății WIS înainte și după uscare la 120°C.

în sistemul de digestie in vitro la păsări de curte la 1 g de WIS se adaugă 200 pl NaN₃ (Merck) și 1 ml standard intern (sorbitol 35 mg/ml, Sigma). Pentru digestia enzimatică în gușă (cu (200 pg proteină) sau fără enzimă) proba se umple cu tampon (NaAc, pH 5,5) până la 15 ml și se incubează la 39°C timp de 1 h. Pentru digestie în stomac, se adaugă 5 ml pepsină (5,28 g/l, pH 3,0; Merck) și se incubează pentru

1,5 h la 39°C. Pentru digestie intestinală, se adaugă 2,5 ml de săruri pancreatice / biliare (16 g/l, respectiv 0,1 g/l; Merck) și se incubează 1,5 h la 39°C. Proba se centrifughează 15 min (2800 g). Se folosește supernatantul pentru a măsura monozaharidele (HPLC, Spectra pHysics; coloană HPX-87P, Biorad) care se eliberează în timpul digestiei enzimatice. Peletul se usucă la 120°C și se determină greutatea. Se calculează procentul de materie uscată.

Drept control în sistemul in vitro se adaugă o doză răspuns a preparatului enzimei brute (rezultatele sunt prezentate în fig. 3). Enzima AXDA (se adugă 200 pg de proteină AXDA) arată o creștere considerabilă a digestiei materiei uscate comparativ cu martorul. Procentul digestiei substanței uscate de 15,8% pe fracția WIS de porumb este crescut cu 4,1% față de blanc-ul WIS de porumb.

Exemplul 7. Experiment de digestibilitate in vitro cu WIS de porumb Exemplul 7.1. Izolarea WIS de porumb

Izolarea WIS de porumb se face cum s-a descris în exemplul 6, cu unele modificări datorită incubării SDS / mercaptoetanol care nu se poate aplica la hrana animalelor. Procedura de izolare se efectuează pe 1 kg porumb degresat. La 1 kg porumb degresat, se adaugă 4 g papaină (Gist-brocades) / 100 g proteină de porumb și se suspendă la 30°C, 2 h. După aceasta, suspensia se digeră cu Maxamyl™ (Gist-brocades) (2 ml/l) la 100°C și se centrifughează (15 min, 24000 g). Supernatantul se îndepărtează și procedura de digestie enzimatică se repetă asupra peletului. Suspensia este centrifugată din nou și se spală de 3 ori cu apă demineralizată (1 I). După spălare, peletul (solide insolubile în apă) se liofilizează.

Conținutul mono/oligozaharide în WIS de porumb se determină printr-o analiză acid trifluoracetic (TFA). La 0,3 g de WIS se adaugă 1 ml 35 mg/ml sorbitol (standard intern), 2 ml apă demineralizată și 450 pl TFA urmat de hidroliză 1 h la 120°C.

1155

1160

1165

1170

1175

1180

1185

1190

RO 116211 Bl

După răcire, se adaugă 20 ml de apă demineralizată și hidrolizarea se continuă 1 h la 12O°C. După coborârea temperaturii, probele se liofilizează și se resuspendăîn 3 ml de apă demineralizată. Monozaharidele se îndepărtează pe o coloană HPX-87P (Biorad) într-un sistem HPLC (Spectra pHysics). Fracțiunea polimerică WIS a porumbului conține: 124,8 mg/g xiloză; 96,6 mg/g arabinoză; 28,2 mg/g galactoză și 156,0 mg/g glucoză. Datorită conținutului ridicat de glucoză, fracțiunea WIS se analizează pentru amidon (trusă de testare amidon, Boehringer Mannheim). Se găsește că fracțiunea WIS nu conține nici un amidon.

Exemplul 7.2. Experiment de digestibilitate cu broileri

Se realizează un experiment pentru detectarea influenței enzimei AXDA asupra conținutului energetic metabolizabil real al unei diete la care se adaugă 20% WIS de la porumb. Metoda folosită este “sibbald-assay” modificată.

Broileri masculi (în vârstă de 3 săptămâni) se adăpostesc individual în cuști întro cameră cu mediu controlat. Animalele sunt înfometate 48 h. Apoi se alimentează prin tub o cantitate de hrană determinată exact. Pentru corectarea pierderii de energie endogenă pe care o conțin componentele, în experiment se include un grup de control. Aceste animale sunt hrănite cu 10 g B-glucoză, în timp ce altele au primit g de hrană. Fiecare tip de hrană se dă la 6 animale. Pentru controlul glucozei, se constituie un grup alcătuit din 5 animale.

Animalele sunt înfometate pentru alte 48 h, perioadă în care se colectează cantitativ excrementele. Excrementele sunt păstrate la -2O°C până când se realizează analiza. în timpul acestei perioade, apa este accesibilă animalelor o singură dată, printr-un tub.

Digestele colectate se liofilizează și se cântăresc după echilibrare la aer. în probele de hrană și în probele de materie uscată a digestelor se analizează conținuturile de azot și energie.

Pentru corectarea rezultatelor experiențelor pe animale de control, se folosesc animale hrănite conform unor diete experimentale. Metoda aplicată este o adaptare a procedurilor experimentale descrise de Mcnab, J.M., Blair, J.C., (1988), British Poultry Science 29: 697-707. în această lucrare, este dată o descriere a metodelor și analizelor, și a calculului.

De asemenea, se realizează măsurători ale digestibilității materiei uscate in vitro pentru metoda descrisă în exemplul 6.2.

Tratamentele experimentale sunt după cum urmează:

I hrană de bază porumb (tabel 2) hrană de bază porumb + 10% WIS de porumb

III hrană de bază porumb + 20% WIS de porumb

IV hrană de bază porumb+20% WIS de porumb+100 mg/kg AXDA

V hrană de bază porumb + 20% WIS de porumb + 45 mg/kg enzimă brută

VI hrană de bază porumb + 20% WIS de porumb + 90 mg/kg enzimă brută

VII hrană de bază porumb + 20% WIS de porumb + 200 mg/kg endoxilanază.

Compoziția dietei de bază este dată în tabelul 2.

1235

RO 116211 Bl

Compoziția dietei de bază folosită în experiment

Tabelul 2

Conținutul hranei de bază	Compoziție (%)
Porumb	50,00
Tapioca	19,69
Făină de soia (50% proteină brută)	19,45
Făină de carne și oase	3,60
Mazăre (22,8% cp)	3,50
Făină de pește (74% cp)	1,00
Ulei de soia	1,00
Făină de pene (hidrolizată)	1,00
Monofosfat de calciu	1,23
Piatră de var (carbonat de calciu)	0,90
Sare	0,30
L-lizină.HCI	0,13
DL-metionină	0,20
Premix vitamine/minerale*	1,00

* Premixul vitamine/minerale eliberat/ kg de hrană: riboflavină, 4 mg; niacină, 40 mg; acid d-pantotenic, 12 mg; clorură de colină, 500 mg; B12, 15 pg; E, 15 mg; K3, 5 mg; retinilacetat, 3,44 mg; colecalciferol, 50 pg; biotină, 0,1 mg; acid folie, 0,75 mg; FeS0₄.7H₂0, 300 mg; Mg0₂, 1OO mg; CuS0₄.5Hg0, 100 mg; ZnS0₄.71-^0, 150 mg; N^iSeO,, 0,15 mg; antioxidant, 100 mg; și virginiamicină, 20 mg.

Rezultatele (energie metabolizabilă reală corectată pentru azot (TMEn) și rezultatele testului in vitro] sunt date în tabelul 3.

1240

1245

1250

1255

Energia metabolizabilă reală (corectată pentru azot: TMEn) și digestibilitatea in vitro a materiei uscate

1260

Tabelul 3

Tratament	Enzimă adăugată	TMEn (kJ/g)	Digestia in vitro (%)
I	-	13,59 a*)	36,4
II	-	12,39 b	36,2
III	-	11,17 c	31,9
IV	AXDA	12,37	39,7
V	enzimă brută	11,87bc	31,4
VI	enzimă brută	11,63bc	33,2
VII	endoxilanază	11,95b	32,6

*) Eroare standard reziduală: 0,42 LSD (5%): 0,76

1265

1270

RO 116211 Bl

Valorile TMEn cu o literă diferită sunt semnificativ diferite (P este mai mic decât 0,05) conform testului LSD.

Nivelul TMEn descrește semnificativ cu creșterea adăugării WIS de porumb.

Toate preparatele enzimatice îmbunătățesc valorile TMEn, dar numai pentru endoxilanază (+ 7,0%) și pentru AXDA (+ 10,7%) aceasta este semnificativă. Conform valorilor medii, AXDA îmbunătățește valoarea energetică până la nivelul hranei de bază suplimentată cu 10% WIS de porumb.

în modelul in vitro, care simulează procesul digestiv la pui, AXOA îmbunătățește important digestia materiei uscate (+ 24,5%). Endoxilanaza și preparatul enzimatic brut în acest model nu sunt la fel de eficiente ca AXDA.

Exemplul 8. AXDA în prepararea pâinii

Se testează AXDA într-un test de producere a unei franzele folosind tăvi pentru pâine. Franzelele se coc din bucăți de pastă de 150 g obținută prin amestecarea a 200 g făină (Robijn™/Columbus™8O/2O), 104 ml apă, 1,4 g drojdie de panificație uscată (Fermipan™) 4 g sare, 3 g zahăr, 400 mg CaCI₂.2H₂0, 3 mg (15ppm) acid ascorbic, 5 mg (25 ppm) alfa-amilază fungică (Fermizyme™P200) și 25 pg de AXDA purificată. După amestecare 6 min și 15 sec la 52 rpm într-un amestecător cu brațe, pasta se divizează, se lasă la întărit 45 min la 30°C, se frământă, se lasă la întărit pentru alte 25 min, se modelează și se așază în formă. După o întărire finală de 70 min la 30°C, aluatul se coace 20 de min la 225°C. Volumul franzelei se determină prin metoda dislocuirii seminței de rapiță. Volumul franzelei crește de la 490 ml (control) la 535 ml pentru franzelele care conțin AXDA, adică o creștere de 9%.

Claims

1. Polipeptidă cu activitate de degradare a arabinoxilanului, caracterizată prin aceea că secvența de aminoacizi este dată în secvența nr. 6 sau secvența nr. 8, precum și în porțiuni ale acesteia, care au activitate de degradare a arabinoxilanului.

2. Polipetidă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se folosește ca aliment sau la prelucrarea hârtiei și celulozei.

3. ADN recombinant cuprinzând un fragment de ADN care codifică o polipeptidă având activitate de degradare a arabinoxilanului, definită în revendicarea 1 sau o polipeptidă precursor al acesteia, caracterizat prin aceea că fragmentul de ADN este ales dintre:

(a) un fragment ADN care codifică o polipeptidă având secvența de aminoacizi reprezentată prin aminoacizii 1...306 din secvența nr. 5, sau un precursor al polipeptidei menționate, reprezentat prin aminoacizii 27...306 din secvența nr. 5;

(b) un fragment ADN care codifică o polipeptidă având secvența aminoacidă reprezentată prin aminoacizii 1...306 din secvența nr. 7 sau un precursor al polipeptidei menționate, reprezentat prin aminoacizii 27...306 din secvența nr. 7;

(c) un fragment ADN care codifică o porțiune a polipeptidelor reprezentate prin resturile de aminoacizi 1...306 ilustrate în secvența nr. 5 sau 7 care are încă activitate de degradare a arabinoxilanului sau o polipeptidă precursoare a acestora;

(d) un fragment ADN care codifică o polipeptidă cu activitate de degradare a arabinoxilanului și având secvența nucleotidică reprezentată prin nucleotidele 7841779 din secvența nr. 5 sau nucleotidele 823...1818 din secvența nr. 7;

RO 116211 Bl (e) un fragment ADN care codifică o polipeptidă cu activitate de degradare a arabinoxilanului sau o parte a unei astfel de polipeptide, fragment ADN care este capabil să hibridizeze la un fragment ADN precum cel reprezentat prin nucleotidele

784...1779în secvența nr. 5 sau nucleotidele 823...1818 din secvența nr. 7;

iar respectivul ADN recombinant mai poate cuprinde, în plus, secvențe ADN regulatoare necesare pentru expresia fragmentului ADN într-o celulă procariotă sau eucariotă, reprezentate prin secvențele de nucleotide 1 ...783 din secvența nr. 5 sau un subfragment al acesteia capabil să regleze expresia unei secvențe ADN atașata de el sau secvențele de nucleotide reprezentate prin nucleotidele 1...822 din secvența nr. 7 sau un subfragment al acesteia capabil să regleze expresia unei secvențe ADN atașată lui.

4. ADN conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că secvențele ADN regulatoare sunt heteroloage față de secvența respectivului fragment ADN, care codifică polipeptidă.

5. ADN conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că secvențele ADN regulatoare sunt selectate astfel, încât sporesc expresia fragmentului ADN într-o gazdă, comparativ cu expresia fragmentului ADN în gazda menționată, atunci când este legat la secvențele ADN regulatoare omoloage pentru el.

6. ADN conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că activitatea de degradare a arabinoxilanului se obține de la un fung filamentos.

7. ADN conform revendicărilor 3 și 4, caracterizat prin aceea că fungul filamentos este o specie de Aspergillus.

8. ADN conform revendicărilor 3 și 5, caracterizat prin aceea că fungul filamentos este Aspergillus niger sau Aspergillus tubigensis.

9. ADN conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că este sub forma unui vector.

10. AON conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că transformă o celulă gazdă eucariotă sau procariotă, care îl conține.

11. AON conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că transformă o celulă gazdă eucariotă, care aparține genului Aspergillus.

12. Procedeu de obținere a unei polipeptide definită în revendicarea 1, prin intermediul celulelor ce conțin ADN-ul recombinant definit în revendicarea 3, caracterizat prin aceea că, celulele obținute prin introducerea ADN-ului recombinant se selecționează, se dezvoltă în mediu de fermentație nutritiv convențional conținând o sursă de carbon, o sursă de azot, o sursă de azot organic, surse nutritive anorganice și, opțional, un inductor - arabinoxilan, se lasă să fermenteze o perioadă de 0,5...20 zile într-un procedeu discontinuu sau discontinuu cu alimentare, la temperatura de O...45°C și la un pH de 2...10, apoi se îndepărtează celulele prin centrifugare sau filtrare, se recuperează enzima și, opțional, se purifică.

13. Compoziție alimentară, caracterizată prin aceea că, conține polipeptidă definită în revendicarea 1 și un aditiv acceptabil din punct de alimentar.

14. Compoziție conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că polipeptidă este imobilizată.