KR20010021555A

KR20010021555A - 효소 혼합물

Info

Publication number: KR20010021555A
Application number: KR1020007000113A
Authority: KR
Inventors: 사바띠에알렝; 피쉬네빌마샬; 헤이니겔패터슨
Original assignee: 크리스티앙 쥘랭; 롱-프랑 아니말 뉴트리시옹; 트롤리에 모리스, 다니엘 델로스; 로디아 쉬미
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2001-03-15
Also published as: BR9906426A; CN1321178C; JP2007061105A; KR100877086B1; AU769386C; BRPI9906426B1; JP3907410B2; US20050227344A1; CN100593570C; US8043844B2; KR20070105387A; CN1944639A; AR019272A1; CN1273601A; UA77381C2; NZ502519A; US7374925B2; CA2295570C; AU769386B2; DE69941559D1

Abstract

본 발명은 새로운 미생물, 페니실리윰 퍼니쿨로섬 수득한 새로운 효소 혼합물 및 이에 대한 핵산서열에 관한 것이다.

Description

효소 혼합물{ENZYMES MIXTURE}

본 발명은 신규한 미생물, 신규한 효소 및 신규한 효소 혼합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 효소 혼합물의 조성물, 그의 제법 및 사료, 식품 및 제지산업 및 섬유산업을 포함한, 그러나 이에 국한되지 않은, 기타 산업들에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

효소는 여러 상이한 산업적 용도로 오랫동안 사용되어 오고있다. 예를 들면, 제빵 산업, 와인 및 과일 쥬스 산업 (여기에서 효소는 펙틴 및 β-글루칸을 분해하는데 사용된다), 섬유 산업 (여기에서 셀룰라제는 부드럽고 유연한 셀룰로스성 섬유를 수득하는데 사용된다), 및 또한 적지않은 활용이 있는, 동물용 사료에서 알려져 있다. 이러한 경우에서, 효소는 식물성 원료의 소화성을 증진시킨다.

이러한 최근의 사용은 가축이 먹이를 보다 효과적으로 섭취할 수 있게 한다. 사료의 가치는 동물의 체중 증량에 대한 소모된 먹이의 양의 영양적인 비율인, FCR (Feed Conversion Ratio)로 측정될 수 있다. 먹이에 대한 FCR 의 감소는 주어진 먹이량에 대해 동물이 비례적으로 보다 많이 증량한다는 것을 나타내는 것으로, 즉, 동물이 먹이를 보다 효율적으로 이용할 수 있다는 것이다.

사료 성분 (전분, 지방, 단백질/아미노산)의 소화가 불량하다는 것은 곡물-기재 사료의 주요 특징으로, 예를 들어, 보리나 밀 함량이 높게 함유되어 있는 것이다. 이러한 경우에, 사료를 다른 원료 및 아미노산과 같은 다른 보충물로부터 더 높은 수준의 에너지을 함유하도록 제조할 필요가 있을 수 있다. 상기 효소는 사료에 포함되는 곡물의 겉보기 대사 에너지 값을 증가시킨다.

상기 문제를 해결하기 위한 또 다른 시도로는 상기 곡물-기재 사료에 효소 보충물인, 셀룰라제, 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 (β-글루카나아제), 엔도-1,4-β-크실라나아제 (크실라나아제) 등, 또는 효소 활성의 혼합물을 첨가시키는 것이다. 효소 보충물은 곡물 (대표적으로 보리 및 밀)에서 발견되는 β-글루칸을 가수분해시키거나 또는 아라비녹실란을 가수분해시키는 특정 용도를 가질 수 있다. 이러한 효소의 첨가는 상이한 목적을 갖는다. 사료의 효능을 명백하게 증명하는 한가지 이점은 적절한 효소 보충물을 함유하는 곡물-기재 사료를 섭취한 동물의 소화관내에서 물질들의 점성도가 감소한다는 것이다. 점성도의 증가는 부분적으로 보리와 밀에서 발견되는 β-글루칸 및 아라비녹실란에 기인된다. 효소 작용으로 인한, 점성도의 감소는 동물의 소화관내에서 영양 성분들을 더욱 용이하게 흡수시킨다. 또 다른 이점은 곡물의 세포벽으로 갇혀있던 영양분들을 방출시켜 다른 값비싼 사료 보충물의 필요성이 줄어든다는 것이다. 전체적인 결과는 FCR 로 측정하여 유사한 또는 유용한 효과를 갖는 사료의 비용을 상당히 감소시킨다는 것이다.

상이한 범주의 미생물들로부터 유래되는 효소 조제물은 사료의 소화성을 향상시키는 것으로 알려져 왔다.

동물 사료에 대한 효소의 용도에 관련된 선행 기술을 고려하자면, 파이타제의 용도에 관해 기재된 유럽 특허 제 0.699.762 호 (issued from Schwanniomyces occidentalis)를 들 수 있다. 이 파이타제는 본 발명에서 피하고자 하는 클론된 유전자를 도입시켜 수득되는 유전적으로 변형된 유기체로부터 수득되는 파이타제이다.

국제 특허출원 WO 95/26398 에서는, 변형된 셀룰라제가 하기 미생물 목록에서 선택되는 원 균주의 성질을 변형시킨 숙주 세포에 외래 DNA 서열을 도입시킴으로서 수득된다: Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus. 본 발명에 있어서, 주요 목적은 효소를 생성하는 미생물에 외래 유전자의 도입을 피하고자 하는 것이다.

국제 특허 출원 WO 96/05739 에서는, 효소의 혼합물 (크실라나아제, 프로테아제 및 선택적으로, β-글루카나아제)이 상이한 미생물들로부터 수득된다. 저자는 크실라나아제 활성과 β-글루카나아제 활성의 비율이 1:5 인 효소 혼합물의 예 (제 5 쪽)를 제시한다. 크실라나아제가 곡물-기재 먹이에 적절한 공급수준 정도로 포함되어 있는 경우, β-글루카나아제 활성을 갖는 효소가 공존하면 사료의 FCR 을 증가시켜 당연히 불리하다는 것이 발견되었다. 결과적으로, 저자는 β-글루카나아제의 존재를 반대하여, 크실라나아제 활성과 β-글루카나아제 활성의 최대 비율이 1:0-0.25 일 것을 제시하였다.

어떠한 경우에 있어서, 사료 이용에 적절한 모든 효소 활성을 유지할 수 있도록, 조제물을 하나 이상의 미생물 유래의 제제들로 구성한다. 많은 경우에 있어서, 효소 조제물은 재조합 DNA 기술을 이용하여 유전자를 변형시킨 미생물로부터 수득되고 있다.

본 출원인은 주로 곡물-기재 동물 사료의 소화성을 성공적으로 증진시키는데 사용될 수 있는 효소 활성의 혼합물 및 새로운 효소를 함유하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 류에 속하는 신규한 미생물을 발견 및 개발하였다.

발명의 요약

따라서, 본 발명은 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum)에서 유래된 신규한 미생물 및 이 미생물의 배양하고 미생물에 의해 생성되는 효소를 회수하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 미생물로부터 방출되는 신규한 효소, 그의 핵산서열 및 상기 효소를 함유하는 신규 조성물을 제공한다.

더욱이, 본 발명에 따르면, 아미노산과 곡물-기재 동물 사료 및 아미노산의 소화성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 주제는 동물에게 섭취시킨 군으로부터의 인 배설 및 암모니아 배설의 감소이다.

A. 신규한 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 균주

균류 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum)의 새로운 균주는 부다페스트 조약(1977)하에 승인된 국제기탁기관 [International Mycological Institute (IMI), Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TW20 9TY, UK]에 기탁번호 IMI 378536 으로 기탁되었다.

파생

새로운 균주는 포자에 연속적인 UV 및 β-조사 처리에 이어 선별 배지상에서의 스크리닝 후 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) IMI 134756 으로부터 수득되었다. 외래 DNA 또는 RNA 의 도입을 이용한 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 변형은 수득되지 않았다.

특징 및 유형 확인

페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) IMI 378536 을 Czapek Dox 아가상에서 25 ℃ 로 성장시켜 특성화하였다. 콜로니 특징 및 미소-형태가 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum)에 대해 특징적이다. 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum)과 같은 미생물의 특징 확인은 기관 [International Mycological Institute, Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TW20 9TY, UK]에서 확인되었다. 균사(funiculose)의 타래 또는 다발로서, 공기중 성장하는 터프 베이살 펠트로 성장하고, 균사체는 기저부에 적색을 띄는 백색이고, 가장자리는 반대로 탁하지만 중심쪽으로 적색을 띄며 더 진하게 될 수 있다. 이러한 페리실리엄이 대표적이고, 이는 대, 복축분기, 아세로스 분생자 세포, 코니디아로부터 대부분 생긴 짧은 분생자병이 타원형으로 유연하다는 것을 나타낸다.

본 발명의 효소 조제물의 생산에 사용되는 미생물은 셀룰로스, 옥수수 침지액, 탄산칼슘 및 황산암모늄을 함유하는 배지에서 호기 조건하에 성장시킨다.

B. 발효 공정

본 발명의 새로운 균주는 하기와 같이 구성됨이 바람직한 종자 배지상에서 우선 기탁된 균주를 발효시켜 제조된다 :

- 옥수수 침지액 1 내지 4 중량%

- 거포제 거포되는 적량

- 물 100 중량% 까지

- NaOH 배지 멸균전에 pH 를 약 3.0 내지 6.0

으로 조절하는 충분량;

배양 온도 27 내지 36 ℃.

생산 배지는 하기 구성이 바람직하다 :

- 옥수수 침지액 0 내지 4.0 중량%

- 배치 및 공급 셀룰로스 0.8 내지 14 중량%

- 칼슘염 0 내지 0.8 중량%

- 황산암모늄 0 내지 1.0 중량%

- 거포제 거포되는 적량

- 물 100 중량% 까지의 충분량

- NaOH 배지 멸균전에 pH 를 약 3.0 내지 6.0

으로 조절하는 충분량;

- H₂SO₄pH 를 약 3.0 내지 6.0 으로 조절하는

충분량;

- 암모니아가스 또는 암모니아수 pH 를 약 3.0 내지 6.0 으로 조절하는

충분량;

배양 온도 27 내지 36 ℃.

발효를 위해서, 발효기에 충분한 물을 채우고, 적절히 진탕하는 용기내에서 물에 성분들을 첨가하고, 성분들이 용해될 때 까지 교반한다. 발효기를 밀봉하고 내용물을 일반적으로 121 ℃ 까지 상승시켜 멸균한다. 발효 용기에 종자 발효액을 접종한다.

발효 공정중에 첨가되는 주요 탄소원은 셀룰로스이고, 여러 셀룰로스 원료중에서 상이한 등급인 ARBOCEL, SOLKAFLOC, CLAROCEL, ALPHACEL, FIBRACEL 을 이용하는 것이 바람직하다.

발효중에 pH 는 황산 또는 다른 산, 및 기체 또는 액체 형태인 암모니아, 또는 기타 염기를 첨가하여 조절하는 것이 바람직하다.

발효가 끝날 무렵, 여과법 또는 원심분리법과 같은 고체-액체 분리방법에 의해 고체를 제거하고, 액상을 수합하여 예컨대 유기 또는 무기막을 이용한 초원심법에 의해 농축시킨다.

상기 효소들은 또한 재조합 DNA 기술로도 제조될 수 있으며, 재조합 상동체 종 또는 이종체 종에 의해서도 생성될 수 있다. 효소를 코드하는 유전자의 전이를 위한 숙주는 균류, 세균성 세포 또는 식물세포로부터 선택될 수 있다. 통상적인 방법으로는 숙주세포내로 목적하는 효소를 코드하는 유전자를 도입하기 위해서 플라스미드 (염색체내로 삽입되거나 삽입되지 않음), 파아지 벡터 및 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 이종 유전자 도입 또는 동종 유전자의 삽입, 결실 또는 변형에 의한 동종 유전자로의 게놈의 변형을 포함하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 이 또한 본 발명의 일부분을 구성한다.

본 발명에 따르면, 효소는 단리 정제된 효소 조제물 또는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 이 성장한 배양 배지와 같은 조 제조물로 제공된 수 있다.

하나 이상의 효소를 함유하는 조성물에 상기 효소(들)을 포함시키는 것도 가능할 수 있으며, 이러한 유형은 조성물의 목적하는 용도에 따라 다르다. 첨가되는 효소는 예를 들어 카르보히드라제, 리파아제 및 프로테아제로부터 선택될 수 있다.

C. 《효소 활성의 혼합물》의 조성물

1. 액체 조성물

액체 조성물을 위해서, 항생제 첨가후, 효소의 농도 및 생성물 강도에 대한 정확한 희석의 측정이 수행된다.

액체 용액의 바람직한 조성은 하기와 같다:

- 전부 유기성 고체인 미생물 생성물 4 - 10 중량%

- 항생제 0.005-0.35 중량%

바람직하게는 0.01-0.25 중량%

- 소르비톨 20-50 중량%

- 종국적인 부동제 0-40 중량%

보다 바람직하게는 15-40 중량%

- 여과 농축된 발효액 0.3-76 중량%

- pH 3-5 로 완충 조절

항생제는 소르브산 및 염, 벤조산 및 염, 메틸 4-히드록시벤조에이트 및 n-프로필 4-히드록시벤조에이트, 푸마르산, 염 및 에스테르와 같은 생성물로부터 선택된다. 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은 염이 또한 사용될 수 있다.

가장 바람직한 부동제는 1,2-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세롤이다.

2. 분말 조성물

분말 제제를 위해서, 수득된 농축 용액을 결국 담체의 존재하에서 건조시킨다. 담체의 부재하에서 농축 용액을 건조시켜 수득한 분말은 적합한 담체와 더 혼합시킬 수 있다.

분말 형태의 바람직한 조성은 하기와 같다:

- 전부 유기 고체인 미생물성 생성물 16 - 40 중량%

- 담체 59 - 83 중량%

- 기타 건조된 발효 배양 성분 1 중량%

바람직한 담체는 밀가루, 전분, 석고, 말토덱스트린, 옥수수 고형물, 굵게 간 옥수수와 같은 곡물 가공에서 유래된 부생성물, 거친 밀가루, 밀기울, 호밀 부스러기, 미네랄 혼합물로부터 선택된다.

F_r= T_기질-T_물/T_시험-T_물F_r= T_기질-T_물/T_시험-T_물D. 효소 특성

페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 에 의해 생산된 새로운 효소 혼합물을 수득하였다. 이러한 효소 혼합물은 셀룰라제, β-글루카나아제, 크실라나아제, 아라비노푸라노시다제 및 페룰로일 에스테라아제와 같은 크실라나아제 부속 효소과 같은 새로운 효소를 함유한다.

1. 절차

효소 제조는 셀룰라아제, 셀로비오히드로라아제, β-글루코시다아제, 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제, 라미나리나아제 엔도-1,4,-β-크실라나아제(상이한 기질사용), β-크실로시다아제, 아라비노푸라노시다아제 및 페룰로일 에스테라아제 (상이한 기질사용)활성을 위한 검정을 포함한 검정을 특징으로 한다.

1.1. DNS CMC 법에 의한 셀룰라아제

셀룰라아제 활성에 대한 검정은 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), β-1,4 글루칸에서의 글루코시드결합의 효소 가수분해에 기초한다. 반응의 산물, β-1,4 글루칸 올리고사카라이드는 환원값(글루코오스로서)의 증가로 측정한다.

0.1M 아세트산나트륨 버퍼중 1%(w/v)CMC 용액 1ml ; 적절히 희석된 효소용액 1ml 를 함유하는 용액을 50℃ 에서 10 분간 인큐베이션시킨다. 효소반응을 2ml 의 DNS 용액 (증류수중의 1%(w/v) 3,5-디니트로살리실산, 1.6%(w/v) 수산화나트륨, 30%(w/v) 칼륨 나트륨(+)-타르트레이트) 을 첨가하여 중지시킨다. 용액을 혼합하여 최소 95℃ 에서 5 분간 비등수조에 넣은후 25℃ 로 냉각시킨다. 10ml 의 증류수를 상기용액에 넣고 2cm 패스(path)길이의 유리셀을 이용하여 540nm 에서 흡광도를 측정한다.

결과는 동일한 방식으로 DNS 용액으로 처리한 0.00-0.04%(w/v)글루코오스 용액 2 ml 에 대한 표준 커브와 비교하여 μmoles 환원당(글루코오스로서) 로 전환시킨다.

관찰된 효소반응 흡광도를 DNS 용액을 효소용액전 혼합물에 첨가하는 반응을 실시하여 비특이적 흡광도에 대해 수정한다. 1 유니트의 셀룰라아제 활성은 검정 (50℃ 및 pH5.0 또는 다른 pH) 의 조건하 1 μmole 글로코오스 당량.min^-1을 생성시키는 효소의 양으로 정의한다.

1.2 p-니트로페닐 β-D-셀로비오피라노시드법에 의한 셀로비오히드로라아제

셀로비오히드로라아제의 검정은 p-니트로페닐 β-D-셀로비오피라노시드의 효소 가수분해에 기초한다. 반응의 산물 p-니트로페놀은 색도로 측정한다.

증류수중 0.1%(w/v)p-니트로페닐β-D-셀로비오피라노시드 1ml; 증류수 1ml; 0.2M 아세트산나트륨버퍼 1ml, pH5.0; 적절히 희석된 효소용액 1ml 을 함유하는 용액을 50℃ 에서 30 분간 인큐베이션시킨다. 효소반응은 0.4M 글리신 용액 4ml 을 첨가하여 중지시킨다. 용액은 혼합하여 20℃ 로 냉각시킨다. 흡광도는 1 cm 패스길이 유리세포를 이용하여 400nm 에서 측정한다.

결과는 상기 조건하 p-니트로페놀의 몰 익스텐션(extenction) 계수와 비교하여 μmole p-니트로페놀로 전환시킨다.

관찰된 효소반응 흡광도는 글리신 용액을 효소용액전 혼합물에 첨가하는 반응을 실시하여 비특이적 흡광도에 대해 수정한다. 1 유니트의 셀로비오히드로라아제 활성은 검정 (50℃ 및 pH5.0) 의 조건하 분당 p-니트로페닐β-D-셀로비오피라노시드로부터 1 μmole p-니트로페놀을 생성시키는 효소의 양으로 정의한다.

1.3 p-니트로페닐β-D-글루코피라노시드법에 의한 β-글루코시다아제

β-글루코시다아제의 검정은 p-니트로페닐β-D-글루코피라노시드의 효소가수분해에 기초한다. 반응의 산물, p-니트로페놀은 색도로 측정한다.

증류수중 0.1%(w/v)p-니트로페닐β-D-글루코피라노시드 1ml; 증류수 1ml; 0.2M 아세트산나트륨버퍼 1ml, pH5.0; 적절히 희석된 효소용액 1ml 을 함유하는 용액을 50℃ 에서 30 분간 인큐베이션시킨다. 효소반응은 0.4M 글리신 용액 4ml 을 첨가하여 중지시킨다. 용액은 혼합하여 20℃ 로 냉각시킨다. 흡광도는 1 cm 패스길이 유리세포를 이용하여 400nm 에서 측정한다.

관찰된 효소반응 흡광도는 글리신 용액을 효소용액전 혼합물에 첨가하는 반응을 실시하여 비특이적 흡광도에 대해 수정한다. 1 유니트의 β-글루코시다아제 활성은 검정 (50℃ 및 pH5.0) 의 조건하 분당 p-니트로페닐β-D-글루코피라노시드로부터 1 μmole p-니트로페놀을 생성시키는 효소의 양으로 정의한다.

1.4. DNS보리β-글루칸법에 의한 엔도-1,3-(4)-β-글루카나아제

엔도-1,3-(4)-β-글루카나아제 활성에 대한 검정은 보리 β-글루칸, β-1,3(4)-글루칸에서의 글루코시드결합의 효소 가수분해에 기초한다. 반응의 산물, β-1,3(4)-글루칸 올리고사카라이드는 환원값(글루코오스로서)의 증가로 측정한다.

0.1M 아세트산나트륨 버퍼중 1%(w/v) 보리 β-글루칸용액 1ml, pH 5.0(또는 상이한 pH 값에서) ; 적절히 희석된 효소용액 1ml 를 함유하는 용액을 50℃ 에서 10 분간 인큐베이션시킨다. 효소반응을 2ml 의 DNS 용액 (증류수중의 1%(w/v) 3,5-디니트로살리실산, 1.6%(w/v) 수산화나트륨, 30%(w/v) 칼륨 나트륨(+)-타르트레이트) 을 첨가하여 중지시킨다. 용액을 혼합하여 최소 95℃ 에서 5 분간 비등수조에 넣은후 25℃ 로 냉각시킨다. 10ml 의 증류수를 상기용액에 넣고 2cm 패스길이의 유리셀을 이용하여 540nm 에서 흡광도를 측정한다.

관찰된 효소반응 흡광도를 DNS 용액을 효소용액전 혼합물에 첨가하는 반응을 실시하여 비특이적 흡광도에 대해 수정한다. 1 유니트의 엔도-1,3-(4)-β-글루카나아제 활성은 검정 (50℃ 및 pH5.0 또는 다른 pH) 의 조건하 1 μmole 글로코오스 당량.min^-1을 생성시키는 효소의 양으로 정의한다.

1.5 아조 밸리 β-글루칸 법에 의한 엔도-1.3(4)-β-글루카나아제

엔도-1,3(4)-β글루카나아제에 대한 활성 분석은 크로모포어를 가진 밸리-베타-글루칸(아조-밸리 β-글루칸)의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물 즉, 에탄올 침전 후 용해되는 올리고머는 590 nm 에서의 흡광도 증가로 알 수 있다.

아조 밸리 β-글루칸 기질(바로 사용할 수 있는 형태) 0.5 ml 과 희석된 효소용액 (0.01M 아세트산나트륨 완충용액, PH 4.6 내 0.15에서 0.60 단위/ml 함유) 0.2 ml 함유 용액을 30 ℃에서 20분간 정확히 인큐베이션시켰다. 효소반응은 침전용액 2.5 ml 을 가하여 정지시켰다. 이 때 침전용액은 18.1 g 아세트산나트륨와 3.0 g 아연을 함유하는데 글래쓰 증류수 300 ml 에서 혼합되었으며, 1 볼륨플라스크에 옮겨서 96% V/V 에탄올로 부피를 맞추었다. 이 용액은 혼합후 10분간 실온에서 방치하였다. 이 후 원심분리용 튜브에 옮긴 후 벤취톱 원심분리기에서 10 분간 1000 g 에서 원심분리하였다. 상층의 흡광도는 1 cm 패스 길이 유리관내에서 590 nm 로 측정되었다.

효소반응의 관측값은 비 특이적 흡광을 고려하기 위해 혼합물에 효소용액을 가하기 전에 침전용액을 가하여 반응시킴으로써 교정하였다. 엔도-1.3(4)-β-글루카나아제 활성 1 단위은 주어진 분석조건하( 30 ℃와 pH4.6 )에서 표준기질을 사용할 때 그 기질을 가수분해하여 590nm에서 0.820 단위의 흡광도를 나타낼 수 있는 효소의 양이다.

1.6 DNS 라미나린법에 의한 라미나리나제(엔도-1.3(4)-β-글루카나아제)

라미나리나제(엔도-1.3(4)-β-글루카나아제) 활성에 대한 분석은 라미나린, β-1.3-글루칸 내 글라이코시드 결합의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물 즉 β-1,3-글루칸 올리고당은 환원값의 증가(포도당으로서)로 알 수 있다.

0.1M 아세트산나트륨 완충용액,pH 5.0내의 1%(W/V)라미나린 용액1 ml과 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 10분간 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 효소반응은 DNS 용액(증류수 내 1%(W/V)3,5-디니트로살리실릭산, 1.6%(W/V)수산화나트륨, 30%(W/V)칼륨나트륨(+)-타트레이트) 2ml을 첨가하여 정지시켰다. 이 용액을 혼합하여 비등수조, 최소 95℃에서 5분간 두었으며 이후 25℃에서 식혔다. 증류수 10ml을 그 용액에 첨가했으며 2 cm 패스길이 유리관을 이용 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 마찬가지 방법으로 DNS용액으로 처리한 0.00-0.04%(W/V) 포도당용액 2ml에 대한 표준커브와 비교하여 1 μ moles 환원당(포도당으로서)으로 전환하였다. 효소반응의 관측값은 비 특이적 흡광을 고려하기 위해 혼합물에 효소용액을 가하기 전에 DNS용액을 가하여 반응시킴으로써 교정하였다. 라미나제 활성 1단위은 분석조건(50℃와 pH 5.0)하에서 1 μ mole 포도당 등량/min을 산출하는 효소의 양으로 정의한다.

1.7 DNS 버취우드 자일란 법에 의한 엔도-1,4-β-자일라나제

엔도-1,4-β-자일라나제 활성에 대한 분석은 버취우드 자일란 즉 β-1,4-자일란 내 자일로시딕 결합의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물, 베타-1,4-자일란 올리고당은 환원값의 증가(자일로스로서) 알 수 있다.

0.1M 아세트산나트륨 완충용액,pH 5.0 (또는 다른 pH값 하에서)내의 1%(W/V)버취우드 자일란 용액 1 ml과 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 10분간 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 효소반응은 DNS 용액(증류수 내 1%(W/V)3,5-디니트로살리실릭산, 1.6%(W/V)수산화나트륨, 30%(W/V)칼륨 나트륨(+)-타트레이트) 2ml을 첨가하여 정지시켰다. 이 용액을 혼합하여 비등수조, 최소 95℃에서 5분간 두었으며 이후 25℃까지 식혔다. 증류수 10ml을 그 용액에 첨가했으며 2 cm 패스 길이 유리관을 이용 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 마찬가지 방법으로 DNS용액으로 처리한 0.00-0.03%(W/V) 자일로스용액 2ml에 대한 표준커브와 비교하여 μ moles 환원당(자일로즈으로서)으로 전환하였다.

효소반응의 관측값은 비 특이적 흡광을 고려하기 위해 혼합물에 효소용액을 가하기 전에 DNS용액을 가하여 반응시킴으로써 교정하였다. 엔도-1,4-β-자일라나제 활성 1단위은 분석조건(50℃와 pH 5.0또는 다른 pH)하에서 1 μ mole 자일로스 등량/min을 산출하는 효소의 양으로 정의한다.

1.8 DNS 밀 아라비노자일란 법에 의한 엔도-1,4-β-자일라나제

엔도-1,4-β-자일라나제 활성에 대한 분석은 밀 아라비노자일란 즉 아라비노즈로 치환된 β-1,4-자일란 내 자일로시딕 결합의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물, 아라비노-β-1,4-자일란 올리고당은 환원값의 증가(자일로스로서)로 알 수 있다.

0.1M 아세트산나트륨 완충용액,pH 5.0 (또는 다른 pH값 하에서)내의 1%(W/V)밀 아라비노자일란 용액 1 ml과 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 10분간 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 효소반응은 DNS 용액(증류수 내 1%(W/V)3,5-디니트로살리실릭산, 1.6%(W/V)수산화나트륨, 30%(W/V)포타슘소듐(+)-타트레이트) 2ml을 첨가하여 정지시켰다. 이 용액을 혼합하여 비등수조, 최소 95C℃에서 5분간 두었으며 이후 25℃까지 식혔다. 증류수 10ml을 그 용액에 첨가했으며 2 cm 패스 길이 유리관을 이용 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

1.9 비스코메트릭 밀 아라비녹실란 법에 의한 엔도-1,4-β-자일라나제

엔도-1,4-β-자일라나제 활성에 대한 분석은 표준 밀 아라비노자일란 용액의 효소적 가수분해에 기초하고 있으며 시간에 대한 상대점성도의 감소로 활성을 결정할 수 있다.

0.1M 아세트산나트륨 완충용액,pH 5.5 (또는 다른 pH값 하에서)내의 1%(W/V)밀 아라비노자일란 용액 1 ml과 증류수 3 ml 및 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 하케(HaaKe) 미세점도계 (0.1-0.2 mPa.s로 규정된 금구 사용)에 주입한 후 30℃에서 15-20분 주기로 매 30초간 구 하강 시간(T_시험)을 측정하였다(규정된 하강길이를 ms단위로). 평균 구 하강시간은 물(5 ml증류수)에 대해서, 기질(0.1M 아세트산나트륨 완충용액,pH 5.5내의 1%(W/V)밀 아라비노자일란 용액 1 ml과 증류수 4 ml)에 대해서 각각 T_물와 T_기질로 측정하였다. 비교치(controls)는 마찬가지 방법으로 측정하였다. 각각의 T_시험값에 대해 상대 유동성은 다음과 같이 계산할 수 있다.

T_기질- T_물

F r = ----------------------------

T_시험- T_물

시간(각 T_시험에 대한 측정이 이루어지는 경과시간)에 대한 F r 도안에서 기울기는 분당 상대유동성의 변화(ㅿF r/ min)로 계산되며 효소농도에 비례한다. 엔도-1,4-β-자일라나제 활성 1단위은 분석조건(30℃와 pH 5.5또는 다른 pH)하에서 기질을 가수분해하여 용액의 점성도를 감소시킴으로써 상대유동성 1(무차원 단위)/min의 변화를 가져오는 효소의 양으로 정의한다.

1.10 p-니트로페닐 β-D-자일로피라노시드 법에 의한β -자일로사이다제

β-자일로시다제 활성에 대한 분석은 p-니트로페닐 β-D-자일로피라노시드의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물, p-니트로페놀은 색도변화로 알 수 있다.

증류수 내 O.1%(w/v)p -니트로페닐 β-D-자일로피라노시드 1 ml, 증류수 1 ml, 0.2M 아세트산나트륨 완충용액 1 ml-pH 5.0 과 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 30분간 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 효소반응은 0.4M 글라이신 용액 4ml을 첨가하여 정지시켰다. 이 용액을 혼합하여 20℃로 식혔다. 1 cm 패스 길이 유리관을 이용 400nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 이러한 조건하에서의 p-니트로페놀의 몰익스텐션계수와 비교함으로써 μ moles p-니트로페놀로 전환하였다.

효소반응의 관측흡광도값은 비 특이적 흡광을 고려하기 위해 혼합물에 효소용액을 가하기 전에 글라이신용액을 가하여 반응시킴으로써 교정하였다. 자일로시다제 활성 1단위은 분석조건(50℃와 pH 5.0)하에서 p-니트로페닐-D-자일로피라노시드로부터 분당 1 μmole p-니트로페놀을 산출하는 효소의 양으로 정의한다.

1.11 p-니트로페닐-L-아라비노퓨라노시드 법에 의한-N-아라비노퓨라노시다제

-N-아라비노퓨라노시다제(아라비노퓨라노시다제)에 대한 분석은 p-니트로페닐-L-아라비노퓨라노시드의 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 반응산물, p-니트로페놀은 색도변화로 알 수 있다.

증류수 내 O.1%(w/v)p-니트로페닐-L-아라비노퓨라노시드 1 ml, 증류수 1 ml, 0.2M 아세트산나트륨 완충용액 1 ml-pH 5.0 과 적절히 희석된 효소용액 1ml을 함유하는 용액을 30분간 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 효소반응은 0.4M 글라이신 용액 4 ml을 첨가하여 정지시켰다. 이 용액을 혼합하여 20℃로 식혔다. 1 cm 패스 랭쓰 유리관을 이용 400nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 이러한 조건하에서의 P-니트로페놀의 몰익스텐션계수와 비교함으로써 micro moles P-니트로페놀로 전환하였다.

효소반응의 관측흡광도값은 비 특이적 흡광을 고려하기 위해 혼합물에 효소용액을 가하기 전에 글리신용액을 가하여 반응시킴으로써 교정하였다. 아라비노퓨라노시다제 활성 1 단위은 분석조건(50℃와 pH 5.0)하에서 p-니트로페닐-L-아라비노퓨라노시드로부터 분당 1 μ mole p-니트로페놀을 산출하는 효소의 양으로 정의한다.

1.12 팩스(FAXX) 법에 의한 페룰로일 에스테라아제

페룰로일 에스테라아제( 페룰 산 에스테라아제 )의 분석은 O -[5-O -(트랜스-페룰로일)--L-아라비노퓨라노실]-(13)-O -β-D-자일로피라노실-(14)-D-자일로피라노즈(FAXX)에 대한 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 팩스(FAXX)는 밀의 겨를 효소로 가수분해처리하여 얻는데, 정제후 NMR로 특성분석을 할 수 있다. 팩스(FAXX)가수분해는 분광학적으로 그 정도를 측정할 수 있다.

효소반응은 1 cm 패스길이 유리관을 이용, 37℃,pH6.0의 0.1M MOPS 완충용액내 0.050mM 팩스(FAXX) 함유용액속에서 325 nm하에 진행한다.

팩스(FAXX)에 대한 페룰로일 에스테라아제 활성 1 유니트는 분석조건(37C와 pH 6.0)하에서 분당 1 micro mole기질을 효소산물로 전환하는 효소의 양으로 정의한다.

1.13 Ara₂F 법에 의한 페룰로일 에스테라아제

페룰로일 에스테라아제( 페룰 산 에스테라아제 )의 분석은 Ara₂F (1,2위치에 아라비노즈가 연결된 페룰 산)에 대한 효소적 가수분해에 기초하고 있다. Ara₂F는 사탕무우펄프를 효소로 가수분해처리하여 얻는데, 정제후 NMR로 특성분석을 할 수 있다. Ara₂F가수분해는 분광학적으로 그 정도를 측정할 수 있다.

효소반응은 1 cm 패스 길이 유리관을 이용, 37℃,pH6.0의 0.1M MOPS 완충용액내 0.050mM Ara₂F 함유용액속에서 325 nm하에 진행한다.

Ara₂F에 대한 페룰로일 에스테라아제 활성 1단위은 분석조건(37℃와 pH 6.0)하에서 분당 1 ℃ mole기질을 효소산물로 전환하는 효소의 양으로 정의한다.

1.14 메틸에스테르-메틸페룰 산(MFA), 메틸카페 산(MCA), 메틸시나프 산(MSA),메틸 p- 쿠마르 산( MpCA )-들의 가수분해법에 의한 페룰로일 에스테라아제

페룰로일 에스테라아제( 페룰 산 에스테라아제 )의 분석은 페룰 산(MFA), 카페 산(MCA), 시나프 산(MSA), p- 쿠마르 산( MpCA )의 메틸 에스테르들에 대한 효소적 가수분해에 기초하고 있다. 메틸 에스테르 가수분해는 37℃,pH6.0의 0.1M MOPS 완충용액내에서 그 정도를 측정할 수 있다. 분석은 두 가지 다른 기술에 기초하고 있다.

분광학적 방법을 쓸 경우 메틸 에스테르 기질 농도는 0.10 mM 이며 에스테르 가수분해는 1 cm 패스길이 유리관을 이용, 325 nm에서 시행한다. 이 방법에서는 초기 기질 농도가 제한된다.

HPLC 방법을 쓸 경우 메틸 에스테르 기질 농도는 1.0 mM 이며 에스테르 가수분해가 시행될 때 10-30분 간격으로 HPLC로 유리산의 방출을 측정하는 것이다. 이 방법에서는 기질농도에 제한이 없으나 측정된 활성이 분광학적 방법에서보다 상당히 높게 나온다.

페룰로일 에스테라아제 활성 1단위은 분석조건(37℃와 pH 6.0)하에서 분당 1 μ mole기질을 효소산물로 전환하는 효소의 양으로 정의한다.

1.15 수정된 브래드포드 쿠마씨블루 결합 단백질 분석에의한 단백질 농도

단백질 농도의 분석은 수정된 브래드포드 쿠마씨블루 결합 단백질 분석에 기초하고 있는데 이는 1 cm 광로유리관을 사용하여 595 nm에서 분광광도계로 측정하는 브릴리언트 블루 지 (쿠마씨 블루)를 이용하는 것이다. 이 방법( 시그마 B 6916 )은 소의 혈청 알부민( 시그마 P 094 )을 이용하여 표준화할 수 있다.

1.16 등전점 전기영동법( Isoelectric focusing )에 의한 등전점(Isoelectric point)

단백질의 등전점은 미리 조제된 수직의 5 % 폴리아크릴아미드 겔, 예컨대 (상표명 NOVEX) 을 이용하여, NOVEX XCell ll^TMMini-Cell 에서, pH 3 - 10 (pl 수행범위 3.5-8.5) 또는 pH 3 내지 7 (pl 수행 범위 3.0 - 6.5) 의 겔을 이용하여 표준방법으로 측정한다. NOVEX(상표명) 캐쏘드, 아노드 및, pH 3-10 또는 pH 3 - 7 의 IEF 샘플 버퍼가 사용된다. 등정 포커싱, 고정, 쿠마시 R-250 블루 염료에 의한 염색, 및 탈색용 NOVEX 표준 프로토콜을 이용한다.

1.17 SDS-PAGE(나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)

단백질의 분석 분리 및 분자량 측정은 표준 SDS-PAGE 방법을 실시한다. 프리캐스트(pre-cast) NOVEX(등록상표)NuPAGE^TM겔(권장되는 실행 버퍼 NOVEX(등록상표) 를 갖는 NuPAGE^TMBis-Tris 겔 또는 (NuPAGE^TMTris-Acetate 겔) 는 NOVEX(등록상표)XCell II^TMMini-Cell 에서 사용한다. NOVEX(등록상표) 시료 제제 및 실행 버퍼, 및 분자량 표준을 사용한다. SDS PAGE 에 대한 NOVEX(등록상표) 표준 프로토콜, 쿠마시 R-250 블루 염료에 의한 고정, 염색 및 탈염이 이용된다.

2.효소혼합물에 대한 결과

2.1 최적 pH

2.1.1 엔도-1,3(4)--글루카나아제

페니실리윰 퍼니쿨로섬( Penicillium funiculosum )으로부터 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제의 분석은 DNS 밸리 β-글루칸 법을 이용하여 50℃ 표준조건하에서 시행되었다. 효소활성은 pH 3.0과 pH 7.0 사이에서 측정되었다. 효소활성의 최적 pH는 pH 4.0 - 5.0이다.

pH	활 성
pH	( IU/ml )	( % )
3	325	42
4	761	98
5	775	100
6	507	66
7	152	20

2.1.2 엔도-1,4-β-자일라나제 활성

페니실리윰 퍼니쿨로섬( Penicillium funiculosum )으로부터 엔도-1,4-β-자일라나제의 분석은 DNS 버취우드 자일란 법을 이용하여 50℃ 표준조건하에서 시행되었다.

pH	활 성
pH	( IU/ml )	( % )
2.0	3559	37
2.6	6700	70
3.0	8411	88
3.0	8113	85
3.5	9582	100
4.0	8523	89
4.0	8510	89
5.0	5544	58
5.5	3522	37
6.0	2190	23
7.0	1103	12

2.2 최적 온도

2.2.1 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 활성

페니실리윰 퍼니쿨로섬( Penicillium funiculosum )으로부터 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제의 분석은 pH 5.0 ( 이 효소의 최적 pH ) 표준조건하에서 DNS 밸리 β-글루칸 법을 이용하여 시행되었다. 효소활성은 30과 70℃사이에서 측정되었다. 최적온도는 50과 60℃사이에 있으며 최대활성은 60℃에서 측정된다.

온도와 관련 구체적 결과는 아래 표와 같다.

온 도	활 성
온 도	( IU/ml )	( % )
30	247	32
40	541	70
50	775	100
60	1082	140
70	774	96

2.2.2 엔도-1,4-β-자일라나제 활성

페니실리윰 퍼니쿨로섬( Penicillium funiculosum )으로부터 엔도-1,4-β-자일라나제의 분석은 DNS 버취우드 자일란 법을 이용하여 pH 5.5와 pH 3.5 표준조건하에서 시행되었다. 효소활성은 30과 70℃사이에서 측정되었다. 최적온도는 50과 60℃사이에 있으며 최대활성은 pH 5.5인 경우 50℃에서, pH 3.5인 경우 60℃에서 측정된다. 온도와 관련 구체적 결과는 아래 표와 같다.

온 도	활 성 ( pH 5.5 )	활 성 ( pH 3.5 )
( ℃ )	( IU/ml )	( % )	( IU/ml )	( % )
30	2492	41	4334	23
40	4042	66	8128	42
50	6107	100	18251	95
60	4602	75	19155	100
70	3851	63	12730	66

페니실리윰 퍼니쿨로섬( Penicillium funiculosum )으로부터 산출되는 효소들은 고단위의 셀룰라제,엔도-1,3(4)-β-글루카나아제 및 다른 글리카날라이틱 활성을 가진다. 더우기 이 효소들은 고단위의 엔도-1,4-β-자일라나제와 자일라나제 부수효소활성을 아울러 가진 것으로 나타난다. 이러한 넓은 작용범위의 헤미셀룰로라이틱 효소는 이 미생물로부터 얻는 효소의 특징이라 할 수 있다.

각 효소 활성의 측정치는 그 시료에 있어서의 주 활성에 대한 비율로서 나타낼 수 있다. 얻은 결과예를 표 A에서 보여주고 있다. 하기의 비율은 상이한 발효조에서 얻는 시료에 따라 가변적일 수 있다.

표 A : 여러 관련 기질에 대한 상대적 활성

시험에 사용한 방법	페니실리윰 퍼니쿨로섬과의 결과
셀룰라제(DNS CMS 법, pH 5.0)[1.1]	3.14
셀로비오하이드롤라제(p-니트로페닐-D-셀로비오피라노시드 법,pH5.0)[1.2]	0.022
-글루코시다제(p-니트로페닐-D-글루코비오피라노시드 법,pH5.0)[1.3]	0.157

엔도-1,3(4)--글루카나아제(DNS 밸리-글루칸 법,pH5.0)[1.4]	7.23
엔도-1,3(4)--글루카나아제(아조- 밸리-글루칸 법,pH4.6)[1.5]	1+/-
라미나리나제( DNS라미나린법,pH5.0)[1.6]	0.30
엔도-1,4--자일라나제(DNS 버취우드법, pH 3.5)[1.7]	9.16
엔도-1,4--자일라나제(DNS 밀 아라비노자일란 법, pH 3.5)[1.8]	8.67
엔도-1,4--자일라나제( 비스코메트릭 밀 아라비녹실란법, pH 5.5)[1.9]	9.80
-자일로시다제(p-니트로페닐-D-자일로비오피라노시드 법)[1.10]	0.0047

α-N-아라비노푸라노시다제(p-니트로페닐 α-L-아라비노푸라노시드법) [1.11]	0.0017
페룰로일 에스테라아제 (FAXX 법) [1.12]	0.000254
페룰로일 에스테라아제 (Ara₂F 법) [1.13]	0.000349
페룰로일 에스테라아제 (MFA 분광광도법) [1.14]	0.000135
페룰로일 에스테라아제 (MCA 분광광도법) [1.14]	0.000174
페룰로일 에스테라아제 (MSA 분광광도법) [1.14]	0.000049
페룰로일 에스테라아제?I>?/I>테라아제광도법) [1.14]	0.000216

3-효소 혼합물내 성분의 특성

3.1. 정제법

소수성 상호작용 크로마토그래피

여과 및 112.6 mg/ml 단백질 농축으로 발효 매질의 농축후 수득된 제조물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 완충액 (50 mM 포스페이트 완충액, pH 7.0/1.7 M (NH₄)₂SO₄/0.04 % 소듐 아지드) 으로써 1/1 희석하고, HIC 완충액으로 교환한다 (PD-10 칼럼 ; Pharmacia). 일부 (10 ml) 를 PhenylSepharose^TM고성능 HIC 겔 (Pharmacia) 의 칼럼 (10 ×5 cm 직경, 200 ml) 에 적용하고 10 ml/분에서 암모늄 술페이트 ((NH₄)₂SO₄) 농도 (1.7-0.0 M) 의 감소 구배를 이용하여 분리한다. 분획 (10 ml) 을 수집하고 크실라나아제 활성을 분석한다.

HIC 는 크실라나아제 활성의 두개의 주요 피크를 나타낸다. 첫째, 상기 A 는 (NH₄)₂SO₄농도가 약 0.6 M 로 감소될 때 칼럼으로부터 용출되는 반면, 상기 B 는 약 0.25 M NH₄)₂SO₄농도에서 용출된다. 각 주입으로부터 피크 A 및 B 를 포함하는 분획은 공동으로 분리된다. 분획 B 가 총 크실라나아제 활성의 97.2 % 에 해당하는 반면, 분획 A 는 총 크실라나아제 활성의 2.8 % 에 해당한다. 수율은 77 % 였다.

이온-교환 크로마토그래피

HIC 로부터 피크 A 및 B 에 대한 공동의 분획은 NH₄)₂SO₄농도를 원심분리 (30 분간 1000 xg) 한 후 100 % 포화시킴으로써 침전된다. 펠릿을 20 mL Tris-HCl 완충액, pH 8.0/0.04 % 소듐 아지드에 재용해시키고 PD-10 칼럼을 이용하여 동일한 완충액에 슬레이트화한다. 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0/0.04 % 소듐 아지드로써 평형을 맞추기전에 표본 (5 ml) 을 MonoQ^TMHR 10/10 음이온-교환 칼럼 (Pharmacia) 에 적용하고, 동일한 완충액중 염화 나트륨 (NaCl (0-1 M) 의 증가 농도로써 2 m/분에서 용출한다. 분획 (2 ml) 을 수집하고 크실라나아제 활성에 대해 분석한다.

피크 A :

음이온-교환 크로마토그래피에 의해 피크 A 를 분리하여 약 0.3 M NaCl 에서 용출된 크실라나아제 활성의 단일 피크를 수득한다. 가장 활성인 분획은 SDS-PAGE (소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 에 의해 모아져서 분석된다. 이것은 분자량 48 kDa 의 단일 주요 띠를 나타낸다. IEF (등전점 전기 영동법) 후 크실라나아제 활성이 회복되는 것은 상기 주요 쿠마시(coomassie)-착색 띠가 크실라나아제라는 것에의해 확인되었다.

피크 B :

음이온-교환 크로마토그래피에 의해 피크 B 를 분리하여 공극 (자유로운 물질 ; 피크 B-I) 및 이외 0.1 M NaCl (피크 B-II) 에서 용출된 것중 하나인, 크실라나아제 활성의 두개의 주요 피크를 수득한다. 또한 0.13 M 및 0.19 M NaCl 에서 용출하는 두개의 약한 피크가 있다. 각 피크에 해당하는 활성 분획을 모으고 SDS-PAGE 에 의해 분석했지만, 표본중 어느 것도 순수하지 않았다.

겔 여과 크로마토그래피

B-I 및 B-II 를 포함하는 수집된 분획을 동결 건조시키고, 물에 재용해시켜 슬레이트화 (PD-10 칼럼이용) 하였다. 표본 (0.2 ml) 을 Superdex^TM75 HR 칼럼 (Pharmacia) 에 적용하고 20 mM 비스-트리스 완충액, pH 6.0/0.2 M NaCl/0.04 % 소듐 아지드로써 0.4 ml/분에서 용출하였다. 분획 (0.4 ml) 을 수집하고 크실라나아제 활성에 대해 분석하였다.

3.2. 크실라나아제의 특성

3.2.1. 등전점 전기 영동법에 의한 등전점

단백질의 등전점은 pH 3-10 및 pH 3-7 용 NOVEX (등록상표) 로부터 예비주조 버티칼 5 % 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 표준법에 의해 측정한다. 등전점 전기 영동법, 고정, 코마시 R-250 블루 염료로써 착색, 탈색용 NOVEX (등록상표) 캐쏘드, 애노드 및 IEF 표준 완충액 및 표준 프로토콜을 사용한다.

크실라나아제 A 에 대해, 하기 MonoQ 표본을 사용한다. 크실라나아제 B-I 및 B-II 에 대해, 하기 HIC 표본, 크실라나아제 B 를 사용한다. 각각 A 및 B 에 대해, 작은 표본 (10 ㎕) 을 단일 웰에 부가하고 큰 표본 (50 ㎕) 을 삼중 웰에 부가하였다. 표본을 포커싱한 후, 겔을 반으로 절단하여 절반은 두개의 작은 표본 (A+B) 및 분자량 표시기 (상기 반은 쿠마시로써 착색된다) 를 함유하는 반면, 다른절반은 두개의 큰 표본을 함유한다. 큰 표본을 함유하는 겔 절반을 절단하여 두개의 표본 레인을 분리하고, 이어서 각 레인을 2 mm 절편으로 분획화하였다. 가가 2 mm 절편을 하룻밤동안 100 mM MOPS 완충액, pH 6.0/0.04 % 소듐 아지드중에 별도로 담가두었다. 분획을 크실라나아제 활성에 대해 분석하였다.

크실라나아제 표본 A 에 대해, 착색된 IEF 겔은 pl 3.55 표시기 의 단일 주요 띠 및 몇몇 약한 얼룩띠를 나타낸다. 크실라나아제 활성은 크실라나아제 주요 띠임을 확인하는, 상기 띠에 해당하는 분획에서만 나타난다.

크실라나아제 표본 B 에 대해, 착색된 IEF 겔은 pl 값의 범위에 걸쳐 수개의 띠를 나타낸다. 크실라나아제 활성은 미착색된 겔의 두개의 별개의 분획내에 발생하고 pl 4.2 및 4.8 의 단백질에 해당한다.

3.2.2. SDS-PAGE 에 의한 분자량

HIC 로부터 피크 B 중 크실라나아제의 분자량을 확인하기위해, IEF 겔로부터 용출된 크실라나아제 활성을 갖는 분획을 슬레이트화하고, 동결-건조시키고, SDS-PAGE 에 의해 분리하였다. 변성 PAGE 를 환원제로서 표본 완충액에 포함된 디티오트레이톨 (DTT 50 mM) 로써 10 % 트리스-글리신 겔 (NOVEX (등록상표)) 를 사용하여 수행하였다.

착색된 겔은 두개의 크실라나아제 모두 순수하며, 크실라나아제 B-I 및 크실라나아제 B-II 각각에 대해 36 kDa 및 15 kDa 의 분자량을 갖는다.

모든 세개의 정제된 크실라나아제를 SDS-PGE 분석을 수행한다 : 음이온 교환 크로마토그래피 후 크실라나아제 A 분획, 겔 여과 크로마토그래피 후 크실라나아제 B-I 및 B-II 분획. 크시라나제 A 는 분자량 48 kDa 의 단일 띠를 나타낸다. 크실라나아제 B-I 는 코마시 착색 후 하나의 주요 띠 및 약한 네개의 띠를 나타낸다. 주요 띠는 그것이 분자량 36 kDa 이므로, 크실라나아제로서 확인된다. 순도는 90 % 로 평가된다. 크실라나아제 B-II 는 분자량 15 kDa 의 주요 띠 및 2-3 개의 약한 띠를 나타낸다. 상기 크실라나아제는 대략 95 % 순수하다.

표분	M.W. (kDa)	P.I.
크실라나아제 A	48	3.55
크실라나아제 B-I	36	4.20
크실라나아제 B-II	15	4.80

3.2.3 효소 활성

효소 활성 측정용 시험은 전술되었다.

3.2.3.1 크실라나아제 A 의 분석

[단백질] 0.4 (mg/ml)

효소 분석법	pH	효소 활성
		(u/ml)	(u/mg 단백질)
셀룰라제(DNS CMC 법) [1.1]	5.0	<1.0	적용불가
셀로비오히드롤라제(p-니트로페닐 β-D-셀로비오피라노시드법) [1.2]	5.0	<0.1	적용불가
엔도-1,3(4)-β-글루카나아제(DNS 베일리 β-글루칸법) [1.4]	5.0	<1.0	적용불가
라미나리나제(DNS 라미나린법) [1.6]	5.0	미측정	적용불가
엔도-1,4-β-크실라나아제(DNS 버취우드 크실란법) [1.7]	5.5	140	350
엔도-1,4-β-크실라나아제(DNS 버취우드 크실란법) [1.7]	3.5	158	395
엔도-1,4-β-크실라나아제(DNS 밀 아라비노크실란법) [1.8]	5.5	152	380
엔도-1,4-β-크실라나아제(DNS 밀 아라비노크실란법) [1.8]	3.5	171	429
엔도-1,4-β-크실라나아제(비스코메트릭 밀 아라비노크실란법) [1.9]	5.5	456	1140

버취우드 크실란 대 pH 에 대한 크실라나아제 활성

pH	효소 활성
pH	(IU/mg 단백질)	(최대 활성 %)
2.00	294	73
3.00	353	87
3.50	385	95
4.00	405	100
5.00	345	85
5.50	340	84
6.00	302	75
7.00	212	52

3.2.3.2 크실라나아제 B-I 의 분석

[단백질] 0.096 (mg/ml)

효소 분석법	pH	효소 활성
		(u/ml)	(u/mg 단백질)
셀룰라제(DNS CMC 법) [1.1]	5.0	26.5	276
셀로비오히드롤라제(p-니트로페닐 β-D-셀로비오피라노시드법) [1.2]	5.0	0.541	5.6
엔도-1,3(4)-β-글루카나아제(DNS 베일리 β-글루칸법) [1.4]	5.0	73.8	769
라미나리나제(DNS 라미나린법) [1.6]	5.0	<0.1	적용불가

(DNS 라미나린 방법)[1.6]
엔도-1,4-β-자일라나제(DNS 버취우드 자일란 방법)[1.7]	5.5	51.3	534
엔도-1,4-β-자일라나제(DNS 버취우드 자일란 방법)[1.7]	3.5	83.6	871
엔도-1,4-β-자일라나제(DNS 밀 아라비노자일란 방법)[1.8]	5.5	93.2	971
엔도-1,4-β-자일라나제(DNS 밀 아라비노자일란 방법)[1.8]	3.5	143.8	1498
엔도-1,4-β-자일라나제(점도 밀 아라비노자일란 방법)[1.9]	5.5	147	1531

nd 측정되지 않음 n/a 적용할수 없음

버취우드 자일란내 자일라네스 활성 대 pH

pH	효소 활성
pH	(IU/mg 단백질)	(최대 활성의 %)
2.00	610	70
3.00	755	87
3.50	871	100
4.00	802	92
5.00	567	65
5.50	534	61
6.00	481	55
7.00	404	46

3.2.3.3 자일라나제 BII의 분석

[단백질] 0.165(mg/ml)

버취우드(FAE-V 또는 FAE-1) 아미노산 서열

E. 동물에 먹이기 위한 효소 혼합물의 용도

실시예 1 : 브로일러에서의 밀-보리 혼합의 에너지값 (ANE_N) 에 대한 페니실리윰 퍼니쿨로섬 효능에 의해 제조된 효소 제제의 평가

50 % 밀 및 22 % 보리를 함유한 규정식의 질소 균형 (ANE_N) 에 대해 보정된 Apparent Metabolizable Energy 에 대한 효소 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1) 의 효능을 증명하는 것이 목적이다.

산후 18 내지 21 일 사이의 총 배설물 수집 및 임의로 피딩으로, European Reference Method (Bourdillon et al., 1990)를 이용하여, 대조군 및 효소 제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1) 에 대해 실험한다.

a. 사용 물질 및 방법

새 : 교배(breed) 및 교배 조건

생후 1일 수컷 Ross 브로일러를 산후 12 일까지 집합 배터리 우리에서 기른다. 그것들에게 표준 출발 규정식 (starter diet)을 먹이고, 12 일이 되면, 새의 중량을 측정하여, 처리에 따른 10 개의 각 우리에 동등하게 분배한 후, 적응 시간 (최소 5일) 동안 실험용 규정식을 먹인다.

표준 온도 및 습도 프로그램을 이용한다. 조명 프로그램을 시험 종료까지, 23 시간 동안 명상태(빛) 및 1 시간 동안 암상태를 유지시킨다.

피드 : 새에게 생후 1 일부터 12 일까지 출발 규정식을 먹인 후, 실험적 피드를 먹인다.

실험적 규정식

50 % 밀 및 22 % 보리를 함유한 피드 (표 1.1). 효소 제제를 20 kg 의 크럼블(crumble) 상에 분무한다.

인-피드 (in-feed) 효소 회복을 점도측정법으로 측정한다 (Sabatier and Fish, 1996).

대사 에너지 측정

D 17, 새들을 하룻밤 동안 단식시킨다 ;

D 18, 새의 중량을 측정하고, 수집 트레이를 청소한다;

D 19, 배설물을 수집, 동결시킨다;

D 20, 배설물을 수집, 동결하여, 하룻밤 동안 단식시킨다;

D 21, 배설물을 수집, 동결하여, 새의 중량을 측정하여, 다시 먹인다.

이어서, 배설물을 동결 건조하여, 피드로서 분쇄한다 (1 mm, Retsch 분쇄기). 피드 및 배설물의 총에너지를 IKA C5000 단열 열랑측정기로 측정한다. 단백질 (N*6.25, Kjeldahl Z130 법) 및 지질 (Z160 법) 함량을 또한 결정한다. 중량 증가에 있어 18 % 단백질을 이용하여, 질소 균형에 대한 보정을 적용한다.

b. 결과 및 논의

질소 균형에 대해 보정된 외관 대사 에너지 (AME_N)

축산(zootechnical) 성능 및 대사 에너지가 표 1.2 에 나와 있다. 처리 간의 축산 성능에는 차이가 없었다.

성장하는 브로일러에서는, 효소 제제가 50 % 밀 및 22 % 보리-기재의 규정식의 AME_N을 6.2 % 향상시켰다 (+ 204 kcal/kg DM(건조물)).

게다가, 에너지 소화성에서의 변화도가 80 에서 62 kcal.kg DM 로 감소되엇다.

이 높은 향상은, 밀 및 보리의 가수분해된 가용성 비전분 다당류에 대한, 페니실리윰 퍼니쿨로섬에 의해 생성된 모든 활성 (자일라나제 및 β-글루카나아제) 의 이득을 입증한다.

실시예 2 : 밀을 먹인 브로일러에서의 피드 소화성에 대한, 페니실리윰 퍼니쿨로섬에 의해 생성된 효소 제제의 영향

54 % 밀을 함유한 규정식을 먹인 브로일러에서의 외관 대사 에너지 (AME), 단백질 및 지질 소화성에 대한, 페니실리윰 퍼니쿨로섬에 의해 생성된 효소 제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1) 의 영향을 결정하기 위해 시험한다. 분쇄와의 상호작용을 또한 조사한다.

(1) 대조군 1 (54 % 분쇄된 밀)

(2) 대조군 1 + 효소 제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1)

(3) 대조군 2 (30 % 통밀, 24 % 분쇄된 밀)

(4) 대조군 2 + 효소 제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1)

European Reference 법 (ad libitum 피딩 및 생후 18 내지 21 일에서의 총 배설물 수집) (Bourdillon et al., 1990) 에 따름.

a. 사용 물질 및 방법

새 : 교배(breed) 및 교배 조건

생후 1일 수컷 Ross 브로일러를 산후 12 일까지 집합 배터리 우리에서 기른다. 이어서, 그것들을 소화 균형을 위해 각 각 배터리 우리에 옮긴다.

표준 온도 및 습도 프로그램을 이용한다. 조명 프로그램을 생후 8 일까지, 23 시간 동안 명상태(빛) 및 1 시간 동안 암상태를 유지시킨다. 이어서, 동일 건물 내에서 층 시험 운영으로 인해, 15h30 명 상태, 및 8h30 암 상태로 변경한다.

피드 : 새에게 생후 12 일까지 표준 출발 규정식을 먹인 후, 실험적 피딩을 한다.

실험적 규정식

실험적 규정식은 54 % 밀을 함유한다. 특성이 표 2.1 에 나와 있다. 규정식 조성이 표 2.2 에 나와 있다.

외관 대사 에너지 측정

하기 계획에 따라 17 일째 균형을 시작한다 :

D 17, 새들을 하룻밤 동안 단식시킨다 ;

D 18, 새의 중량을 측정하고, 수집 트레이를 청소한다;

D 19, 배설물을 수집, 동결시킨다;

D 20, 배설물을 수집, 동결하여, 하룻밤 동안 단식시킨다;

이어서, 배설물을 동결 건조하여, 피드로서 분쇄한다 (1 mm, Retsch grinder). 피드 및 배설물의 총에너지를 IKA C5000 단열 열랑측정기로 측정한다. 단백질 (N*6.25, Kjeldahl Z130 법 (피드) 및 Z135 법 (배설물)) 및 지질 (Z160 법) 함량을 또한 결정한다.

아미노산 프로파일을 또한 HPLC (Z100 법 (피드) 및 Z080 법(배설물)) 로 수행한다. 피드 및 배설물의 인 함량을 AFNOR법 (NFV18-106)을 이용하여, 측정한다.

b. 결과 및 논의

외관 대사 에너지 (AME)

성장 성능 및 대사 에너지 데이터가 표 2.3 에 나와 있다. 3 일간 측정한, 성능 (중량 증가, 피드 섭취량) 은 처리 간에 다르지 않다. 54 % 분쇄된 밀을 함유하는 대조군 규정식의 AME 는 3173 kcal/kg 이었다. 밀의 총량이 동일한, 단 통밀이 30 % 인 규정식의 대사 에너지는 이론치에 비해 100 kcal/g 이 증가된다. 게다가, 측정된 다른 기준의 표준 편차에 의한 변화도도 또한 통밀로 감소된다.

페니실리윰 퍼니쿨로섬에 의해 생성된 효소 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.kg^-1및 자일라나제의 활성 : 1100 U.kg^-1) 는, 모든 밀이 분쇄될 경우, 54 % 밀-기재의 규정식의 대사 에너지가 +3.4 % (122 kcal/kg DM) 향상되고, 밀의 30 % 가 통밀에 해당하는 경우, +2.7 (101 kcal/kg DM) 향상된다.

영양소의 외관 소화성 (지질, 단백질 및 아미노산)

모든 밀이 분쇄된 경우, 외관 지질 및 단백질 소화성은, 페니실리윰 퍼니쿨로섬에 의해 생성된 효소 제제로써 각기 7 및 2.7 % 증가한다. 통체의 그레인인 밀의 있어서는, 전체 향상된 영양소 소화성으로 인해, 각기 +3 및 +0.6 % 미만이다. 실제로, 통밀을 함유한 대조군 규정식에 있어서의 영양소 소화성은 분쇄된 밀만을 함유하되, 효소 제제로 보충된 실험적 규정식의 경우와 유사하다.

외관 아미노산 소화성에 대한 효소 제제의 영향이 표 2.4 에 나와 있다. 효소 제제로 인한 향상은, 모든 밀이 통밀인 경우, 평균 +2.9 % 에 달하고, 통체의 그레인의 경우에는 +1.1 % 에 달하며, 이로써 외관 단백질의 소화성에 대한 영향을 확인할 수 있다.

외관 인 보유(retention) 및 인 배설(excretion)

외관 인 보유에 대한 효소 제제의 영향이 표 2.5 에 나와 있다. 외관 인 보유는 효소 제제 첨가에 의해 상당히 증가한다 (+8.0 %). 이 증가는 다른 영양소에서 관찰되는 것보다 크다 (AME, 단백질, 지질, 아미노산과 같은 기준에 따라, +2.9 내지 3.5 %). 그러한 증가는 향상된 영양소 소화성 (자일라나제 및 β-글루카나아제의 직접적 영향) 으로 인해 결과된 것일 수 있으나, 밀 피타제(phytase) 의 더욱 나은 활성으로부터도 결과된 것일 수 있다. 비전분 다당류를 가수분해할 경우, 자일라나제 및 β-글루카나아제는 내인성 밀 피타제에 대한 피트산의 접근성을 더욱 증가시킨다.

인의 상기와 같은 더욱 좋은 소화 이용은 인 배설을 감소시킨다 : -8 % (인 g/ 중량 증가 kg)

성장기 영계에 있어서 밀-기재 규정식 (54% 갈은 밀, 또는 24% 갈은 밀 + 30% 통밀)의 AME 에 의한 효소제제의 효과 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 1100 U.㎏^-1).

규정식	1 2 3 4
	갈은 밀 갈은 밀+효소 통밀 통밀+효소
무게(g)사료섭취량(g)일일 사료섭취량(g/일)FCR³(g/g)겉보기 단백질소화력(%)겉보기 지방소화력(%)	172 ±11.8 170 ±13.1 167 ±8.9 165 ±12.0282 ±20.5 272 ±17.2 274 ±15.5 267 ±14.094 ±6.8 91 ±5.7 91 ±5.2 89 ±4.71.64 ±0.05 1.60 ±0.06 1.64 ±0.05 1.63 ±0.0983.8 ±1.08^a85.9 ±1.14^b86.5 ±0.77^bc87.0 ±0.8^c82.2 ±2.5^a88.0 ±2.1^bc86.6 ±2.45^b89.2 ±1.25^c
AME(kcal/kg DM)(kcal/kg)	3577 ±76^a3699 ±85^b3678 ±35^b3779 ±34^c3194 ±67 3303 ±76 3284 ±31 3375 ±31
1: 한가지 방법으로 분산분석. 규정식효과, n=47; a, b: 동일 위첨자로 표시된 값은 p<0.05 를 벗어나지 않음.2: 두가지 방법으로 분산분석. n=47 (54% 갈은 밀, 또는 24% 갈은 밀 + 30% 통밀; enz: 0.2 ℓ/t 크실렌 존재 및 비존재)3: FCR: 사료전환비(g사료/g수득)

성장기 영계에 있어서 54% 밀-기재 규정식에 대한 아미노산의 겉보기 소화력(%)에 의한 효소제제의 효과 (처리군에 대해 혼합 배설물 한가지 샘플).

	갈은 밀	갈은 밀 + 통밀
	테모인(Temoin)	효소제제	테모인(Temoin)	효소제제
질소ASPTHRSERGLUPROGLYALAVALILELEUTYRPHELYSHISARGCYSMETTRP	83.478.674.279.587.984.877.174.678.680.682.180.983.780.681.784.970.887.279.5	85.380.975.382.189.687.179.976.980.883.084.385.085.983.184.987.672.888.582.7	86.482.178.083.080.787.780.778.281.884.085.383.787.183.985.088.176.588.583.3	87.182.779.983.391.488.782.080.183.085.086.484.487.684.886.089.077.089.484.7

성장기 영계 (n=12) 에 있어서의 밀-기재 규정식 (54% 갈은 밀) 의 인(P)의 배출 및 인의 겉보기 보존에 의한 효소제제의 효과.

규정식	1 2	효소 효과
	밀 밀-효소 제제
겉보기 보존 (%)배출된 P (g/조류/3일)P 배출 (g/kg수득)	37.9 + 3.0 40.5 ±2.81.24 ±0.13 1.14 ±0.17.2 ±0.5 6.7 ± 0.5	P0.0470.0710.034

실시예 3 : 성장기 칠면조에서의 밀-기재 규정식의 AME_N에 의한 효소제제의 평가.

이와 같은 측정의 목표는 하기 실험 계획에 따른 밀-기재 규정식의 겉보기 대사에너지(AME)에 의한, 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum, β-글루카나아제의 활성 : 100 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 1100 U.㎏^-1) 에 의해 제조된 효소제제의 효력을 검정하는 것이다:

(1) 대조군 ;

(2) EP 1 : 효소제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 1100 U.㎏^-1) ;

(3) EP 2 : 효소제제 (β-글루카나아제의 활성 : 150 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 1650 U.㎏^-1) ;

를 임의로 공급하고, 33 과 37일 연령사이의 총 배설물을 수집하는 European Reference Method (Bourdillon et al., 1990) 를 사용한다.

a. 재료 및 방법

조류 : 사육 및 사육조건

암컷의 늙은 BUT9 칠면조를 20일 연령이 될 때까지 공동의 새장에서 사육한 다음, 7일 이상의 적응기간 후 소화력의 균형을 위해 개별 새장으로 이동시켰다.

표준온도 및 습도 프로그램을 적용시켰다. 조명 프로그램은 처음 2 주일 동안은 연속적으로 23 시간동안 빛을 가하고, 1 시간동안 어둡게 한 후, 최종적으로는 빛을 가하는 것을 15 시간으로 줄이고, 9 시간 동안 어둡게 하였다.

사료 : 21일 연령부터 표준 완전 개시 규정식을 취하고, 그 후 실험용 사료를 취한다.

실험용 규정식

47% 밀 및 33% 콩가루 (표 3-1). 효소 분무는 대조군의 규정식의 20kg 펠렛 위에서 행하였다.

대사에너지의 측정

D 21에, 조류의 무게를 측정하고, 각 처리군에 대하여 10개의 개별 새장에 동일하게 분배한 후, 실험용 규정식을 공급하였다.

하기의 과정에 따라, D 33 에 그 평가를 개시하였다 :

D 32, 조류를 하룻밤 절식시킴;

D 33, 조류의 무게를 측정하고, 콜렉션트레이를 청결히 함;

D 34 및 D 35, 배설물을 모아서 냉동시킴;

D 36, 배설물을 모아서 냉동시키고, 하룻밤 절식시킴;

D 37, 배설물을 모아서 냉동시키고, 조류의 무게를 측정한 후 다시 사료를 공급함.

배설물을 냉동건조시키고, 사료와 마찬가지로 갈았다 (1 mm, Retsch 분쇄기). 사료 및 배설물의 총 에너지는 IKA C5000 단열 열량계로 측정하였다.

몸무게 (g) 및 그의 질소 용량 (21% 비정제 단백질)을 측정하여, N 밸런스로 AME를 보정하였다.

배설물을 냉동건조시키고, 사료와 마찬가지로 갈았다 (1 mm, Retsch 분쇄기). 사료 및 배설물의 총 에너지는 IKA C5000 단열 열량계로 측정하였다. 또한, 단백질 (N^*6.25, 사료는 키엘달(Kjeldahl) Z130 방법, 배설물은 135 방법) 을 측정하고, 아미노산에 관한 데이터를 얻기 위해 HPLC 측정을 수행하였다 (사료는 Z100 방법, 배설물은 Z080 방법).

b. 결과 및 고찰

겉보기 대사에너지 (AME)

축산 성과 및 대사에너지는 표 3-2에 나타내었다. 처리군들간을 무게를 측정하는 동안 성장 성과에 큰 차이는 없었다.

성장기 칠면조에서 효소제제는 밀-기재 규정식의 AME_N이 EP 1 은 2.2%, EP 2 는 5.4% 로 개선되었다.

이와 같이 크게 개선됨으로서, 성장기 칠면조에서 곡류의 에너지 값을 개선시키기 위해서는 가수분해된 밀의 비녹말 다당류에 대하여 효소제제에 내포된 두가지 활성 (크실렌 및 β-글루카나아제)이 중요하다는 것이 입증되었다.

실험용 규정식의 주성분 및 분석된 특성

조성(5)
밀콩콩가루가축사료지방인산이칼슘탄산칼슘비타민/미네랄	47.55.0033.006.004.002.300.851.30
특성(%)	대조군	EP 1	EP 2
DM비정제 단백질지방	89.026.36.4	89.126.1	88.926.3

성장기 칠면조(32 내지 37일 연령)에서, 밀-기재 규정식의 질소 밸런스로 보정한 겉보기 대사에너지 (AME_N) 에 의한 효소제제의 효과. (평균 ±SD)

	대조군n=2	EP 1n=12	EP 2n=12	확률¹
				효소 효과	도스 효과
총 에너지 (kcal/kg DM)체충 (g)사료섭취 (g/일)사료 전환 비 (g/g)배설물 DM (%)AME_N(kcal/kg DM)²AME_N(kcal/kg)²	4659341 ±23111 ±5.91.63 ±0.0926.1 ±5.53025 ±862700 ±77	4680338 ±36107 ±6.31.60 ±0.1226.5 ±2.23092 ±562759 ±50	4654337.5 ±57103 ±12.11.59 ±0.1725.9 ±4.83191 ±340.037 ±30	NSNSNSNS0.0370.037	NSNSNSNS0.0610.061
¹한가지 방법으로 분산분석. 효소효과, n=60; a, b: 동일 위첨자로 표시된 평균값은 p<0.05를 크게 벗어나지 않음; 도스 효과:0, 0.2, 0.3 l/t.²평균 ±SEM

실시예 4 : 성장기 돼지에서 밀-기재 완전 규정식의 페니실리윰 퍼니쿨로섬 (Penicillium funiculosum) 에 의해 제조된 효소제제의 평가.

이 실험의 목표는 성장기 돼지의 소장에서 에너지 소화에 의한, 밀-기재 규정식에 효소를 추가한 효과를 평가하는 것이다. 효소제제의 정상적인 활성은, 크실라아제의 경우에는 1100 U.㎏^-1, β-글루카나아제의 경우에는 100 U.㎏^-1이다.

a. 재료 및 방법

동물

처리군을 3가지 규정식, 3 단계 및 각 규정식 단계에 대하여 두마리의 돼지로 디자인된 라틴 스퀘어에 따라 테스트하였다. 각 테스트단계를 거친 돼지의 무게에 따라, 고정된 레벨에서 상기 규정식들을 공급하였다.

실험용 규정식

질이 낮은 밀을 기재로 하고, 다른 종류의 사료 성분과 함께 균형을 이룬 규정식을 6마리의 성장기 돼지에게 공급하였다 (표 4-1 참조). 상기 규정식은 각각 하기와 같이 공급하였다 :

1. 비추가 (기본) ;

2. 추가 (1) : 1×레벨의 효소제제 (β-글루카나아제의 활성 : 100 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 1100 U.㎏^-1);

3. 추가 (2) : 2×레벨의 효소제제 (β-글루카나아제의 활성 : 200 U.㎏^-1및 크실라아제의 활성 : 2200 U.㎏^-1);

규정식에 적당히 첨가한 예비혼합물의 제조를 위하여 옥수수 전분으로 규정식을 희석함으로써 규정식을 정확하게 투여하였다.

샘플 수집

RPNA 실험실에서 표준 단계에 따라 매주 48 시간 동안 이레알(ileal) 주스를 수집하였다. ileal 주스 및 시험용 규정식의 샘플은, 소화tjd 에너지 측정을 위해 샌더스(Sanders)에 의한 봄베 열량측정을 함으로써 에너지를 분석하였다. 정제할 수 있는 샘플은 가능한한 추가의 분석을 위해 보관하였다.

통계분석

원 에너지의 소화력은 이레알 주스, 사료 및 사료섭취에 대한 봄베 열량측정의 결과로부터 계산하였다. 분산 분석은 소화력 계산을 위해 수행하였다.

기본 규정식의 성분 및 영양분 내역

	퍼센트 함유량
성분밀보리완두콩어분해바라기 가루(30)리신미네랄 및 비타민합계영양분단백질건조물소화성 에너지(kcal/kg)섬유질Dig. 리신	60.09.711.45.010.00.153.75100.014.984.931505.10.8

b. 결과 및 고찰

돼지의 규정식에 크실라아제를 추가함으로써, 에너지 소화력이 6 퍼센트 이상 증가하였다. 이러한 결과로서 상기 효소가 원 미네랄 세포벽 (특히, 밀) 의 손상 및 소장에서 추가 에너지의 방출을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.

성장기 돼지에 공급된 사료의 에너지 소화력에 의한, 밀-기재 규정식에 효소제제를 추가한 효과.

	비추가 처리	추가 (1)	추가 (2)	p 값
평균 (5)에너지 소화력% 개선	70.10.80	74.50.496.27	75.60.457.87	<0.001

실시예 5 : 반추 동물에서 짚, 옥수수 사료, 건초 및 풀 사료 식품의 성과에 의한, 페니실리윰 퍼니쿨로섬(Penicillium funiculosum) 에 의해 제조된 효소제제의 효과.

HFT 테스트 (Hohenheimer Futterwertesten, Menke et al., 1979, 1988) 는 루멘 주스 완충액에서 상기 사료 원료의 발효에 의해 생성된 가스를 통해, 원 미네랄 분해를 측정하는, 시험관 내에서 배양하는 테스트이다.

a. 재료 및 방법

건조되고 분말화된 기질 200 mg를 온도 조절 배양기 (39℃)에서 로터위에 부드럽게 교반되는 시린지(syringes)에서 루멘 쥬스(rumen juice) 10 ㎖ 와 완충액 20 ㎖ 로써 배양한다. 생성된 가스의 부피는 24 시간에 기록된다. 대조( 기질이 없음), 표준 건초 대조군 및 표준 농축물 대조군 (기지의 생성 가스 순부피와 함께)를 사용하여 그 결과를 교정하고 24 시간 생성된 가스의 순부피를 계산한다. 24 시간 생성된 가스의 부피 및 멘케 등(1988 년)에 의하여 제안된 예측식을 사용하여 기질의 에너지값 및 OMD (Organic matter Digestibility)를 계산한다.

루멘 쥬스를 2 마리의 젖이 마른 젖소에서 채집하고, 루멘 켄뉴레이트화하고 오전 8 시 및 오후 7 시에 6 ㎏의 건초 및 2 ㎏의 농축물 (비율 75/25)로 구성된 배합으로 섭취시킨다. 루멘 쥬스 채집은 오전 먹이 섭취시키기 직전에 실행한다. 루멘 쥬스를 필터하여 음식물 입자의 통과를 피하고 엄격한 무산소 환경으로써 유지시킨다.

이러한 시행의 목적은 HFT 배양 15 시간전 사료에 대하여 효소 조제 적용이 미치는 영향을 시험하는 것이다.

효소 조제로 예비 처리: 효소 용액을 사료들, 짚, 옥수수 사료, 건초 및 생풀 사료위에 분무한다. 1 ㎖의 효소 조제를 2 ㎏의 건조 사료위에 분무시킨다. 끝에 있는(약 10 ㎝)에 있는 사료는 샘플의 균질성을 증대시키기 위하여 배제시킨다. 처리후에, 사료를 손으로 혼합하고 분무후 15 시간 동안에 실온에 방치시킨다. HFT 배양은 처리당 1 연속 6 반복의 15 시간 효소 조제 접촉후에 수행한다.

b. 결과 및 검토

24 시간에서의 생성 가스 순부피를 짚, 옥수수 사료, 건초 및 생풀 사료에 대하여 표 5.1에 나타내었다.

예비 처리를 통하여 짚위에 셀룰라아제의 적용은 대조군에 대비하여 가스의 순부피 증대가 18 ％이었다. 옥수수 사료에 대하여, 8 ％ 증대하였고 건초에 대하여 9.5 ％ 증대하였고 생풀에 대하여는 9 ％ 이었다.

OMD 는 예비 처리 전 후에 다른 사료에 대하여 표 5.2에 나타나있다.

OM 소화율(Digestibility)은 대조군에 대비하여 짚, 옥수수 사료, 건초 및 생풀 사료에 대하여 각기 증대되었으며, 짚에 대하여 8.5 ％, 옥수수 사료에 대하여 5 ％, 건초에 대하여 5.4 ％, 생풀 사료에 대하여 5 ％이었다.

효소 조제로 사료(짚, 옥수수 사료, 건초, 생풀 사료)의 15 시간 예비 처리시키면 루멘 기질 배양의 강도와 기질의 OM 소화율를 증대시켰다.

표 5.1 : 24 시간에 생성 가스 순부피

원료	처리	가스 순부피 ( 24 시간에서)	스태트 사인(Stat Sign)
짚	대조군셀룰라아제	2529.5	S(p＜0.05)
옥수수 사료	대조군셀룰라아제	53.757.8	S(p＜0.05)
건초	대조군셀룰라아제	39.543.1	(p＜0.08)
생풀 사료	대조군셀룰라아제	43.747.7	(p＜0.08)

표 5.2 : OMD

원료	처리	OMD	σ	스태트 사인(Stat Sign)
짚	대조군셀룰라아제	47.551.0	0.672.37	S(p＜0.05)
옥수수 사료	대조군셀룰라아제	70.774.2	0.912.19	S(p＜0.05)
건초	대조군셀룰라아제	59.762.9	0.773.27	p＜0.08
생풀 사료	대조군셀룰라아제	70.574.0	0.723.46	p＜0.08

실시예 6: 페니실리윰 퍼니쿨로섬(Penicillium funiculosum)에 의하여 생성된 효소 조제의 밀 또는 보리 섭취 닭의 성능에 대한 영향

이 실험의 목적은 밀 또는 보리 기재의 규정식로 섭취시켜 알낳는 암탉의 생산 파라미터에대한 효소 조제 첨가의 영향을 평가하는 것이었다.

a. 재료 및 방법

실험 설계 : 4 처리 ×8 반복 ×5 케이지(cages) ×3 암탉

처리 : 1. 대조군 1: 60 ％ 밀

2. 대조군 1 ＋ 효소 조제

3. 대조군 2 : 60 ％ 보리

4. 대조군 2 ＋ 효소 조제

동물, 집 및 관리

상기 시도는 Hy-line 스트레인의 480 갈색 암닭에 대하여 시행되었다. 매 반복은, 공통의 먹이를 가지고, 5 우리에 의하여, 즉 15 새의 총 32 반복에 의하여 형성되었다.

두개의 동일한 방에 배분되어, 상기 반복은 프로그램 할 수 있는 조명 및 통풍 시설을 가지고 있다. 조명 프로그램은 17 주된 암닭의 도달되었을 때 하루당 14 시간 조명으로 시작하였고, 30 분씩 매 2 주를 하루에 최대 17 시간의 조명에 까지 증가시킨다.

암닭은 실험 초기에 22 주된 것이었고, 첫 5 개월의 산란 기간 동안에 존속하였다.

규정식 및 먹이

60 ％의 밀 (규정식 1) 및 60 ％의 보리 (규정식 2), 및 10 ％의 해바라기 밀(meal) 기재의 두가지 실험용 규정식이 있었다. 그들의 조성물은 표 6.1에 나타나있다. 곡물 특성은 표 6.2에 나타내었다.

대조군

화학 분석:

먹이 샘플

실험용 먹이의 품질 조절은 건조 물질, 조(천연)단백질, 조지방 및 재(ash)를 분석하여 수행하였다.

크실라나아제(xylanase) 활성도(T-1, T-2) 및 베타-글루카나아제 활성도(T-3, T-4)는 사료 먹이에서 결정되었다.

측정

먹이 소비 및 먹이 효율은 매 4 주 마다 기록되었다. 실험의 초기와 말기에 암닭의 무게를 재었다. 알 생산, 알 무게, 더러운 알 및 불완전한 알의 비율이 매 4 주의 5 기간 동안에 매일 기록되었다. 사망의 원인을 포함하여 사망율이 매일 점검되고 기록되었다.

b. 결과 및 검토

성능 시험

상기 시험 동안에 수득한 생산 파라미터를 표 6.3 내지 6.5에 나타내었다. 처음의 두기간 동안(22 주 내지 30 주) 및 총괄 실험중에 더러운 알의 비율은 처리에 의해 통계상 영향을 받았다 (P＞0.005). 효소가 없는 밀 규정식 섭취 동물은 더로운 알을 더욱 많이 생산했다. 처리들 사이에 통계상 의미있는 차이는 두번째 기간에서 실험의 말기까지에서 산란율(P＞0.05) 및 알무게(P＞0.005)에서 발견되었다. 보리 규정식 섭취 동물은 높은 알산란율을 나타내었고 밀 규정식 섭취 동물보다도 무거운 알을 생산하였다. 효소 조제는 이러한 파라미타를 증대시키는 것처럼 보이지만 0.05 확율 수준으로 주목할 만하지는 않았다.

모든 실험 기간 동안에, 처리 T-3 및 T-4 (보리 규정식)로부터 동물의 먹이 섭취는 밀규정식을 섭취한 동물의 소비보다도, 두가지 규정식의 에너지 수준(보리 규정식은 2600 kcal/kg 인 반면에 밀규정식은 2800 kcal/kg으로 제제되었다) 때문에, 더 높았다. 두가지 형태의 규정식의 상이한 에너지 수준 및 동물의 먹이 소비를 고려할 때, 전 기간에 있어서 모든 동물은 동일한 일일 에너지 소비를 나타내었다.

첫번째 기간 동안에 실험용 규정식의 먹이 효율(먹이g/ 알g으로 표현)은 이 기간 동안에 암닭의 낮은 알산란율 때문에 매우 높았다. 첫 두 기간에서, 밀 처리에대한 먹이 효율은 보리 처리로 수득한 것에 비하여 더욱 좋았으나; 그러나 세번째 기간에서, 가장 높은 알산란율 퍼센티지가 기록되었을때, 두가지 형태의 규정식은 비슷한 효율을 나타내었다. 34 주부터 실험의 끝까지, 보리 규정식은 밀로써 처리할 때 보다 더욱 좋은 먹이 효율을 나타내었다. 효소는 먹이 효율을 증대시키는 경향을 보였다(P＞0.05). 전 기간에서 베타-글루카나아제는 보리 규정식의 먹이 효율을 증대시켰다(P＝0.066).

표 6.4에서는, 효소 조제로 보충한 밀을 섭취시킨 닭은 보충하지 않은 것보다도 더욱 높은 산란율(＋1.5 절대점), 더욱 높은 평균 알 무게(＋0.37 g) 및 더욱 낮은 먹이 전환율(－2.7 ％)을 나타내는 경향이 있음을 보여주고 있다.

표 6.5에서는, 보리 섭취 닭에 효소 조제의 첨가는, 대조군 보리 규정식와 비교하여, 산란율(＋4 ％), 평균 알무게(＋0.7 ％) 및 먹이 전환율(－5.7 ％)을 증대시킨다는 것을 보여주고 있다.

표 6.1: 실험용 산란 규정식의 조성

(*) 먹이 1 ㎏은 다음을 포함한다 : 비타민 A: 8000 UI; 비타민 D3: 1600 UI; 비타민 E:5 ㎎; 비타민 K3: 2㎎; 비타민 B1: 1.5 ㎎; 비타민 B2: 4 ㎎;비타민 B6: 3 ㎎; 비타민 B12: 11.8 ㎍; 엽산: 0.35 ㎎; 비오틴: 150 ㎍; 판토텐산 칼슘염; 10 ㎎; 니코틴산: 20 ㎎; 망간: 30 ㎎; 아연: 50 ㎎; 요오드: 0.3 ㎎; 철: 50 ㎎; 구리: 6 ㎎;셀레니움: 0.1 ㎎; 에토퀴닌(etoxiquin): 125 ㎎.

표 6.2: 곡물의 조성 분석

표 6.3: 22 내지 42 주까지의 생산 파라미터(완전 실험용 프로토콜)

1. 유전적으로 완전한 암닭과 비교 (암닭 공급자에 의해 주워진 값)

수치들은 15 암닭의 8 반복의 평균이다. 칼럼내에서, 다른 윗첨자가 따르는 평균은 현저하게 다르다(P＜0.05).

표 6.4: 밀 섭취 닭의 산란 성능에 크실란(xylan)의 영향(절대값¹및 대조군 대비 퍼센테이지²로써)

3. 22-42 주 기간 동안

표 6.5: 보리 섭취 닭의 산란 성능에 효소 조제의 영향(절대값¹및 대조군 대비 퍼센테이지²로써)

³22-42 주 기간 동안

문헌 목록

Claims

부다페스트 조약하 IMI No 378536 로 기탁된 페니실리윰 퍼니쿨로섬(Penicillium funiculosum).
부다페스트 조약하 IMI No 378536 로 기탁된 페니실리윰 퍼니쿨로섬으로부터 수득가능한 효소 혼합물.
적어도 pH 3.0 내지 5.0 로 이루어진 크실라나아제 활성 최적 pH 를 갖는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 으로부터 수득가능한 효소 혼합물.
페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 으로부터 수득가능한 β-글루카나아제.
페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 으로부터 수득가능한 페룰로일 에스테라아제.
적어도 크실라나아제, β-글루카나아제 셀룰라아제 및 페룰로일 에스테라아제를 함유하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 으로부터 수득가능한 효소혼합물.
제 6 항에 있어서, DNS 밀 아라비녹실란법으로 정의된 크실라나아제, pH 3.5 와 DNS CMC 법으로 측정된 β-글루카나아제/셀룰라아제, pH 5.0 사이의 비는 10/1 내지 1/4 인 효소 혼합물.
하기 성분들을 함유하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 으로부터 수득가능한 액상 조성물 :

- 전부 유기성 고체인 미생물 생성물 4% - 10%

- 항생제 0.005% - 0.35%

- 소르비톨 20% - 50%

- 부동제 0 - 40%

- 여과된 농축발효배양물 0.3 내지 76%

- pH 3 내지 5 로 완충 조정됨.
제 8 항에 있어서, 항진균 및/또는 항균제는 소르브산 및 염, 벤조산 및 염, 메틸 4-히드록시벤조에이트, n-프로필 4-히드록시벤조에이트, 푸람산, 염 및 에스테르, 염화나트륨 또는 염화칼륨으로부터 선택하는 액상 조성물.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 부동제는 1,2-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세롤로부터 선택하는 액상 조성물.
하기 조성을 갖는 페니실리윰 퍼니쿨로섬 IMI 378536 로부터 수득가능한 분말 조성물 :

- 전부 유기성 고체인 미생물 생성물 16% - 40%

- 담체 59% - 83%

- 기타 건조된 발효 배양성분 1%
제 11 항에 있어서, 담체는 밀가루, 전분, 석고, 말토덱스트린, 옥수수 고형물, 옥수수 그리트(grits), 밀 미들링(middlings), 밀겨, 호밀 찌끼로부터 선택한 분말 조성물.
가금, 돼지, 반추동물과 같은 농장 동물을 사육하기 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제품의 용도.
제 13 항에 있어서, 밀, 보리, 호밀, 트리티케일(triticale), 귀리, 벼와 같은 곡물; 대두, 옥수수, 평지씨와 같은 오일성 종자; 및 밀겨와 같은 곡물부산물의 소화성을 개선시키기 위한 용도.
인배설을 감소시키기 위한 제 6 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 따른 제품의 용도
인의 소화이용을 증가시키기 위한 제 6 항 내지 제 12 항중 어느 한항에 따른 제품의 용도.
아미노산 소화성을 개선시키기 위한 제 1 항의 제품의 용도.
배터리의 공기에서의 암모니아를 감소시키기 위한 제 1 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 따른 제품의 용도.
이종 유전자 봉입체를 함유하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬.
동종 유전자의 삽입, 결실 또는 수정에의한 동종 유전자를 갖는 게놈의 수정을 특징으로 하는 페니실리윰 퍼니쿨로섬.
SEQ ID n°1 및 도 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID n°1 에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 변이체.
SEQ ID n°4 및 도 2 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID n°4 에 나타낸 핵산서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 변이체.
SEQ ID n°5 및 도 3 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID n°5 에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 변이체.
SEQ ID n°6 및 도 4 에 나타낸 아미노산을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID n°6 에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 변이체.
AEAINYNQDY 와 같은 내부 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
크실라나아제 C 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산서열.
크실라나아제 B1 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산서열.
크실라나아제 A 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산서열.
페룰로일 에스테라아제 B 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산서열.
제 22, 24, 26 및 28 항 또는 제 30 내지 33 항중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제 34 항에 있어서, 플라스미드, 파아지 또는 바이러스인 벡터.
제 21 항 내지 제 29 항중 어느 한 항의 폴리펩티드의 숙주세포에서의 발현을 위한 34 항의 벡터의 용도.
제 34 항에 따른 벡터로 트랜스펙션 또는 감염된 숙주 세포.
제 37 항에 있어서, 단세포 또는 다세포 유기체로부터 분리된 숙주세포.
제 21 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 2,6 및 7 항중 어느 한 항에 따른 효소 혼합물의 제조를 위한 제 37 항에 따른 숙주세포의 용도