CN100443582C - 一种小刺青霉 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够转化银杏叶提取物有效成分种类和含量的微生物菌株。本发明所述的小刺青霉命名为小刺青霉云南变种YM34161(Penicillium spinulosum var.yunnanensis nov.var YM 34161)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC No：M 205131。本发明是采用微生物固体发酵方式，以银杏叶提取物(Ginkgo bilobaExtractant，GBE)为发酵基质，小刺青霉云南变种代谢过程可促使银杏叶提取物有效成分发生质量改变，特别是该菌株能够使银杏叶提取物氨基酸含量和质量上发生明显变化，以提升银杏叶提取物的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够转化银杏叶提取物有效成分种类和含量的微生物菌株。
背景技术
银杏(Ginkgo)系银杏科植物，是世界上最古老的孑遗植物，中国特产。随着人类对银杏的利用、开发、研究，特别是国际市场对银杏叶、制品的需求，其提取物和制剂已被广泛用于药品、保健品和化妆品中。银杏叶提取物中含有多种生理活性成分，如黄酮类化合物、萜内酯等。国际标准银杏叶提取物：黄酮含量为24％，萜内酯为6％，白果酸小于0.0005％，原花青素类7.0％，羧酸类成分13.0％，儿茶素类2.0％，非黄酮苷类20％，高分子化合物4.0％，其他3.0％。现代药理研究表明，银杏叶黄酮具有扩张血管，降低血清胆固醇、解痉、抗菌及松弛支气管等作用，其制剂在治疗心脑血管疾病方面有显著疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省老君山自然保护区土壤、能够促使银杏叶提取物氨基酸种类及含量发生重要变化的微生物--小刺青霉。
本发明所述的小刺青霉命名为小刺青霉云南变种YM 34161(Penicilliumspinulosum var.yunnanensis nov.var YM 34161)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC NO：M 205131。
本发明所述的小刺青霉系从中国云南省老君山自然保护区土壤中分离获得的。现保藏在国家知识产权局专利局保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2005年10月31日，保藏编号为M 205131。
通过对菌株YM34161的形态特征观察及分子生物ITS(internaltranscribed spacer)序列分析，确定该菌株为小刺青霉的一个新变种，命名为小刺青霉云南变种YM 34161(Penicillium spinulosum var.yunnanensis nov.var YM 34161)。根据对银杏微生物转化菌株的形态观察、培养特征及ITS序列分析，菌株YM34161具备典型的青霉属的形态特征。但是，该菌与同种典型菌株形态比较，具有分生孢子表面光滑，无小刺的明显区别；ITS碱基序列同本属的典型菌株存在0.56％的差异，18SrDNA同源性为99％。
菌株YM34161的培养基培养特征(见图1)：
①PDA琼脂平板上28℃培养4天，菌落直径20mm，7天40mm，11天50mm。菌落边缘整齐，紧密细绒状，中间白色小凸起，外缘浅青灰色，背面黄色。
②麦芽汁培养基28℃培养4天，菌落直径20mm，7天45mm，11天50mm。菌落紧密，白色细绒状，中间白色小凸起，背面褐色。
③察贝克氏培养基28℃培养4天，菌落直径10mm，7天15mm，11天25mm。菌落紧密细绒状，中部浅黄色，外缘白色，中央浅黄色小凸起；背面咖啡色，有同心环。
YM34161菌株的形态特征(见图2、3)：
①无性世代菌丝有隔，无色，分生孢子梗从气生菌丝生出，有隔膜，小梗瓶状，单层，分生孢子串生，光滑或椭圆形，孢子直径约3μm，小梗7-10×2-3μm。
②有性世代未发现。
YM34161菌株的分子生物学特征：
采用分子生物学PCR技术，DNA测序仪分析，该菌18SrDNA基因组由1653个碱基组成。该菌ITS(internal transcribed spacer)基因序列由532个碱基组成。该系列由国际NCBI的GenBank数据库注册(Accession number是DQ219458)。同时以ITS序列同源性为基础构建包括菌株YM34161在内的8株相关真菌的系统发育树(图4)。
YM34161菌株的分类学地位：
本发明涉及一种微生物，该微生物能够以银杏叶提取物(GBE)为发酵基质，通过人工纯培养方式，而获得的转化产物，与原银杏叶提取物比较，氨基酸成分的种类及含量都发生了系列变化。该微生物经形态观察、培养特征以及分子生物学18SrDNA和ITS基因序列分析，其分类学地位划为小刺青霉的一个新变种，命名为小刺青霉云南变种(Penicillium spinulosum var.yunnanensis n.var)。
小刺青霉云南变种YM34161在察氏培养基上，菌落生长局限缓慢，呈现紧密而细绒状，其典型形态特征是分生孢子表面光滑，无小刺，与同种典型菌株明显区别。
以ITS基因序列同源性为基础构建形成包括菌株YM34161在内的8株相关真菌的系统发育树。结果看出，菌株YM34161与P.spinulosum形成一个小分支，二者在比对的532个碱基中，相差4个碱基对，序列相似性为99％，同本属菌株Penicillium spinulosum AY373933有0.56％的差异。
YM34161菌株发酵培养特征：
培养基：麦麸(30-35％)+鲜豆渣(30-35％)，银杏提取物(25-30％)，按重量(w/w)计。
培养温度：28℃±5℃。
发酵时间：12-15天。
发酵培养特征：培养第1天，有零星的白色菌丝点生长。培养第2天，可见白色菌丝，菌丝短，发酵物结块。培养第4天，发酵物表面长满白色菌丝，但稍显稀疏。培养第5天，发酵物表面呈白色。培养第6天，发酵物表面长满白色菌丝，发酵物致密。培养第7天，发酵物紧密，布满白色菌丝。培养第8天，发酵物表面长满白色菌丝，发酵物上五分之四左右部分呈白色，下五分之一左右部分呈灰白色。培养第9天，发酵物呈灰白色，表面零星出现灰绿色孢子，发酵物致密。培养第10天，发酵物呈灰白色，发酵物致密，表面长满灰绿色孢子。培养第11天，发酵物同第10天。培养第12天后，布满白色菌丝，表面大量灰绿色孢子，发酵物紧密。
YM34161菌株的发酵银杏叶提取物工艺如下：
菌种→活化→一级种子(固体PDA)→培养(28℃±2℃，3-4天)→接种(接种针一环)→二级种子(液体PDA)→培养(摇床rpm200转/分，28℃±5℃，4-5天)→接种(接种量5％)→发酵(500毫升玻璃瓶，28℃±5℃，12-15天)→烘干(60℃)→称重→发酵产物→提取(乙醇溶剂)→转化银杏提取物。
上述步骤中，发酵基质为标准银杏叶提取物(GBE)。本工艺适合于半知菌类的其它丝状真菌类微生物。发酵基质银杏叶提取物(GBE)，按德国Schwabe专利工艺生产的EGb761为国际标准，银杏叶提取物中黄酮含量为24％，萜内酯为6％，白果酸小于0.0005％，原花青素类7.0％，羧酸类成分13.0％，儿茶素类2.0％，非黄酮苷类20％，高分子化合物4.0％，其他3.0％。银杏叶提取物能增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，免受缺血损害；扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞；抑制血小板聚集，防止血栓形成，清除有害的氧化自由基，提高免疫能力，具有防癌抗衰功能。对治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病有显著疗效。以标准银杏叶提取物(GBE)为发酵基质，通过小刺青霉云南变种微生物固体发酵方式，既能改变银杏叶提取物氨基酸的种类，又可以使转化银杏叶提取物药用成分的含量得到提高。
上述银杏叶提取物发酵工艺中，YM34161菌种的发酵条件如下：
(1)发酵方式：固体发酵。
(2)种子培养：一级种子培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)。二级种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备：取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃马铃薯，滤夜加水补足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然。
上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克，即为固体PDA培养基。
(3)发酵培养：发酵培养基为银杏提取物(25-30％)，鲜豆渣(30-35％)，麦麸(30-35％)，按重量(w/w)计。PH自然(即不对其进行限制)。
(4)培养时间：菌种活化培养72-96小时，一级种子静止培养时间72-96小时，二级种子摇床培养时间96-120小时，发酵培养时间12-15天。
(5)培养温度：一级种子培养温度28℃±2℃，二级种子摇床培养温度28℃±2℃，发酵培养温度为28℃±5℃。
(6)烘干：发酵完毕，发酵产物置60℃下烘干，备用。
(7)提取：发酵产物用80％(重量百分比)乙醇萃取，经浓缩，分离获得转化银杏叶提取物。
菌株YM34161发酵银杏叶提取物12-15天之后，与原银杏叶提取物比较，其特征是发酵后的转化银杏提取物由天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸14种氨基酸组成。其中，转化生成苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸7种人体必需氨基酸，而组氨酸消失(见表1)。
表1小刺青霉云南变种YM34161转化银杏提取物的氨基酸组成
(单位：mg/g)
注：*为必需氨基酸。
本发明是通过微生物发酵途径，以银杏叶提取物为基质，依靠微生物转化作用，提升银杏叶提取物的药用价值，发现新的有效成分或新结构(先导化合物)，以求获得抗人类心脑血管疾病新型天然药用成分。采用微生物固体发酵方式，以银杏叶提取物(Ginkgo biloba Extractant，GBE)为发酵基质，小刺青霉云南变种代谢过程可促使银杏叶提取物有效成分发生质量改变，特别是该菌株能够使银杏叶提取物氨基酸含量和质量上发生明显变化。
小刺青霉云南变种微生物发酵银杏叶提取物最显著的特征，经该菌转化后，所含氨基酸的种类较转化前更为丰富。转化前银杏叶提取物含有的氨基酸种类总数为9种，其中人体必需氨基酸只有3种，而转化后的发酵产物氨基酸种类总数达到了14种，其中人体必需氨基酸有7种。其次，氨基酸含量都较银杏叶提取物转化前明显提高，发酵转化后总游离氨基酸含量为8.773mg/g，较转化前提高了143％。转化前银杏叶提取物人体必需氨基酸仅占总游离氨基酸的27.4％，而转化后达31％。除苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸为转化后新产生的氨基酸外，含量增幅最大的是脯氨酸，是转化前的2.78倍。
附图说明
图1为本发明所述的小刺青霉云南变种YM34161的菌落图。
图2为本发明所述的小刺青霉云南变种YM34161分生孢子穗显微图。
图3为本发明所述的小刺青霉云南变种YM34161扫描电镜图。
图4为本发明所述的小刺青霉云南变种ITS序列同源性的系统发育树图。
图5为本发明所述的小刺青霉云南变种转化银杏提取物氨基酸含量的变化图。
具体实施方式
小刺青霉云南变种(Penicillium spinulosum var.yunnanensis n.var)YM34161菌株是发酵转化银杏叶提取物；提高或改变抗人类心血管疾病药用成分的天然微生物药源。
取YM34161(小刺青霉云南变种(Penicillium spinulosumvar.yunnanensisnov.var)菌种，在无菌条件下(无菌室或超净工作台)，用接种针挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体PDA培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃活化培养96小时。取出活化96小时的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的一级种子固体PDA培养基中，在28℃±2℃下培养72-96小时，即为YM34161一级种子。
采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟备用。取YM34161菌株一级种子，在无菌条件下，接种于装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中，一级种子接种量为每支斜面接三个三角瓶，置28℃±2℃摇床培养72-96小时后，作为发酵二级种子用。
根据发酵规模大小，按发酵料重量比率，称取标准银杏提取物干粉(25-30％)加入30-35％鲜豆渣和30-35％麦麸，充分拌匀，控制发酵料水分62-68％。银杏提取物发酵料配制好后，装入500毫升罐头瓶中，塑料薄膜、牛皮纸封口，置灭菌锅内15磅灭菌60分钟后，取出待冷却至30℃，接入液体二级种子，二级种子接用量为5％(v/w)。摇匀，放置28℃±5℃下，静止发酵12-15天。在发酵期间，控制发酵室保湿不低80％相对湿度，第2天分别进行摇瓶一次，并注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，发酵产物置60℃下烘干，得到银杏提取物发酵产物。再经化学提取，即可得到转化银杏提取物。
本发明所述的小刺青霉云南变种YM 34161 18SrDNA基因组由1653个碱基(bp)组成，系列如下：
agcaacttgt actgtgaaac tgcgaatggc tcattaaatc agttatcgtt tatttgatag
taccttacta catggatacc tgtggtaatt ctagagctaa tacatgctaa aaaccccgac
ttcaggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaacgcc cttcggggct ccttggtgaa
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tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt gaatggctca gtgaggcctt gggactggct
caggagggtt ggcaacgacc ccccagagcc gaa。
本发明所述的小刺青霉云南变种YM 34161 ITS序列由532个碱基(bp)组成：
tctgggtcca cctcccaccc gtgtttatta taccttgttg cttcggtgcg cccgcctcac
ggccgccggg gggcttctgc ccccgggccc gcgcgcaccg gagacaccat tgaactctgt
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cccgctctgt aggcccggcc ggcgccagcc gacaacccat catccttttc aggttgacct
cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg ag。
Claims (3)
1、一种小刺青霉，其特征是命名为小刺青霉云南变种YM 34161(Penicillium spinulosum var.yunnanensis nov.var YM 34161)，保藏编号为CCTCC NO：M 205131。
2、按照权利要求1所述的小刺青霉，其特征是其18SrDNA基因组由1653个碱基组成，序列如下：
agcaacttgt actgtgaaac tgcgaatggc tcattaaatc agttatcgtt tatttgatag
taccttacta catggatacc tgtggtaatt ctagagctaa tacatgctaa aaaccccgac
ttcaggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaacgcc cttcggggct ccttggtgaa
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gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt
tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaacc ttggggcctg gctggccggt ccgcctcacc
gcgagtactg gtccggctgg gcctttcctt ctggggaacc tcatggcctt cactggctgt
ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa attagagtgt tcaaagcagg cctttgctcg
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tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt gaatggctca gtgaggcctt gggactggct
caggagggtt ggcaacgacc ccccagagcc gaa。
3、按照权利要求1所述的小刺青霉，其特征是其内转录间隔区序列由532个碱基组成：
tctgggtcca cctcccaccc gtgtttatta taccttgttg cttcggtgcg cccgcctcac
ggccgccggg gggcttctgc ccccgggccc gcgcgcaccg gagacaccat tgaactctgt
ctgaagattg cagtctgagc ataaactaaa taagttaaaa ctttcaacaa cggatctctt
ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc
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gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcacg gctlgtgtgt tgggctccgt ccccccgggg
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cccgctctgt aggcccggcc ggcgccagcc gacaacccat catccttttc aggttgacct
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20081217 Termination date: 20101114 |