JP4421596B2 - 酵素混合物 - Google Patents

Description

本発明は、新規の微生物、新規の酵素、および新規の酵素混合物に関する。さらに、本発明は、酵素混合物の組成物、その調製物、ならびに飼料、食品、およびその他、製紙産業および繊維産業などを含むが、これらに限定されない産業におけるその使用に関する。

酵素は、長い間、さまざまな産業に応用するために用いられてきた。実例は、製パン業や、酒造業および果汁産業（ペクチンやβ−グルカンを破壊するために酵素が用いられる）、繊維産業（柔らかで滑らかなセルロース繊維を得るためにセルロースを用いる）において知られているが、動物の飼料にも少なからず利用されている。この場合、酵素は、植物性の原料の消化性を向上させる。

この後者の使用法によって、家畜は、飼料をより有効に消化することができるようになる。飼料の有効性は、動物の体重増加に対する飼料消費量の栄養比である、ＦＣＲ（飼料転換比率）によって測定することができる。ある飼料についてＦＣＲが減少したとすると、所定の飼料量について、動物がより多くの体重を比例して得たことを示している。すなわち、動物は、より有効に飼料を利用できることを示している。

飼料成分（澱粉、脂肪、タンパク質／アミノ酸）の消化性が悪いことが、穀類を主原料とする飼料、および、例えば、特に、オオムギとコムギの含量が高い飼料の顕著な特徴である。これらの場合、別の材料から高レベルのエネルギーや、アミノ酸などの別の栄養補助食品を含むように飼料を処方する必要があろう。これらの酵素は、飼料に取り込まれた穀類の見かけの代謝可能なエネルギー利用値を増加させる。

この問題を解決するためのもう１つの方法は、セルラーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（β−グルカナーゼ）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（キシラナーゼ）など、または、酵素活性の混合物などの酵素補給剤を、これらの穀類主原料とする飼料に加えることである。酵素補給剤は、穀類（典型的にはオオムギとコムギ）に見られるβ−グルカンまたはアラビノキシランを加水分解するときに特異的に使用することができる。酵素を加えることには、さまざまな目的がある。飼料酵素補給剤の効能を明らかに証明する利点の１つは、適当な酵素補給剤を含む、穀類を主原料とする飼料を食べた動物の腸の中で材料の粘度が低下することである。粘度が高くなるのは、部分的には、オオムギとコムギに見られるβ−グルカンおよびアラビノキシランが原因である。酵素作用の結果、粘度が低下すると、動物の腸の中で栄養成分を吸収するのが容易になる。この他の利点は、穀類の細胞壁に捉えられている栄養分を放出させることによって、他の高価な飼料補助食品に対する必要性が減少することである。全体として、結果的に、ＦＣＲで測定したときに同じような、または優れた効果をもつ飼料にかかる費用をかなり低減させることになる。

さまざまな範囲の微生物に由来する酵素調製物が、飼料の消化性を向上させたことが記載されている。

動物飼料における酵素使用に関する先行技術については、シュワニノマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）に由来するフィターゼの使用について記載のある欧州特許第０，６９９，７６２号を挙げることができる。このフィターゼは、本発明では回避するつもりのクローニングされた遺伝子を入れて得られた、遺伝子改変生物から得られたフィターゼである。

国際公開公報第９５／２６３９８号特許出願によれば、宿主細胞に外来ＤＮＡ配列を封入して、以下の微生物リストから選ばれた原菌株の性質を改変して、改変セルロースが再び得られる。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属である。本発明において、発明者らの主な目的は、酵素の生産をする微生物に外来遺伝子を組み込むことを避けることであった。

国際公開公報第９６／０５７３９号特許出願では、さまざまな微生物から酵素混合物（キシラナーゼ、プロテアーゼ、および、選択的にはβ−グルカナーゼ）が得られている。この著者らは、キシラナーゼ活性がβ−グルカナーゼ活性に対して１：５という位数の比率をもつ酵素混合物を実施例として挙げている（５頁）。穀類を主原料とする飼料が、最適な用量レベル、またはそれに近いレベルでキシラナーゼを含んでいるときに、β−グルカナーゼ活性をもつ酵素が共存すると、飼料のＦＣＲ値が上昇して、当然ながら不利益なことになる。その結果、著者らは、β−グルカナーゼの存在について注意を促し、キシラナーゼ活性のβ−グルカナーゼ活性に対する最大比率が１：０−０．２５になるように勧めている。

場合によっては、飼料への応用に関連する酵素活性のすべてが確実に表れるようにするために、１種類以上の微生物からの調製物から製剤を作製する。多くの場合、組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子改変を行なった微生物から酵素調製物を得ている。

本発明者らは、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）という分類に属する新規の微生物で、主には、穀類を主原料とする飼料の消化性をうまく向上させるために利用できるような、新規の酵素および酵素活性の混合物を含む微生物を発見開発した。

したがって、本発明は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍに由来する新規の微生物、および、この微生物を培養し、この微生物によって産生される酵素を回収するための方法に関するものである。

さらに、本発明によって、この微生物から生み出される新規の酵素、その塩基配列、およびこれらの酵素を含む新規の組成物が提供される。

さらに、本発明によって、アミノ酸、穀類を主原料とする飼料およびアミノ酸の消化性を向上させる方法が提供される。

本発明のもう１つの目的は、動物を飼育しているケージからのリンおよびアンモニアの排出を減少させることである。

（詳細な説明）
Ａ．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍの新菌株
菌類であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍの新菌株は、ブタペスト条約（１９７７）で国際寄託機関として認められている、英国、ＴＷ２０ ９ＴＹ、サリー州エグハム、イングルフィールドグリーン、ベイクハムレーンにある国際菌類学研究所（ＩＭＩ）（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＩＭＩ）， Ｂａｋｅｒｈａｍ Ｌａｎｅ， Ｅｎｇｌｅｆｉｅｌｄ Ｇｒｅｅｎ， Ｅｇｈａｍ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＴＷ２０ ９ＴＹ， ＵＫ）に、寄託番号ＩＭＩ ３７８５３６として寄託されている。
系統関係
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ １３４７５６の胞子を連続的にＵＶおよびβ線で照射処理して、選択培地でスクリーニングしたところ、新菌株が得られた。外来ＤＮＡまたはＲＮＡの組込みを利用する組換えＤＮＡ技術による遺伝子改変は行なわれていない。

同定と分類
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ ３７８５３６は、ツザペク−ドックス寒天培地上、２５℃で増殖するという特徴をもっている。コロニーの特徴と微小構造は、典型的なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍである。この微生物をＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍであると同定したことは、英国、ＴＷ２０ ９ＴＹ、サリー州エグハム、イングルフィールドグリーン、ベイクハムレーンにある国際菌類学研究所で確認されている。増殖は、基底部が固いフェルトのようで、空中では、菌糸がロープか管束のようになって（フニクロース（ｆｕｎｉｃｌｏｓｅ））増殖し、菌糸は白く、その下の培地が赤く着色して、縁は逆に青白いが、中心に向かって赤く着色していて、次第に深紅になってゆく。このペニシリウム属は典型的なもので、そのほとんどが、索状で双輪性で針状の分生子産生細胞から生じる短い分生子柄を示し、分生子は楕円形で滑らかである。

本発明の酵素調製物を製造するために使用する微生物は、セルロース、トウモロコシの浸出液、炭酸カルシウム、および硫酸アンモニウムを含む培地の中で好気条件下で増殖させる。

Ｂ．醗酵方法
この新規の菌は、まず、寄託されている菌株を、好ましくは、以下の組成（重量で）からなる植菌用培地上で醗酵させて製造する：
トウモロコシ浸出液 １％から４％
消泡剤 発泡を避けるのに必要なだけ
水 １００％まで
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ） 培地を滅菌する前のｐＨが約３．０から６．０になるように調整するのに十分な量
インキュベーション温度 ２７℃から３６℃
製造用培地は、好ましくは、以下の組成（重量で）からなる：
トウモロコシ浸出液 ０から４．０％
１回分にまとめた養分となるセルロース ０．８から１４％
カルシウム塩 ０から０．８％
硫酸アンモニウム ０から１．０％
消泡剤 発泡を避けるのに必要なだけ
水 １００％にするのに十分な量
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ） 培地を滅菌する前のｐＨが約３．０から６．０になるように調整するのに十分な量；
硫酸 Ｈ_２ＳＯ_４ ｐＨを約３．０から６．０に維持するのに十分な量；
気体または液体のアンモニア ｐＨを約３．０から６．０に維持するのに十分な量；
インキュベーション温度 ２７℃から３６℃

醗酵を行なうためには、醗酵器の中に十分な量の水を入れ、適当に振とうさせている容器の水の中に成分を加え、成分が溶解するまで撹拌する。醗酵器を密封し、一般的には、１２１℃に温度を上昇させて滅菌する。植菌用醗酵器から醗酵用容器に植菌をする。

醗酵過程で加える主要な炭素源はセルロースである。中でも、我々が好んで用いたセルロース源は、さまざまな等級のＡＲＢＯＣＥＬ、ＳＯＬＫＡＦＬＯＣ、ＣＬＡＲＯＣＥＬ、ＡＬＰＨＡＣＥＬ、ＦＩＢＲＡＣＥＬである。

醗酵中のｐＨは、硫酸または別の酸、または気体状または液状のアンモニアまたは塩基を加えて調整するのが好ましい。

発行時間が終わったら、濾過または遠心分離などの固体−液体分離法によって固体を取り除き、液相を集めてから、例えば、有機質または無機質の膜上で限外濾過を行なうなどして濃縮する。

これらの酵素は、組換えＤＮＡ技術という方法によって、組換えた同種または異種の生物種に産生させて製造することもできる。酵素をコードする遺伝子を導入させるための宿主は、菌類、バクテリア細胞、または植物細胞から選択することができる。プラスミド（組込み型、またはそれ以外の）、ファージベクター、およびウイルスベクターなど、いずれかの従来の技術を用いて、目的とする酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に挿入にすることができる。組み込まれた異種由来の遺伝子、または相同な遺伝子の挿入、欠失または改変によって、相同な遺伝子をもつゲノムを改変したものを含むＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍも本発明の一部をなす。

本発明によれば、酵素は、単離精製された酵素調製物として、または、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍを増殖させた培養培地などの粗調製物として提供することができる。

また、その組成物の目的とする用途に応じた種類のさらに別の酵素を含む組成物の中に、このような酵素を含ませることも可能であろう。添加する酵素は、例えば、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼから選択することができる。

Ｃ．（酵素活性混合物）の組成
１．液体組成物
液体組成物については、抗菌剤を加えた後に、酵素濃度の測定と製品の強度になるよう正確な希釈が行われる。

液体溶液の、重量による好ましい組成は以下のとおりである：
全有機固形物としての菌体生産物 ４から１０％
抗菌剤 ０．００５から０．３５％
好ましくは ０．０１から０．２５％
ソルビトール ２０から５０％
最終的な不凍剤 ０から４０％
より好ましくは １５から４０％
濃縮濾過した醗酵培地 ０．３から７６％
ｐＨ ３から５になるよう緩衝調整する。

抗菌剤は、ソルビン酸とその塩、安息香酸とその塩、メチル４−ヒドロキシ安息香酸とｎ−プロピル４−ヒドロキシ安息香酸、フマル酸、塩類およびエステルなどの製品から選択される。塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩類を用いることもできよう。

もっとも好ましい不凍剤は、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセロールである。

２．粉末組成物
粉末組成物については、得られた濃縮溶液を、担体存在下で最終的に乾燥させる。担体を入れないで濃縮溶液を乾燥させた後に得られた粉末を、さらに、適当な担体と混合することもできる。

好ましい粉末状の組成物は以下の通りである：
全有機固形物としての菌体生産物 １６％から４０％
担体 ５９％から８３％
その他の乾燥した醗酵培地成分 １％
好ましい担体は、小麦粉、澱粉、石膏、マルトデキストリン、トウモロコシ固形物、また、トウモロコシの挽割粉、小麦シャープス、小麦ふすま、ライムギのくず殻、無機物の混合物など、穀物処理から得られる副生産物から選択する。

Ｄ．酵素の特徴
発明者らは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される新規の酵素混合物を得た。この酵素混合物には、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼ、および、アラビノフラノシダーゼおよびフェルロイルエステラーゼなどのキシラナーゼ補助酵素などの新規の酵素などが含まれている。

１．方法
酵素調製物の特徴は、セルラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（異なった培地を用いる）、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼおよびフェルロイルエステラーゼ（異なった培地を用いる）の活性に関するアッセイ法を含むアッセイ法である。

１．１．ＤＮＳ ＣＭＣ法によるセルラーゼ
セルラーゼ活性に関するアッセイ法は、β−１，４グルカンであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の中のグリコシド結合の加水分解に基づいている。この反応生産物であるβ−１，４グルカンオリゴサッカライドを、反応の結果起こる還元値の増加（グルコースとしての）によって測定する。

１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣ溶液を含む１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０（または、異なったｐＨ値）；適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応は、２ ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸、１．６％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、および３０％（ｗ／ｖ）のカリウムナトリウム（＋）−酒石酸）を加えて停止させる。溶液を混合して、最低でも９５℃の沸騰水中に５分間置いてから２５℃に冷却する。この溶液に１０ ｍｌの蒸留水を加え、２ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、４００ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、ＤＮＳ溶液で同じように処理した０．００から０．０４％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液２ ｍｌに関する標準曲線と比較して、μモル単位の還元糖（グルコースとして）に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にＤＮＳ溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のセルラーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃で、ｐＨ ５．０またはその他のｐＨ）で、１分間当りに１μモル当量のグルコースを産生する酵素量であると定義されている。

１．２．ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシド法によるセロビオヒドロラーゼ
セロビオヒドロラーゼのアッセイ法は、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシドの酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるｐ−ニトロフェノールを、比色定量法によって測定する。

１ ｍｌの蒸留水中０．１％（ｗ／ｖ）のｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシド；１ ｍｌの０．２ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０；および、適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌをを含む溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。この酵素反応は、４ ｍｌの０．４ Ｍグリシン溶液を加えて停止させる。溶液を混合して、２０℃に冷却する。１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、４００ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、同じ条件でのｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数と比較して、μモル単位のｐ−ニトロフェノールに換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にグリシン溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のセロビオヒドロラーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃でｐＨ ５．０）で、１分間当りに、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−セロビオピラノシドから１μモル当量のｐ−ニトロフェノールを産生する酵素量であると定義されている。

１．３．ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄグルコピラノシド法によるβ−グルコシダーゼ
β−グルコシダーゼのアッセイ法は、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドの酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるｐ−ニトロフェノールを、比色定量法によって測定する。

１ ｍｌの蒸留水中０．１％（ｗ／ｖ）のｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド；１ ｍｌの蒸留水；１ ｍｌの０．２ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０；および、適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。この酵素反応を、４ ｍｌの０．４ Ｍグリシン溶液を加えて停止させる。溶液を混合して、２０℃に冷却する。１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、４００ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、同じ条件でのｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数と比較して、μモル単位のｐ−ニトロフェノールに換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にグリシン溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のβ−グルコシダーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃でｐＨ ５．０）で、１分間当りに、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドから１μモル当量のｐ−ニトロフェノールを産生する酵素量であると定義されている。
１．４．ＤＮＳオオムギβ−グルカン法によるエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性のアッセイ法は、β−１，３（４）−グルカンであるオオムギβ−グルカンのグリコシド結合グリコシド結合の酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるβ−１，３（４）−グルカンオリゴサッカライドを、反応の結果起こる還元値（グルコースとして）の増加によって測定する。

１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０（または、異なったｐＨ値）に１％（ｗ／ｖ）のオオムギβ−グルカン溶液を含むもの；および適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応は、２ ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸、１．６％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、および３０％（ｗ／ｖ）のカリウムナトリウム（＋）−酒石酸）を加えて停止させる。溶液を混合して、最低でも９５℃の沸騰水中に５分間置いてから２５℃に冷却する。この溶液に１０ ｍｌの蒸留水を加え、２ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、５４０ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、ＤＮＳ溶液で同じように処理した０．００から０．０４％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液２ ｍｌに関する標準曲線と比較して、μモル単位の還元糖（グルコースとして）に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にＤＮＳ溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃で、ｐＨ ５．０またはその他のｐＨ）で、１分間当りに１μモル当量のグルコースを産生する酵素量であると定義されている。

１．５．アゾオオムギβ−グルカン法によるエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性のアッセイ法は、結合発色団をもつオオムギβ−グルカン（アゾオオムギβ−グルカン）の加水分解に基づく。この反応生産物であるエタノール沈殿後の可溶性オリゴマーを、その結果生じる５９０ ｎｍでの吸光度の増加によって測定する。

０．５ ｍｌのアゾオオムギβ−グルカン基質（すぐに使用できる形になったもの）を含む溶液と、０．２ ｍｌの酵素希釈液（０．０１ Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ４．６の中に１ ｍｌ当り０．１５から０．６０単位を含む）を含む溶液を３０℃で正確に２０分間インキュベートした。酵素反応は、２．５ ｍｌの沈殿溶液（蒸留水中、１８．１ ｇの酢酸ナトリウムと３．０ ｇの亜鉛を、ガラス容器の中の３００ ｍｌの蒸留水と混合し、塩酸でｐＨ ５．０に調整し、１ ｌの計量用フラスコに移して、９６％ ｖ／ｖエタノールで容量を合わせたもの）を加えて停止させる。溶液を混合して、１０分間室温放置する。この溶液を遠心管に移して、卓上遠心機中１０００ ｇで１０分間遠心分離する。１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、５９０ ｎｍでの上清の吸光度を測定する。

酵素溶液を加える前の混合液に沈殿溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性とは、アッセイ条件下（３０℃でｐＨ ４．６）で標準的な基質を用いたときに、５９０ ｎｍで０．８２０単位の吸光度となる加水分解をもたらす酵素量であると定義されている。

１．６．ＤＮＳラミナリン法によるラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）
ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）活性のアッセイ法は、β−１，３−グルカンであるラミナリンのグリコシド結合の酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるβ−１，３−グルカンオリゴサッカライドを、反応の結果起こる還元値（グルコースとして）の増加によって測定する。

１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０（または、異なったｐＨ値）に１％（ｗ／ｖ）のラミナリン溶液を含むもの；および適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを５０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応は、２ ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸、１．６％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、および３０％（ｗ／ｖ）のカリウムナトリウム（＋）−酒石酸）を加えて停止させる。溶液を混合して、最低でも９５℃の沸騰水中に５分間置いてから２５℃に冷却する。この溶液に１０ ｍｌの蒸留水を加え、２ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、５４０ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、ＤＮＳ溶液で同じように処理した０．００から０．０４％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液２ ｍｌに関する標準曲線と比較して、μモル単位の還元糖（グルコースとして）に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にＤＮＳ溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のラミナリナーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃でｐＨ ５．０）で、１分間当りに１μモル当量のグルコースを産生する酵素量であると定義されている。

１．７．ＤＮＳカバノキ（ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ）キシラン法によるエンド−１，４−β−キシラナーゼ
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性のアッセイ法は、β−１，４−キシランであるカバノキキシランのキシロシド結合の酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるβ−１，４−キシランオリゴサッカライドを、反応の結果起こる還元値（キシロースとして）の増加によって測定する。

１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０（または、異なったｐＨ値）に１％（ｗ／ｖ）のカバノキキシラン溶液を含むもの；および適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応は、２ ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸、１．６％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、および３０％（ｗ／ｖ）のカリウムナトリウム（＋）−酒石酸）を加えて停止させる。溶液を混合して、最低でも９５℃の沸騰水中に５分間置いてから２５℃に冷却する。この溶液に１０ ｍｌの蒸留水を加え、２ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、５４０ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、ＤＮＳ溶液で同じように処理した０．００から０．０３％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液２ ｍｌに関する標準曲線と比較して、μモル単位の還元糖（キシロースとして）に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にＤＮＳ溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃で、ｐＨ ５．０またはその他のｐＨ）で、１分間当りに１μモル当量のグルコースを産生する酵素量であると定義されている。

１．８．ＤＮＳコムギアラビノキシラン法によるエンド−１，４−β−キシラナーゼ
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性のアッセイ法は、アラビノース置換β−１，４−キシランであるコムギキシランのキシロシド結合の酵素的加水分解に基づく。この反応生産物であるアラビノβ−１，４−キシランオリゴサッカライドを、反応の結果起こる還元値（キシロースとして）の増加によって測定する。

１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０（または、異なったｐＨ値）に１％（ｗ／ｖ）のコムギアラビノキシラン溶液を含むもの；および適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で１０分間インキュベートした。酵素反応は、２ ｍｌのＤＮＳ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）の３，５−ジニトロサリチル酸、１．６％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、および３０％（ｗ／ｖ）のカリウムナトリウム（＋）−酒石酸）を加えて停止させる。溶液を混合して、最低でも９５℃の沸騰水中に５分間置いてから２５℃に冷却する。この溶液に１０ ｍｌの蒸留水を加え、２ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、５４０ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、ＤＮＳ溶液で同じように処理した０．００から０．０３％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液２ ｍｌに関する標準曲線と比較して、μモル単位の還元糖（キシロースとして）に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にＤＮＳ溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃で、ｐＨ ５．０またはその他のｐＨ）で、１分間当りに１μモル当量のグルコースを産生する酵素量であると定義されている。

１．９．粘度測定コムギアラビノキシラン法によるエンド−１，４−β−キシラナーゼ
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性のアッセイ法は、標準的なコムギアラビノキシラン溶液の酵素的加水分解に基づくが、この活性は、時間に対する相対的な粘性の低下によって判定される。

１ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．５（または、異なったｐＨ値）に１％（ｗ／ｖ）のコムギアラビノキシラン溶液を含むもの；３ ｍｌの蒸留水、および適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を、ハーク（Ｈａａｋｅ）微量粘度計（０．１−２．０ ｍＰａ．ｓの口径に揃えた金粒を用いる）の中へ注入し、３０℃で１５−２０分間にわたり３０秒毎に落下時間Ｔ（試験）を測定する。金粒の落下平均時間を水（５ ｍｌの蒸留水）と基質（０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．５中に１％（ｗ／ｖ）のコムギアラビノキシラン溶液を含む１ ｍｌの溶液および４ ｍｌの蒸留水）を、それぞれＴ（水）およびＴ（基質）として測定する。対照も同じようにして測定する。Ｔ（試験）の各数値について、相対的な流動性（Ｆ_ｒ）をつぎのように計算する：

時間（Ｔ（試験）の測定を行なった各経過時間）に対するＦ_ｒのプロットの傾きを、１分当りの相対的な流動性の変化（△Ｆｒ．ｍｉｎ^−１）として計算すると、酵素濃度に比例する。１単位のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性とは、アッセイ条件下（３０℃で、ｐＨ ５．５またはその他のｐＨ）で、基質を加水分解し、溶液の粘度を低下させ、１分間当りの相対的流動性変化を１（無寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｌｅｓｓ）単位）にする酵素量と定義されている。

１．１０．ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシド法によるβ−キシロシダーゼ
β−キシロシダーゼのアッセイ法は、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシドの酵素的加水分解に基づく。反応生産物であるｐ−ニトロフェノールを、比色定量法によって測定する。

蒸留水中０．１％（ｗ／ｖ）のｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１ ｍｌ；蒸留水１ ｍｌ；１ ｍｌの０．２ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０；および、適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素反応は、４ ｍｌの０．４ Ｍグリシン溶液を加えて停止させる。溶液を混合して、２０℃に冷却する。１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、４００ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、同じ条件でのｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数と比較して、μモル単位のｐ−ニトロフェノール量に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にグリシン溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のβ−キシロシダーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃でｐＨ ５．０）で、１分間当りに、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシドから１μモルのｐ−ニトロフェノールを産生する酵素量であると定義されている。

１．１１．ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド法によるα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ（アラビノフラノシダーゼ）のアッセイ法は、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシドの酵素的加水分解に基づく。反応生産物であるｐ−ニトロフェノールを、比色定量法によって測定する。

蒸留水中０．１％（ｗ／ｖ）のｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド１ ｍｌ；蒸留水１ ｍｌ；１ ｍｌの０．２ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ５．０；および、適当に希釈した酵素溶液１ ｍｌを含む溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素反応は、４ ｍｌの０．４ Ｍグリシン溶液を加えて停止させる。溶液を混合して、２０℃に冷却する。１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、４００ ｎｍでの吸光度を測定する。

この結果を、同じ条件でのｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数と比較して、μモル単位のｐ−ニトロフェノール量に換算する。

酵素溶液を加える前の混合液にグリシン溶液を加えて反応を行なうことによって、非特異的な吸光に対して酵素反応の吸光度の観察値を補正する。１単位のアラビノフラノシダーゼ活性とは、アッセイ条件下（５０℃でｐＨ ５．０）で、１分間当りに、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド１から１μモルのｐ−ニトロフェノールを産生する酵素量であると定義されている。

１．１２．ＦＡＸＸ法によるフェルロイルエステラーゼ
フェルロイルエステラーゼ（フェルラ酸エステラーゼ）のアッセイ法は、Ｏ−［５−Ｏ−（トランス−フェルロイル）−α−Ｌ−アラビノフラノシル］−（１−＞３）−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル−（１−＞４）−Ｄ−キシロピラノース（ＦＡＸＸ）の酵素的加水分解に基づく。ＦＡＸＸは、酵素加水分解した小麦ふすまから調製し、精製してからＮＭＲで特徴を調べる。ＦＡＸＸ加水分解は、分光光度測定法によって測定する。

酵素反応は、１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、３７℃でｐＨ ６．０の０．１ Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液中に０．０５０ ｍＭのＦＡＸＸを含む溶液を３２５ ｎｍで調査する。

１単位のフェルロイルエステラーゼ活性とは、アッセイ条件下（３７℃でｐＨ ６．０）で、１分間当りに１μモルの基質を生産物に転化させる酵素量であると定義されている。

１．１３．Ａｒａ_２Ｆ法によるフェルロイルエステラーゼ
フェルロイルエステラーゼ（フェルラ酸エステラーゼ）のアッセイ法は、Ａｒａ_２Ｆ（１，２位がアラビノースに結合しているフェルラ酸）の酵素的加水分解に基づく。Ａｒａ_２Ｆは、酵素加水分解したサトウダイコンのパルプから調製し、精製してからＮＭＲで特徴を調べる。Ａｒａ_２Ｆ加水分解は、分光光度測定法によって測定する。

酵素反応は、１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、３７℃でｐＨ ６．０の０．１ Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液中に０．０５０ ｍＭのＡｒａ_２Ｆを含む溶液を３２５ ｎｍで調査する。

Ａｒａ_２Ｆについて１単位のフェルロイルエステラーゼ活性とは、アッセイ条件（３７℃でｐＨ ６．０）下で、１分間当りに１μモルの基質を生産物に転化させる酵素量であると定義されている。

１．１４．メチルエステルの加水分解、すなわち、メチルフェルラ酸（ＭＦＡ）法、メチルカフェイン酸（ＭＣＡ）法、メチルシナピン酸（ＭＳＡ）法、およびメチルｐ−クマリン酸（ＭｐＣＡ）法によるフェルロイルエステラーゼ
フェルロイルエステラーゼ（フェルラ酸エステラーゼ）のアッセイ法は、メチルフェルラ酸（ＭＦＡ）、メチルカフェイン酸（ＭＣＡ）、メチルシナピン酸（ＭＳＡ）、およびメチルｐ−クマリン酸（ＭｐＣＡ）のメチルエステルの酵素的加水分解に基づく。メチルエステルの酵素的加水分解は、３７℃でｐＨ ６．０の０．１ Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液中で測定する。アッセイは、２種類の異なった技術に基づく。

分光光度測定法においては、メチルエステルの基質濃度は０．１０ ｍＭであり、エステルの加水分解は、１ ｃｍの透過距離をもつガラス製のセルを用いて、３２５ ｎｍで調査する。この方法では、最初の基質濃度が限定されている。

ＨＰＬＣ法においては、メチルエステルの基質濃度は０．１０ ｍＭであり、エステルの加水分解は、１０〜３０分間隔で、ＨＰＬＣによる遊離酸の解離を測定して調べられる。この方法では、基質濃度に対する制限はなく、測定される活性は、分光光度測定法よりもかなり高くなる。

１単位のフェルロイルエステラーゼ活性とは、アッセイ条件（３７℃でｐＨ ６．０）下で、１分間当りに１μモルの基質を生産物に転化する酵素量であると定義されている。

１．１５．修正ブラッドフォードクーマシーブルー結合タンパク質アッセイ法によるタンパク質濃度
タンパク質濃度のアッセイ法は、ブリリアントブルーＧ（クーマシーブルー）を用い、１ ｃｍの透過距離をもつガラス製キュベットを用いて、５９５ ｎｍで分光光度を測定する修正ブラッドフォードクーマシーブルー結合タンパク質アッセイに基づく。この方法（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製Ｂ ６９１６）は、ウシ血清アルブミン（シグマ社製Ｐ ０９１４）を用いて標準化する。

１．１６．等電点電気泳動法による等電点
タンパク質の等電点を、ノベックス社（ＮＯＶＥＸ）製 ＸＣｅｌｌ ＩＩ（登録商標）ミニセルにおいてｐＨ ３−１０（ｐＩ実効範囲３．５−８．５）またはｐＨ ３−７（ｐＩ実効範囲３．０−６．５）のＮＯＶＥＸゲルなど、既製の垂直５％ポリアクリルアミドゲルを用いた、標準的な方法によって測定する。ＮＯＶＥＸの陰極と陽極、および、ｐＨ ３−１０とｐＨ ３−７のためのＩＥＦサンプル緩衝液を用いる。等電点、固定、クーマシーＲ−２５０ブルー染色液による染色、および脱色のためのＮＯＶＥＸ標準プロトコールを用いる。

１．１７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）
タンパク質の解析用分離、および分子量測定を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって行なう。既製のＮＯＶＥＸ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（ＮＯＶＥＸが推奨する泳動緩衝液による、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ビス−トリスゲルまたはＮｕＰＡＧＥ（登録商標）トリス−酢酸ゲル）を、ＮＯＶＥＸ ＸＣｅｌｌ ＩＩ（登録商標）ミニセルで用いる。ＮＯＶＥＸサンプル調製物と泳動用緩衝液、および分子量標準を用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、固定、クーマシーＲ−２５０ブルー染色液による染色、および脱色のためのＮＯＶＥＸ標準プロトコールを用いる。

２．酵素混合物についての結果
２．１．最適なｐＨ
２．１．１．エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性
ＤＮＳオオムギβ−グルカン法を用い、標準条件下、５０℃でＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ由来のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性のアッセイを行なった。ｐＨ ３．０とｐＨ ７．０の間で酵素活性を測定した。酵素活性についての最適なｐＨはｐＨ ４．０−５．０である。

２．１．２．エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性
ＤＮＳカバノキキシラナーゼ法を用い、標準条件下、５０℃でＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ由来のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性のアッセイを行なった。

２．２．最適な温度
２．２．１．エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性
ＤＮＳオオムギβ−グルカン法を用い、ｐＨ ５．０（この酵素にとって最適なｐＨ）での標準条件下で、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ由来のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性のアッセイを行なった。酵素活性を３０℃と７０℃の間で測定した。最適な温度は５０℃と６０℃の間に存在し、最大の活性は６０℃で測定された。詳しい結果を、温度に対する表の形で示す。

２．２．２．エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性
ＤＮＳカバノキキシラナーゼ法を用い、ｐＨ ５．５とｐＨ ３．５の標準的条件下で、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ由来のエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性のアッセイを行なった。酵素活性を３０℃と７０℃の間で測定した。最適な温度は５０℃と６０℃の間に存在し、最大の活性を、ｐＨ ５．５については５０℃で、ｐＨ ３．５については６０℃で測定された。詳しい結果を、温度に対する表の形で示す。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素は、高レベルのセルラーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、およびその他のグルカン分解活性をもつ。さらに、高レベルのエンド−１，４−β−キシラナーゼ、およびキシラナーゼ補助酵素活性をもつという特徴がある。ヘミセルロース分解酵素の範囲が広いのが、この微生物からの酵素調製物の特徴である。

測定された各活性は、その調製物についての主要活性に対する比率として報告することができる。得られた結果の実例を表Ａに示す。これらの比率は、異なった醗酵バッチからの調製物では変化するかもしれない。

３．酵素混合物における成分の性質
３．１．精製法
疎水性相互作用クロマトグラフィー
濾過、および１１２．６ ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度まで醗酵培地を濃縮して得られた調製物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）緩衝液（５０ ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．０／１．７ Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４／０．０４％アジ化ナトリウム）で１／１に希釈して、ＨＩＣ緩衝液に交換した（ＰＤ−１０カラム；ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）。この一部（１０ ｍｌ）をフェニルセファロース（ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ）高速ＨＩＣゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（直径１０×５ ｃｍ， ２００ ｍｌ）に入れて、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）濃縮液の濃度が１０ ｍｌ／分で減少してゆく勾配（１．７−０．０ Ｍ）を用いて分離した。画分（１０ ｍｌ）を集めてキシラナーゼ活性を測定した。

ＨＩＣによって、キシラナーゼ活性の主要なピークが２つ示された。Ａと名づけた第１のピークは、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度が約０．６ Ｍに減少したときにカラムから溶出し、Ｂと名づけた第２のピークは、約０．２５ Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度で溶出した。各注入液のピークＡおよびＢを含む画分を別々にまとめた。Ａの全画分は全キシラナーゼ活性の２．８％であったのに対して、画分Ｂは、全キシラナーゼ活性の ９７．２％に相当した。収率は７７％であった。

イオン交換クロマトグラフィー
ＨＩＣのピークＡおよびＢについてまとめた画分を、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度を１００％に飽和するまで増加して沈殿させた後に遠心分離した（１００００×ｇで３０分間）。２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０／０．０４％ アジ化ナトリウムに沈殿を溶解させてから、ＰＤ−１０カラムを用いて、カラムと同じになるまで脱塩した。サンプル（５ ｍｌ）を、予め、２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０／０．０４％ アジ化ナトリウムで平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ（登録商標）ＨＲ １０／１０陰イオン交換カラム（ファルマシア社）にかけて、同一の緩衝液の中で塩化ナトリウムの濃度を増加して（ＮａＣｌ ０−１ Ｍ）、２ ｍｌ／分で溶出した。画分（２ ｍｌ）を集めて、キシラナーゼ活性を測定した。

ピークＡ：
陰イオン交換クロマトグラフィーによるピークＡの分離では、０．３ Ｍ ＮａＣｌのところで溶出した単一のキシラナーゼ活性ピークが得られた。もっとも活性の強い画分を集めて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって解析した。これでは、分子量約４８ ｋＤａの一本の主要バンドが示された。ＩＥＦ（等電点電気泳動）の後でキシラナーゼ活性が回収されたことから、この主要なクーマシー染色バンドがキシラナーゼであることが確認された。

ピークＢ：
陰イオン交換クロマトグラフィーによるピークＢの分離では、主なキシラナーゼ活性ピークが２つ得られ、１つはボイド（非結合物質；ピークＢ−Ｉ）に溶出し、残りは、０．１ Ｍ ＮａＣｌ（ピークＢ−ＩＩ）のところで溶出した。また、０．１３ Ｍ と０．１９ Ｍ ＮａＣｌのところに溶出する２つの小さなピークがあった。各ピークに対応する活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析したが、どのサンプルも純粋なものではなかった。

ゲル濾過クロマトグラフィー
Ｂ−ＩおよびＢ−ＩＩを含むプール画分を凍結乾燥させ、水に溶解して、（ＰＤ−１０カラムを用いて）脱塩した。サンプル（０．２ ｍｌ）をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）（登録商標）７５ ＨＲカラム（ファルマシア社）に入れて、２０ ｍＭビス−トリス緩衝液、ｐＨ ６．０／０．２ Ｍ ＮａＣｌ／０．０４％アジ化ナトリウムによって０．４ ｍｌ／分で溶出した。画分（０．４ ｍｌ）を集めて、キシラナーゼ活性を測定した。

３．２．キシラナーゼの性質
３．２．１．等電点電気泳動による等電点
タンパク質の等電点を、ＮＯＶＥＸのｐＨ ３−１０およびｐＨ ３−７の既製の垂直５％ポリアクリルアミドゲルなど、既製の垂直５％ポリアクリルアミドゲルを用いた、標準的な方法によって測定する。ＮＯＶＥＸの陰極と陽極、およびＩＥＦサンプル緩衝液、等電点、固定、クーマシーＲ−２５０ブルー染色液による染色、および脱色のための標準プロトコールを用いる。

キシラナーゼＡについては、ＭｏｎｏＱ後のサンプルを用いた。キシラナーゼＢ−ＩおよびＢ−ＩＩについては、ＨＩＣ後のサンプルのキシラナーゼＢを用いた。ＡおよびＢのそれぞれについて、少量のサンプル（１０μｌ）を１つのウエルに入れ、大量のサンプル（５０μｌ）を３倍のウエルの中に入れた。サンプルを等電点電気泳動した後、片方が２種類の少量のサンプル（Ａ＋Ｂ）と分子量マーカーを含み（この部分をクーマシーで染色した）、もう片方が２種類の大量サンプルを含むようにゲルを半分に切った。大量サンプルを含む側のゲルを切って、２本のサンプルのレーンに分けてから、各レーンを２ ｍｍ断片に分画した。２ ｍｍ断片のそれぞれを別々に、１００ ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ ６．０／０．０４％ アジ化ナトリウムの中に一晩浸漬した。

キシラナーゼサンプルＡでは、染色したＩＥＦゲルに、ｐＩ ３．５５マーカーのところに一本の主要バンドと、いくつかの薄い混入バンドが現れた。キシラナーゼ活性は、このバンドに相当する画分にだけ見られ、キシラナーゼの主要バンドであることが確認された。

キシラナーゼサンプルＢでは、染色したＩＥＦゲルに、広い範囲のｐＩ値にわたっていくつかのバンドが示された。キシラナーゼ活性が、ｐＩ ４．２と４．８のタンパク質に対応する、染色していないゲルの２つの別々の画分に存在した。

３．２．２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
ＨＩＣのピークＢにおけるキシラナーゼの分子量を確認するために、キシラナーゼ活性をもつ画分をＩＥＦゲルから溶出し、脱塩、凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。還元剤としてサンプル緩衝液の中に含まれたジチオスレイトール（ＤＴＴ ５０ ｍＭ）とともに、１０％トリス−グリシンゲル（ＮＯＶＥＸ）を用いて、変性ＰＡＧＥを行なった。

ゲル染色によって、どちらのキシラナーゼも純粋で、キシラナーゼＢ−ＩおよびＢ−ＩＩのそれぞれについて、３６ ｋＤａと１５ ｋＤａという分子量をもっていた。

精製された３つのキシラナーゼすべて、すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィー後のキシラナーゼＡ、ゲル濾過クロマトグラフィー後のキシラナーゼＢ−ＩおよびＢ−ＩＩにＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行なった。キシラナーゼＡは、分子量４８ ｋＤａの単一のバンドを生じた。キシラナーゼＢ−Ｉは、クーマシー染色後一本の主要バンドと４本の弱いバンドを示した。この主要バンドは分子量３６ ｋＤａであったため、主要なバンドはキシラナーゼであると確認された。精製度は９０％であると評価されている。キシラナーゼＢ−ＩＩは、１５ ｋＤａの主要バンドと２−３本の弱いバンドを生じた。このキシラナーゼの精製度は約９５％である。

３．２．３．酵素活性
酵素活性を測定するための試験については以前に説明した。

３．２．３．１ キシラナーゼＡの解析
［タンパク質］ ０．４（ｍｇ／ｍｌ）

３．２．３．２ キシラナーゼＢ−Ｉの解析
［タンパク質］０．０９６（ｍｇ／ｍｌ）

３．２．３．３ キシラナーゼＢ−ＩＩの解析
［タンパク質］０．１６５（ｍｇ／ｍｌ）

３．２．４ 配列
本発明の１つの実施形態は、上記のタンパク質またはそれらの変異体のアミノ酸配列および塩基配列に関する。

このために、精製したタンパク質（キシラナーゼＡ、キシラナーゼＢ−ＩおよびＢ−ＩＩ）のアミノ酸配列、および、既知の菌類のキシラナーゼのアミノ酸配列および塩基配列を比較して、キシラナーゼの配列を同定した。

本発明に関して、変異体とは、天然のタンパク質またはポリペプチドのポリペプチドまたはタンパク質の類似体、タンパク質断片、派生タンパク質、または突然変異したタンパク質で、該天然タンパク質またはポリペプチドと同一の生物学的機能をもつものを意味するものと理解されている。天然の状態でさまざまな変異体が存在する。これらの変異体は、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子の配列の違う点に特徴のある対立遺伝子変異や、異なったスプライシング、または転写後修飾からできることがある。変異体は、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または修飾によって得ることができる。すべての修飾についてはよく知られており、当業者に既知の方法によって行なうことができる。

変異体は、例えば、基質に対してより高い親和性を持っていたり、新しい生物学的性質を持っている。

また、本発明のもう１つの目的は、単細胞生物または多細胞生物の宿主細胞で、開示されたタンパク質またはポリペプチドを発現させるために、この配列を使用することである。この目的のために、ベクターのゲノムの中に該配列を含ませることができる。該ベクターは、プラスミド、ファージまたはウイルスであろう。したがって、本発明のもう１つの実施形態は、上述のベクターによって形質転換された、単細胞生物または多細胞生物から単離された宿主細胞である。好ましい実施形態において、宿主細胞はバクテリアである。

開示されているタンパク質の塩基配列を含む該ベクターを、宿主細胞の中で該タンパク質の発現のために使用することが、本発明のもう１つの実施形態である。

３．２．４．１ キシラナーゼＣの配列
既知の菌類キシラナーゼのアミノ酸および塩基の配列との比較に基づいてプローブを作製した。保存領域を同定し、それを用いてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍのゲノミックライブラリーのスクリーニングに用いるＰＣＲプライマーを設計した。

２組の縮重プライマーを作製した。第１の組は、Ｂ型（または２型）キシラナーゼ遺伝子からの２００ 塩基対（ｐｂ）（およそ）の生産物を増幅するために設計した。第２の組は、Ａ型（または１型）キシラナーゼ遺伝子からの２５０ ｂｐの生産物を増幅するために設計した。

プライマー３と４によって、２５８ ｂｐのバンドができた。ｐＧＥＭＴにクローニングした後、これを配列決定したところ、菌類のＡ／１型キシラナーゼに対して有意な配列類似性をもつことが分かった。クローニングした生産物を含むプラスミドには、ｐＰＦＸＹＬＡという名前が付いている。

キシラナーゼＣの全長配列を図１および配列番号：１に示す。

３．２．４．２ キシラナーゼＢＩの配列
他の菌類セロビオヒドロラーゼとの配列アラインメントとともに、内部のアミノ酸配列を用いて、縮重ＰＣＲプライマー（配列番号：２および３）を設計した。２９０ ｂｐの生産物（配列番号：４）を増幅し、ｐＧＥＭＴ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングして、ｐＧＥＭＴＣＢ２を作製して配列決定した。図２に示されているように、プライマーの配列に下線が付されている。このＰＣＲ生産物が現在のところ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ１３４７５６のゲノミックライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いられている。

３．２．４．３ キシラナーゼＢＩＩの配列
キシラナーゼＢＩＩ遺伝子の配列はすべて、１．３ ｋｂの５’非翻訳上流領域、０．８５ ｋｂの３’非翻訳領域、５４ ｂｐのイントロン、および２２３アミノ酸のタンパク質をコードする、６６９ ｂｐの塩基配列とを含んでいる。

逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、５４ ｂｐのイントロンが存在することが証明された。１％（ｗ／ｖ）オートスペルトキシラン上で４日間増殖させてから回収したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ１３４７５６培養菌の菌糸から全ＲＮＡを単離した。プライマーを設計して、メッセンジャーＲＮＡから１９５ ｂｐ（ゲノムＤＮＡでは２４９ ｂｐ）と４３３ ｂｐ（ゲノムＤＮＡでは４８７ ｂｐ）の断片を増幅した。

プラスミド（ｐＰＦＸＹＮＣ２）の３’末端側の３ ｋｂの配列決定によって、２つの推定イントロンを含み、約５７０アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子（ｐｅｒ Ａと命名した）の存在が明らかになった。このポリペプチドは、菌類のパーミアーゼアミノ酸に対して有意な配列類似性を示した。

３．２．４．４ キシラナーゼＡの配列
キシラナーゼＡの内部配列を得られたが、次のアミノ酸配列によって代表される：
ＡＥＡＩＮＹＮＱＤＹ
３．３ フェルロイルエステラーゼの性質
３．３．１ 精製
キシラナーゼと同じ方法にしたがって行なった。

酵素混合物には、少なくとも２つの異なるフェルロイルエステラーゼが含まれている。このうちの１つ（ＦａｅＢ）は、質量分析によると、３８，９４５−４１，０５１ Ｄａの分子量をもっている（アミノ酸の一次構造からは３５，４５０ Ｄａ、また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは３７ ｋＤａ）。ＦａｅＢは、ｐＩが４．２で、Ｂ型フェルロイルエステラーゼであり、ＭｐＣＡとＡｒａ_２Ｆ基質に対して特異性がある（ＭｐＣＡ、ＭＣＡ、ＭＦＡおよびＡｒａ_２Ｆに対する活性；しかし、ＭＳＡとＦＡＸＸに対する活性はない）。

もう１つのフェルロイルエステラーゼ（ＦａｅＡ）は、２９ ｋＤａの分子量をもつ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。ＦａｅＢは、ｐＩが４．６５で、Ａ型フェルロイルエステラーゼであり、ＦＡＸＸとＭＳＡ基質に対して特異性がある（ＭＳＡ、ＭＣＡ、ＭＦＡおよびＦＡＸＸに対して活性、しかし、ＭｐＣＡとＡｒａ_２対する活性はない）。

３．３．２．等電点電気泳動による等電点
常法によって、タンパク質の等電点を測定する。酵素混合物を幅広のストリップ（約２０ ｍｍ）としてＩＥＦゲルに充填して、低温（５℃）で電気泳動した。等電点電気泳動してバンドをはっきりとさせた後、サンプルレーンの真ん中でゲルを切った。サンプルレーンの片方の半分とＩＥＦ分子量標準を固定し、標準的な方法によって染色および脱染色を行なった。残りの半分のレーンを２ ｍｍ幅の切片に切断して、それぞれの切片を１ ｍｌの１００ ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ ６．０の中に一晩浸漬した。ＭＦＡ、ＭｐＣＡおよびＭＳＡを基質に用いて、各ゲル切片についてフェルロイルエステラーゼの活性を測定した。

染色したＩＥＦゲルは、高い酸性（ｐＩ ２．４）からｐＩ ７の範囲のｐＩをもつセルラーゼには、非常にたくさんのタンパク質が存在することを示している。ほとんどのタンパク質は酸性である（ｐＩ範囲２．４−５）。ゲルから切り出された画分の中に、フェルロイルエステラーゼ活性の２つのピークを検出した。１つはＦａｅＢに相当するが、ｐＩが４．２で、ＭＦＡとＭｐＣＡにだけ活性を示す（ＭＳＡには示さない）。もう１つは、ＦａｅＡに対応するが、ｐＩが４．６５で、３つの基質すべてに活性をもっていた。

３．３．３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
１０％トリス−グリシンゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量を解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動して、固定し、クーマシーブルー染色し、標準的なプロトコールを用いて脱染した。

この酵素混合物は、少なくとも２つの異なるフェルロイルエステラーゼを含んでいる。ＦａｅＢ（ｐＩ ４．２）に対応する方は、分子量が３７ ｋＤａである。もう１つは、ＦａｅＡ（ｐＩ ４．６５）に対応するが、分子量が２９ ｋＤａである。

ＦａｅＢの分子量は、アミノ酸の一次配列からは３４，４５０ Ｄａと見積もられており、質量分析によれば３８，９４５−４１，０５１ Ｄａである。

３．３．４ フェルロイルエステラーゼの活性
質量分析法を用いて、酵素混合物についてのフェルロイルエステラーゼ活性の測定を行なった。

酵素混合物には、試験したすべての基質に対する活性が含まれている。メチルエステルについては、ＭｐＣＡに対する活性がもっとも高く、ＭＳＡに対する活性が最も低い。Ａｒａ_２ＦとＦＡＸＸに対する活性が、その他のメチルエステラーゼに対する活性よりも高いが、このことは、このエステラーゼ活性が真のフェルロイルエステラーゼによるものであって、一般的なエステラーゼや、細胞壁を分解する他のエステラーゼ（例えば、アセチルキシランエステラーゼ、ペクチンエステラーゼ）の副作用によらないことを示している。

３．３．５ 配列
３．３．５．１ ＦＥＡ−Ａの配列
精製タンパク質のトリプシン分解によって得られた内部アミノ酸配列は以下に示すとおりであった：
配列１
ＱＹＴＬＴＬＰＳＮＹＮＰＮＫ
配列２
ＡＶＡＶＭＳＧＡＮＬ
配列３
ＴＥＹＳＧ（Ｃ／Ａ）ＤＳＥＨＰＶＷＷＩＡＦＤＧＰ
配列４
ＤＴＦＶＫＤＤＨＣＴＰＴＮＰＰＡＰＡＡＧＳＧＴＨＩＫＹＶ

精製タンパク質から得られたアミノ酸配列から、縮重ＰＣＲプライマーを設計した。多くの生産物をｐＧＥＭＴ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。

ｐＧＥＭＴＤ１９と名付けたプラスミド（１８０ ｂｐ）（図３）が、上記のペプチド配列４として認識されうる配列を含むことがＰＣＲによって判明した。図３に示すように、プライマーの配列を二重下線で、以前から既知の配列を下線で示した。

ＦＥＡ−Ａの塩基配列とアミノ酸配列を配列番号：５に開示する。

３．３．５．２ ＦＥＡ−Ｂの配列
ＦＥＡ−Ｂのペプチド配列から設計したプライマーを用いてプローブを増幅し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍのゲノミックライブラリーをスクリーニングするのに用いた。２２９１ ｂｐのクローンを単離して配列を決定した（配列番号：６）。３０４アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子には、イントロンが１つある。推定されるアミノ酸配列を図４に示し、成熟タンパク質（成熟タンパク質の長さ＝３３８）を太字で示す。このタンパク質は、高度にグリコシル化されたリンカーによって隔てられている２つの異なるドメインを含んでいる。図４では、触媒ドメインを太字で示し、結合ドメインを太字の二重下線で、また、リンカーを太字の点線で表している。

このタンパク質は、次の推定触媒３残基をもつ、図４の下線で示された推定活性部位のモチーフ（セリン＝求核基）によっても特徴づけられる。

（１）Ｓ１３６／Ｄ１７４／Ｈ２１６
（２）Ｓ１３６／Ｄ２２０／Ｈ２７６
ＦＥＡ−Ｂタンパク質は、分泌配列（３５３）と１０個のシステインを含む。

３．４ グルカナーゼの性質
酵素混合物の２Ｄゲル電気泳動を行なった。ノベックス社（ＮＯＶＥＸ）製 ＸＣｅｌｌ ＩＩ（登録商標）ミニセルにおいて、ノベックス社（ＮＯＶＥＸ）から購入したｐＨ ３−７（ｐＩ実効範囲３．０−６．５）の既製の垂直５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＩＥＦを行なった。ＮＯＶＥＸの陰極と陽極、および、ｐＨ ３−７のためのＩＥＦサンプル緩衝液を用い、等電点電気泳動用のノベックス社（ＮＯＶＥＸ）の標準的なプロトコールを用いる。１レーン切り出し、１０％レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて２次元で電気泳動を行なった。２番目のレーンをゲルから切り出して、３５個の画分に分けて、ゲル切片を緩衝液に浸漬し、各画分の酵素活性を測定した。３番目のレーンはゲルに残しておき、固定して、クーマシーＲ−２５０ブルー染色液によって染色し、ＮＯＶＥＸ標準プロトコールを用いて脱染した。

ｐＩ ４．２、Ｍ．Ｗ． ３６ ｋＤａおよびｐＩ ５．４、Ｍ．Ｗ． ２７ ｋＤａをもつタンパク質に対応する画分において、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（ＤＮＳオオムギβ−グルカン法）およびセルラーゼ（ＤＮＳ ＣＭＣ法）の有意な活性が見られた。画分の１つに存在するキシラナーゼＢ−Ｉを除去するために、ＤＮＳカバノキキシラン法を用いて画分の活性を調べた。β−グルカナーゼまたはセルラーゼの活性に相当する画分で、キシラナーゼ活性が検出された。

Ｅ．動物を飼育するための酵素混合物の使用
実施例１：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物の、ブロイラーの小麦−大麦混合飼料のエネルギー値（ＡＭＥ_Ｎ）に対する有効性の評価
この目的は、５０％の小麦および２２％の大麦を含む飼料の窒素出納（ＡＭＥ_Ｎ）についての補正を行なった、見かけの代謝可能エネルギーに対する酵素の有効性（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）を明らかにすることである。随意の給餌を行ない、１８日齢と２１日齢の間に排泄物を集める欧州標準法（Ｂｏｕｒｄｉｌｌｏｎら、１９９０）を用いて、対照と酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）についての実験を行なった。

ａ．材料と方法
鳥：交配と交配条件
１日目のオスのロス（Ｒｏｓｓ）ブロイラーを、１２日齢になるまで集合バタリーケージの中で飼育する。標準的なスターター飼料で飼育する。１２日目に、鳥の重さを量り、処理毎にそれぞれのケージ１０個の中に同じ数になるように分配し、馴化期間（最低５日間）の間は実験用飼料を与えた。

標準的な温度および湿度プログラムを適用する。照明プログラムは、実験が終わるまで２３時間一定の照明を行い、１時間暗黒とするものである。

餌：鳥には、１日齢から１２日齢までスターター飼料を与えてから、実験用飼料を与えた。

実験用飼料
飼料には、５０％の小麦および２２％の大麦が含まれていた（表１．１）。２０ ｋｇのクランブルに酵素調製物をスプレーした。

飼料中の酵素回収量を粘度測定法（ＳａｂａｔｉｅｒとＦｉｓｈ、１９９６）によって測定する。

代謝可能エネルギーの測定
次の手順にしたがって、１８日目に出納を開始した。

１７日目、鳥を一晩絶食させた；
１８日目、鳥の体重を測り、清潔な採集用トレイの上に置く；
１９日目、糞便を集めて凍らせる；
２０日目、糞便を集めて凍らせ、一晩絶食させる；
２１日目、糞便を集めて凍らせる。鳥の体重を測り、再飼育する。

そして、糞便を凍結乾燥させてから餌のように磨砕する（１ ｍｍ、レッチ（Ｒｅｔｓｃｈ）グラインダー）。飼料と排泄物のエネルギー総量を、ＩＫＡ ５０００断熱性カロリー計で測定する。タンパク質（Ｎ^＊６．２５、ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）Ｚ１３０法）と脂肪（Ｚ１６０法）含量も測定する。得られた体重の１８％のタンパク質を用いて、窒素出納に対する補正を行なった。

ｂ．結果および考察
窒素出納（ＡＭＥ_Ｎ）について補正した見かけの代謝可能エネルギー
畜産学的な結果と代謝可能エネルギーを表１．２に示す。処理間における畜産学的な結果に差異はなかった。

成長中のブロイラーでは、酵素調製物によって、５０％の小麦および２２％の大麦を主原料とする飼料のＡＭＥ_Ｎが６．２％（＋２０４ ｋｃａｌ／ｋｇ ＤＭ（乾燥物））向上した。さらに、エネルギー消化性の変化が８０から６２ ｋｃａｌ．ｋｇ ＤＭまで減少した。

この大きな改善によって、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍが、小麦と大麦のデンプン以外の可溶性多糖類を加水分解するために産生する２つの活性（キシラナーゼとβ−グルカナーゼ）の長所が明らかになる。

実施例２：小麦で飼育したブロイラーに対する、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物の効果
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）の、５４％の小麦を含む飼料で飼育したブロイラーにおけるタンパク質と脂質の消化性である見かけの代謝可能エネルギー（ＡＭＥ）に対する効果を測定するために実験を行なった。磨砕との相関も調査した。

欧州標準法（Ｂｏｕｒｄｉｌｌｏｎら、１９９０）（随意の給餌を行ない、１８日齢から２１日齢の間に排泄物を集める）にしたがった
（１）対照１（５４％挽いた小麦粉）
（２）対照１＋酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）
（３）対照２（３０％全粒粉、２４％挽いた小麦粉）
（４）対照２＋酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）。

ａ．材料と方法
鳥：交配と交配条件
１日目のオスのロス（Ｒｏｓｓ）ニワトリを、１２日齢になるまで集合バタリーケージの中で飼育する。そして、消化出納をとるために各バテリーケージに移す。

標準的な温度および湿度プログラムを使用する。照明プログラムは、８日齢になるまで２３時間照明を行ない、１時間暗黒とするものである。それから、同じ建物の中で覆いを重ねることを繰り返すことによって、１５時間３０分間照明、８時間３０分間暗黒にした。

餌：鳥には、１日齢から１２日齢までスターター飼料を与えてから、実験用飼料を与えた。

実験用飼料
飼料には、５４％の小麦が含まれていた。特徴を表２．１に示す。飼料の組成を表２．２に示す。

見かけの代謝可能エネルギーの測定
次の日程にしたがって、１７日目に出納を開始した。

１７日目、鳥を一晩絶食させた；
１８日目、鳥の体重を測り、清潔な採集用トレイの上に置く；
１９日目、糞便を集めて凍らせる；
２０日目、糞便を集めて凍らせ、一晩絶食させる；
２１日目、糞便を集めて凍らせる。鳥の体重を測り、再飼育する。

そして、糞便を凍結乾燥させてから餌のように磨砕する（１ ｍｍ、レッチ（Ｒｅｔｓｃｈ）グラインダー）。飼料と排泄物のエネルギー総量を、ＩＫＡ ５０００断熱性カロリー計で測定する。タンパク質（飼料についてはＮ^＊６．２５、ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）Ｚ１３０法、糞便についてはＺ１３５法）と脂質（Ｚ１６０法）の含量も測定する。

ＨＰＬＣ（飼料についてはＺ１００法、糞便についてはＺ０８０法）によってアミノ酸プロファイルも調べた。ＡＦＮＯＲ法（ＮＦＶ１８−１０６）を用いて、飼料と排泄物のリン含量を測定した。

ｂ．結果および考察
見かけの代謝可能エネルギー（ＡＭＥ）
成長結果と代謝可能エネルギーのデータを表２．３に示す。３日間にわたって測定したが、各処理の間で結果（体重増加、飼料摂取量）は異ならなかった。５４％の挽いた小麦を含む対照飼料のＡＭＥは３１７３ ｋｃａｌ／ｋｇであった。同一の小麦全量を含むが、３０％が全粒である飼料の代謝可能エネルギーは、理論値と比べて１００ ｋｃａｌ／ｋｇ増加している。さらに、測定された異なる基準の標準偏差によって評価された変異も、全粒小麦では減少している。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）は、５４％の小麦を主原料とする飼料で、小麦のすべてを挽いてある場合には代謝可能エネルギー値が＋３．４％（１２２ ｋｃａｌ／ｋｇ ＤＭ）上昇し、３０％の小麦が全粒で含まれている場合には＋２．７％（１０１ ｋｃａｌ／ｋｇ ＤＭ）上昇する。

栄養分の見かけの消化性（脂質、タンパク質およびアミノ酸）
小麦のすべてを挽くと、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍの酵素調製物による脂質とタンパク質の見かけの消化性が、それぞれ７％と２．７％増加する。小麦の一部を全粒にすると、全体的な栄養の消化性が上昇するために、それぞれ＋３と＋０．６％と増加分が少なくなる。ところで、全粒小麦を含む対照飼料での栄養分の消化性は、挽いた小麦しか含まないが酵素調製物を添加した実験用飼料の消化性と同じであった。

見かけのアミノ酸消化性に対する酵素調製物の効果を表２．４に示す。酵素調製物による改善効果は、すべてを挽いた小麦粉では、平均して＋２．９％、全粒では＋１．１％改善し、見かけのタンパク質消化性に対する効果が確認された。

見かけのリン保持とリン排出
見かけのリン保持に対する酵素調製物の効果を表２．５に示す。酵素調製物を添加することによって、見かけのリン保持は＋８．０％と有意に増加する。

この増加は、他の栄養分に見られる増加（基準によって＋２．９から＋３．５％：ＡＭＥ、タンパク質、脂質、アミノ酸）よりも大きい。したがって、このような増加は、栄養分の消化性が向上したため（キシラナーゼとβ−グルカナーゼの直接の効果）に生じた結果でもあろうが、小麦フィターゼの作用が向上した結果でもあろう。デンプン以外の多糖類を加水分解して、キシラナーゼとβ−グルカナーゼは、小麦の内生フィターゼがフィチン酸に結合しやすくなるようにする。

このように、リンを消化利用が向上すると、リンの排出が減少する。すなわち、体重増加ｋｇあたりのリンｇで表すと、−８％であった。

実施例３：成長中の七面鳥における、小麦を主原料とする飼料のＡＭＥ_Ｎに対する酵素調製物の効果。

このアッセイ法の目的は、次の実験デザインにしたがって、小麦を主原料とする飼料の見かけの代謝可能エネルギー（ＡＭＥ_Ｎ）に対する、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍからの酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）の有効性を明らかにすることである。

（１）対照；
（２）ＥＰ １：酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）；
（３）ＥＰ ２：酵素調製物（β−グルカナーゼの活性：１５０ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１６５０ Ｕ．ｋｇ^−１）；
随意の給餌を行ない、３３日齢と３７日齢の間の排泄物を集める欧州標準法（Ｂｏｕｒｄｉｌｌｏｎら、１９９０）を用いる。

ａ．材料と方法
鳥：交配と交配条件
１日目のオスのＢＵＴ９七面鳥を２０日齢になるまで集合バテリーケージの中で飼育した。その後、少なくとも７日間の馴化期間の後、消化出納をとるために各バテリーケージに移した。

標準的な温度および湿度プログラムを使用した。照明プログラムは、最初の２週間は２３時間一定の照明を行ない、１時間暗黒とするものである。その後実験が終わるまで、照明時間を１５時間に減らし、暗黒を８時間にした。

飼料：鳥には、１日齢から２１日齢までスターター飼料を与えてから、実験用飼料を与えた。

実験用飼料
飼料には、４７％の小麦と３３％大豆粗びき粉が含まれていた（表３．１）。対照飼料の２０ ｋｇのペレットに酵素をスプレーした。

代謝可能エネルギーの測定
２１日目に鳥の体重を測り、各処理あたり、それぞれ１０個のケージに同じ数になるように分配してから、実験用飼料で飼育した。

次の方法にしたがって、３３日目に出納を開始した。

３２日目、鳥を一晩絶食させた；
３３日目、鳥の体重を測り、清潔な採集用トレイの上に置いた［？］；
３４および３５日目、糞便を集めて凍らせた；
３６日目、糞便を集めて凍らせ、一晩絶食させる；
３７日目、糞便を集めて凍らせる。鳥の体重を測り、再飼育する。

次に、糞便を凍結乾燥させてから餌のように磨砕する（１ ｍｍ、レッチ（Ｒｅｔｓｃｈ）グラインダー）。飼料と排泄物のエネルギー総量をＩＫＡ ５０００断熱性カロリー計で測定する。体重増加（ｇ）とその窒素含量（２１％粗タンパク質）を考慮して、窒素出納についてＡＭＥを補正する。

そして、糞便を凍結乾燥させてから餌のように磨砕する（１ ｍｍ、レッチ（Ｒｅｔｓｃｈ）グラインダー）。飼料と排泄物のエネルギー総量を、ＩＫＡ ５０００断熱性カロリー計で測定する。タンパク質（飼料についてはＮ^＊６．２５、ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）Ｚ１３０法、糞便についてはＺ１３５法）の含量も測定し、ＨＰＬＣ（飼料についてはＺ１００法、糞便についてはＺ０８０法）を行なってアミノ酸プロファイルを調べた。

ｂ．結果および考察
畜産学的な結果と代謝可能エネルギーを表３．２に示す。出納を行なっている間、各処理間における成長効果に有意な差異はなかった。

成長中の七面鳥では、酵素調製物によって、小麦を主原料とする飼料のＡＭＥ_Ｎが、ＥＰ １とＥＰ ２のそれぞれについて２．２％と５．４％向上した。

このように大きな改善が観察されたことは、デンプン以外の小麦の多糖類を加水分解して、成長中の七面鳥における小麦のエネルギー値を向上させるための２つの活性（キシラナーゼとβ−グルカナーゼ）で、酵素調製物に含まれている活性に利点があることを示している。

実施例４：成長中のブタにおける、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物の、小麦を主原料とする完全飼料の有効性の評価
目的は、成長中のブタの小腸におけるエネルギー消化に対する、小麦を主原料とする飼料への酵素添加の効果を評価することである。酵素調製物の通常の活性レベルは、キシラナーゼでは１１００ Ｕ．ｋｇ^−１、β−グルカナーゼでは１００ Ｕ．ｋｇ^−１である。

ａ．材料と方法
動物
３種類の飼料と３種類の期間、および各飼育期間当たり２頭のブタについて、ラテン方格法によって処理を試験した。試験期間を通して、ブタの体重にしたがって一定のレベルで飼料を与えた。

実験飼料
品質の劣る小麦を主原料とし、その他の典型的な飼料成分によってバランスをとった飼料で、６頭の成長中のブタを飼育した（表４．１． を参照）。飼料は次のいずれかで飼育した：
１．添加なし（基本飼料）；
２．１×レベル（β−グルカナーゼの活性：１００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：１１００ Ｕ．ｋｇ^−１）の酵素調製物を添加したもの（１）；
３．２×レベル（β−グルカナーゼの活性：２００ Ｕ．ｋｇ^−１、およびキシラナーゼの活性：２２００ Ｕ．ｋｇ^−１）の酵素調製物を添加したもの（２）。

酵素調製物をコーンスターチで希釈してプレミックスを作製して、それを飼料に適量加えることによって正確な量の飼料を投与した。

サンプル収集
ＲＰＮＡ研究所の標準的な方法にしたがって、各週４８時間回腸液を集めた。回腸液のサンプルと試験用飼料のサンプルのエネルギーを、Ｓａｎｄｅｒｓによる爆灼熱量測定法によって解析して消化可能なエネルギーを測定した。必要な場合には、さらに解析を行なうためにサンプルの等量液を保存しておいた。

統計解析
回腸液、飼料、および飼料摂取量の爆灼熱量測定の結果から、粗エネルギーの消化性を計算した。消化性の計算結果について分散分析を行なった。

ｂ．結果と考察
ブタの飼料にキシラナーゼを添加することによって、エネルギー消化性が少なくとも６％増加した。このことは、この酵素が原料（特に、小麦）の細胞壁の分解と、小腸における付加的なエネルギーの放出を促進することを示している。

実施例５：反芻動物における、藁、トウモロコシのサイレージ、干し草および草のサイレージ飼料の効率に対する、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物の効果。

ＨＦＴ試験（Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｕｔｔｅｒｗｅｒｔｅｓｔｅｎ， Ｍｅｎｋｅら、１９７９、１９８８）は、緩衝したルーメン液の中の飼料材料の発酵によって産生される気体容量によって原料の分解を測定できるインビトロのインキュベーション試験法である。

ａ．材料と方法
２００ ｍｇの乾燥して磨砕した基質を、１０ ｍｌのルーメン液に２０ ｍｌの緩衝液を加えたものをシリンジに入れて、温度調節したインキュベーター（３９℃）の中でローターでゆっくり撹拌しながらインキュベートした。産生された気体の容量を２４時間後に記録した。ブランク（基質なし）、標準的な干し草対照、および標準的な濃度対照（気体産生の正味容量の既知の値をもつ）を用いて結果を補正し、２４時間で産生された気体の正味容量を計算する。２４時間で産生された気体容量、およびＭｅｎｋｅら（１９８８）によって提唱された予測式を用いて、基質のエネルギー値とＯＭＤ（有機物の消化率）を計算する。

ルーメンにカニューレを挿入し、午前８時と午後７時に、６ ｋｇの干し草と２ ｋｇの濃縮液からなる（比率７５／２５）配合飼料を与えた２頭の痰を吐かない牛からルーメン液を採集する。ルーメン液の採集は、午前の給餌の直前に行なう。ルーメン液を濾過して、食物の粒子が通過しないようにして、厳密に嫌気的な条件を維持する。

この実験の目的は、ＨＦＴインキュベーションの１５時間前に酵素調製物を飼い葉に施用することの効果を調べることであった。

酵素調製物による前処理：床の上の藁、トウモロコシのサイレージ、干し草および草のサイレージなどの飼い葉に酵素溶液をスプレーする。スプレーは、１ ｍｌの酵素調製物を２ ｋｇの飼い葉乾燥物の上に行なう。サンプルの均一性を向上させるために、縁（約１０ ｃｍ）にある飼い葉を除く。処理後、飼い葉を手で混ぜて、スプレーしてから１５時間室温で放置する。１回のシリーズを通して酵素調製物に接触させた１５時間後にＨＦＴインキュベーションを行ない、各処理ごとに６回反復する。

ｂ．結果と考察
藁、トウモロコシのサイレージ、干し草および草のサイレージについて、２４時間後の正味気体容量を表５．１に示す。

前処理によって、藁にセルラーゼを施用すると、対照に対して、気体の正味容量が１８％増加する。この増加量は、トウモロコシのサイレージでは８％、干し草のサイレージでは９．５％、また、草のサイレージで９％である。

前処理前後のさまざまな飼い葉についてのＯＭＤを表５．２に示す。対照と比べると、藁、トウモロコシのサイレージ、干し草および草のサイレージでのＯＭ消化率の向上率はそれぞれ、藁、８．５％、トウモロコシのサイレージ、５％、干し草のサイレージ、５．４％、および草のサイレージ５％である。

飼い葉（藁、トウモロコシのサイレージ、干し草および草のサイレージ）を酵素調製物で１５時間前処理すると、ルーメン基質のインキュベーション強度と基質のＯＭ消化率とが向上する。

実施例６：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍによって産生される酵素調製物の、小麦または大麦で飼育した産卵鶏の生産性に対する効果
本実験の目的は、小麦または大麦を主原料にした飼料で飼育した産卵鶏の生産性パラメータに対する酵素調製物添加の効果を評価することであった。

ａ．材料と方法
実験設計：４種類の処理×８回反復×５個のケージ×３羽のニワトリ
処理：１．対照１：６０％小麦
２．対照１＋酵素調製物
３．対照２：６０％大麦
４．対照２＋酵素調製物
動物、収容、管理
４８０羽のＨｙ−Ｌｉｎｅ系統の茶色のニワトリに対して実験を行なった。各反復区は、同じ給餌器がついた５個の囲いで構成されていた。すなわち、それぞれ１５羽からなる全部で３２の反復区で構成されていた。２つの同じような部屋に分配して、反復区にプログラムされた照明と換気を行なった。１７週齢のメンドリが到着した日から、１日１４時間の照明プログラムを開始し、２週間おきに３０分ずつ時間を延長し、最大１日１７時間の照明にまでもって行った。実験開始時にはメンドリは２２週齢で、産卵期間の最初の５ヶ月間生存させた。

飼料と飼育
６０％小麦（飼料１）、および６０％大麦（飼料２）と、１０％のヒマワリ粗びき粉を主原料とする２種類の実験用飼料があった。これらの組成を表６．１に示す。穀類の特性を表６．２に示す。

対照
化学分析：
・飼料サンプル
乾物、粗タンパク質、粗脂質、および灰分を分析して、実験用飼料の品質管理を行なった。キシラナーゼ活性（Ｔ−１、Ｔ−２）とβ−グルカナーゼ活性（Ｔ−３、Ｔ−４）は、すりつぶした飼料で測定した。

・測定
飼料消費と飼料効率を４週間ごとに記録した。実験の最初と最後にメンドリの体重を測定した。それぞれ４週間からなる５つの期間中、産卵数、卵の重さ、および汚れた卵や欠陥のある卵を毎日記録した。死亡数を調べて、死亡原因とともに毎日記録した。

ｂ．結果と考察
生産性試験
試験期間中に得られた生産性パラメータを表６．３から６．５に示す。最初の２期間（２２週から３０週）と、実験の全期間で、統計的に、汚れた卵の割合は処理による影響を受けていた（Ｐ＞０．００５）。酵素なしの小麦で飼育した動物は、より多くの汚れた卵を産卵した。処理区間の統計的な有意差は、第２期から実験が終わるまで、産卵率（Ｐ＞０．００５）と卵の重さ（Ｐ＞０．００５）で見られた。大麦で飼育された動物は、小麦で飼育された動物よりも産卵率が高く、また、重い卵を産んだ。酵素調製物は、これらのパラメータを増加させるように見えるが、統計的に確率の０．０５レベルではなかった。

実験期間のすべてにおいて、両飼料のエネルギー量の違いによって（大麦飼料は、２６００ ｋｃａｌ／ｋｇのエネルギー量になるよう調製されたが、小麦飼料は２８００ ｋｃａｌ／ｋｇを含んでいた）、処理区Ｔ−３およびＴ−４（大麦飼料）の動物の飼料摂取量は、小麦飼料で飼育した動物の飼料消費量よりも高かった。全期間における２つのタイプの飼料のエネルギー値の違いと、動物による飼料消費量を考え合わせると、すべての動物の１日当たりのエネルギー消費量は同じであることが分かる。

最初の期間における産卵率は低いために、この期間における実験用飼料の飼料効率（飼料のｇ数／卵のｇ数）は非常に高かった。最初の２つの期間で、小麦処理に関する飼料効率は、大麦処理で得られた飼料効率よりも良好であったが、第３期になって、最も高い産卵率が記録されるようになると、どちらのタイプの飼料でも同様の効率が示された。３４週目から実験が終わるまで、大麦飼料は、小麦で処理したものよりも高い飼料効率を示した。酵素は、飼料効率を向上させる傾向にある（Ｐ＞０．００５）。全期間にわたって、β−グルカナーゼは、大麦飼料の飼料効率を向上させた（Ｐ＝０．０６６で）。

表６．４は、酵素調製物を添加した小麦飼料で飼育した産卵鶏は、添加なしで飼育したものよりも高い産卵率（＋１．５絶対値）、平均卵重（＋０．３７ ｇ）、および低い飼料転換率（−２．７％）を示す傾向にあることが分かる。

表６．５は、酵素調製物を大麦に添加することによって、対照大麦飼料で飼育したものに比べ、産卵率（＋４％）、平均卵重（＋０．７％）、および飼料転換率（−５．７％）が向上していることが分かる。

文献
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Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍキシラナーゼＣタンパク質のアミノ酸配列。 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍキシラナーゼＣタンパク質のアミノ酸配列。 キシラナーゼＢＩ（ＸｎｙＢＩ）ＰＣＲ生産物の塩基配列とアミノ酸配列。 フェルロイルエステラーゼＡ（ｆａｅＡ）ＰＣＲ生産物の塩基配列とアミノ酸配列。 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍフェルロイルエステラーゼＢ（ｆａｅＢ）タンパク質（ＦＡＥ−ＶまたはＦＡＥ−Ｉ）のアミノ酸配列。

Claims (13)

1. セルラーゼ、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを含む酵素の混合物を含む醗酵培地を製造する方法であって、ブダペスト条約の下にＩＭＩ番号３７８５３６として寄託されたペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）による、当該酵素の混合物を産生する醗酵を含むことを特徴とする、前記方法。
2. 醗酵培地がさらにフェルロイルエステラーゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の醗酵培地の製造方法。
3. 醗酵培地が少なくともエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性およびエンド−１，４−β−キシラナーゼ活性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の醗酵培地の製造方法。
4. 抗微生物剤 ０．００５％から０．３５％、ソルビトール ２０％から５０％、不凍剤 ０から４０％、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ ３７８５３６によって製造された濃縮濾過したセルラーゼ、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを含む酵素の混合物を含む醗酵培地 ０．３から７６％を含む、ｐＨ ３〜５になるよう緩衝調整した液体組成物。
5. 抗微生物剤が、ソルビン酸またはその塩、安息香酸またはその塩、４−ヒドロキシ安息香酸メチル、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、フマル酸、塩類、エステル、塩化ナトリウム、および塩化カリウムから選択される、請求項４に記載の液体組成物。
6. 不凍剤が、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセロールから選択される、請求項４または５に記載の液体組成物。
7. 担体 ５９％から８３％、全有機固形物として全組成物の質量に対して１６から４０％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ ３７８５３６のセルラーゼ、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを含む酵素の混合物を含む乾燥醗酵培地、およびその他のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ＩＭＩ ３７８５３６の乾燥醗酵培地成分 １％を含む粉末組成物。
8. 担体が、小麦粉、澱粉、石膏、マルトデキストリン、トウモロコシ固形物、ならびに、トウモロコシの挽割粉、小麦シャープス、小麦ふすまおよびライ麦のくず殻からなる群から選択される穀物処理から得られる副生産物からなる群から選択される、請求項７に記載の粉末組成物。
9. 家禽、ブタ、反芻動物からなる群から選択される家畜動物を飼育するための、請求項４から８のいずれか一項に記載の生産物の使用。
10. 小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、オート麦およびイネからなる群から選択される穀物；大豆、ヒマワリ、ナタネからなる群から選択される油糧種子；および小麦ふすまからなる群から選択される穀物の副生産物の消化性を高めるための、請求項９に記載の生産物の使用。
11. リンの排泄を減少させるための、請求項４から８のいずれか一項に記載の生産物の使用。
12. リンの消化による利用性を高めるための、請求項４から８のいずれか一項に記載の生産物の使用。
13. バタリーの空気中のアンモニアを減少させるための、請求項４から８のいずれかに記載の生産物の使用。

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