BRPI1012166B1 - complexo de enzimas com atividade de beta 1,4-endoglucano hidrolase, seu uso e seu processo de produção - Google Patents

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Neville Marshall Fish
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Dupont Nutrition Biosciences Aps
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Abstract

COMPLEXO DE ENZIMA A PARTIR DE ENZIMAS DE TRICHODERMA REESEI E P. FUNICOLOSUM, BEM COMO SEUS USOS E PROCESSO PARA SUA PRODUÇÃO. A invenção refere-se a um aperfeiçoado complexo de enzimas tendo uma pluralidade de atividades de enzima de um produto de expressão obtido por fermentação do gênero Trichoderma em combinação com uma ou mais enzimas de uma diferente linhagem de fungo.

Description

TrichodermaComp\exo de Enzima Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a um aperfeiçoado complexo de enzimas tendo uma pluralidade de atividades de enzimas de um produto de expressão obtido por fermentação do gênero Tríchoderma em combinação com uma ou mais enzimas de uma espécie diferente de uma linhagem de fungo.
Antecedentes da Invenção
[0002] O uso de enzimas na produção de cerveja é bem conhecido. Aplicação de enzimas à etapa de formação de decocto para aperfeiçoar capacidade de filtração de decocto e aumentar rendimento de extrato é descrito no WO 97/42302.
[0003] W02005118769 e W02005059084 referem-se a uma etapa de formação de decocto e filtração em um processo para a produção de cerveja, e a composições enzimáticas para uso em um tal processo.
[0004] WO1990057325 refere-se a linhagens de Penicillium funiculosum , para novas misturas de enzimas obtidas das mesmas e seqüências nucléicas para as mesmas.
[0005] Entretanto, há uma necessidade de aperfeiçoados complexos de enzimas úteis na produção de produtos alimentícios, tal como nas etapas de formação de decocto, cozimento e filtração na produção de uma bebida alcoólica, como cerveja ou uísque.
Objeto da Invenção
[0006] É um objeto da presente invenção prover um aperfeiçoado complexo de enzimas permitindo aperfeiçoados processos de produção na preparação de, por exemplo, produtos alimentícios, como nas etapas de formação de decocto, cozimento e/ou filtração na produção de uma bebida alcoólica, tal como cerveja ou uísque, ou um biocombustível.
Sumário da Invenção
[0007] Verificou-se que através de combinação de um produto de expressão obtido através de fermentação de espécies do gênero Trichoderma e específicas enzimas de qualquer uma espécie diferente de um fungo, propriedades aperfeiçoadas do complexo de enzimas são obtidas. Assim, em um primeiro aspecto a presente invenção refere-se a um complexo de enzimas derivado de uma combinação de: a. um produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Trichoderma', e b. uma ou mais enzimas de qualquer uma espécie diferente do reino de fungos selecionados de uma xilanase (EC 3.2.1.8), uma celulase (ECF 3.2.1.4), e uma beta -glucanase (EC 3.2.1.6); e onde pelo menos cerca de 61% da atividade beta-1,4- endoglucano hidrolase como medida através do processo de "Ensaio 1" como aqui descrito são derivados da fermentação do gênero Trichoderma.
[0008] É para ser entendido que "qualquer uma diferente espécie do reino de fungos"refere-se a uma espécie diferente das espécies do gênero Trichoderma em (a). Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um complexo de enzimas derivado de uma combinação de: a. pelo menos cerca de 61% de um produto de expressão obtido através de fermentação do gênero Trichoderma', e b. menos que cerca de 39% de um produto de expressão obtido por fermentação de um diferente fungo do gênero Penicillium', onde as porcentagens são baseadas na atividade beta-1,4- endoglucano como medida pelo processo de "ensaio 1" como aqui descrito.
[0009] Em um terceiro aspecto a presente invenção refere-se a um processo para a produção de um complexo de enzimas, o processo compreendendo as etapas de a. fermentação do gênero Trichodermaem um meio para obter um caldo de fermentação; b. fermentação do gênero Penicillium em um meio para obter um caldo de fermentação, e c. recuperação e combinação de cada complexo de enzimas derivado de etapa a) e b) na forma de um caldo livre de células a partir das ditas fermentações para obter um complexo de enzimas, onde pelo menos cerca de 61 % da atividade beta-1,4-endoglucano hidrolase como medida através do processo de "Ensaio 1" como aqui descrito são derivados da fermentação do gênero Trichoderma.
[00010] Ainda em um aspecto a presente invenção refere-se ao uso de um complexo de enzima de acordo com a invenção, em um processo para produção de um decocto de fabricação de cerveja, tal como na produção de uma bebida de malte, tal como uma cerveja, e/ou em uma produção de uísque e/ou na produção de biocombustível.
[00011] Ainda em um aspecto a presente invenção refere-se ao uso de um complexo de enzimas de acordo com a invenção, na produção de suco de fruta, vinho, processamento de grão, álcool combustível, e álcool de bebidas.
[00012] Ainda em um aspecto a presente invenção refere-se a um complexo de enzima derivado de uma combinação de: a. um produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Trichoderma', e b. uma ou mais enzimas de qualquer uma espécie diferente do reino de fungos selecionada de uma família 11 xilanase (EC 3.2.1.8), uma celulase (EC 3.2.1.4), e uma beta-glucanase (EC 3.2.1.6); e onde pelo menos cerca de 61 da atividade beta-1,4- endoglucano hidrolase como medida através do processo de "Ensaio 1" como aqui descrito são derivados de fermentação do gênero Trichoderma.
Legendas para as figuras
[00013] A figura 1 experimento 1 de farinha de malte amassada em escala de laboratório - beta - glucano decocto de cerveja e volume de filtração.
[00014] figura 2 Experimento 2 farinha de malte amassada em escala de laboratório - volumes de filtração de decocto, beta - glucano residual e dados de figura 3 Dados de viscosidade (em 12°P).
[00015] figura 3 Dados de separação de decocto de grãos de experimento piloto - tempo total de separação de decocto de grãos, taxa de fluxo média e o desenvolvimento de pressão total. A: controle negativo, nenhum controle de enzima; B: LAMINEX® Super em 0,20 kg/ton; C: The LAMINEX® XG (LAMINEX® Super 1.5 + 50% mais atividade T. reesei) em 0,133 kg/ton.
Descrição Detalhada da Invenção
[00016] Cerveja é tradicionalmente referida como uma bebida alcoólica derivada de malte, tal como malte derivado de cevada, e opcionalmente adjuntos, tais como grãos de cereais, e aromatizadas com lúpulos. Incluído no termo "cerveja" é qualquer decocto fermentado, produzido através de preparação de cerveja e fermentação de um material contendo amido, principalmente derivado de grãos de cereais, como cevada maltada. Trigo, milho, e arroz também podem ser usados.
[00017] Como aqui usado, o termo "bebida de malte" inclui tais bebidas de malte fermentadas formadoras de espuma tais como cerveja maltada, cerveja, cerveja seca, cerveja próxima, cerveja leve, cerveja de baixo teor alcoólico, cerveja de baixo teor de calorias, porter, cerveja bock, cerveja preta, licor de malte, licor de malte não alcoólico e semelhantes. O termo "bebidas de malte" também inclui cerveja não espumante e bebidas de malte alternativas como bebidas de malte aromatizadas com frutas, por exemplo, aromatizadas com citrus, como limão, laranja, lima, ou bebidas de malte aromatizadas com bagas, bebidas de malte aromatizadas com licor, por exemplo, licor de malte aromatizado com vodka, rum ou tequila, ou bebidas de malte aromatizadas com café, como licor de malte aromatizado com cafeína, e semelhantes.
[00018] Cerveja pode ser fabricada a partir de uma variedade de grãos através de essencialmente o mesmo processo. Todos os amidos de grãos são homopolímeros de glicose nos quais os resíduos glicose estão ligados por ligações alfa-1,4- ou alfa-1,6, com a primeira predominando.
[00019] O processo de fabricação de bebidas de malte fermentadas é comumente referido como fabricação de cerveja. Os principais materiais brutos usados na fabricação destas bebidas s]ao água, lúpulos e malte. Em adição, adjuntos tais como grãos de milho comuns, grãos de milho refinados, levedura moída de cervejeiro, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal torrado, flocos de cereais, centeio, aveias, batata, tapioca, e xaropes, como xarope de milho, xarope de cana-de-açúcar, xarope de açúcar invertido, xaropes de cevada e/ou trigo, e semelhantes podem ser usados como uma fonte de amido. O amido eventualmente será convertido em dextrinas e açúcares fermentáveis.
[00020] Por um número de razões, o malte, que produzido principalmente a partir de variedades selecionadas de cevada, tem o efeito mais alto sobre o caráter total e qualidade da cerveja. Primeiro, o malte é o agente aromatizante primário em cerveja. Segundo, o malte provê a maior porção do açúcar fermentável. Terceiro, o malte provê as proteínas, que contribuirão para o caráter de corpo e espuma da cerveja. Quarto, o malte provê a necessária atividade enzimática durante formação de pasta.
[00021] Lúpulos também contribuem significantemente para qualidade de cerveja, incluindo aromatizante. Em particular, lúpulos (ou constituintes de lúpulos) adicionam desejáveis substâncias amargas à cerveja. Em adição, os lúpulos atuam como precipitadores de proteínas, estabelecem agentes preservativos e auxiliam em formação e estabilização de espuma.
[00022] O processo de fabricação de cerveja é bem conhecido na técnica, mas em resumo, ele envolve cinco etapas: (a) formação de pasta e/ou cozimento adjunto, (b) separação e extração de decocto, (c) ebulição e adição de lúpulo à caldeira de cerveja, (d) resfriamento, fermentação e estocagem, e (e) maturação, processamento e embalagem.
[00023] Tipicamente, na primeira etapa, malte moído ou triturado é misturado com água e mantido por um período de tempo sob temperaturas controladas para permitir que as enzimas presentes no malte convertam o amido presente no malte em açúcares fermentáveis.
[00024] Na segunda etapa, a pasta é transferida para "vaso usado para separação de decocto extraído" ou filtro de pasta onde o líquido é separado do resíduo de grãos. Este líquido doce é chamado "decocto" e o deixado sobre resíduo de grão é chamado "grão gasto". A massa é tipicamente submetida a uma extração, que envolve adição de água à massa de modo a recuperar o extrato solúvel residual a partir do grão gasto.
[00025] Na terceira etapa, o decocto é colocado em vigorosa ebulição. Isto esteriliza o decocto e auxilia no desenvolvimento de cor, aroma e odor. Lúpulos são adicionados em algum ponto durante a ebulição.
[00026] Na quarta etapa, o decocto é resfriado e transferido para um fermentador, que também contem a levedura ou ao qual levedura é adicionada. A levedura converte os açúcares por fermentação em álcool e gás dióxido de carbono; no final de fermentação o fermentador é resfriado ou o fermentador pode ser resfriado para interromper fermentação. A levedura flocula e é removida.
[00027] Na última etapa, a cerveja é resfriada e estocada por um período de tempo, durante o qual a cerveja clarifica e desenvolve seu sabor, e qualquer material que possa prejudicar a aparência, o aroma e vida de prateleira da cerveja é depositado. Antes de embalagem, a cerveja é carbonatada e, opcionalmente, filtrada e pasteurizada.
[00028] Após fermentação, a bebida é obtida a qual usualmente contem de cerca de 2% a cerca de 10% de álcool em peso. Os carboidratos não fermentáveis não são convertidos durante fermentação e formam a maioria dos sólidos dissolvidos na cerveja final.
[00029] Este resíduo permanece devido à inabilidade de amilases de malte para hidrolisar as ligações alfa-1,6 do amido. Os carboidratos não fermentáveis contribuem com cerca de 50 calorias por 0,3548 litros (12onças) de cerveja.
[00030] Recentemente, houve uma ampla popularização de bebidas cervejas chamadas cervejas leves, cervejas de reduzidas calorias ou cervejas de baixas calorias, particularmente no mercado dos U.S. Como definidas nos U.S., estas cervejas têm aproximadamente 30% menos calorias que uma cerveja "normal" de fabricante.
[00031] Ainda informação sobre convencionais processos de fabricação de cerveja, assim como definições para termos usados no campo de tecnologia de fabricação de cerveja para serem aplicados na presente invenção, podem ser encontradas em "Technology Brewing and Malting"por Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2 nd revised Edition 1999, ISBN 3- 921690-39-0 ou 3rd edition (2004): ISBN 3-921690-49-8.
Definições
[00032] O termo "complexo de enzimas" como aqui usado significa no presente contexto uma composição substancialmente livre de células compreendendo várias enzimas tendo diferentes atividades enzimáticas e/ou classificadas sob diferentes números de Comissão de Enzima (número EC). Quando o "complexo de enzimas" é obtido por fermentação, ele é o caldo de fermentação substancialmente livre de células, opcionalmente o caldo de fermentação concentrado, que é incluído no produto final. É para ser entendido que o termo "complexo de enzimas" também abrange uma composição compreendendo várias enzimas derivadas através de dois ou mais processos de fermentação separados que também podem envolver diferentes microorganismos. Em algumas modalidades o complexo de enzimas é um complexo de enzimas grau alimento, o que significa que ele pode ser usado para a preparação de produtos alimentícios.
[00033] Em alguns aspectos da invenção, o complexo de enzimas de acordo com a invenção contem a atividades secundárias necessárias para degradar os compostos muito complexos de, por exemplo, uma pasta em um processo de fabricação de cerveja. O termo "atividade secundária"refere-se no presente contexto às atividades de uma enzima na direção de outros substratos que não são seu substrato principal ou refere-se a outras atividades que um complexo de enzimas pode ter que não sua atividade principal.
[00034] Em um aspecto da invenção, o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende pelo menos 5 diferentes atividades secundárias.
[00035] Em um aspecto da invenção, o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende pelo menos 10 diferentes atividades secundárias.
[00036] Em um aspecto da invenção, o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende pelo menos 15 diferentes atividades secundárias.
[00037] Em um aspecto da invenção, o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende pelo menos 20 diferentes atividades secundárias.
[00038] Xilanases são classificadas em EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.136 e EC 3.2.1.156; atividade pode ser medida, por exemplo, como descrito em "Ensaio 2".
[00039] Endo-1,4-beta xilanase é classificada como EC 3.2.1.8. A enzima causa endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos.
[00040] O termo "família 11 xilanase" como aqui usado refere-se a uma endo-1,4-beta xilanase classificada como EC 3.2.1.8, que causa endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos e que é classificada como uma família 11 xilanase de acordo com B. Henrissat, A classification of glicosil hidrolases base don amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), pp. 309-316.
[00041] Em um aspecto, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade endo-1,4-beta xilanase como medida por "Ensaio 2"como descrito no que se segue sob o título "Ensaios".
[00042] "Ensaio 2" pode ser realizado em pH 3,5 ou pH 5 e 50°C usando xilano como substrato, ou pode ser realizado em diferentes valores de pH e temperatura para a adicional caracterização e especificação de enzimas. Atividade de enzima é calculada a partir do aumento em absorbância causado por xilose em 540 nm por tempo unitário.
[00043] Uma unidade de atividade xilanase é aqui definida como a quantidade de enzima (normalizada para volume total de ensaio) que rende um aumento em ΔOD540nm.min‘1sob as condições do "Ensaio 2"(pH 3,5 e 50°C).
[00044] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende uma atividade xilanase de pelo menos cerca de 5000 U/g, tal como pelo menos cerca de 6000 U/g, tal como pelo menos cerca de 7000 U/g, tal como pelo menos cerca de 8000 U/g, tal como pelo menos cerca de 8500 U/g, como medida através de "Ensaio 2".
[00045] O complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade celulolítica. O nome sistemático de celulose é 4-(1,3; 1,4)-β-D- glucan 4-glucano hidrolase e enzimas celulolíticas ou celulases são classificadas em EC 3.2.1.4. Celulase endoidrolisa ligações (1—>4)-β-D- glicosídicas em por exemplo, liquenina e beta-D-glucanos cereais e também hidrolisará ligações 1,4 em beta-D-glucanos também contendo ligações 1,3. Celulase também tem outros nomes como endo-1,4-beta- D-glucanase , beta-1,4-glucanase , beta-1,4-endoglucan hidrolase, celulase A, celulosina AP, endoglucanase D, celulose alcalina, celulase A 3, celudextrinase, 9.5 celulase, avicelase, pancelase SS e 1,4- (1,3; 1,4)-beta-D-glucano 4-glucano hidrolase.
[00046] Em um aspecto da invenção, a atividade celulase do complexo de enzimas de acordo com a invenção é medida através de "Ensaio 1" como descrito no que se segue sob o título "Ensaios".
[00047] Ainda em aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade beta-glucanase determinada como descrito em "Ensaio 7".
[00048] O ensaio padrão é realizado em pH 5,0, e pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
[00049] Uma unidade de atividade endo-1,3(4)-beta-glucanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de equivalentes de glicose por minuto sob as condições do ensaio (pH 5,0 (ou como especificado) e 50°C).
[00050] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende uma atividade beta-glucanase de pelo menos cerca de 10000 U/g, tal como pelo menos cerca de 12000 U/g, tal como pelo menos cerca de 14000 U/g, tal como pelo menos cerca de 15000 U/g, tal como pelo menos cerca de 18000 U/g como medida por "Ensaio 7".
[00051] "Beta-glucanase" ou "β-glucanase" como aqui usado refere- se a uma endo-1,3(4)-beta-glucanase de EC 3.2.1.6. Catálise de endoidrólise de ligações (1—>3) ou (1—>4) em beta-D-glucanos quando o resíduo glicose cujo grupo redutor está envolvida na ligação a ser hidrolisada é ela própria substituída em C-3.
[00052] Ainda em aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade laminarinase determinada como descrito no "Ensaio 3".
[00053] Laminarinase pode ser endo-1,3(4)-beta-glucanase classificada em E.C. 3.2.1.6 ou glucano endo-1,3-beta-D-glicosidase classificada em E.C. 3.2.1.39. Endo-1,3(4)-beta glucanase com os nomes alternativos, laminarinase, endo-1,3-beta glucanase , endo-1,4- beta glucanase é classificada em E.C. 3.2.1.6. Os substratos incluem laminarina, liquenina e D-glucanos cereais e a enzima catalisa endoidrólise ligações (1- >3) ou (1- >4) em beta-D-glucanos quando o resíduo glicose cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada é ele próprio substituído em C-3. Glucano endo-1,3-beta-D- glicosidase com os nomes alternativos (1->3)- beta-glucano endo hidrolase, endo-1,3-beta glucanase e laminarinase é classificada em E.C. 3.2.1.39 e hidrolisa ligações (1->3)-beta-D-glicosídicas em (1->3)- beta-D-glucanos em substratos como, por exemplo, laminarina, paramylon e pachyman.
[00054] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade arabinanase. Arabinanase é classificada como EC 3.2.1.99. O nome sistemático é 5-alfa-L-arabinan 5-alfa-L-arabinano hidrolase mas ela tem vários outros nomes tais como arabinan endo- 1,5-alfa-L-arabinosidase, e endo-1,5-alfa-L-arabinanase, endo-alfa-1,5- arabanase, endo-arabanase, 1,5-alfa-L-arabinano e 1,5-alfa-L- arabinano hidrolase. Arabinase endo hidrolisa ligações (1-.5)-alfa- arabino furanosídicas em (1->5)-arabinanos. Arabinanase também atua sobre arabinano.
[00055] Em um aspecto da invenção, a atividade arabinase do complexo de enzimas de acordo com a invenção é medida através de "Ensaio 4" como descrito no que se segue sob o título "Ensaios". O ensaio pode ser realizado em pH 3,5 e 50°C usando arabinano de beterraba sacarina como substrato, e ele pode ser realizado em diferentes valores de pH e temperatura para a adicional caracterização e especificação de enzimas. Atividade de enzima é calculada a partir de aumento em absorbância em 540 nm por unidade de tempo.
[00056] Uma unidade de atividade arabinase é definida como a quantidade de enzima (normalizada para volume total de ensaio) que rende um aumento em ΔOD540nm.minuto1 sob as condições do ensaio (pH 3,5 e 50°C).
[00057] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade beta-D-glicosídeo glico hidrolase. Beta-D- glicosídeo glico hidrolase refere-se a enzimas de E.C 3.2.1.21.
[00058] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade beta-xilosidase. "beta-xilosidase" ou "xilano 1,4-beta-xilosidase" refere-se a enzimas de E.C 3.2.1.37. Beta- xilosidase catalisa a hidrólise de (1->4)-beta-D-xilanos, para remover sucessivos resíduos D-xilose a partir dos não redutores terminais.
[00059] Em um aspecto da invenção, a atividade celobioidrolase do complexo de enzimas de acordo com a invenção é medida através de "Ensaio 6" como descrito no que se segue sob o título "Ensaios". O ensaio padrão é realizado em pH 5,0, e ele pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
[00060] Uma unidade de atividade de celobioidrolase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenol beta-D-celobiopiranosídeo por minuto sob as condições do ensaio (pH 5,0 (ou como especificado) e 50°C).
[00061] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade celobioidrolase. "Celobioidrolase" ou "celulose 1,4-beta-celobiosidase"refere-se a enzimas de EC 3.2.1.91. Celulose 1,4-beta-celobiosidase catalisa hidrólise de ligações 1,4-beta-D- glicosídicas em celulose e celotetraose, liberando celobiose a partir de extremidades não redutoras das cadeias.
[00062] Em um aspecto da invenção, a atividade arabino furanosidase do complexo de enzimas de acordo com a invenção é medida através de "Ensaio 5" como descrito no que se segue sob o título de "Ensaios". O ensaio padrão pode ser realizado em pH 5,0 e 50°C e ele pode ser realizado em diferentes valores de pH e temperatura para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
[00063] Uma unidade de atividade alfa-N-arabino furanosidase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de p- nitrofenol a partir de p-nitrofenil alfa-L-arabino furanosídeo por minuto sob as condições do ensaio (pH 5,0 e 50°C (ou como especificado)).
[00064] Em alguns aspectos, o complexo de enzima de acordo com a invenção tem atividade alfa-N-arabino furanosidase. "alfa-N-arabino furanosidase" ou "alfa-N-arabino furanosidase"refere-se a enzimas de EC 3.2.1.55. alfa-N-arabino furanosidase catalisa a hidrólise de resíduos alfa-L-arabino furanosídeo não redutores terminais em alfa-L- arabinosídeos.
[00065] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade glucano 1,4-beta glicosidase."Glucano 1,4- beta-glicosedase" ou "glucano 1,4-beta glicosidase"refere-se a enzimas de EC 3.2.1.74. Glucano 1,4-beta-glicosidase catalisa a hidrólise de ligações (1->4) em (1->4)-beta-D-glucano s, para remoção de sucessivas unidades glicose.
[00066] Em alguns aspectos, o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem atividade exo-beta-1,4-glucanase específica - xiloglucano . "exo-beta-1,4-glucanase específica - xiloglucano "refere- se a enzimas de EC 3.2.1.155. exo-beta-1,4-glucanase específica - xiloglucano catalisa a exo-hidrólise de ligações (1->4)-beta-D- glicosídicas em xiloglucano .
[00067] O complexo de enzimas de acordo com o aspecto precedentes pode ser usado em um processo compreendendo redução de viscosidade de uma solução aquosa compreendendo um hidrolisado de amido.
[00068] O complexo de enzimas também pode ser usado em um processo compreendendo filtração de uma solução aquosa compreendendo um hidrolisado de amido. Em algumas modalidades a solução aquosa compreendendo um hidrolisado de amido é uma massa para fabricação de cerveja, e em outras modalidades a solução aquosa compreendendo um hidrolisado de amido é uma composição alimentícia.
[00069] Alternativamente, o complexo de enzimas de acordo com a presente invenção pode ser usado na produção de suco de fruta, vinho, processamento de grão, álcool combustível, tal como bioetanol, e álcool de bebidas.
[00070] Em algumas modalidades o bioetanol é produzido de estoques de alimentação de agricultura tais como cana-de-açúcar, batata, milho, trigo, sorgo, etc., ou a partir de material celulósico tal como palha de milho, grama ("switchgrass")ou outro material de planta. Em ambos os casos açúcares fermentáveis são extraídos do material bruto e fermentados por microorganismos em álcool, que é destilado e pode ser usado como combustível de transporte. O complexo de enzimas de acordo com a presente invenção pode ser usado nesta produção de biocombustível. O complexo de enzimas pode ser adicionado para aperfeiçoar extração de polissacarídeos a partir de material bruto, auxiliar degradação de polissacarídeos em açúcares fermentáveis e/ou para aperfeiçoamento de parâmetros de processamento tal como separação de líquidos de sólidos, características de fluxo e capacidade de bombeamento.
[00071] O processo da invenção pode ser aplicado na formação de massa de qualquer grão. De acordo com a invenção o grão pode compreender qualquer material de planta contendo amido e/ou açúcar derivável de qualquer planta e parte de planta, incluindo tubérculos, raízes, caules, folhas e sementes.
[00072] Em algumas modalidades o grão compreende um grão de cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milo, painço e sorgo, e mais preferivelmente, pelo menos 10%, ou mais preferivelmente pelo menos 15%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 25%, ou mais preferivelmente pelo menos 35%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou mesmo 100% (peso/peso) do grão do decocto são derivados de grão.
[00073] Em algumas modalidades o grão compreende grão maltado, tal como malte de cevada. Preferivelmente, pelo menos 10%, ou mais preferivelmente pelo menos 15%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 25%, ou mais preferivelmente pelo menos 35%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou mesmo 100% (peso/peso) do grão do decocto são derivados de grão maltado.
[00074] O termo "fermentação" significa no presente contexto produção de substâncias tais como enzimas através de crescimento de microorganismos em uma cultura.
[00075] Como aqui usado, o termo "malte" é entendido como qualquer grão de cereal maltado, tal como cevada.
[00076] O termo "adjunto" é entendido como a parte do grão que não é malte de cevada. O adjunto pode ser qualquer material rico em carboidrato.
[00077] O termo "massa" é entendido como pasta aquosa de amido, por exemplo, compreendendo malte de cevada moído, cevada moída, e/ou outro adjunto ou uma combinação dos mesmos, misturada com água para posteriormente ser separada em decocto + grãos usados.
[00078] O termo "separação de massa" é entendido como a separação de decocto dos grãos usados, tal como separação de grãos ou filtração de massa.
[00079] O termo "filtração de cerveja" é entendido como um processo de separação no qual as células de levedura e outros materiais causadores de turbidez ainda presentes na cerveja são removidos, tal como através de microfiltração ou processos de membrana.
[00080] A preparação de complexo de enzimas, tal como na forma de um ingrediente alimentício preparado de acordo com a presente invenção, pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou o modo de aplicação e/ou o modo de administração. A forma sólida pode ser tanto como um pulverizado de enzima seco ou como uma enzima granulada.
[00081] Em um aspecto a invenção provê uma preparação de complexo de enzimas compreendendo o complexo de enzimas de acordo com a invenção, um carreador de enzima e opcionalmente um estabilizador e/ou um preservativo.
[00082] Ainda em um aspecto da invenção, o carreador de enzima é selecionado do grupo consistindo em glicerol ou água.
[00083] Ainda em um aspecto, a preparação compreende um estabilizador. Em um aspecto, o estabilizador é selecionado do grupo consistindo em sais inorgânicos, polióis, açúcares e suas combinações. Em um aspecto, o estabilizador é um sal inorgânico tal como cloreto de potássio. Em um outro aspecto, o poliol é glicerol, propileno glicol, ou sorbitol. Ainda em um outro aspecto, o açúcar é um carboidrato de molécula pequena, em particular qualquer um de vários com sabor doce como glicose, frutose e sacarose.
[00084] Ainda em um aspecto, a preparação compreende um preservativo. Em um aspecto, o preservativo é metil parabeno, propil parabeno, benzoato, sorbato ou outros preservativos aprovados para alimentos ou uma mistura dos mesmos.
Específicas modalidades da invenção
[00085] Como descrito acima a presente invenção refere-se a um complexo de enzimas derivado de uma combinação de: a. um produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Trichoderma',e b. uma ou mais enzimas de qualquer uma espécie diferente do reino de fungos, selecionada de uma xilanase (EC 3.2.1.8), uma celulase (EC 3.2.1.4), e uma beta-glucanase (EC 3.2.1.6); e onde pelo menos cerca de 61% da atividade beta-1,4- endoglucano hidrolase como medida através do processo "ensaio 1"como aqui descrito são derivadas de fermentação do gênero Trichoderma.
[00086] Em algumas modalidades pelo menos cerca de 62%, tal como pelo menos 63%, tal como pelo menos cerca de 64%, tal como pelo menos cerca de 65%, tal como pelo menos cerca de 66%, tal como pelo menos cerca de 68%, tal como pelo menos cerca de 69% da atividade beta-1,4-endoglucano hidrolase como medida através de processo "Ensaio 1" como aqui descrito, são derivadas de fermentação do gênero Trichoderma.
[00087] Em algumas modalidades não mais que cerca de 90%, tal como não mais que cerca de 85%, tal como não mais que cerca de 80%, tal como não mais que cerca de 75%, tal como não mais que cerca de 70%, tal como não mais que cerca de 65% da atividade beta-1,4- endoglucano hidrolase como medida pelo processo de "Ensaio 1" como aqui descrito são derivadas da fermentação do gênero Trichoderma..
[00088] Em algumas modalidades a uma ou mais enzimas de um fungo diferente no complexo de enzimas de acordo com a invenção é um produto de expressão obtido através de fermentação destes fungos diferentes.
[00089] Em algumas modalidades os fungos diferentes são do gênero Penicillium.
[00090] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação dos fungos diferentes compreende uma xilanase, tal como uma xilanase diferente de uma xilanase derivada a partir do gênero Trichoderma. Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação dos diferentes fungos compreende uma família 11 xilanase, tal como uma família 11 xilanase diferente de uma família 11 xilanase derivada do gênero Trichoderma.
[00091] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção compreende uma ou mais atividades de enzima selecionadas da lista consistindo em endo-1,4-beta-xilanase, endo- 1,3(4)-beta-glucanase , celulase, laminarinase, endo-1,5-alfa-L- arabinanase, beta-D-glicosídeo glicoidrolase, beta-xilosidase, celobioidrolase, glucano , 1,4-beta-glicosidase, exo-beta-1,4-glucanase específica xiloglucano e alfa-N-arabino furanosidase.
[00092] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Trichoderma é de uma cultura simples da espécie Trichoderma reesei.
[00093] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Penicillium é de uma cultura simples da espécie Penicillium funiculosum .
[00094] Em algumas modalidades a cultura simples usada para fermentação não foi geneticamente modificada.
[00095] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Tríchoderma é obtido através de fermetação submersa.
[00096] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido através de fermentação do gênero Tríchoderma é da espécie Tríchoderma reesei.
[00097] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido através de fermentação de um fungo diferente é de uma cultura simples das espécies Penicillium funiculosum .
[00098] Em algumas modalidades o produto de expressão obtido por fermentação é de uma espécie do tipo selvagem.
[00099] Em algumas modalidades a linhagem usada para preparação de complexo de enzimas da invenção é Tríchoderma reesei depositada sob o Tratado de Budapeste no American Type Culture Collection (ATCC) IP, Licensing and Services, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA tendo uma designação de linhagem GC Cellulose A83 GICC 0004, M)3000004 e uma designação de depósito de patente ATCC PTA-1001, em nome de Danisco A/S na data de 5 de maio de 2009, ou um seu derivado ou progénie. (O depósito foi testado em International Depository Authority: American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA em 14 de maio de 2009 e naquela data, as sementesZlinhagem(s) foram viáveis).
[000100] Em algumas modalidades a linhagem usada na preparação de complexo de enzimas da invenção é Penicillium funiculosum depositado sob o tratado de Budapeste no International Mycological Institute sob o número IMI 378536, ou um seu derivado ou progénie.
[000101] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem uma atividade de enzima de pelo menos cerca de 3000 U/g, tal como pelo menos cerca de 4000 U/g, tal como pelo menos cerca de 5000 U/g, tal como pelo menos cerca de 6000 U/g, tal como pelo menos cerca de 7000 U/g como medida através de "Ensaio 1" como aqui descrito derivada da fermentação do gênero Trichoderma.
[000102] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem uma atividade total de enzima de pelo menos cerca de 4000 U/g, tal como pelo menos cerca de 5000 U/g, tal como pelo menos cerca de 6000 U/g, tal como pelo menos cerca de 7000 U/g, tal como pelo menos cerca de 8000 U/g, tal como pelo menos cerca de 9000 U/g, tal como pelo menos cerca de 10000 U/g, tal como pelo menos cerca de 11000 U/g, tal como pelo menos cerca de 12000 U/g, como medida através de "Ensaio 1" como aqui descrito.
[000103] Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção consiste em cerca de 3100 u/g de Penicillium funiculosum e cerca de 5200 u/g de Trichoderma reesei onde as ditas unidades/g são determinadas através de "Ensaio 1" como aqui descrito.
[000104] Em algumas modalidades o complexo de enzima de acordo com a invenção consiste em cerca de 2362 u/g de Penicillium funiculosum e cerca de 5315 u/g de Trichoderma reesei onde as ditas unidades/g são determinadas através de "Ensaio 1" como aqui descrito. Em algumas modalidades o complexo de enzimas de acordo com a invenção tem as especificações do produto "LAMINEX XG" como aqui definido.
[000105] Ainda em um aspecto, a linhagem Trichoderma reesei usada de acordo com a invenção tem características substancialmente idênticas àquelas da linhagem Trichoderma reesei depositada sob o Tratado de Budapeste no American Type Culture Collection (ATCC) tendo uma designação de linhagem GC Cellulose A83 GICC 0004, M)3000004 depositada por Danisco A/S na data de 5 de maio de 2009.
[000106] Ainda em um aspecto, a linhagem é uma linhagem Trichoderma reesei depositada sob o Tratado de Budapeste no American Type Culture Collection (ATCC) tendo uma designação de linhagem GC Cellulose A83 GICC, M03000004 depositada por Danisco A/S na data de 5 de maio de 2009.
[000107] No contexto da presente invenção, a frase "características substancialmente idênticas" significa que a linhagem tem uma ou mais (preferivelmente todas) as características de Trichoderma reesei depositado sob o Tratado de Budapeste no American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 tendo uma designação de linhagem GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004 depositada por Danisco A/S na data de 5 de maio de 2009.
[000108] Como descrito acima a presente invenção refere-se ao uso de um complexo de enzimas de acordo com a invenção, em um processo para produção de uma massa de fabricação de cerveja, tal como na produção de uma bebida cerveja de malte e/ou em uma produção de uísque. As seguintes modalidades são particularmente relevantes no processo para produção de uma massa de fabricação de cerveja.
[000109] Em algumas modalidades particulares, o complexo de enzimas de acordo com a presente invenção não é derivado de uma combinação de um produto de expressão obtido por fermentação das espécies Trichoderma reesei e um produto de expressão obtido por fermentação das espécies Penicillium funiculosum , onde a razão de atividade beta-1,4-endoglucano hidrolase derivada de Penicillium funiculosum e de Trichoderma reesei é cerca de 0,25/0,75 a 0,37/0,63, tal como de cerca de 0,26/0,74 a 0,36/0,64, tal como de cerca de 0,27/0,73 a 0,35/0,65, tal como de cerca de 0,28/0,72 a 0,34/0,66, tal como de cerca de 0,29/0,71 a 0,33/0,67, tal como de cerca de 0,30/0,70 a 0,32/0,68, tal como de cerca de 0,31/0,69.
[000110] Em algumas modalidades particulares, o complexo de enzima de acordo com a presente invenção é derivado de uma combinação de um produto de expressão obtido através de fermentação das espécies Tríchoderma reesei e um produto de expressão obtido por fermentação das espécies Penicillium funiculosum , onde a razão de atividade beta-1,4-endoglucano hidrolase derivada de Penicillium funiculosum e de Tríchoderma reesei é cerca de 0,25/0,75 a 0,37/0,63, tal como de cerca de 0,26/0,74 a 0,36/0,64, tal como de cerca de 0,27/0,73 a 0,35/0,65, tal como de cerca de 0,28/0,72 a 0,34/0,66, tal como de cerca de 0,29/0,71 a 0,33/0,67, tal como de cerca de 0,30/0,70 a 0,32/0,68, tal como de cerca de 0,31/0,69.
[000111] Em algumas modalidades o complexo de enzima é usado na massa para auxiliar na separação e/ou filtração de massa e/ou filtração de cerveja.
[000112] Em algumas modalidades o complexo de enzima é usado na massa para auxiliar na separação de massa.
[000113] Em algumas modalidades há uma redução em beta-glucano residual de decocto, tal como uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 30% comparado a um controle sem enzima, ou pelo menos 2%, 5%, ou 10% comparado a um controle usando LAMINEX Super.
[000114] Em algumas modalidades há uma viscosidade reduzida, tal como uma viscosidade de decocto, tal como uma redução de pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, ou pelo menos 7,5% comparado a um controle sem enzima.
[000115] Em algumas modalidades há um aumento em ciclos/dia de preparação de cerveja, tal como um aumento de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, ou pelo menos 20% comparado a um controle sem enzima, ou pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, ou pelo menos 10% comparado a um controle usando LAMINEX Super com a mesma ou comparável atividade de enzima baseado no componente Penicillium funiculosum.
[000116] Em algumas modalidades há uma aperfeiçoada capacidade de filtração.
[000117] Em algumas modalidades há aperfeiçoada separação de massa.
[000118] Em algumas modalidades há uma aumentada taxa de fluxo durante separação de massa, tal como um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% comparado a um controle sem enzima, ou pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, ou pelo menos 10% comparado a um controle usando LAMINEX Super.
[000119] É para ser entendido que a dita taxa de fluxo é definida como a taxa de fluxo média calculada a partir do tempo total de separação.
[000120] Em algumas modalidades há uma diminuição em tempo de espargimento ou extração, tal como uma diminuição de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% comparado a um controle sem enzima, ou um controle usando LAMINEX Super.
[000121] Em algumas modalidades há uma diminuição no tempo total de separação de decocto de grãos.
[000122] Em algumas modalidades há um diminuído tempo total de separação de massa, tal como uma diminuição de pelo menos 5%, pelo menos 10%, ou pelo menos 15% comparado a um controle sem enzima, ou pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, ou pelo menos 10% comparado a um controle usando LAMINEX Super.
[000123] Em algumas modalidades há uma diminuída ΔP através de leito de filtro durante a recirculação de massa sobre o leito de filtro e/ou durante o processo de separação de decocto de grãos.
[000124] É para ser entendido que ΔP refere-se à queda de pressão através do leito.
[000125] Em algumas modalidades há uma diminuída ΔP média através de superfície de separação durante a recirculação de massa sobre o leito de filtro e/ou durante o processo de separação de decocto de grãos.
[000126] Em algumas modalidades há uma diminuída ΔP média através de superfície de separação durante o processo de separação de massa, tal como uma diminuição de pelo menos 5%, pelo menos 10%, ou pelo menos 15% comparado a um controle sem enzima, ou um controle usando LAMINEX Super.
[000127] Em algumas modalidades não há alteração em turvação de decocto.
[000128] Em algumas modalidades há uma redução em pentosanos de decocto.
[000129] Em algumas modalidades há aperfeiçoado rendimento de extrato.
[000130] Em algumas modalidades há aumentada taxa de fluxo durante filtração de cerveja.
[000131] Em algumas modalidades há uma diminuição no desenvolvimento de pressão através de filtro sobre tempo durante filtração de cerveja, tal como uma diminuição de pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% comparado a um controle sem enzima, ou um controle usando LAMINEX Super.
[000132] Em algumas modalidades há diminuída turvação de cerveja, tal como uma diminuição de pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% comparado a um controle sem enzima, ou um controle usando LAMINEX Super.
[000133] Em algumas modalidades não há diminuição em estabilidade de espuma.
[000134] Em algumas modalidades há diminuído beta-glucano de cerveja, tal como uma diminuição de pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% comparado a um controle sem enzima, ou um controle usando LAMINEX Super.
[000135] Em algumas modalidades há uma diminuição em pentosanos de cerveja, tal como uma diminuição de pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% comparado a um controle sem enzima.
[000136] Em algumas modalidades menos que cerca de 0,5 kg de complexo de enzima por ton de grãos é usado em um processo para produção de uma massa de fabricação de cerveja, tal como na produção de uma cerveja bebida de malte e/ou em uma produção de uísque. Em algumas modalidades menos que cerca de 0,4 kg de complexo de enzimas por ton de grãos é usado, tal como menos que cerca de 0,3 kg de complexo de enzima por ton de grãos é usado, tal como menos que cerca de 0,25 kg de complexo de enzima por ton de grãos é usado, tal como menos que cerca de 0,2 kg de complexo de enzimas por ton de grãos é usado, tal como menos que cerca de 0,19 kg de complexo de enzimas por ton de grãos é usado, tal como menos que cerca de 0,18 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,17 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,16 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,15 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,14 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,13 kg de complexo de enzima por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,12 kg de complexo de enzimas por ton de grãos, tal como menos que cerca de 0,11 kg de complexo de enzimas por ton de grãos.
[000137] É para ser entendido que uma linhagem de fungos usada de acordo com a invenção pode ser uma cultura da linhagem depositada mencionada acima, mas também pode ser uma cultura de uma linhagem que tem propriedades substancialmente idênticas à linhagem isolada e depositada mencionada acima. Em uma realização preferida a linhagem é a linhagem depositada ou uma sua progénie.
[000138] O produto de expressão obtido por fermentação de uma espécie do gênero Trichoderma usada de acordo com a presente invenção pode ser derivada de qualquer Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, tal como a composição Celluclast disponível de Novozymes A/S. Celluclast tem um pronunciado efeito de redução de viscosidade sobre substratos celulósicos solúveis. Alternativamente LAMINEX BG, uma preparação de celulase comercial produzida por Trichoderma reesei e disponível de Danisco A/S pode ser usada.
[000139] O produto de expressão obtido através de fermentação de uma espécie do gênero Penicillium usada de acordo com a presente invenção pode ser derivado de qualquer Penicillium tal como Penicillium funiculosum . Em algumas modalidades a linhagem é Penicillium funiculosum depositada sob o tratado de Budapeste no International Mycological Institute sob o número IMI 378536, ou um seu derivado ou progénie. Alternativamente o Penicillium funiculosum é como mostrado em WO9957325. EM algumas modalidades alternativas, LAMINEX C2K (obtido de Danisco A/S) um produto de expressão derivado de Penicillium funiculosum , é usado de acordo com a invenção.
[000140] LAMINEX Super é um produto enzima de fabricação de cerveja para ser usado na massa para auxiliar em separação de decocto de grãos ou filtração de massa. O produto LAMINEX Super é uma combinação de dois produtos enzima de fermentação diferentes - a Penicillium funiculosum celulase e a Trichoderma reesei celulase. LAMINEX Super é obtido de Danisco A/S. O componente Penicillium funiculosum é incluído para hidrolisar beta-glucano s e xilanos solubilizados, reduzindo viscosidade de decocto e aperfeiçoando separação de decocto de grãos ou filtração de massa; o componente Trichoderma reesei é incluído para obter um baixo beta-glucano medido (através do procedimento de ensaio de beta-glucano de ligação mista Megazyme) no decocto e para aumentar taxa de filtração de cerveja.
[000141] Produto(s) de T. reesei - LAMINEX BG - usado para aperfeiçoar filtração de cerveja obtido de Danisco A/S.
[000142] O produto LAMINEX Super é definido como sendo constituído por: 1575 u/g (determinada através de "Ensaio 1") de concentrado de Penicillium funiculosum ; 2362 u/g (determinada através de "Ensaio 1") de Trichoderma reesei.
[000143] Isto foi arredondado para 3900 u/g na especificação final de produto LAMINEX Super.
[000144] A especificação de LAMINEX Super é: Atividade celulase > 3900 u/g (determinada através de "Ensaio 1") pH 3,7-4,2
[000145] Micro especificações serão padrões.
[000146] Estabilizado com 0,25% benzoato de sódio.
[000147] O LAMINEX XG é definido como sendo constituído por: um complexo de enzimas derivado de uma combinação de um produto de expressão obtido através de fermentação das espécies Trichoderma reesei e um produto de expressão obtido através de fermentação das espécies Penicillium funiculosum , onde a razão de atividade beta-1,4-endoglucano hidrolase derivada de Penicillium funiculosum e de Trichoderma reesei é cerca de 0,25/0,75 a 0,37/0,63, tal como um complexo de enzimas onde: cerca de 2363 u/g (atividade medida através de "Ensaio 1") são derivadas de concentrado de Penicillium funiculosum ; e cerca de 5315 u/g (atividade medida através de "Ensaio 1") são derivadas de Tríchoderma reesei. Nesta realização particular, o produto LAMINEX XG rende uma razão de Penicillium funiculosum/Tríchoderma de 0,31/0,69 baseado na atividade U como medida através de "Ensaio 1" como descrito sob "Ensaios".
Exemplo 1 Estudo de massa em escala de laboratório 1 Atividades de Enzima:
[000148] Produto LAMINEX Super misturado para este específico experimento:
[000149] Atividade nominal: 3937 CMC U/g. Atividade medida: 3682 CMC U/g (atividade medida através de processo de "Ensaio 1") dosada em 0,2 kg/ton de grãos rendendo 736400 CMC U/ton de grãos (= 0,736 U/g de grãos).
[000150] Proporcionando a definição de produto LAMINEX Super de 0,40 x produto P. funiculosum e 0,60 x produto T. reesei baseado em atividade CMC como medida através de "Ensaio 1": - contribuição de atividade de P. funiculosum - 0,295 CMC U/g de grãos - contribuição de atividade de T. reesei - 0,442 CMC U/g de grãos.
[000151] LAMINEX Super (0,200 kg/ton de grãos) + 50% atividade do componente T. reesei (o LAMINEX XG): 3682 CMC U/g (atividade medida por "Ensaio 1") dosada em 0,2 kg/ton de grãos + 0,09534 g componente T. reesei (12539 CMC U/g, através de "Ensaio 1"/g produto LAMINEX Super rendendo 975 494 CMC U/ton de grãos (= 0,975 U/g de grãos) - contribuição de atividade de P. funiculosum - 0,295 CMC U/g de grãos - contribuição de atividade de T. reesei - (0,442 + 0,239) CMC U/g = 0,681 CMC U/g de grãos.
[000152] Razão de contribuição de P. funiculosum ? T. reesei no estudo 1 de massa de escala de laboratório LAMINEX XG -0,30/0,70
[000153] Testes de LAMINEX Super (0,200 kg/ton de grãos) vs. LAMINEX Super (0,200 kg/ton de grãos) + 50% de atividade do componente T. reesei em uma massa de cevada de Fawcett (90% malte de Fawcett: 10% cevada de Fawcett) : - 50 g de grãos no total de 250 g de água. Perfil de formação de massa: 50g de grãos triturados mistos em 0,5 mm foram usados e 190 mL de água a 67°C foram adicionados. O ciclo de temperatura de formação de massa foi de 60 minutos a 65°C, então 10 minutos a 72°C. As massas foram então resfriadas, levadas para 250 g em peso e filtradas através de papéis de filtro pregueado (Ederol 12).
[000154] Comparada ao produto LAMINEX Super a solução de enzimas de LAMINEX Super (0,200 g/ton de grãos) com 50% de atividade extra adicionada do componente T. reesei mostrou: . reduzido beta-glucano residual de decocto (ver figura 1)
[000155] Reduzido beta-glucano residual de decocto indica um potencial para reduzida viscosidade e seguinte aumentada separação/filtração de decocto e um potencial de aumento em ciclos/dias de fabricação de cerveja . aumentada filtração (ver figura 1)
[000156] Aumentada filtração indicou o potencial positivo de um aumentado comprimento de ciclos de filtração sem interrupções (por exemplo, racking) que por sua vez pode diminuir tempo total de filtração e assim resultar em um aumento em ciclos/dias de fabricação de cerveja.
Exemplo 2 Estudo 2 de massa em escala de laboratório
[000157] Atividades de enzimas:
[000158] LAMINES Super:
[000159] 4380 CMC U/g (atividade calculada a partir de contribuição de componente simples) dosada em 0,2 kg/ton de grãos rendendo 876000 CMC U/ton (= 0,876 U/g de grãos).
[000160] Componente P. funiculosum contribuindo com 2069 U/g (através de "Ensaio 1") correspondendo a 0,414 CMC U/g de grãos.
[000161] Componente T. reesei contribuindo com 2311 CMC U/g (através de "Ensaio 1") correspondendo a 0,462 CMC U/g de grãos.
[000162] A razão de contribuição de P. funiculosum/T. reesei para o produto LAMINEX Super neste estudo é 0,47/0,52.
[000163] O LAMINEX XG (LAMINEX Super concentrado 1,5 vezes + um adicional extra de 50% de atividade do componente T. reesei):
[000164] 8304 CMC U/g (atividade calculada a partir de contribuição de componente simples) dosada em 0,133 kg/ ton de grãos rendendo 1104432 CMC U/ton de grãos (= 1,104 U/g de grãos).
[000165] Componente P. funiculosum contribuindo com 3104 CMC U/g (através de "Ensaio 1" correspondendo a 0,413 CMC U/g de grãos.
[000166] Componente T. reesei contribuindo com 5200 CMC U/g (através de "Ensaio 1") correspondendo a 0,692 CMC /g de grãos.
[000167] Razão de contribuição de P. funiculosum/T. reesei em estudo 2 de massa em escala de laboratório de LAMINEX XG - 0,37/0,63.
[000168] Testes de LAMINEX Super (0,200 kg/ton de grãos) vs. LAMINEX XG (0,133 kg/ton de grãos) em massa de grãos mistos - 25,8% malte Spitz e 74,2% malte Pilsner. Perfil de massa: 50 g de grãos foram feitos massa com 150 g de água e o programa de massa dado na Tabela 1 foi seguido: Tabela 1. Programa de massa de escala de laboratório: Programa de formação de massa: Formação de massa em a 50°C em10 minutos Descanso a 50°C por 20 minutos Aquecimento para 65°C em 15 minutos Descanso a 65°C por 30 minutos Aquecimento para 76°C em 15 minutos Descanso a 76°C por 15 minutos e então massa fora
[000169] No final de formação de massa 30 ml_ de água quente (a 76°C) foram adicionados a cada massa e as massas foram filtradas quentes usando papéis de filtro Ederol 12.
[000170] Comparada ao produto LAMINEX® Super (dosado 0,2 kg/ton de grãos) a solução de enzimas de LAMINEX® XG (dosado 0,133 kg/ton de grãos) mostrou: reduzidas concentrações de beta-glucano de decocto residual (ver Figura 2)
[000171] A importância de redução de concentração de beta-glucano em decocto não é clara, entretanto, teorias associam reduzido beta- glucano em moOsto com reduzidas viscosidades de decocto. Com separação de massa como o gargalo do processo de fabricação de cerveja o resultante aumento positivo pode aumentar capacidade de alojamento de fabricação de cerveja através de aumento de número de ciclo/dias de fabricação de cerveja devido ao diminuído tempo gasto na separação de massa. .aumentados volumes de filtração sobre tempo (ver Figura 2)
[000172] Maiores taxas de filtração diminuem positivamente o tempo gasto na filtração, resultando potencialmente em um aumento em capacidade de alojar na fabricação de cerveja através de aumento de número de ciclos/dias de fabrico de cerveja. reduzida viscosidade de decocto (ver Figura 2)
[000173] Reduzida viscosidade de decocto tem o potencial positivo de aumento de taxas de filtração e assim aumento em capacidade de alojamento de fabricação de cerveja.
Exemplo 3 Experimentos de cervejaria piloto
[000174] As mesmas composições de enzimas como no estudo 2 de massa de escala piloto.
[000175] Testes de LAMINEX Super (0,200 kg/ton de equivalente de grãos) e LAMINEX XG (LAMINEX Super concentrado 1,5 vezes + um adicional de 50% de atividade extra se o componente T. reesei) (0,133 kg/ton de grãos). O estudo de formação de massa de cervejaria piloto foi conduzido usando 31 kg de grãos mistos - 25,8% malte Spitz e 74,2% malte Pilsner - em um volume de massa de 110 L. O perfil de formação de massa é visto na Tabela 2. Tabela 2. Perfil de formação de massa de cervejaria piloto:
Figure img0001
Experimentos de formação de massa em cervejaria piloto
[000176] Em comparação a LAMINEX ®Super adição de LAMINEX® XG no processo de formação de massa resulta em: .diminuído tempo de espargimento por até 13% (ver Tabela 3)
[000177] Tempo de espargimento diminuído contribui positivamente parqa um diminuído tempo gasto na separação de decocto e assim é um potencial para aumentada capacidade de alojamento de fabricação de cerveja através de um aumento em número de ciclos/dias de fabricação de cerveja. . diminuído tempo total de separação de decocto de grãos por até 8% como comparado a LAMINEX® Super e até 20% comparado a controle de água (nenhuma enzima adicionada) (ver Tabela 3 e Figura 3). Com o processo de separação de decocto dos grãos sendo o gargalo do processo de fabricação de cerveja, diminuição de tempo de separação de decocto dos grãos tem o potencial de reforçar a capacidade de alojamento de fabricação de cerveja através de aumento de número de ciclos/dias de fabrico de cerveja. . aumentada taxa de fluxo média tanto calculada como a média das taxas de fluxo medidas "continuamente" durante o processo de separação de decocto dos grãos ou como o "volume total filtrado" para o "tempo total de separação de decocto dos grãos" (ver Tabela 3 e Figura 3).
[000178] Aumentada taxa de fluxo média pode diminuir positivamente o tempo total gasto em separação de decocto e assim potencialmente aumentar capacidade de hospedagem de fabricação de cerveja. . diminuída ΔP média através de leito de filtro por até 19% durante o processo de separação de decocto dos grãos (ver Tabela 3).
[000179] Potencialmente, uma diminuída ΔP média através de leito de filtro pode resultar em uma diminuída necessidade de racking de leito de filtro e aumentar volume filtrado sobre o tempo. Ambos fatores têm o potencial positivo de diminuição de tempo de separação de decocto de grãos e assim aumentando capacidade de alojamento de fabricação de cerveja. .diminuído desenvolvimento de pressão durante a recirculação de massa sobre o leito de filtro (por até 22%) e durante separação de decocto de grãos (por até 24%) (ver Tabela 3)
[000180] Ambos, diminuído desenvolvimento de pressão durante recirculação e separação de decocto de grãos têm o potencial de contribuir para aumentada filtração e assim diminuído tempo total de separação de decocto de grãos. Novamente isto pode resultar em aumentada capacidade de alojar em fabricação de cerveja. O efeito visto é especialmente forte quando uma aumentada taxa de filtração normalmente pode estar ligada a um aumento em pressão - e os presentes dados mostram aumento em filtração e ao mesmo tempo uma diminuição em desenvolvimento de pressão. . nenhuma mudança em turvação de decocto (ver Tabela 3)
[000181] Que turvação é inalterada, o que é positivo quando uma turvação aumentada pode ser um fator resultando na escolha de indução de racking. Racking é consumidor de tempo e pode aumentar tempo total de separação de decocto e assim diminuída capacidade de alojamento de fabricação de cerveja. . diminuído "desenvolvimento de pressão total" durante separação de decocto de grãos por até 24% (ver Tabela 3 e figura 3).
[000182] Diminuído "desenvolvimento de pressão total" durante separação de decocto pode aumentar taxa de filtração e assim aumentada capacidade de alojamento de fabricação de cerveja através de diminuído tempo gasto no processo de separação de decocto. . ausência de racking de leito de filtro induzida por desenvolvimento de pressão. Como marcado por (1) na parte inferior de Tabela 3 somente o racking obrigatório foi introduzido quando incluindo o LAMINEX XG na etapa de formação de massa (marcado por (1) na Tabela 3).
[000183] Diminuição de tempo de espargimento contribui para diminuição em tempo total de separação de decocto dos grãos e um potencial aumento no número de ciclos/dias de fabricação de cerveja. Tabela 3. Experimentos de formação de massa de cervejaria piloto - Resumo de dados de separação de decocto de grãos
Figure img0002
Figure img0003
* A partir de volume total e tempo total de separação de decocto de grãos 1 significa raking induzido por aumento de pressão, 0 significa nenhum raking, (1) significa raking obrigatório induzido manualmente no início de 2o espargimento se não houve nenhum antes.
[000184] Análises de amostras de decocto de massas adicionadas com LAMINEX XG no processo de formação de massa resultam em: .diminuído beta-glucano em decocto como medido pelo processo beta-glucano de ligação mista Megazyme (catálogo Megazyme referência K-BGLU aquiescendo com processo padrão AOAC 995.16) (ver Tabela 4).
[000185] Diminuído beta-glucano residual de decocto pode resultar em uma positiva diminuição em viscosidade de decocto, assim aumentando capacidade de filtração e alojamento de fabrico de cerveja através de aumento de número de ciclos/dias de fabricação de cerveja. .extrato aumentado até 2,3% (ver Tabela 4).
[000186] Um aumento em extrato pode render um positivo aumento em rendimento de alojamento de fabricação de cerveja - mais produto produzido a partir da mesma quantidade de material bruto - em outros termos uma aumentada capacidade de alojamento de fabrico de cerveja em uma maneira mais eficiente em custo. Tabela 4. Análises de decocto de cervejaria piloto:
Figure img0004
73: controle negativo: nenhum controle de enzima 75: LAMINEX Super em 0,20 kg/ton 79: LAMINEX XG em 0,133 kg/ton
Filtração de cerveja de cervejaria piloto
[000187] A comparação a LAMINEX Super adição do LAMINEX XG no processo de formação de massa resulta em: .aumentada taxa de fluxo durante filtração de cerveja (ver Tabela 5).
[000188] Aumentada taxa de fluxo durante filtração de cerveja tem o efeito positivo de aumentar capacidade de filtração e assim potencialmente diminuir (limitar) as necessidades de extra capacidade de tanque de cerveja brilhante (BBT) (BBTs são tanques de pressão usados para estocagem de cerveja após filtração até enchimento. Estes tanques são capazes de manter uma pressão estável, evitar perda de dióxido de carbono e prevenir a formação de espuma). diminuição significante em desenvolvimento de pressão através de filtro sobre o tempo (ver Tabela 5).
[000189] Diminuição em desenvolvimento de pressão através de filtro sobre o tempo aumenta positivamente o comprimento do ciclo de filtração entre limpeza. Isto limita positivamente limpeza no lugar, o consumo de água e energia. Também a quantidade de material de filtro necessária é diminuída resultando em economias de custo. Ciclos de filtração mais longos entre limpeza reduz positivamente a perda de cerveja vinda de partida e interrupção de processo de filtração de cerveja. Tabela 5. Resumo de dados de filtração de cerveja de cervejaria piloto:
Figure img0005
Figure img0006
73: controle negativo: nenhum controle de enzima 75: LAMINEX Superem 0,20 kg/ton 79: LAMINEX XG em 0,133 kg/ton
Análises de cerveja de cervejaria piloto
[000190] Análises de cerveja produzida de massas adicionadas com LAMINEX XG no processo de formação de massa mostram: .diminuído beta-glucano em cerveja (ver Tabela 6)
[000191] Diminuído beta-glucano em cerveja pode diminuir positivamente viscosidade de cerveja e pelo que aumentar o ciclo de filtração e reduzir o auxílio de filtro e consumo de instalação (economia de custo). .diminuída turvação de cerveja (ver Tabela 6)
[000192] O principal contribuinte para turvação de cerveja pode estar relacionado a material não beta-glucano . Reduzido beta-glucano de cerveja também pode contribuir positivamente para diminuída turvação de cerveja, rendendo uma aparência positiva para a cerveja. .nenhuma diminuição em estabilidade de espuma (ver Tabela 6 - valor de retenção de parte superior)
[000193] Estabilidade de espuma de cerveja não foi diminuída usando o "LAMINEX Super cone. 1,5 vezes + adicionais 50% de atividade extra do componente T. reesei". Isto é positivo na medida em que pode ser um fator de compromisso com relação a aparência e qualidade de cerveja. . diminuídos pentosanos de cerveja podem ser esperados.
[000194] Diminuídos pentosanos em cerveja pode contribuir positivamente para aumentada filtração de cerveja. Tabela 6. Análises de cerveja de cervejaria piloto:
Figure img0007
73: controle negativo: nenhum controle de enzima 75: LAMINEX Super em 0,20 kg/ton 79: LAMINEX XG em 0,133 kg/ton
Exemplo 4
[000195] Estudos de cervejaria de escala total
[000196] Experimento de linha 1:
[000197] O experimento foi corrido sobre uma composição de grãos de Cevada 31,6% usando 9500 kg de grãos por fabricação de cerveja (3000 kg de Cevada, 6500 kg de Malte).
[000198] Como demonstrado pela Tabela 7, bons resultados foram observados com LAMINEX XG com relação a separação de massa. Diminuição de tempo de separação de decocto de grãos tem o potencial de reforçar a capacidade de alojar de fabricação de cerveja através de aumento de número de ciclos/ dias de fabricação de cerveja. Tabela 7. Performance de alojamento de fabricação de cerveja sobre separação de massa
Figure img0008
Experimento linha 2:
[000199] O experimento foi corrido sobre uma composição de grãos de Cevada 28% usando 12300 kg de grãos por fabricação de cerveja (3500 kg de Cevada, 8800 kg de Malte).
[000200] Como demonstrado pela Tabela 8, bons resultados foram observados com LAMINEX XG com relação a filtração de cerveja. .aumentados ciclos de filtração de cerveja entre limpeza tem o potencial de reforçar a capacidade de alojamento de fabricação de cerveja através de diminuição de tempo gasto em limpeza e aumento de número de ciclos/dias de fabricação de cerveja der filtração de cerveja. Também, aumento de ciclos de filtração de cerveja resulta em economia de custos e reduzido consumo de energia e reduzida perda de cerveja originando de partida e interrupção de filtração de cerveja. .redução de auxílio de filtro e consumo de utilidade (reduzido consumo de kieselguhr) resultam em uma direta economia de custos. Tabela 8. Performance de alojamento de decoto sobre filtração de cerveja.
Figure img0009
[000201] Como apresentado em Tabela 9 análises de cerveja produzida de Linha 2 adicionada com LAMINEX XG no processo de formação de massa .mostraram: diminuído beta-glucano em cerveja.
[000202] Diminuído beta-glucano em cerveja pode diminuir positivamente viscosidade de cerveja e pelo que aumentar o ciclo de filtração e reduzir o auxiliar de filtro e consumo de utilidade (economia de custo). .reduzidos pentosanos de cerveja podem ser esperados.
[000203] Diminuídos pentosanos de cerveja podem contribuir positivamente para aumentada filtração de cerveja através de redução de viscosidade. .reduzida viscosidade dinâmica de cerveja
[000204] Reduzida viscosidade de cerveja pode aumentar positivamente ciclos de filtração e reduzir o auxiliar de filtro e consumo de utilidade (economia de custo). Aumentados ciclos de filtração também podem aumentar capacidade de alojamento de decocto através de aumento de número de ciclos/dias de filtração de cerveja. Tabela 9. Análises de cerveja de cervejaria de escala total, Linha 2
Figure img0010
[000205] SUMARIO- Dosagem de atividade de enzima usada em experimentos
[000206] São cedidos dados na razão PF/TR que é justo a razão de contribuição de cada componente para a atividade total. PF é a contribuição feita por Penicillium funiculosum e TR e contribuição feita por Trichoderma reesei. Tabela 10. Atividades CMC de enzimas usadas nos diferentes experimentos/exemplos.
Figure img0011
Ensaios
[000207] Ensaios 1: processo de atividade de DNS celulase (processo CMC DNS)
[000208] Nome sistemático: 1,4-( 1,3; 1,4)-β-D-glucano4-glucanohi- drolase
[000209] Número lUB: EC 3.2.1.4
Princípio
[000210] O ensaio de celulase é baseado na endo-hidrólise enzimática das ligações 1,4-β -D-glicosídicas em carbóxi metil celulose (CMS), um beta-1,4-glucano . Os produtos da reação (β-1,4-glucano oligossacarídeos) foram determinados colorimetricamente através de medição de resultante aumento em grupos redutores usando um reagente ácido 3,5-dinitro salicílico. Atividade de enzima foi calculada a partir da relação entre a concentração de grupos redutores, como equivalentes glicose, e absorbância em 540 nm.
[000211] O ensaio foi realizado em pH 5,0, mas ele pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
Definição de Unidade
[000212] Uma unidade de atividade celulase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes glucose por minuto sob as condições do ensaio (pH 5,0 (ou como especificado) e 50°C).
Materiais
[000213] Carbóxi metil celulose. Fornecedor: Metgazyme Ltd. Product No.: CM-Cellulose 4M
[000214] D-glicose ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10117. P.M.: 180,16
[000215] Acetato de sódio anidro ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck LTd (BDH). Product No.: 10236. P.M.: 82,03
[000216] Ácido acético ("glacial") AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10001. P.M.: 60,05
[000217] Ácido 3,5-dinitro salicílico GPR (ácido 3,5-dinitro-2-hidróxi benzóico). Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 28235
[000218] Pelotas de hidróxido de sódio ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10252. PM.: 40,00
[000219] (+)-tartarato de sódio potássio ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10219. PM.: 282,22
[000220] Solução 1,5% (solução peso/volume) de carbóxi metil celulose (CMC) em tampão de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0 (solução substrato).
[000221] Solução de ácido 3,5-dinitro salicilico (DNS). 20 g/L de DNS em tampão contendo 32 g/L de pelotas de hidróxido de sódio, e 600 g/L de (+)-tartarato de sódio potássio.
[000222] Solução padrão de glucose (0,50 mg/mL)
Procedimento
[000223] O complexo de enzimas foi diluído em amostras e uma curva padrão de glicose como mostrado na figura 2 foi feita usando concentrações de glicose de 0, 0,125, 0,25, 0,375, e 0,5 mg/mL.
[000224] 0,25 mL de solução de enzima foi misturado com 1,75 mL da solução substrato (1,5% peso/volume) em 50°C e a reação foi interrompida após 10 minutos pela adição de solução de DNS. Isto é seguido por aquecimento a 95°C por 5 minutos.
[000225] A densidade ótica foi medida em 540 nm (OD540nm) das amostras diferentes.
Cálculo
[000226] A atividade de enzima é determinada a partir da curva padrão como mostrado na figura 2.
[000227] A atividade é calculada como se segue:
Figure img0012
onde: T = ΔOD540nm Teste = OD540nm Teste - OD540nm Branco m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0) c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,02) 180,16 = peso molecular de glicose 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em ml_ V = volume de enzima em ml_ t = tempo de ensaio em minutos D = fator real de diluição de enzima (por exemplo, para 1,000 g diluída para 1 litro D = 1000) Ensaio 2. Endo-1,4-beta-xilanase (processo xilano de bétula DNS)
Princípio
[000228] A reação, catalisada por endo-1,4-beta-xilanase, envolve a endo hidrólise das ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilano (por exemplo, xilano da madeira de bétula ou xilanos substituídos de cereais como arabino xilano de trigo) formando beta-1,4-xilano oligossacarídeos.
[000229] Os produtos da reação (beta-1,4-xilano oligossacarídeos) foram determinados colorimetricamente, através de medição de resultante aumento em grupos redutores usando um reagente ácido 3,5- dinitro salicílico. Atividade de enzima é calculada a partir da relação entre a concentração de grupos redutores, como equivalentes xilose, e absorbância em 540 nm.
[000230] O ensaio padrão foi realizado em pH 3,5, mas ele pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
Definição de Unidade
[000231] Uma unidade de atividade endo-1,4-beta-xilanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de equivalente xilose por minuto sob as condições do ensaio (pH 3,5 (ou como especificado) e 50°C).
Materiais:
[000232] Ver a lista de materiais dada acima para o ensaio de atividade de Celulase.
[000233] Xilano de bétiula. Fornecedor: Sigma Chemical Co. Product No.: X 0502]D-(+)-xilose ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10372. PM.: 150,13
[000234] Solução de xilano de bétula 1,5% (solução peso/volume) em tampão acetato de sódio 0,1, pH 4,0 (solução substrato).
[000235] Solução padrão de xilose (0,50 mg/mL)
Procedimento
[000236] 1,75 mL de solução de xilano de bétula foram misturados com 0,25 mL de solução de enzima diluída a 50°C por 10 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 2 mL de solução DNS, seguido por aquecimento para 95°C por 5 minutos. Densidade ótica foi medida em 540 nm (OD540nm).
[000237] Uma curva padrão foi feita a partir de 0,125, 0,250, 0,375, 0,500 mg/mL de xilose.
Cálculo
[000238] A atividade é calculada como se segue:
Figure img0013
onde: T = ΔOD540nm Teste = OD540nm Teste - OD540nm Branco m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0) c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,02) 150,13 = peso molecular de xilose 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em mL V = volume de enzima em mL t = tempo de ensaio em minutos D = fator real de diluição de enzima (por exemplo, para 1,000 g diluída para 1 litro D = 1000) Ensaio 3. Laminarinase (processo laminarina DNS)
Princípio
[000239] A reação, catalisada por laminarinase, envolve a endo hidrólise de ligações 1,3-glicosídicas em 1,3-beta-D-glucano s. Substratos incluem laminarina, pramylon e pachyman. Os produtos da reação (beta-1,3-glucano oligossacarídeos) são determinados colorimeticamente através de medição de resultante aumento em grupos redutores usando um reagente ácido 3,5-dinitro salicílico. Atividade de enzima é calculada a partir da relação entre a concentração de grupos redutores, como equivalentes glicose, e absorbância em 540 nm.
[000240] O ensaio foi realizado em pH 5,0 e 50°C, mas ele pode ser realizado em diferentes valores de pH e temperatura para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
Definição de Unidade
[000241] Uma unidade de atividade laminarinase é definida como a quantidade de enzima que produzi micromol de equivalentes de glicose por minuto sob as condições do ensaio (pH 5,0 e 50°C (ou como especificado)).
Materiais
[000242] Ver materiais dados acima para o ensaio de atividade de Celulase.
[000243] Laminarina (de Laminaria digitata). Fornecedor: sigma- Aldrich Co. Ltd. Product No.: L 9634
[000244] Solução de Laminarina 1,00% (solução peso/volume) (solução substrato tampão de acetato de sódio 0,1M, pH 5,0)
[000245] 1,75 mL de solução de laminarina são misturados com 0,25 ml_ de solução diluída de enzima a 50°C por 10 minutos e a reação interrompida pela adição de 2 ml_ de solução DNS.
[000246] Curva padrão foi feita usando 0, 0,125, 0,25, 0,5 e 0,75 mg/mL de solução de glicose.
[000247] Densidade ótica foi medida em 540 nM (OD540 nm).
Cálculo
[000248] A atividade é calculada como se segue:
Figure img0014
onde: T = ΔOD540nm TβStβ = ODs40nm Teste - OD540nm Branco m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0) c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,03) 180,16 = peso molecular de glicose 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em ml_ V = volume de enzima em ml_ t = tempo de ensaio em minutos D = fator real de diluição de enzima (por exemplo, para 1,000 g diluída para 1 litro D = 1000) Ensaio 4. Ensaio de arabinase
Princípio
[000249] O ensaio de atividade de arabinase é baseado na determinação colorimétrica através de medição de resultante aumento em grupos redutores usando um reagente ácido 3,5-dinitro salicílico. Atividade de enzima foi calculada a partir da relação entre a concentração de grupos redutores, como equivalentes arabinose, e absorbância em 540 nm.
[000250] O ensaio foi realizado em pH 3,5, mas ele pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas.
Definição de Unidade
[000251] Uma unidade de atividade arabinanase (arabinase (endo- 1,5-alfa-L-arabinanase)) é definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de equivalentes arabinose por minuto sob as condições do ensaio (pH 3,5 (ou como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de equivalentes de arabinose por minuto sob as condições do ensaio (pH 3,5 (ou como especificado) e 50°C).
Materiais
[000252] Arabinano de beterraba sacarina de Megazyme
[000253] Arabinose Sigma A3131 PM.: 150,1
[000254] Acetato de sódio anidro ‘analaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10236. PM.: 82,03
[000255] Ácido acético ("glacial") ‘AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10001. PM.: 60,05.
[000256] Ácido 3,5-dinitro salicílico GPR (ácido 3,5-dinitro-2-hidróxi benzóico). Fornecedor.: Merck Ltd (BDH). Product No.: 28235
[000257] Pelotas de hidróxido de sódio ‘AnaIR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). Product No.: 10252. PM.: 40,00
[000258] (+)-tartarato de sódio potássio "AnalaR’. Fornecedor: Merck Ltd (BDH). No. de produto.: 10219. PM.: 282,22
[000259] Solução de arabinano 1,5% (solução peso/volume) em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 3,5 (solução substrato)
[000260] Solução de ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS). 20 g/L de DNS em tampão contendo 32 g/L de pelotqs de hidróxido de sódio, e 600 g/L de (+)-tartarato de sódio potássio.
[000261] Solução padrão de arabinase (0,50 mg/mL).
Procedimento
[000262] O complexo de enzimas foi diluído em amostras e uma curva padrão de glicose foi feita usando concentrações de arabinase de 0, 0,125, 0,25, 0,375, e 0,5 mg/mL.
[000263] 0,25 mL de solução de enzimas foi misturado com 1,75 mL da solução substrato (1,5% peso/volume) a 50°c e a reação foi interrompida após 10 minutos pela adição de solução de DNS. Seguido por aquecimento para 95°C por 5 minutos.
[000264] A densidade ótica foi medida em 540 nm (ODs40nm) das diferentes amostras.
Cálculo
[000265] A atividade de enzima é determinada a partir da curva padrão.
[000266] A atividade é calculada como se segue:
Figure img0015
onde: T = ΔOD540nm TESTE — OD540nm TESTE — OD540nm BRANCO m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0) c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,02) 150,13 = peso molecular de arabinase 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em mL V = volume de enzima em mL t = tempo de ensaio em minutos D = fator real de diluição de enzima (por exemplo, para 1,000 g diluído para 1 litro D = 1000) Ensaio 5. Ensaio de arabino furanosidase
[000267] A reação, catalisada por alfa-N-arabino furanosidase, envolve a hidrólise da ligação terminal, no resíduo alfa-L-arabino furanosídeo não redutor, de alfa-L-arabinosídeos. A enzima atua sobre alfa-L-arabino furanosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3)- e/ou (1,5), arabino xilanos e arabino galactanos.
[000268] O ensaio de alfa-N-arabino furanosidase é baseado na hidrólise enzimática de p-nitro fenil alfa-L-arabino furanosídeo. O ensaio é um processo de "dois pontos" antes que uma "monitoração contínua". O cálculo de atividade de enzima é baseado em medições tomadas somente no início e fim do período de incubação. Um produto da reação, p-nitro fenol é determinado colorimetricamente (após ajuste de pH). Atividade de enzima é calculada a partir da relação entre a concentração de p-nitro fenol e absorbãncia em 400 nm.
Prpearação de solução diluída de enzima:
[000269] Preparar todas as soluções de enzimas, a partir de preparações de enzimas líquidas ou pulverizadas, com água destilada. Minimizar erros de diluição de ensaio evitando etapas de grande diluição envolvendo pequenos volumes ou pesos. Na fabricação de diluições de enzimas é mais preciso, mesmo para uma amostra líquida, pesar a amostra inicial de enzima. Se isto é feito, no caso de amostras líquidas é por isso necessário medir o peso específico do líquido a 20°C.
[000270] Como o ensaio é um processo de "dois pontos" antes que uma "monitoração contínua", é importante assegurar a linearidade dentro de período de incubação com diferentes sistemas e condições de enzimas. Sob as condições padrões de ensaio de concentração de substrato, pH, temperatura e tempo o ensaio foi demonstrado ser linear na faixa de ΔODs40nm TESTE (T) = 0,20-1,50. entretanto, para boa prática, o ensaio é operado dentro de uma faixa definida de ΔOD540nmTESTE (T) = 0,400 - 0,800.
Procedimento
[000271] Cada ensaio de amostra de enzima envolve três análises: análises de teste duplicata (TESTE) e uma análise em branco (BRANCO). O procedimento dado descreve a análise de uma amostra de enzima simples.
Figure img0016
[000272] 0,25 mL de solução diluíc a de enzimas foi adicionado às soluções a 50°C, a reação foi interrompida após 10 minutos pela adição de 4 mL de solução de glicina 0,4 M, pH 10,8 (reagente de interrupção).
[000273] Absorbância foi medida em 400 nm a 25°C contra um branco de água. .determinar OD4oonm TESTE para os TESTES em duplicata medidos; .determinar ODzioonm BRANCO. Cálculo
Figure img0017
onde: T = OD400nm TESTE - OD400 nm BRANCO 18300 = coeficiente de extinção m olar de p-nitrofenol (1 cm de comprimento de caminho) V = 7,25 (volume líquido total em teste em mL) T = 10 (minutos) 1 u = 1 pmol.min'1 E = 0,25 (volume de amostra de enzima diluída em ml_) D = fator de diluição de enzima, por exemplo, para 1 ml_ diluido para 1 litro D = 1000) Ensaio 6. Ensaio de celobioidrolase
Princípio
[000274] A reação, catalisada por celobioidrolase, envolve a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose e celotetraose, liberando celobiose a partir de extremidades não redutoras das cadeias.
[000275] O ensaio de celobioidrolase4 é baseado na hidrólise enzimática de p-nitro fenol beta-D-celobiopiranosídeo. O produto da reação, p-nitro fenol é determinado colorimetricamente (após ajuste de pH). Atividade de enzima é calculada a partir da relação entre a concentração de p-nitro fenol e absorbância em 400 nm.
[000276] O ensaio é operado dentro de faixas definida Iine4ar de ΔOD54onm TESTE (T) = 0,400 - 0,800.
Procedimento
[000277] Cada ensaio de amostra de enzima envolve três análises: análises de teste duplicata (TESTE) e uma análise em branco (BRANCO). O procedimento dado descreve a análise de uma única amostra de enzima.
Figure img0018
[000278] 0,25 ml_ de solução de enzima diluída foi adicionado à solução teste a 50°C, após 30 minutos 4 ml_ de solução de glicina 0,4 M, pH 10,8 (reagente de interrupção) foram adicionados a cada tubo.
[000279] Absorbância foi medida a 20°C em 400 nm em uma cubeta de vidro de 1 cm contra um branco de água. .determinar ODOOnmk de TESTE para os TESTES duplicatas medidos; .determinar OD400nm de BRANCO Cálculo
Figure img0019
onde: T = OD4oonm TESTE — OD4oonm BRANCO 18300 = coeficiente de extinção molar para p-nitrofenol (comprimento de caminho de 1 cm) V = 7,25 (volume líquido total em teste em mL) 1000 = para converter para litros 106 = para converter para pmoles T = 30 (minutos) 1 u = 1 pmol.minuto1 E = 0,25 (volume de amostra de enzima diluída em mL) D = fator de diluição de enzima, por exemplo, para 1 mL diluído para 1 litro D = 1000) Ensaio 7. Ensaio de beta-glucanase
Princípio
[000280] A reação, catalisada por endo-1,3(4)-beta-glucanase , envolve a endo hidrólise de ligações 1,3- ou 1,4-glicosídicas em betqa- D-glucano s quando o resíduo glicose, cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada, é ele próprio substituído em C-3. Substratos incluem beta-D-glucano s de cereais, laminarina e liquenina. Por definição esta enzima é diferente de EC 3.2.1.39 (endo-1,3-beta- glucanase , ou laminarinase).
[000281] O ensaio de endo-1,3(4)-beta-glucanase é baseado na hidrólise enzimática das ligações 1,3- ou 1’,4-glicosídicas em beta- glucano de cevada, um beta-1,3(4)-glucano . Os produtos da reação (beta-1,3(4)-glucano oligossacarídeos) são determinados colorimetricamente através de medição de resultante aumento em grupos redutores usando um reagente ácido 3,5-dinitro salicílico. Atividade de enzima é calculada a partir da relação entre a concentraçãode grupos redutores, como equivalentes glicose, e absorbância em 540 nm.
[000282] Neste ensaio após a adição e mistura do reagente DNS os tubos de ensaio são colocados em um banho de água fervendo (mínimo de 95°C) e incubados por exatamente 15 minutos. Isto está em contraste a ensaios de enzima baseados em DNS com outros substratos onde o período de incubação é é de 5 minutos. Esta mudança também afeta a faixa de valores de ΔODs40nm TESTE (T) que são aceitáveis no teste.
[000283] Embora o ensaio padrão seja realizado em pH 5,0, ele pode ser realizado em diferentes valores de pH para a adicional caracterização e especificação de enzimas. Neste caso somente o pH das soluções tampões (notadas abaixo) é alterado.
Reagentes Requeridos
[000284] Em todos os casos, exceto para o beta-glucano , é a identidade e pureza dos reagentes, e não o fornecedor, que são importantyes.
[000285] Beta-glucano (Cevada; viscosidade média), MEgazyme Ltd., Produto N° P-BGBM, viscosidade: 20-30 cSt
[000286] D-glicose ‘AnalaR’, Merck Ltd. (BDH), Produto N° 10117, PM.: 180,16
[000287] Acetato de sódio anidro ‘AnalaR’, Merck Ltd. (BDH), Produto N° 10236, PM.: 82,03
[000288] Ácido acético ("glacial") ‘AnalaR’, Merck Ltd (BDH), Produto N° 10001, PM 60,05
[000289] Ácido 3,5-dinitro salicílico GPR (ácido 3,5-dinitro-2-hidróxi benzóico), Merck Ltd (BDH), Produto N° 28235
[000290] Pelotas de hidróxido de sódio ‘AnalaR’, Merck Ltd. (BDH), Produto N° 10252, PM.: 40,00
[000291] (+)-tartarato de sódio potássio ‘AnalaR’, Merck Ltd (BDH), Produto N° 10219, PM.: 282,22
Reagentes
[000292] Beta-glucano 1,5% (solução peso/volume em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0) (Barley;
[000293] Aolução de ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS): 10 g DNS, 16 g de pelotas de hidróxido de sódio, 300 g de (+)-tartarato de sódio potássio foram dissolvidos em 1000 mL de água destilada
Tampão acetato de sódio 1M, pH 5,0 Solução padrão de glicose (1,000 mg/mL) Procedimento
[000294] Cada ensaio de amostra de enzima envolve três análises: análise de teste em duplicata (TESTE) e uma análise de branco (BRANCO). Uma curva padrão de glicose também é requerida.
[000295] o,25 mL de solução diluída de enzima é adicionado a 1,75 (??) de solução de beta-glucano a 50°C, 2 mL de solução de DNS foram adicionados após 10 minutos e os tubos foram colocados a 95°C mínimos por 15 minutos. Resfriar para 25°+Ccom água.
[000296] 10 mL de água destilada foram adicionados e densidade ótica medida em 540 nm (OD540nm) usando uma cubeta de 1cm de comprimento de caminho.
[000297] Determinar ODõ40nmTESTE para os TESTES em duplicata medidos;
[000298] Determinar ODs40nm de BRANCO;
[000299] Determinar ODs40nm PADRÕES para 0,125, 0,250, 0,500, 0,750 mg/mL de padrões de glicose feitos referência contra a amostra PADRÃO de glicose de 0,00 mg/mL (ou contra água).
Cálculos
[000300] Determinar ΔODs40nm TESTE (T) = ODs40nm TESTE - ODõ40nm BRANCO
[000301] A atividade é calculada como se segue:
Figure img0020
onde: T = ΔODs40nm TESTE = ODs40nm TESTE — ODs40nm BRANCO m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0)] c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,02) 180,16 = peso molecular de glicose 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em mL 2,00 mL usados V = volume de enzima em mL 0,25 mL usado t = tempo de ensaio em minutoslO minutos usados D = fator de diluição de enzima (por exemplo, parqa 1 g diluído para 1 litro D = 1000) TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMULÁRIO INTERNACIONAL RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL EMITIDO POR FORÇA DA REGRA 7.3 E DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE EMITIDA POR FORÇA DA REGRA 10.2 A American Type Culture Collection (ATCC®) recebeu seu depósito de sementes/linhagem(s)/cepa(s) em associação com o depósito de um pedido de patente para patente. A informação a seguir é fornecida para satisfazer os requisitos do Registro de Patentes. Para: Kathleen Houghtaling Danisco A/S 1700 Lexington Ave Rochester, NY 14606 Depositado em Nome de: Danisco A/S Data de Recebimento de sementesZlinhagem(s) pela ATCC®: 05 de Maio de 2009 Referência de Identificação pelo Depositante: Designação de Depósito de Patente da ATCC®: Tríchoderma reesei GC Cellulase A83 GICC 0004 M03000004 PTA-10001 A ATCC® entende que: 1. O depósito destas sementes/cepa(s) não concede à ATCC® uma licença, expressa ou subentendida, para infringira patente e a nossa liberação destas sementesZcepa(s) para outros não concede aos mesmos uma licença, expressa ou subentendida, para infringir a patente. 2. Se o depósito precisar expirar ou ser destruído durante o prazo efetivo da patente, deve ser de sua responsabilidade substituí-lo com material viável: Também deve ser de sua responsabilidade fornecer uma quantidade suficiente para distribuição durante o prazo de depósito. A ATCC® distribuirá e manterá o material durante 30 anos ou 5 anos após o requerimento mais recente pelo depósito, seja qual for mais longo. Os Estados Unidos da América e muitos outros países são signatários do Tratado de Budapeste. Antes da concessão de uma Patente U.S., a ATCC® concorda em pagar uma taxa de serviço única, em não distribuir estas sementesZcepa(s) ou qualquer informação que se relaciona às mesmas ou ao seu depósito exceto quando instruído pelo depositante ou registro de patente relevante. Após concessões de patente relevantes somos responsáveis por liberar as sementesZcepa(s) e estas se tornarão disponíveis para distribuição para o público sem quaisquer restrições. Nós lhe informaremos as solicitações para as sementesZcepa(s) durante 30 anos a partir da data de depósito. O depósito foi testado em 14 DE MAIO DE 2009 e até tal data, as sementesZcepa(s) eram viáveis Autoridade Depositante Internacional: American Type Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA, USA Latha Ramakrishnan on Depositante de Patente na ATCC® Ref. Protocolo ou Case No:

Claims (10)

1. Complexo de enzimas com atividade de beta 1,4- endoglucano hidrolase, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um produto de expressão de Trichoderma reesei', e b. um produto de fermentação de Penicillium funiculosum compreendendo uma ou mais enzimas selecionadas de uma xilanase (EC 3.2.1.8), uma celulase (EC 3.2.1.4), e uma beta- glucanase (EC 3.2.1.6); em que a razão da atividade da beta-1,4-endoglucana-hidrolase de Penicillium funiculosum e de Trichoderma reesei é de 0,25/0,75 a 0,35/0,65 e em que a atividade da beta-1,4-endoglucana-hidrolase do complexo enzimático é medida usando o seguinte ensaio: uma unidade de atividade da celulase é definida como a quantidade de enzima que produz de 1 pmole de equivalentes de glicose por minuto nas condições do ensaio (pH 5,0) e 50 °C; o complexo enzimático é diluído nas amostras e é feita uma curva padrão de glicose usando concentrações de glicose de 0, 0,125, 0,25, 0,375 e 0,5 mg/ml; 0,25 ml de solução enzimática são misturados com 1,75 ml da solução de substrato (1,5% p/v, solução de carboximetilcelulose (CMC) em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0) a 50 °C e a reação é interrompida após 10 minutos por adição da solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (20 g/L de DNS em tampão contendo pastilhas de hidróxido de sódio de 32 g/L, e 600 g/L de potássio e sódio (+)-tartarato); isto é seguido por aquecimento a 95 °C por 5 minutos; a densidade óptica é medida a 540 nm (OD540nm); a atividade enzimática é determinada a partir da curva padrão; A atividade é calculada da seguinte forma:
Figure img0021
em que: T = ΔOD540nm Teste = ODs40nm Teste - ODs40nm Branco m = gradiente da curva padrão (aproximadamente 1,0) c = eixo y intercepta a curva padrão (sempre negativo e aproximadamente -0,02) 180,16 = peso molecular da glicose 103 = para converter para micromoles A = volume de ensaio em mL V = volume de enzima em mL t = tempo de ensaio em minutos D = fator real de diluição de enzima (por exemplo, para 1,000 g diluída para 1 litro D = 1000)
2. Complexo de enzimas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que produto de expressão obtido por fermentação do Penicillium funiculosum compreende uma xilanase.
3. Complexo de enzimas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais atividades de enzima selecionadas da lista consistindo em endo-1,4-β- xilanase, endo-1,3(4)-β-glicanase, celulase, laminarinase, endo-1,5-a- L-arabinanase, beta-D-glicosídeo glicoidrolase, β -xilosidase, celobiohidrolase, glucano 1,4-beta-glicosidase, exo-beta-1,4-glucanase específica para xiloglucano e o-N-arabinofuranosidase.
4. Complexo de enzimas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que apresenta uma atividade de enzima de pelo menos 3000 U/g, como medida através do ensaio como definido na reivindicação 1, derivada do produto de fermentação de Trichoderma reesei.
5. Complexo de enzimas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que apresenta uma atividade total de enzima de pelo menos 4000 U/g como medida através do ensaio, de acordo com a reivindicação 1.
6. Processo para a produção de um complexo de enzimas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a. fermentação de Trichoderma reeseiem um meio para obter um caldo de fermentação; b. fermentação de Penicillium funiculosum em um meio para obter um caldo de fermentação, e c. recuperação e combinação de cada caldo de fermentação derivado de etapa (a) e (b) na forma de um caldo livre de células a partir das ditas fermentações para obter um complexo de enzimas, em que em que a razão da atividade da beta-1,4-endoglucana-hidrolase de Penicillium funiculosum e de Trichoderma reesei é de 0,25/0,75 a 0,35/0,65, em que a atividade da beta-1,4-endoglucana-hidrolase do complexo enzimático é medida pelo ensaio, como definido na reivindicação 1
7. Complexo de enzimas, caracterizado pelo fato de ser obtenível através de um processo, como definido na reivindicação 6.
8. Uso de um complexo de enzimas, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser em um processo para produção de uma massa de fabricação de cerveja, tal como na produção de uma bebida de malte, tal como uma cerveja, tal como uma cerveja de bebida de malte e/ou em uma produção de uísque e/ou na produção de biocombustível.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o complexo de enzimas é usado na massa para auxiliar na separação de mosto de grãos e/ou filtração de massa e/ou filtração de cerveja.
10. Uso de um complexo de enzimas, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na produção de suco de fruta, vinho, processamento de grão, álcool combustível e álcool de bebida.
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