CN102482657A

CN102482657A - 里氏木霉和绳状青霉酶的酶复合物

Info

Publication number: CN102482657A
Application number: CN2010800270956A
Authority: CN
Inventors: N·M·费什; L·B·米勒
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: International Nutrition And Health Denmark Ltd
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-05-07
Also published as: PL2427550T3; EA025703B1; US20120058510A1; AU2010244397B2; JP5876823B2; CA2761008A1; EP2427550B1; CA2761008C; UA106372C2; EP2427550A1; US10119129B2; US20120270263A9; MX2011011724A; BRPI1012166A2; AU2010244397A1; AR076661A1; JP2012525831A; WO2010128140A1; BRPI1012166B1; EP3524674A1

Abstract

本发明涉及通过木霉菌属的发酵获得的表达产物与不同真菌菌株的一种或多种酶组合的具有多种酶活性的改进的酶复合物。

Description

里氏木霉和绳状青霉酶的酶复合物

发明领域

本发明涉及通过木霉属(Trichoderma)的发酵获得的表达产物与不同种的真菌菌株的一种或多种酶组合的具有多种酶活性的改进的酶复合物。

发明背景

啤酒生产中酶的使用是众所周知的。将酶用于淀粉糖化(mashing)步骤以改善醪液过滤性(mash filterability)和增加浸出物收得率(extract yield)的应用描述于WO 97/42302中。

WO2005118769和WO2005059084涉及用于生产啤酒的方法中的淀粉糖化和过滤步骤和涉及用于这样的方法的酶促组合物。

WO1999057325涉及绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)的菌株，从其获得的新型酶混合物以及其核酸序列。

然而，对可用于食品生产中，例如在酒精饮料例如啤酒或威士忌酒生产中的淀粉糖化、蒸煮和过滤步骤中的改进的酶复合物存在需要。

发明目的

本发明的实施方案的一个目的是提供改进的酶复合物，所述酶复合物使得能够将改进的生产方法用于制备例如食品，例如用于酒精饮料例如啤酒或威士忌酒或生物燃料生产中的淀粉糖化、蒸煮和过滤步骤。

发明概述

本发明者已发现，通过组合由木霉属的种发酵获得的表达产物与任一不同种的真菌的特定酶，可获得所述酶复合物的改进性质。这样，在第一方面，本发明涉及来源于如下组合的酶复合物：

a.通过发酵木霉属的种获得的表达产物；和

b.选自木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)的真菌界任一不同种的一种或多种酶；

并且其中如通过本文中所述的“测定1”法测量的，至少约61％的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性来源于该木霉属的发酵。

应当理解，“真菌界的任一不同种”是指与(a)中所述木霉属的种不同的种。

在第二方面，本发明涉及来源于如下组合的酶复合物：

a.至少约61％的通过木霉属的发酵获得的表达产物；和

b.少于约39％的通过青霉属(Penicillium)不同真菌的发酵获得的表达产物；

其中所述百分比基于如通过在本文中所述的“测定1”法测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性。

在第三方面，本发明涉及用于产生酶复合物的方法，所述方法包括步骤：

a.在培养基中发酵木霉属以获得发酵液；

b.在培养基中发酵青霉菌属以获得发酵液，和

c.以来自所述发酵的无细胞培养液的形式回收和组合来源于步骤a)和b)的各酶复合物以获得酶复合物，其中如通过本文中所述的“测定1”法测量的至少约61％的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性来源于木霉属的发酵。

在另外的方面，本发明涉及根据本发明的酶复合物在用于啤酒糟(brewing mash)的生产例如用于麦芽酒精饮料例如啤酒，例如麦芽酒精饮料啤酒的生产和/或威士忌酒的生产和/或生物燃料的生产的方法中的用途。

在另外的方面，本发明涉及根据本发明的酶复合物在果汁、果酒(wine)、粮食加工、燃料酒精和可饮用酒精的生产中的用途。

在另外的方面，本发明涉及来源于如下组合的酶复合物：

a.通过木霉属的种的发酵获得的表达产物；和

b.选自家族11木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)的真菌界任一不同种的一种或多种酶；

并且其中如通过本文中所述的“测定1”法测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性中至少约61％来源于木霉属的发酵。

图例说明

图1.实验室规模醪液试验1-麦芽汁β-葡聚糖和过滤体积。

图2.实验室规模醪液试验2-麦芽汁过滤体积，残留β-葡聚糖和粘度(在12°P)数据。

图3.预试验(Pilot trial)过滤数据-总过滤时间、平均流速和总压建立。A：阴性对照，无酶对照；B：0.20kg/吨的LAMINEX

Super；C：0.133kg/吨的LAMINEX

XG(LAMINEX

Super 1.5+50％以上的里氏木霉(T.reesei)活性)。

本发明的详细公开内容

啤酒在传统上称为来源于麦芽(例如来源于大麦的麦芽)和任选地辅料例如谷粒并且用啤酒花调味的的酒精饮料。术语“啤酒”包括任何已发酵的麦芽汁，其通过主要来源于谷粒的含淀粉材料例如发芽大麦的酿造和发酵产生的。也可使用小麦、玉米和稻。

如本文中所使用的，术语″麦芽酒精饮料″包括形成泡沫的发酵麦芽酒精饮料如完全加麦曲啤酒(malted beer)、淡色啤酒、干啤酒、淡啤酒、低酒度啤酒(light beer)、低酒精啤酒、低热量啤酒、波特(porter)、烈性啤酒(bock beer)、烈啤酒、麦芽酒、不含酒精的麦芽酒等。术语″麦芽酒精饮料″还包括不发泡的啤酒和可选地麦芽酒精饮料例如果味麦芽酒精饮料例如柑桔味，例如柠檬味、柑橘味、lime-或浆果味麦芽酒精饮料、酒调味的麦芽酒精饮料例如伏特加酒、罗姆酒或龙舌兰酒调味的麦芽酒，或咖啡调味的麦芽酒精饮料例如咖啡因调味的麦芽酒等。

啤酒可通过基本上相同的方法从多种谷物制造。所有谷类淀粉是其中葡萄糖残基通过α-1，4-或α-1，6-键连接(以前者为主)的葡萄糖同聚物。

制备发酵麦芽酒精饮料的方法通常称为酿造。用于制备这些饮料的主要原料是水、啤酒花和麦芽。此外，辅料例如普通粗玉米粉、精制粗玉米粉、酿造酵母(brewer′s milled yeast)、稻、高粱、精细的玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙的谷类、麦片(cereal flake)、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉和糖浆剂，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆等可用作淀粉的来源。最终将淀粉转化成糊精类和可发酵糖。

由于许多原因，主要从选择的大麦品种产生的麦芽对啤酒的总体特征和质量具有最大的影响。首先，麦芽是啤酒中的主要调味剂。第二，麦芽提供了大部分可发酵糖。第三，麦芽提供了形成啤酒的本体和泡沫特征的蛋白质。第四，麦芽在淀粉糖化过程中提供了必需的酶促活性。

啤酒花也对啤酒质量作出重大贡献，包括调味。具体地，啤酒花(或啤酒花成分)将期望的苦味物质加入啤酒。此外，啤酒花充当蛋白质沉淀剂、确立防腐剂和促进泡沫形成和稳定。

制造啤酒的方法在本领域内是公知的，但简而言之，其包括5个步骤：(a)淀粉糖化和/或辅料蒸煮(b)麦芽汁分离和提取(c)麦芽汁的煮沸和产生啤酒花(hopping)(d)冷却、发酵和贮存，和(e)成熟、加工和包装。

通常，在第一步骤，将磨成粉的或破碎的麦芽与水混合，在受控的温度下保持一段时间以允许存在于麦芽中的酶将麦芽中存在的淀粉转化成可发酵糖。

在第二步骤中，将醪液转移至″过滤槽(lauter tun)″或糖化醪滤器(mash filter)，在其中将液体与颗粒残余物分离。该甜液体被称为″麦芽汁″并且剩下的颗粒残余物被称为″酒糟(spent grains)″。通常对醪液进行提取，其包括将水加入醪液以从酒糟回收残留的可溶性提取物。

在第三步骤中，将麦芽汁剧烈地煮沸。这使麦芽汁灭菌并且帮助产生颜色、风味和气味。在煮沸过程中的某些点加入啤酒花。

在第四步骤中，冷却麦芽汁，将其转移至发酵罐，其装有酵母或向其中加入酵母。酵母通过发酵将糖转化成醇和二氧化碳气体；在发酵结束时冷却发酵罐或可冷却发酵罐来终止发酵。酵母絮凝并且被除去。

在最后的步骤中，冷却啤酒，将其贮存一段时间，在该过程中，啤酒澄清并且风味产生，并且沉淀出可能损害啤酒的外观、风味和贮存期限的任何物质。在包装前，给啤酒充二氧化碳以及，任选地进行过滤和巴氏消毒。

发酵后，获得通常包含按重量计约2％至约10％的酒精的饮料。不可发酵的碳水化合物在发酵过程中不被转化，并且在最终的啤酒中形成溶解固体的大部分。

该残留物由于麦芽淀粉酶不能水解淀粉的α-1，6-键而保留。不可发酵的碳水化合物贡献了约50卡路里/12盎司的啤酒。

最近，特别是在美国市场存在广受欢迎的称为低酒度啤酒、减少卡路里的啤酒或低卡路里啤酒的酿造饮料，如美国所定义的，此类啤酒具有比制造商的“常规”啤酒少约30％的卡路里。

关于常规酿造方法的进一步信息以及用于本发明的酿造技术的领域中使用的术语的定义可见于Research and Teaching Institute ofBrewing，Berlin(VLB)，第2次修定版1999，ISBN 3-921690-39-0或第3版(2004)：ISBN 3-921690-49-8的由Wolfgang Kunze编著的″技术酿造和制备麦芽(Technology Brewing and Malting)″。

定义

如本文中使用的术语″酶复合物″在本说明书中意指基本上不含细胞的组合物，所述组合物包含几种具有不同酶促活性和/或在不同酶委员会编号(EC编号)下分类的酶。当通过发酵获得“酶复合物”时，其为基本上不含细胞的发酵液，任选地为浓缩发酵液，其包含在终产物中。应理解，术语“酶复合物”也包括含有由两个或更多个分别的发酵方法(所述方法也可包括不同的微生物)产生的几种酶的组合物。在某些实施方案中，所述酶复合物是食品级酶复合物，意指其可用于食品的制备。

在本发明的某些方面，根据本发明的酶复合物包含在酿造过程中降解例如醪液的非常复杂的化合物所必需的副活性(side-activity)。术语″副活性″在本说明书中是指酶针对不是其主要底物的其他底物的活性，或其指酶复合物除了其主要活性外还具有的其他活性。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物包含至少5个不同的副活性。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物包含至少10个不同的副活性。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物包含至少15个不同的副活性。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物包含至少20个不同的副活性。

木聚糖酶被分类在EC 3.2.1.8，EC 3.2.1.32，EC 3.2.1.136和EC3.2.1.156中；可以例如如“测定2”中所描述的测量活性。

内切-1，4-β木聚糖酶被分类为EC 3.2.1.8。该酶引起木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内切水解。

如本文所使用的术语″家族11木聚糖酶″是指分类为EC 3.2.1.8的内切-1，4-β木聚糖酶，其引起木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键(xylosidiclinkage)的内切水解，并且按照B.Henrissat，A classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem.J.280(1991)，pp.309-316被分类为家族11木聚糖酶。

在一个方面，根据本发明的酶复合物具有如通过“测定2”(如在标题“测定”下所描述的)测量的内切-1，4-β木聚糖酶活性。

可使用木聚糖作为底物在pH 3.5或pH 5和50℃下进行″测定2″，或对于酶的进一步表征和鉴定，可以在不同的pH和温度值下进行该测定。根据每单位时间内由木糖引起的540nm处的吸光度的增加来计算酶活性。

木聚糖酶活性的一个单位在本文中定义为在“测定2”的条件(pH3.5和50℃)下引起ΔOD_540nm分钟^-1的增加的酶量(针对总测定体积标准化)。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物包含至少约5000U/g，例如至少约6000U/g，例如至少约7000U/g，例如至少约8000U/g，例如至少约8500U/g的木聚糖酶活性，如通过“测定2”测量的。

根据本发明的酶复合物具有纤维素水解活性。纤维素的系统名称为4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和纤维素分解酶或纤维素酶被分类在EC 3.2.1.4中。纤维素酶内切水解例如纤维素、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖类中的(1→4)-β-D-葡糖苷键，并且还可水解也包含1，3-键的β-D-葡聚糖类中的1，4-键。纤维素酶也具有其他名称，例如内切-1，4-β-D-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，4-内切葡聚糖水解酶、纤维素酶A、cellulosin AP、内切葡聚糖酶D、碱性纤维素、纤维素酶A 3、纤维糊精酶、9.5纤维素酶、微晶粉末纤维素酶(avicelase)、pancellaseSS和1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物的纤维素酶活性通过在下文中在标题″测定″下所述的“测定1”测量。

在其他方面，根据本发明的酶复合物具有β-葡聚糖酶活性，如“测定7”中所述测定的。

在pH 5.0下进行标准测定，对于酶的进一步表征和鉴定，可以在不同的pH值下进行该测定。

内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH5.0(或如所指定的)和50℃)下每分钟产生1μmole葡萄糖等同物的酶的量。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物包含至少约10000U/g，例如至少约12000U/g，例如至少约14000U/g，例如至少约15000U/g，例如至少约18000U/g的β-葡聚糖酶活性，如通过“测定7”测量的。

如本文中使用的″β-葡聚糖酶″或″beta-葡聚糖酶″是指EC 3.2.1.6的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团参与被水解键的葡萄糖残基在C-3被其本身取代时，催化β-D-葡聚糖类中的(1-＞3)-或(1-＞4)-键的内切水解。

在其他方面中，根据本发明的酶复合物具有昆布多糖酶活性，如“测定3”中所述测定的。

昆布多糖酶可以是分类在E.C.3.2.1.6中的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶或分类在E.C.3.2.1.39中的葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶。具有可选名称昆布多糖酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶分类在E.C.3.2.1.6中。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷类D-葡聚糖类，并且当其还原基团参与被水解的键的葡萄糖残基在C-3上被其本身取代时，所述酶催化β-D-葡聚糖类中的(1-＞3)-或(1-＞4)-键的内切水解。具有可选名称(1-＞3)-β-葡聚糖内切水解酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶的葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶被分类在E.C.3.2.1.39中，并且水解底物中的(1-＞3)-β-D-葡聚糖类如例如昆布多糖、副淀粉和茯苓聚糖(pachyman)中的(1-＞3)-β-D-糖苷键。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有阿拉伯聚糖酶(arabinanase)活性。阿拉伯聚糖酶被分类为EC 3.2.1.99。其系统名为5-α-L-阿拉伯聚糖5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶，但其具有几个其他名称，例如阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶和内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶、内切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶、内切-阿拉伯聚糖酶、1，5-α-L-阿拉伯聚糖和1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。阿拉伯糖酶内切水解(1-＞5)-阿拉伯聚糖中的(1-＞5)-α-阿拉伯呋喃糖苷键。阿拉伯聚糖酶也作用于阿拉伯聚糖。

在本发明的一个方面，利用在下文中在标题“测定”下所述的“测定4”测量根据本发明的酶复合物的阿拉伯聚糖酶活性。使用甜菜阿拉伯聚糖作为底物，在pH 3.5和50℃下进行测定，对于酶的进一步表征和鉴定，可以在不同的pH和温度值下进行该测定。从每单位时间内540nm处吸光度的增加计算酶活性。

阿拉伯糖聚酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH 3.5和50℃)下导致ΔOD₅₄₀nm.分钟^-1增加的酶的量(对于总测定体积标准化的)。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有β-D-葡萄糖苷水解酶活性。β-D-葡萄糖苷酶是指E.C 3.2.1.21的酶。

在一些方面，根据本发明的酶复合物具有β-木糖苷酶活性。″β-木糖苷酶″或″木聚糖1，4-β-木糖苷酶″是指E.C 3.2.1.37的酶。β-木糖苷酶催化(1-＞4)-β-D-木聚糖类的水解，以从非还原末端除去D-木糖残基。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物的纤维二糖水解酶活性利用在下文中在标题“测定”下所述的“测定6”来测量。在pH 5.0下进行标准测定，对于酶的进一步表征和鉴定，可以在不同的pH值下进行该测定。

纤维二糖水解酶活性的一个单位定义为在测定的条件下(pH5.0(或如所指定的)和50℃)每分钟从对-硝基苯基β-D-纤维素二糖吡喃糖苷产生1μmole对硝基苯酚的酶的量。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有纤维二糖水解酶活性。″纤维二糖水解酶″或″纤维素1，4-β-纤维二糖苷酶″是指EC 3.2.1.91的酶。纤维素1，4-β-纤维二糖苷酶催化纤维素和纤维四糖中的1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从而从链的非还原末端释放纤维二糖。

在本发明的一个方面，根据本发明的酶复合物的阿拉伯呋喃糖苷酶活性通过“测定5”(如在下文中标题″测定″下所描述的)来测量。可在pH 5.0和50℃下进行标准测定法，对于酶的进一步表征和鉴定，可以在不同的pH和温度值下进行该测定。

α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH5.0和50℃(或如所指定的))下每分钟从对-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷产生1μmole对硝基苯酚的酶的量。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。″α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶″或″Alpha-N-阿拉伯呋喃糖苷酶″是指EC 3.2.1.55的酶。α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶活性。″葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶″或″葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶″是指E.C3.2.1.74的酶。葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶催化(1-＞4)-β-D-葡聚糖内的(1-＞4)-键的水解，以除去连续的葡萄糖单位。

在某些方面，根据本发明的酶复合物具有木葡聚糖特异性外切-β-1，4-葡聚糖酶活性，″木葡聚糖特异性外切-β-1，4-葡聚糖酶″是指E.C3.2.1.155的酶。木葡聚糖特异性外切-β-1，4-葡聚糖酶催化木葡聚糖中的(1-＞4)-β-D-葡糖苷键的外切水解。

根据本发明的酶复合物可用于包括降低含有淀粉水解物的水溶液的粘度的方法。

所述酶复合物还可用于包括过滤含有淀粉水解物的水溶液的方法中。在某些实施方案中，包含淀粉水解物的水溶液是用于啤酒制备的醪液，在其他实施方案中，包含淀粉水解物的水溶液是食品成分(foodcomposition)。

可选地，根据本发明的酶复合物可用于生产果汁，果酒，粮食加工，燃料酒清例如生物乙醇和可饮用酒精。

在某些实施方案中，从农业原料例如甘蔗、马铃薯、玉米、小麦、高粱等或从纤维素类材料例如玉米秸杆、柳枝稷或其他植物材料生产生物乙醇。在两种情况下，可从原料提取可发酵糖，将其通过微生物发酵成酒精，蒸馏所述酒精，可将其用作运输燃料。根据本发明的酶复合物可用于生物燃料的这种生产中。可加入酶复合物以增加多糖从原料的提取，帮助将多糖降解成可发酵糖和/或改善处理参数例如液体与固体的分离、流动特征和泵送性。

本发明的方法可被用于任何酿造用麦芽(grist)的淀粉糖化。根据本发明，酿造用麦芽可包含任何含淀粉和/或糖的植物材料，其可来源于任何植物和植物部分，包括根茎类、根、茎、叶和种子。

在某些实施方案中，酿造用麦芽包括谷粒例如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、milo、粟和高粱的谷粒，更优选至少10％，或更优选至少15％，更优选至少25％，或最优选至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％或甚至100％(w/w)的麦芽汁的酿造用麦芽来源于谷粒。

在某些实施方案中，酿造用麦芽包含麦芽谷粒，例如大麦麦芽。优选至少10％，或更优选至少15％，更优选至少25％，或最优选至少35％，例如至少50％、至少75％、至少90％或甚至100％(w/w)的麦芽汁的酿造用麦芽来源于麦芽谷粒。

术语“发酵”在本说明书中意指通过在培养物中生长微生物来产生物质例如酶。

如本文中所使用的，术语“麦芽(malt)”被理解为任何含麦芽的谷粒例如例如大麦。

术语″辅料″被理解为并非大麦麦芽麦的酿造用麦芽部分。辅料可以是任何富含碳水化合物的物质。

术语“醪液”理解为含水淀粉浆液，例如包含破碎的大麦麦芽、压碎的大麦和/或其他辅料或其组合，以后与水混合以分成麦芽汁+酒糟。

术语″醪液分离″理解为通过过滤或醪液过滤进行的麦芽汁与酒糟的分离。

术语″啤酒过滤″被理解为其中例如通过微过滤或膜法(membrane process)除去存在于啤酒中的酵母细胞和其他引起混浊的物质的分离方法。

酶复合物制剂(例如以按照本发明制备的食品成分的形式存在的)可以以溶液的形式或作为固体存在-这取决于用途和/或应用的模式和/或施用的模式。固体剂型可以以干燥酶粉剂或以颗粒化的酶的形式存在。

在一个方面，本发明提供了包含根据本发明的酶复合物、酶载体和任选地稳定剂和/或防腐剂的酶复合物制剂。

在本发明的另外方面，酶载体选自甘油或水。

在另外的方面，制剂包含稳定剂。在一个方面，稳定剂选自无机盐、多元醇、糖和其组合。在一个方面，稳定剂是无机盐例如氯化钾。在另一个方面，多元醇是甘油、丙二醇或山梨醇。在另一个方面，糖是小分子碳水化合物，特别是几种甜味碳水化合物例如葡萄糖、果糖和蔗糖中的任何种类。

在另外的方面，制剂包含防腐剂。在一个方面中，防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或其他已批准的食品防腐剂或其混合物。

本发明的具体实施方案

如上所述，本发明涉及来源于如下组合的酶复合物：

a.通过木霉属的种的发酵获得的表达产物；和

并且其中如通过如本文中所述的“测定1”测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性中至少约61％来源于木霉属的发酵。

在某些实施方案中，如通过本文中所述的“测定1”测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性中至少约62％，例如至少约63％，例如至少约64％，例如至少约65％，例如至少约66％，例如至少约68％，例如至少约69％来源于木霉属的发酵。

在某些实施方案中，如通过本文中所述的“测定1”测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性中不超过约90％，例如不超过约85％，例如不超过约80％，例如不超过约75％，例如不超过约70％，例如不超过约65％来源于木霉属的发酵。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物中的不同真菌的一种或多种酶是通过该不同真菌的发酵获得的表达产物。

在某些实施方案中，所述不同真菌是青霉属的真菌。

在某些实施方案中，通过所述不同真菌的发酵获得的表达产物包含木聚糖酶，例如与来源于木霉属的木聚糖酶不同的木聚糖酶。在某些实施方案中，通过所述不同真菌的发酵获得的表达产物包含家族11木聚糖酶，例如与来源于木霉属的家族11木聚糖酶不同的家族11木聚糖酶。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物包含选自下述的一种或多种酶活性：内切-1，4-β-木聚糖酶、内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶、纤维素酶、昆布多糖酶、内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-D-葡萄糖苷水解酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶、葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶、木糖葡聚糖特异性外切-β-1，4-葡聚糖酶和α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶。

在某些实施方案中，通过木霉属的种的发酵获得的表达产物来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的一个单一培养物。

在某些实施方案中，通过青霉属的种的发酵获得的表达产物来自绳状青霉(Penicillium funiculosum)的一个单一培养物。

在某些实施方案中，用于发酵的单一培养物在遗传上未被修饰。

在某些实施方案中，通过浸没发酵获得所述由木霉属的种的发酵获得的表达产物。

在某些实施方案中，所述通过木霉属的发酵获得的表达产物来自里氏木霉。

在某些实施方案中，所述通过不同真菌的发酵获得的表达产物来自绳状青霉菌的单一培养物。

在某些实施方案中，所述通过发酵获得的表达产物来自野生型种。

在某些实施方案中，用于制备本发明的酶复合物的菌株是在布达佩斯条约下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC

)IP，Licensingand Services，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA的里氏木霉(其具有菌株名称GC Cellulose A83GICC 0004 M03000004和ATCC

专利保藏名称PTA-1001，于2009年5月5日由Danisco A/S保藏)或其衍生物或后代。(2009年5月14日在国际保藏单位：美国典型培养物保藏中心(ATCC

)，Manassas，VA，USA测试了所述保藏物，并且在该日期，所述种子/菌株是存活的)。

在某些实施方案中，用于制备本发明的酶复合物的菌株是在布达佩斯条约下以编号IMI 378536保藏在国际真菌研究所(InternationalMycological Institute)的绳状青霉或其衍生物或后代。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物具有至少约3000U/g，例如至少约4000U/g，例如至少约5000U/g，例如至少约6000U/g，例如至少约7000U/g(如通过本文中所述的“测定1”测量的)的来源于木霉属的发酵的酶活性。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物具有至少约4000U/g，例如至少约5000U/g，例如至少约6000U/g，例如至少约7000U/g，例如至少约8000U/g，例如至少约9000U/g，，例如至少约10000U/g，例如至少约11000U/g，例如至少约12000U/g(如通过本文中所述的“测定1”测量的)的总酶活性。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物由来自绳状青霉的约3100u/g和来自里氏木霉的约5200u/g组成，其中所述酶活性u/g是利用本文中所述的“测定1”测定的。

在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物由来自绳状青霉的约2362u/g和来自里氏木霉的约5315u/g组成，其中所述酶活性u/g是利用本文中所述的“测定1”测定的。在某些实施方案中，根据本发明的酶复合物具有如本文中定义的″LAMINEX

XG″产品特征。

在另外一个方面，根据本发明使用的里氏木霉菌株具有基本上与在布达佩斯条约下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的里氏木霉菌株(具有菌株名称GC Cellulose A83 GICC 0004 M03000004，由Danisco A/S在2009年5月5日保藏)的特征相同的特征。

在另外的方面，所述菌株是在布达佩斯条约下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的里氏木霉菌株(具有菌株名称GC CelluloseA83 GICC 0004 M03000004，在2009年5月5日由Danisco A/S保藏的)。

在本发明的说明书，短语“基本上相同的特征”意指所述菌株具有在布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，PatentDepository，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110的里氏木霉(具有菌株名称GC Cellulose A83 GICC 0004 M03000004，2009年5月5日由Danisco A/S保藏)的一个或多个(优选全部)特征。

如上所述，本发明涉及根据本发明的酶复合物在用于生产啤酒糟例如用于生产麦芽酒精饮料啤酒和/或用于威士忌酒生产的方法中的用途。下列实施方案特别地与用于生产啤酒糟的方法相关。

在某些具体的实施方案中，根据本发明的酶复合物不来源于通过里氏木霉的发酵获得的表达产物与通过绳状青霉的发酵获得的表达产物的组合，其中来源于绳状青霉与来源于里氏木霉的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性的比率为约0.25/0.75至0.37/0.63，例如约0.26/0.74至0.36/0.64，例如约0.27/0.73至0.35/0.65，例如约0.28/0.72至0.34/0.66，例如约0.29/0.71至0.33/0.67，例如约0.30/0.70至0.32/0.68，例如约0.31/0.69。

在某些具体的实施方案中，根据本发明的酶复合物来源于通过里氏木霉的发酵获得的表达产物与通过绳状青霉的发酵获得的表达产物的组合，其中来源于绳状青霉与来源于里氏木霉的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性的比率为约0.25/0.75至0.37/0.63，例如约0.26/0.74至0.36/0.64，例如约0.27/0.73至0.35/0.65，例如约0.28/0.72至0.34/0.66，例如约0.29/0.71至0.33/0.67，例如约0.30/0.70至0.32/0.68，例如约0.31/0.69。

在某些实施方案中，将所述酶复合物用于醪液以帮助过滤和/或醪液过滤和/或啤酒过滤。

在某些实施方案中，将所述酶复合物用于醪液以帮助醪液分离。

在某些实施方案中，麦芽汁中残留的β-葡聚糖减少，例如与不使用酶的对照相比较，减少至少10％，至少20％，或至少30％，或与使用LAMINEX

Super的对照相比较，减少至少2％，5％或10％。

在某些实施方案中，有粘度例如麦芽汁粘度的降低，例如与不使用酶的对照相比较，降低至少2.5％，至少5％，或至少7.5％。

在某些实施方案中，酿造周期/天增加，例如与不使用酶的对照相比较，增加至少5％，例如至少10％，或至少20％，或与使用LAMINEXSuper(具有相同或相当的基于绳状青霉成分的酶活性)的对照相比较，增加至少2.5％，至少5％，或至少10％。

在某些实施方案中，存在增强的过滤性。

在某些实施方案中，存在增强的醪液分离。

在某些实施方案中，在醪液分离过程中流速增加，例如与不使用酶的对照相比较，有至少10％，至少15％，或至少20％的增加，或与使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少2.5％，至少5％，或至少10％的增加。

应理解，所述流速定义为从总分离时间计算的平均流速。

在某些实施方案中，存在洒水(sparging)或提取时间的减少，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少5％，至少10％，至少15％，或至少20％的减少。

在某些实施方案中，存在总过滤时间的减少。

在某些实施方案中，存在总醪液分离时间的减少，例如与不使用酶的对照相比较，有至少5％，至少10％，或至少15％的减少，或与使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少2.5％，至少5％，或至少10％的减少。

在某些实施方案中，在于滤床上醪液再循环的过程中和/或在过滤过程中跨滤床的平均ΔP减小。

应理解，ΔP是指跨床的压力下降。

在某些实施方案中，在于滤床上醪液再循环的过程中和/或在过滤过程中跨分离表面的平均ΔP减小。

在某些实施方案中，在于醪液分离过程中的跨分离表面的平均ΔP减小，例如与不使用酶的对照或与使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少5％，至少10％或至少15％的减小。

在某些实施方案中，麦芽汁浊度(wort haze)无变化。

在某些实施方案中，存在麦芽汁戊聚糖的减少。

在某些实施方案中，浸出物收得率提高。

在某些实施方案中，在啤酒过滤过程中流速增加。

在某些实施方案中，在啤酒过滤过程中随时间的跨过滤器建立的压力减小，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的减小。

在某些实施方案中，啤酒浊度减小，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

在某些实施方案中，泡沫稳定性没有降低。

在某些实施方案中，啤酒β-葡聚糖减少，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的减少。

在某些实施方案中，啤酒戊聚糖减少，例如与不使用酶的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的减少。

在某些实施方案中，将小于约0.5kg酶复合物/吨酿造用麦芽用于生产啤酒糟，例如生产麦芽酒精饮料啤酒和/或生产威士忌酒的方法中。在某些实施方案中，使用小于约0.4kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.3kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.25kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.2kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.19kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.18kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.17kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.16kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.15kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.14kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.13kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.12kg酶复合物/吨酿造用麦芽，例如使用小于约0.11kg酶复合物/吨酿造用麦芽。

应理解，按照本发明使用的真菌菌株可以是上述保藏的菌株的培养物，但也可以是具有与上述分离和保藏的菌株基本上相同的性质的菌株培养物。在一个优选实施方案中，所述菌株是所述保藏的菌株或其后代。

通过根据本发明使用的木霉属种的发酵获得的表达产物可来源于任何木霉属，例如里氏木霉，例如可从Novozymes A/S.获得的组合物CelluclastCelluclast

对可溶性纤维素底物具有显著的粘度减小效应。可选地可使用LAMINEXBG，由里氏木霉产生的、并可从Danisco A/S获得的一种商业化纤维素酶制剂。

通过根据本发明使用的青霉属种的发酵获得的表达产物可来源于任何青霉菌，例如绳状青霉。在某些实施方案中，所述菌株是在布达佩斯条约下以编号IMI 378536保藏在国际真菌研究所中的绳状青霉或其衍生物或后代。可选地，所述绳状青霉公开于WO9957325中。在一些可选择的实施方案中，根据本发明使用LAMINEXC2K(获自Danisco A/S)，其是来源于绳状青霉的表达产物。

LAMINEX

Super是在醪液中用于帮助过滤或醪液过滤的一种酿造酶产品(brewing enzyme product)。LAMINEX

Super产品是两种不同发酵酶产物-绳状青霉纤维素酶和里氏木霉纤维素酶的混合物。LAMINEX

Super获自Danisco A/S。该绳状青霉成分被包含用以水解溶解的β-葡聚糖类和木聚糖类，降低麦芽汁粘度和促进过滤或醪液过滤；该里氏木霉成分被包含用以在麦芽汁中获得低的(通过Megazyme Mixed-linkage β-葡聚糖测定法测定)β-葡聚糖和用以增加啤酒过滤速度。

LAMINEX

BG-获自Danisco A/S的用于促进啤酒过滤的里氏木霉产品。

LAMINEX

Super产品被定义为由如下物质组成：

1575u/g(通过“测定1”测定的)的来自绳状青霉浓缩物的成分；

2362u/g(通过“测定1”测定的)的来自里氏木霉的成分。

这在终LAMINEX

Super产品规格中下舍成3900u/g。

LAMINEX

Super的规格为：

纤维素酶活性≥3900u/g(通过“测定1”测定的)

pH 3.7-4.2

Micro，specs将是标准

利用0.25％苯甲酸钠稳定化。

LAMINEX

XG被定义为由如下物质组成：

来源于通过里氏木霉的发酵获得的表达产物与通过绳状青霉的发酵获得的表达产物的组合的酶复合物，其中来源于绳状青霉与来源于里氏木霉的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性的比率为约0.25/0.75至0.37/0.63，例如如下酶复合物，其中：约2363u/g(通过“测定1”测定的活性)来源于绳状青霉菌浓缩物；和约5315u/g(通过“测定1”测定的活性)来源于里氏木霉。在该具体的实施方案中，LAMINEXXG产品提供了0.31/0.69的绳状青霉/木霉比率，这一活性比率是基于如通过在“测定”下描述的“测定1”测量的活性单位的。

实施例1

实验室规模醪液研究1

酶活性：

经混合用于本特定实验的LAMINEX

Super产品：

标称活性：3937CMC U/g。测量的活性：3682CMC U/g(利用方法“测定1”测量的活性)，以0.2kg/吨酿造用麦芽应用，提供736400CMC U/吨酿造用麦芽(＝0.736U/g酿造用麦芽)。

由于LAMINEXSuper产品的定义为0.40x绳状青霉产物和0.60x里氏木霉产物(基于如通过“测定1”测量的CMC活性)：

-来自绳状青霉的活性贡献-0.295CMC U/g酿造用麦芽；

-来自里氏木霉的活性贡献-0.442CMC U/g酿造用麦芽。

LAMINEX

Super(0.200kg/吨酿造用麦芽)+50％里氏木霉成分(LAMINEX

XG)的活性：

3682CMC U/g(通过“测定1”测定的活性)，以0.2kg/吨酿造用麦芽应用+0.09534g里氏木霉成分(12539CMC U/g，通过″测定1″测定的)/g LAMINEX

Super产品，提供了975494CMC U/吨酿造用麦芽(＝0.975U/g酿造用麦芽)

-来自绳状青霉的活性贡献-0.295CMC U/g酿造用麦芽

-来自里氏木霉的活性贡献-(0.442+0.239)CMC U/g＝0.681CMC U/g酿造用麦芽.

LAMINEX

XG实验室规模醪液研究1中绳状青霉/里氏木霉贡献比率-0.30/0.70

10％Fawcett′s大麦醪液(90％Fawcett′s麦芽：10％Fawcett′s大麦)中的LAMINEX

Super(0.200kg/吨酿造用麦芽)相对LAMINEX

Super(0.200kg/吨酿造用麦芽)+50％里氏木霉成分活性的测定：-50g酿造用麦芽于总共250g水中。淀粉糖化特征：使用以0.5mm碾磨的50g混合酿造用麦芽，加入190ml 67℃的水。淀粉糖化温度循环为在65℃下进行60分钟，然后在72℃下进行10分钟。随后冷却醪液，制成250g重量并且通过波纹滤纸(Ederol 12)过滤。

与LAMINEX

Super产品相比较，具有额外添加50％里氏木霉成分活性的LAMINEXSuper(0.200kg/吨酿造用麦芽)的酶溶液显示：

●麦芽汁残留β-葡聚糖减少(参见图1)

麦芽汁残留β-葡聚糖减少标示着粘度的减少的潜能和随后麦芽汁分离/过滤增加，以及酿造循环/天增加的潜能

●过滤增加(参见图1)

过滤增加标示着无间断过滤循环的长度增加的正潜能(例如换桶(racking))，这反过来可减少总过滤时间，从而导致酿造循环/天的增加。

实施例2

实验室规模醪液研究2

酶活性：

LAMINEX

Super：

以0.2kg/吨酿造用麦芽提供的4380CMC U/g(从单一成分贡献计算的活性)提供876000CMC U/吨酿造用麦芽(＝0.876U/g酿造用麦芽)。

绳状青霉成分贡献2069CMC U/g(通过″测定1″)，相应于0.414CMC U/g酿造用麦芽。

里氏木霉成分贡献2311CMC U/g(通过″测定1″)，相应于0.462CMC U/g酿造用麦芽。

本研究中LAMINEXSuper产品的绳状青霉/里氏木霉贡献比率为0.47/0.52。

LAMINEX

XG(1.5倍浓缩的LAMINEX

Super+里氏木霉成分的额外50％活性)：

以0.133kg/吨酿造用麦芽提供的8304CMC U/g(从单一成分贡献计算的活性)提供了1104432CMC U/吨酿造用麦芽(＝1.104U/g酿造用麦芽)。

绳状青霉成分贡献3104CMC U/g(通过”测定1”)，相应于0.413CMC U/g酿造用麦芽

里氏木霉成分贡献5200CMC U/g(通过”测定1”)，相应于0.692CMC U/g酿造用麦芽LAMINEX

XG实验室规模醪液研究2中的绳状青霉/里氏木霉贡献比率-0.37/0.63

混合的酿造用麦芽-25.8％Spitz麦芽和74.2％Pilsner麦芽-醪液中LAMINEXSuper(0.200kg/吨酿造用麦芽)相对LAMINEX

XG(0.133kg/吨酿造用麦芽)的测试。醪液特征：将50g酿造用麦芽捣碎于150g水中，下面是表1中给出的捣碎程序：

表1.实验室规模捣碎程序：

在淀粉糖化结束时，向各醪液中加入30ml热水(于76℃下)并且使用Ederol 12滤纸热过滤醪液。

与LAMINEXSuper产品(以0.2kg/吨酿造用麦芽应用)相比较，LAMINEX

XG(以0.133kg/吨酿造用麦芽应用)的酶溶液显示：

●残留麦芽汁β-葡聚糖浓度降低(参见图2)

减少麦芽汁β-葡聚糖浓度的重要性还不清楚；然而有理论将麦芽汁β-葡聚糖的减少与麦芽汁粘度的减少相关联。由于醪液分离是酿造过程的瓶颈，因此所获得的正增加可通过因花费在醪液分离上的时间缩短而增加酿造循环的次数/天，由此增加酿造室容量。

●随时间的过滤体积增加(参见图2)

更高的过滤速度有利地减少了花在过滤上的时间，潜在地通过增加酿造循环的次数/天而导致酿造室容量的增加。

●麦芽汁粘度降低(参见图2)

麦芽汁粘度降低具有增加过滤速度的正潜能，从而增加酿造室容量。

实施例3

试验性啤酒厂试验(Pilot Brewery trial)

与实验室规模醪液研究2中相同的酶组合物

测试LAMINEX

Super(0.200kg/吨酿造用麦芽当量)和LAMINEX

XG(1.5倍浓缩的LAMINEX

Super+里氏木霉成分的额外50％活性)(0.133kg/吨酿造用麦芽)。在110L的醪液体积中使用31kg混合的酿造用麦芽-25.8％Spitz麦芽和74.2％Pilsner麦芽进行试验性啤酒厂淀粉糖化研究。淀粉糖化概括见于表2中。

表2.试验性啤酒厂淀粉糖化概括

步骤

时间

总时间

温度

	(分钟)	(分钟)	(℃)
					0	0	50
淀粉糖化于	10	10	50
				静置	20	30	50
加热	15	45	65
				静置	30	75	65
加热	15	90	76
				静置	15	105	76

试验性啤洒厂淀粉糖化试验

与LAMINEX

Super相比较，淀粉糖化过程中添加LAMINEX

XG导致：

●洒水(sparge)时间减少达到13％(参见表3)

洒水时间减少确实促成了花在麦芽汁分离上的时间减少，从而可能通过酿造循环的次数/天的增加来潜在地增加酿造室容量。

●与LAMINEX

Super相比较达到8％和与水对照(未加入酶)相比较达到20％的总过滤时间减少(参见表3和图3)。由于过滤过程是酿造过程的瓶颈，因此过滤时间减少具有通过增加酿造循环的次数/天来增加酿造室容量的潜能。

●平均流速增加，其计算为在过滤过程中“连续地”测量的流速的平均值或计算为″过滤的总体积″/″总过滤时间″(参见表3和图3)。

平均流速增加可积极地减少花费在麦芽汁分离上的总时间，从而潜在增加酿造室容量。

●跨滤床的平均ΔP在过滤过程中有达到19％的减少(参见表3)。

潜在地，跨滤床的平均ΔP减小可导致对过滤床换桶的需要降低和随着时间过滤的体积增加。两个因素都具有减少过滤时间，从而增加酿造室容量的正潜能。

●于滤床上酿造再循环过程中(达至22％)和在过滤过程(达到24％)建立的压力减小(参见表3)

在再循环和过滤过程中建立的压力减小二者具有促成增加过滤、从而减少总过滤时间的潜能。再次地，这可导致增加的酿造室容量。看到的这种效应特别强，因为通常增加的过滤速率可能与压力的增加有相关-并且目前的数据显示过滤的增加和同时建立的压力减小。

●麦芽汁浊度无变化(参见表3)

浊度未改变，这是有益的，因为浊度增加可能是导致选择诱导换桶的因素。换桶十分费时并且可增加麦芽汁分离的总时间，从而减少酿造室容量。

●在过滤过程中“建立的总压力”减小达到24％(参见表3和图3)。

在麦芽汁分离过程中“建立的总压力”减小可增加过滤速度，从而通过减少花费在麦芽汁分离过程上的时间来增加酿造室容量。

●不存在由建立的压力诱导的滤床换桶。如由(1)参见表3底部所标记的，只有当在淀粉糖化步骤包含LAMINEX

XG时(由表3中(1)标记的)，才引入强制性换桶。

洒水时间减少促成了总过滤时间的减少和酿造循环的次数/天的潜在增加。

表3.试验性啤酒厂淀粉糖化试验-过滤数据的概述

^*来自总体积和总过滤时间

^**1指由压力增加诱导的换桶，0表示无换桶，(1)表示在第二次洒水开始时的手工诱导的强制性换桶，如果之前没有的话。

在淀粉糖化过程中添加有LAMINEX

XG的醪液的麦芽汁样品分析发现：

●麦芽汁β-葡聚糖减少，如通过Megazyme Mixed Linkage β-葡聚糖法(Megazyme目录参考K-BGLU，按照标准AOAC法995.16)测量的(参见表4)。

麦芽汁残留β-葡聚糖减少可导致麦芽汁粘度的有益减少，从而增加过滤和通过增加酿造循环的次数/天来增加酿造室容量。

●浸出物增加达到2.3％(参见表4)。

浸出物的增加可获得酿造室收得率的有益增加-从相同量的原料产生更多产品-换句话说，以更具成本效益的方式获得增加的酿造室容量。

表4.试验性啤酒厂麦芽汁分析：

试验编号

样品

浸出物

[β-葡聚糖]

		(°P)	(mg/l)
				73	组合的麦芽汁	14.11	1163
75	组合的麦芽汁	14.18	588
				79	组合的麦芽汁	14.34	187

73：阴性对照：无酶对照

75：LAMINEX

Super，0.20kg/吨

79：LAMINEXXG，0.133kg/吨

试验性啤酒厂啤酒过滤

与LAMINEX

Super相比较，淀粉糖化过程中LAMINEX

XG的添加导致：

●啤酒过滤过程中流速增加(参见表5)。

啤酒过滤过程中的流速增加具有增加过滤能力的有益效应，从而潜在地减少(限制)对额外清酒罐(BBT)容量(BBT是在过滤后直至灌注前用于贮存啤酒的压力罐。这些罐子能够保持适当压力，避免二氧化碳的损失和防止泡沫形成)的需要。

●随着时间的跨滤器建立压力显著减小(参见表5)。随着时间的跨滤器建立压力的减小有益地增加清洗之间过过滤循环的长度。这有益地限制在线清洗、水和能量消耗。此外需要的过滤材料的量减少，从而导致费用节省。各清洗之间更长的过滤循环有益地减少了来自啤酒过滤过程的开始和终止的啤酒损失。

表5.试验性啤酒厂啤酒过滤数据的概述：

73：阴性对照：无酶对照

75：LAMINEX

Super，0.20kg/吨

79：LAMINEX

XG，0.133kg/吨

试验性啤酒厂啤酒分析

从在淀粉糖化过程中添加有LAMINEX

XG的醪液产生的啤酒的分析显示：

●啤酒β-葡聚糖减少(参见表6)

啤酒β-葡聚糖减少可有益地减少啤酒粘度，从而增加过滤循环并且减少助滤剂和公用事业消费(成本节约)。

●啤酒浊度减小(参见表6)

啤酒浊度的主要贡献者可能与非β-葡聚糖材料相关。啤酒β-葡聚糖减少也可有益地促成啤酒浊度减少，产生优良的啤酒外观。

●泡沫稳定性未降低(参见表6-泡沫头持久性值)

使用″1.5浓缩的LAMINEXSuper+另外50％额外的里氏木霉成分活性″未减少啤酒泡沫稳定性。这是有益的，因为其是关于啤酒外观和质量的折衷因子。

●可预期啤酒戊聚糖减少

啤酒戊聚糖减少可有益地促成啤酒过滤增加。

表6.试验性啤酒厂啤酒分析：

73：阴性对照：无酶对照

75：LAMINEX

Super，0.20kg/吨

79：LAMINEX

XG，0.133kg/吨

实施例4

工业规模(Full scale)啤酒厂研究

线1试验：

使用9500kg酿造用麦芽/酿造(3000kg大麦，6500kg麦芽)对31.6％大麦酿造用麦芽组合物进行该试验。

如由表7所显示的，对于LAMINEX

XG，在醪液分离方面观察到良好的结果。减少过滤时间具有通过增加酿造循环的次数/天来增加酿造室容量的潜能。

表7.关于醪液分离的酿造室的性能

线2试验：

使用12300kg酿造用麦芽/酿造(3500kg大麦，8800kg麦芽)对28％大麦酿造用麦芽组合物进行该试验。

如由表8所显示的，对于LAMINEX

XG，在啤酒过滤方面观察到良好的结果。

●增加各清洗之间的啤酒过滤循环具有通过减少花费在清洗上的时间和增加啤酒过滤酿造循环的次数/天来增加酿造室容量的潜能。此外，增加啤酒过滤循环导致成本节省和能量消耗减少以及来自啤酒过滤的开始和终止的啤酒损失减少。

●减少助滤剂和公用事业消费(减少的kieselguhr消耗)导致直接的成本节省。

表8.关于啤酒过滤的酿造室的性能

●如表9中显示的，从在淀粉糖化过程中加有LAMINEX

XG的线2产生的啤酒的分析显示：啤酒β-葡聚糖减少。啤酒β-葡聚糖减少可有益地降低啤酒的粘度，从而增加过滤循环和减少助滤剂和公用事业消费(成本节省)。

●可预期啤酒戊聚糖减少。

啤酒戊聚糖减少可通过减少粘度而有益地促成啤酒过滤增加。

●啤酒动力学粘度降低

啤酒粘度降低可有益地增加过滤循环以及减少助滤剂和公用事业消费(成本节省)。过滤循环增加还可通过增加啤酒过滤循环的次数/天来增加酿造室容量。

表9.工业规模啤酒厂啤酒分析，线2

概述-试验中使用的酶活性用量

数据以PF/TR比率的形式给出，所述比率是来自各成分的贡献对总活性的比率。PF是由绳状青霉产生的贡献，TR是由里氏木霉产生的贡献。

表10.不同试验/实例中使用的酶CMC活性

测定

测定1：DNS纤维素酶活性法(DNS CMC法)

系统名：1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶

IUB编号：EC 3.2.1.4

原理

纤维素酶的测定基于羧甲纤维素(CMC)(一种β-1，4-葡聚糖)中的1，4-β-D-葡糖苷键的酶促内切水解。通过使用3，5-二硝基水扬酸试剂测量所获得的还原性基团的增加来测定反应产物(β-1，4葡聚糖寡糖类)。根据还原性基团的浓度(作为葡萄糖当量)与在540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在pH 5.0进行该测定，但对于酶的进一步表征和鉴定，可在不同pH值下进行该测定。

单位定义

纤维素酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH 5.0(或如所指定的)和50℃)下每分钟产生1μmole葡萄糖当量的酶的量。

材料

羧甲基纤维素。提供商：Megazyme Ltd.产品编号：CM-纤维素4M；

D-葡萄糖′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10117.M.W.：180.16；

无水醋酸钠′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10236.M.W.：82.03；

乙酸(″冰醋酸″)′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10001.M.W.：60.05；

3，5-二硝基水扬酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)。提供商：MerckLtd(BDH).产品编号：28235；

氢氧化钠颗粒′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10252.M.W.：40.00；

酒石酸钾钠(+)′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10219.M.W.：282.22；

0.1M醋酸钠缓冲液，pH 5.0中的1.5％(w/v溶液)羧甲纤维素(CMC)溶液(底物溶液)。

3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液。在含32g/L氢氧化钠颗粒和600g/L酒石酸钾钠(+)的缓冲液中的20g/L DNS。

葡萄糖标准溶液(0.50mg/ml)

方法

将酶复合物稀释至样品中，使用0、0.125、0.25、0.375和0.5mg/ml的葡萄糖浓度产生如图2中显示的葡萄糖标准曲线。

将0.25ml酶溶液与1.75ml底物溶液(1.5％w/v)于50℃下混合，10分钟后通过加入DNS溶液来终止反应。随后加热至95℃进行5分钟。

在540nm测量不同样品的光密度(OD₅₄₀nm)。

计算

根据如图2中显示的标准曲线测定酶活性。

如下计算活性：

其中

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的斜率(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总为负值，并且约为-0.02)

180.16＝葡萄糖的分子量

10³＝转化成μmoles

A＝以ml表示的测定体积

V＝以ml表示的酶体积

t＝以分钟表示的测定时间

D＝实际酶稀释度(例如，对于稀释至1升的1.000g，D＝1000)

测定2.内切-1，4-β-木聚糖酶(DNS桦木木聚糖法)

原理

由内切-1，4-β-木聚糖酶催化的反应包括木聚糖(例如桦木(birchwood)木聚糖或谷物取代的木聚糖例如小麦阿拉伯木聚糖)中1，4-β-D-木糖苷键的内切水解，从而形成β-1，4木聚糖寡糖类。

通过使用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所得的还原性基团的增加来比色测定反应产物(β-1，4-木聚糖寡糖类)。根据还原性基团的浓度(以木糖当量表示)与在540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在pH 3.5下进行标准测定，但对于酶的进一步表征和鉴定，可在不同pH值下进行该测定。

单位定义

内切-1，4-β-木聚糖酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH3.5(或如所指定的)和50℃)下每分钟产生1μmole木糖当量的酶的量。

材料

参见上文中对于纤维素酶活性测定所给出的材料的列表。

桦木木聚糖。提供商：Sigma Chemical Co.产品编号：X 0502；

D(+)-木糖′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10372M.W.：150.13；

0.1醋酸钠缓冲液，pH 4.0中的1.5％(w/v溶液)桦木木聚糖溶液(底物溶液)

木聚糖标准溶液(0.50mg/ml)

方法

将1.75ml桦木木聚糖溶液与0.25ml稀释的酶溶液于50℃下混合，进行10分钟，通过加入2ml DNS溶液，随后加热至95℃进行5分钟来终止反应。在540nm测量光密度(OD₅₄₀nm)。

从0.125、0.250、0.375和0.500mg/ml木聚糖产生标准曲线。

计算

如下计算活性：

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的斜率(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总为负值，并且约为-0.02)

150.13＝木糖的分子量

10³＝转化成μmoles

A＝以ml表示的测定体积

V＝以ml表示的酶体积

t＝以分钟表示的测定时间

D＝实际酶稀释度(例如，对于稀释至1升的1.000g，D＝1000)

测定3.昆布多糖酶(DNS昆布多糖法)

原理

由昆布多糖酶催化的反应包括1，3-β-D-葡聚糖中1，3-葡糖苷键的内切水解。底物包括昆布多糖、副淀粉和茯苓聚糖。通过使用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所得的还原性基团的增加来比色测定反应产物(β-1，3-葡聚糖寡糖类)。根据还原性基团的浓度(以葡萄糖当量表示)与在540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在pH 5.0和50℃下进行测定，但对于酶的进一步表征和鉴定，可在不同pH和温度值下进行该测定。

单位定义

昆布多糖酶活性的一个单位定义为在测定的条件(pH 5.0和50℃(或如所指定的))下每分钟产生1μmole葡萄糖当量的酶的量。

材料

参见上文中对于纤维素酶活性测定所给出的材料。

昆布多糖(来自掌状海带(Laminaria digitata))。提供商：

Sigma-Aldrich Co.Ltd.产品编号：L 9634；

1.00％(w/v溶液)昆布多糖溶液(底物溶液0.1M醋酸钠缓冲液，pH5.0)

将1.75ml昆布多糖溶液与0.25ml稀释的酶溶液于50℃下混合，进行10分钟，通过加入2ml DNS溶液终止反应。

使用0、0.125、0.25、0.5和0.75mg/ml的葡萄糖浓度产生标准曲线。

在540nm测量光密度(OD₅₄₀nm)。

计算

如下计算活性：

其中

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的斜率(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总为负值，并且约为-0.03)

180.16＝葡萄糖的分子量

10³＝转化成μmoles

A＝以ml表示的测定体积

V＝以ml表示的酶体积

t＝以分钟表示的测定时间

D＝酶稀释度(例如，对于稀释至1升的1g，D＝1000)

测定4.阿拉伯聚糖酶测定

原理

阿拉伯糖聚酶活性的测定基于通过使用3，5-二硝基水扬酸试剂测量所获得的还原性基团的增加进行的比色测定。根据还原性基团的浓度(以阿拉伯糖当量表示)与在540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在pH 3.5下进行该测定，但对于酶的进一步表征和鉴定，可在不同pH值下进行该测定。

单位定义

阿拉伯聚糖酶(阿拉伯聚糖酶(Arabinanase)(内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶))活性的一个单位定义为在测定的条件(pH 3.5(或如所指定的)和50℃)下每分钟产生1μmole阿拉伯糖当量的酶的量。

材料

Megazyme甜菜阿拉伯聚糖

阿拉伯糖Sigma A3131 M.W.：150.1

无水醋酸钠′AnalaR’。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10236.M.W.：82.03

乙酸(″冰醋酸″)′AnalaR’。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10001.M.W.：60.05

3，5-二硝基水扬酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)。提供商：MerckLtd(BDH).产品编号：28235

氢氧化钠颗粒′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10252.M.W.：40.00

酒石酸钾钠(+)′AnalaR′。提供商：Merck Ltd(BDH).产品编号：10219.M.W.：282.22

0.1M醋酸钠缓冲液，pH 3.5中的1.5％(w/v溶液)阿拉伯聚糖溶液(底物溶液)。

3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液。含有32g/L氢氧化钠颗粒和600g/L酒石酸钾钠(+)的缓冲液中的20g/L DNS。

阿拉伯聚糖酶标准溶液(0.50mg/ml)

方法

将酶复合物稀释至样品中，使用0、0.125、0.25、0.375和0.5mg/ml的阿拉伯聚糖酶浓度产生葡萄糖标准曲线。

在540nm测量不同样品的光密度(OD₅₄₀nm)。

计算

从标准曲线测定酶活性。

如下计算活性：

其中

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的斜率(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总为负值，并且约为-0.02)

150.13＝阿拉伯糖的分子量

10³＝转化成μmoles

A＝以ml表示的测定体积

V＝以ml表示的酶体积

t＝以分钟表示的测定时间

D＝实际酶稀释度(例如，对于稀释至1升的1.000g，D＝1000)

测定5.阿拉伯呋喃糖苷酶测定

由α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶催化的反应包括在α-L-阿拉伯糖苷的非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基上水解端键。该酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶的测定基于对-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷的酶促水解。测定是“两点”法而非“连续监控”法。酶活性的计算基于只在温育期的起始和终止时获得的测量值。(在pH调整后)通过比色测定反应产物对-硝基苯酚。根据对-硝基苯酚的浓度与400nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

稀释的酶溶液的制备：

利用玻璃器具蒸馏水从粉剂或液体酶制剂制备所有酶溶液。通过避免涉及小的体积或重量的大稀释度步骤使测定中的稀释度误差减至最小。在制备酶稀释液时，既使对于液体样品，称出初始酶样品是更精确的。如果这样做，则在液体样品的情况下，必须测量20℃下液体的比重。

由于测定是“两点”而非“连接监控”的方法，因此确保对于不同酶系统和条件在温育期内为线性是很重要的。在底物浓度、pH、温度和测定时间的标准测定条件下，已显示该测定在ΔOD₅₄₀nm测试(T)范围＝0.20-1.50内是线性的。然而，为了良好的实践，在确定的ΔOD₅₄₀nm测试(T)范围＝0.400-0.800内进行该测定。

方法

每一个酶样品的测定包括3个分析：一式二份测试(TEST)分析和空白(BLANK)分析。给出的方法描述了单个酶样品的分析。

在50℃下向溶液中加入0.25ml稀释的酶溶液，10分钟后通过加入4ml的0.4M甘氨酸溶液，pH 10.8(终止试剂)来终止反应。

针对水空白在25℃下测量400nm处的吸光度。

●测定一式两份测量的测试的OD_400nm测试；

●测定OD_400nm空白。

计算

ΔOD_400nm测试(T)＝OD_400nm测试-OD_400nm空白

其中：T＝OD400nm测试-OD400nm空白

18300＝对-硝基苯酚的摩尔消光系数(1cm光程长)

V＝7.25(以ml表示的测试的总液体体积)

t＝10(分钟)

1u＝1μmol.分钟^-1

E＝0.25(以ml表示的稀释酶样品的体积)

D＝酶稀释度，例如，对于稀释至1升的1ml，D＝1000)

测定6.纤维二糖水解酶测定

原理

由纤维二糖水解酶催化的反应包括纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从而从链的非还原末端释放纤维二糖。

纤维二糖水解酶的测定基于对-硝基苯基β-D-纤维二糖吡喃糖苷的酶促水解。(在pH调整后)比色测定反应产物对-硝基苯酚。根据对-硝基苯酚的浓度与400nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在ΔOD_540nm测试(T)＝0.400-0.800的线性范围内实施测定。

方法

在50℃下向测试溶液中加入0.25ml稀释的酶溶液，30分钟后向各管中加入4ml的0.4M甘氨酸溶液，pH 10.8(终止试剂)。

在1cm玻璃比色杯中针对水空白在20℃下测量400nm处的吸光度。

●测定一式两份测量的测试的OD_400nm测试；

●测定OD_400nm空白

计算

ΔOD_400nm测试(T)＝OD_400nm测试-OD_400nm空白

其中：T＝OD_400nm测试-OD_400nm空白

18300＝对-硝基苯酚的摩尔消光系数(1cm光程长)

V＝7.25(以ml表示的测试的总液体体积)

1000＝转化成升

10⁶＝转化成μmoles

t＝30(分钟)

1u＝1μmol.分钟-1

E＝0.25(以ml表示的稀释酶样品的体积)

D＝酶稀释度，例如，对于稀释至1升的1ml，D＝1000)

测定7.β-葡聚糖酶测定

原理

由内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶催化的反应包括，当其还原基团参与被水解的键的葡萄糖残基本身在C-3被取代时，催化β-D-葡聚糖类中(1，3)-或(1，4)-葡糖苷键的内切水解。底物包括谷类β-D-葡聚糖类、昆布多糖和地衣多糖。按定义，该酶与EC 3.2.1.39(内切-1，3-β-葡聚糖酶或昆布多糖酶)不同。

内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的测定基于大麦β-葡聚糖(一种β-1，3(4)-葡聚糖)中1，3-或1，4-葡糖苷键的酶促水解。通过使用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所得的还原性基团的增加来比色测定反应产物(β-1，3(4)-葡聚糖寡糖类)。根据还原性基团的浓度(以葡萄糖当量表示)与在540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在该测定中，在添加和混合DNS试剂后，将测定管置于沸水浴(最低95℃)并且温育正好15分钟。这与使用其他底物的基于DNS的酶测定(其中温育期为5分钟)相反。该变化也影响测试中为可接受的ΔOD_540nm测试(T)值的范围。

虽然在pH 5.0下进行标准测定，但对于酶的进一步表征和鉴定，可在不同pH值下进行该测定。在该情况下，只有缓冲液的pH(下面指定的)被改变。

所需试剂

在所有情况下，除了β-葡聚糖外，重要的是试剂的一致性和纯度而不是提供商。

β-葡聚糖(大麦；中等粘度)，Megazyme Ltd，产品编号P-BGBM，粘度：20-30cSt

D-葡萄糖′AnalaR′，Merck Ltd(BDH)，产品编号10117，M.W.：180.16

无水醋酸钠′AnalaR′，Merck Ltd(BDH)，产品编号10236，M.W.82.03

醋酸(″冰醋酸″)′AnalaR′，Merck Ltd(BDH)，产品编号10001，M.W.60.05

3，5-二硝基水杨酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)，MerckLtd(BDH)，产品编号28235，

氢氧化钠颗粒′AnalaR′，Merck Ltd(BDH)，产品编号10252，M.W.40.00

酒石酸钾钠(+)′AnalaR′，Merck Ltd(BDH)，产品编号10219，M.W.282.22

试剂

1.5％(w/v，0.1M醋酸钠缓冲液中的溶液，pH 5.0)β-葡聚糖(大麦)；

3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液：10g DNS，16g氢氧化钠颗粒，将300g酒石酸钾钠(+)溶解于1000ml玻璃器具蒸馏水中。

1M醋酸钠缓冲液，pH 5.0

葡萄糖标准溶液(1.000mg/ml)

方法

每一个酶样品的测定包括3个分析：一式二份测试(TEST)分析和空白(BLANK)分析。还需要葡萄糖标准曲线。

在50℃下向1.75β-葡聚糖溶液中加入0.25ml稀释的酶溶液，10分钟后向加入DNS溶液，将管置于95℃下，进行15分钟。在水中冷却至25℃。

加入10ml玻璃器具蒸馏水，使用1cm光程长比色杯测量540nm处的光密度(OD_540nm)。

●测定一式两份测量的测试的OD_540nm测试；

●测定OD_540nm空白；

测定0.125、0.250、0.500、0.750mg/ml葡萄糖标准相对于0.00mg/ml葡萄糖标准样品(或全部针对水)的OD_540nm标准。

计算

测定ΔOD_540nm测试(T)＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

如下计算活性：

其中：T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的斜率(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总为负值，并且约为-0.02)

180.16＝葡萄糖的分子量

10³＝转化成μmoles

A＝以ml表示的测定体积使用2.00ml

V＝以ml表示的酶体积使用0.25ml

t＝以分钟表示的测定时间使用10分钟

D＝酶稀释度(例如，对于稀释至1升的1g，D＝1000)

Claims

1.来源于如下组合的酶复合物：

a.通过发酵木霉属(Trichoderma)的种获得的表达产物；和

2.权利要求1的酶复合物，其中所述不同真菌的一种或多种酶是通过所述不同真菌的发酵获得的表达产物。

3.权利要求2的酶复合物，其中所述不同真菌是青霉属(Penicillium)的真菌。

4.权利要求1-3中任一项的酶复合物，其中通过所述不同真菌的发酵获得的表达产物包含木聚糖酶。

5.权利要求1-4中任一项的酶复合物，其中包含选自下述中的一种或多种酶活性：内切-1，4-β-木聚糖酶、内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶、纤维素酶、昆布多糖酶、内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶，β-D-葡糖苷葡糖水解酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶、葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶、木葡聚糖特异性外切-β-1，4-葡聚糖酶和α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶。

6.来源于如下组合的酶复合物：

a.至少约61％的通过木霉属的发酵获得的表达产物；和

b.少于约39％的通过青霉属的不同真菌的发酵获得的表达产物；

其中所述百分比是基于如通过在本文中所述的“测定1”法测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性。

7.权利要求1-6中任一项的酶复合物，其中所述通过木霉属的发酵获得的表达产物来自里氏木霉(Trichoderma reesei)。

8.权利要求7的酶复合物，其中所述菌株是在布达佩斯条约下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的里氏木霉或其衍生物或后代，所述里氏木霉具有菌株名称GC Cellulose A83 GICC 0004M03000004，由Danisco A/S于2009年5月5日保藏。

9.权利要求1-8中任一项的酶复合物，其中所述通过不同真菌的发酵获得的表达产物来自绳状青霉的单一培养物。

10.权利要求9的酶复合物，其中所述菌株是在布达佩斯条约下以编号IMI 378536保藏在国际真菌研究所的绳状青霉或其衍生物或后代。

11.权利要求1-10中任一项的酶复合物，其中所述通过发酵获得的表达产物来自野生型物种。

12.权利要求1-11中任一项的酶复合物，其具有如通过本文中所述的“测定1”测量的至少约3000U/g，例如至少约4000U/g，例如至少约5000U/g，例如至少约6000U/g，例如至少约7000U/g的来源于木霉属发酵的酶活性。

13.权利要求1-12中任一项的酶复合物，其具有如通过在本文中所述的“测定1”测量的至少约4000U/g的总酶活性。

14.权利要求1-13中任一项的酶复合物，所述复合物由来自绳状青霉的约2362u/g和来自里氏木霉的约5315u/g组成，其中所述u/g是利用本文中所述的“测定1”测定的。

15.用于产生酶复合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在培养基中发酵木霉属以获得发酵液；

b.在培养基中发酵青霉属以获得发酵液，和

c.以来自所述发酵的无细胞培养液的形式回收和组合来源于步骤a)和b)的各酶复合物以获得酶复合物，其中如通过本文中所述的“测定1”测量的β-1，4-内切葡聚糖水解酶活性中至少约61％来源于木霉属的发酵。

16.权利要求15的方法，其中所述获得的酶复合物是如权利要求1-14的任一项中定义的。

17.通过权利要求15-16中任一项的方法可获得的酶复合物。

18.权利要求1-14中任一项的酶复合物在用于啤酒糟生产例如用于麦芽酒精饮料例如啤酒，例如麦芽酒精饮料啤酒生产和/或威士忌酒生产和/或生物燃料生产的方法中的用途。

19.权利要求18的用途，其中将所述酶复合物用于醪液以帮助过滤和/或醪液过滤和/或啤酒过滤。

20.权利要求18-19中任一项的用途，其中存在酿造周期/天的增加，例如与不使用酶的对照相比较，有至少5％，例如至少10％，或至少20％的增加，或与使用具有相同或相当的基于绳状青霉成分的酶活性的LAMINEXSuper的对照相比较，有至少2.5％，至少5％，或至少10％的增加。

21.权利要求18-20中任一项的用途，其中存在醪液分离增加。

22.权利要求18-21中任一项的用途，其中在醪液分离过程中流速增加，例如与不使用酶的对照相比较，有至少10％，至少15％，或至少20％的增加，或与使用LAMINEX

23.权利要求18-22中任一项的用途，其中存在总醪液分离时间减少，例如与不使用酶的对照相比较，有至少5％，至少10％，或至少15％的减少，或与使用LAMINEX

24.权利要求18-23中任一项的用途，其中存在酒水或提取时间减少，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

25.权利要求18-24中任一项的用途，其中在醪液分离过程中跨分离表面的平均ΔP减小，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEXSuper的对照相比较，有至少5％，至少10％或至少15％的减小。

26.权利要求18-25中任一项的用途，其中存在麦芽汁残留β葡聚糖的减少，例如与不使用酶的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少30％的减少，或与使用LAMINEX

Super的对照相比较，或至少2％，5％或10％的减少。

27.权利要求18-25中任一项的用途，其中存在麦芽汁粘度降低，例如与不使用酶的对照相比较，有至少2.5％，至少5％，或至少7.5％的降低。

28.权利要求18-27中任一项的用途，其中存在麦芽汁戊聚糖的减少。

29.权利要求18-28中任一项的用途，其中浸出物收得率提高。

30.权利要求18-29中任一项的用途，其中麦芽汁浊度不发生变化。

31.权利要求18-30中任一项的用途，其中在啤酒过滤过程中流速增加。

32.权利要求18-31中任一项的用途，其中在啤酒过滤过程中随时间的跨过滤器建立压力有减小，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

33.权利要求18-32中任一项的用途，其中啤酒浊度降低，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEX

Super的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的降低。

34.权利要求18-33中任一项的用途，其中泡沫稳定性不发生降低。

35.权利要求18-34中任一项的用途，其中啤酒β-葡聚糖减少，例如与不使用酶的对照或使用LAMINEXSuper的对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的减少。

36.权利要求18-35中任一项的用途，其中啤酒戊聚糖减少，例如与无酶对照相比较，有至少10％，至少20％，或至少25％的减少。

37.酶复合物在制备果汁、果酒、粮食加工、燃料酒清和可饮用酒精中的用途。