CN108368527B - 研磨方法 - Google Patents

Abstract

一种用于处理作物籽粒的方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在有效量的具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽或具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

Description

研磨方法

对序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

技术领域

本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本发明还涉及一种酶组合物并且涉及本发明的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。

背景技术

作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和甜味剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。

通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小时，以开始使淀粉和蛋白质键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨，以破坏果皮并使胚芽与剩余的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成，将其细磨并筛选，以将纤维与淀粉和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆或醇，或干燥并销售为玉米淀粉，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。

已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品(可得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。

最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种改进的湿磨方法，该方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。Johnston等人,Cereal Chem[谷物化学],81,第626-632页(2004)。

US 6,566,125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并将碾磨的玉蜀黍浆液与酶(例如，蛋白酶)一起孵育。

US 5,066,218披露了一种研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洗谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。

WO 2002/000731披露了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。

WO 2002/000911披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。

WO 2002/002644披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。

仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。

发明内容

本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在一种或多种具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在一种或多种具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽和一种或多种具有木聚糖酶活性的GH10或GH11多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，本发明提供了具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽用于增强一种或多种酶的湿磨益处的用途。

本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在一种或多种具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在一种或多种具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽和一种或多种具有木聚糖酶活性的GH10或GH11多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，上述步骤c)在纤维洗涤步骤过程中进行。

在一个实施例中，本发明提供了具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽用于增强一种或多种酶的湿磨益处的用途。

定义

辅助活性9多肽：术语“辅助活性9多肽”或“AA9多肽”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)的多肽(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人,2011,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)。根据Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316以及Henrissat和Bairoch,1996,Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。

AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下与具有无纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)相比，由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg的总蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w AA9多肽蛋白组成，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(如4-9，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续1-7天。

可以使用1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦德/>丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来测定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一方面，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(例如，根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一方面，该β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，如在WO 02/095014中所述的，在米曲霉中重组产生的)。

AA9多肽增强活性还可以通过以下来测定：在40℃下将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO₄、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小时，接着测定从PASC释放的葡萄糖。

还可以根据WO 2013/028928测定高温组合物的AA9多肽增强活性。

AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

根据WO 2008/151043或WO 2012/122518，AA9多肽也可以在可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。

该AA9多肽可以在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料或半纤维素材料(如预处理的玉米秸杆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变天然产生，并且可能导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)-和/或(1,2)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，布瑞公司(Bray,Co.)，威克洛郡，爱尔兰)以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行阿拉伯糖分析来测定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有选自以下列表的一种或多种多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性的至少50％，该列表由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66和SEQID NO:69。在一个优选的实施例中，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有选自以下列表的一种或多种多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性的至少70％，该列表由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118。在一个更优选的实施例中，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有选自以下列表的一种或多种多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性的至少80％，该列表由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:117和SEQ ID NO:118。在一个甚至更优选的实施例中，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有选自以下列表的一种或多种多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性的至少90％，该列表由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118。在一个最优选的实施例中，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶具有选自以下列表的一种或多种多肽的阿拉伯呋喃糖苷酶活性的至少95％，该列表由以下组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118。

含阿拉伯木聚糖的材料：术语“含阿拉伯木聚糖的材料”意指包含阿拉伯木聚糖的任何材料。阿拉伯木聚糖是在植物(包括木头和谷物)的初生和次生细胞壁中发现的半纤维素，由两种戊糖、阿拉伯糖和木糖的共聚物组成。阿拉伯木聚糖链包含大量的1,4-连接的木糖单元。许多木糖单元被2-、3-或2,3-取代的阿拉伯糖残基取代。

含阿拉伯木聚糖的材料的实例是草料、粗粮、种子和谷物(例如来自玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或通过粉碎、研磨等制备的)、树木或硬木(如杨树、柳树、桉树、棕榈、枫树、桦树)、竹子、草本和/或木本能源作物、农业粮食和饲料作物、动物饲料产品、木薯皮、可可豆荚、甘蔗、甜菜、槐豆粕、蔬菜或水果果渣、木材废料、树皮、刨花、锯末、木浆、制浆废液、废纸、纸板、建筑和拆除木材废料、工业或城市废水固体或污泥、肥料、来自酿造和/或发酵过程的副产物、湿酒糟、干酒糟、谷物渣、酒糟和甘蔗渣。

如在此所定义的草料还包括粗粮。草料是新鲜的植物物料，例如来自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、发芽谷物和豆类植物)或其任何组合的干草和青贮饲料。草料植物的实例是苜蓿(紫花苜蓿)、百脉根、芸苔属植物(例如，羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉(canola))、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、萝卜)、三叶草(例如，杂三叶、红三叶、地三叶、白三叶)、禾草(例如，百慕大草、雀麦、伪燕麦草、羊茅、石南草(heath grass)、草地早熟禾、芒草、鸭茅(orchard grass)、黑麦草、柳枝稷、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、大麻、粟、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦和蔬菜(如甜菜)。适用于青贮的作物是普通的禾草、三叶草、紫花苜蓿、野豌豆、燕麦、黑麦和玉蜀黍。草料进一步包括来自谷物产物的作物残余物(例如玉米秸秆，来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)，来自蔬菜像甜菜缨(beettop)的残余，来自油籽产物像来自大豆、油菜籽和其他豆类植物的茎和叶子的残余，以及来自用于动物或人类消耗的谷物精制过程或来自燃料生产或其他行业的部分。

粗粮一般是具有高水平纤维的干植物物料，例如来自种子和谷物以及作物残余(例如秸秆、干椰肉(copra)、稻草、谷壳、甜菜废料)的纤维、麸、苞叶。

包含阿拉伯木聚糖的材料的优选来源是草料、粗粮、种子和谷物、甘蔗、甜菜和木浆。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人,2002,J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。可以在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物来测定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％/>20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可存在于对应基因组DNA中的内含子序列。起初的原始RNA转录本是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工，然后作为成熟的剪接的mRNA出现。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何包含β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。可以根据Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；vanTilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；以及Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量单独的纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可以使用不溶性底物(包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等)测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。

可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，在一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素连同其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，其从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即来自相同基因)或外源的(即来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

作物籽粒：术语“作物籽粒”包括来自例如玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、果壳以及小麦的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。在一个实施例中，该玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。

干固体：术语“干固体”是在干重基础上的浆液的全固体(以百分比计)。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来测定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。还可以根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测确内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地连接至供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽，其中该片段具有酶活性。在一方面，片段包含酶的成熟多肽的至少85％(例如至少90％或至少95％)的氨基酸残基。

胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。被胚芽覆盖或包围的胚乳构成约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白质来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。

碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”意指破坏果皮并打开作物籽粒的任何方法。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如，Shallom和Shoham,2003,CurrentOpinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物半纤维素是支链和直链多糖的异质性组，其可以通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可以分配到GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可以进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可以根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.[纯粹与应用化学]59:1739-1752，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)以及适合的pH(如4-9，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下测量半纤维素分解酶活性。

高度支链化的木聚糖：术语“高度支链化的木聚糖”意指在阿拉伯木聚糖主链中的超过50％的木糖单元是被取代的。这优选地从如在Huismann等人Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物],2000,42:269-279中进行的连锁分析来计算。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于在自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

研磨的：术语“研磨的”是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被分解成更小的颗粒。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸1至302，并且SEQ ID NO:2的氨基酸-26至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸1至302。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸1至303，并且SEQ ID NO:11的氨基酸-26至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸1至303。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至382，并且SEQ ID NO:15的氨基酸-21至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:15的氨基酸1至382。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:17的氨基酸1至378，并且SEQ ID NO:17的氨基酸-17至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸1至378。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸1至311，并且SEQ ID NO:20的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:21的氨基酸1至311。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:23的氨基酸1至302，并且SEQ ID NO:23的氨基酸-29至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸1至302。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸1至309，并且SEQ ID NO:26的氨基酸-16至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:27的氨基酸1至309。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:29的氨基酸1至438，并且SEQ ID NO:29的氨基酸-36至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸1至438。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸1至446，并且SEQ ID NO:32的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:33的氨基酸1至446。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:35的氨基酸1至438，并且SEQ ID NO:35的氨基酸-36至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸1至438。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:38的氨基酸1至446，并且SEQ ID NO:38的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:39的氨基酸1至446。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:41的氨基酸1至318，并且SEQ ID NO:41的氨基酸-18至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸1至318。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸1至326，并且SEQ ID NO:44的氨基酸-18至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:45的氨基酸1至326。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:47的氨基酸1至302，并且SEQ ID NO:47的氨基酸-25至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:48的氨基酸1至302。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:50的氨基酸1至311，并且SEQ ID NO:50的氨基酸-25至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:51的氨基酸1至311。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:53的氨基酸1至364，并且SEQ ID NO:53的氨基酸-24至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:54的氨基酸1至364。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:56的氨基酸1至373，并且SEQ ID NO:56的氨基酸-24至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:57的氨基酸1至373。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:59的氨基酸1至436，并且SEQ ID NO:59的氨基酸-31至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:60的氨基酸1至436。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:62的氨基酸1至444，并且SEQ ID NO:62的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:63的氨基酸1至444。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:65的氨基酸1至302，并且SEQ ID NO:65的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:66的氨基酸1至302。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:68的氨基酸1至311，并且SEQ ID NO:68的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:69的氨基酸1至311。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:77的氨基酸1至183，并且SEQ ID NO:77的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:78的氨基酸1至302。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:80的氨基酸1至181，并且SEQ ID NO:80的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:81的氨基酸1至181。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:83的氨基酸1至299，并且SEQ ID NO:83的氨基酸-42至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:84的氨基酸1至299。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:86的氨基酸1至307，并且SEQ ID NO:86的氨基酸-27至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:87的氨基酸1至307。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:117的氨基酸1至306，并且SEQ ID NO:117的氨基酸-26至-1是信号肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:118的氨基酸1至306，并且SEQ ID NO:118的氨基酸-26至-1是信号肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:119的氨基酸1至300，并且SEQ ID NO:119的氨基酸-19至-1是信号肽。

在一方面，基于预测SEQ ID NO:96的氨基酸1至25是信号肽的SignalP3.0程序(Bendtsen等人,2004,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]340:783-795)，纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:96的氨基酸26至532。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:98的氨基酸1至18是信号肽的SignalP3.0程序，纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:98的氨基酸19至464。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:100的氨基酸1至19是信号肽的SignalP 3.0程序，β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:100的氨基酸20至863。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:102的氨基酸1至25是信号肽的SignalP 3.0程序，AA9多肽的成熟多肽是SEQ IDNO:102的氨基酸26至253。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:104的氨基酸1至20是信号肽的SignalP 3.0程序，GH10木聚糖酶的成熟多肽是SEQ ID NO:104的氨基酸21至405。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:106的氨基酸1至19是信号肽的SignalP 3.0程序，GH10木聚糖酶的成熟多肽是SEQ ID NO:106的氨基酸20至398。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:108的氨基酸1至21是信号肽的SignalP 3.0程序，β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:108的氨基酸22至796。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:110的氨基酸1至22是信号肽的SignalP 3.0程序，内切葡聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:110的氨基酸23至459。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:112的氨基酸1至21是信号肽的SignalP 3.0程序，内切葡聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:112的氨基酸22至418。在一方面，基于预测SEQ ID NO:114的氨基酸1至26是信号肽的SignalP 3.0程序(Bendtsen等人,2004,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]340:783-795)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:114的氨基酸27至532。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:116的氨基酸1至19是信号肽的SignalP 3.0程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:116的氨基酸20至454。

本领域已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸79至987，并且SEQ ID NO:10的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:25的核苷酸49至70和核苷酸123至1027的结合序列或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:25的核苷酸1至48编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:28的核苷酸109至1422，并且SEQ IDNO:28的核苷酸1至108编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:31的核苷酸82至1419，并且SEQ IDNO:31的核苷酸1至81编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:34的核苷酸109至1422，并且SEQ IDNO:34的核苷酸1至108编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:37的核苷酸82至1419，并且SEQ IDNO:37的核苷酸1至81编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:46的核苷酸76至981，并且SEQ IDNO:46的核苷酸1至75编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:49的核苷酸76至1008，并且SEQ IDNO:49的核苷酸1至75编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:52的核苷酸73至318、核苷酸470至1298和核苷酸1392至1408的结合序列，并且SEQ ID NO:52的核苷酸1至72编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:55的核苷酸73至318、核苷酸470至1298和核苷酸1392至1435的结合序列，并且SEQ ID NO:55的核苷酸1至72编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:58的核苷酸94至1401，并且SEQ IDNO:58的核苷酸1至93编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:61的核苷酸82至1413，并且SEQ IDNO:61的核苷酸1至81编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:64的核苷酸58至330、核苷酸403至655、核苷酸795至948和核苷酸1100至1325的结合序列，并且SEQ ID NO:64的核苷酸1至57编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:67的核苷酸58至330、核苷酸403至655、核苷酸795至948和核苷酸1100至1352的结合序列，并且SEQ ID NO:67的核苷酸1至57编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:83的核苷酸127至1023，并且SEQ IDNO:83的核苷酸1至126编码信号肽。

在一方面，基于预测SEQ ID NO:95的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP 3.0程序(Bendtsen等人,2004，见上文)，纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:95的核苷酸76至1727或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:97的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP 3.0程序，纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:97的核苷酸55至1895或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:99的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP 3.0程序，β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:99的核苷酸58至3057或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:101的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP3.0程序，AA9多肽的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:101的核苷酸76至832或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:103的核苷酸1至123编码信号肽的SignalP3.0程序，GH10木聚糖酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:103的核苷酸124至1517或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:105的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP 3.0程序，GH10木聚糖酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:105的核苷酸58至1194。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:107的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP 3.0程序，β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:107的核苷酸64至2388。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:109的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP 3.0程序，内切葡聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:109的核苷酸67至1504或其cDNA序列。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:111的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP 3.0程序，内切葡聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:111的核苷酸64至1504。在一方面，基于预测SEQ ID NO:113的核苷酸1至78编码信号肽的SignalP 3.0程序(Bendtsen等人,2004，见上文)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:113的79至1596。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:115的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP 3.0程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:115的核苷酸58至1700或其cDNA序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

寡糖：术语“寡糖”是具有2至10个单糖单位的化合物。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。

蛋白酶：术语“蛋白水解酶”或“蛋白酶”意指一种或多种(例如，若干种)酶，其通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而分解蛋白质的酰胺键。蛋白酶可以包括例如金属蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、和天冬氨酸蛋白酶。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势],16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。使用版本6.1.0。所用的可选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。

浸渍(steep或steeping)：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO2浸泡作物籽粒。

严格条件：不同的严格条件定义如下。

术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2.0X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用1.0X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用1.0X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用1.0X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用0.5X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在75℃下使用0.5X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有阿拉伯呋喃糖苷酶或木聚糖酶活性的片段。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制剂，该制剂包含与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有木聚糖酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸置换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

湿磨益处：术语“湿磨益处”意指改进的淀粉产量和/或纯度，改进的面筋品质和/或产量，改进的纤维、面筋或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，以及(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、和α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括Biely和Puchard,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture[食品与农业科学杂志]86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]580(19):4597-4601；Herrimann等人,1997,Biochemical Journal[生物化学杂志]321:375-381。

可以通过确定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦木聚糖、山毛榉木材木聚糖、和落叶松木材木聚糖)形成的还原糖，或者通过光度确定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量总木聚糖降解活性。常见的总木聚糖分解活性测定是基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如描述于Bailey等人,1992,Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity[用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法],Journal of Biotechnology[生物技术杂志]23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。

木聚糖降解活性可以通过测量由一种或多种木聚糖降解酶在以下典型条件下造成的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)水解的增加来测定：1ml反应，5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠(pH 5)，50℃，24小时，如Lever,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指一种1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内部水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。

命名法

出于本发明的目的，命名[Y/F]意指在该位置处的氨基酸可以是酪氨酸(Try，Y)或苯丙氨酸(Phe，F)。同样，如在此所述，命名[V/G/A/I]意指在该位置处的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如在此所述的其他组合，依次类推。除非进一步另有限制，氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。

具体实施方式

因此，本发明的目的在于提供处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的淀粉。

在一个实施例中，有用于本发明的方法的酶组合物提供以下益处，包括改进淀粉产量和/或纯度，改进面筋品质和/或产量，改进纤维、面筋或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约。

此外，诸位发明人已经出人意料地发现，由于将淀粉和蛋白质两个级分都与纤维级分更好地分离，根据本发明有用的酶提供了减少的纤维质量和较低蛋白含量的纤维。将淀粉和面筋与纤维分离对于工业而言是有价值的，因为纤维是湿磨方法中价值最低的产品，并且较高纯度的淀粉和蛋白质是令人希望的。

出人意料地，诸位发明人已经发现，替换酶组合物中的一些蛋白酶活性可以提供优于仅主要包含蛋白酶活性的另外的类似组合物的改进。这例如可以在成本和易用性的基础上为工业提供益处。

研磨方法

研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

在一个实施例中，使用湿磨方法。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于平行生产糖浆的场所。

本发明的诸位发明人已经出人意料地发现，可以通过在如在此描述的方法中处理作物籽粒而改进淀粉终产物的品质。

本发明的方法与传统方法相比，产生了更高的淀粉品质，因为淀粉终产物更纯和/或获得了更高的产量和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少需要使用的化学品(例如SO2和NaHSO3)的量或甚至完全除去。

湿磨

淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形式而形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。有待根据本发明加工的颗粒状淀粉可以是包含粗淀粉的材料，该材料包括(例如，研磨的)全谷物，这些全谷物包括非淀粉级分，如胚芽残余物和纤维。可以例如通过湿磨将原料(如全谷物)的粒度减小，以便打开结构并允许进一步加工。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。

在一个实施例中，粒度被减小至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。

更具体而言，将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉基本由四个步骤组成：

1.浸渍并分离胚芽，

2.洗涤纤维并干燥，

3.分离淀粉面筋，并且

4.洗涤淀粉。

1.浸渍并分离胚芽

通过在约50℃(例如约45℃至60℃之间)的温度下，在水中浸泡约30分钟至约48小时(优选30分钟至约15小时，如约1小时至约6小时)之间而软化玉米籽粒。在浸渍过程中，籽粒吸水，从而将其水分含量从15％增加至45％并使大小增加超过一倍。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的面筋键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，它们裂了开来，以释放胚芽。胚芽包含有价值的玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、外壳和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。

在本发明的一个实施例中，于范围在40℃与60℃之间的温度(优选大约50℃)下，将籽粒在水中浸泡2-10小时、优选约3-5小时。

在一个实施例中，在浸泡过程中可以添加0.01％-1％、优选0.05％-0.3％、尤其是0.1％SO2和/或NaHSO3。

2.洗涤纤维并干燥

为了得到最大的淀粉回收同时将终产物中的任何纤维保持至绝对最小值，在加工过程中必须从纤维中洗涤出游离淀粉。收集纤维，并使其成浆并过筛，以回收任何残留的淀粉或蛋白质。

3.分离淀粉面筋

将来自纤维洗涤步骤的淀粉-面筋悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和面筋。与淀粉相比，面筋具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出面筋。

4.洗涤淀粉

来自淀粉分离步骤的淀粉浆液包含一些不溶性蛋白质和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其除去。在水力旋流器中，将仅仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以除去最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。

产物

可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浆、玉米面筋饲料、胚芽、玉米油、玉米面筋粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。

具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽

下文披露了本发明的方面的优选实施例，涉及具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽。在2015年1月19日提交的PCT/CN2015/071015中发现了具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的优选GH62多肽的另外的细节。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:9具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:15具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:18具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:21具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:24具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:27具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:30具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:35的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:36具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:42具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:47的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:48具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:53的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:54具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:59的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:60具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:65的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:66具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:117具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽与SEQ ID NO:118具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

多肽的来源

本发明的具有阿拉伯呋喃糖苷酶或木聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是真菌多肽。在一个实施例中，该多肽来自散囊菌目的真菌，或来自曲霉科，或来自青霉属，或来自以下物种：黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)、草酸青霉或胶囊青霉(Penicillium capsulatum)。

在一个实施例中，该多肽来自散囊菌目的真菌，或来自曲霉科，或来自曲霉属，或来自以下物种：棒曲霉(Aspergillus clavatus)或温特曲霉(Aspergillus wentii)或黑曲霉。

在一个实施例中，该多肽来自散囊菌目的真菌，或来自曲霉科，或来自新萨托菌属(Neosartorya)，或来自以下物种：费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)。

在一个实施例中，该多肽来自散囊菌目的真菌，或来自发菌科，或来自篮状菌属(Talaromyces)，或来自以下物种：褐红篮状菌(Talaromyces pinophilus)。

在一个实施例中，该多肽来自黑粉菌目(Ustilaginales)的真菌，或来自黑粉菌科(Ustilaginaceae)，或来自黑粉菌属(Ustilago)，或来自以下物种：玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)。

在一个实施例中，该多肽来自子囊菌门的真菌，或来自端梗孢属(Acrophialophora)，或来自以下物种：梭孢端梗霉(Acrophialophora fusispora)。

该多肽可以是细菌多肽。在一个实施例中，该多肽来自放线菌目的细菌，或来自链霉菌科，或来自链霉菌属，或来自以下物种：硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)或北疆链霉菌(Streptomyces beijiangensis)。

在一个实施例中，该多肽来自放线菌目的细菌，或来自链孢子囊菌科，或来自链孢子囊菌属，或来自以下物种：链孢囊菌属物种-60756。

将理解的是，对于以上提到的物种，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectand imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center,NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域已知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码多肽的多核苷酸，便可以通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。

酶组合物

优选地，这些组合物富含根据本发明有用的多肽。术语“富含”表示，组合物的酶活性已经增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。在一个实施例中，该组合物包括本发明第一方面的多肽和一种或多种调配剂，如在下文“调配剂”部分中所述。

这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。这样的组合物可以进一步包括调配剂，如在以下“调配剂”部分中所述。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下组成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、葡糖苷酸酶、溶血磷脂酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、内切-1,4-β-木聚糖酶乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-糖苷酶、支链淀粉酶或其任何混合物。如下文进一步概述的，另外的纤维素分解活性是特别考虑的。

在考虑阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶活性的情况下，目前考虑，按以下量(剂量范围)中的一个或多个使用木聚糖酶：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10，其中所有这些范围都是每kg底物中木聚糖酶蛋白的mg数(ppm)。目前考虑，按以下量(剂量范围)中的一个或多个施用阿拉伯呋喃糖苷酶：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10，其中所有这些范围都是每kg底物中阿拉伯呋喃糖苷酶蛋白的mg数(ppm)。进一步考虑，GH10或GH11木聚糖酶与GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的比例是在100:1至1:100的木聚糖酶:阿拉伯呋喃糖苷酶的范围内，如50:1至1:50、50:1至1:10、25:1至1:5、10:1至1:2或如10:1至1:50、5:1至1:25、2:1至1:10的木聚糖酶:阿拉伯呋喃糖苷酶的范围。

调配剂

本发明的酶可以配制为液体或固体。针对液体配制品，该调配剂可以包括多元醇(像例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(像例如，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(像例如，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是一种液体组合物，该液体组合物包括本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的调配剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇。

针对固体配制品，该配制品可以是例如作为颗粒、喷雾干粉或聚结物。调配剂可以包括盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，像例如，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。

在一个实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式。该颗粒可以具有基体结构(matrix structure)，其中组分是均匀混合的。然而，该颗粒典型地包括核心颗粒和一种或多种包衣，该包衣典型地是盐的和/或蜡质的包衣。该核心颗粒可以是任选地与一种或多种另外的酶组合的本发明的木聚糖酶并且任选地连同一种或多种盐的均匀共混物，抑或是惰性颗粒(具有本发明的木聚糖酶，该木聚糖酶任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合)。

在一个实施例中，核心颗粒的材料选自下组，该组由以下组成：无机盐(如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质。

盐包衣典型地至少是1μm厚并且可以是一种具体的盐或多种盐的混合物，例如Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄和/或柠檬酸钠。其他实例是在例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034中描述的那些，或是例如在WO 2001/00042中描述的聚合物包衣。

在另一个实施例中，该组合物是一种固体组合物，该固体组合物包括本发明的木聚糖酶和一种或多种选自以下列表的调配剂，该列表由以下组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。在一个优选的实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式。在一个实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式，并且包括核心颗粒、包含本发明的木聚糖酶的酶层以及盐包衣。

在另外的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。

来自黍亚科的基于植物的材料

在一个实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自蜀黍族，如级别须芒草属(Andropogon)或翼颖草属(Andropterum)或水蔗草属(Apluda)或楔颖草属(Apocopis)或荩草属(Arthraxon)或孔颖草属(Bothriochloa)或细柄草属(Capillipedium)或葫芦草属(Chionachne)或金须草属(Chrysopogon)或空轴茅属(Coelorachis)或薏苡属(Coix)或香茅属(Cymbopogon)或双花草属(Dichanthium)或双黄茅属(Diheteropogon)或觿茅属(Dimeria)或香鳞茅属(Elionurus)或娱蚣草属(Eremochloa)或优解草属(Euclasta)或金茅属(Eulalia)或吉曼草属(Germainia)或牛鞭草属(Hemarthria)或异蛇尾草属(Heteropholis)或黄茅属(Heteropogon)或苞芽属(Hyparrhenia)或金苞茅属(Hyperthelia)或白茅属(Imperata)或鸭嘴草属(Ischaemum)或合穗茅属(Iseilema)或泰蔗草属(Kerriochloa)或莠竹属(Microstegium)或芒羽藓属(Miscanthidium)或芒属或毛俭草属(Mnesithea)或蛇尾草属(Ophiuros)或偏基草属(Oxyrhachis)或束尾草属(Phacelurus)或蜥尾禾属(Pholiurus)或金丝草属(Pogonatherum)或多裔草属(Polytoca)或单序草属(Polytrias)或假金发草属(Pseudopogonatherum)或假高粱属(Pseudosorghum)或皱颖草属(Rhytachne)或筒轴茅属(Rottboellia)或甘蔗属(Saccharum)或针粱草属(Sarga)或裂稃草属(Schizachyrium)或沟颖草属(Sehima)或假高粱属(Sorghastrum)或高粱属(Sorghum)或大油芒属(Spodiopogon)或假蛇尾草属(Thaumastochloa)或疣颖草属(Thelepogon)或菅草属(Themeda)或皱芒草属(Trachypogon)或荻属(Triarrhena)或摩擦草属(Tripsacum)或尾鳞草属(Urelytrum)或香根草属(Vetiveria)或河马草属(Vossia)或旱米草属(Xerochloa)或玉蜀黍属(Zea)。

在一个优选的实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自玉蜀黍属级别，如以下物种：二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis)、繁茂类玉米(Zea luxurians)、玉蜀黍(Zea mays)、尼加拉瓜类玉米(Zea nicaraguensis)或四倍体多年生类玉米(Zeaperennis)。

在一个优选的实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自高粱属级别，如以下物种：阔叶高粱(Sorghum amplum)、狭叶高粱(Sorghum angustum)、澳大利亚高粱(Sorghumaustraliense)、双色高粱(Sorghum bicolor)、短柄高粱(Sorghum brachypodum)、球茎高粱(Sorghum bulbosum)、龙骨状高粱(Sorghum ecarinatum)、外鞘柄高粱(Sorghumexstans)、格兰德高粱(Sorghum grande)、假高粱(Sorghum halepense)、高粱杂种栽培品种、中间高粱(Sorghum interjectum)、非可迁黍(Sorghum intrans)、疏花高粱(Sorghumlaxiflorum)、利奥克拉德高粱(Sorghum leiocladum)、巨籽高粱(Sorghummacrospermum)、麦特粒高粱(Sorghum matarankense)、光高粱(Sorghum nitidum)、羽状高粱(Sorghum plumosum)、拟高梁(Sorghum propinquum)、紫绢毛高粱(Sorghumpurpureosericeum)、针茅高粱(Sorghum stipoideum)、苏丹草(Sorghum sudanense)、帝汶高粱(Sorghum timorense)、多色高粱(Sorghum versicolor)、高粱属物种(Sorghum sp.)“西尔克”(‘Silk’)、或如WO2007/002267中所定义的高粱属物种。

在另一个实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自黍族，如级别缠芒草属(Acritochaete)、凤头黍属(Acroceras)、Alexfloydia、毛颖草属(Alloteropsis)、姬苇属(Amphicarpum)、钩穗草属(Ancistrachne)、瓶刷草属(Anthephora)、臂形草属(Brachiaria)、纤隐草属(Calyptochloa)、蒺藜草属(Cenchrus)、髯柄草属(Chaetium)、鬃禾属(Chaetopoa)、鬃针茅属(Chamaeraphis)、绿兜草属(Chlorocalymma)、蔺隐草属(Cleistochloa)、拱稃草属(Cyphochlaena)、弓果黍属(Cyrtococcum)、二型花属(Dichanthelium)、马唐属(Digitaria)、假狗尾草属(Dissochondrus)、稗草属(Echinochloa)、内毛草属(Entolasia)、野黍属(Eriochloa)、同鳞虎属(Homopholis)、水鞭草属(Hygrochloa)、林行黍属(Hylebates)、火鸡草属(Ixophorus)、小芦竹属(Lasiacis)、玉毛虫属(Leucophrys)、泥稗属(Louisiella)、长颖马唐属(Megaloprotachne)、大序黍属(Megathyrsus)、糖蜜草属(Melinis)、新小竹属(Microcalamus)、Moorochloa、脉颖草属(Neurachne)、水斗草属(Odontelytrum)、球米草属(Oplismenus)、露籽草属(Ottochloa)、黍属(Panicum)、秃刷草属(Paractaenum)、异脉颖草属(Paraneurachne)、隐鬃草属(Paratheria)、Parodiophyllochloa、类雀稗属(Paspalidium)、狼尾草属(Pennisetum)、鬃刷草属(Plagiosetum)、灿穗黍属(Poecilostachys)、钩毛草属(Pseudechinolaena)、枝狼草属(Pseudochaetochloa)、伪针茅属(Pseudoraphis)、Rupichloa、囊颖草属(Sacciolepis)、盾颖黍属(Scutachne)、狗尾草属(Setaria)、坚狗尾草属(Setariopsis)、胁穗草属(Snowdenia)、滨刺草属(Spinifex)、钝叶草属(Stenotaphrum)、芒马唐属(Stereochlaena)、交雀草属(Thrasya)、萏雷草属(Thuarea)、窗颖草属(Thyridolepis)、贫地黍属(Tricholaena)、未归类的黍、节鞭草属(Uranthoecium)、尾稃草属(Urochloa)、Walwhalleya、丝梗黍属(Whiteochloa)、柱梗黍属(Yakirra)、弱臂草属(Yvesia)、Zuloagaea或沙芜草属(Zygochloa)。

在一个优选的实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自黍属级别，如以下物种：紫茎黍(Panicum adenophorum)、尖头黍(Panicum aff.Aquaticum)JKT-2012、苦黍(Panicum amarum)、蓝黍(Panicum antidotale)、粉绿黍(Panicum aquaticum)、天栌黍(Panicum arctum)、筒节黍(Panicum arundinariae)、暗红黍(Panicum atrosanguineum)、奥里科姆黍(Panicum auricomum)、折萼黍(Panicum auritum)、巴氏黍(Panicumbartlettii)、伯氏黍(Panicum bergii)、糠稷(Panicum bisulcatum)、勃氏黍(Panicumboliviense)、布拉柴维尔黍(Panicum brazzavillense)、短叶黍(Panicum brevifolium)、卡瓜苏黍(Panicum caaguazuense)、坎佩斯特雷黍(Panicum campestre)、毛绒稷(Panicumcapillare)、卡宴恩瑟黍(Panicum cayennense)、卡约恩瑟黍(Panicum cayoense)、塞尔维黍(Panicum cervicatum)、绿亮状黍(Panicum chloroleucum)、克氏黍(Panicumclaytonii)、着色黍(Panicum coloratum)、暗蓝黍(Panicum cyanescens)、多籽黍(Panicum decompositum)、焦色黍(Panicum deustum)、洋野黍(Panicumdichotomiflorum)、细叶黍(Panicum dinklagei)、黄藓黍(Panicum distichophyllum)、藤黍(Panicum dregeanum)、象脚黍(Panicum elephantipes)、傅氏黍(Panicum fauriei)、柔性黍(Panicum flexile)、弗吕科拉黍(Panicum fluviicola)、铺地黍(Panicum gouinii)、细长黍(Panicum gracilicaule)、广东黍(Panicum granuliferum)、危地马拉黍(Panicumguatemalense)、霍氏黍(Panicum hallii)、杂多穗黍(Panicum heterostachyum)、腺毛茎黍(Panicum hirticaule)、恶味黍(Panicum hirtum)、雨林黍(Panicum hylaeicum)、背倚黍(Panicum incumbens)、致病黍(Panicum infestum)、意大利黍(Panicum italicum)、光泽黍(Panicum laetum)、光滑节点黍(Panicum laevinode)、绵柄黍(Panicum lanipes)、拉科尼亚黍(Panicum larcomianum)、长梗黍(Panicum longipedicellatum)、町田黍(Panicum machrisianum)、软毛黍(Panicum malacotrichum)、珠黍(Panicummargaritiferum)、硬叶黍(Panicum micranthum)、猪粟(Panicum miliaceum)、多花黍(Panicum milioides)、粒结节黍(Panicum millegrana)、神秘黍(Panicum mystasipum)、纳塔莱黍(Panicum natalense)、霞石黍(Panicum nephelophilum)、多脉黍(Panicumnervosum)、心叶稷(Panicum notatum)、奥格罗黍(Panicum olyroides)、水生黍(Panicumpaludosum)、扩展黍(Panicum pansum)、周毛黍(Panicum pantrichum)、小叶黍(Panicumparvifolium)、铃珑黍(Panicum parviglume)、佩氏黍(Panicum pedersenii)、潘氏黍(Panicum penicillatu)、彼氏黍(Panicum petersonii)、苇状黍(Panicumphragmitoides)、皮奥伊州黍(Panicum piauiense)、疏毛黍(Panicum pilosum)、丰饶黍(Panicum pleianthum)、多毛黍(Panicum polycomum)、黄精黍(Panicum polygonatum)、柳叶箬黍(Panicum pseudisachne)、多疣黍(Panicum pygmaeum)、梨果黍(Panicumpyrularium)、昆士兰单黍(Panicum queenslandicum)、葡萄状黍(Panicum racemosum)、铺地黍(Panicum repens)、桧藓稷(Panicum rhizogonum)、微硬毛黍(Panicum rigidulum)、紫萼黍(Panicum rivale)、野稷(Panicum rude)、汝孜黍(Panicum rudgei)、欣氏黍(Panicum schinzii)、施拉克黍(Panicum schwackeanum)、塞氏黍(Panicum sellowii)、半裸黍(Panicum seminudum)、毛梗黍(Panicum stapfianum)、窄纹黍(Panicum stenodes)、草黄黍(Panicum stramineum)、亚亮黍(Panicum subalbidum)、亚提拉米苏黍(Panicumsubtiramulosum)、细柄黍(Panicum sumatrense)、柔叶黍(Panicum tenellum)、细叶黍(Panicum tenuifolium)、长毛黍(Panicum trichanthum)、毛鹧鸪黍(Panicumtrichidiachne)、毛样黍(Panicum trichoides)、毛腺状黍(Panicum tricholaenoides)、阔叶黍(Panicum tuerckheimii)、圆锥黍(Panicum turgidum)、长尖黍(Panicumurvilleanum)、强壮黍(Panicum validum)、委内瑞拉黍(Panicum venezuelae)、鲜绿黍(Panicum verrucosum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、宽叶雀稗(Panicum wettsteinii)、黍属(Panicum sp.)、黍属克里斯汀(Christin)16-200、黍属ELS-2011、黍属EM389或黍属福雷斯特(Forest)761。

在另外的实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料是玉蜀黍(maize)(玉蜀黍属(zea))、玉米(corn)(玉蜀黍属)、高粱(高粱属)、柳枝稷(switchgrass)(柳枝稷(Panicumvirgatum))、粟(millet)(黍(Panicum miliaceum))、珍珠粟(Cenchrus violaceus，还称珍珠稷(Pennisetum glaucum))、谷子(粟(Setaria italica)，还称为秫米(Panicumitalicum))，或其经加工的形式，如研磨的玉米、研磨的玉蜀黍、脱脂玉蜀黍、脱脂脱淀粉的玉蜀黍、研磨的高粱、研磨的柳枝稷、研磨的粟、研磨的谷子、研磨的珍珠粟、或其任何组合。

在一个实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自植物的种子。在一个优选的实施例中，来自黍亚科的基于植物的材料来自玉蜀黍(maize)(玉蜀黍属(zea))、玉米(corn)(玉蜀黍属)、高粱(高粱属)、柳枝稷(switchgrass)(柳枝稷(Panicum virgatum))、粟(millet)(黍(Panicum miliaceum))、珍珠粟(Cenchrus violaceus，还称珍珠稷(Pennisetum glaucum))、谷子(粟(Setaria italica)，还称为秫米(Panicum italicum))的种子，或其中该种子已经被加工，如研磨的玉米、研磨的玉蜀黍、脱脂玉蜀黍、脱脂脱淀粉的玉蜀黍、研磨的高粱、研磨的柳枝稷、研磨的粟、研磨的谷子、研磨的珍珠粟、或其任何组合。

另外的酶

在一个实施例中，考虑了除或除了根据本发明有用的具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽之外的酶活性。具体而言，考虑了蛋白酶和另外的纤维素分解活性。

在一个实施例中，本发明包括具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽和GH10木聚糖酶的使用。

在一个实施例中，本发明包括具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽和GH11木聚糖酶的使用。

在一个实施例中，本发明包括具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽和GH10木聚糖酶的使用。

在一个实施例中，本发明包括具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH43多肽和GH11木聚糖酶的使用。

蛋白酶

该蛋白酶可以是任何蛋白酶。适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性内切蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可以使用其他蛋白酶。

酸性真菌蛋白酶可以来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、小核菌属以及球拟酵母菌属。具体而言，该蛋白酶可以来源于棘孢曲霉(WO95/02044)、泡盛曲霉(Hayashida等人,1977,Agric.Biol.Chem.[农业、生物学与化学]42(5),927-933)、黑曲霉(参见例如，Koaze等人,1964,Agr.Biol.Chem.Japan[日本农业、生物学与化学]28:216)、斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(参见例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan[日本农业、化学与社会学杂志]28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。

在一个实施例中，该酸性蛋白酶是一种来自米曲霉的在商品名(来自诺维信公司)下销售的蛋白酶复合体或来自米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶或来自杰能科公司(Genencor Int.)的/>FAN或GC 106。

在一个优选的实施例中，该酸性蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，例如来源于曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉，尤其是棘孢曲霉CBD 101.43)的天冬氨酸蛋白酶。

优选的酸性蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，其在选自下组的抑制剂的存在下保留活性，该组由以下组成：胃酶抑素、Pefabloc、PMSF、或EDTA。来源于棘孢曲霉CBS 101.43的蛋白酶I是这样的酸性蛋白酶。

在一个优选的实施例中，在有效量的来源于棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶I的存在下进行本发明的方法。

在另一个实施例中，该蛋白酶来源于曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉的菌株，例如棘孢曲霉CBS 101.43(例如披露于WO 95/02044中的一种)，或与WO 95/02044的蛋白酶具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的蛋白酶。在一方面，该蛋白酶与WO 95/02044的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的WO 95/02044的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入WO 95/02044的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

该蛋白酶可以是一种中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。一种具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot获得的序列。这些蛋白酶与披露于Swissprot数据库中的氨基酸序列(登录号P06832)可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％一致性。

该蛋白酶与WO 2003/048353中披露为序列1的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％一致性。

该蛋白酶可以是选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，该组由以下组成：EC3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)以及EC 3.4.22.30(木瓜蛋白酶Q(caricain))。

在一个实施例中，该蛋白酶是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白酶制剂。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属的菌株，优选是米黑根毛霉。在另一个实施例中，该蛋白酶是一种蛋白酶制剂，优选是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白质分解制剂和来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于例如Handbook of Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],由A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编辑,Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,1998,第270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如披露于以下中的那些：Berka等人,1990,Gene[基因]96:313；Berka等人,1993,Gene[基因]125:195-198；和Gomi等人,1993,Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物科技与生物化学]57:1095-1100，将其通过引用而特此结合。

该蛋白酶还可以是一种金属蛋白酶，将其定义为选自下组的蛋白酶，该组由以下组成：

(a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；

(b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶；

(c)尚未指定宗族的金属蛋白酶(指定：宗族MX)，或属于宗族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第989-991页所定义)；

(d)其他家族的金属蛋白酶(如在以上手册的第1448-1452页所定义)；

(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；

(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；

(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第1448-1452页所定义)；

(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及

(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如在以上手册的第1492-1495页所定义)。

在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施例中，数目是二或三，优选是三。

对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在一个实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24、优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是酸稳定的金属蛋白酶，例如真菌酸稳定的金属蛋白酶，如来源于嗜热子嚢菌属的菌株、优选橙色嗜热子囊菌的菌株、尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(分类为EC3.4.24.39)。在另一个实施例中，该金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株、优选米曲霉的菌株。

在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的序列号1(一种橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-159至177、或优选氨基酸+1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少97％的序列一致性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。

橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的一个优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉并且包括披露于WO2003/048353中的序列号11，或其氨基酸23-353、23-374、23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374、或177-397，以及披露于WO 2003/048353中的序列号10。

另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包括WO 2010/008841的序列号5的米曲霉金属蛋白酶，或一种作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与序列号5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％一致性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由序列号5的氨基酸序列组成。

在一个具体实施例中，金属蛋白酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与橙色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。

在另一个实施例中，金属蛋白酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个或相差一个氨基酸。

在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包括以下或b)由以下组成

i)WO 2010/008841的序列号1的氨基酸-159至177、或+1至177的氨基酸序列；

ii)WO 2010/008841的序列号3的氨基酸23-353、23-374、23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374、或177-397的氨基酸序列；

iii)WO 2010/008841的序列号5的氨基酸序列；或

i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列的等位基因变体或片段。

WO 2010/008841的序列号1的氨基酸-159至177、或+1至177或WO2010/008841的序列号3的氨基酸23-353、23-374、23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374、或177-397的片段是一种自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。

在另一个实施例中，该金属蛋白酶与另一种蛋白酶组合，该蛋白酶是例如真菌蛋白酶，优选是酸性真菌蛋白酶。

在另一个实施例中，该蛋白酶选自下组，该组由以下组成：

(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或

(b)属于EC 3.4.14酶组的蛋白酶；和/或

(c)肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶，其包括两种不同类型的肽酶：三肽基氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993,Biochem.J.[生物化学杂志]290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于Rawlings,N.D.,Barrett,A.J.和Bateman,A.,2010,“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:thepeptidase database)”,Nucl.Acids Res.[核酸研究]38:D227-D233中。还参见2013年11月26日提交的PCT/CN2013/087861。

可商购产品包括ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、NOVOZYM^TMFM 2.0L及iZyme BA(可得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杰能科国际公司(Genencor International,Inc.)的GC106^TM和SPEZYME^TMFAN。

该蛋白酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒、优选0.001至0.1mg酶蛋白/gDS籽粒的量存在。

在一个实施例中，该蛋白酶是一种按以下量添加的酸性蛋白酶：1-20,000HUT/100g DS籽粒，例如1-10,000HUT/100g DS籽粒、优选300-8,000HUT/100g DS籽粒、尤其是3,000-6,000HUT/100g DS籽粒、或4,000-20,000HUT/100g DS籽粒酸性蛋白酶、优选5,000-10,000HUT/100g、尤其是从6,000-16,500HUT/100g DS籽粒。

纤维素分解组合物

在另外的实施例中，本发明涉及与纤维素分解组合物的组合的使用。

示例性的纤维素分解组合物如在例如WO 2015/081139和PCT/US2015/034179中所述。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉的菌株。

该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII，内切葡聚糖酶，木聚糖酶或其两种、三种或四种的混合物。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-木糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及β-木糖苷酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶以及木聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶I以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶II以及木聚糖酶。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及CBHI。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。

该纤维素分解组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀蛋白以及植酸酶。

木聚糖酶(GH10和GH11多肽)

涉及具有木聚糖酶活性的GH10或GH11多肽的示例性实施例在下文披露，可替代地分别称为家族10木聚糖酶和家族11木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽，例如如在WO1994/021785中披露为SEQ ID NO:5且在此披露为SEQ ID NO:70的来自棘孢曲霉的木聚糖酶(Xyl II)。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:70具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽，例如如在J.Bacteriol.[细菌学杂志]2001,183(16):4823中披露为Swissprot:Q97TP5且在此披露为SEQ ID NO:71的来自丙酮丁醇梭杆菌的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:71具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽，例如如在WO2005/059084中披露为SEQ ID NO:8且在此披露为SEQ ID NO:72的来自棘孢曲霉的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:72具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在WO1996/23062中披露为SEQ ID NO:2且在此披露为SEQ ID NO:73的来自疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:73具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:305且在此披露为SEQ ID NO:74的来自嗜热网团菌(Dictyoglomusthermophilum)的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:74具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在WO2005/079585中披露为SEQ ID NO:2且在此披露为SEQ ID NO:75的来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:75具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在此披露为SEQ ID NO:78的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的木聚糖酶。在一个实施例中，该组合物包括具有木聚糖酶活性的GH10多肽，该多肽与SEQ ID NO:77的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:78具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在此披露为SEQ ID NO:84的来自北疆链霉菌的木聚糖酶。在一个实施例中，该组合物包括具有木聚糖酶活性的GH10多肽，该多肽与SEQ ID NO:83的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:84具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在WO 2014/019220中披露为SEQ ID NO:2且如在此披露为SEQ ID NO:88的称为FoxXyn6的来自尖孢镰孢菌的木聚糖酶。

在一个实施例中，该组合物包括具有木聚糖酶活性的GH10多肽，该多肽与SEQ IDNO:88具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽，例如如在WO 2014/020143中披露为SEQ ID NO:7且如在此披露为SEQ ID NO:89的称为AclXyn5的来自尖孢镰孢菌的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:89具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH11多肽是来自棒囊菌属(Cornyascus)(例如嗜热棒囊菌(Corynascus thermophilus))、来自柱顶孢霉属(Scytalidium)(例如嗜热柱顶孢霉(Scytalidium thermophilum))、来自青霉属(例如草酸青霉)(如WO 2013/075642中所披露)的木聚糖酶，或以下具有木聚糖酶活性的GH11多肽，该多肽与这些中的任一个具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包括如在WO 2013/019827中披露且在此披露为SEQ ID NO:104的来自雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)的木聚糖酶。在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:104具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽包括如在WO 2011/057083中披露且在此披露为SEQ ID NO:106的来自褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)的木聚糖酶。在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:106具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括木聚糖酶。在一个优选方面，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。

有用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO 2011/041405)、青霉属物种(WO 2010/126772)、土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/079210)以及褐孢长毛盘菌GH10(WO 2011/057083)。

在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如棘孢曲霉的菌株(例如在WO94/021785中描述为序列号5的一种(称为Xyl II))；或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO94/021785中的序列号5具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的该成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2006/078256中描述为Xyl III；或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO 2006/078256中的Xyl III具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的该成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽，例如如在此披露为SEQ ID NO:119的来自黑曲霉的木聚糖酶。

在一个实施例中，具有木聚糖酶活性的GH10多肽与SEQ ID NO:119具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61)多肽

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61)多肽。

在一方面，该AA9(GH61)多肽是具有纤维素分解增强活性的任何AA9多肽。AA9多肽的实例包括但不限于来自于以下的AA9多肽：土生梭孢壳霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、橙色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868、WO 2009/033071、WO 2012/027374、及WO 2012/068236)、烟曲霉(WO 2010/138754)、嗜松青霉(WO 2011/005867)、嗜热子嚢菌属物种(WO2011/039319)、青霉属物种(埃默森青霉(emersonii))(WO 2011/041397和WO 2012/000892)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)、棘孢曲霉(WO2012/125925)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/113340、WO 2012/129699、WO 2012/130964及WO 2012/129699)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、褐孢长毛盘菌(WO2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄篮状菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、雷塞氏篮状菌(WO 2012/101206)、以及嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(WO 2012/000892)、变色栓菌(Trametes versicolor)(WO 2012/092676和WO 2012/093149)、和嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)(WO 2012/129697和WO 2012/130950)；将其都通过引用以其全文结合在此。

在另一方面，具有纤维素分解增强活性的AA9多肽选自下组，该组由以下组成：(i)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，包括SEQ ID NO:102的成熟多肽或由其组成；(ii)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，包括与SEQ ID NO:102的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:101的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQID NO:101的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

在另一方面，具有纤维素分解增强活性的青霉属物种(埃默森青霉)AA9多肽或其同系物选自下组，该组由以下组成：(i)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，包括SEQ IDNO:102的成熟多肽或由其组成；(ii)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，包括与SEQ IDNO:102的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:101的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)具有纤维素分解增强活性的AA9多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:101的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株(例如在WO 2005/074656中描述为序列号2的一种)；或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2005/074656中的序列号2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的该成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于来自青霉属的菌株，例如埃默森青霉的菌株(例如在WO 2011/041397中披露的一种)，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2011/041397中的序列号2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的该成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于梭孢壳属，例如土生梭孢壳霉的菌株(例如在WO 2005/074647中披露为序列号7或序列号8的一种)；或来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株(例如在WO 2010/138754中描述为序列号2的一种)，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与这些中的任一个具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

内切葡聚糖酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括内切葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II。

可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利号5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等人,1986,Gene[基因]45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等人,1988,Gene[基因]63:11-22)；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等人,1988,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64:555-563，GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等人,1994,MolecularMicrobiology[分子微生物学]13:219-228，GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等人,1990,Nucleic Acids Research[核酸研究]18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等人,1995,Current Genetics[当代遗传学]27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等人,1990,Gene[基因]90:9-14)；尖孢镰孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II，例如来源于木霉属的一种，例如里氏木霉的菌株(例如在WO 2011/057140中描述为序列号22的一种)；或以下内切葡聚糖酶，该内切葡聚糖酶与WO 2011/057140中的序列号22具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽3相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的该成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一方面，该内切葡聚糖酶I选自下组，该组由以下组成：(i)内切葡聚糖酶I，包括SEQ ID NO:110的成熟多肽或由其组成；(ii)内切葡聚糖酶I，包括与SEQ ID NO:110的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)内切葡聚糖酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQID NO:109的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)内切葡聚糖酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:109的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

在另一方面，该内切葡聚糖酶II选自下组，该组由以下组成：(i)内切葡聚糖酶II，包括SEQ ID NO:112的成熟多肽或由其组成；(ii)内切葡聚糖酶II，包括与SEQ ID NO:112的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)内切葡聚糖酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:111的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)内切葡聚糖酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:111的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

β-木糖苷酶

有用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的β-木糖苷酶：粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)以及埃默森篮状菌(SwissProt登录号Q8X212)。

在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株(例如在WO2011/057140中描述为序列号206的一种)；或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与WO 2011/057140中的序列号206具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一方面，该蛋白酶与该成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQID NO:6的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株(例如在美国临时号61/526,833或PCT/US12/052163(实例16和17)中披露的一种)，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO2011/057140中的序列号58的成熟多肽，或与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的β-木糖苷酶。

在另一方面，该埃默森篮状菌β-木糖苷酶或其同系物选自下组，该组由以下组成：(i)β-木糖苷酶，包括SEQ ID NO:108的成熟多肽或由其组成；(ii)β-木糖苷酶，包括与SEQID NO:108的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)β-木糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:107的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)β-木糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:107的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

β-葡糖苷酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是来源于曲霉属的菌株的一种，例如来源于米曲霉，例如披露于WO 2002/095014中的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉，例如在WO 2005/047499中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如在PCT申请WO 2012/044915披露中，例如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2005/047499中描述的一种，或与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2012/044915中描述的一种，或与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的β-木糖苷酶。

在另一方面，该烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物选自下组，该组由以下组成：(i)β-葡糖苷酶，包括SEQ ID NO:100的成熟多肽或由其组成；(ii)β-葡糖苷酶，包括与SEQ IDNO:100的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)β-葡糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)β-葡糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

纤维二糖水解酶I

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140中的序列号2中的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶I来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的CBHI。

在一方面，该烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同系物选自下组，该组由以下组成：(i)纤维二糖水解酶I，包括SEQ ID NO:114的成熟多肽或由其组成；(ii)纤维二糖水解酶I，包括与SEQ ID NO:114的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)纤维二糖水解酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:113的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)纤维二糖水解酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:113的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

纤维二糖水解酶II

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉；或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、优选至少95％、例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性的CBHII。

在另一方面，该烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下组成：(i)纤维二糖水解酶II，包括SEQ ID NO:116的成熟多肽或由其组成；(ii)纤维二糖水解酶II，包括与SEQ ID NO:116的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)纤维二糖水解酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)纤维二糖水解酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:115的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

示例性纤维素分解组合物

具体而言，根据一个实施例，本发明涉及酶组合物的用途，这些酶组合物包括：(A)(i)纤维二糖水解酶I，(ii)纤维二糖水解酶II，以及(iii)至少一种选自下组的酶，该组由以下组成：β-葡糖苷酶或其变体、具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、GH10木聚糖酶和β-木糖苷酶；(B)(i)GH10木聚糖酶和(ii)β-木糖苷酶；或(C)(i)纤维二糖水解酶I，(ii)纤维二糖水解酶II，(iii)GH10木聚糖酶，和(iv)β-木糖苷酶；

其中该纤维二糖水解酶I选自下组，该组由以下组成：(i)纤维二糖水解酶I，包括SEQ ID NO:96的成熟多肽或由其组成；(ii)纤维二糖水解酶I，包括与SEQ ID NO:96的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)纤维二糖水解酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:95的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)纤维二糖水解酶I，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:95的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；

其中该纤维二糖水解酶II选自下组，该组由以下组成：(i)纤维二糖水解酶II，包括SEQ ID NO:98的成熟多肽或由其组成；(ii)纤维二糖水解酶II，包括与SEQ ID NO:98的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)纤维二糖水解酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:97的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)纤维二糖水解酶II，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQID NO:97的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；

其中该β-葡糖苷酶选自下组，该组由以下组成：(i)β-葡糖苷酶，包括SEQ ID NO:100的成熟多肽或由其组成；(ii)β-葡糖苷酶，包括与SEQ ID NO:100的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)β-葡糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)β-葡糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:99的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；

其中该木聚糖酶选自下组，该组由以下组成：(i)木聚糖酶，包括SEQ ID NO:104的成熟多肽或SEQ ID NO:106的成熟多肽或由其组成；(ii)木聚糖酶，包括与SEQ ID NO:104的成熟多肽或SEQ ID NO:106的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)木聚糖酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:103的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:105的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)木聚糖酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:103的成熟多肽编码序列或SEQ IDNO:105的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交；并且

其中该β-木糖苷酶选自下组，该组由以下组成：(i)β-木糖苷酶，包括SEQ ID NO:108的成熟多肽或由其组成；(ii)β-木糖苷酶，包括与SEQ ID NO:108的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列或由其组成；(iii)β-木糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NO:107的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列或由其组成；以及(iv)β-木糖苷酶，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下与SEQ ID NO:107的成熟多肽编码序列或其全长互补体杂交。

具体而言，根据一个实施例，本发明涉及酶组合物的用途，这些酶组合物包括：(A)(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种AA9多肽；(v)褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶；和(vi)埃默森篮状菌β-木糖苷酶；或其同系物；(B)(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶；和(iv)埃默森篮状菌β-木糖苷酶；或其同系物；或(C)(i)褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶；和(ii)埃默森篮状菌β-木糖苷酶；或其同系物。

在一个实施例中，在本发明的酶组合物中的纤维二糖水解酶I的量是该酶组合物的总蛋白质的5％至60％，例如该酶组合物的总蛋白质的7.5％至55％、10％至50％、12.5％至45％、15％至40％、17.5％至35％、和20％至30％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的纤维二糖水解酶II的量是该酶组合物的总蛋白质的2.0％至40％，例如该酶组合物的总蛋白质的3.0％至35％、4.0％至30％、5％至25％、6％至20％、7％至15％、和7.5％至12％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的β-葡糖苷酶的量是该酶组合物的总蛋白质的0％至30％，例如该酶组合物的总蛋白质的1％至27.5％、1.5％至25％、2％至22.5％、3％至20％、4％至19％、4.5％至18％、5％至17％、和6％至16％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的AA9多肽的量是该酶组合物的总蛋白质的0％至50％，例如该酶组合物的总蛋白质的2.5％至45％、5％至40％、7.5％至35％、10％至30％、12.5％至25％、和15％至25％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的木聚糖酶的量是该酶组合物的总蛋白质的0％至30％，例如该酶组合物的总蛋白质的0.5％至30％、1.0％至27.5％、1.5％至25％、2％至22.5％、2.5％至20％、3％至19％、3.5％至18％、和4％至17％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的β-木糖苷酶的量是该酶组合物的总蛋白质的0％至50％，例如该酶组合物的总蛋白质的0.5％至30％、1.0％至27.5％、1.5％至25％、2％至22.5％、2.5％至20％、3％至19％、3.5％至18％、和4％至17％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的内切葡聚糖酶I的量是该酶组合物的总蛋白质的0.5％至30％，例如该酶组合物的总蛋白质的1.0％至25％、2％至20％、4％至25％、5％至20％、16％至15％、和7％至12％。

在另一个实施例中，在本发明的酶组合物中的内切葡聚糖酶II的量是该酶组合物的总蛋白质的0.5％至30％，例如该酶组合物的总蛋白质的1.0％至25％、2％至20％、4％至25％、5％至20％、16％至15％、和7％至12％。

如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(例如酶)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素酶制剂，该制剂包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)以及橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)与含有烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499)和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256)和烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2011/057140)与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)和青霉属物种(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，该组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，该组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的序列号2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的序列号2)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素分解酶组合物，该组合物进一步包括在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的序列号2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉家族10木聚糖酶以及来源于里氏木霉RutC30的纤维素分解组合物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉家族10木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉RutC30。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶(WO2011/057083)和埃默森篮状菌β-木糖苷酶与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)和青霉属物种(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素酶制剂，该制剂包含褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶(WO 2011/057083)以及埃默森篮状菌β-木糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括雷塞氏篮状菌GH10木聚糖酶(WO2013/019827)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶(WO2011/057083)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物如PCT/US2015/034179中所述。

本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。

根据本发明，以下活性中的一种或多种的有效量可以在处理籽粒的过程中存在或添加：乙酰木聚糖酯酶、戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofurasidase)、木葡聚糖酶、植酸酶活性。

据信在将籽粒分为更细的颗粒后，该一种或多种酶可以更直接地作用于籽粒的细胞壁和蛋白质基质并且因此更有效。因而，在随后的步骤中，更加容易地将淀粉洗出。

酶量

可以按有效量添加酶，可以根据从业者和具体过程需要调节该有效量。通常，酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。在具体实施例中，该酶可以按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

材料与方法

酶

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A：来自胶囊青霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2006/125438)。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B：来自草酸青霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:24)。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C：来自褐红篮状菌的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:27)。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶D：来源于黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:117)。

GH62阿拉伯呋喃糖苷酶E：来源于黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQ ID NO:118)。

具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的酶单独使用或与例如以下任何一种组合使用：Celluclast、纤维素酶A、纤维素酶B、纤维素酶C、纤维素酶D、纤维素酶E、纤维素酶F、纤维素酶G、纤维素酶H、纤维素酶J、纤维素酶K、纤维素酶L、纤维素酶M、GH10木聚糖酶A、蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C和/或蛋白酶D。

Celluclast：来源于Celluclast 1.5L(可在诺维信公司购得的商业产品)的纤维素酶。

纤维素酶A：棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)与包含烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499)和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

纤维素酶B：包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶C：烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256)和烟曲霉β-木糖苷酶(WO2011/057140)与包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)和青霉属物种(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

纤维素酶D：棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)。

纤维素酶E：包含棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 94/021785)的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶F：包含烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256)和烟曲霉β-木糖苷酶(WO2011/057140)的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶G：一种纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物包括棘孢曲霉家族10木聚糖酶(WO 1994/021785)和来源于里氏木霉RutC30的纤维素分解酶组合物。

纤维素酶H：一种来源于里氏木霉RutC30的纤维素分解组合物。

纤维素酶J：褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶(WO 2011/057083)和埃默森篮状菌β-木糖苷酶与含有烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(WO 2012/044915)和青霉属物种(埃默森青霉)GH61多肽(WO 2011/041397)的里氏木霉纤维素酶制剂的共混物。

纤维素酶K：包含褐孢长毛盘菌GH10木聚糖酶(WO 2011/057083)和埃默森篮状菌β-木糖苷酶的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶L：含有SEQ ID NO:104的GH10木聚糖酶的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶M：含有SEQ ID NO:106的GH10木聚糖酶的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶N：含有SEQ ID NO:96的纤维二糖水解酶I、SEQ ID NO:98的纤维二糖水解酶II、SEQ ID NO:104的GH10木聚糖酶、和SEQ ID NO:108的β-木糖苷酶的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶P：含有SEQ ID NO:96的纤维二糖水解酶I、SEQ ID NO:98的纤维二糖水解酶II、SEQ ID NO:100的β-葡糖苷酶变体、和SEQ ID NO:102的AA9(GH61)的里氏木霉纤维素酶制剂。

纤维素酶Q：含有SEQ ID NO:96的纤维二糖水解酶I、SEQ ID NO:98的纤维二糖水解酶II、和SEQ ID NO:102的AA9(GH61)的里氏木霉纤维素酶制剂。

GH10木聚糖酶A：来源于黑曲霉的GH10木聚糖酶(SEQ ID NO:119)。

蛋白酶I：来自披露于WO 95/02044中的棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶。

蛋白酶A：米曲霉曲霉蛋白酶(aspergillopepsin)A，披露于Gene[基因],第125卷,第2期,第195–198页(1993年3月30日)。

蛋白酶B：来自橙色嗜热子囊菌(AP025)的具有如WO 2003/048353-A1中的SEQ IDNO:2的氨基酸1-177所示的成熟酸序列的金属蛋白酶。

蛋白酶C：产生于米曲霉中的可得自丹麦的诺维信公司的米黑根毛霉衍生的天冬氨酸内肽酶(Novoren^TM)。

蛋白酶D：来自披露于WO 2014/037438中的大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:6)。

方法

蛋白酶HUT活性的测定：

1HUT是在40℃和pH 4.7下经30分钟在275nm处的吸光度下将变性的血红蛋白等效物消化为吸光度为0.0084的1.10μg/ml酪氨酸于0.006N HCl中的溶液而形成水解物的酶量。在给定条件下，在0.5M乙酸盐缓冲液中通过酶消化变性的血红蛋白底物。将未消化的血红蛋白用三氯乙酸加以沉淀并且测量上清液中的水解物在275nm下的吸光度。

木糖测定

从2.5mg木糖/mL的储液(通过将0.125g木糖溶解于50mL去离子水中来制备)制备从0至125μg木糖/mL的木糖标准曲线。

测定原理。通过木糖变旋酶(XMR)使用来自麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland)的D-木糖测定试剂盒催化D-木糖的α-和β-异头形式的相互转化。在pH 7.5，在β-木糖脱氢酶(β-XDH)存在下，通过NAD+将β-D-木糖氧化成D-木糖酸。在该反应中形成的NADH的量采用D-木糖的量进行化学计量，并通过在340nm处的吸光度增加进行测量。

实例1.

该10-g纤维测定通常包括：在酶存在下，在与该方法相关的条件(pH3.5至4，温度约52℃)下并且经1至4hr之间的时间段，孵育从湿磨设备获得的湿纤维样品。孵育后，将纤维转移并压在筛(典型地为100微米或更小)上，在其中然后收集主要由分离的淀粉和面筋组成的滤过物。在筛上进行多次洗涤，并将洗涤液与初始滤液一起收集。然后将收集的滤液通过漏斗过滤器(具有0.45微米开口的玻璃过滤器)，以进一步将不溶性固体(淀粉和面筋)与剩余滤液(主要是溶解的固体)分离。将这些保留的不溶性固体洗涤，并且然后烘干至干燥。称取不溶性干物质，并且然后分析淀粉含量。

在pH 3.8下进行10-g纤维测定，以30ug EP/g玉米的剂量在52℃下孵育1小时。使用GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B+纤维素酶L、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B+纤维素酶M、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C+纤维素酶L、和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C+纤维素酶M的共混物。测量淀粉+面筋(干物质)从30ug/g玉米的剂量的玉米纤维的释放。

更具体地，根据示例性的10-g纤维测定，使用以下设备和试剂来分析按压的玉米纤维样品(源自湿磨设备)，其在使用前被冷冻储存并解冻，根据下表中的步骤：

●150-μm的开式筛和托盘(莱驰股份有限公司(Retsch GmbH))

●250ml带盖的锥形瓶

●150ml瓶

●玻璃微滤纸(沃特曼150mm直径)

●真空过滤装置

●小铝盘

●2000ml塑料烧杯

●600ml玻璃烧杯

●漏斗

●水分分析仪

●用于HPLC系统的玻璃小瓶和盖子

●HPLC系统

●0.45μm孔径聚丙烯针筒式滤器(沃特曼公司(Whatman))

●3ml塑料注射器

●烘箱(能够加热至105℃)

●冰浴

●分析天平

●橡胶刮刀

●0.4M HCl

●1M乙酸钠缓冲液(pH 4)

●1M乙酸

●1M pH 7乙酸钠

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实例2.

在pH 4.0下进行10-g纤维测定，以35ug EP/g玉米的剂量在52℃下孵育4小时，使用与蛋白酶D和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C进一步组合的纤维素酶K、纤维素酶L或纤维素酶N的共混物。共混物由以下组成：10％(w/w)的蛋白酶D、10％(w/w)的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C和剩余80％(w/w)来自纤维素酶K/纤维素酶L/纤维素酶N。为了比较，包括仅含有纤维素酶K和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶C(无GH62)的共混物。测量淀粉+面筋(干物质)从以下指定剂量的玉米纤维的释放。

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实例3.

在pH 4.0下进行10-g纤维测定，以35ug EP/g玉米或50ug EP/g玉米70ug EP/g玉米的剂量在52℃下孵育4小时，使用与蛋白酶D和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B组合的纤维素酶L或纤维素酶N的共混物。共混物由以下组成：10％(w/w)的蛋白酶D、10％(w/w)的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B和剩余80％(w/w)来自纤维素酶L或纤维素酶N。为了比较，包括不含GH62的共混物。测量淀粉+面筋(干物质)从以下指定剂量的玉米纤维的释放。

实例4.

该10-g纤维测定通常包括：在酶存在下，在与该方法相关的条件(pH3.5至4，温度约52℃)下并且经1至4hr之间的时间段，孵育从湿磨设备获得的湿纤维样品。孵育后，将纤维转移并压在筛(典型地为100微米或更小)上，在其中然后收集主要由分离的淀粉和面筋组成的滤过物。在筛上进行多次洗涤，并将洗涤液与初始滤液一起收集。然后将收集的滤液通过漏斗过滤器(具有0.45微米开口的玻璃过滤器)，以进一步将不溶性固体(淀粉和面筋)与剩余滤液(主要是溶解的固体)分离。将这些保留的不溶性固体洗涤，并且然后烘干至干燥。称取不溶性干物质，并且然后分析淀粉含量。

在pH 4.0下进行10-g纤维测定，以35ug EP/g玉米的剂量在52℃下孵育4小时，使用纤维素酶N的共混物，包含或不包含GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B，以及包含或不包含蛋白酶D。共混物由以下组成：10％(w/w)的蛋白酶D(当包括时)、10％(w/w)的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B(当包括时)和剩余量(80％、90％、或100％(w/w))的纤维素酶N。测量淀粉+面筋(干物质)从玉米纤维的释放。

实例5.

在pH 3.8下进行10-g纤维测定，以35ug EP/g玉米的剂量在52℃下孵育1小时，使用与GH62阿拉伯呋喃糖苷酶D或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶E组合的包括Celluclast和GH10木聚糖酶A的共混物。共混物由以下组成：5％(w/w)的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶D或GH62阿拉伯呋喃糖苷酶E、15％(w/w)的GH10木聚糖酶A和剩余80％(w/w)来自Celluclast。为了比较，包括仅含有Celluclast和GH10木聚糖酶D(无GH62)的共混物。测量淀粉+面筋(干物质)从以下指定剂量的玉米纤维的释放。

因此，在Celluclast+GH10木聚糖酶A上添加GH62阿拉伯呋喃糖苷酶D和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶E可以显著提高玉米湿磨过程中淀粉+面筋的产量。

实例6.

在每天磨1400MT玉米的湿磨设备中进行全规模工业试验。该试验进行了几个月，可以大致分为酶前基线(基线1)、共混物1阶段、共混物1后基线(基线2)和共混物2阶段。下表1中给出了测试的酶和使用的相关剂量。在第三次碾磨步骤之后，将酶直接添加到纤维洗涤阶段。

表1

在该试验中使用的两种酶共混物之间的主要组成差异是添加GH62阿拉伯呋喃糖苷酶，并且在这两种共混物之间使用的木聚糖酶(家族GH10)来源生物体不同。

表1显示了这些共混物在试验过程中的剂量差异。与共混物2相比，共混物1在总酶蛋白中的剂量高4倍。下表2和3显示了在纤维组成和实际实现的产量两方面，与其基线相比在过程中添加酶的作用。在条件相对稳定的情况下，这些产量数据和纤维组成在两周的价值数据上取平均值，并且在纤维洗涤中的总停留时间始终在80-90分钟左右。

4x低剂量和更好性能的共混物2的组合强烈指向共混物中GH62的促进作用，如从纤维中淀粉含量的较高降低(10对比6个百分点的差异)中所判断的。两者都表现出纤维中的蛋白质和水分的相同的降低。至于实现的产量，共混物2的更好的性能再次表现为实现了更高的淀粉产量(相差约1个百分点的淀粉产量)。这些酶之间的面筋减少大致相同(与基线相差0.2到0.3个百分点，共混物2可能略好)。当将进来的玉米的蛋白质含量归一化时也显示了这一点(使用共混物2总回收似乎稍好一些)。

表2.纤维组成

表3.实现的产量/能量减少

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Claims (12)

1.一种用于处理玉米籽粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b) 碾磨这些浸泡的籽粒；和

c)在有效量的纤维素水解酶、GH62阿拉伯呋喃糖苷酶和GH10木聚糖酶的存在下处理这些浸泡的籽粒；

其中，在步骤b)之后进行步骤c)，所述步骤c)在纤维洗涤步骤过程中进行，

其中，所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于青霉属的菌株；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于篮状菌属的菌株；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于曲霉属的菌株；而且，

其中，所述的GH10木聚糖酶来源于篮状菌属的菌株；或者所述的GH10木聚糖酶来源于曲霉属的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在蛋白酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。

3.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在选自下组的酶的存在下处理这些浸泡的籽粒，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61、或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在内切葡聚糖酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将这些籽粒在水中浸泡2-10小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其中该浸泡在40ºC与60ºC之间的温度下进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中该浸泡在酸性pH下进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其中该浸泡在0.01%-1%之间的SO₂和/或NaHSO₃的存在下进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的成熟多肽是SEQID NO: 27的氨基酸1至309；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:117的氨基酸1至306；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO: 118的氨基酸1至306。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的GH10木聚糖酶的成熟多肽是SEQ ID NO:104的氨基酸21至405；或者所述的GH10木聚糖酶的成熟多肽是SEQ ID NO: 119的氨基酸1至300。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于胶囊青霉或草酸青霉的菌株；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于褐红篮状菌的菌株；或者所述的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶来源于黑曲霉的菌株。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的GH10木聚糖酶来源于雷塞氏篮状菌的菌株；或者所述的GH10木聚糖酶来源于黑曲霉的菌株。