CN103667078B - 一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用。本发明提供了一株胶囊青霉(Penicillium？capsulatum)，保藏编号为CGMCC？No.6020。本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。本发明还提供了该菌株的分离培养纯化方法，以及在筛选抗真菌药物中的应用。

Description

一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胶囊青霉及其分离培养方法与应用。

背景技术

青霉属大约包含300个种，多为腐生菌，存在于土壤中。该属菌种在食品工业和药品生产方面发挥重要作用。

在青霉菌中除了马尔尼菲青霉（Penicilliummarneffei）外，一般不引起人类疾病(参见文献HuY,ZhangJ,LiX,YangY,ZhangY,MaJ,XiL.Penicilliummarneffeiinfection:anemergingdiseaseinmainlandChina.Mycopathologia.2013Feb;175(1-2):57-67.)。

目前，尚无从人类内脏组织中分离得到非马尔尼菲青霉菌，也没有对于非马尔尼菲青霉菌是否致病等进行分子和药敏鉴定的研究。

发明内容

本发明的目的在于分离得到一株新的可致病的非马尔尼菲青霉菌，本发明的另一目的是提供该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。

本发明首次分离培养纯化一株新的可致人类真菌性肺炎的胶囊青霉（Penicilliumcapsulatum）菌株。

本发明的第一方面，是提供了一株胶囊青霉(Penicilliumcapsulatum)，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.6020。

该菌株是于2011年长征医院一名56岁女性肺部占位中分离所得，组织病理可见大量菌丝存在，真菌培养菌株经核糖体基因ITS测序证实为胶囊青霉。

本发明的胶囊青霉(Penicilliumcapsulatum)菌株LWQ2011，CGMCCNo.6020，属丝孢纲（hyphomycetes），青霉属（penicillium）。

1.形态特征：肺部占位用HE染色可见大量菌丝存在。

2.培养特征：组织在麦芽糖培养基（maltextractagar,MEA）25℃环境下培养7天可见灰绿色产孢菌落生成。MEA培养时，菌株在30℃和38℃环境下生长快于25℃。显微镜下可见单轮青霉分生孢子头，孢子光壁，椭圆形，大小3.5-4.5×2.5-3.0μm。

本发明对该菌株进行鉴定：采用胶囊青霉ITS1、5.8SrDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为：合成以下真菌通用引物

上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(如SEQIDNO:1所示)；

和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQIDNO:2所示)；

以基因组扩增，PCR反应体系50μL：10×PCRbuffer5μL，2.5mmol/LdNTP混合物8μL，10umol/L引物各1μl，模板2μl，Taq酶0.5μl，无菌水32.5μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

所得扩增产物由ABI3730DNA自动测序仪双向测序两次。序列如SEQIDNO:3所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），比对结果：与国外环境中分离的胶囊青霉菌株（NRRL2056）同源性99%。

本发明的第二方面，是提供了该菌株的培养方法。

挑取少许培养基上青霉菌落，将其分别接种于麦芽浸出培养基(MEA；Oxoid,Basingstoke,UK)、查氏培养基(Czapekyeastextractagar,CYA)培养基和酵母浸出膏葡萄糖琼脂培养基(yeastextractsucroseagar,YES)上，置于25℃、30℃和37℃温箱孵育，24小时后可见30℃、37℃孵育的培养基上有菌落长出，72小时后可见25℃孵育的培养基有菌落长出。菌落大体图见图2，培养微观图见图3。

所述的MEA培养基的组分和配方如下：麦芽浸出物10g、葡萄糖4g、琼脂15g，双蒸水1000ml，加200mg氯霉素，调节pH至6-7，121℃15分钟灭菌后备用；

所述的CYA培养基的组分和配方如下：磷酸氢二钾1g、查氏浓缩液10ml、酵母浸出物5g、蔗糖30g、琼脂15g、双蒸水1000ml，调节pH至6-7，121℃15分钟灭菌后备用（查氏浓缩液配方：硝酸钠30g、氯化钾5g、硫酸镁5g、硫酸亚铁0.1g、硫酸锌0.1g、硫酸铜0.05g，双蒸水1000ml溶解后备用）。

所述YES培养基的组分和配方如下：酵母浸出物4g、蔗糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂15g，双蒸水1000ml溶解后调节pH至6-7，121℃，灭菌15分钟备用。

本发明的第三方面，是提供了该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。该抗真菌药物为抗人类侵袭性真菌病所用药物。

本发明的菌株在筛选抗真菌药物中的应用，特别是该菌株在伏立康唑（voriconazole）、伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)、酮康唑(ketoconazole)、氟胞嘧啶（flucytosine）、两性霉素B(amphotericinB)等抗真菌药筛选中的应用。

参照M38-A2方法（ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute.ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofYeasts.ApprovedstandardM38-A2.），对该胶囊青霉对两性霉素B、酮康唑、、伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑的药物敏感性进行测定，其MIC值分别为0.5、16、0.0625、0.5、>64和0.25mg/L。药敏结果显示该菌对氟胞嘧啶和氟康唑耐药。

该菌株可进一步用于筛选新的抗真菌药物。

附图说明

图1：肺部真菌球HE染色；

图2不同温度下青霉生长情况，其中A为25℃；B为37℃；

图3：菌丝及孢子形态（放大400倍）。

微生物保藏信息：胶囊青霉（penicilliumcapsulatum），已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.6020。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：

本发明分离得到一株胶囊青霉（penicilliumcapsulatum）菌株CGMCCNo.6020。

一、胶囊青霉（penicilliumcapsulatum）菌株CGMCCNo.6020

本发明的菌株LWQ2011，CGMCCNo.6020由上海长征医院皮肤科于患者肺空洞内真菌球内分离所得；属子囊菌门（Ascomycota），散囊菌目（Eurotiales），发菌科（Trichocomaceae），青霉属（Penicillium）。

于2012年4月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏登记号为CGMCCNO.6020。

1.组织病理特征：

肺部真菌球HE染色可见大量菌丝组成，菌丝分隔，如图1所示。

2.培养特征：

该菌可在麦芽浸出培养基(MEA；Oxoid,Basingstoke,UK)、查氏培养基(Czapekyeastextractagar,CYA)培养基和酵母浸出膏葡萄糖琼脂培养基(yeastextractsucroseagar,YES)，25℃、30℃和37℃下生长（不同温度生长情况如图2），在37℃和30℃生长速度快于25℃时。

培养微观图如图3所示，可见青霉特有的帚状枝并见顶端产孢。

二、真菌鉴定技术

采用胶囊青霉ITS1、5.8SrDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为：合成以下真菌通用引物

本发明对该菌株进行鉴定：采用胶囊青霉ITS1、5.8SrDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为：合成以下真菌通用引物

上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(如SEQIDNO:1所示)；

和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQIDNO:2所示)；

以基因组扩增，PCR反应体系50μL：10×PCRbuffer5μL，2.5mmol/LdNTP混合物8μL，10umol/L引物各1μl，模板2μl，Taq酶0.5μl，无菌水32.5μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，70℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

所得扩增产物由ABI3730DNA自动测序仪双向测序两次。序列为cccgccgaggacccctgggaactcgtgtctgaagagtgccgtctgagcgagaagcgaaatcagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggccgccgtccccccgcctgcccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctccgcaggcccggccggtcgcccgccggcgcacctcttcctctctccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattgccccagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggcccccccggggtccgcgttgtaatttgcagaggatgcttcgggagcggcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtctgggacggggtgcccgcgcccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatattggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggcactcgtgcccggtgaacttccccgcgggcgggccagcgtcggttcggcggccggtcaaaggccctcggaatgtaacgccccccggggcgtcttatagccgagggtgccatgcggccagcccggaccgaggaacgcgctccggcacggacgctggcgtaatggtcgtaagcgacc(如SEQIDNO:3所示)。

将测序结果于NCBI网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对，比对结果：与胶囊青霉菌株（NRRL2056）同源性99%。

实施例2：真菌药敏实验

参照M38-A2方法（ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute.ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofYeasts.ApprovedstandardM38-A2.），对该胶囊青霉对两性霉素b、氟胞嘧啶、酮康唑、、伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑的药物敏感性进行测定，其MIC值分别为0.5、16、0.0625、0.5、>64和0.25mg/L。药敏结果显示该菌对氟胞嘧啶和氟康唑耐药。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一株胶囊青霉(Penicilliumcapsulatum)，保藏编号为CGMCCNo.6020。

2.一种如权利要求1所述的胶囊青霉的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

挑取少许培养基上胶囊青霉菌落，接种于麦芽浸出培养基、查氏培养基或酵母浸出膏葡萄糖琼脂培养基上，置于25℃、30℃或37℃温箱孵育，24小时后可见30℃和37℃孵育的培养基上有菌落长出，72小时后可见25℃孵育的培养基有菌落长出。

3.一种如权利要求1所述的胶囊青霉在筛选抗真菌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的胶囊青霉在筛选抗真菌药物中的应用，该抗真菌药物为抗人类侵袭性真菌病所用药物。

5.根据权利要求3所述的胶囊青霉在筛选抗真菌药物中的应用，该抗真菌药物为两性霉素B、酮康唑、伏立康唑、氟康唑或伊曲康唑。