CN105229144A - 通过组合的遗传工程和化学工程经由正向编程产生肝细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于由多种细胞来源特别是多潜能干细胞产生肝细胞的方法，所述方法包括遗传手段和化学手段两者。

Description

通过组合的遗传工程和化学工程经由正向编程产生肝细胞

本发明要求于2013年2月22日提交的美国临时申请号61/768,301的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明总体上涉及分子生物学、干细胞和分化细胞领域。更具体地，本发明涉及体细胞和未分化细胞向特定细胞谱系，特别是肝细胞谱系细胞的编程。

2.相关技术的说明

除其在移植疗法中治疗多种肝病的用途之外，人肝细胞还由于其在解毒药物或其他生物异源物质(xenobiotic)以及内源底物中的重要功能而在药物毒性筛选和开发方面具有高需求。然而，当在体外培养时，人原代肝细胞迅速丧失其功能。此外，人原代肝细胞的药物代谢能力在不同个体间表现出显著差异。能够不受限地供应患者特异性的功能肝细胞将极大地有利于药物开发和肝细胞移植的最终临床应用。因此，需要产生治疗和研究用途中的肝谱系(lineage)细胞，特别是人肝细胞。

发明内容

本发明通过正向编程(forwardprogramming)提供不受限供应的患者特异性肝细胞克服了本领域中在提供肝细胞方面的主要缺陷。在第一个实施方案中，提供了通过对多种细胞类型(包括体细胞或干细胞)进行遗传和化学正向编程来提供肝细胞的方法。正向编程为肝细胞可包括提高某些肝细胞编程因子基因的表达水平，并且在一个方面，可进一步包括使细胞与某些小分子接触以引发非肝细胞向肝细胞的正向编程。

在另一个实施方案中，还可提供将非肝细胞直接编程为肝细胞的方法(例如多潜能干细胞的分化)，其包括提高能够引起正向编程为肝谱系或肝细胞的某些肝细胞编程因子基因的表达，由此将所述细胞直接编程为肝细胞。

本文使用的“正向编程”指这样的过程，其基本不需要使用适合每个中间的细胞阶段的培养条件通过所述中间的细胞阶段来培养细胞，和/或任选地，在起始细胞来源与期望的终细胞产物(例如肝细胞)之间的不同时间点期间无需添加不同的生长因子，如图1的上面部分中所示例的。与已丧失多能性或多潜能性的分化体细胞相对，正向编程可包括通过人工提高多能或多潜能细胞中一种或更多种特定的谱系决定基因的表达来编程多能或多潜能细胞。例如，正向编程可描述将胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)或诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)编程为肝细胞样细胞或其他分化前体或体细胞的过程。在某些其他方面，正向编程可指“转分化”，其中分化的细胞被直接编程为另一种分化的细胞类型而不通过中间的多潜能阶段。

另一方面，图1的下面部分证明了逐步分化过程中存在的不同发育阶段和在该过程中不同时间点添加不同生长因子的需要，这比本发明某些方面中所述的方法花费更多的劳力、时间和费用。因此，在本发明的某些方面，正向编程法的有利之处在于避免了在编程或分化的不同阶段添加不同生长因子的需要。例如，培养待编程细胞或其后代细胞的培养基可基本不含进行性分化(即，下文所定义的定向分化)沿不同发育阶段常规所需的一种或更多种转化生长因子(例如，激活素A)、成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态发生蛋白(BMP)。

适合进行肝正向编程的细胞来源可包括任意干细胞或非肝细胞体细胞。例如，干细胞可以是多潜能干细胞或任意非多潜能干细胞。多潜能干细胞可以是诱导性多潜能干细胞、胚胎干细胞或通过核转移或细胞融合获得的多潜能干细胞。干细胞还可包括多能干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞还可包括胎儿干细胞或成体干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞和皮肤干细胞。在某些方面，干细胞可分离自脐带、胎盘、羊水、绒毛膜绒毛、胚泡、骨髓、脂肪组织、脑、外周血、脐带血、月经血、血管、骨骼肌、皮肤和肝。

在另一些方面，可通过对非肝细胞体细胞进行转分化来产生肝细胞。用于肝谱系编程的体细胞可以是形成生物体的不同于肝细胞的任意细胞。在一些实施方案中，体细胞是人体细胞，例如皮肤成纤维细胞、脂肪组织来源细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在一个具体方面，体细胞是无限增殖化的以提供不受限供应的细胞，例如通过提高端粒酶逆转录酶(TERT)的水平。这可通过从内源基因提高TERT的转录或者通过经由任何基因递送方法或系统引入转基因来实现。

肝细胞编程因子基因包括单独地或组合地直接将肝命运赋予非肝细胞的任意基因，特别是当在细胞中表达时对肝分化或肝功能重要转录因子基因或基因。例如，在本发明的某些方面，可使用表1中所列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个示例性基因及其同种型或变体。这些基因中的很多基因具有不同的同种型，这些同种型可具有类似的功能并因此被考虑用在本发明的某些方面中。在本发明的一个实施方案中，可使用编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A、MAFB和TBX3的肝细胞编程因子基因。

在某些方面，提供了通过对多潜能干细胞进行正向编程来提供肝细胞的方法，其包括如下提供肝细胞：在提高能够引起干细胞(例如，多潜能干细胞)正向编程为肝细胞的某些肝细胞编程因子基因的表达水平的条件下培养多潜能干细胞(例如，通过转染所述干细胞)，由此引起多潜能干细胞直接分化为肝细胞。

技术人员将理解，用于在将被编程为肝细胞之细胞中提高肝细胞编程因子基因表达的方法可包括本领域中已知的任意方法，例如通过诱导之前被引入该细胞中的一种或更多种表达盒的表达，或者通过向该细胞引入核酸(例如DNA或RNA)、多肽或小分子。提高某些内源但在转录上被阻遏之编程因子基因的表达还可通过调控上游转录因子表达或表观遗传调节来逆转对这些编程因子基因表达的沉默或抑制作用。

在一个方面，用于肝谱系编程的细胞可包含至少一种外源表达盒，其中所述表达盒包含数目足以引起非肝细胞正向编程或转分化为肝细胞的肝细胞编程因子基因。外源表达盒可包含用于肝细胞编程因子基因的诱导型表达的外部诱导型转录调控元件，例如含有四环素应答元件的诱导型启动子。

在另一个方面，用于肝细胞编程的一种或更多种外源表达盒可包含在基因递送系统中。基因递送系统的非限制实例可包括转座子系统、病毒基因递送系统、附加型基因(episomalgene)递送系统或同源重组系统。病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。附加型基因递送系统可以是质粒、基于EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)的附加型载体、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿猴病毒40(SV40)的附加型载体、基于牛乳头状瘤病毒(BPV)的载体等。同源重组系统可靶向基因组安全港基因座(safeharborlocus)，例如Rosa26和AAVS1基因座，并且可借助核酸酶(例如锌指核酸酶、TALEN和大范围核酸酶)来改善效率。

在另一个方面，可将用于肝谱系编程的细胞与足以引起干细胞被正向编程为肝细胞的量的肝细胞编程因子接触。肝细胞编程因子可包括肝细胞因子基因的基因产物。所述基因产物可以是肝细胞编程因子基因的多肽或RNA转录本。在另一个方面，肝细胞编程因子可包含一个或更多个有利于其细胞内进入和/或细胞核进入的蛋白质转导结构域。这样的蛋白质转导结构域在本领域中是公知的，例如HIVTAT蛋白质转导结构域、HSVVP22蛋白质转导结构域、果蝇触角足同源结构域(DrosophilaAntennapediahomeodomain)或其变体。

在某个实施方案中，可使包含表达水平提高的某些肝细胞编程因子基因的干细胞另外与MEK抑制剂(例如，PD0325901)和/或ALK5抑制剂(例如，A83-01)接触，同时诱导所述基因的表达。

在另一个实施方案中，在肝细胞编程因子基因的表达提高和/或与MEK抑制剂和ALK5抑制剂接触后，使干细胞与环AMP类似物(例如，8-Br-cAMP)接触。

所述方法还可包括对由正向编程或转分化提供的肝细胞进行选择或富集步骤。为了有助于选择或富集，用于编程的细胞(例如多潜能干细胞或其后代细胞)可包含含有报道基因的可选择或可筛选报道蛋白表达盒(reporterexpressioncassette)。报道蛋白表达盒可包含与报道基因有效连接的成熟的肝细胞特异性转录调控元件。肝细胞特异性转录调控元件的非限制性实例包括以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、载脂蛋白A-I或apoE。成熟的肝细胞特异性转录调控元件可包括以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、脱唾液酸糖蛋白受体、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、CYP3A4、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)、葡萄糖-6-磷酸酶、酪氨酸转氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和色氨酸2，3-双加氧酶。

在某一方面，所述方法还可包括将干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。在一些方面，可将悬浮培养物维持在转瓶(spinnerflask)中。可以以约40rpm至70rpm运行转瓶。在一些方面，可将悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。

本发明某些方面中所提供的肝细胞的特征包括，但不限于以下的一个或更多个：(i)表达一种或更多种肝细胞标志物，所述肝细胞标志物包括葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、醇脱氢酶1、I型精氨酸酶、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、肝特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或其组合；(ii)肝特异性酶(例如葡萄糖-6-磷酸酶或CYP3A4)，副产物(例如胆汁和尿素)的产生或胆汁分泌，或者生物异源物质解毒作用的活性；(iii)肝细胞的形态特征；或(iv)免疫缺陷对象中的体内肝植入。

对于肝细胞的选择或富集，还可提供鉴定包含肝报道基因的表达或本文中所述的一个或更多个肝细胞特征的肝细胞的步骤。

在一些具体方面，本文中提供的肝细胞可以是成熟肝细胞。可如下选择或富集成熟肝细胞：使用包含与报道基因有效连接的成熟肝细胞特异性转录调控元件的可筛选或可选择报道蛋白表达盒，或使用针对肝细胞特异性细胞表面抗原(例如ASGR)的抗体进行磁性细胞分选，或评估如本领域已知的成熟肝细胞特异性特征。例如，可通过以下的一项或更多项来鉴定成熟肝细胞：存在肝细胞生长因子受体、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、脱唾液酸糖蛋白受体、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、CYP3A4、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)、葡萄糖-6-磷酸酶、酪氨酸转氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和色氨酸2，3-双加氧酶，和不存在细胞内胰腺相关胰岛素或胰岛素原的产生。在另一些方面，可通过人工提高表1中所详述之基因的表达来将本文中提供的肝细胞样细胞进一步正向编程为成熟的肝细胞。

对于更多成熟肝细胞的产生，可在包含一种或更多种生长因子(例如制瘤素M，OSM)，或者还包含肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养起始细胞群。所述培养可在实现肝细胞编程因子的表达之前、期间或之后进行。肝细胞可在表达提高或者在存在或不存在生长因子的情况下培养后至少、约或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天(或可来源于从中的任意范围)提供。

在另一个实施方案中，可通过本文中所示的任意方法来产生肝细胞。在某些方面，还可提供包含通过本文所述的方法提供的肝细胞的组织工程化肝。在另一个方面，可提供基于肝细胞的包含肝细胞的生物人工肝(bio-artificialliver，BAL)。

在某些方面，本发明提供了包含一种或更多种含有一种或更多种肝细胞编程因子基因(例如，表1中的基因及其同种型或变体)的外源表达盒的细胞。外源表达盒可包含两种、三种、四种、五种或六种肝细胞编程因子基因。例如，外源表达盒可包含FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A、MAFB和TBX3的编码序列。

对于肝细胞编程因子基因的诱导型表达，至少一种外源表达盒可包含外部诱导型转录调控元件。在一些具体方面，可提供包含一种或更多种外源表达盒的细胞，其中一种或更多种外源表达盒包含FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A、MAFB和TBX3的编码序列，并且至少一种外源表达盒与外部诱导型转录调控元件有效连接。

外源表达盒可包含在一种或更多种基因递送系统中。基因递送系统可以是转座子系统；病毒基因递送系统；附加型基因递送系统；或同源重组系统，例如利用锌指核酸酶、转录激活因子样效应蛋白(TALE)核酸酶或大范围核酸酶等。细胞还可包含含有与报道基因有效连接的肝细胞特异性启动子的可筛选或可选择报道蛋白表达盒。肝细胞特异性转录调控元件可以是以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、载脂蛋白A-I或apoE，或者本领域中已知的任何其他肝细胞特异性启动子或增强子。

在一个方面，细胞可以是干细胞或其后代细胞。干细胞可以是多潜能干细胞或任何非多潜能干细胞。多潜能干细胞可以是诱导性多潜能干细胞、胚胎干细胞或者通过核转移或细胞融合获得的多潜能干细胞。干细胞还可以是多能干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞还可以是胎儿干细胞或成体干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞或皮肤干细胞。在另一个方面，细胞可以是体细胞，无论其是否无限增殖化。细胞还可以是肝细胞，更特别地，是成熟肝细胞或未成熟肝细胞(例如，肝细胞样细胞)。

还可提供包含含有两种细胞类型(即，肝细胞和仅响应编程培养条件改变而由初始细胞分化的细胞)并且基本不含其他中间细胞类型的细胞群的组合物。例如，这样的细胞群可具有这样的两种细胞类型，其包括非肝谱系细胞和肝细胞但基本不含肝分化过程的中间发育阶段中的其他细胞类型。特别地，可提供包含由非肝谱系细胞和肝细胞组成的细胞群的组合物。特别地，非肝谱系细胞可以特别是由多潜能干细胞(例如诱导性多潜能干细胞)分化的上皮细胞。肝细胞可以是细胞群的至少、约或至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％(或任意中间范围)，或可来源于其中的任意范围。

还可提供包含肝细胞的细胞群，其中至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％(或任意中间范围)的肝细胞包含一种或更多种含有至少编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A、MAFB和TBX3之序列的表达盒。

可提供由干细胞产生肝细胞的方法，其包括(i)用包含至少编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A、MAFB和TBX3的肝细胞编程因子基因的至少一种外源诱导型表达盒转染所述干细胞；(ii)在第一时间段内诱导所述表达盒表达；(iii)在第一时间段内使所述干细胞与MEK抑制剂(例如，PD0325901)和/或ALK5抑制剂(例如A83-01)接触；并且(iv)在第二时间段内使所述干细胞与环AMP类似物(例如，8-Br-cAMP)接触。在某些方面，所述第一和第二时间段是连续且不重叠的。在某一方面，所述方法还可包括将干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。在一些方面，可将悬浮培养物维持在转瓶中。可以以约40rpm至70rpm运行转瓶。在一些方面，可将悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。

本文中提供的肝细胞可用于本领域中当前已知的有关肝细胞的任何方法和应用。例如，可提供评估化合物的方法，其包括测定所述化合物对本文中提供的肝细胞或组织工程化肝的药理学或毒理学特性。还可提供评估化合物对肝细胞作用的方法，其包括：a)使本文中提供的肝细胞与所述化合物接触；以及b)测定所述化合物对肝细胞的作用。

在另一个方面，还可提供用于治疗患有肝功能障碍或处于肝功能障碍风险之中的对象的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的本文中提供的肝细胞或含有肝细胞的细胞群。

对于本文中所述的任何其他方法或组合物，可采用在本发明的方法和/或组合物背景下所讨论的实施方案。因此，涉及一种方法或组合物的一个实施方案也可应用于本发明的其他方法和组合物。

本文中使用的术语“编码”在提及核酸时用于使本领域技术人员容易理解本发明，然而这些术语可分别与“包含”互换使用。

说明书中使用的没有数量词修饰的名词可指一个/种或更多个/种。当在权利要求书中使用时，在与词语“包含/包括/含有”联合使用的情况下，没有数量词修饰的名词可指一个/种或一个/种以上。

除非明确指出仅指替代方案或者替代方案互相排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。本文中使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。

贯穿本申请通篇，术语“约/大约”用于指数值包括装置、用来测定所述数值之方法的误差的固有变异，或者研究对象间存在的变异。

本发明的其他目的、特征和优点将由下文的详细描述而变得明显。然而，应当理解详细描述和具体实施例尽管指出本发明的一些优选实施方案，但仅作为举例说明给出，因为根据该详细描述，本发明精神和范围内的多种改变和修改对本领域技术人员而言将是明显的。

附图简述

下列附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中所提出的具体实施方案的详细描述将更好地理解本发明。

图1：用于由人ESC/iPSC进行肝细胞分化的可替选方法。

图2：用于肝细胞分化的人ESC/iPSC报道/诱导型(R/I)系的建立。

图3：人H1ESCR/I系中Tet-On诱导型基因表达的确认。图3A：双载体PiggyBac稳定基因表达系统。Ptight：rtTET响应的诱导型启动子；pEF：真核延伸因子1α启动子；hPBase：具有被优化用于在人细胞中表达之密码子的PiggyBac转座酶的编码区。图3B：人ESCR/I系中的EGFP诱导。图3C：对用或不用多西环素(1μg/ml)诱导4天后的人ESCR/I系中EGFP表达的流式细胞术分析。灰线：未经EGFP载体转染的人ESCR/I系(阴性对照)。黑线：在用或不用多西环素诱导4天后具有稳定的PiggyBac转座子整合的人ESCR/I系。

图4：由人ESC/iPSC进行肝细胞正向编程的示意图。将参与正常哺乳动物发育期间的肝分化的基因或者在成体肝细胞中富集的基因克隆到在Ptight启动子(表1)控制之下的PiggyBac载体中(图3)。

图5：用于成功肝编程的转基因和共表达载体。F：FOXA2；G：GATA4；HH：HHEX；H1A：HNF1A；M：MAFB；T：TBX3；GFH：使用双向Ptight启动子共表达FOXA2、GATA4和HHEX，其中FOXA2和HHEX通过编码F2A肽的短序列相连；H1AM：使用双向Ptight启动子共表达HNF1A和MAFB。GFH和H1AM共表达载体两者具有BSD作为选择标志物，而所有的单基因表达载体具有Neo作为选择标志物。

图6：MEK抑制剂PD0325901(P)和TGFβ激酶/激活素受体样激酶(ALK5)抑制剂A83-01(A)对肝编程效率的作用。

图7：多西环素诱导持续时间对肝编程的作用。图7A：ALB表达的流式细胞术分析。图7B：在进行不同天数的转基因诱导之后，铺板后第12天的肝编程培养物的明视场图像。

图8：环AMP类似物8-Br-cAMP对肝编程的作用。

图9：初始铺板细胞密度对肝编程的作用。

图10：肝编程期间的ALB表达动力学。

图11：3D培养有利于肝细胞的存活和成熟。(A)经编程肝细胞在补充有胰岛素(0.5μg/ml)和地塞米松(0.1μM)的HMM中进行4天2D培养之前(第11天)和之后(第15天)的形态。(B)在编程的第7天制备的3D球状体的明视场(第9、11和19天)图像。(C)第11天3D球状体中的ALB表达的流式细胞术分析。

说明性实施方案的描述

本发明通过提供用于肝细胞产生的方法和组合物克服了当前技术中的若干主要问题，所述肝细胞产生使用遗传和化学手段通过正向编程来进行。与之前使用逐步分化方案的方法相比，这些方法的某些方面提高了非肝细胞中肝细胞编程转录因子的水平以通过正向编程来提供肝细胞。除提高肝细胞编程转录因子的水平之外，还可使非肝细胞与MEK抑制剂和ALK5抑制剂接触以进一步增强肝细胞产生。这可通过使正经历正向编程的细胞与环AMP类似物接触而进一步增强。本发明方法的某些方面是时间和成本更为有效的并且可使得由可再生来源(干细胞)能够制造用于治疗的肝细胞。本发明的另一些实施方案和优点在下文进行描述。

I.定义

“编程”是这样的过程，与细胞在相同条件下但不进行编程将具有的后代相比，所述过程改变细胞以形成至少一种新细胞类型的后代，不管是在培养物中还是在体内。这意味着，在充分增殖之后，具有新细胞类型之表型特征的后代的可测量比例(如果在编程前基本上没有这样的后代可以形成的话)；或者，具有新细胞类型之特征的比例可测量地大于编程前。这一过程包括分化、去分化和转分化。“分化”是这样的过程，通过所述过程较不特化的细胞变成更特化的细胞类型。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分分化细胞或终末分化细胞恢复至早期的发育阶段，例如多潜能性或多能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化成另一种分化细胞类型的过程。在某些条件下，具有新细胞类型之特征的后代的比例可以是至少约1％、5％、25％或更大(以优选性逐渐增加的顺序)。

术语“外源”当用于涉及细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸时指已通过人工手段引入所述细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸，或者当涉及细胞时指被分离并随后通过人工手段引入其他细胞或生物体中的细胞。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者其可以是所述生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或更多个另外的拷贝。外源细胞可来自不同的生物体，或者其可来自相同的生物体。作为一个非限制性实例，外源核酸位于不同于天然细胞中染色体位置的染色体位置，或者其侧翼是不同于自然界中所发现的核酸序列的核酸序列。

术语“药物”指这样的分子，其包括，但不限于改变与疾病相关的表型或者是用于改变疾病相关表型之候选物的小分子、核酸和蛋白质或其组合。

“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包含一种或更多种指导在一种或更多种期望的细胞类型、组织或器官中进行基因表达的转录控制元件(例如，启动子、增强子或其结构功能等同元件)。还可包含另外的元件，例如转录终止信号。

“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“载剂(vehicle)”)指包含待被递送至宿主细胞(不管是体外还是体内)的多核苷酸的大分子或分子复合体。

“质粒”(常见的载体类型)是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在某些情况下，质粒为环状并且为双链。

“复制的起点”(“ori”)或“复制起点”是当存在于细胞的质粒中时能够将所连接的序列维持在质粒中的DNA序列(例如，在嗜淋巴细胞孢疹病毒中)，和/或位于或接近DNA合成起始处的位点。EBV的ori包含FR序列(30bp重复的20个不完全拷贝)和优选的DS序列，然而EBV中的其他位点与EBNA-1结合，例如，Rep＊序列可替换DS作为复制的起点(Kirshmaier和Sugden，1998)。因此，EBV的复制起点包含FR、DS或Rep＊序列或由其衍生之经由核酸修饰或合成组合的任意功能等同序列。例如，本发明还可使用EBV的遗传工程化复制起点，例如通过插入或突变单个元件，如Lindner等(2008)中所具体描述的。

术语“对应于”在本文中使用时意指多核苷酸序列与参照多核苷酸序列的全部或一部分同源(即，相同，不是严格地进化上相关)，或者多肽序列与参照多肽序列相同。相比之下，术语“与…互补”在本文中使用时意指互补序列与参照多核苷酸序列的全部或一部分同源。举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参照序列“TATAC”，并且与参照序列“GTATA”互补。

“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当被置于合适调控序列的控制之下时在体外或体内被转录并且任选地还被翻译成基因产物(例如多肽)的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链(即，有义链)或双链。编码区的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。基因可包括，但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及合成的DNA序列。转录终止序列通常将位于基因序列的3’。

术语“控制元件”总体指启动子区、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制的起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子、剪接点等，其共同提供了接受者细胞中编码序列的复制、转录、转录后加工和翻译。不是所有的这些控制元件都需要总是存在，只要所选择的编码序列在合适的宿主细胞中能够被复制、转录和翻译即可。

术语“启动子”在本文中以其常规含义使用，指包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的基因。

“增强子”意指，相对于在不存在增强子结构域的情况下由启动子所引起的转录活性，当位于邻近启动子时，赋予提高的转录活性的核酸序列。

当与核酸分子有关时，“有效连接”意指将两种或更多种核酸分子(例如，待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。当与肽和/或多肽分子有关时，“有效连接”意指将两种或更多种肽和/或多肽分子以产生单多肽链(即具有融合的每种肽和/或多肽组分的至少一种特性的融合多肽)的方式连接。优选地，融合多肽是嵌合的，即由异源分子构成。

“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽之间的同一性百分比。可通过本领域中已知的技术来确定一条序列与另一条序列之间的一致性。例如，可借助比对序列信息并使用容易获得的计算机程序通过直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。或者，可如下确定同源性：在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，之后用单链特异性核酸酶消化并对经消化的片段进行尺寸测定。当至少约80％，优选至少约90％，并且最优选至少约95％的核苷酸或氨基酸分别与限定长度的分子匹配时，两条DNA序列或两条多肽序列彼此“基本同源”，如使用上述方法所确定。

术语“细胞”在本文中以其在本领域中的最广泛含义使用并且指这样的活体，其是多细胞生物体组织的结构单元、被将其与外部隔开的膜结构包围、具有自我复制的能力并且具有遗传信息和使其表达的机制。本文中使用的细胞可以是天然存在细胞或人工修饰细胞(例如，融合细胞、经遗传修饰的细胞等)。

本文中使用的术语“干细胞”指能够产生至少一种类型的更特化细胞的细胞。干细胞具有自我更新的能力，即具有经历无数细胞分裂周期而仍维持未分化状态的能力，并且具有效力，即分化成特化细胞类型的能力。通常来说，干细胞可再生损伤的组织。本文中的干细胞可以是，但不限于，胚胎干(ES)细胞、诱导性多潜能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞(somaticstemcell))。可具有上述能力的任何人工产生的细胞(例如，本文中使用的融合细胞、经重编程细胞等)可以是干细胞。

“胚胎干(ES)细胞”是由早期胚胎衍生的多潜能干细胞。ES细胞最早建立于1981年，其自1989年以来还一直被应用于敲除小鼠的产生。1998年，建立了人ES细胞，其目前正变得可供再生医学使用。

不同于ES细胞，组织干细胞具有有限的分化潜力。组织干细胞存在于组织中的特定位置并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多潜能性通常低。组织干细胞具有较高的核质比并且具有很少的细胞内细胞器。大多数的组织干细胞具有低多潜能性、长细胞周期和超过个体生命的增殖能力。基于细胞所来源的部位，例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，可对组织干细胞分类。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。

“诱导性多潜能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)指由非多潜能细胞(通常是成体体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)通过插入某些基因(称为重编程因子)而人工制备的一类多潜能干细胞。产生和工程化iPS细胞的方法在美国专利申请13/546,365中进行了描述，其整体并入本文。

“重编程”是这样的过程，与细胞在相同条件下但不进行重编程将具有的能力相比，其赋予细胞可测量增加的形成至少一种新细胞类型的能力，无论是在培养物中还是在体内。更具体地，重编程是赋予体细胞多潜能潜力的过程。这意味着，在充分增殖之后，可测量比例的后代具有新细胞类型的表型特征(如果在重编程之前基本上没有这样的后代可以形成的话)；或者，具有新细胞类型的特征的比例可测量地大于重编程前。在某些条件下，具有新细胞类型之特征的后代比例可以是至少约0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、25％或更大(以优选性逐渐增加的顺序)。

“多潜能性”是指具有分化成构成一种或多种组织或器官或优选的三个胚层之任意胚层的所有细胞的潜力的干细胞，所述三个胚层为：内胚层(胃内衬、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。本文中使用的“多潜能干细胞”是指可分化成由三个胚层中的任意胚层衍生之细胞的细胞，例如，全能干细胞或诱导性多潜能细胞的直接后代。

本文中使用的“全能干细胞”指具有分化成构成生物体所有细胞之能力的细胞，例如由卵细胞和精细胞的融合产生的细胞。通过受精卵的最初几次分裂产生的细胞也是全能的。这些细胞可分化成胚胎和胚外细胞类型。多潜能干细胞可产生任何胎儿或成体细胞类型。然而，它们单独不能发育成胎儿或成体动物，因为它们缺乏促成胚外组织(例如胎盘)的潜力。

相比之下，很多祖细胞是多能干细胞，即，它们能够分化成有限数量的细胞命运。多能祖细胞可产生数种其他的细胞类型，但是这些类型的数量是有限的。多能干细胞的一个实例是造血细胞，其是可发育成多种类型的血细胞，但不能发育成脑细胞或其他类型细胞的血液干细胞。在长系列的细胞分裂结束时，形成胚胎的是终末分化细胞或被认为永久定型于特定功能的细胞。

本文中使用的术语“体细胞”指不同于生殖细胞(例如卵子、精子等)的任何细胞，其不直接将其DNA转移至下一代。通常来说，体细胞具有有限的多潜能性或者无多潜能性。本文中使用的体细胞可以是天然存在的或经遗传修饰的。

当涉及细胞时本文中使用的术语“工程化”指这样的细胞，其包含被整合到细胞基因组中的对细胞而言是外源的至少一种遗传元件。在一些方面，可将外源遗传元件整合在细胞基因组中的随机位置上。在另一些方面，可将遗传元件整合在基因组中的特定位点上。例如，可将遗传元件整合在特定的位置上以替代内源核酸序列，例如相对于内源序列提供改变(例如，单核苷酸位置的改变)。

如本文中所使用的，当细胞具有少于10％的不期望细胞类型时，细胞“基本上不含”某些不期望的细胞类型，并且当细胞具有少于1％的不期望细胞类型时，细胞“基本上不含”某些细胞类型。然而，甚至更期望的是这样的细胞群，其中总细胞群中的少于0.5％或少于0.1％包含不期望的细胞类型。因此，其中群中少于0.1％至1％(包括所有的中间百分数)的细胞包含不期望细胞类型的细胞群基本上不含这些细胞类型。如本文中所使用的，当没有外部添加的某些试剂时，培养基可“基本上不含”这些试剂。更优选地，这些试剂不存在，或者这些试剂可以以不可检测的量存在。

本文中使用的术语“肝细胞”意指包括表现出成熟肝细胞的一些特征但不是全部特征的肝细胞样细胞以及成熟肝细胞和全功能肝细胞。迄今，通过该方法产生的细胞可至少与通过定向分化产生的肝细胞具有相同的功能。当对该技术进行进一步改进时，其能够产生具有肝细胞之所有特征的完全的全功能肝细胞，如通过形态学、标志物表达以及体外和体内功能测定所确定。

本文中使用的术语“悬浮”可指其中细胞不附着于固体支持物的细胞培养条件。在增殖的同时，可使用本领域技术人员公知的装置搅拌悬浮状态下增殖的细胞。

本文中使用的术语“球状体”可指悬浮生长的细胞的小聚集体，有时还与混悬的基质材料组合。

II.参与肝细胞编程的细胞

在本发明的某些方案中，公开了对不是肝细胞的细胞进行正向编程来产生肝细胞的方法和组合物。还可提供包含外源表达盒的细胞，所述外源表达盒含有一种或更多种肝细胞编程因子基因和/或对肝细胞鉴定具有特异性的报道蛋白表达盒。在一些实施方案中，细胞可以是干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。在另一些实施方案中，细胞可以是任何体细胞。

A.干细胞

干细胞是在大多数(如果不是全部的话)多细胞生物体中发现的细胞。它们的特征在于能够通过细胞有丝分裂自我更新并且分化成多种特化细胞类型。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在胚泡中发现的胚胎干细胞和在成体组织中发现的成体干细胞。在正在发育的胚胎中，干细胞可分化成所有的特化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞作为身体的修复系统起作用，补充特化细胞，而且也维持再生器官(例如血液、皮肤或肠组织)的正常更新。

人胚胎干细胞(ESC)和诱导性多潜能干细胞(iPSC)能够在体外进行长期增殖而仍保留分化成身体所有细胞类型(包括肝细胞)的潜力。因此，这些细胞可潜在地提供不受限供应的患者特异性功能肝细胞以用于进行药物研发和移植疗法两者。人ESC/iPSC至肝细胞的体外分化重演了正常的体内发育，即它们经历以下顺序发育阶段：定形内胚层、肝特化、未成熟肝细胞和成熟肝细胞(图1)。这需要在不同的分化阶段添加不同的生长因子，并且一般需要超过20天的分化(图3)。更重要地是，人ESC/iPSC衍生的肝细胞一般尚不能表现出人原代成体肝细胞的全功能谱。本发明的某些方面提供了：与iPSC的产生类似，可通过表达对肝细胞分化/功能重要的转录因子的组合来由人ESC/iPSC直接诱导肝细胞(例如肝细胞样细胞或全功能肝细胞)，这绕过了大部分(如果不是全部的话)的正常发育阶段(图1)。这种方法可以是时间和成本更为有效的，并且产生与人原代成体肝细胞具有高度类似(如果不相同的话)功能的肝细胞。此外，与体细胞相比，其增殖能力不受限制的人ESC/iPSC作为用于肝细胞分化的起始细胞群具有独特的优势。

1.胚胎干细胞

胚胎干细胞系(ES细胞系)是由胚泡或早期桑椹胚期胚胎之内细胞团(ICM)的上胚层组织衍生的细胞的培养物。胚泡是早期的胚胎，在人类中约4至5天大并且由50至150个细胞组成。ES细胞是多潜能的并且在发育期间产生3个原胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的所有衍生物。换言之，对于特定的细胞类型，当给予充分且必需的刺激时，它们可发育成为成体200种以上细胞类型的每一种细胞类型。它们对胚外膜或胎盘没有贡献。

迄今几乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干细胞(mES)或人胚胎干细胞(hES)来进行的。两者都具有基本的干细胞特征，但是它们需要非常不同的环境以维持未分化状态。小鼠ES细胞可在明胶层上生长并且需要白血病抑制因子(LeukemiaInhibitoryFactor，LIF)的存在。人ES细胞可在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上生长并且通常需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的存在。在无最佳培养条件或遗传操作的情况下(Chambers等，2003)，胚胎干细胞将迅速分化。

还可通过数种转录因子和细胞表面蛋白的存在来定义人胚胎干细胞。转录因子Oct-4、Nanog和Sox-2形成核心调控网络，其确保抑制导致分化的基因和维持多潜能性(Boyer等，2005)。鉴定hES细胞最常用的细胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角质素抗原Tra-1-60和Tra-1-81。

用于获得小鼠ES细胞的方法是公知的。在一种方法中，将来自129品系小鼠的植入前胚泡用小鼠抗血清处理以除去滋养外胚层，并在含有胎牛血清之培养基中的经化学失活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养内细胞团。在胎牛血清存在下，将形成的未分化ES细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行传代培养以产生ES细胞群。在一些方法中，可在不存在饲养层的情况下通过向含血清培养基添加细胞因子白血病抑制因子(LIF)来培养小鼠ES细胞(Smith，2000)。在另一些方法中，可在骨形态发生蛋白和LIF存在下在无血清培养基中培养小鼠ES细胞(Ying等，2003)。

可使用之前所述的方法从胚泡获得人ES细胞(Thomson等，1995；Thomson等，1998；Thomson和Marshall，1998；Reubinoff等，2000)。在一种方法中，使第5天人胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清，然后暴露于1∶5稀释度的豚鼠补体以裂解滋养外胚层细胞。在从完整内细胞团除去经裂解的滋养外胚层后，将内细胞团在经γ失活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上并且在胎牛血清存在下培养。9至15天后，将由内细胞团衍生的细胞块(clump)化学(即暴露于胰蛋白酶)或机械分离并重新铺板在含有胎牛血清和小鼠成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，将其机械分离成块并重新铺板(参见美国专利No.6,833,269)。ES样形态的特征为具有明显高的核质比和明显核仁的致密集落。通过简单胰蛋白酶化或者通过借助微量移液管选择单个集落来常规传代所得ES细胞。在一些方法中，可在无血清的情况下通过在碱性成纤维细胞生长因子存在下在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞来培养人ES细胞(Amit等，2000)。在另一些方法中，可在无饲养细胞层的情况下通过在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件化(conditioned)”培养基存在下于蛋白质基质(例如Matrigel^TM或层粘连蛋白)上培养细胞来培养人ES细胞(Xu等，2001)。所述培养基是此前通过与成纤维细胞共培养而条件化的。

用于分离恒河猴ES细胞和常见的绒猴ES细胞的方法也是已知的(Thomson和Marshall，1998；Thomson等，1995；Thomson和Odorico，2000)。

ES细胞的另一来源是已建立的ES细胞系。多种小鼠细胞系和人ES细胞系是已知的并且用于其生长和繁殖的条件是已经限定的。例如，小鼠CGR8细胞系是由小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的并且CGR8细胞的培养物可在无饲养层的情况下于LIF存在下生长。作为另一个实例，人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14是由Thompson等建立的。此外，已开发了H9系的亚克隆H9.1和H9.2。预期，几乎本领域中已知的任何ES或干细胞系均可用于本发明，例如，如Yu和Thompson(2008)中所述那些，其通过引用并入本文。

结合本发明使用的ES细胞的来源可以是胚泡、由培养胚泡的内细胞团衍生的细胞或从已建立细胞系的培养物获得的细胞。因此，本文中使用的术语“ES细胞”可指胚泡的内细胞团、从内细胞团之培养物获得的ES细胞和从ES细胞系之培养物获得的ES细胞。

2.诱导性多潜能干细胞

诱导性多潜能干细胞(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是具有ES细胞之特征但通过重编程经分化的、通常为成体体细胞而获得的细胞。诱导性多潜能干细胞在关于多潜能性的所有方面与胚胎干细胞都是高度类似的(如果不相同的话)，例如在以下方面：某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、活嵌合体(viablechimera)形成以及效力和分化能力。iPSC具有以下优势：它们由从个体收集的细胞产生，因此能够产生与供体遗传匹配的细胞，并可进一步用于制备几乎任何不同的细胞类型。

已通过多种方法获得了诱导性多潜能干细胞。在一种方法中，使用逆转录病毒转导用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转染成体人皮肤成纤维细胞(Takahashi等，2007)。将经转染的细胞铺板在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)之培养基中的SNL饲养细胞(产生LIF的小鼠细胞成纤维细胞细胞系)上。约25天后，培养物中出现与人ES细胞集落类似的集落。挑选ES细胞样集落，并使其在bFGF存在下于饲养细胞上扩增。

基于细胞特征，ES细胞样集落的细胞是诱导性多潜能干细胞。诱导性多潜能干细胞在形态上与人ES细胞类似，并且表达多种人ES细胞标志物。此外，当在已知导致人ES细胞分化的条件下培养时，诱导性多潜能干细胞相应地分化。例如，诱导性多潜能干细胞可分化成具有神经元结构和神经元标志物的细胞。预期，几乎任何iPS细胞或细胞系都可用于本发明，包括例如Yu和Thompson(2008)中所述的那些。

在另一种方法中，使用慢病毒转导用四种基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转染人胎儿或新生儿成纤维细胞(Yu等，2007)。在感染后12至20天，具有人ES细胞形态的集落变得可见。挑选集落并扩增。构成集落的诱导性多潜能干细胞在形态上与人ES细胞类似、表达多种人ES细胞标志物并且在被注射到小鼠中后形成具有神经组织、软骨和肠上皮的畸胎瘤。

从小鼠制备诱导性多潜能干细胞的方法也是已知的(Takahashi和Yamanaka，2006)。iPS细胞的诱导通常需要表达或暴露于来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是指定ES细胞身份的转录调控层次的中心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另外的因子可提高重编程效率，如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；重编程因子的特定组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选的Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选的c-Myc的组。

与ES细胞类似，iPS细胞具有特征性的抗原，所述抗原可使用SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4(发育研究杂交瘤库(DevelopmentalStudiesHybridomaBank)，国家儿童健康与人类发育研究所(NationalInstituteofChildHealthandHumanDevelopment)，BethesdaMd.)以及TRA-1-60和TRA-1-81的抗体通过免疫组织化学或流式细胞术被鉴定或确定(Andrews等，1987)。可通过将约0.5x10⁶至10x10⁶个细胞注射到8至12周大雄性SCID小鼠的后腿肌肉中来确定胚胎干细胞的多潜能性。发生证明3个胚层中每一个胚层的至少一种细胞类型的畸胎瘤。

在本发明的某些方面，使用包含Oct家族成员和Sox家族成员(例如Oct4和Sox2)的重编程因子与上述Klf或Nanog的组合由重编程体细胞制备iPS细胞。例如，重编程载体可包含编码Sox2、Oct4、Nanog和任选的Lin-28的表达盒，或者可包含编码Sox2、Oct4、Klf4和任选的C-myc、L-myc或Glis-1的表达盒。用于重编程的体细胞可以是可被诱导多潜能性的任何体细胞，例如成纤维细胞、角质形成细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞、胃细胞或β细胞。在某一个方面，也可使用T细胞作为用于重编程的体细胞来源(参见美国申请No.61/184,546，其通过引用并入本文)。

重编程因子可由包含在一种或更多种载体中的表达盒表达，所述载体例如整合型载体或附加型载体，例如基于EBV元件的系统(参见美国申请No.61/058,858，其通过引用并入本文；Yu等，2009)。在另一个方面，可通过蛋白质转导或RNA转染将重编程蛋白或RNA(例如mRNA或miRNA)直接引入体细胞中(参见美国申请No.61/172,079，其通过引用并入本文；Yakubov等，2010)。

Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)已被鉴定为参与诱导过程的关键转录调控因子，其不存在使诱导变得不可能。然而，经鉴定，另外的基因提高诱导效率，所述基因包括Klf家族的某些成员(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族(C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog和LIN28。

Oct-3/4(Pou5f1)是八聚体(“Oct”)转录因子家族中的一员，并且在维持多潜能性方面起关键作用。Oct-3/4+细胞(例如卵裂球和胚胎干细胞)中Oct-3/4的不存在导致自发的滋养层分化，因此Oct-3/4的存在产生了胚胎干细胞的多潜能性和分化潜能。“Oct”家族中的多种其他基因不能引起诱导，包括Oct-3/4的紧密相关物Oct1和Oct6。

与Oct-3/4类似，Sox基因家族与维持多潜能性有关，但是与仅在多潜能干细胞中表达的Oct-3/4相反，其与多能和单能干细胞相关。尽管通过Takahashi等(2006)、Wernig等(2007)和Yu等(2007)，Sox2是用于诱导的初始基因，但是已发现Sox家族中的其他基因在诱导过程中也起作用。Sox1以与Sox2类似的效率产生iPS细胞；而且Sox3、Sox15和Sox18基因也产生iPS细胞，但是效率降低。

Nanog是关键地参与未分化胚胎干细胞的自我更新的转录因子。在人中，这种蛋白质由NANOG基因编码。Nanog是在胚胎干细胞(ESC)中表达的基因并且被认为是维持多潜能性的一个关键因子。认为NANOG与其他因子(例如Oct4(POU5F1)和Sox2)协调作用以建立ESC身份。

LIN28是在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达的与分化和增殖有关的mRNA结合蛋白。Yu等(2007)证明其是iPS产生中的因子，但不是必需的。

Klf基因家族中的Klf4最初由Takahashi等(2006)鉴定，之后被Wernig等(2007)证实为用于产生小鼠iPS细胞的因子并被Takahashi等(2007)证明为用于产生人iPS细胞的因子。然而，Yu等(2007)报道Klf4对于人iPS细胞的产生而言并不是必需的。发现Klf2和Klf4是能够产生iPS细胞的因子并且相关基因Klf1和Klf5也能够产生iPS细胞，但是效率降低。

Myc基因家族是癌症中所涉及的原癌基因。Takahashi等(2006)和Wernig等(2007)证明了C-myc是在产生小鼠iPS细胞中所涉及的因子并且Yamanaka等证明了其是在产生人iPS细胞中所涉及的因子。然而，Yu等(2007)和Takahashi等(2007)报道c-myc对于人iPS细胞的产生而言是不必要的。“myc”基因家族在诱导iPS细胞中的使用对iPS细胞作为临床治疗的不测事件而言是令人担心的，因为移植有c-myc诱导性iPS细胞的25％小鼠发生致命的畸胎瘤。经鉴定，N-myc和L-myc代替C-myc以类似的效率诱导多潜能性。在某些方面，可使用Myc突变体、变体、同源物或衍生物，例如具有降低的细胞转化的突变体。实例包括LMYC(NM_001033081)、N端缺失41个氨基酸的MYC(dN2MYC)或在第136位氨基酸具有突变的MYC(例如，W136E)。

3.通过体细胞核转移获得的胚胎干细胞

可借助体细胞核转移来制备多潜能干细胞，其中将供体的细胞核转移到无纺锤体的卵母细胞中。通过核转移产生的体细胞在遗传方面与供体细胞核相同。在一种方法中，通过电融合将来自恒河猴之皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞核引入无纺锤体的成熟中期II恒河猴卵母细胞的细胞质中(Byrne等，2007)。通过暴露于离子霉素来活化融合的卵母细胞，之后将其孵育直至胚泡阶段。然后，培养所选择的胚泡的内细胞团以产生胚胎干细胞系。所述胚胎干细胞系示出正常的ES细胞形态、表达多种ES细胞标志物并且在体外和体内都分化成多种细胞类型。本文中使用的术语“ES细胞”指来源于含有受精核之胚胎的胚胎干细胞。ES细胞区别于通过核转移产生的胚胎干细胞，其被称为“通过体细胞核转移获得的胚胎干细胞”。

4.另一些干细胞

胎儿干细胞是具有自我更新能力和多潜能分化潜力的细胞。它们可分离和扩增自胎儿细胞滋养层细胞(欧洲专利EP0412700)以及绒毛膜绒毛、羊水和胎盘(WO/2003/042405)。这些在此通过引用以其整体并入。胎儿干细胞的细胞表面标志物包括CDl17/c-kit⁺、SSEA3⁺、SSEA4⁺和SSEAl^-。

已在大多数的器官组织中鉴定到体干细胞。最佳表征的是造血干细胞。造血干细胞是已基于细胞表面标志物和功能特征进行了纯化的中胚层衍生的细胞。从骨髓、血液、脐带血、胎儿肝和卵黄囊分离的造血干细胞是重启用于接受者生命的血细胞生成并产生多个造血谱系的祖细胞(参见美国专利No.5,635,387；5,460,964；5,677,136；5,750,397；5,759,793；5,681,599；5,716,827；Hill等，1996)。这些在此通过引用以其整体并入。当被移植到经致死剂量照射的动物或人中时，造血干细胞可重建红细胞系(erythoid)、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞以及淋巴样造血细胞库。在体外，造血干细胞可被诱导以经历至少一些自我更新的细胞分裂并且可被诱导以分化成与在体内所见到的相同的谱系。因此，该细胞符合干细胞的标准。

下一个最佳表征的是最初由胚胎中胚层衍生并分离自成体骨髓的间充质干细胞(MSC)，其可分化以形成肌肉、骨、软骨、脂肪、骨髓基质和腱。在胚胎发生期间，中胚层发育成肢芽中胚层，即产生骨、软骨、脂肪、骨骼肌和可能的内皮的组织。中胚层还分化成内脏中胚层，其可产生心肌、平滑肌或由内皮和造血祖细胞组成的血岛。因此，原始中胚层或间充质干细胞可为多种细胞和组织类型提供来源。已分离到大量间充质干细胞(参见，例如美国专利No.5,486,359；5,827,735；5,811,094；5,736,396；美国专利No.5,837,539；5,837,670；5,827,740；Jaiswal等，1997；Cassiede等，1996；Johnstone等，1998；Yoo等，1998；Gronthos，1994；Makino等，1999)。这些均在此通过引用以其整体并入。在已被描述的众多间充质干细胞中，经证明，所有都具有有限的分化以只形成一般被认为来源于间充质的那些分化的细胞。迄今，最多能的间充质干细胞表达SH2⁺SH4⁺CD29⁺CD44⁺CD71⁺CD90⁺CD106⁺CD120a⁺CD124⁺CD14^-CD34^-CD45^-表型。

已鉴定到其他干细胞，包括胃肠干细胞、表皮干细胞、神经和肝干细胞，也称为卵圆细胞(Potten，1998；Watt，1997；Alison等，1998)。

在一些实施方案中，可用于本文中所述方法的干细胞包括但不限于胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞、间充质干细胞、骨髓来源的干细胞、造血干细胞、软骨细胞祖细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、神经干细胞、肝干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、胰腺祖细胞、毛囊干细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。

在一些实施方案中，用于本文中所述方法的干细胞分离自脐带、胎盘、羊水、绒毛膜绒毛、胚泡、骨髓、脂肪组织、脑、外周血、胃肠道、脐带血、血管、骨骼肌、皮肤、肝和月经血。将在月经血中制备的干细胞称为子宫内膜再生细胞(MedistemInc.)。

本领域的普通技术人员可以定位、分离和扩增这样的干细胞。用于从多种来源分离人干细胞的详细程序在CurrentProtocolsinStemCellBiology(2007)中进行了描述并且其在此通过引用以其整体并入。或者，可使用市售的试剂盒和分离系统。例如，来自BDBiosciences的BDFACSAria细胞分选系统、BDIMag磁性细胞分离系统和BDIMag小鼠造血祖细胞富集套装(set)。从多种来源分离并培养干细胞的方法在美国专利No.5,486,359、6,991,897、7,015,037、7,422,736、7,410,798、7,410,773和7,399,632中也进行了描述，其各自均在此通过引用以其整体并入。

B.体细胞

在本发明的某些方面，还可提供转分化的方法，即将一种体细胞类型直接转化成另一种，例如从其他体细胞衍生肝细胞。转分化可涉及使用肝细胞编程因子基因或基因产物以提高这些基因在用于产生肝细胞的体细胞中的表达水平。

然而，人体细胞的供应可能是有限的，尤其是来自活供体的那些。在提供不受限供应的编程初始体细胞的某些方面，可通过引入无限增殖化基因或蛋白质(例如hTERT或癌基因)来使体细胞无限增殖化。细胞的无限增殖化可以是可逆的(例如，使用可去除的表达盒)或可诱导的(例如，使用诱导型启动子)。

在本发明的某些方面，体细胞可以是原代细胞(非无限增殖化细胞)，例如从活生物体新鲜分离的那些或其尚未建立或无限增殖化成细胞系的后代，或者可来源于细胞系(无限增殖化细胞)。在将细胞从对象分离之后，可将其维持在细胞培养物中。在某些实施方案中，在将细胞用于本发明的方法之前，使其传代一次或一次以上(例如，2至5次、5至10次、10至20次、20至50次、50至100次，或更多次)。在一些实施方案中，在将细胞用于本发明的方法之前，其将已传代不超过1、2、5、10、20或50次。可将它们冷冻、解冻等。

本文中所使用的或所述的体细胞可以是天然体细胞或工程化体细胞，即已被遗传改变的体细胞。本发明的体细胞通常是哺乳动物细胞，例如，如人细胞、灵长类动物细胞或小鼠细胞。它们可通过公知的方法获得并且可获自含有活体细胞的任何器官或组织，例如血液、骨髓、皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道或其他泌尿器官等。

本发明中可用的哺乳动物体细胞包括，但不限于，塞托利细胞(Sertolicell)、内皮细胞、颗粒上皮细胞(granulosaepithelialcell)、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核的细胞(mononuclearcell)、心肌细胞以及其他肌肉细胞等。

在一些实施方案中，根据已知仅在或主要在期望细胞类型中表达的内源标志物的表达来选择细胞。例如，波形蛋白是成纤维细胞标志物。其他可用的标志物包括多种角蛋白、细胞粘附分子，例如钙黏着蛋白、纤连蛋白、CD分子等。体细胞群的平均细胞周期时间可以是18至96小时，例如24至48小时、48至72小时等。在一些实施方案中，预期至少90％、95％、98％、99％或更多的细胞在预定的时间内(例如24、48、72或96小时)分裂。

本文中所述的细胞可用于将一种或更多种体细胞(例如体细胞集落或体细胞群)编程为肝细胞。在一些实施方案中，本发明的细胞群在以下方面是大体一致的：至少90％的细胞表现出目的表型或特征。在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％或更多的细胞表现出目的表型或特征。在本发明的某些实施方案中，体细胞具有分裂的能力，即体细胞不是有丝分裂期后的。

体细胞可以是部分或完全分化的。分化是这样的过程，通过该过程较不特化的细胞变为更加特化的细胞类型。细胞分化可涉及尺寸、形状、极性、代谢活性、基因表达和/或对细胞信号的响应性的改变。例如，造血干细胞分化以产生所有的血细胞类型，包括髓样谱系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。在沿分化途径进展期间，细胞的最终命运变得更加固定。如本文中所述，部分分化的体细胞和完全分化的细胞两者都可按照本文中所述进行编程以产生期望的细胞类型，例如肝细胞。

III.肝细胞编程因子

本发明的某些方面提供了用于肝细胞正向编程的肝细胞编程因子。肝细胞可通过提高细胞中的肝细胞编程因子的水平来由其他细胞来源直接产生。可通过有限数量肝细胞富集的转录因子的协调作用来将肝细胞的多种功能控制在转录水平。对肝细胞分化或功能重要的任何转录因子均可用于本文中，如肝细胞富集的转录因子，特别是表1中所列出的其基因。表1中所列出的基因的所有同种型和变体均可包括在本发明中，并且提供了某些同种型或变体的登录号的非限制性实例。

A.遗传因子

例如，通过使表1中的转录因子的组合表达，从多潜能干细胞正向编程为肝细胞可绕过大部分(如果不是全部的话)的正常发育阶段。所示实例是下列转录因子的组合：FOXA2、HHEX、HNF1A、GATA4、MAFB和TBX3。

表1.用于将人ESC/iPSC直接编程为肝细胞的候选基因的列表

肝细胞富集的转录因子包括，但不限于，肝细胞核因子1-α(HNF-1α)、-1β、-3α、-3β、-3γ、-4α和-6以及c/ebp家族的成员)。肝细胞核因子(HNF)是一组在系统发生学方面不相关的转录因子，其调控多组基因转录成为蛋白质。这些蛋白质包括凝血因子以及另外的参与葡萄糖、胆固醇和脂肪酸转运以及代谢的酶和转运蛋白。在这些蛋白质中，HNF4A(也称为HNF4α或核受体2A1或(NR2A1))和HNF1A(即，HNF1α)似乎与经培养的肝细胞瘤细胞的分化表型有关。HNF1A缺失小鼠是可存活的，表明该因子不是形成活性肝实质绝对必需的。相比之下，HNF4A缺失小鼠在胚胎发生期间死亡。HNF4A在发育的早期被表达，其在肝发育前很长时间在胚胎第4.5天通过小鼠内脏内胚层中的原位杂交可见。虽然HNF4A似乎是内脏内胚层中所必需的，但是其可能不是胎儿肝发育的最早步骤中所必需的(Li等，2000)。

HNF1A也称为HNF1、LFB1、TCF1和M0DY3。HNF1A是在肝中高度表达并参与调控多种肝特异性基因(例如人I类醇脱氢酶)之表达的转录因子。HNF1A(Genbank登录号：NM_000545.4)属于同源框基因家族，因为其含有同源框DNA结合结构域。同源框是与DNA结合的DNA序列。经翻译的同源框是一段高度保守的60个氨基酸残基。

叉头框A2(FOXA2)也称为HNF3β、HNF3B、TCF3B和MGC19807。FOXA2是叉头类DNA结合蛋白的成员。叉头框是形成与DNA结合之基序的80至100个氨基酸的序列。由于该结构域的蛋白质结构中环的蝴蝶样外观，因此该叉头基序也称为翼状螺旋。这些肝细胞核因子是肝特异性基因的转录激活剂，例如白蛋白和运甲状腺素蛋白，并且它们还与染色质相互作用。小鼠中的类似家族成员在代谢调控以及胰腺和肝的分化方面具有作用。该基因已经与青少年的成年型糖尿病的散发病例联系在一起。对于该基因，已鉴定到编码不同同种型(同种型1和2)的转录本变体(Genbank登录号：NM021784.4；FOXA2-1)和NM_153675.2；FOXA2-2)。

造血表达的同源框蛋白HHEX是在人中由HHEX基因编码的蛋白质。该基因编码转录因子同源框家族的成员，其中很多成员参与发育过程。HHEX是肝的早期发育所需要的。HHEX的无效突变导致不能形成肝芽以及胚胎致死。

T框转录因子TBX3是在人中由TBX3基因编码的蛋白质。该基因是共有共同DNA结合结构域T框的在系统发生学方面保守的基因家族的成员。T框基因编码参与调控发育过程的转录因子。这种蛋白质是转录阻遏物并且认为其在四足动物前肢的前/后轴中发挥作用。该基因中的突变引起尺骨-乳房综合征、影响肢体、顶质分泌腺、牙齿、毛发和生殖器发育。该基因的选择性剪接产生编码不同同种型的三种转录本变体。

Gata4基因编码锌指转录因子GATA家族的成员。该家族的成员识别在很多基因的启动子中存在的GATA基序。认为GATA4蛋白调控参与胚胎发生以及心肌分化和功能的基因。该基因中的突变已经与心脏间隔缺陷以及生殖缺陷联系在一起。

MafB基因编码转录因子MAFB，其也称为V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B。MAFB是通过阻遏髓样细胞中红细胞系特异性基因之ETS1介导的转录而在调控谱系特异性血细胞生成方面发挥作用的碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。MAFB激活胰岛素和胰高血糖素启动子。

B.化学因子

在本发明的某些方面，在重编程过程的至少一部分期间，可在一种或更多种抑制参与信号转导级联之信号转导物的信号转导抑制剂存在下维持细胞，例如在MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂两者，或这些相同途径中其他信号转导物的抑制剂存在下。

这样的信号转导抑制剂(例如，MEK抑制剂或TGF-β受体抑制剂)可以以以下有效浓度使用：至少或约0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、500至约1000μM或者可来源于其中的任意范围。

2.MEK抑制剂

MEK1和MEK2是双功能丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶并且也称为MAP激酶激酶。选择性MEK抑制剂抑制MEK1和MEK2而基本上不抑制其他酶。MEK抑制剂是这样的化合物，当在美国专利5,525,625中的测定标题“酶测定”中被测试时其示出MEK抑制作用，所述专利通过引用并入本文。MEK抑制剂可以是ATP竞争性MEK抑制剂、非ATP竞争性MEK抑制剂或ATP非竞争性抑制剂。MEK抑制剂的实例包括，但不限于，AZD6244(参见WO2003/077914)、PD-0325901(Pfizer)、PD-184352(Pfizer)、XL-518(Exelixis)、AR-119(ArdeaBiosciences，ValeantPharmaceuticals)、AS-7001173(MerckSerono)、AS-701255(MerckSerono)、360770-54-3(Wyeth)和GSK-1120212(GlaxoSmithKline)。特别地，已发现当与其他已知MEK抑制剂相比时，PD184352和PD0325901具有高度的特异性和效力(Bain等，2007)。其他MEK抑制剂和MEK抑制剂的种类在Zhang等(2000)中进行了描述。

3.ALK5抑制剂

TGF-β细胞因子通过单跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族转导信号。这些受体可分为两类，I型或激活素样激酶(activin-likekinase，ALK)受体和II型受体。ALK受体与II型受体的区别在于ALK受体(a)缺乏富含丝氨酸/苏氨酸的细胞内尾，(b)拥有在I型受体间非常同源的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和(c)共有称为GS结构域的共同序列基序，GS结构域由富含甘氨酸和丝氨酸残基的区域组成。GS结构域在细胞内激酶结构域的氨基末端，并且认为其对通过II型受体的活化具有关键作用。许多研究已表明TGF-β信号转导需要ALK(I型)和II型受体两者。特别地，在TGF-β存在下，II型受体使TGF-β的I型受体ALK5的GS结构域磷酸化。然后，ALK5继而在两个羧基端丝氨酸处使胞质蛋白smad2和smad3磷酸化。

多种ALK5受体抑制剂已有描述。参见，例如美国专利No.6,465,493和6,906,089以及美国专利申请公开No.US2003/0166633、US2004/0063745和US2004/0039198，其各自内容均通过引用并入本文。另外的ALK5抑制剂包括，但不限于，SB-431542(GlaxoSmithKline)、ALX-270-448(EnzoLifeSciences)、A83-01(Tojo等，2005)、EW-7195(Park等，2011)、K126894(Ehata等，2007)、LY2109761(EliLilly)、LY-364947(EliLilly)、SB-525334(GlaxoSmithKline)、SB-505124(GlaxoSmithKline)、SD-208(Uhl等，2004)、IN-1233(Kim等，2010)和SKI2162(SKChemicals)。此外，尽管“ALK5抑制剂”并非旨在涵盖非特异性激酶抑制剂，但是除ALK5之外，“ALK5抑制剂”应被理解为还涵盖抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如，如SB-431542(参见，例如Inman等，2002)。

4.cAMP类似物

环腺苷单磷酸(cAMP)是天然存在的化合物，其存在于所有细胞和组织中，从细菌到人。本发明中可用的cAMP衍生物的实例包括，但不限于，N6-单酰基腺苷-3’，5’-环磷酸，2’-O-单酰基腺苷-3’，5’-环磷酸，N6，2’-O-二酰基腺苷-3’，5’-环磷酸或其8-巯基、8-低级烷硫基、8-苄硫基、8-氨基、8-羟基、8-氯或8-溴取代产物(优选8-溴腺苷3’，5’-环单磷酸)，8-苄硫基腺苷-3’，5’-环磷酸或其N6-低级烷基取代产物，和8-巯基腺苷-3’，5’-环磷酸，其中特别优选的实例是N6，2’-O-二丁酰基腺苷-3’，5’-环磷酸钠(DBcAMP)、2’-O-丁酰基腺苷-3’，5’-环磷酸钠、N6-丁酰基腺苷-3’，5’-环磷酸钠、腺苷-3’，5’-环磷酸钠、8-苄硫基-N6-丁酰基腺苷-3’，5’-环磷酸盐/酯和8-苄硫基腺苷-3’，5’-环磷酸盐/酯。

IV.基因或基因产物的递送

在某些实施方案中，可构建用于递送编码肝谱系编程或分化因子的核酸的载体以在细胞中表达这些因子。下文公开了对这些载体的组成和递送方法的详述。此外，还可使用蛋白质转导组合物或方法来实现肝细胞编程因子的表达。

在另一个方面，下述系统和方法还可用于递送用来鉴定期望细胞类型(例如肝细胞)的报道蛋白表达盒。特别地，可使用肝细胞特异性调控元件来驱动报道基因的表达，因此可对通过正向编程获得的肝细胞进行表征、选择或富集。

A.核酸递送系统

本领域技术人员充分具备通过标准的重组技术构建载体的能力(参见，例如Sambrook等，2001和Ausubel等，1996；两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于，质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，例如逆转录病毒载体(例如，衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括复制型、复制缺陷型及其“无内容”形式(gutlessform))、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头状瘤病毒载体、EB病毒、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳房肿瘤病毒载体和劳斯肉瘤病毒载体。

1.病毒载体

在产生重组病毒载体中，通常用异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替代非必需的基因。病毒载体是这样的一类表达构建体，其利用病毒序列来将核酸和可能的蛋白质引入细胞中。某些病毒感染细胞或经由受体介导的胞吞作用进入细胞的能力以及稳定且有效地整合到宿主细胞基因组中并表达病毒基因的能力使其成为用于将外来核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。下文描述了可用于递送本发明某些方面之核酸的病毒载体的非限制性实例。

逆转录病毒具有作为基因递送载体的前景，因为其能够将其基因整合到宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广谱的物种和细胞类型以及被包装在特定的细胞系中(Miller，1992)。

为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入到病毒基因组中而替代某些病毒序列以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建含有gag、pol和env基因而无LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将含有cDNA以及逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入特定细胞系中时(例如，如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录本被包装在病毒颗粒中，随后其被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后，收集含有重组逆转录病毒的培养基，将其任选地浓缩并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛的多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞进行分裂(Paskind等，1975)。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，除共同的逆转录基因gag、pol和env之外，其还包含具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域中是公知的(参见，例如Naldini等，1996；Zufferey等，1997；Blomer等，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可用于体内和离体二者的基因转移以及核酸序列的表达。例如，能够感染非分裂细胞的重组慢病毒在美国专利5,994,136(其通过引用并入本文)中进行了描述，其中用携带包装功能(即，gag、pol和env以及rev和tat)的两种或更多种载体转染合适的宿主细胞。

同样地，腺相关病毒(AAV)载体也可用于介导将核酸分子整合到宿主细胞基因组中。例如，可使用无内容AAV载体以使得病毒的反向末端重复(ITR)位于核酸分子的侧翼以整合。如果用这样的载体转导细胞，可实现基本随机的基因组整合。在另一方面，如果在功能AAVRep基因存在下(不管是在病毒中还是以反式表达)转导细胞，则可实现该序列在AAVS1整合位点处的位点特异性整合。

2.附加型载体

在本发明的某些方面，还可提供基于质粒或基于脂质体的染色体外(即附加型)载体的使用。这样的附加型载体可包括，例如基于oriP的载体和/或编码EBNA-1的衍生物的载体。这些载体可允许大的DNA片段被引入细胞并维持在染色体外，每个细胞周期复制一次，有效地被分配到子细胞并且基本上不引起免疫应答。

特别地，EBNA-1(基于oriP的表达载体复制所需的唯一病毒蛋白)不引起细胞免疫反应，因为它已形成绕过在I类MHC分子上呈递其抗原所需的加工的有效机制(Levitskaya等，1997)。进一步，EBNA-1可反式作用以增强所克隆基因的表达，从而诱导所克隆基因在一些细胞系中的表达高达100倍(Langle-Rouault等，1998；Evans等，1997)。最后，这种基于oriP的表达载体的制备是便宜的。

已通过突变和缺失分析将EBNA-1的641个氨基酸(AA)分类成与其不同功能相关的结构域。当被EBNA-1结合时，AA40-89与AA329-378之间的两个区域能够将两个DNA元件以顺式或反式连接，因此已将其命名为连接区1和2(LR1、LR2)。LR1和LR2在复制方面是功能上冗余的；任一个区域的缺失产生能够支持DNA复制的EBNA-1衍生物(Mackey和Sugden，1999；Sears等，2004)。LR1和LR2富含精氨酸和甘氨酸残基，并且类似于与富含A/T之DNA结合的AT-钩基序(AT-hookmotif)(Aravind和Landsman，1998)，(Sears等，2004)。对EBNA-1之LR1和LR2的体外分析已证明其与富含A/T之DNA结合的能力(Sears等，2004)。当将含有一个这样的AT钩的LR1与EBNA-1之DNA结合和二聚化结构域融合时，发现足以用于oriP质粒的DNA复制，尽管效率低于野生型EBNA-1。

在本发明的一些具体实施方案中，重编程载体将包含oriP和编码能够在细胞分裂期间支持质粒复制及其适当维持的EBNA-1形式的短缩序列(abbreviatedsequence)两者。EBNA-1之与oriP有关的反式作用功能不需要野生型EBNA-1之氨基端三分之一内的高度重复序列并且去除已在多种细胞中证明具有毒性的25个氨基酸区域(Kennedy等，2003)。因此，在一个实施方案中，在此基于附加型载体的系统内，可将EBNA-1的短缩形式(也称为δUR1)与oriP一起使用。

在某些方面，可用于本发明中的EBNA-1衍生物是相对于对应的野生型多肽具有经修饰的氨基酸序列的多肽。修饰包括对应于EBNA-1中LR1之独特区域(约第40位残基至约第89位残基)的区域中至少一个氨基酸残基的缺失、插入或替换，并且可包括对应于EBNA-1之其他残基的区域中一个或更多个氨基酸残基的缺失、插入和/或替换，例如约第1位残基至约第40位残基、约第90位残基至约第328位残基(“Gly-Gly-Ala”重复区)、约第329位残基至约第377位残基(LR2)、约第379位残基至约第386位残基(NLS)、约第451位残基至约第608位残基(DNA结合和二聚化)或约第609位残基至约第641位残基，只要所得衍生物具有期望的特性即可，例如使含有对应于oriP之ori的DNA二聚化并与其结合、定位于细胞核、无细胞毒性并且激活从染色体外的转录但基本不激活从所整合的模板的转录。

重要地是，基于oriP的附加型载体的复制和维持是有缺陷的并且在其被引入细胞中的前两周内从细胞急剧丧失(每次细胞分裂25％)；然而保留质粒的那些细胞丧失其的频率较低(每次细胞分裂3％)(Leight和Sugden，2001；Nanbo和Sugden，2007)。一旦除去对含有该质粒之细胞的选择，质粒将在每次细胞分裂期间丧失直至它们都已随时间被消除而不留下其之前在所得子细胞中存在过的足迹。本发明的某些方面利用基于oriP的系统的这种无足迹特征作为当前病毒相关方法的一种替代方案来递送基因以产生iPS细胞。其他的染色体外载体在宿主细胞的复制和增殖期间也会丧失，并且也可应用于本发明中。

其他染色体外载体包括其他基于淋巴营养性疱疹病毒(lymphotrophicherpesvirus)的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如，人B淋巴母细胞)中复制并在其自然生命周期的一部分内变成质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性的淋巴营养性疱疹病毒包括，但不限于EBV、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirussaimiri，HS)和马立克病病毒(Marek’sdiseasevirus，MDV)。基于附加体(episome)的载体的其他来源也在考虑之内，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。

本领域技术人员充分具备通过标准的重组技术构建载体的能力(参见，例如，Maniatis等，1988和Ausubel等，1994；两者均通过引用并入本文)。

载体还可包含进一步调节基因递送和/或基因表达，或者以其他方式对靶细胞提供有益特性的其他组分或功能。这样的其他组分包括，例如影响与细胞的结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞中之定位的组分(例如介导核定位的物质)；和影响多核苷酸表达的组分。

这样的组分还可包括标志物，例如可用于检测或选择已摄取或正表达载体所递送之核酸的细胞的可检测标志物和/或选择标志物。这样的组分可以载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或者可将载体修饰成提供这样的功能。很多种这样的载体在本领域中是已知的并且一般是可获得的。当将载体维持在宿主细胞中时，载体可以作为自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定地复制、被整合到宿主细胞的基因组中或者被维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。

3.基于转座子的系统

根据一个具体实施方案，核酸的引入可使用转座子-转座酶系统。所使用的转座子-转座酶系统可以是公知的睡美人(SleepingBeauty)、青蛙王子(FrogPrince)转座子-转座酶系统(有关后者的描述参见，例如EP1507865)或TTAA特异性转座子PiggyBac系统。

转座子是可四处移动至单个细胞基因组内的不同位置(称为转座的过程)的DNA序列。在该过程中，它们可引起基因组中DNA的突变并改变基因组中DNA的量。转座子曾经也被称为跳跃基因，并且是可移动的遗传元件的实例。

存在多种可移动的遗传元件，并且可基于其转座机制对其进行分组。I类移动的遗传元件或逆转录转座子如下自我拷贝：首先被转录成RNA，然后通过逆转录酶被逆转录回DNA，之后被插入在基因组中的另一个位置。使用转座酶在基因组内对II类移动的遗传元件“剪切和粘贴”来将其从一个位置直接移动到另一个位置。

4.基于同源重组核酸酶的系统

在本发明的某些方面，可以以基因组工程的特异性方式(例如经由同源重组)将核酸分子引入细胞中。如上文所讨论的，在细胞中表达基因的一些方法涉及使用在基因组中随机整合的病毒载体或转基因。然而，这些方法具有以下缺点：整合发生在不能够有效介导所整合之核酸的表达的位点或导致天然基因破裂的位点。与随机整合有关的问题可通过同源重组至靶基因组中的特定基因座(例如，AAVS1或Rosa26基因座)而得以部分克服。

同源重组(HR)，也称为一般性重组，是用于所有生命形式中的遗传重组类型，其中核苷酸序列在两条类似或相同的DNA链之间发生交换。自20世纪80年代中期以来，该技术一直是用于在哺乳动物细胞中进行基因组工程的标准方法。过程涉及DNA的物理断裂以及最后再结合数个步骤。该过程被最广泛用于修复DNA中潜在的致命双链断裂。此外，在减数分裂期间同源重组产生新的DNA序列组合，通过该过程真核细胞产生生殖细胞，如精子和卵子。这些新的DNA组合代表后代中的遗传变化，其允许群体在进化上适应随时间不断改变的环境条件。同源重组还可用于水平基因转移中以在细菌和病毒的不同株以及物种之间交换遗传物质。同源重组还用作用于将遗传变化引入靶生物体中的分子生物学技术。

同源重组(HR)是一种靶基因组修饰技术，其自20世纪80年代中期以来一直是用于在哺乳动物细胞中进行基因组工程的标准方法。标准HR在哺乳动物细胞中的效率为仅处理10^-6至10^-9的细胞(Capecchi，1990)。已使用大范围核酸酶或归巢内切核酸酶(例如I-SceI)的用途来提高HR的效率。天然大范围核酸酶以及具有修饰的靶向特异性的工程化大范围核酸酶两者均已被用于提高HR效率(Pingoud和Silva，2007；Chevalier等，2002)。朝向提高HR效率的另一条途径是用可编程DNA特异性结构域工程化嵌合内切核酸酶(Arnould等，2011)。锌指核酸酶(ZFN)是这样的嵌合分子的一个实例，其中将锌指DNA结合结构域与IIS型限制性内切核酸酶(例如FokI)的催化结构域融合(如Durai等，2005中所综述的；WO05/028630)。

另一类这样的特异性分子包括与IIS型限制性内切核酸酶(例如FokI)的催化结构域融合的转录激活因子样效应蛋白(TALE)DNA结合结构域(Miller等，2011：PCT/IB2010/000154)。可在给定的几乎任何目的位点处为位点特异性基因组修饰设计TALEN(Cermak等，2011；Christian等，2010；Li等，2011；Miller等，2011；Weber等，2011；Zhang等，2011)。位点特异性DNA结合结构域作为具有DNA切割酶(例如，FokI)的融合蛋白被表达。DNA结合结构域是重复氨基酸的骨架；连接每个重复的是与DNA中单个核苷酸结合的两个可变氨基酸。例如，Asn-Asn与鸟苷结合、Asn-Ile与腺苷结合、Asn-Gly与胸苷结合而His-Asp与胞嘧啶结合。这两个氨基酸被称为重复可变的双残基(RepeatVariableDiresidue)或RVD。存在很多不同的RVD，并且可将它们工程化为TAL效应蛋白/Fok1蛋白构建体以产生特定的TALEN。然后，可纯化编码重组TALEN的RNA并将其转染到用于进行位点特异性基因组修饰的细胞中。一旦TALEN引入双链DNA断裂，可通过非同源末端联接(NHEJ)或者通过同源定向修复(HDR)对DNA进行修饰。根据在DNA修复期间存在的另外序列，这允许DNA诱变、缺失或添加。

B.调控元件

载体中包含的真核表达盒优选含有(以5’至3’的方向)与蛋白质编码序列有效连接的真核转录启动子、包含间插序列的剪接信号以及转录终止/多腺苷酸化序列。

1.启动子/增强子

“启动子”是控制序列，其为核酸序列的区域，在该区域转录的起始和速率受到控制。其可含有这样的遗传元件，调节性蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合在这些遗传元件处以起始核酸序列的特定转录。短语“有效定位”、“有效连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。

启动子一般包含起定位RNA合成之起始位点作用的序列。其众所周知的实例是TATA框，但是在缺乏TATA框的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点本身的离散元件(discreteelement)有助于固定起始位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30bp至110bp的区域中，但是已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“处于启动子的控制之下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选启动子的“下游”(即，其3’)。“上游”启动子刺激DNA的转录并启动所编码RNA的表达。

启动子元件之间的间隔经常是灵活的，以使得当元件被倒置或相对于彼此发生移动时，能够保留启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至相隔50bp，之后活性开始下降。根据启动子，似乎单个元件可以协作地或独立地发挥激活转录的作用。启动子可与或者可不与“增强子”组合使用，增强子是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。

启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。可将这样的启动子称为“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合的增强子，其位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制之下将会产生某些益处，重组或异源启动子指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核细胞或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变的启动子或增强子。例如，在构建重组DNA时最常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR^TM)，联合本文中公开的组合物来产生序列(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，各自均通过引用并入本文)。此外，考虑也可采用指导非核细胞器(如线粒体、叶绿体等)内序列之转录和/或表达的控制序列。

自然地，采用有效指导DNA区段在选定用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子将具有重要意义。分子生物学领域技术人员一般知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见例如Sambrook等，1989，其通过引用并入本文)。所采用的启动子可以为组成型、组织特异性、诱导型和/或可用于在合适条件下指导所引入DNA区段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中具有优势。启动子可以是异源或内源的。

另外，还可使用任何启动子/增强子组合(按照例如真核生物启动子数据库EPDB，通过epd.isb-sib.ch/访问万维网)来驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可能的实施方案。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体，那么真核细胞可支持从某些细菌启动子的细胞质转录。

启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，如β-肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等，1989)、GADPH启动子(Alexander等，1988，Ercolani等，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等，1989；Richards等，1984)；以及多联应答元件启动子(concatenatedresponseelementpromoter)，例如环AMP应答元件启动(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA框附近的应答元件启动子(tre)。还可使用人生长激素启动子序列(例如，描述于Genbank，登录号X05244，核苷酸283-341的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可获自ATCC，目录No.ATCC45007)。一个具体的实例可以是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

组织特异性转基因表达，尤其是由正向编程产生的肝细胞中的报道基因表达(例如抗生素抗性基因表达)是鉴定所产生肝细胞的理想方式。为了提高特异性和活性两者，已考虑使用顺式作用调控元件。例如，可使用肝细胞特异性启动子，例如以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、载脂蛋白A-I或APOE。

在某些方面，这还涉及增强子序列，即不管其方向，甚至在相对长的距离(距离靶启动子多至数千碱基)提高启动子的活性并且具有顺式作用的潜力的核酸序列。然而，并非必须将增强子功能限制于这样长的距离，因为它们也可紧靠给定的启动子而发挥功能。对于肝而言，迄今已报道了多种方法来将这样的器官特异性调控序列引入逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒载体或非病毒载体中(通常除管家肝细胞特异性细胞启动子之外)(Ferry等，1998；Ghosh等，2000；Miao等，2000；Follenzi等，2002)。

已记载了用于肝特异性基因的若干增强子序列。WO2009130208描述了若干肝特异性调控增强子序列。WO95/011308描述了包含与启动子和转基因连接的肝细胞特异性控制区(HCR)增强子的基因治疗载体。人载脂蛋白E-肝细胞控制区(apolipoproteinE-HepatocyteControlRegion，ApoE-HCR)是用于载脂蛋白E(ApoE)基因之肝特异性表达的基因座控制区(LCR)。ApoE-HCR位于ApoE/CI/CII基因座中，总长度为771bp并且对ApoE和ApoC-1基因在肝中的表达具有重要意义(Simonet等，1993)。在WO01/098482中，建议该特异性ApoE增强子序列或其截短形式与肝启动子的组合。已表明，组合(未经截短的)ApoE-HCR增强子与人α-抗胰蛋白酶(AAT)启动子的载体构建体能够在体内产生最高水平的治疗蛋白(Miao等，2000)并且当与异源转基因联合使用时可赋予持续的表达(Miao等，2001)。

当用于例如pAAV-ApoHCR-AAT-FIXIA构建体(VandenDriessche等，2007)中时，该ApoE-HCR-AAT表达盒是已知的最有效肝特异性FIX表达构建体之一，并且已被成功应用于患有重度血友病B之人的1/2期剂量递增临床研究(Manno等，2006)。该hFIX小基因的表达由与人AAT启动子联接的ApoE-HCR驱动。人AAT基因的5’-侧翼序列含有多个顺式调控元件，包括远端增强子和近端序列，总长度为约1.2kb。已表明，通过主要驱动肝中的基因表达以及在较低程度上驱动已知表达AAT之其他组织中的基因表达足以赋予体内组织特异性(Shen等，1989)。该1.2kb区域的347bp片段与ApoE增强子的组合能够实现体内的长期肝特异性基因表达(Le等，1997)。有趣的是，与针对较长的AAT启动子片段所报道的相比，该较短的启动子以更大的特异性靶向肝的表达(Yull等，1995)。

文献中还已经提出另一些嵌合肝特异性构建体，例如AAT启动子和白蛋白或乙型肝炎增强子(Kramer等，2003)，或连接有载脂蛋白E增强子元件的两个串联拷贝的醇脱氢酶6(ADH6)基本启动子(Gehrke等，2003)。后一篇公开的作者强调了这种增强子-启动子组合的相对小尺寸(1068bp)的重要性。

2.起始信号和内部核糖体结合位点

还可使用特定的起始信号来有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将容易能够确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与期望编码序列的阅读框在“框内”，以确保整体插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包含合适的转录增强子元件来增强表达效率。

在本发明的某些实施方案中，利用内部核糖体进入位点(IRES)元件的用途产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式，并在内部位点处开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起被转录，每个开放阅读框均以IRES隔开，产生多顺反子信息。借助IRES元件，每个开放阅读框可接近核糖体以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息可以有效表达多个基因(参见，美国专利No.5,925,565和5,935,819，其均通过引用并入本文)。

3.复制的起点

为了在宿主细胞中增殖载体，其可含有一个或更多个复制位点起点(通常称为“ori”)，例如，与如上所述之EBV的oriP，或在编程中具有相似或提高功能的遗传工程化oriP对应的核酸序列，其是在此起始复制的特定核酸序列。OriP是在此或在此附近DNA复制起始并且由相隔约1千碱基对的两个顺式作用序列(已知为重复序列家族(familyofrepeats，FR)和二重对称(dyadsymmetry，DS))构成的位点。或者，可采用如上所述的其他染色体外复制型病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。

4.选择和可筛选标志物

在本发明的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物而在体外或体内鉴定含有本发明核酸构建体的细胞。这样的标志物将赋予细胞可鉴定的变化，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。一般地，选择标志物是赋予允许进行选择之特性的标志物。阳性选择标志物是这样的标志物，其中该标志物的存在允许对其进行选择，而阴性选择标志物是这样的标志物，其中该标志物的存在阻止对其进行选择。阳性选择标志物的一个实例是药物抗性标志物。

通常，包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇抗性的基因是可用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的执行来区分转化体的表型的标志物之外，其他类型的标志物也在考虑之内，包括可筛选标志物(例如基础是比色分析的GFP)。或者，可利用可筛选酶作为阴性选择标志物，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知道如何使用免疫标志物，可能与FACS分析联合。认为所使用的标志物并不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时被表达即可。选择和可筛选标志物的其他实例是本领域技术人员公知的。本发明的一个特征包括在编程因子已在那些细胞中实现期望的编程改变之后使用选择和可筛选标志物来选择肝细胞。

C.核酸递送

如本文中所述的或如本领域普通技术人员已知的，可使用适用于核酸递送以转化细胞的任何方法来将核酸(例如DNA或RNA)引入待用本发明编程的细胞中。这样的方法包括但不限于，DNA的直接递送，例如通过离体转染(Wilson等，1989；Nabel等，1989)，通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自均通过引用并入本文)，包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利No.5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，之后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波装载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请NO.WO94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自均通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利No.5,302,523和5,464,765，各自均通过引用并入本文)；通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，各自均通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)，以及这些方法的任意组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。

1.脂质体介导的转染

在本发明的某个实施方案中，可将核酸包载(entrap)在脂质复合体(例如脂质体)中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有通过水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，它们自发形成。在形成封闭结构之前，脂质组分经历自我重排并将水和溶解的溶质包载在脂质双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。核酸与Lipofectamine(GibcoBRL)或Superfect(Qiagen)复合也在考虑之内。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如，可以考虑约5μg至约20μg载体DNA/1百万至1千万个细胞。

在体外进行脂质体介导的核酸递送和外来DNA的表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。也已经证明了脂质体介导的外来DNA递送和表达在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞瘤细胞中的可行性(Wong等，1980)。

在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。已证明，这样有利于与细胞膜的融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在另一些实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或者可与之联合使用(Kato等，1991)。在又一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1二者复合或者可与之联合使用。在另一些实施方案中，递送载剂可包含配体和脂质体。

2.电穿孔

在本发明的某些实施方案中，经由电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及使细胞悬浮液和DNA暴露于高压放电。可以通过机械损伤使接受者细胞变得更易于转化。所使用的载体的量也可以根据所使用的细胞的性质而变化，例如，可考虑约5μg至约20μg载体DNA/1百万至1千万个细胞。

使用电穿孔转染真核细胞已经相当的成功。已经用人κ-免疫球蛋白基因以这种方式转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等，1984)，并且已经以这种方式用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa等，1986)。

3.磷酸钙

在本发明的另一些实施方案中，使用磷酸钙沉淀来将核酸引入细胞中。已经使用该技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham和VanDerEb，1973)。同样，以这种方式，用新霉素标志物基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen和Okayama，1987)，并且用多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等，1990)。

4.DEAE-葡聚糖

在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇来将核酸递送到细胞中。以这种方式，将报道质粒引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(Gopal，1985)。

D.蛋白质转导

在本发明的某些方面，可使待编程为肝细胞的细胞与肝细胞编程因子接触，所述肝细胞编程因子包含数量足以进行正向编程的肝细胞转录因子基因的多肽。蛋白质转导已被用作用于增强将大分子递送到细胞中的方法。蛋白质转导结构域可用于将肝细胞编程多肽或其功能片段直接引入细胞中。很多组的研究已表明可使由HIVTat蛋白衍生的TAT蛋白的区域与靶蛋白融合，从而使靶蛋白进入细胞中。认为TAT介导的进入机制通过大胞饮进行(Gump和Dowdy，2007)。

“蛋白质转导结构域”或“PTD”是可穿过生物学膜，特别是细胞膜的氨基酸序列。当与异源多肽连接时，PTD可增强异源多肽易位穿过生物学膜。PTD通常与异源DNA结合结构域共价连接(例如，通过肽键)。例如，PTD和异源DNA结合结构域可由单核酸编码，例如在共同的开放阅读框中或者在共同基因的一个或更多个外显子中。一个示例性的PTD可含有10至30个氨基酸并且可形成两亲性螺旋。很多PTD具有碱性特征。例如，碱性PTD可含有至少4、5、6或8个碱性残基(例如，精氨酸或赖氨酸)。PTD可以能够增强将多肽易位到缺乏细胞壁的细胞或来自特定物种的细胞中，例如，哺乳动物细胞，例如人细胞、猿猴细胞、鼠细胞、牛细胞、马细胞、猫细胞或羊细胞。

可使PTD与人工转录因子连接，例如使用柔性接头。柔性接头可含有一个或更多个甘氨酸残基以允许自由旋转。例如，PTD可与转录因子的DNA结合结构域间隔至少10、20或50个氨基酸。PTD可位于相对于DNA结合结构域的N端或C端。位于特定结构域的N端或C端无需邻近该特定结构域。例如，DNA结合结构域N端的PTD可与DNA结合结构域相隔间隔区和/或其他类型的结构域。可通过化学方式合成PTD，然后使用或不使用接头肽通过化学方式将其与分开制备的DNA结合结构域缀合。人工转录因子还可把包含多个PTD，例如多个不同的PTD或一个PTD的至少两个拷贝。

若干蛋白质和小肽能够不依赖经典的受体和胞吞作用介导的途径而转导或移动通过生物学膜。这些蛋白质的实例包括HIV-1TAT蛋白、单纯疱疹病毒1(HSV-1)DNA结合蛋白VP22和果蝇触角足(Antp)同源异型转录因子。可将来自这些蛋白质的小蛋白质转导结构域(PTD)与其他大分子、肽或蛋白质融合以将它们成功地转运到细胞中。对来自这些蛋白质的转导结构域的序列比对示出高碱性氨基酸含量(Lys和Arg)，其可有利于这些区域与膜中带负电脂质的相互作用。二级结构分析显示所有三个结构域之间无一致结构。

使用这些转导结构域的融合的优势在于蛋白质进入是快速的、浓度依赖性的并且似乎与不同细胞类型起作用。

来自I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的Tat蛋白当被外源添加时具有进入细胞的优异能力(Frankel和Pabo，1988；Mann和Frankel，1991；Fawell等，1994)。已表明，TATPTD在体外和体内成功地介导了将超过100kDa的异源肽和蛋白质引入哺乳动物细胞中(Ho等，2001)。Schwarze等示出当将与TATPTD融合的120kDaβ-半乳糖苷酶蛋白腹膜内注射到小鼠中时，在所有的细胞和组织类型(甚至包括脑)中都发现融合蛋白，由于血脑屏障的原因，这一直被认为是困难的(Schwarze等，1999)。

在一些情况下，由约6至12个精氨酸残基构成的聚精氨酸肽可介导蛋白质转导。有关聚精氨酸的更多信息，参见，例如，Rothbard等(2000)；Wender等(2000)。

有关PTD的更多信息，还参见美国专利No.6,919,425；美国2003/0082561；美国2003/0040038；Schwarze等(1999)；Derossi等(1996)；Hancock等(1991)；Buss等(1988)；Derossi等(1998)；Lindgren等(2000)；Kilic等(2003)；Asoh等(2002)；和Tanaka等(2003)。

除PTD之外，还可使用细胞摄取信号。这些信号包括被细胞受体或其他表面蛋白质特异性识别的氨基酸序列。细胞摄取信号与细胞之间的相互作用引起含有细胞摄取信号的人工转录因子的内在化。一些PTD也可通过与细胞受体或其他表面蛋白质的相互作用来发挥功能。

可用多种测定确定氨基酸序列是否可发挥PTD的功能。例如，可将所述氨基酸序列与报道蛋白(例如β-半乳糖苷酶)融合以形成融合蛋白。使该融合蛋白与经培养的细胞接触。将细胞洗涤并随后测定报道蛋白活性。另一种测定检测含有所讨论氨基酸序列和另一条可检测序列(例如，表位标签)之融合蛋白的存在。使该融合蛋白与经培养的细胞接触。将细胞洗涤并通过Western或免疫荧光分析以检测细胞中可检测序列的存在。还可使用其他测定来检测含有推定PTD、DNA结合结构域和任选的效应蛋白结构域之融合蛋白的转录调控活性。例如，可使用例如微阵列、质谱和高通量技术针对mRNA或蛋白质的存在或水平来测定与这样的融合蛋白接触的细胞。

V.细胞培养

一般来说，本发明的细胞在培养基中培养，其是能够维持细胞生长的富营养物缓冲溶液。然而，起始细胞和最终的重编程细胞一般对培养基和培养条件具有不同的需求。同样地，当同时选择整合工程化构建体的细胞时，可在重编程过程的特定部分期间向培养基添加选择性药物。为了在实现这一点的同时还允许发生细胞的重编程，在培养基存在下并且在已知适合起始细胞生长的培养条件下，在引入重编程因子之后通常进行至少初始阶段的培养。然而，该初始阶段还可包括选择药物，以使得只有包含抗性标志物的细胞在该初始生长期增殖。

适用于根据本文中所述方法分离、扩增并使干细胞分化成肝细胞的培养基包括，但不限于，高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F-15、LiebovitzL-15、RPMI1640、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)和Opti-MEMSFM(InvitrogenInc.)。化学成分确定的培养基包括最低必需培养基例如Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(Gibco)，补充有人血清白蛋白、人ExCyte脂蛋白、transfernin、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和促分裂原的最低必需培养基也是合适的。如本文中所使用的，促分裂原指刺激细胞之细胞分裂的物质。物质可以是化学物质，通常是促使细胞开始细胞分裂从而触发有丝分裂的蛋白质的某种形式。在一个实施方案中，考虑将无血清培养基(例如美国专利No.5,908,782和WO96/39487中所述那些)和如美国专利No.5,486,359中所述的“完全培养基”用于本文中所述的方法。在一些实施方案中，培养基补充有10％胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)、人自体血清、人AB血清或补充有肝素(2U/ml)的富血小板血浆。

本发明的培养基还可含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是，例如，约0.05mM至1.0mM，特别是约0.1mM至0.5mM，但是该浓度并不特别局限于此，只要其适合于培养干细胞即可。

用于培养干细胞的培养容器可以包括，但不特别限于：瓶、组织培养瓶、皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微板、微孔板、多板、多孔板、微载玻片、腔室载玻片、管、盘、Chamber、培养袋和滚瓶，只要其能够培养其中的干细胞即可。根据培养的需求，可在至少或约0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml，或可来源于其中的任意范围的体积中培养干细胞。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可指支持生物学活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可以是至少或约2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、1立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米，或可来源于其中的任意范围。

培养容器可以是细胞粘附型的或非粘附型的，并且根据目的来选择。细胞粘附型培养容器可以经任何用于细胞粘附的底物(例如胞外基质(ECM))包被以改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的底物可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何物质。用于细胞粘附的底物包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白，和RetroNectin及其混合物，例如Matrigel^TM，以及经裂解的细胞膜制备物(Klimanskaya等，2005)。

也可适当地限定其他培养条件。例如，培养温度可以是约30℃至40℃，例如，至少或约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃，但不特别局限于这些。CO₂浓度可以是约1％至10％，例如约2％至5％，或可来源于其中的任意范围。氧张力可以是至少或约1％、5％、8％、10％、20％，或可来源于其中的任意范围。

可在足以维持多潜能性的培养基中培养待分化为肝细胞的多潜能干细胞。培养在本发明某些方面产生的诱导性多潜能干(iPS)细胞可使用被开发来培养灵长类动物多潜能干细胞，更具体为胚胎干细胞的多种培养基和技术，如美国专利No.7,442,548和美国专利申请20030211603中所述。例如，如人胚胎干(hES)细胞，可将iPS细胞维持在80％DMEM(Gibco#10829-018或#11965-092)、20％未经热灭活的精制胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇中。或者，可将ES细胞维持在由以下制成的无血清培养基中：80％Knock-OutDMEM(Gibco#10829-018)、20％血清替代物(Gibco#10828-028)、1％非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇。临用前，可添加人bFGF，直至终浓度为约4ng/mL(WO99/20741)。

可如下产生本发明的肝细胞：在使肝细胞编程因子的细胞内水平提高至足以促进细胞被编程为肝细胞的条件下，在培养基中培养多潜能干细胞或其他非肝细胞。培养基还可含有一种或更多种肝细胞分化剂和成熟剂，例如多种生长因子。然而，通过提高肝细胞编程转录因子的细胞内水平，本发明的某些方面绕过了朝向成熟肝细胞的大部分阶段而无需更换用于每个阶段的培养基。因此，鉴于本发明所提供的优势，在一些具体方面，在肝细胞编程的情况下，用于培养细胞的培养基可基本不含一种或更多种肝细胞分化剂和成熟剂，或者可不经历含有此类试剂之不同组合的培养基的连续更换。

这些试剂可能有助于诱导细胞定型成更成熟的表型-或者优先地促进成熟细胞的存活-或者具有这两种作用的组合。本公开内容中所举例说明的肝细胞分化剂和成熟剂可包括能够促进肝细胞谱系之细胞的生长的可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物以及其他化合物)。这样的试剂的非限制性实例包括但不限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(OSM)、IL-1、L-6、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I，IGF-2)、肝素结合生长因子1(HBGF-1)和胰高血糖素。有技能的读者已知道抑瘤素M与白血病抑制因子(LIF)、白介素-6(IL-6)和睫状神经营养因子(CNTF)在结构上相关。

另一个实例是正丁酸盐/酯，如此前的专利公开内容(美国专利No.6,458,589，美国专利No.6,506,574；WO01/81549)中所述。具有类似作用的正丁酸盐/酯同源物可容易地被鉴定，并且可用作实践本发明中的替代物。一些同源物与正丁酸盐/酯具有类似的结构和物理化学特性：包含3至10个碳原子酸性烃和选自羧酸、磺酸、膦酸及其他质子供体的共轭碱。实例包括异丁酸、丁烯酸、丙酸、其他短链脂肪酸和丁酸二甲酯。还包括同构(isoteric)烃磺酸或膦酸，例如丙磺酸和丙烷膦酸，以及缀合物例如酰胺、糖类、哌嗪和环状衍生物。另一类丁酸盐/酯同源物是组蛋白脱乙酰酶的抑制剂。非限制实例包括曲古抑菌素A、5-氮杂胞苷、trapoxinA、oxamflatin、FR901228、顺铂和MS-27-275。另一类试剂是有机溶剂，如DMSO。具有类似特性的替代选择包括但不限于二甲基乙酰胺(DMA)、六亚甲基双乙酰胺以及其他聚亚甲基双乙酰胺。此类溶剂部分地通过提高细胞的膜渗透性而相关。也感兴趣的是溶质，例如烟酰胺。

在某些方面，可使用细胞的悬浮(或3D)培养，包括载体上的悬浮培养(Fernandes等，2004)或凝胶/生物聚合物包封(美国公开2007/0116680)来进行本发明的方法。相对于培养容器或培养基中的饲养细胞(如果使用的话)，术语细胞的悬浮培养意指在非粘附条件下培养细胞。细胞的悬浮培养包括细胞的解离培养和细胞的聚集体悬浮培养。术语细胞的解离培养意指培养悬浮的细胞，并且细胞的解离培养物包括单个细胞中的那些或由多个细胞(例如，约2至400个细胞)构成的小细胞聚集体中的那些。当继续进行上述解离培养时，经培养的解离细胞形成较大的细胞聚集体，并且此后可进行聚集体悬浮培养。聚集体悬浮培养包括胚状体培养方法(参见Keller等，1995)和SFEB方法(Watanabe等，2005；国际公开No.2005/123902)。

根据本发明一些实施方案的方法，用于悬浮培养细胞的培养容器可以是具有合适纯度级别的任何组织培养容器，其具有被设计成使得在其中培养的细胞不能够粘附或附着于此表面(例如，非组织培养处理的细胞，以防止附着或粘附于表面)的内表面。优选地，为了获得可扩展培养，使用受控培养系统(优选计算机控制的培养系统)来实现根据本发明一些实施方案的培养，其中使用合适的装置自动执行培养参数(例如温度、搅拌、pH和pO₂)。一旦培养参数被记录，系统被设置成根据促进细胞扩增的需要自动调节的培养参数。可在动态条件下(即，在其中在悬浮培养的同时使细胞持续移动的条件下)或非动态条件下(即，静态培养)培养细胞而同时保留其增殖能力。对于细胞的非动态培养，可在未经包被的58mm培养皿(Greiner，Frickenhausen，Germany)中培养细胞。对于细胞的动态培养，可在转瓶中(例如，200ml至1000ml，例如250ml；100ml；或者在125ml锥形瓶中)培养细胞，其可与控制单元连接，并由此呈现为受控培养系统。持续摇动培养容器(例如，转瓶，锥形瓶)。根据本发明的一些实施方案，使用摇床以90转/分钟(rpm)摇动培养容器。根据本发明的一些实施方案，每日更换培养基。

基于细胞来源和扩增需要，可将经解离的细胞以如下分传比(splittingratio)单独或以小簇转移至新的培养容器，例如至少或约1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200或可来源于其中的任意范围。可根据培养细胞悬浮物的体积来确定悬浮细胞系的分传比。传代间隔可以是至少或约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或可来源于其中的任意范围。例如，不同酶促传代方案的可实现分传比可以是1∶2每3至7天、1∶3每4至7天和1∶5至1∶10约每7天、1∶50至1∶100每7天。当使用高分传比时，可将传代间隔延长为至少12至14天或不会因过度的自发分化或细胞死亡而引起细胞损失的任意时间段。

VI.肝细胞特征

可根据多个表型标准来表征细胞。所述标准包括但不限于检测或量化所表达的细胞标志物、酶促活性以及表征形态学特征和细胞内信号。在另一些方面，待编程的细胞可包含含有组织或细胞特异性转录调控元件(如用于肝细胞鉴定的肝细胞特异性启动子)的报道基因表达盒。

本发明某些方面中包括的肝细胞具有自然界中肝细胞(例如来自器官来源的原代肝细胞)的特征性形态学特征。评价此类事情的技术人员容易理解所述特征，并且所述特征包括下列中的任意或所有：多边形细胞形状、双核表型、用于合成分泌性蛋白质之粗面内质网的存在、用于细胞内蛋白质分选之高尔基体-内质网溶酶体复合物的存在、过氧化物酶体和糖原颗粒的存在、相对丰富的线粒体以及形成导致胆汁小管空隙产生之紧密细胞间联接的能力。单个细胞中存在的许多这些特征与为肝细胞谱系成员的细胞一致。可如下进行细胞是否具有肝细胞的特征性形态学特征的无偏确定：加密正进行编程的后代细胞、成体或胎儿肝细胞，和一种或更多种阴性对照细胞(例如成纤维细胞或RPE(视网膜色素上皮)细胞)的显微图，然后以盲法方式评价这些显微图并破译密码以确定是否精确鉴定了由正向编程产生的细胞。

还可根据细胞是否表达肝细胞谱系细胞的特征性表型标志物来表征本发明的细胞。可用于区分肝细胞的细胞标志物的非限制性实例包括白蛋白、脱唾液酸糖蛋白受体、α1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、apoE、精氨酸酶I、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛缩酶B、醇脱氢酶1、过氧化氢酶、CYP3A4、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胰岛素生长因子1和2、IGF-1受体、胰岛素受体、瘦蛋白、肝特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)、L-型脂肪酸结合蛋白、苯丙氨酸羟化酶、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白和促红细胞生成素(EPO)。成熟肝细胞标志物包括，但不限于，白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、脱唾液酸糖蛋白受体、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、CYP3A4、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)、葡萄糖-6-磷酸酶、酪氨酸转氨酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和色氨酸2，3-双加氧酶。

可通过与其他细胞进行比较来确定此类标志物表达水平的评估。成熟肝细胞之标志物的阳性对照包括目的物种的成体肝细胞和已建立的肝细胞系。提醒读者永生化细胞系或长期肝细胞培养物可能在代谢方面有所改变，并且不能表达原代肝细胞的某些特征。阴性对照包括独立谱系的细胞，例如成体成纤维细胞系或视网膜色素上皮(RPE)细胞。未分化干细胞对上文所列举的一些标志物是阳性的，但对成熟肝细胞的标志物是阴性的，如下文的实施例举例说明。

可使用任何合适的免疫学技术来检测本公开内容中所列举的组织特异性(例如，肝细胞特异性)蛋白质或寡糖决定簇，所述技术例如针对细胞表面标志物的流式免疫细胞化学、针对细胞内或细胞表面标志物的免疫组织化学(例如，固定细胞或组织切片的免疫组织化学)、针对细胞提取物的Western印迹分析和针对细胞提取物或分泌到培养基中之产物的酶联免疫测定。如果在标准的免疫细胞化学或流式细胞术测定中，任选地在固定细胞并且任选地使用经标记的二抗或其他用于放大标记的缀合物(例如生物素-抗生物素蛋白缀合物)后显著可检测量的抗体与抗原结合，则认为细胞的抗原表达是“抗体可检测的”。

还可通过Northern印迹分析、斑点印迹杂交分析或者使用标准扩增方法中的序列特异性引物通过实时聚合酶链式反应(PCR)(美国专利No.5,843,780)在mRNA水平上检测组织特异性(例如，肝细胞特异性)标志物的表达。用于本公开内容中所列举的特定标志物的序列数据可获自公开数据库，例如GenBank。如果根据典型受控实验中的标准程序对细胞样品进行测定在标准时间窗口内产生可清楚辨别的杂交或扩增产物，则称为根据本公开内容中所述的一种测定在mRNA水平上的表达是“可检测的”。除非另有要求，否则如果通过RT-PCR可检测到相应的mRNA，则指示特定标志物的表达。如果水平高于对照细胞(例如未分化的多潜能干细胞、成纤维细胞或其他不相关的细胞类型)之水平的至少2倍，并且优选大于10倍或50倍以上，则认为在蛋白质或mRNA水平上检测到的组织特异性标志物的表达是阳性的。

还可根据细胞是否表现出肝细胞谱系细胞的特征性酶促活性来表征细胞。例如，Bublitz(1991)；Yasmineh等(1992)；和Ockerman(1968)描述了针对葡萄糖-6-磷酸酶活性的测定。Shiojiri(1981)描述了针对肝细胞中碱性磷酸酶(ALP)和5-核苷酸酶(5’-Nase)的测定。服务研究和卫生保健部分的很多实验室提供针对肝酶的测定作为商业服务。

在另一些实施方案中，针对指示生物异源物质解毒作用的活性来测定本发明的细胞。细胞色素p450是单加氧酶系统中的关键催化组分。其构成了负责生物异源物质(所施用药物)和很多内源化合物之氧化代谢的血红素蛋白家族。不同的细胞色素呈现特征性的且重叠的底物特异性。大部分的生物转化能力可归因于命名为1A2、2A6、2B6、3A4、2C9-11、2D6和2E1的细胞色素(Gomes-Lechon等，1997)。

用于测量通过细胞色素p450酶活性之生物异源物质解毒作用的很多测定在本领域中是已知的。使用P450-Glo^TMCYP3A4DMSO耐受性测定(荧光素-PPXE)和P450-Glo^TMCYP3A4基于细胞的/生物化学测定(荧光素-PFBE)(Promegalnc，#V8911和#V8901)来证明通过CYP3A4的解毒作用。使用P450-Glo^TM测定(荧光素-CEE)(PromegaInc.，#V8762)来证明通过CYP1A1和或CYP1B1的解毒作用。使用P450-Glo^TM测定(荧光素-ME)(PromegaInc.，#V8772)来证明通过CYP1A1和或CYP1B1的解毒作用。使用P450-Glo^TMCYP2C9测定(荧光素-H)(PromegaInc.，#V8791)来证明通过CYP2C9的解毒作用。

在另一个方面，例如通过分析糖原贮积来评价通过编程提供的肝细胞的生物学功能。通过测定对糖原颗粒的过碘酸希夫(PeriodicAcidSchiff，PAS)功能性染色来进行表征糖原贮积。肝细胞样细胞最先被过碘酸氧化。氧化过程导致通过碳-碳键切割形成醛基团。应当存在自由羟基以发生氧化。当其达到醛阶段时氧化完成。通过希夫试剂检测醛基团。形成无色的不稳定二醛化合物，然后通过恢复醌型发色基团将其转化成有色的终产物(Thompson，1966；Sheehan和Hrapchak，1987)。根据万维网jhu.edu/～iic/PDFjrotocols/LM/GlycogenStaining.pdf和library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/PAS.PDF上所述的方案以及针对肝细胞样细胞的体外培养物的一些修改来进行PAS染色。本领域普通技术人员应当能够做出适当的修改。

在另一个方面，通过本发明某些方面的正向编程产生的肝细胞以尿素产生为特征。基于脲酶还原为尿素和氨的生物化学反应以及与2-氧代戊二酸盐/酯形成谷氨酸盐/酯和NAD的后续反应，可使用获自SigmaDiagnostic(Miyoshi等，1998)的试剂盒比色地测定尿素产生。

在另一个方面，对胆汁分泌进行分析。可通过荧光素二乙酸盐/酯延时测定来确定胆汁分泌。简言之，将肝细胞样细胞的单层培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗三次，并用补充有多西环素和荧光素二乙酸盐/酯(20μg/ml)(Sigma-Aldrich)的无血清肝细胞生长培养基在37℃下孵育35分钟。将细胞用PBS洗涤三次并进行荧光成像。荧光素二乙酸盐/酯是荧光素的非荧光前体。对图像进行评价以确定化合物已被摄取并在肝细胞样细胞中被代谢成荧光素。在一些实施方案中，化合物被分泌到细胞单层的细胞间裂缝(cleft)中。或者，通过Gebhart和Wang(1982)所述之使用荧光素钠的方法来确定胆汁分泌。

在又一个方面，对脂质合成进行分析。可通过油红O染色来确定肝细胞样细胞中的脂质合成。油红O(溶剂红27、苏丹红5B、C.I.26125、C26H24N4O)是用于在冷冻切片上染色中性甘油三酯和脂质以及在石蜡切片上染色一些脂蛋白的脂肪染色剂(脂肪可溶性染料)重氮染料。其具有红色粉末的外观并且在518(359)nm具有最大吸收。油红O是用于苏丹染色的一种染料。类似的染料包括苏丹III、苏丹IV和苏丹黑B。染色必须要在新鲜样品和/或经福尔马林固定的样品上进行。将肝细胞样细胞在显微镜载玻片上培养，在PBS中漂洗三次，将载玻片于室温下风干30至60分钟，在冰冷的10％福尔马林中固定5至10分钟，并随后立即更换三次蒸馏水漂洗。然后，将载玻片置于无水丙二醇中2至5分钟以避免将水带入油红O中并在600℃烘箱中在预热的油红O溶液中染色8分钟。然后，将载玻片置于85％丙二醇溶液中2至5分钟并两次更换蒸馏水漂洗。还可根据万维网library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/OILRED.PDF上所述的方案以及通过本领域普通技术人员针对肝细胞样细胞的体外培养的一些修改来进行油红染色。

在又一个方面，测定细胞的糖原合成。糖原测定是本领域普通技术人员公知的，例如在Passonneau和Lauderdale(1974)中。或者，可使用市售的糖原测定，例如来自BioVision，Inc.目录#K646-100。

还可通过其贮积糖原的能力来评估肝细胞谱系的细胞。合适的测定使用过碘酸希夫(PAS)染色，其不与单糖和二糖反应，但染色长链聚合物，例如糖原和葡聚糖。PAS反应提供了对复杂碳水化合物以及可溶性和膜结合碳水化合物的定量估计。Kirkeby等(1992)描述了对碳水化合物和去污剂的定量PAS测定。vanderLaarse等(1992)描述了使用PAS反应的针对糖原的显微光密度组织化学测定。如果细胞以高于对照细胞(例如成纤维细胞)至少2倍并且优选10倍以上的水平是PAS阳性的，则确定了糖原贮积的证据。还可根据标准方法通过核型分析来表征细胞。

对于参与小分子药物的缀合、代谢或解毒作用之酶的测定也是可获得的。例如，可通过缀合胆红素、胆汁酸和小分子药物，经由尿道或胆道排泄的能力来表征细胞。使细胞与合适的底物接触，孵育合适的时间段并随后对培养基进行分析(通过GCMS或其他合适的技术)以确定是否已形成缀合产物。药物代谢酶活性包括去乙基化、脱烷基化、羟基化、去甲基化、氧化、葡糖醛酸缀合、磺基缀合(sulfoconjugation)、谷胱甘肽缀合和N-乙酰转移酶活性(Guillouzo，1997)。测定包括非那西汀去乙基化、普鲁卡因胺N-乙酰化、扑热息痛磺基缀合和扑热息痛葡糖苷酸化(glucuronidation)(Chesne等，1988)。

本发明某些细胞群的另一个特征是它们在适当条件下对于对灵长类动物肝细胞具有向性的病原体易感。这样的病原体包括甲型、乙型、丙型和丁型肝炎、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、结核病和疟疾。例如，可通过将经培养的正向编程衍生的肝细胞与感染性乙型肝炎颗粒来源(例如来自人HBV载体的血清)组合来确定乙型肝炎的感染性。然后，可通过免疫组织化学或实时PCR测试肝细胞的病毒核心抗原(HBcAg)的合成。

有技能的读者将容易理解，正向编程衍生的肝细胞的一个优势是它们将基本不含通常污染从成体或胎儿肝组织分离的原代肝细胞培养物的其他细胞类型。窦状隙内皮细胞的特征性标志物包括VonWillebrand因子、CD4、CD14和CD32。胆管上皮细胞的特征性标志物包括细胞角蛋白-7、细胞角蛋白-19和γ-谷氨酰转肽酶。星状细胞的特征性标志物包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、突触小泡蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经细胞黏着分子(N-CAM)和脂滴的存在(可通过自体荧光或者经由油红O染色检测)。库普弗细胞(Kupffercell)的特征性标志物包括CD68、某些凝集素和巨噬细胞谱系之细胞的标志物(例如HLAII类和吞噬作用的介体)。如通过免疫染色和荧光激活定量或者其他合适的技术所确定的，如果少于0.1％(优选少于100或10ppm)含有不期望细胞类型的标志物或其他特征，则正向编程衍生的肝细胞的特征可为基本不含这些细胞类型中的一些或全部。

通过根据本发明某些方面的正向编程所提供的肝细胞可具有它们旨在代表之细胞阶段的多个特征。特定细胞中存在的这些特征越多，其越可被表征为肝细胞谱系的细胞。具有这些特征中至少2、3、5、7或9个特征的细胞越来越更优选。涉及如可存在于培养容器或施用制备物中的特定细胞群，细胞之间在表达这些特征方面的一致性通常是有利的。在这种情况下，越来越更优选其中至少约40％、60％、80％、90％、95％或98％的细胞具有期望特征的群。

本发明某些方面提供的肝细胞的另一些理想特征是在药物筛选测定中用作靶细胞的能力，以及在体内和作为体外装置的一部分都能重建肝功能的能力。这些特征在下文的部分中进一步描述。

VII.肝细胞的用途

通过本发明某些方面的方法和组合物提供的肝细胞可用于多种应用中。这些包括但不限于体内肝细胞移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂生长/调控因子、药物化合物等；阐明肝疾病和感染的机制；研究药物和/或生长因子作用的机制；在患者中诊断和监测癌症；基因治疗；和产生生物学活性产物等等。

A.测试化合物的筛选

本发明的正向编程衍生的肝细胞可用于筛选影响本文提供之肝细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。

在一些应用中，使用干细胞(已分化的或未分化的)来筛选这样的因子，其促进细胞沿肝细胞谱系成熟，或者促进这些细胞在长期培养中增殖和维持。例如，如下测试候选肝细胞成熟因子或生长因子：将它们添加至不同孔中的干细胞，然后根据进一步培养和使用这些细胞的期望标准确定所产生的任何表型变化。

本发明的特定筛选应用涉及在药物研究中测试药物化合物。读者一般参考标准教科书InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch，AcademicPress，1997，和美国专利No.5,030,015)。在本发明的某些方面，被编程为肝细胞谱系的细胞起用于标准药物筛选和毒性测定的测试细胞的作用，如此前在短期培养中对于肝细胞细胞系或原代肝细胞所进行的。评估候选药物化合物的活性一般涉及将本发明某些方面所提供的肝细胞与候选化合物组合，确定可归因于所述化合物之细胞在形态学、标志物表型或代谢活性方面的任何变化(相比较于未经处理的细胞或经惰性化合物处理的细胞)，然后将该化合物的作用与所观察到的变化联系起来。筛选可进行是因为化合物被设计成对肝细胞具有药理学作用，或者是因为被设计成具有作用的化合物另外可能具有非预期的肝副作用。可组合测试两种或更多种药物(通过同时或依次与细胞组合)，以检测可能的药物-药物相互作用。

在一些应用中，初始筛选化合物的潜在肝毒性(Castell等，1997)。在第一种情况下，可通过对细胞生存力、存活、形态学的作用和酶渗漏到培养基中来确定细胞毒性。进行更详细的分析以确定化合物是否影响细胞功能(例如糖异生、尿素生成和血浆蛋白合成)而不引起毒性。乳酸脱氢酶(LDH)是一种良好的标志物，因为肝同工酶(V型)在培养条件下是稳定的，允许在孵育12至24小时后于培养上清液中有可重现的测量。还可利用酶(例如线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶)的泄露。Gomez-Lechon等(1996)描述了用于测量糖原的微测定，其可用于测量药物化合物对肝细胞糖异生的作用。

当前，评价肝毒性的其他方法包括确定白蛋白、胆固醇和脂蛋白的合成和分泌；缀合的胆汁酸和胆红素的转运；尿素生成；细胞色素p450水平和活性；谷胱甘肽水平；α-谷胱甘肽S-转移酶的释放；ATP、ADP和AMP代谢；细胞内K⁺和Ca²⁺浓度；核基质蛋白和寡核体(oligonucleosome)的释放；以及凋亡的诱导(通过细胞变圆、染色质凝聚和核碎裂来指示)。可根据[³H]-胸苷或BrdU掺入来测量DNA合成。药物对DNA合成或结构的作用可通过测量DNA合成或修复来确定。[³H]-胸苷或BrdU掺入，尤其是在细胞周期中不定期时间，或是超过细胞复制所需水平的[³H]-胸苷或BrdU掺入，与药物作用一致。不需要的作用还可包括通过中期扩展(metaphasespread)确定的不正常姐妹染色单体交换率。关于更多信息，读者还可参考Vickers(1997)。

B.肝治疗和移植

本发明还提供了本文中提供的肝细胞使可能由于急性、慢性或遗传性肝功能受损而有此治疗需要的对象恢复一定程度的肝功能的用途。

为了测定本文中提供的肝细胞用于治疗应用的适宜性，首先可在合适的动物模型中对该细胞进行测试。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。在适合进行进一步观察的部位(例如肾囊以下、脾内或肝小叶内)向免疫缺陷动物(例如SCID小鼠，或通过化学方法或通过辐照致使免疫缺陷的动物)施用本文提供的肝细胞。几天至数周或更长时间段后收获组织并评估是否仍存在起始细胞类型(例如多潜能干细胞)。这可通过提供具有可检测标签(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)的施用细胞来进行；或通过测量所施用细胞特异性的组成型标志物来进行。当在啮齿类动物模型中测试本文提供的肝细胞时，可通过免疫组织化学或ELISA使用人特异性抗体来评估所施用细胞的存在和表型，或者通过RT-PCR分析使用引起人多核苷酸序列之特异性扩增的引物和杂交条件来评估所施用细胞的存在和表型。本公开内容中的其他部分提供了用于在mRNA或蛋白质水平上评估基因表达的合适标志物。Grompe等(1999)；Peeters等(1997)；和Ohashi等(2000)中提供了确定肝细胞样细胞在动物模型中之命运的一般性描述。

在另一个水平上，评估本文提供的肝细胞在缺乏全肝功能的动物中恢复肝功能的能力。Braun等(2000)概述了用于HSV-tk基因转基因小鼠中毒素诱导的肝疾病的模型。Rhim等(1995)和Lieber等(1995)概述了用于通过表达尿激酶的肝疾病的模型。Mignon等(1998)概述了由细胞表面标志物Fas的抗体诱导的肝疾病。Overturf等(1998)已开发了用于Fah基因靶向破坏之小鼠中的I型遗传性酪氨酸血症(HereditaryTyrosinemiaTypeI)的模型。可通过提供2-(2-硝基-4-氟-甲基-苯甲酰基)-1，3-环己二酮(NTBC)使这些动物免受缺陷，但是当取走NTBC时，它们发生肝疾病。急性肝疾病可通过90％肝切除术来建模(Kobayashi等，2000)。还可通过用肝毒素(例如半乳糖胺、CC14或硫代乙酰胺)处理动物来对急性肝疾病进行建模。

慢性肝疾病(例如肝硬化)可通过用亚致死剂量的肝毒素处理动物足以诱发纤维化的时间来建模(Rudolph等，2000)。评估本文提供的肝细胞重建肝功能的能力涉及向此类动物施用所述细胞，然后确定在1至8周或更长时间段内的存活，同时监测动物的疾病进程。对肝功能的作用可通过评价肝组织中表达的标志物、细胞色素p450活性和血液指标，例如碱性磷酸酶活性、胆红素缀合和凝血酶原时间，以及宿主的存活来确定。根据这些标准中的任意标准，存活、疾病进程或肝功能维持的任何改善均与治疗的有效性相关并且可导致进一步优化。

根据其代谢酶谱或在动物模型中的功效证明期望功能特征之本发明某些方面所提供的肝细胞还可适用于向肝功能受损的人对象直接施用。出于止血的目的，可在具有充分进入循环的任何部位(通常是在腹腔内)施用细胞。对于一些代谢和解毒功能，可进入胆道对细胞而言是有利的。因此，可在肝附近(例如，在治疗慢性肝疾病时)或脾附近(例如，在治疗暴发性肝功能衰竭时)施用细胞。在一种方法中，可通过由留置导管输注将细胞经由肝动脉或经由门静脉施用到肝循环中。可操作门静脉中的导管以使得细胞主要流进脾或肝或两者的组合中。在另一种方法中，通过将丸剂(bolus)置于靶器官附近的腔中来施用细胞，通常置于将使丸剂保持位置的赋形剂或基质中。在另一种方法中，将细胞直接注射到肝叶或脾叶中。

本发明某些方面所提供的肝细胞可用于需要恢复或补充肝功能的任何对象的治疗。可能适合这样的治疗的人病症包括由任何病因引起的暴发性肝功能衰竭、病毒性肝炎、药物诱导性肝损伤、肝硬化、遗传性肝功能不全(例如威尔逊病、吉尔伯综合征或α1-抗胰蛋白酶缺乏)、肝胆管癌、自身免疫肝疾病(例如自身免疫慢性肝炎或原发性胆汁性肝硬化)，以及导致肝功能受损的任何其他病症。对于人治疗，剂量一般为约10⁹至10¹²个细胞，并且通常为约5×10⁹至5×10¹⁰个细胞，根据对象的体重、病痛的性质和严重程度以及所施用细胞的复制能力进行调整。用于确定治疗方式和合适剂量的最终责任在于主管的临床医师。

C.在肝辅助装置中的用途

本发明的某些方面包括被包封或者是生物人工肝装置的一部分的本文提供的肝细胞。CellEncapsulationTechnologyandTherapeutics，1999中描述了包封的多种形式。可根据这些体外或体内使用的方法对本发明某些方面所提供的肝细胞进行包封。

用于临床用途的生物人工器官被设计来支持肝功能受损的个体(作为长期治疗的一部分，或者连接暴发性肝功能衰竭与肝重建或肝移植之间的时间)。生物人工肝装置由Macdonald等(1999)进行了综述并且在美国专利No.5,290,684、5,624,840、5,837,234、5,853,717和5,935,849中进行了举例说明。悬浮型生物人工肝包含这样的细胞，其悬浮于板透析器中，经在合适的基材中微胶囊化或者附着于经胞外基质包被的微载体珠。或者，可将肝细胞置于填充床中、多片平床(multiplateflatbed)中、微通道屏上或围绕空心纤维毛细管的固体支持物上。装置具有对象的血液从其通过的进口和出口，并且有时具有用于向细胞供应营养物质的独立的一组端口。

根据早前所述的方法制备肝细胞，然后将其铺板到装置中的合适基材(例如或胶原蛋白的基质)上。可如下评估装置的效力：将传入通道中的血液组成与传出通道中的血液组成进行比较(就从传入流中移出的代谢物和传出流中新合成的蛋白质方面而言)。

这种装置可用于使流体(例如血液)解毒，其中在允许细胞来去除或修饰流体中的毒素的条件下，使流体与本发明某些方面所提供的肝细胞接触。解毒作用将涉及去除或改变通常通过肝进行加工的至少一种配体、代谢物或其他化合物(天然的或合成的)。这些的化合物包括但不限于胆红素、胆汁酸、尿素、血红素、脂蛋白、碳水化合物、转铁蛋白、血红素结合蛋白、脱唾液酸糖蛋白、激素(如胰岛素和胰高血糖素)和多种小分子药物。该装置还可用于富集具有合成的蛋白质(例如白蛋白、急性期反应物和空载(unloaded)载体蛋白)的传出流体。可将该装置优化以使得进行多种这些功能，从而恢复所需要的许多肝功能。在治疗护理的背景下，该装置对从肝细胞衰竭患者流出的血液进行加工，然后将血液返回至所述患者。

D.商业、治疗和研究目的的分配

出于制备、分配和使用的目的，本发明的肝细胞谱系细胞通常以等渗赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮物的形式供应，任选地所述形式是经冷冻的以有利于运输或储存。

本发明还包括不同的试剂体系，其包含在制备、分配或使用期间的任意时间存在的细胞的组或组合。所述细胞组包含本公开内容中所述的两个或更多个细胞群的任意组合，例如但不限于编程衍生的细胞(肝细胞谱系细胞、其前体以及亚型)与未分化干细胞、体细胞衍生的肝细胞或其他分化细胞类型的组合。所述组中的细胞群有时共有相同的基因组或其遗传修饰形式。可将所述组中的每种细胞类型包装在一起或者包装在同一设备的独立容器中，或者在不同的位置、相同或不同的时间、受控于相同的实体或存在商务关系的不同实体。

VIII.用于测试正向编程中的候选基因的细胞和方法

可使用本公开内容中所提供的方法和细胞来测试特定候选基因或候选基因之组合用作特定细胞类型(例如肝细胞)的正向编程因子的能力。可通过其对细胞形态学、标志物表达、酶促活性、增殖能力或其他目的特征的作用来评估特定候选基因或候选基因之组合在正向编程中的效力，随后其可通过与不含候选基因或组合的平行培养物进行比较来确定。候选基因可以是对分化成期望的细胞类型或对期望细胞类型的功能具有重要意义的转录因子。

在某些实施方案中，可提供包含用于表达候选基因或候选基因之组合的至少一种表达盒的起始细胞(例如多潜能干细胞)。所述表达盒可包含外部可控制的转录调控元件，例如诱导型启动子。这些启动子的活性可通过生物或非生物因子的存在或不存在诱导。诱导型启动子是遗传工程中一种非常强有力的工具，因为可在生物体发育的某些阶段或者在特定的组织中开启或关闭与其有效连接之基因的表达。可使用基于大肠杆菌(E.coli)四环素抗性操纵子的基本调控组件的Tet-On和Tet-Off诱导型基因表达系统。一旦在起始细胞中建立，诱导剂多西环素(Dox，四环素衍生物)可以以剂量依赖性方式控制表达系统，允许精确地调节候选基因的表达水平。

为了帮助鉴定期望的细胞类型，起始细胞还可包含细胞特异性或组织特异性报道蛋白表达盒。所述报道蛋白表达盒可包含与期望细胞类型特异性的转录调控元件有效连接的报道基因。例如，报道蛋白表达盒可包含用于肝细胞产生、分离、选择或富集的肝细胞特异性启动子。报道基因可以是本领域中已知的并且在此前的公开内容中进行了举例说明的任何可选择或可筛选标志物基因。

IX.实施例

包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本发明时作用良好的技术，因此可被认为是构成实践本发明的一些优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可对所公开的一些具体实施方案进行许多改变并且仍获得相同或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1-经由遗传和化学手段进行肝细胞的正向编程

图1中示出了由人ESC/iPSC进行肝细胞分化的可替选方法。肝谱系细胞(例如成熟肝细胞)可由人ESC/iPSC通过表达合适的转基因组合有效地诱导(上面的框)，这绕过了正常分化(下面的框)期间所需的大部分(如果不是全部的话)发育阶段。

针对肝细胞分化建立了人ESC/iPSC报道蛋白/诱导型(R/I)系(图2)。选择3号染色体上的人Rosa26基因座以允许表达肝细胞特异性报道蛋白和rtTET两者，同时使染色体位置依赖性沉默效应最小化。首先，经由同源重组将LoxP重组位点(LOX71和LOX2272)引入人ROSA26基因的外显子1和外显子2之间的位点。靶向构建体(KI构建体)使用磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)驱动的白喉毒素A片段基因(DTA)的表达来进行阴性选择，并且含有约2.0kb的5’臂和4.5kb的3’臂。将来自人BCL2基因(SA)的剪接受体信号置于LOX71位点的前面以允许从内源人ROSA26启动子进行选择标志物的表达。包括胸苷激酶(TK)的编码区以使得在步骤2使用更昔洛韦能够针对不正确Cre/LoxP重组事件进行阴性选择。使用新霉素磷酸转移酶(Neo)以在同源重组期间进行阳性选择(步骤1)。使用口蹄疫病毒肽(F2A)来从内源人ROSA26启动子共表达TK和Neo基因。BGHpA是衍生自牛生长激素基因的多腺苷酸化信号。同源重组产生用于经由Cre/LoxP重组进行有效盒交换的亲本人ESC/iPSC系。为了建立用于肝细胞分化的报道蛋白/诱导型细胞系，通过重组介导的盒交换(RMCE)载体和Cre表达质粒的脂质介导的共转染，将F2A肽连接的标志物基因mOrange和杀稻瘟素S脱氨酶(BSD)(由肝细胞特异性启动子ApoE4pAAT驱动)以及rtTET(由组成型活性真核延伸因子1α启动子pEF驱动)引入Rosa26基因座中。使用嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(Puro)来选择重组事件。正确重组的R/I细胞对嘌呤霉素(Puro⁺)和更昔洛韦(TK^-)具有抗性并且对遗传霉素选择灵敏(Neo^-)。

在人H1ESCR/I系中证实Tet-On诱导型基因表达(图3A至3C)。使用图3A中两种载体之FugeneHD介导的转染将由Ptight启动子(rtTET响应的诱导型启动子)驱动的EGFP引入人ESCR/I系中。用遗传霉素(100μg/ml)选择具有稳定PiggyBac转座子整合的人ESC。用或不用多西环素(1μg/ml)诱导2天后的人ESCR/I系的图像示于图3B中。在用或不用多西环素(1μg/ml)诱导4天后的人ESCR/I系中通过流式细胞术分析EGFP表达(图3C)。在4天的多西环素诱导后，通过EGFP表达，83.3％的人ESCR/I系表现出稳定的PiggyBac转座子整合。

图4中示出了举例说明由人ESC/iPSC进行肝细胞正向编程的一个示意图。将参与正常哺乳动物发育期间的肝分化或者在成体肝细胞中富集的基因克隆到在Ptight启动子(表1)控制之下的piggyBac载体中(图3)。为了找到能够将成熟肝命运直接赋予人ESC的转录因子，通过核转染(nucleofection)(MirusIngenio电穿孔溶液：目录#MIR50114；程序：AmaxaB-016)将转基因表达PiggyBac载体的多种组合以及hPBase表达载体引入组成型表达rtTET的人ESC中。在mTeSR1中的matrigel上培养经核转染的人ESC(StemCellTechnologies)。在对稳定的基因组转基因整合进行遗传霉素(100μg/ml)选择之后(使细胞在分化之前至少传代一次)，通过accutase处理来使人ESC个体化(individualize)并将其铺板于经matrigel包被的12孔板。第二天，向补充有0.5μg/ml胰岛素、0.1μM地塞米松(dex)和50ng/ml制瘤素M(OSM)的肝细胞维持培养基(HMM，Lonza)添加多西环素(1μg/ml)以诱导转基因表达。在进行适当天数的转基因诱导后，移除多西环素，使细胞转变为肝细胞样细胞并在表征之前将其维持在补充有0.5μg/ml胰岛素、0.1μMdex和50ng/mlOSM的HMM中。适当时，在肝编程期间添加小分子，例如MEK抑制剂PD0325901、TGFβ激酶/激活素受体样激酶(ALK5)抑制剂A83-01和天然信号转导分子环AMP8-溴腺苷3’，5’-环单磷酸(8-Br-cAMP)的类似物。

用转基因和/或共表达载体的多种组合转染人表达rtTET的ESC。在对稳定的转基因整合进行药物选择后，将细胞用accutase个体化并以约0.2x10⁶细胞/孔铺板于经matrigel包被的12孔板之补充有10μM有利于细胞附着的HA100的mTeSR中(第0天)。从铺板后的第1天至第7天，用补充有0.5μg/ml胰岛素、0.1μMdex和50ng/mlOSM的HMM中的1μg/ml多西环素诱导转基因表达。从第7天开始，将细胞维持在补充有0.5μg/ml胰岛素、0.1μMdex和50ng/mlOSM的HMM中。在编程期间每隔一天更换培养基。在第13天，用小鼠抗人白蛋白单克隆抗体(1∶5000，Cedarlane，目录#CL2513A)，之后是AlexaFluor488驴抗小鼠IgG(H+L)二抗(1∶1000，Invitrogen，目录#A-21202)染色编程中的培养物。在所测试的转基因和共表达载体中，FOXA2、GATA4、HHEX和HNF1A似乎是成功肝重编程所需要的，而MAFB和TBX3影响效率(图5)。在GFH和H1AM共表达载体的情况下观察到肝编程效率有所提高，如图5的描述中所定义。

为了确定MEK抑制剂PD0325901(P)和TGFβ激酶/激活素受体样激酶(ALK5)抑制剂A83-01(A)对肝编程效率的作用，在第0天，将经GFH、H1AM和TBX3转染的人表达rtTET的ESC以约0.2×10⁶细胞/孔铺板在经matrigel包被的12孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。在铺板后的第1天至第7天添加PD0325901(0.5μM)、A83-01(0.5μM)或两者，以及多西环素。在铺板后的第13天，收集细胞以用于进行白蛋白(ALB)流式分析。如附图中所示，仅添加P或A显著提高表达ALB的细胞％(图6)。尽管P和A似乎没有显著的叠加效应，但是在肝诱导阶段中将两者都包括在内以确保由不同的人ESC/iPSC系进行一致的肝编程。

通过用GFH、H1AM和TBX3转染人表达rtTET的ESC来确定多西环素诱导的持续时间对肝编程的作用。在第0天，将经转染的细胞以约0.2×10⁶细胞/孔铺板在经matrigel包被的12孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。添加多西环素(1μg/ml)、P和A，持续0、2、4、6、8或10天。在铺板后的第12天，收集细胞以用于进行ALB流式分析。如图7A中所示，看起来存在用于肝编程转基因诱导的最佳时间窗口(4天的多西环素处理)。在不存在转基因表达的情况下，如图7B中所示没有观察到肝细胞样细胞，证明肝编程基因的必需性。在转基因表达的情况下，容易观察到具有多边形形状、清楚细胞核和紧密细胞-细胞接触的肝细胞样细胞。

为了确定环AMP类似物8-Br-cAMP对肝编程的作用，在第0天，将经GFH、H1AM和TBX3转染的人表达rtTET的ESC以约0.2×10⁶细胞/孔铺板在经matrigel包被的12孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。在铺板后的第1天至第7天，添加多西环素(1μg/ml)、P和A。在第7天移除多西环素、P和A之后，添加不同浓度的8-Br-cAMP以促进肝转变。在铺板后的第13天，收集细胞以用于进行ALB流式分析。如附图中所示，8-Br-cAMP的添加显著提高了肝编程，其中饱和浓度接近200μM(图8)。

通过用GFH、H1AM和TBX3转染人表达rtTET的ESC来确定初始铺板细胞密度对肝编程的作用。在第0天，将经转染的细胞以不同的细胞数目/孔铺板在经matrigel包被的12孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。在铺板后的第1天至第5天，添加多西环素(1μg/ml)、P和A。在第5天移除多西环素、P和A之后，添加8-Br-cAMP(200μM)以促进肝转变。在铺板后的第11天，收集细胞以用于进行ALB流式分析。如附图中所示，最佳肝编程需要合适的初始铺板细胞密度(图9)。较高的细胞密度培养物(例如，约0.3×10⁶细胞/孔)显著降低了肝编程效率。

通过用GFH、H1AM和TBX3转染人表达rtTET的ESC来确定肝编程期间ALB表达的动力学。在第0天，将经转染的细胞以约0.1×10⁶细胞/孔铺板在经matrigel包被的12孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。在铺板后的第1天至第5天，添加多西环素(1μg/ml)、P和A。在第5天移除多西环素、P和A之后，添加8-Br-cAMP(200μM)以促进肝转变。如附图中所示，在铺板后不同天数，收集细胞以用于进行ALB流式分析。如附图中所示，在铺板后的第9天至第11天，表达ALB的细胞％迅速提高(图10)。第11天之后，表达ALB的细胞％保持不变。这表明在这一方案下，在铺板后的约第11天完成从非肝细胞到肝细胞样细胞的转变。

包括3D培养有利于肝细胞存活和成熟。经编程的肝细胞在2D培养中表现出迅速退化(图11A)。特别地，与2D培养中的原代人肝细胞类似，在补充有胰岛素(0.5μg/ml)和地塞米松(0.1μM)的HMM中4天后，在第15天肝细胞的形态表现出显著退化。当在肝编程的第0天、第3天和第5天形成球状体时，其导致在第11天非常差的产率(hESC的输入∶第11天的肝细胞产出≈10∶1)。从肝编程的第7天有效地形成球状体，具有合理的产率(hESC的输入∶第11天的肝细胞产出≈1∶1)(图11B)。对于肝编程，在第0天，将经GFH、H1AM和TBX3转染的人表达rtTET的ESC以约0.4×10⁶细胞/孔铺板在经matrigel包被的6孔板上之补充有10μMHA100的mTeSR中。在铺板后的第1天至第5天添加补充有胰岛素(0.5μg/ml)、地塞米松(0.1μM)、人白血病抑制因子(hLIF：5ng/ml代替OSM)、多西环素(1μg/ml)、P和/或A的HMM。在第5天移除多西环素、P和/或A之后，添加补充有胰岛素(0.5μg/ml)、地塞米松(0.1μM)、hLIF(L，5ng/ml)、8-Br-cAMP(B，200μM)和抗坏血酸钠(AA，100μg/ml)(HMM+LBAA)的HMM以促进肝转变。为了制备球状体，将第7天的肝编程培养物每6孔板的孔用2ml在不含Ca²⁺和Mg²⁺之PBS中制备的0.5mMEDTA和0.5mMEGTA洗涤一次，并每孔用预热的1.5ml/孔之补充有0.5mMEGTA的0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37℃下解离6至7分钟。在解离之后，使用补充有10％FBS的HMM中和胰蛋白酶。收集细胞并用HMM在1200rpm下洗涤5分钟。为了球状体形成，将细胞重悬于HMM+LBAA(6孔板中的每4个孔约6ml)中并转移至经10％polyHema包被的T25瓶以防止细胞附着(每瓶约6ml)。将T25瓶置于细胞培养箱中15rpm下的摇床上。截止第9天，有效地形成球状体。为了防止球状体成块，于第9天向HMM+LBAA添加约3mg/ml的AlbumaxI或II(Invitrogen)。与2D培养类似，在第11天的3D球状体中，ALB阳性细胞％几乎接近饱和(图11C)。第11天之后，将球状体维持在补充有胰岛素(0.5μg/ml)和地塞米松(0.1μM)的HMM中以促进进一步的成熟(＞31天)，其中球状体逐渐收缩(比较第19天和第11天的球状体)表明细胞损失。

***

根据本公开内容，无需过度实验即可进行和实践本文中所公开并要求保护的所有方法。虽然已经依据一些优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但是对本领域技术人员明显的是，可对本文中所述的方法、方法的步骤或方法的步骤顺序进行改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，某些化学和生理学上均相关的物质可以替换本文中所述的物质，同时仍然获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的是，所有这样的类似替换和修改都被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.通过对干细胞进行正向编程来产生肝细胞的方法，其包括用包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和TBX3之肝细胞编程因子基因的至少一种外源表达盒转染所述干细胞，由此从所述干细胞的正向编程产生肝细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种外源表达盒与外部诱导型转录调控元件有效连接。

3.根据权利要求1所述的方法，其还包括使所述干细胞与MEK抑制剂和/或ALK5抑制剂接触。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述ALK5抑制剂是A83-01。

6.根据权利要求3所述的方法，其还包括使所述干细胞与环AMP类似物接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述环AMP类似物是8-Br-cAMP。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞或其后代细胞还包含含有与报道基因有效连接的肝细胞特异性转录调控元件的报道蛋白表达盒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肝细胞特异性转录调控元件是以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、载脂蛋白A-I或APOE。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝细胞包含一个或更多个肝细胞特征，所述肝细胞特征包括：

(i)表达一种或更多种肝细胞标志物，所述肝细胞标志物包括葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、醇脱氢酶1、I型精氨酸酶、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、肝特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或其组合；

(ii)葡萄糖-6-磷酸酶、CYP3A4、胆汁产生或分泌、尿素产生或者生物异源物质解毒作用的活性；

(iii)肝细胞的形态特征；或

(iv)免疫缺陷对象中的体内肝植入。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肝细胞特征是白蛋白表达。

13.根据权利要求1所述的方法，其还包括选择或富集肝细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在含有一种或更多种生长因子的培养基中培养所述干细胞或其后代细胞，所述生长因子包括制瘤素M(OSM)。

15.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述悬浮培养物维持在转瓶中。

17.根据权利要求16所述的方法，其中以约40rpm至70rpm运行所述转瓶。

18.根据权利要求15所述的方法，其中将所述悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。

19.根据权利要求1所述的方法，其包括所述肝细胞在于所述条件下培养后少于15天或约15天获得。

20.根据权利要求19所述的方法，其包括所述肝细胞在于所述条件下培养后少于10天或约10天获得。

21.评估化合物对肝细胞的药理学或毒理学作用的方法，其包括：

(a)使通过根据权利要求1所述的方法提供的肝细胞与所述化合物接触；以及

(b)测定所述化合物对所述肝细胞的药理学或毒理学作用。

22.肝细胞或干细胞，其包含：

(a)含有FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和TBX3的一种或更多种外源表达盒；以及

(b)含有与报道基因有效连接的肝细胞特异性启动子的报道蛋白表达盒。

23.包含一种或更多种外源表达盒的肝细胞或干细胞，其中所述一种或更多种外源表达盒包含FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和TBX3，并且至少一种所述外源表达盒与外部诱导型转录调控元件有效连接。

24.包含肝细胞的细胞群，其中至少80％的所述肝细胞包含一种或更多种外源表达盒，所述外源表达盒包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和TBX3的基因。

25.由干细胞产生肝细胞的方法，其包括：

(a)用至少包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和TBX3的肝细胞编程因子基因的至少一种外源诱导型表达盒转染所述干细胞；

(b)诱导所述至少一种外源诱导型表达盒表达；

(c)使所述干细胞与MEK抑制剂和/或ALK5抑制剂接触；以及

(d)使所述干细胞与环AMP类似物接触，由此从干细胞产生肝细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其还包括将所述干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。

Claims (26)

1.通过对干细胞进行正向编程来产生肝细胞的方法，其包括用包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和MAFB或TBX3之肝细胞编程因子基因的至少一种外源表达盒转染所述干细胞，由此从所述干细胞的正向编程产生肝细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种外源表达盒与外部诱导型转录调控元件有效连接。

3.根据权利要求1所述的方法，其还包括使所述干细胞与MEK抑制剂和/或ALK5抑制剂接触。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述ALK5抑制剂是A83-01。

6.根据权利要求3所述的方法，其还包括使所述干细胞与环AMP类似物接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述环AMP类似物是8-Br-cAMP。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞或其后代细胞还包含含有与报道基因有效连接的肝细胞特异性转录调控元件的报道蛋白表达盒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肝细胞特异性转录调控元件是以下的启动子：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、载脂蛋白A-I或APOE。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝细胞包含一个或更多个肝细胞特征，所述肝细胞特征包括：

(i)表达一种或更多种肝细胞标志物，所述肝细胞标志物包括葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、醇脱氢酶1、I型精氨酸酶、细胞色素p4503A4(CYP3A4)、肝特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或其组合；

(ii)葡萄糖-6-磷酸酶、CYP3A4、胆汁产生或分泌、尿素产生或者生物异源物质解毒作用的活性；

(iii)肝细胞的形态特征；或

(iv)免疫缺陷对象中的体内肝植入。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肝细胞特征是白蛋白表达。

13.根据权利要求1所述的方法，其还包括选择或富集肝细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在含有一种或更多种生长因子的培养基中培养所述干细胞或其后代细胞，所述生长因子包括制瘤素M(OSM)。

15.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述悬浮培养物维持在转瓶中。

17.根据权利要求16所述的方法，其中以约40rpm至70rpm运行所述转瓶。

18.根据权利要求15所述的方法，其中将所述悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。

19.根据权利要求1所述的方法，其包括所述肝细胞在于所述条件下培养后少于15天或约15天获得。

20.根据权利要求19所述的方法，其包括所述肝细胞在于所述条件下培养后少于10天或约10天获得。

21.评估化合物对肝细胞的药理学或毒理学作用的方法，其包括：

(a)使通过根据权利要求1所述的方法提供的肝细胞与所述化合物接触；以及

(b)测定所述化合物对所述肝细胞的药理学或毒理学作用。

22.肝细胞或干细胞，其包含：

(a)含有FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和MAFB或TBX3的一种或更多种外源表达盒；以及

(b)含有与报道基因有效连接的肝细胞特异性启动子的报道蛋白表达盒。

23.包含一种或更多种外源表达盒的肝细胞或干细胞，其中所述一种或更多种外源表达盒包含FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和MAFB或TBX3，并且至少一种所述外源表达盒与外部诱导型转录调控元件有效连接。

24.包含肝细胞的细胞群，其中至少80％的所述肝细胞包含一种或更多种外源表达盒，所述外源表达盒包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和MAFB或TBX3的基因。

25.由干细胞产生肝细胞的方法，其包括：

(a)用至少包含编码FOXA2、GATA4、HHEX、HNF1A和MAFB或TBX3的肝细胞编程因子基因的至少一种外源诱导型表达盒转染所述干细胞；

(b)诱导所述至少一种外源诱导型表达盒表达；

(c)使所述干细胞与MEK抑制剂和/或ALK5抑制剂接触；以及

(d)使所述干细胞与环AMP类似物接触，由此从干细胞产生肝细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其还包括将所述干细胞或其后代细胞作为悬浮培养物培养。