CN109983118B - 以rna通过干细胞分化诱导肝细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以前所未有的效率和功能由人类诱导的多能干细胞诱导或产生肝细胞的新颖方法。本发明的核心在于在多个关键分化决定点使用实验上发现的mRNA以先前未知的方式沿多能至中内胚层至内胚层至肝细胞的路径来实现。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年11月16日提交的美国临时专利申请第62/423,113号的权益，所述申请以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及利用细胞密度、试剂浓度和mRNA的特定组合的特定组合和范围通过动力学控制的细胞生长方法引导肝细胞自多能干细胞的诱导。
背景技术
在人类干细胞的产生和随之而来的分化方面的最近成果已改变关于细胞命运的可塑性、人类疾病模型和临床疗法的范例。由体细胞制得的胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)二者可分化成一系列日益增加的不可与其对应初生细胞区分的特定细胞类型。因此，干细胞对于研发新的人类细胞疗法来说非常有前景。iPSC在个体化用药领域中展示特定潜力，归因于细胞的无限可用性、获得细胞的程序的非侵袭性和对个别患者免疫匹配各治疗的可能性，从而给予免疫抑制药物自由。
大批研究经费花费在研发治疗或预防各种人类疾病的细胞置换疗法上。举例来说，常常导致晚期肝功能衰竭的如肝纤维化和肝硬化的肝病可通过移植捐赠的人类肝脏器官或器官衍生的肝细胞治疗。然而，发现可靠的供体肝脏供应源仍然是难以克服的障碍。现在，许多学术和工业群体已研发使用多种呈重组蛋白形式的重组生长因子引导ESC或iPSC变为肝细胞的方式，此为昂贵的且难以控制有效剂量。
为缓解成本和不一致性的负担，一些研究者已尝试寻找可作为生长因子受体的激动剂或拮抗剂影响信号路径的小分子。尽管通常比生长因子更便宜，但小分子的一个主要不足的处为其可能对非预期标靶发挥的非特异性影响，所述非预期标靶如细胞膜结合受体、胞内细胞器或基因组组分等。
典型分化方案的另一关键组分为培养细胞的介质，所述介质可由营养素(脂质、氨基酸、碳水化合物、维生素等)、适当浓度的盐、pH缓冲剂、关键元素和如胰岛素或血清白蛋白的常见蛋白因子组成。不同类型的细胞具有不同的营养素和介质组分需求且由用于信号传递的细胞类型特异性生长因子和小分子进一步复杂化。
在干细胞衍生的组织细胞的临床应用中，所建立的分化介质的大多数组分需要在当前良好作业规范(cGMP)规章下的个体认证；例如，需要通过专用程序制造生长因子且需要个体认证。
发明内容
本发明提供通过调节细胞生长动力学和相关参数诱导干细胞分化的方法，其中细胞密度、试剂浓度和mRNA的组合的特定组合用于控制分化/诱导方向。
为实现目的且根据本发明的目的，如本文所实施和广泛地描述，本发明的一个方面涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
在一个实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第一组合包含Sox17mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2mRNA和Sox17mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2mRNA、Sox17mRNA、GATA4mRNA和GATA6mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离朝多能状态向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第二组合包含HexmRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第二组合包含Tbx3mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第二组合包含Tbx3mRNA和Hex mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第二组合包含Tbx3mRNA、GATA4mRNA、GATA6mRNA和Hex mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第三组合包含HNF1amRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第三组合包含HNF4amRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述mRNA的第三组合包含HNF4amRNA、HNF1amRNA、HNF6mRNA、CEB/Pa mRNA和CEB/Pb mRNA。
在另一实施例中，本发明涉及一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述起始细胞收集自体液或组织。
本发明的一个方面涉及通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离朝多能状态向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
本发明的一个方面涉及一种用于治疗疾病、病症或畸形的组合物，其包含通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
本发明的一个方面涉及一种治疗疾病、病症或畸形的方法，其包含以下步骤：向有需要的个体投与以下中的至少一种：通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞；和用于治疗疾病或畸形的组合物，其包含通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗疾病、病症或畸形的方法，其包含向有需要的个体投与以下中的至少一种的步骤：通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞；和用于治疗疾病或畸形的组合物，其包含通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述细胞衍生自接受者个体。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗疾病、病症或畸形的方法，其包含向有需要的个体投与以下中的至少一种的步骤：通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞；和用于治疗疾病或畸形的组合物，其包含通过诱导干细胞分化成肝细胞的方法获得的细胞，所述方法包含以下步骤：(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞，其中所述起始细胞收集自接受者。
本发明的一个方面涉及一种由诱导的多能干细胞产生分化肝细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养所述诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层细胞；(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞；(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞；和(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
本发明的一个方面涉及一种由诱导的多能干细胞产生内胚层细胞的方法，其包含以下步骤：(a)在分化条件下培养所述诱导的多能干细胞作为起始细胞；(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；和(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用内胚层特异性mRNA进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层。
在一个方面中，本发明提供涉及控制细胞密度和分裂速率以获得所需分化结果的能够实现的新颖方法。在一些方面中，方法包括例如时序、添加顺序、RNA剂量和在RNA转染期间不同RNA之间的比值以及其重复持续时间或数目的优化。在一些方面中，本发明进一步涉及培养容器表面和如氧浓度的环境条件的选择。本发明进一步提供选择所需细胞或提高其在总群体中的百分比的工艺和方法，以及冷冻保存和重新培养分化细胞的方法。本发明的方法包括通过3维阶段使肝细胞成熟化的简化方案和有效方法。在一些方面中，由操控干细胞产生的成熟分化肝细胞分泌肝糖。在一个方面中，本发明提供一种新近研发的方案，所述方案产生活体内起作用的更加功能性和更加成熟的肝细胞。在一些方面中，本发明的成熟肝细胞适用于各种肝病、病状和损伤的疗法。
在某些实施例中，通过干细胞诱导产生成熟和功能性肝细胞的例示性方法可由如本文中的实例所描述和阐述的方案和步骤表示。通过以适当剂量和递送条件使mRNA与关键命运变化点处的细胞接触，在不使用大量生长因子下获得极高效率和较低成本。因为借助于编码功能性蛋白，mRNA在引导细胞和发育事件中更具特异性，所以所公开的方法在产生人类肝细胞中比任何已知方法都稳固地多，从而开辟一种针对治疗肝病、病状和损伤的人类疗法的方法。
在一些方面中，本发明还提供在不使用或减少使用减少量的小分子下实现细胞命运确定的新颖方法，所述小分子作为生长因子受体的激动剂或拮抗剂影响信号路径，其纯度、稳定性和毒性常常变化。
在本发明的另一方面中，方法提供以下主要益处：通过使用适当供应的分化引导基因的mRNA简化建立分化培养基。此与通过每次去除或添加一种组分进行的“分化培养基”的费力测试的先前方法相反。在一个方面中，mRNA与适当培养基以及本文所公开的其它参数的最佳组合可简化产生分化功能性肝细胞的方法且为本发明的整体部分。
另外，其它方法还依赖于必须经历认证和/或必须使用GMP实践产生的动物产物，如血清或基质胶。本发明的另一方面为创建主要基于适合于均匀认证和质量控制方法的单一类型的分子的新方法。
本发明提供利用在组织特异性分化中的主控基因或关键转录因子的高效和受控良好表达的分化方法。更具体来说，这些因子呈通过所提供的范例表明的经适当修饰和纯化的mRNA分子形式引入多能干细胞中。
在一个方面中，本发明提供一种诱导细胞分化的方法，其包含：利用具有转活化域的常规转录因子(TF)之间的关键细胞命运因子和融合物，其经优化以用于引导干细胞朝向不同类型的细胞；通过产生适当转基因表达量的方法以优选密度将作为合成信使RNA(mRNA)的这些因子引入培养的多能干细胞中；将细胞维持在经优化的条件下以产生高效特异性分化，其中诱导干细胞或祖细胞的多能状态或先驱状态朝向特定谱系或组织细胞类型。
在另一方面中，本发明提供用于改变干细胞或祖细胞的多能状态或先驱状态朝向特定谱系或组织细胞类型的方法，所述方法包含以下中的至少一种：产生表达关键细胞命运基因的干细胞(总称为干细胞)，其包括具有转活化域的常规转录因子(TF)之间的关键细胞命运因子和融合物，其经优化以用于引导干细胞朝向不同类型的细胞；通过产生适当转基因表达量的方法以优选密度将作为合成信使RNA(mRNA)的这些因子引入培养的多能干细胞中；将细胞维持在经优化的条件下以产生高效特异性分化。
在一个方面中，本发明提供一种用于由iPSC产生分化肝细胞的方法，所述方法包含：a)在如本文所公开的实验验证的条件下培养iPSC作为起始细胞，制备作为起始细胞的细胞用于分化；b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；c)以所公开的剂量且在特定时间窗内使用内胚层特异性基因的mRNA通过进行培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层；d)进一步使用另一基因的mRNA分子或基因的mRNA分子的组合通过转染来引导内胚层细胞朝向肝祖细胞；e)进一步用又一基因的mRNA或基因的mRNA的组合使肝祖细胞成熟化为肝细胞；和f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得肝细胞。
在一个方面中，本发明提供一种由iPSC产生内胚层细胞的方法，所述方法包含：a)在如本文所公开的实验验证的条件下培养iPSC作为起始细胞，制备作为起始细胞的细胞用于分化；b)诱导起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层；c)以所公开的剂量且在特定时间窗内使用内胚层特异性基因的mRNA通过培养细胞转染来引导分化细胞朝向内胚层。
本发明的其它目标和优势将部分地阐述于下文描述中，且部分地显见于所述描述中，或可通过本发明的实践来习得。本发明的目标和优势将借助于随附权利要求书中所特定指出的元素和组合来实现和获得。
应了解，前文一般描述与以下具体实施方式仅为例示性和解释性的且不限制所要求的本发明。
并入此说明书中且构成此说明书的一部分的附图说明本发明的若干实施例，且连同描述一起用以阐明本发明的原则。
附图说明
专利或申请档案含有至少一个彩制图式。在申请且支付必要费用后，专利局将提供具有彩色图式的本专利或专利申请公开案的复本。
参考附图自以下具体实施方式，本发明的前述方面和优势可变得显而易见，其中：
图1A展示来自不同起始密度的内胚层细胞且说明内胚层诱导的例示性实施例。
图1B展示通过使用各种密度(例如，如实例中所述的由低至高的密度)的Sox17mRNA自iPSC诱导的内胚层细胞且说明内胚层诱导的例示性实施例。
图2展示形成集群的自不同内胚层细胞密度起始的肝祖细胞且说明肝原始诱导的例示性实施例。图2A展示与诱导相关的细胞密度/集群的例示性视图。图2B展示与诱导相关的细胞密度/集群的例示性视图。图2C展示与诱导相关的细胞密度/集群的例示性视图。
图3展示自单层培养物中的肝祖细胞直接衍生的肝细胞且说明肝细胞诱导的例示性实施例。
图4展示成熟化为肝细胞的呈3维(3D)球体生长的肝细胞祖细胞，且说明呈3D球体的肝细胞成熟的例示性实施例。
图5展示对肝糖(右侧的PAS)呈阳性的呈肝细胞球体的细胞(左侧的H&E)且说明起分泌肝糖作用的呈3D形式的肝细胞的例示性实施例。图5A展示肝细胞/肝糖的例示性视图。图5B展示肝细胞/肝糖的例示性视图。
图6展示呈现肝细胞标记物的呈肝细胞球体的细胞且说明呈现特异性细胞标记物的衍生自人类iPSC的内胚层和肝细胞的例示性实施例。图6A展示AFP染色且图6B展示A1抗胰蛋白酶。
图7展示自再接种为单层培养物的3D肝祖细胞球体直接衍生的肝细胞且说明以下例示性实施例：通过3D球体产生的人类肝细胞可再接种为单层且呈现成熟肝细胞形态。
图8展示使用MaxCyte STX转染起始群体中的两百万iPSC，所述MaxCyte STX设定在Optimization 2,OC-100加工组装。使用EVOS成像系统在10×下转染后24小时采取相片。图8A展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。图8B展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。图8C展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。图8D展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。图8E展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。图8F展示与例示性转染相关的iPSC的例示性视图。
具体实施方式
当描述本发明时，本文中未定义的全部术语具有其在所属领域中认识的常见含义。在以下描述具有本发明的具体实施例或特定用途范围内，打算仅为说明性的且不限制所要求的发明。以下描述打算涵盖包括于本发明的精神和范围中的所有替代方案、修改和等效物。
基于在肌肉(MyoD)、眼睛(Pax6)和发生生物学的其它领域中的研究，已总体接受以下概念：“主控”基因，即一个关键基因(通常为转录因子基因，有时少数一起作用的基因)在发育期间可决定细胞和组织的命运和最终整个器官的形成。山中伸弥(ShinyaYamanaka)的发现：分化细胞可通过表达在干细胞中表达的选定组的转录因子恢复至多能状态表明少数关键转录因子驱动细胞通过冗长多阶段命运变化的能量。其它群体对iPSC产生的研究扩增再程序化因子的选择且展示出于程序化的目的转录因子选择可容许一些变化。在山中的原始研究中，再程序化因子的表达通过应用整合于基因组中的病毒载体实现，因为需要这些因子的延长表达以影响细胞变形。基因组的伴随修饰表示iPSC的治疗性应用的重要障碍，同时自整合病毒盒的再活化表达的可能性甚至对于体外研究来说也是关注点。如由当前发明人群组最近公开的将mRNA转染应用于再程序化为尤其吸引人的，因为此系统允许再程序化混合物的表达和甚至仅通过改变添加至细胞培养基中的转录物类型在短时间范围内调节个体组分因子。一旦终止特定因子的转染，靶细胞内的异位表达即由于细胞质内mRNA的快速衰减而迅速停止。尽管mRNA不继续留存于靶细胞中，但其如在转染DNA和整合病毒载体的情况下在无需速率限制核易位下于细胞质中直接翻译的能力远远补偿mRNA的短暂半衰期从而引起高效表达但很好地在小时间窗口内，这对于细胞命运确定来说至关重要。
当用于细胞命运变化时，如游离型质体的长效DNA载体需要断奶以降低任何无规基因组整合的风险。如仙台病毒(Sendai virus)或委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equineencephalitis，VEE)病毒的RNA病毒或病毒衍生物甚至在经剥除成为经修饰的非感染性RNA复制子之后仍携带易于与隐藏在宿主基因组中的病毒元素再结合的病毒元素。在未频繁发现呈负面数据形式的证明下始终难以完全确定细胞不含病毒载体。本发明公开多个发明步骤，旨在将基于mRNA的细胞命运确定的优势应用于引导分化。综上所述，本发明教示在简化方法中的单轮或多轮异位转录因子表达以引导细胞分化。
但是，基于mRNA的干细胞分化存在技术壁垒。并非所有干细胞类型和培养基均同等有助于有效的mRNA递送，且这目前是基于mRNA的分化的障碍。还通常已知，干细胞，尤其大多数人类干细胞系在未形成抗转染贴片下相对难以培养。本发明的教示内容的部分为多能干细胞可在大多数细胞可用经修饰的mRNA转染的条件下生长。在另一实施例中，将以能够发挥主控基因影响同时在面对由细胞命运改变过程产生的促凋亡和细胞生长抑制力时支撑靶细胞的存活率的含量将RNA和转染剂(两者均有相关毒性)的剂量提供于细胞。
因此，鉴于与先前已知的干细胞分化程序相关的问题，本文所述的新颖方法、材料和方案自iPSC或ESC产生不同细胞类型，具有改良的所得细胞的过程效率和质量。本发明通过增强递送至标靶干细胞的TF mRNA实现显著改良。本发明还提供支持在不使用饲养细胞或任何其它可能异种污染剂下自人类干细胞产生无占据面积组织细胞的新颖方案。新的方案扩展经修饰的mRNA的益处且帮助清除干细胞衍生技术的治疗性应用的剩余障碍。
鉴于自多能至末端分化状态的分化常常需要多个步骤，需要若干周至甚至若干月的时间范围，基于生长因子的步进式策略本质上低效且繁琐。因此，本发明的实施例在导引肝细胞产生中根本上去除对生长因子的需要。
更具体来说，本发明涉及通过以下改变干细胞或祖细胞朝向特定谱系或组织细胞类型的多能状态或先驱状态的方法：表达关键细胞命运基因(总为干细胞)，包括具有转活化域的常规转录因子(TF)之间的关键细胞命运因子和融合物，其经优化以用于引导干细胞朝向不同类型的细胞；通过产生适当转基因表达量的方法以优选密度将作为合成信使RNA(mRNA)的这些因子引入培养的多能干细胞中；将细胞维持在经优化的条件下以产生先前未获得的有效特异性分化。通过引入mRNA表达的因子还可包括生长因子、细胞因子、激素、信号肽和影响分泌因子或修饰酶的其它细胞命运。使用类似程序，可在细胞状态过渡下将微RNA(miRNA)或其它非蛋白质编码的RNA引入细胞中以便引导分化。与所属领域中已知的其它方法相比，本发明显著降低涉及干细胞分化成肝细胞的时间、成本和工作。
本发明描述一种改变干细胞或祖细胞朝向特定谱系或组织细胞类型的多能状态或先驱状态的方法，其包含以下中的至少一种：表达关键细胞命运基因(共同称为干细胞)，包括关键细胞命运因子，其经优化以用于引导干细胞朝向不同类型的细胞；通过产生适当转基因表达量的方法以优选密度将作为合成信使RNA(mRNA)的这些因子引入培养多能干细胞；将细胞维持在经优化的条件下以引起特异性分化的高效。
在某些实施例中，提供完全稳定的扩增iPSC。
在某些实施例中，不需要清除游离基因体或RNA病毒(例如仙台)，其可能需要10+次iPSC后分离。
在某些实施例中，方法不含进料器。
在某些实施例中，方法不含异种，包含所有合成或人类试剂且不含非人类动物衍生的组分。
在某些实施例中，方法不含占据面积：不具有DNA无规整合成基因组(如游离型常常发生)。
在某些实施例中，方法借助于患者特异性起始组织和/或基因组编辑获得完全自定义的基因背景。
在另一实验中，如表1中概述的方法的替代方案，呈球体生长于悬浮液中的iPSC细胞在未于板表面上接种的情况下使用电穿孔(例如使用MaxCyte STX电穿孔仪)直接转染。在一个实施例中，呈球体的2百万起始iPSC于悬浮液中用不同mRNA，例如Sox17或Pax6转染或模拟转染。在图8中测试的mRNA量为2500ng。细胞随后在Sox17转染的情况下生长于NBM，或在Pax6转染的情况下生长于具有KSR的MEMalpha。如果过渡耗费较长时段，那么转染可重复1次、2次、3次、4次、5次或甚至更多次。结果，在Sox17mRNA的第1次转染之后，细胞集群变为显著较小和较不紧凑的球体，损失确定“边缘”或外部边界。相比之下，模拟转染的球体维持轮廊分明，在2D相片中清晰展示可见的外部“边缘”。未经转染或经模拟转染的iPSC的较小球体具有透明外观，而较大球体由于细胞层较厚看起来较不透明。相比之下，经Pax6(神经分化TF)mRNA转染的iPSC球体朝向外胚层(即神经祖细胞)发展，其球体与经模拟转染的iPSC球体相比变得更暗且具有更不清晰的“边缘”，但与经Sox17转染的iPSC球体相比尺寸更大且具有更加确定的边界。
通过相同原理和类似方法，如内胚层细胞的生殖层特异性中间细胞和如肝细胞祖细胞、胰脏祖细胞等的更加下游的中间细胞也可用呈球体的其它TF mRNA转染。此方式转染的细胞对来自小分子、生长因子或细胞培养物中的其它元素的毒性更具有抵抗性，且一般来说在分化方面应比使用化学试剂的2D转染更加有效。未见于科学出版物中的此观测结果是在电穿孔设备的测试期间无意获得，且作为本发明的部分充当能够实现的方法。
定义
为促进对本发明的理解，下文定义多个术语。本文所定义的术语具有如本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。如“一(a)、(an)”和“所述”的术语并不打算仅指单数实体，反而包括可用于说明的具体实例的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施例，但其使用不对本发明定界，除了如权利要求书中所概述。
术语“肝细胞样细胞”打算意指与肝细胞共享特征的细胞。肝细胞样细胞通过形态特征以及通过特异性标记物特征进一步界定。因为诱导的多能干细胞衍生的肝细胞样细胞具有与肝细胞的类似特征(包括标记物和激素特征)，所以诱导的多能干细胞衍生的肝细胞样细胞可与诱导的多能干细胞衍生的肝细胞(liver cell)或肝细胞(hepatocytes)互换使用。
“胚状体”是指衍生自多能细胞的细胞的聚集体，其中细胞聚集可通过防止细胞粘附至表面以形成典型的集落生长的任何方法起始。如本文所用，“胚状体”是指多能干细胞的三维球状体聚集体，包括但不限于衍生自来自哺乳动物来源的胚胎的囊胚阶段的胚胎干细胞。胚状体可由通过所属领域中一般已知的任何技术衍生的胚胎干细胞形成，所述技术包括但不限于为获得诱导的多能干细胞的体细胞的体细胞核转移或再程序化。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”是指衍生自体细胞(例如成人体细胞)的多能干细胞。诱导的多能干细胞在其形成任何成人细胞类型的分化能力中类似于胚胎干细胞，但不衍生自胚胎。
如本文所用，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括子代。还应理解由于有意或无意突变，所有子代的DNA含量可能不会精确相同。包括具有与最初转型细胞中所筛检的相同功能或生物特性的变异子代。
如本文所用，“组合物”是指活性剂与至少一种惰性(例如，可侦测试剂或标记)或活性(例如佐剂)的其它化合物或分子的组合。
如本文所用，“培养”是指将细胞维持在其中所述细胞可作为细胞群增殖且避免衰老的条件下。“培养”还可包括其中细胞也或可替代地分化的条件。
如本文所用，“差异表达”是指相比于通过正常或对照细胞中的相同基因或调节区产生的RNA水平，RNA的差异产生，所述RNA包括自基因组或由基因编码的蛋白质产物的基因或调节区转录的mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA和piRNA。在另一情形中，“差异表达”还涉及细胞或组织中的核苷酸序列或蛋白质，所述核苷酸序列或蛋白质相比于正常或对照细胞具有不同的时间和/或空间表达图谱。
如本文所用，“过度表达(overexpressed)或(overexpression)”是指相比于正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平，由基因编码的RNA或蛋白质产物的提高的表达水平。
如本文所用，“表达不足(underexpressed)或(underexpression)”是指相比于正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平，由基因编码的RNA或蛋白质产物的降低的表达水平。
如本文所用，“分化(differentiate)或(differentiation)”是指前体或祖细胞(即肝祖细胞)分化成特定细胞类型(例如肝细胞)的过程。
如本文所用，“有效量”是足以实现细胞、组织、系统、动物或人类的有益或所需生物、情感、医药或临床反应的量。有效量可以一或多次投药、施用或剂量形式来投与。所述术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
如本文所用，在细胞的情形下的“扩增(expansion)或(expanded)”是指特征细胞类型或可能相同或可能不相同的来自初始细胞群的细胞类型的数目的增加。用于扩增的原始细胞不必与由扩增产生的细胞相同。举例来说，扩增细胞可通过原始细胞群的离体或体外生长和分化产生。
如本文所用，“表达”是指聚核苷酸转录成RNA转录物的过程。在mRNA和其它经翻译的RNA物种的情形下，“表达”也指经转录的RNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的一或多个过程。
如本文所用，“诱导的多能干细胞”或“iPS细胞”或“iPSC”是指人工衍生(非天然衍生)自非多能细胞的能够分化成多个细胞类型的细胞。
如本文所用，“不含整合的iPS细胞”是指不含整合于非多能细胞的基因组中的外源性转基因的iPS细胞。
如本文所用，“分离”意指与成分、细胞和其它者分离，其中聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常天然与的相关。非天然产生的聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使其与其天然产生的对应物区分。
如本文所用，“浓缩”是指包括但不限于聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段的分子可与其天然产生的对应物区分，原因在于每体积的分子浓度或数目大于其天然产生的对应物的浓度或数目。
如本文所用，“稀释”是指包括但不限于聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段的分子可与其天然产生的对应物区分，原因在于每体积的分子浓度或数目小于其天然产生的对应物的浓度或数目。
如本文所用，“分离”是指与原始源或群体物理分开的状态，使得可不再考虑分离的化合物、试剂、颗粒或分子为原始源或群体的部分。
如本文所用，出于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农畜、非人类灵长类动物和动物园、运动或宠物动物，如但不限于狗、马、猫和牛。
如本文所用，“干细胞”是指能够分化成多个细胞类型的任何自身更新分化全能、多能细胞或多潜能细胞或祖细胞或前体细胞。
如本文所用，“分化全能”是指细胞，加胚胎外或胎盘细胞可分化且在生物体中产生所有细胞类型。
如本文所用，“多能”是指细胞可分化且产生构成生物体的所有细胞类型，所述细胞类型包括任何胚胎或成人细胞类型，不同的处在于胚胎外或胎盘细胞。
如本文所用，“多潜能”是指细胞可产生超过一种细胞类型，但在其可产生的细胞类型方面比多能细胞更加受限。
如在本文中可互换地使用，“个体(subject)”、“个体(individual)”或“患者”是指脊椎动物生物体。
如本文所用，“基本上纯细胞群”是指具有指定细胞标记物特征和为构成总细胞群的细胞的约50％、优选约75-80％、更优选约85-90％、和最优选至少约95％的分化潜能的细胞群。因此，“基本上纯细胞群”是指含有在指定分析条件下不呈现指定标记物特征和分化潜能的细胞的少于约50％、优选少于约20-25％、更优选少于约10-15％、且最优选少于约5％的细胞群。
如本文所用，“前分化”是指前体或祖细胞(例如多能干细胞)分化成可能进一步分化为最终效应细胞(例如肝细胞)的中间细胞类型，例如肝祖细胞的过程。
如本文所用，“治疗性”是指治疗、治愈和/或改善疾病、病症、病状或副作用或是指降低疾病、病症、病状或副作用的进展速率。所述术语在其范围内还包括改善正常生理功能、缓解性治疗和疾病、病症、病状或副作用的局部补救。
如本文所用的术语“治疗(treating)和(treatment)”总体上是指获得所需药理和/或生理效果。所述效果就预防或部分预防疾病或其症状或病况来说可具预防性，且/或就部分或完全治愈疾病、病状、症状或可归因于所述疾病的不良影响来说可具治疗性。如本文所用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物，尤其人类的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在易患所述疾病但尚未诊断患有所述疾病的个体中发生；(b)抑制疾病，即遏制其发展；或(c)减轻疾病，即缓和或改善疾病和/或其症状或病状。如本文所用的术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施两者。需要治疗者包括已患有病症者以及待预防病症者。
如本文所用，“预防性”是指在疾病或病状发生之前(即使未诊断)或在疾病或病状仍处于亚临床阶段时妨碍或阻止疾病或病状。
如本文所用，“活性剂”是指在生物学上具有活性或以其它方式诱导对投与个体的生物或生理影响的物质、化合物或分子。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂，其中活性剂、本发明的软骨细胞或含有本发明的软骨细胞的组合物与其结合投与且其经联邦或州政府的监管机构批准或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或一般认可用于动物和/或人类的药典中。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
细胞类型
例示性细胞类型可包括例如内胚层细胞、肝祖细胞和肝细胞。
用于培养容器的合适表面的范例包括但不限于玻璃连结蛋白、E-钙粘附蛋白、用于iPSC的II或基质胶，包括但不限于用于内胚层的基质胶，且包括但不限于用于肝祖细胞的基质胶或胶原蛋白。
在一个方面中，用于去分化或再程序化体细胞的例示性方法可包括使用选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28的合成mRNA再程序化因子和转活化域中的任何一或多个，其中体细胞经再程序化或去分化。用于IPSC调节的方法和组合物描述于USSN 13/893,166和USSN 14/292,317中，其内容以引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，存在用于使用悬浮液细胞培养物的方案，且低细胞附着培养盘和容器可用于此类悬浮培养物。
在某些实施例中，可针对最佳诱导条件调节如氧浓度的环境条件。
在某些实施例中，提供选择所需细胞或提高其在总细胞培养物群体中的百分比汇合或细胞密度的工艺和方法。
在某些实施例中，提供冷冻保存肝细胞样细胞的方法。在一个实施例中，低温保藏一些分化细胞以实现储存期间的最佳细胞存活率。在一些实施例中，可将HSA和DMSO添加至培养基中以提高储存期间的细胞存活率。在一些实施例中，例如可以使用培养基中的具有10％DMSO的2.5％HSA。可使用此应用优化细胞数量以进一步提高储存的存活率。
还提供再培养分化细胞方法。细胞可在大多数可在市面上购得的培养容器中再培养：例如T75烧瓶、T25烧瓶、6孔板、96孔板。细胞可以不同细胞密度再培养以用于不同应用。
在某些实施例中，本发明还提供用于在处理整个分化过程期间控制对细胞的物理应激从而提高存活率的方法。在分化期间某些细胞类型极小，如iPSC。这些小细胞对离心力极其敏感。iPSC对过高离心力极其敏感。在分化期间一些细胞类型极粘，如iPSC和内胚层阶段细胞。这些细胞对剪切力极其敏感。当处理这些细胞时，使用10mL吸管以避免使用任何小尖端且避免上下反复移液细胞。为维持，可将这些细胞培养为群落且随后解离为集群代替单细胞。为分化，如果需要单细胞，那么我们可以在细胞分离之前结束解离，去除解离溶液，且使残余解离溶液进一步解离细胞。此方案常用于细胞培养。
鉴于说明书内所引用的参考文献的教示内容，最彻底理解本说明书。说明书内的实施例提供本发明的实施例的说明且不应视为限制本发明的范围。熟练技术人员容易认识到本发明涵盖许多其它实施例。在本发明中所引用的所有公开案和专利均以全文引用的方式并入。以引用的方式并入的材料达到与本说明书矛盾或不一致的程度时，本说明书将替代任何此类材料。然而，本文中任何参考文献的引用并非承认此类参考文献为本发明的现有技术。
除非另外指示，否则本说明书，包括权利要求书中所使用的表述成分数量、反应条件等的所有数字均应理解为在所有情况下皆由术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则数值参数为近似值且可视试图通过本发明获得的所需特性而变。至少且不试图等效物原则的应用限制为权利要求书的范围，各数值参数应根据有效数字的数目和普通四舍五入方法来解释。
当与术语“包含”结合用于权利要求书和/或说明书中时，词语“一(a/an)”的使用可意指“一个(one)”，但其也与“一或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义相符。尽管本发明支持指代仅替代和“和/或”的定义，但除非明确指示为指代仅替代或替代相互排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”。
除非另外指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指所述系列中的每一要素。所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所描述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物打算由以下权利要求书涵盖。
除非另外规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然类似或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现对优选方法和材料加以描述。
考虑本文中所公开的本发明的说明书和实践，所属领域的技术人员将清楚本发明的其它实施例。仅希望说明书和实例被视为例示性的，其中本发明的真正范围和精神通过以下权利要求书指示。
实例
现参考以下实例描述本发明。仅出于说明的目的提供这些实例，且本发明不限于这些实例，而是涵盖由于本文提供的教示显而易见的变化形式。
在一些用于产生成熟分化肝细胞的实施例中，例示性参数提供于表I中，所述参数包括起始细胞、培养容器、涂料、解离试剂、培养基名称和主要组分、例示性6孔板的接种密度和氧含量。
表1：肝细胞分化
实例1：自iPSC产生内胚层细胞
将iPSC接种于标准尺寸6孔细胞培养板(约9.5cm2生长面积/孔)或标准尺寸12孔细胞培养板(约3.8cm2生长面积/孔)中以开始分化。其它尺寸的培养容器任选地也是可适用的且有时归因于使用试剂和时间的更高效率可比6孔或12孔板更优选。
在(可在市面上购得的标准)6孔板中，已成功使用具有1×105至4×105/孔的群体规模的细胞。当存在足够具有轮廊分明的清晰边缘的典型iPSC群落时，认为iPSC准备分化，其中细胞为紧凑的且群落未过度生长。当本发明的iPSC株与通过使用其它方法的其它者产生的iPSC株相比时，证明使用这些准则产生的本发明的iPSC的质量对于分化来说至关重要。
诱导在此阶段的iPSC分化成中内胚层谱系细胞。发现悬浮液培养系统极其适用于在此阶段的规模扩大，尽管用于分化的最新方案倾向于使用附着单层细胞。发现用于诱导的生长于悬浮液中的iPSC对化学毒性更具有抵抗性且在后续阶段更易于再接种。超低附着板(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))或其它低附着板用于促进iPSC悬浮液细胞生长。
当需要传代iPS细胞时，重要的为用引起低细胞毒性且产生更小iPSC集群的方案解离iPSC群落，所述iPSC群落可在需要悬浮液培养时迅速形成球体。在37℃下使用TripLETM(赛默飞世尔(ThermoFisher))、Accutase(生命技术公司(Life Technology))或通过用DPBS中的0.1mM、有时0.5mM或1mM EDTA解离的EDTA(飞世尔科技(Fisher Scientific))解离iPSC，历时5分钟。成功使用各种解离时间，包括在1至2分钟，和有时对此步骤高达10至20分钟。在一些实施例中，解离时间可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25分钟，或在任何两个所述时间之间的任何时间范围内。
对于培养基来说，用10-50uM胰岛素和5％KSR测试MEMa、DMEM/F12和DMEM B27且在此分化阶段获得所需要的结果。随后通过GSK3抑制剂，如CHIR99021、CHIR98014、BIO或GSK抑制剂IX和SB-216763的存在诱导iPSC离开多能阶段且朝向中内胚层分化，所述抑制剂去抑制Wnt、BMP4和活化素A路径基因的功能。在一些方面中，胰岛素的浓度可为例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50uM，或在任何两个所述浓度之间的任何值或范围内。GSK3抑制剂在1天、2天、3天时间窗中进行且在选择时间和例如5mM、8mM、10mM等的抑制剂浓度时，使用FoxA2、CXCR4阳性细胞计数作为质量分析。
在一个实验中，细胞随后用Stemgent转染剂(Stemgent)以约20纳克/孔的剂量用FoxA2mRNA和/或Sox17mRNA转染。还进行包括GATA4mRNA和/或GATA6mRNA的此转染，且使用Stemgent转染剂或其它可在市面上购得的转染试剂有时以高10倍的mRNA剂量重复3次、4次、5次和6次。在此阶段的细胞展示相比于间叶细胞更接近上皮细胞的形态，其衍生自来自不同mRNA转染次数和起始密度的iPSC(图1)。
在另一实验中，如表1中概述的方法的替代方案，呈球体生长于悬浮液中的iPSC细胞在未于板表面上接种的情况下使用电穿孔(例如使用MaxCyte STX电穿孔仪)直接转染。在一个实施例中，呈球体的2百万起始iPSC于悬浮液中用不同mRNA，例如Sox17或Pax6转染或模拟转染。在图8中测试的mRNA量为2500ng。细胞随后在Sox17转染的情况下生长于NBM，或在Pax6转染的情况下生长于具有KSR的MEMalpha。如果过渡耗费较长时段，那么转染可重复1次、2次、3次、4次、5次或甚至更多次。结果，在Sox17mRNA的第1次转染之后，细胞集群变为显著较小和较不紧凑的球体，损失确定“边缘”或外部边界。相比之下，模拟转染的球体维持轮廊分明，在2D相片中清晰展示可见的外部“边缘”。未经转染或经模拟转染的iPSC的较小球体具有透明外观，而较大球体由于细胞层较厚看起来较不透明。相比之下，经Pax6(神经分化TF)mRNA转染的iPSC球体朝向外胚层，即神经祖细胞发展，其球体与经模拟转染的iPSC球体相比变得更暗且具有更不清晰的“边缘”，但与经Sox17转染的iPSC球体相比尺寸更大且具有更加确定的边界。
通过相同原理和类似方法，如内胚层细胞的生殖层特异性中间细胞和如肝祖细胞、胰脏祖细胞等的更加下游的中间细胞还可呈球体用其它TF mRNA转染。此方式转染的细胞对来自小分子、生长因子或细胞培养物中的其它元素的毒性具有更高抵抗性，且一般来说在分化方面应比使用化学试剂的2D转染更加有效。未见于科学出版物中的此观测结果是在电穿孔设备的测试期间无意获得，且作为本发明的部分充当能够实现的方法。
实例2：自内胚层细胞产生肝祖细胞
将内胚层细胞接种于商业细胞培养容器上。将6孔培养板用于图2中所示的实验，但其它孔尺寸也是可适用的。板用基质胶(BD生物科学(BD Biosciences))预涂，随后将1×105-1×106个细胞接种于补充有8mM D-葡萄糖的DMEM/F12或MCDB131中。观测到有时在此阶段添加1％DMSO有助于提高产生肝祖细胞的效率。
在一个实验中，细胞随后用Hex mRNA和/或Tbx3mRNA转染。另外，细胞在培养基中用Stemgent转染剂(Stemgent)以50纳克/孔的剂量用GATA4mRNA、GATA6mRNA转染或共转染以实现较强效果，且使用Stemgent转染剂或可在市面上购得的其它转染试剂以在低到10纳克/孔与高达200纳克/孔范围内的剂量重复2次、3次或更多次。在一些方面中，Stemgent浓度可为例如约10纳克/孔、20纳克/孔、30纳克/孔、40纳克/孔、50纳克/孔、60纳克/孔、70纳克/孔、80纳克/孔、90纳克/孔、100纳克/孔、110纳克/孔、120纳克/孔、130纳克/孔、140纳克/孔、150纳克/孔、160纳克/孔、170纳克/孔、180纳克/孔、190纳克/孔或200纳克/孔或为任何两个所述量之间的任何量。还可针对其它孔体积调节此量。在此阶段的细胞比内胚层细胞呈现地更暗且倾向于形成肝祖细胞集群(图2)。
实例3：自肝祖细胞产生肝细胞
肝祖细胞培养于用DMEM/F12、MEMa或DMEM B27中的基质胶(BD生物科学)或胶原蛋白I(西格玛)预涂的6孔或其它板中。其它类似附着细胞培养基也适合于使用。
肝祖细胞在补充有200ng/mL B18R的培养基中以10-200纳克/孔的剂量用HNF1amRNA、HNF4a mRNA、HNF6mRNA、CEB/Pa mRNA或CEB/Pb mRNA进一步转染。Stemgent的剂量还可以是约10纳克/孔、20纳克/孔、30纳克/孔、40纳克/孔、50纳克/孔、60纳克/孔、70纳克/孔、80纳克/孔、90纳克/孔、100纳克/孔、110纳克/孔、120纳克/孔、130纳克/孔、140纳克/孔、150纳克/孔、160纳克/孔、170纳克/孔、180纳克/孔、190或200纳克/孔，或为在任何两个所述量之间的量。还可针对其它孔体积调节此量。大多数可在市面上购得的转染试剂也可适用。肝细胞通过在肝细胞培养基中将祖细胞传递至较低密度在此阶段获得(图3)。
实例4：呈3维球体的肝细胞
代替解离和再接种，使肝祖细胞继续生长1周至2个月或甚至更久，在此时间期间聚集祖细胞会连续不断地形成3维(3D)球体且将其移至悬浮液中(图4)。
在此阶段呈3D形式的细胞通过肝糖表达测试(图5)，且通过抗体进行肝细胞标记物染色(图6)。肝糖、AFP、胰蛋白酶的阳性染色确认细胞已达到肝细胞的成熟阶段。
呈3D球体的这些肝细胞用Accutase、TrypLE或其它解离试剂解离，且再接种于如实例3中的经涂布表面。其立即展示肝细胞的终末分化形态而未于单层培养物中进一步分裂(图7)。
实例5：动物模型中的iPSC衍生的肝细胞功能
为进一步测试根据本发明产生的成熟肝细胞的功能，在如以下的肝病或损伤小鼠模型中测试iPSC衍生的肝细胞的肝功能：1)针对胆汁郁积性肝脏损伤的手术胆管结扎(BDL)小鼠模型；2)针对胆汁郁积性肝脏损伤的经MDR2/Tgfbr2/Il2ra基因修饰的小鼠模型；3)针对胆汁郁积性肝脏损伤的DDC修饰的饮食、ANIT修饰的饮食或d-半乳糖胺诱导的小鼠模型作为替代方案；4)针对NASH肝脏损伤的高营养膳食诱导的小鼠模型；5)针对NASH肝脏损伤的经ob/ob、nSREBP-1c或PTEN基因修饰的小鼠模型；6)针对NASH肝脏损伤的MCDD/CDAA小鼠模型作为替代方案；或7)针对有毒肝脏损伤的CCl4/TAA/DEN/DMN诱导的小鼠模型。
另外，醇诱导(ALD)的自体免疫性肝炎(AIH)和病毒感染性肝病是由本发明产生的肝细胞可通过移植，包括使用动物模型解决的所有主要公共卫生问题。
如：1)高营养膳食诱导的猴肝脏损伤模型、2)CCl4诱导的猴肝脏损伤模型、3)BDL猴肝脏损伤模型的非人类灵长类动物模型用于测试所公开的肝细胞的功能。
递送途径：将肝细胞或球体灌注于肝脏中。
测试：测量白蛋白、AST、ALT、胆红素和玻尿酸(第2周、第4周、第8周、第12周、第16周、第24周)的血液含量；测量促炎性细胞因子，如IL-8、TNFa、MCP-1的血液含量(第2周、第4周、第8周、第12周、第16周、第24周)；进行纤维化、肝细胞、库弗细胞(Kupffer cells)/巨噬细胞和HCC标记物的移植部位的IHC。
实例6：在治疗具有肝病，如慢性肝功能衰竭的人类患者中的iPSC衍生的肝细胞
参考其它细胞疗法根据动物研究给药使用经调适以符合cGMP程序的所公开的方案的使用人类iPSC衍生的肝细胞的临床试验。将基于3D肝细胞的制造的肝细胞或微小器官递送至肝脏，或人体的其它部分，如肌肉、结缔组织或其它器官的某些部位以获得功效。
Claims (14)
1.一种诱导干细胞分化成肝细胞的方法，其包含以下步骤：
(a)在分化条件下培养诱导的多能干细胞作为起始细胞；
(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；
(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导所述分化细胞朝向内胚层细胞，其中mRNA的第一组合包括FoxA2和/或Sox17 mRNA；
(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞，其中mRNA的第二组合包括Hex mRNA和/或Tbx3 mRNA；
(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞，其中mRNA的第三组合包括HNF4a mRNA或HNF1a mRNA；和
(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2 mRNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第一组合包含Sox17 mRNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2 mRNA和Sox17mRNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第一组合包含FoxA2 mRNA、Sox17mRNA、GATA4 mRNA和GATA6 mRNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第二组合包含Hex mRNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第二组合包含GATA4 mRNA和GATA6mRNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第二组合包含Tbx3 mRNA和Hex
mRNA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第二组合包含Tbx3 mRNA、GATA4mRNA、GATA6 mRNA和Hex mRNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第三组合包含HNF1a mRNA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第三组合包含HNF4a mRNA。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的第三组合包含HNF4a mRNA、HNF1amRNA、HNF6 mRNA、CEB/Pa mRNA和CEB/Pb mRNA。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱导的多能干细胞是从个体的体液或组织制备的。
14.一种由诱导的多能干细胞产生分化肝细胞的方法，其包含以下步骤：
(a)在分化条件下培养所述诱导的多能干细胞作为起始细胞；
(b)诱导所述起始细胞脱离多能状态朝向中内胚层谱系；
(c)以有效剂量且在特定时间窗内通过用mRNA的第一组合进行培养细胞转染来引导所述分化细胞朝向内胚层细胞，其中mRNA的第一组合包括FoxA2或Sox17mRNA；
(d)进一步通过用mRNA的第二组合进行转染来引导所述内胚层细胞朝向肝祖细胞，其中mRNA的第二组合包括Hex mRNA和/或Tbx3 mRNA；
(e)进一步用mRNA的第三组合使所述肝祖细胞成熟化为肝细胞，其中mRNA的第三组合包括HNF4a mRNA、HNF1a mRNA、HNF6 mRNA、CEB/Pa mRNA或CEB/Pb mRNA；和
(f)通过将祖细胞集群传代成单层或收集由所述肝祖细胞形成的集群且再接种成单层来获得所述肝细胞。
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