KR102361849B1 - 합성 메신저 rna를 사용한 인간-유도된 만능 줄기 세포의 무-피더 유래 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 일반적으로, 동역학적으로 제어되는 과정을 통해, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 생성을 위해 조작된 재프로그램화 인자(들)를 사용하는 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 다양한 세포 유형을 재프로그램화하는데 최적화된, 통상적인 재프로그램화 인자와 전사활성화 도메인 사이의 융합을 포함한 재프로그램화 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 예시적인 방법은, 인간 섬유모세포를 포함한 다양한 포유동물 세포 유형으로부터 유도된 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 합성 메신저 RNA를 사용한 인간 유도된 만능 줄기 세포의 무-피더 유래의 예시적인 방법이 또한 개시된다.

Description

합성 메신저 RNA를 사용한 인간-유도된 만능 줄기 세포의 무-피더 유래 {FEEDER-FREE DERIVATION OF HUMAN-INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS WITH SYNTHETIC MESSENGER RNA}

관련 출원

본 출원은 2012년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/646,292의 우선권의 이익을 주장하는, 2013년 5월 13일에 출원된 미국 출원 일련 번호 13/893,166의 일부 계속 출원인, 2014년 5월 30일에 출원된 미국 출원 일련 번호 14/292,317의 일부 계속 출원이다. 상기 출원 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다. 2015년 7월 21일에 생성된 상기 ASCII 사본은 F6035-00038_SL.txt로 명명되고 1,059 바이트 크기이다.

발명의 분야

본 개시내용은 일반적으로, 제어 과정을 통해, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 생성을 위해 조작된 재프로그램화 인자(들)를 사용하는 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 다양한 세포 유형을 재프로그램화하는데 최적화된, 통상적인 재프로그램화 인자와 전사활성화 도메인 사이의 융합을 포함한 재프로그램화 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 예시적인 방법은, 비-인간 영장류 세포를 포함한 다양한 포유동물 세포 유형으로부터 유도된 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 합성 메신저 RNA를 사용한 인간 유도된 만능 줄기 세포의 무-피더(feeder-free) 유래의 예시적인 방법이 또한 개시된다.

하기는 본 개시내용의 다양한 측면 및 실시양태를 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 본원에 기재 또는 청구된 발명의 선행 기술이거나 그에 관련된 것이라는 것, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 참조된 임의의 간행물 또는 문헌이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 치료 잠재력은 만능 상태로의 재프로그램화를 수행하기 위해 체세포를 유전자 변형시킬 필요성을 피하는 재프로그램화 방법을 개발하는 노력에 박차를 가하였다. 이에 관한 성공을 달성하기 위한 최초 "비-통합" 접근법 - 단백질 형질도입, 플라스미드 형질감염 및 아데노바이러스 벡터의 사용 - 은 수득된 iPSC 전환의 낮은 효율로 인해 적용이 제한되었다. 보다 최근에, 에피솜 DNA, 센다이(Sendai) 바이러스 및 합성 메신저 RNA (mRNA)를 사용하는 기술이 바이러스 벡터의 통합을 사용하여 달성된 것에 필적하거나 그를 능가하는 효율로 "무-풋프린트(footprint-free)" iPSC를 생성하는 것으로 제시되었다. RNA 형질감염은 재프로그램화 인자 (RF) 발현 시간 경과에 걸쳐 정확한 제어를 제공하면서도, 벡터의 잔류 흔적을 없애기 위한 재프로그램화된 세포의 "클린업"에 대한 임의의 요건을 완전히 배제시키기 때문에, 원칙적으로 이들 방법 중 가장 매력적이다. 그러나, mRNA-기반 재프로그램화의 현재 프로토콜은 인간 세포에서의 만능성의 유도를 위해 요구되는 ~2주 동안의 매일의 재형질감염의 필요성으로 인해 비교적 노동-집약적이다. 이들 절차는 또한 비-인간-유래된 ("이종(xeno)") 생물학적 물질에 의한 오염의 잠재적 공급원을 도입하면서 과정에 복잡성 및 기술적 가변성을 부가하는 피더 세포의 사용에도 의존한다.

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 생산의 주요 난점은 분화 세포에서 만능 세포로의 재프로그램화의 낮은 효율이었다. 이전에, Sox2, Klf4 및 c-Myc (SKM)와 함께, Oct4 및 MyoD (M3O라 불림)의 전사활성화 도메인으로 구성된 융합 유전자에 의해 형질도입될 때 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)의 5%가 iPSC로 재프로그램화된다고 보고되었다. 추가로, iPSC가 되지 않은 세포를 포함한 형질도입된 MEF 중 대다수에서 M3O는 만능성 유전자의 염색질 재형성을 용이하게 하였다. 이들 관찰은 세포의 5% 초과가 보다 선호되는 배양 조건 하에서 iPSC가 되는 능력을 획득하였다는 가능성을 시사하였다.

mRNA를 사용하여 비-인간 기원으로부터의 세포를 성공적으로 재프로그램화하는 것은 RNA 분자가 세포, 특히 포유동물 세포 내로 형질감염될 때 그에 의해 유도된 잠재적 세포성 면역 반응으로 인해 달성하기 어렵다. 인간 섬유모세포를 재프로그램화하는데 있어서, 관례는 형질감염된 mRNA 분자에 의해 유도된 인터페론을 약화시키기 위해 바이러스 단백질을 디코이 수용체로서 사용하는 것이다. 그러나, 디코이 수용체 또는 다른 유사한 전략을 사용하는 이러한 전략은 개코원숭이, 말 및 개를 포함한 비-인간 종으로부터의 섬유모세포를 재프로그램화하는데 성공적이지 않았다.

따라서, 이들 결점을 다루기 위해, 본 개시내용은 신체의 모든 상이한 조직을 생산할 수 있는 줄기 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법은, 바이러스 벡터 또는 피더 세포의 필요 없이 메신저 RNA 분자를 사용하여, 비-인간 섬유모세포에서 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로의 재프로그램화에 사용될 수 있다. 예시적인 방법 및 조성물의 사용은 이전에 보고된 세포 재프로그램화 방법론에 비해 놀라운 예상외의 개선된 효율을 가져왔으며, 비-인간 포유동물 세포에서 세포성 면역 반응을 억제하는데 있어서 이전에 해결되지 않은 문제를 극복하였다.

따라서, 주목할만하게는 공지된 강한 전사 인자, 예컨대 VP16 및 MyoD의 전사활성화 도메인을 혼입시킨, 통상적인 재프로그램화 인자, 예컨대 Oct4 (또한 Oct3/4로도 지칭됨), Sox2 등의 조작된 변이체의 적용을 통해, 재프로그램화 인자 (RF) 칵테일을 개선시킴으로써 mRNA-매개된 재프로그램화를 가속화시키는데 유용한 방법, 작용제 및/또는 조성물이 제공된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 mRNA-기반 재프로그램화에 수반되는 시간, 비용 및 노력을 극적으로 감소시키는 무-피더 프로토콜을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 a) 단리된 체세포를 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog 및 Lin28로부터 선택된 합성 mRNA 재프로그램화 인자 중 어느 1종 이상과 전사활성화 도메인 사이의 융합 산물의 유효량을 포함하는 조성물로 형질감염시켜 체세포를 재프로그램화하거나 탈분화시키는 단계를 포함하는, 체세포를 탈분화시키거나 재프로그램화하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 조성물이 N-말단 MyoD 전사활성화 도메인에 융합된 Oct4를 포함하는 것인 청구항 1의 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, Oct4는 일렬 삼중으로 N-말단 MyoD 전사활성화 도메인에 융합된다.

한 측면에서, a) 표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더 표면에서 15 k 내지 500 k 세포/웰의 밀도로 성장시키는 단계; 및 b) 재프로그램화 동안 매회 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 청구항 1의 재프로그램화 인자의 합성 mRNA 중 어느 1종 이상을 사용하여 포유동물 세포를 재프로그램화하는 방법이 제공된다.

한 실시양태에서, 표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더 표면에서 30 k, 75 k, 100 k 또는 150 k 세포/웰의 밀도로 성장시키고; b) 재프로그램화 동안 매회 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 형질감염시키며, 여기서 나중 시점보다 더 이른 시점에 보다 낮은 용량을 사용하고; c) 계대배양 없이 iPSC를 수득한다.

한 실시양태에서, 표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더 표면에서 15 k, 75 k, 100 k 또는 150 k 세포/웰의 밀도로 성장시키며, 여기서 각각의 웰의 부피를 0.5 ml 내지 5 ml의 적절한 배지가 되도록 조정하고; 재프로그램화 동안 매회 50 ng 내지 800 ng/ml mRNA의 가변 용량으로 세포를 형질감염시키며, 여기서 나중 시점보다 더 이른 시점에 보다 낮은 용량을 사용하고; 계대배양 없이 iPSC를 수득한다.

특정 실시양태에서, 재프로그램화 과정 전반에 걸쳐 보다 낮은 용량을 사용하는 것은 세포성 면역 반응을 감소시켰으며 개선된 iPSC 성공률을 가져왔다. 다른 실시양태에서, 보다 높은 순도의 mRNA 분자를 사용하는 것, 즉 시험관내 전사로부터 이상 전사체에 의한 오염이 없는 것은, 세포가 보다 낮은 밀도로 시딩되도록 하고 반복된 형질감염에서 살아남게 하며 보다 높은 iPSC 수율이 얻어지도록 하였다.

한 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 한 실시양태에서, 방법은 무-이종(Xeno-free)이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 한 실시양태에서, 비-인간 영장류 세포는 시노몰구스 원숭이 세포이다.

한 실시양태에서, 1종 이상의 인자는 mRNA, 조절 RNA, siRNA, miRNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 체세포는 적어도 2종의 상이한 RNA로 형질감염된다. 한 실시양태에서, 체세포는 단능, 다능, 만능 및 분화 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 1종 이상의 RNA는 체세포에서 단능, 다능 또는 만능 세포로의 탈분화를 유도한다.

한 실시양태에서, 인자 중 적어도 1종은 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 MYC mRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 mRNA는 조합되어 투여된다. 한 실시양태에서, OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC mRNA는 조합되어 투여된다.

한 실시양태에서, 형질감염된 세포는 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포로서 배양 중에 유지된다. 한 실시양태에서, 형질감염된 세포는 유도된 만능 줄기 세포를 형성하고, iPS 세포를 유도하여 분화 세포를 형성하는 것을 추가로 포함한다.

한 측면에서, 세포를 시험관내에서 탈분화시키는 단계 및 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 치료하거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 Rarg 및 LrH-1 트랜스액션 활성화 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 VP16 전사활성화 도메인에 융합된 OCT4를 포함한다.

한 실시양태에서, 개시내용은 비-인간 영장류 세포로부터 유래된 iPSC를 제공하며, 이는 다른 동물 산물 없이 무-통합, 무-피더 시험 환경을 생성할 수 있기 때문에 질환 모델 시스템을 확립하는데 사용되었다. 따라서, 본원에 기재된 비-인간 iPSC는 전임상 시험에 유용하다.

본원에 기재되고 청구된 발명은 이 발명의 내용란에 제시 또는 기재 또는 언급된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 속성 및 실시양태를 갖는다. 이는 모두를 포함한 것으로 의도되는 것은 아니며, 본원에 기재 및 청구된 발명은 단지 예시할 뿐 제한하는 것은 아닌 목적으로 포함되는 이 발명의 내용란에서 확인된 특색 또는 실시양태로 제한되지 않거나 또는 그에 의해 제한되지는 않는다. 추가의 실시양태는 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용란에 개시될 수 있다.

도 1. M3O-기반 mRNA 재프로그램화 칵테일을 사용하여 유래된 iPSC 콜로니. (A) 최초 M3O-기반 BJ 재프로그램화 시험으로부터 유래된 2종의 증식된 iPSC 클론의 10x 명시야 영상. (B) 만능성 마커에 대한 증식된 클론의 면역염색.
도 2. M3O-기반 칵테일을 사용한 무-피더 재프로그램화. (A) c-Myc 및 L-Myc-기반 칵테일 및 4-시간 및 24-시간 형질감염 요법을 비교하는, 50K XFF 섬유모세포에 대한 무-피더 유래로부터 TRA-1-60⁺ 콜로니 수율을 보여주는 면역형광 영상화. 모든 웰을 9일 동안 형질감염시켰다. 4-시간 형질감염 배양물을 실험 제15일에, 24-시간 형질감염 배양물을 제11일에, 염색을 위해 고정시켰다. (B) 유래 제9일에 배양을 능가하는 거의 전면생장의 hESC-유사 콜로니를 보여주는, 동일한 실험으로부터의 400 ng/ml 스템펙트(Stemfect) 웰의 10x 명시야 영상화. (C) 상피화 및 이후 hESC-유사 콜로니의 출현을 보여주는, 400 ng/ml 스템펙트 요법을 사용하여 100K XFF를 다시 9일 동안 형질감염시킨 추적 시험에서 마킹된 시야의 10x 명시야 시간 경과.
도 3. 4종의 상이한 mRNA 칵테일을 사용한 재프로그램화 효율의 비교. 4종의 칵테일 비교 실험을 요약한 플로우차트.
도 4. HDF-a 무-피더 재프로그램화 배양물 내 hESC-유사 콜로니. 스템펙트 형질감염 시약을 사용하여 배지 보충제로서 전달된 400 ng/ml mRNA 칵테일 (M3O+ c-Myc⁺ Nanog⁺)로 9일 동안 처리된, 75K HDF-a 성체 섬유모세포로부터의 무-피더 유래 제9일에 출현한 hESC-유사 콜로니의 10x 명시야 영상.
도 5. 합성 mRNA 칵테일의 생성. (A) mRNA 재프로그램화 칵테일을 제조하는 절차를 요약한 개략도. (B) SYBR E-겔 상의 다수의 RF를 코딩하는 합성 mRNA 및 형광 리포터. 레인당 500 ng의 RNA를 로딩하였다.
도 6. 재프로그램화 칵테일을 위해 2-티오-우라실을 사용한 합성 mRNA 칵테일의 생성. SYBR E-겔 상의 다수의 RF를 코딩하는 합성 mRNA. mRNA는 그의 우라실 염기 중 10%가 2-티오-우라실에 의해 대체되었다. 레인당 100 ng의 RNA를 로딩하였다.
도 7. 2-티오-우라실에 의해 변형된 mRNA를 갖는 mRNA 칵테일을 사용하여 생성된 인간 iPSC. 플루리톤(Pluriton) (A) 또는 대립유전자 재프로그램화 배지 (B)에서의 상이한 재프로그램화 실행 동안 재프로그램화로부터 (A) 7일 또는 (B) 11일 후의 인간 iPSC의 집단.
도 8. 무-피더 재프로그램화 배양에서 mRNA 칵테일을 사용하여 생성된 시노몰구스 원숭이 iPSC 콜로니. 제10일 및 제13일에 출현한 hESC-유사 콜로니의 10x 명시야 영상이 사진으로 제시되어 있다. 제10일 패널에서, 중심 근처의 세포는 섬유모세포에서 줄기 세포로의 형태 변화를 나타낸다. 제13일 패널에서, 세포는 완전히 형질전환된 원숭이 iPSC의 거대 콜로니를 형성하였다.

본 발명을 기재할 때, 본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 관련 기술분야에서 인식된 그의 통상의 의미를 갖는다. 하기 기재가 본 발명의 특정 실시양태 또는 특정한 용도에 대한 것이므로, 이는 단지 예시적일 뿐 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기 기재는 본 발명의 취지 및 범주에 포함되는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.

분화 세포가 선택 군의 전사 인자의 발현에 의해 만능 상태로 복귀될 수 있다는 것은, 환자-특이적 세포가 시험관내에서 유전 질환의 연구를 위해 및 궁극적으로 세포-대체 요법을 위해 임의의 목적하는 유형의 세포를 생성하는데 사용될 수 있다는 전망을 열어주었다. 재프로그램화 인자의 발현은 게놈 내로 통합되는 바이러스 벡터의 적용을 통해 달성될 수 있고, iPSC 유래는 여전히 통상적으로 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 통합으로 수행된다. 수반되는 게놈의 변형은 iPSC의 치료 적용에 중요한 장애물을 나타내며, 통합된 바이러스 카세트로부터의 재활성화된 발현의 가능성은 시험관내 연구에서도 중요하다. 게놈-변형 문제점을 완화시키거나 제거하는 신규 발현 벡터의 적용에 있어서 최근에 상당한 진행이 이루어졌다. Cre 레콤비나제의 일시적 발현을 통한 재프로그램화 후 흔적이 거의 없는 트랜스진 절제를 가능하게 하는, lox 재조합 부위에 플랭킹되어 있는 단일 폴리시스트론 카세트에서 iPSC 유도에 요구되는 다중 인자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 이제 이용가능하다. 절제가 후속되는 트랜스진 삽입은 또한 트랜스포손 벡터를 사용하는 것에 이어서 트랜스포사제의 짧은 발현에 의해서도 수행될 수 있다. 아데노바이러스, 플라스미드 및 에피솜 DNA를 포함한, 만능성을 유도하기에 충분한 시간 동안 재프로그램화 인자를 일시적으로 발현시킬 수 있는 여러 상이한 유형의 비-통합 DNA 벡터가 사용되었다. 낮은 효율이기는 하지만, 세포-침투 펩티드를 혼입시킨 재조합 RF 단백질을 사용한 세포의 반복된 형질도입에 의해 iPSC를 생성하는 것이 가능한 것으로 또한 입증되었다. 비교적 효율적인 iPSC 전환은 이제, 완전히 RNA-기반 생식 주기를 갖는 센다이 바이러스를 사용하고, 야마나카(Yamanaka) 인자를 코딩하는 합성 mRNA 전사체의 지속적 형질감염에 의해 달성될 수 있다.

재프로그램화 (및 잠재적으로 지정 분화 및 전환분화)를 위한 mRNA 형질감염의 적용은, 이 시스템이 단순히 어떤 전사체를 세포 배양 배지에 첨가할지를 변화시킴으로써 재프로그램화 칵테일 및 심지어 개별 성분 인자의 발현을 매일 조정되게 하기 때문에 매력적이다. 일단 특정한 인자의 형질감염이 종결되면, 세포질 내 mRNA의 급속 붕괴로 인해 표적 세포 내 이소성 발현이 즉시 중지된다. 비-통합 DNA 벡터 또는 RNA 바이러스와 대조적으로, mRNA 형질감염에 어떤 클린업도 요구되지 않으며, 무작위 게놈 통합 또는 지속적 바이러스 감염의 어떤 위험도 존재하지 않는다. 본 발명자들이 수회의 이소성 RF 발현이 궁극적으로 환자 생검으로부터 iPSC 중간체를 통해 목적하는 유형의 특화 세포가 되는데 사용될 수 있다고 구상한다면, 이들 이점은 보다 큰 유의성을 상정한다. 그럼에도 불구하고, 현재 실시되는 바와 같은 mRNA-기반 재프로그램화에는 결점이 존재한다. RF의 발현은 mRNA가 형질감염된 후 대략 24시간 동안은 전형적으로 강력하지만, 인간 세포에서 만능성을 유도하기 위해서는 인자 발현에 약 2주가 소요되며, 따라서 이 기술로 세포를 재프로그램화하는데 요구되는 체험 시간은 비교적 길다. 모든 세포 유형 및 배양 배지가 효율적 mRNA 전달에 동일하게 공헌하지는 않으며, 이는 현재 혈액 세포를 포함한 특정 관심 세포 유형의 mRNA-기반 재프로그램화에 장애물이다. 또한 지금까지는, mRNA 방법을 사용하여 세포를 iPSC로 성공적으로 재프로그램화하기 위해 유사분열에서 정지된 섬유모세포의 피더 층을 사용하는 것이 필요하다고 입증되었다. 이들 피더 세포는 표적 세포가 iPSC 유도에 요구되는 연장된 시간 경과에 걸쳐 낮은 출발 밀도로부터 성장함에 따라 배양물의 집단 밀도를 완충시켜, RNA 및 형질감염 시약 (이들 둘 다 연관된 독성을 가짐)의 전달되는 용량을 균일하게 하고, 재프로그램화 과정에 의해 일어나는 아폽토시스촉진 및 세포증식억제성 경향에 직면한 표적 세포의 생존율을 지지한다. 이러한 요건은 절차에 복잡성 및 체험 시간을 부가하며, 특히 피더가 스스로 형질감염에 적용될 경우 기술적 가변성의 중요한 공급원이 된다. 피더 층의 존재는 또한 재프로그램화 과정의 모니터링 및 분석도 지연시킨다. 최종적으로, 현재 인간 피더 세포가 mRNA 재프로그램화에 대한 표준임에도 불구하고, 이들 세포는 비-인간 동물 산물이 그의 유래 및 증식에 사용될 때 이종-생물학적 오염의 잠재적 공급원이다.

따라서, 이전에 공지된 절차와 연관된 문제점을 고려하여, 재프로그램화의 개선된 효율 및 생성된 세포의 개선된 질을 갖는 iPSC를 생산하기 위한 신규 방법, 물질 및 프로토콜이 본원에 제공된다. 본 발명의 실시양태는 세포에 전달된 RF 칵테일의 강화를 통해 상당히 놀라운 예상외의 개선을 성공적으로 달성하는데 사용되었다. 본 발명의 실시양태는 또한 mRNA 재프로그램화 과정을 압축시키고 간소화하며, 피더 세포 또는 임의의 다른 잠재적 이종-오염 시약의 사용 없이 인간 섬유모세포로부터 무-풋프린트 iPSC의 생산을 지지하는 신규 프로토콜(들)을 제공한다. 본원에 제공된 신규 방법 및 조성물은 이전에 공지된 mRNA 방법의 이익을 확장시키며 iPSC 기술의 치료 적용에 남아있는 걸림돌을 해결하는데 도움을 줄 것이다.

본 개시내용은 일반적으로, 동역학적으로 제어되는 과정을 통해, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 생성을 위해 조작된 재프로그램화 인자(들)를 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상이한 유형의 세포를 재프로그램화하는데 최적화된, 통상적인 재프로그램화 인자와 전사활성화 도메인 사이의 융합을 포함한 재프로그램화 인자의 조합을 확립하는 것에 관한 것으로; 합성 메신저 RNA (mRNA)로서의 이들 인자를 트랜스진 발현의 적절한 수준을 유발하는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 포유동물 세포 내로 도입하고, 규정된 조건 하에서 세포를 유지하여 이전에 달성할 수 없었던 효율의 재프로그램화를 유발한다. 관련 기술분야에 공지된 다른 방법과 비교하여, 본 발명은 완전히 무-피더 및 무-이종일 것을 옵션으로, 계대배양 없이, 재프로그램화에 수반되는 시간, 비용 및 노력을 극적으로 감소시킨다. 본원에 개시된 물질 및 절차는 인간 섬유모세포를 포함한 상이한 유형의 포유동물 세포로부터 유도된 만능 줄기 세포를 생성하는데 유용하다.

개시내용의 측면은 또한 바이러스 벡터, 동물 산물 또는 피더 세포의 필요 없이 메신저 RNA 분자를 사용하여 인간 신체의 다양한 상이한 조직을 생산할 수 있는 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 신규 방법은 최적 조건 하에서 놀라운 예상외의 효율로 인간 섬유모세포를 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로 재프로그램화하는데 사용될 수 있다.

본 개시내용은 본원에 기재된 예시적인 재프로그램화 인자를 코딩하는 "클린업" mRNA의 칵테일을 사용하여 비-인간 포유동물 세포 (예를 들어 섬유모세포)를 처리하기 위한 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. mRNA 조성물은 처리된 세포가 mRNA 분자의 도입과 연관된 세포 사멸을 겪도록 야기하지 않으면서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 포유동물 세포는 시노몰구스 원숭이 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 시노몰구스 원숭이 세포는 달라지는 국부 밀도에서 세포가 성장하도록 웰에 구배로 시딩된다.

정의

본원에 사용된, 방법에 사용하기에 적합한 세포는 1차 세포 및 확립된 세포주, 배아 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 및 분화 세포, 예를 들어 비제한적으로 섬유모세포, 실질 세포, 조혈 세포 및 상피 세포를 포함한, 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 줄기 세포는 단능 세포, 다능 세포 및 만능 세포; 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 근육 위성 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 체세포는 탈분화되거나 재프로그램화된다. 임의의 적합한 체세포가 사용될 수 있다. 대표적인 체세포는 섬유모세포, 각질세포, 지방세포, 근육 세포, 기관 및 조직 세포; 및 다양한 혈액 세포, 예를 들어 비제한적으로 조혈 줄기 세포를 포함한 조혈 세포, 및 단기 또는 장기 조혈 생착을 제공하는 세포를 포함한다. 가장 바람직한 세포 유형은 인간 섬유모세포, 각질세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방법은 세포 게놈의 영구적 변경 없이 세포를 탈분화시키고 임의로 재분화시키는데 특히 유용하다.

개시된 방법에 유용한 RNA는 mRNA, 조절 RNA, 또는 소형 RNA, 예컨대 siRNA 또는 miRNA를 포함하며, 여기서 1종 이상의 mRNA는 세포를 탈분화시키거나 재프로그램화하도록 기능하는 폴리펩티드를 코딩한다. 형질감염의 효율은 높다. 전형적으로 형질감염된 세포 집단 중 90% 초과는 도입된 RNA를 발현시킬 것이다. 따라서, 1종 이상의 구별되는 RNA로 세포를 형질감염시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 세포 집단은 1종 이상의 구별되는 mRNA, 1종 이상의 구별되는 siRNA, 1종 이상의 구별되는 miRNA, 또는 이들의 조합으로 형질감염될 수 있다. 세포 집단은 단일 투여로 동시에 다수의 RNA로 형질감염될 수 있거나, 또는 다수의 투여가 수분, 수시간, 수일 또는 수주의 시차를 둘 수 있다. 다수의 구별되는 RNA의 형질감염이 시차를 둘 수 있다. 예를 들어, 최초 RNA가 1종 이상의 추가의 RNA의 발현 전에 발현되는 것이 바람직하다.

형질감염된 RNA의 발현 수준은 유입 RNA의 양을 변화시킴으로써 폭넓은 범위에 걸쳐 조작될 수 있어, 각각의 형질감염된 RNA의 발현 수준을 개별적으로 조절하는 것이 가능하다. 유입 RNA의 유효량은 목적하는 결과에 기초하여 결정된다. 게다가, PCR-기반 mRNA 생산 기술은 상이한 구조 및 도메인 조합을 갖는 mRNA의 설계를 용이하게 한다. 개시된 방법에 유용한 RNA는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 표적 숙주 세포 유형, 뿐만 아니라 조작되는 경로 또는 세포 활성, 또는 치료 적용에 기초하여 선택될 것이다. 세포를 탈분화시키는데, 예를 들어 성체 분화 체세포를 줄기 세포로 전환시키는데 유용한 구축물은 공지된 유전자, mRNA, 또는 다른 뉴클레오티드 또는 단백질 서열에 기초하여 구축될 수 있다.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적으로나 생화학적으로 변형된 비천연의, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 DNA의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, 본 개시내용의 목적상, 올리고뉴클레오티드의 길이에 상한치는 없다. 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고머 또는 올리고로도 공지되어 있으며, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 유전자로부터 단리될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "마이크로RNA"는 내인성 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA (예를 들어, 합성 miRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 간섭 RNA를 지칭한다. 내인성 마이크로RNA는 mRNA의 생산 이용을 조정할 수 있는, 게놈 내에서 자연적으로 코딩되는 소형 RNA이다. 인공 마이크로RNA는 mRNA의 활성을 조정할 수 있는, 내인성 마이크로RNA 이외의 다른 임의의 유형의 RNA 서열일 수 있다. 마이크로RNA 서열은 이들 서열 중 어느 1종 이상으로 구성된 RNA 분자일 수 있다.

"마이크로RNA 전구체" (또는 "프리-miRNA")는 마이크로RNA 서열이 내부에 혼입된 스템-루프 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. "성숙 마이크로RNA" (또는 "성숙 miRNA")는 마이크로RNA 전구체 ("프리-miRNA")로부터 절단되었거나 또는 합성된 (예를 들어, 실험실에서 무-세포 합성에 의해 합성된) 마이크로RNA를 포함하고, 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 27개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 예를 들어 성숙 마이크로RNA는 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt 또는 27 nt의 길이를 가질 수 있다. 성숙 마이크로RNA는 표적 mRNA에 결합하여 표적 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.

OCT4에 대한 예시적인 게놈, mRNA (cDNA) 및 단백질 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 호모 사피엔스(Homo sapiens) POU 클래스 5 호메오박스 1 (POU5F1), 전사체 변이체 3, mRNA라는 명칭의 진뱅크(Genbank) 수탁번호 NM-001173531.1; 호모 사피엔스 POU 클래스 5 호메오박스 1 (POU5F1), 전사체 변이체 1, mRNA라는 명칭의 진뱅크 수탁번호 NM-002701.4; 및 호모 사피엔스 POU 클래스 5 호메오박스 1 (POU5F1), 전사체 변이체 2, mRNA라는 명칭의 진뱅크 수탁번호 NM-203289.4의 mRNA (cDNA) 서열을 제공하는 (OCT4) POU5F1 POU 클래스 5 호메오박스 [호모 사피엔스] 진(Gene) ID: 5460을 참조한다. SOX2에 대한 예시적인 게놈, mRNA (cDNA) 및 단백질 서열도 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 mRNA 서열 호모 사피엔스 SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (SOX2), mRNA라는 명칭의 mRNA (cDNA) 서열 진뱅크 수탁번호 NM-003106.2를 제공하는 SOX2 SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 [호모 사피엔스], 진 ID: 6657을 참조한다. NANOG에 대한 예시적인 게놈, mRNA (cDNA) 및 단백질 서열도 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 호모 사피엔스 Nanog 호메오박스 (NANOG), mRNA라는 명칭의 mRNA (cDNA) 서열 진뱅크 수탁번호 NM-024865.2를 제공하는 NANOG Nanog 호메오박스 [호모 사피엔스], 진 ID: 79923을 참조한다. LIN28에 대한 예시적인 게놈, mRNA (cDNA) 및 단백질 서열도 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 호모 사피엔스 lin-28 상동체 A (씨. 엘레간스(C. elegans)) (LIN28A), mRNA라는 명칭의 mRNA (cDNA) 서열 진뱅크 수탁번호 NM-024674.4를 제공하는 LIN28A 상동체 A (씨. 엘레간스) [호모 사피엔스], 진 ID: 79727을 참조한다. KLF4에 대한 예시적인 게놈, mRNA (cDNA) 및 단백질 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 호모 사피엔스 크루펠(Kruppel)-유사 인자 4 (장) (KLF4), mRNA라는 명칭의 mRNA (cDNA) 서열 진뱅크 수탁번호 NM-004235.4를 제공하는 KLF4 크루펠-유사 인자 4 (장) [호모 사피엔스], 진 ID: 9314를 참조한다. MYC에 대한 mRNA 서열도 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 호모 사피엔스 v-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류) (MYC), mRNA라는 명칭의 mRNA (cDNA) 서열 진뱅크 수탁번호 NM-002467.4를 제공하는 MYC v-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류) [호모 사피엔스], 진 ID:4609를 참조한다.

"스템-루프 구조"는 우세하게는 단일-가닥 뉴클레오티드의 영역 (루프 부분)에 의해 한 측에 연결되어 있는 이중 가닥 (스템 부분)을 형성하는 것으로 공지되어 있거나 예측되는 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 2차 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. 용어 "헤어핀" 및 "폴드-백" 구조는 또한 스템-루프 구조를 지칭하는 것으로 본원에서 또한 사용된다. 이러한 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이들 용어는 관련 기술분야에서 이들의 공지된 의미로 일관되게 사용된다. 스템-루프 구조 내 뉴클레오티드의 실체 1차 서열은 2차 구조가 존재하는 한 본 발명의 실시에 결정적이지는 않다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 2차 구조는 정확한 염기-쌍형성을 요구하지 않는다. 따라서, 스템은 1개 이상의 염기 미스매치를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기-쌍형성은 정확할 수 있으며, 즉 어떤 미스매치도 포함하지 않을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "줄기 세포"는 증식하도록 유도될 수 있는 미분화 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 각각의 세포 분열 시에 하나의 딸 세포가 또한 줄기 세포임을 의미하는 자기-유지가 가능하다. 줄기 세포는 배아, 태아, 생후, 소아 또는 성체 조직으로부터 수득될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "전구 세포"는 줄기 세포로부터 유래된 미분화 세포를 지칭하며, 그 자체로 줄기 세포는 아니다. 일부 전구 세포는 1종 초과의 세포 유형으로 분화될 수 있는 자손을 생산할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유도된 만능 줄기 세포" (또는 "iPS 세포")는 체세포, 예를 들어 분화된 체세포부터 유도되고 상기 체세포보다 더 높은 효력을 갖는 줄기 세포를 지칭한다. iPS 세포는 자기-재생 및 성숙 세포, 예를 들어 평활근 세포로의 분화가 가능하다. iPS는 또한 평활근 전구 세포로의 분화가 가능할 수 있다.

본원에 사용된 세포에 관한 용어 "단리된"은 세포가 자연 발생하는 곳, 예를 들어 세포가 다세포 유기체에서 자연 발생하는 곳과 상이한 환경에 있는 세포를 지칭하고, 세포가 다세포 유기체로부터 제거되면 세포는 "단리된" 것이다. 단리된 유전자 변형된 숙주 세포는 유전자 변형된 숙주 세포의 혼합 집단 내에 또는 유전자 변형된 숙주 세포 및 유전자 변형되지 않은 숙주 세포를 포함하는 혼합 집단 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 단리된 유전자 변형된 숙주 세포는 유전자 변형된 숙주 세포의 시험관내 혼합 집단 내에, 또는 유전자 변형된 숙주 세포 및 유전자 변형되지 않은 숙주 세포를 포함하는 시험관내 혼합 집단 내에 존재할 수 있다.

본원에 사용된 "숙주 세포"는 진핵 세포가 핵산 (예를 들어, 외인성 핵산)의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 생체내 또는 시험관내 세포 (예를 들어, 단세포 개체로서 배양되는 진핵 세포)를 나타내며, 핵산에 의해 유전자 변형된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 모체와 형태학상 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체와 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다.

용어 "유전자 변형"은 새로운 핵산 (즉, 세포에 대해 외인성인 핵산)의 도입 이후 세포에서 유도된 영구적 또는 일시적 유전자 변화를 지칭한다. 유전자 변화 ("변형")는 새로운 핵산을 숙주 세포의 게놈 내로 혼입시킴으로써, 또는 염색체외 요소로서의 새로운 핵산의 일시적 또는 안정적 유지에 의해 달성될 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우에, 영구적 유전자 변화는 핵산을 세포의 게놈 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 유전자 변형의 적합한 방법은 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주사 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "외인성 핵산"은 정상적으로 또는 자연적으로 발견되지 않고/거나 자연에서 세포에 의해 생산되지 않고/거나 세포 내로 도입되는 (예를 들어, 전기천공, 형질감염, 감염, 리포펙션, 또는 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 다른 수단에 의해) 핵산을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나, 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 유해 효과의 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다.

본원에 사용된 "치료"는 포유동물에서, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 대한 소인이 있을 수 있지만 질환을 가진다고 아직 진단되지는 않은 대상체에서 질환이 발생하지 않도록 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 등), 유제류, 개, 토끼류, 고양이 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 관심 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물, 예컨대 원숭이, 설치류 또는 토끼류이다.

"치료 유효량" 또는 "효과적인 양"은 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때 질환에 대한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 화합물, 핵산의 양 또는 세포의 수를 의미한다. "치료 유효량"은 화합물 또는 세포, 질환 및 그의 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.

본 발명이 추가로 기재되기 전에, 본 발명은 기재된 특정한 실시양태에 제한되지 않으며, 그 자체로 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하려는 목적이며, 제한하려는 의도가 아닌 것으로 이해되어야 한다.

값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 그 범위의 상한치 내지 하한치에서 하한치 단위의 10분의 1까지의 각각의 중간 값, 및 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값이 본 발명 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 이 보다 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계치 외에는 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 그러한 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물에서 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용의 한 측면에서, mRNA-기반 재프로그램화는 N-말단 MyoD 전사활성화 도메인 (Hirai et al., Stem Cells, 2011) 또는 C-말단 VP16 전사활성화 도메인의 삼중 반복부 (Wang et al., EMBO Reports, 2011; 여기서 합성 재프로그램화 인자는 VP16 전사활성화 도메인을 OCT4 (또한 Pou5f1로도 공지됨), NANOG 및 SOX2에 각각 융함시킴으로써 제조되었으며, 이들 합성 인자는 마우스 및 인간 섬유모세포 둘 다를 증진된 효율 및 가속화된 동역학으로 재프로그램화할 수 있음)를 혼입시킨 Oct4 또는 Sox2의 조작된 변이체의 사용을 통해, 또는 "표준" RF 칵테일을 2종의 추가의 인자인 Rarg 및 Lrh-1로 증대시킴으로써 (Wang et al., PNAS, 2011) 증진될 수 있다. 이들의 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 강한 전사 활성인자는 특이적 부위의 DNA에 결합될 때 다수의 염색질 재형성 복합체를 효과적으로 동원할 수 있다. 우수한 예는 분화 세포의 운명을 바꿀 수 있는 골격 근발생의 마스터 전사 인자인 MyoD이다. 히라이(Hirai) 등은, MyoD가 그토록 강한 전사 인자이기 때문에, 함께 융합된다면 iPS 인자에의 염색질 접근가능성을 증가시킬 수 있을 것으로 추측하였다. 마우스 또는 인간 세포가 Sox2 및 Klf4와 함께 Oct-MyoD TAD 융합 유전자를 운반하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입되는 경우에, 이들은 iPSC 콜로니의 수를 정규 iPS 인자와 비교하여 ~50배까지 증가시켰다. 유사하게, 강력한 전사 활성인자로서 광범위하게 공지된 VP16은 상이한 iPS 인자에 융합될 때 재프로그램화에 대한 강한 자극 효과를 나타낼 수 있다.

인간 iPSC의 예시적인 제조

방법은, 예를 들어, 추가로 조정되어 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 근육 위성 세포를 형성하거나, 또는 적혈구, 림프구를 포함한 백혈구, 혈소판, 기질 세포, 지방 세포, 파골세포를 포함한 골 세포, 피부 세포를 포함한 상피 조직, 평활근, 골격근 및 심장근을 포함한 근육 조직, 내피 세포를 포함한 혈관 조직, 간세포를 포함한 간 조직, 및 뉴런을 포함한 신경 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 조직의 분화 세포를 형성할 수 있는 iPS 세포를 생산하기 위한 세포의 재분화 또는 재프로그램화에도 또한 광범위하게 사용될 수 있다. iPS 세포에서 심근세포, 조혈 줄기 세포, 골 세포, 예컨대 파골세포, 간세포, 망막 세포, 및 뉴런, 줄기 세포, 예를 들어 비제한적으로 단리된 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 분화 세포 유형으로의 분화를 유도하는 방법은 분화를 유도하는 RNA에 의한 일시적 형질감염에 의해 분화되도록 유도될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 세포는 세포 유형-특이적 조건 하에서 세포를 배양함으로써 재분화될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포는 CF-1 피더 상에서 유지된 후에 무-피더 조건에 적합화될 수 있다. iPS 세포는 noggin, Dkk-1 및 IGF-1의 존재 하에 세포를 배양함으로써 분화된 망막 세포를 형성하도록 유도될 수 있다.

이전에 보고된 방법론은 변형된 인자를 운반하기 위해 벡터, 즉 바이러스 또는 플라스미드를 통합하는 것에 의존하였다. 한 실시양태에서, 재프로그램화 시험은 5종의 mRNA 재프로그램화 인자 (Oct4, Sox2, Klf4, cMyc-T58A 및 Lin28)에 대한 전사체, 또는 Rarg 및 Lrh-1을 포함한 7-재프로그램화 인자 RF 칵테일을 포함하는 6종의 상이한 mRNA 조합 칵테일의 성능을 비교하면서 수행되었고, 각각의 조합은 야생형 Oct4 및 MyoD- 및 VP16-Oct4 융합 구축물 (M3O 및 VPx3으로 각각 지정됨)에 기반한 3종의 변이에서 시험되었다. BJ 섬유모세포는 피더-기반 재프로그램화 배양으로 11일 동안 형질감염되었으며, 이때까지 진행된 형태학이 여러 웰에서 분명하였다. 다음 몇일에 걸쳐, 특징적 hESC 형태학을 갖는 콜로니가 야생형 Oct4 및 M3O에 기반한 칵테일로 형질감염된 웰에 출현하였다. VPx3-형질감염된 배양물에서의 표적 세포는 섬유모세포의 형태학을 유지하였으나, 가속화된 성장 및 증식소로 응집되는 일부 경향을 보여주었고 콜로니는 출현하지 않았다. 야생형 Oct4 및 M3O-기반 칵테일의 5-인자 및 7-인자 실시양태는 유사한 콜로니 생산성을 보여주었고, 따라서 칵테일 내 Rarg 및 Lrh-1의 포함으로부터의 이점은 없었다. 그러나, M3O 칵테일은 야생형 Oct4에 의해 생산된 콜로니 수의 여러배를 제공하였다. 이러한 결과에 비추어, 콜로니는 증식 및 추가 분석을 위해 M3O 5-인자 웰로부터 선별되었다 (도 1). M3O-유래된 콜로니의 만능성은 핵 및 세포-표면 마커에 대한 면역염색 및 3종의 1차 배층으로의 시험관내 분화에 의해 확인되었다. 6종의 증식된 iPSC 클론은 핵형 분석 및 DNA 핑거프린팅을 받았고, 세포의 핵형 정상 및 BJ 계열이 모든 경우에서 확인되었다.

방법은, 예를 들어, 추가로 조정되어 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 근육 위성 세포를 형성하거나, 또는 적혈구, 림프구를 포함한 백혈구, 혈소판, 기질 세포, 지방 세포, 파골세포를 포함한 골 세포, 피부 세포를 포함한 상피 조직, 평활근, 골격근 및 심장근을 포함한 근육 조직, 내피 세포를 포함한 혈관 조직, 간세포를 포함한 간 조직, 및 뉴런을 포함한 신경 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 조직의 분화 세포를 형성할 수 있는 iPS 세포를 생산하기 위한 세포의 재분화 또는 재프로그램화에도 또한 광범위하게 사용될 수 있다. iPS 세포에서 심근세포, 조혈 줄기 세포, 골 세포, 예컨대 파골세포, 간세포, 망막 세포 및 뉴런을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 분화 세포 유형으로의 분화를 유도하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Song et al., Cell Res., 19(11):1233-42 (2009), Lamba et al., PLoS One, 5(1):e8763 (2010), Gai et al., Cell Biol Int. 200933(11):1184-93 (2009). Grigoriadis et al., Blood, 115(14):2769-76 (2010)). 단리된 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 줄기 세포는 분화를 유도하는 RNA에 의한 일시적 형질감염에 의해 분화되도록 유도될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 세포는 세포 유형-특이적 조건 하에서 세포를 배양함으로써 재분화될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포는 CF-1 피더 상에서 유지된 후에 무-피더 조건에 적합화될 수 있다. iPS 세포는 noggin, Dkk-1 및 IGF-1의 존재 하에 세포를 배양함으로써 분화된 망막 세포를 형성하도록 유도될 수 있다. 또 다른 측면에서, mRNA 칵테일의 효능은 Nanog 전사체의 포함에 의해 추가로 증진될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 피더 상에 50K BJ 섬유모세포를 함유하는 4종의 웰이 야생형 Oct4 또는 M3O-기반 5-인자 또는 6-인자 칵테일로 6일 동안 형질감염된 다음, 각각의 배양물이 6-웰 플레이트에서 집단화되도록 신선한 피더 상에서 1:6으로 계대배양되었다 (4). 형질감염은 각각의 플레이트 내에서 0-5일 더 계속되었다. iPSC 생산성에 대한 상이한 칵테일 및 형질감염 시간 경과의 영향을 평가하기 위해 배양물은 고정되고 TRA-1-60 항체로 제18일 (제0일은 최초 형질감염에 상응함)에 염색되었다. 결과는 칵테일에의 Nanog의 첨가가 사용된 Oct4 변이체와 무관하게 매우 유익한 반면, M3O 및 Nanog가 함께 사용될 때 최대 전환 효율이 수득되었다는 것을 제시하였다.

한 실시양태에서, M3O-기반 5-인자 또는 6-인자 칵테일의 효능이 3종의 추가의 인간 섬유모세포 세포주 (HDF-f, HDF-n 및 XFF)를 사용하는 추가의 피더-기반 실험에서 확인되었다. 재프로그램화 동역학 및 효율은 이들 저-계대배양 세포주의 모든 3종에 의해 현저히 개선되어, 정상 증식 배양에서의 BJ보다 더 빠른 천연 집단 배가 시간을 나타냈다. 일부 경우에서, 본 발명자들은 적게는 형질감염 6일만에 hESC-유사 콜로니를 수득하였으며, 수율은 형질감염이 몇일 더 계속된 실험에서 훨씬 더 높기는 하였다. 신선한 세포의 첨가에 의한 피더 층의 주기적 강화를 수반한 실험은, 이러한 전략이 일부 이익을 제공할 수 있지만, 생성된 프로토콜의 복잡성에 의해 상쇄될 것이라고 시사하였다. 따라서 본 발명자들은 간소화된 무-피더 프로토콜의 개발을 위해 보다 강력한 칵테일을 적용하는데 초점을 맞추기로 결정하였다.

본 개시내용은 무-피더 iPSC의 생성에 관한 것이다. 피더-독립적 iPSC 유래는 일반적으로 사용되는 재프로그램화 기술과 무관하게 다소 난해하다고 입증되었나, 지속적 형질감염 요법의 맥락에서 특수한 난점을 제기한다. 세포 생존율 및 증식 활성을 손상시키지 않으면서 섬유모세포가 플레이팅될 수 있는 밀도에는 하한치가 존재한다. 세포가 희박 배양물에서 유사분열 정지 또는 아폽토시스를 겪는 경향은 세포가 형질감염에 의해 및 재프로그램화 인자의 이소성 발현에 의해 스트레스를 받으면 악화된다. 더욱이, 피더-기반 재프로그램화에서 높은 세포 밀도 특징에 대해 잘 허용되는 RNA 용량은 세포가 거의 없는 분포일 때 보다 심각한 세포독성 효과를 생성시킨다. 동시에, mRNA 형질감염에 의해 달성될 수 있는 발현의 침투도는 아마도 접촉 억제와 연관된 세포내이입의 하향조절 및 G1 정지로 인해 섬유모세포가 전면생장에 도달한 후에 급격히 저하한다. 밀집 배양물에서 형질감염에 대한 이러한 감소된 허용도는 세포가 중간엽-상피 이행 (MET)을 겪은 후에 재프로그램화 동안 완화되는 것처럼 보인다. 그러나, 현재 mRNA 칵테일을 사용할 때 인간 섬유모세포가 MET에 도달하기 위해 전형적으로 요구되는 ~7일은 심지어 세포가 최저 생존가능한 초기 밀도로 플레이팅된다고 하더라도 섬유모세포 과도성장의 문제를 저지하는 것을 어렵게 만든다. 세포는 이 운명을 연기하기 위해 계대배양에 의해 묽어질 수 있지만, 매우 스트레스를 받은 재프로그램화 중간체의 플레이팅 효율은 예측하기 어렵고, 어떤 경우에도 계대배양-기반 유래 프로토콜은 편의성을 희생시키며 고처리량 적용에 들어맞지 않는다. 특정 실시양태에서, 세포는 또한 상이한 국부 세포 밀도가 반복된 형질감염을 용이하게 할 수 있도록 웰에 구배로 시딩될 수 있다.

본 개시내용은 MET의 표현형 지표 (섬유모세포 과정의 퇴화, 및 증식소의 출현 및 조약돌 형태)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, MET는 다양한 낮은 밀도 (웰당 50K vs. 100K vs. 150K)로의 표적 세포의 시딩, 계대배양 없이 6-인자 M3O 칵테일을 사용한 무-피더 재프로그램화를 가능하게 하는 증진된 칵테일을 사용한 본 발명자들의 발명에 의해 가속화되었다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 웰당 총 세포 수 약 15K 내지 500K 범위의 세포를 사용한 밀도 구배로 시딩된다.

본 발명의 한 측면은 이들 재프로그램화 배양물의 운명에 관한 것으로, 이는 아마도 과도한 세포독성 및 섬유모세포 과도성장의 효과가 둘 다 형질감염 요법의 경과에 걸쳐 자기-강화되기 때문에 시딩 밀도에 매우 민감한 것으로 입증되었다. "표준" RNA 투여 (웰당 1200 ng)를 사용한 실험에서, 수십개의 hESC-유사 콜로니가 웰당 100K로 플레이팅된 HDF-n 및 XFF 섬유모세포로부터 수득된 반면, 상응하는 50K 및 150K 배양물은 각각 집단 파괴 및 섬유모세포 과도성장에 의한 결과로서 단지 몇개의 콜로니만을 제공하였다. 2종의 다른 섬유모세포 세포주 BJ 및 HDF-a에 의해 시도된 유래에서, 심지어 가장 유망한 (150K) 배양물조차 전면생장에 도달한 직후 사실상 진행이 정지되었고, 이후 지연된 동역학을 갖는 단지 산발성 콜로니만이 수득되었다.

본 발명의 한 측면은 dsRNA 구조를 스스로 형성하거나 mRNA를 사용하여 형성할 수 있고 세포성 면역 반응을 야기할 수 있는 이상 RNA 종을 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 통해 시험관내 전사된 mRNA를 정제하는 것에 관한 것이다. 이러한 "클린업" mRNA - 감소된 세포성 면역원성을 갖는 mRNA - 를 사용하는 것은 구배 밀도로 성장시킨 비-인간 영장류 세포의 재프로그램화를 효과적으로 가능하게 하였다.

본 발명의 하나의 구체적 실시양태에서, 본 발명자들은 주위에서 5% 산소 배양으로 전환시키고, 스트레스-유도된 세포 노쇠를 최소화하기 위한 노력으로 형질감염의 최초 4일에 걸쳐 4분의 1 용량으로부터 전체 RNA 투여로 늘렸다.

본 발명의 한 예에서, 이들 신규 조건을 사용하여 본 발명자들은 c-Myc의 L-Myc로의 치환이 재프로그램화 칵테일을 추가로 개선시킬 수 있는지를 시험하였다.

또 다른 실시양태에서 본 발명자들은 RNA를 4시간 전에 분리 단계로 전달하기보다 매일 배지를 교체하면서 세포에 첨가하는 것에 의한 단순화된 형질감염 계획을 평가하였다. RNA 투여를 예상되는 세포독성의 증가를 보상하기 위해 "24-시간 형질감염" 웰에서 하향 조정하고, 2종의 상이한 형질감염 시약을 시험하였다 (RNAiMAX 및 스템펙트). XFF 세포를 웰당 50K로 플레이팅하고, 9일 동안 형질감염시켰다. 통상적인 "4-시간 형질감염" 요법은 c-Myc-기반 칵테일을 사용하여 웰당 대략 수백개의 TRA-1-60⁺ 콜로니를 제공한 반면 L-Myc 칵테일은 비교적 저조하게 수행되었다 (도 2). "24-시간 형질감염" 배양물의 결과는 보다 더 인상적이었다. 이들 웰에서 가장 생산적인 경우 (c-Myc 400 ng/ml 스템펙트 조건에 상응함), 배양물은 제9일에 마지막 형질감염 24시간 후 hESC-유사 세포에 의해 거의 과도성장되었다. "24-시간 형질감염"의 우수한 성능에 대한 기계론적 기초는 세포에 의해 방출된 확산 인자를 집중시킴으로써 묽은 배양물의 유효 밀도를 증가시키는 효과를 나타낼 수 있다. 이들 바람직한 프로토콜 조건이 웰당 75K 세포로 시딩된 배양물에서 HDF-a 섬유모세포를 사용한 유래의 또 다른 예시적인 실험에 적용될 때, 생산성은 고도 증식성 XFF 세포일 때 달성된 것보다 덜 극적이었지만, 수많은 hESC-유사 콜로니가 이르게는 프로토콜의 제9일에 다시 출현하였다 (도 4).

하나의 특정한 실시양태에서, 세포가 통상적으로 사용되는 부피, 예를 들어 1 ml, 0.75 ml, 0.5 ml, 또는 세포 배양을 여전히 지속할 수 있는 배지의 최소 양보다 더 낮은 부피의 배지에 시딩될 때, 상기 개시된 조건을 사용한 재프로그램화의 효율은 명백히 개선된다. 이러한 재프로그램화 동안의 낮은 부피 조건은 본원에서 본 발명에 포함된다.

본원에 기재된 실시양태는 물론 본 발명의 유일한 적용이 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개시내용이 약간 가변적인 조건 하에서나 또는 재프로그램화, 지정 분화 또는 전환분화를 위한 통상적인 또는 조작된 인자의 유사한 조합으로 다른 세포를 재프로그램화하는데 또한 유용하다는 것을 인식할 것이다.

다른 실시양태에서, 인자 화학양론의 최적화가 또한 재프로그램화의 속도를 증진시킬 수 있다 - mRNA 방법은 ipPSC 유도의 초기 및 후기 단계를 독립적으로 다루는 칵테일을 정의할 기회를 제공한다. M3O의 사용으로부터 수득한 이점은 iPSC 생성을 위한 신규 조작된 재프로그램화 인자의 최근 적용에 대한 검증을 제공한다. 이러한 조작된 재프로그램화 인자는 VP16 또는 MYOD, 예컨대 GAL4, GATA1, P53 등 이외의 다른 인자로부터의 전사활성화 도메인에 SOX2, KLF4, CMYC, LMYC, LIN28, NANOG 등을 융합시키는 것을 포함한다. mRNA를 전달하는데 사용되는 시약 및 방법론은 또한 siRNA 및 miRNA를 공동-형질감염시키는데 사용될 수 있으며, iPSC 생성에서 이들의 가치는 이미 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 본원에 개시된 무-피더 프로토콜은 노동 및 물질 비용의 동일하거나 보다 큰 감소와 함께 재프로그램화에 요구되는 시간을 많게는 절반까지 감소시키고, 절차에서 번거로운 단계를 제거하고, 성장 인자 또는 시토카인 - 즉, 배지 보충제와 거의 동일한 용이함으로 mRNA가 세포에 전달되게 하여, 현재 프로토콜에 비해 상당한 진전을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 세포는 면역 반응을 조정하도록 재프로그램화된다. 예를 들어, 림프구는 면역 내성, 특히 자가-내성의 증가 또는 전달을 위해 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있는 조절 T 세포로 재프로그램화될 수 있다. Foxp3 양성 T 세포의 유도 또는 투여는 자가면역 반응, 예컨대 이식 거부를 감소시키고/거나, 자가면역 질환 또는 장애, 예컨대 당뇨병, 다발성 경화증, 천식, 염증성 장 질환, 갑상선염, 신질환, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반증 (ATP), 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 증후군, 면역 결핍 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 반흔성 유천포창, 저온 응집소 질환, Crest 증후군, 크론병, 데고스병, 피부근염, 소아-피부근염, 원판상 루푸스, 본태성 혼합형 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), IgA 신병증, 인슐린 의존성 당뇨병 (제I형), 소아 관절염, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 열, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직-사람 증후군, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 결장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증의 1종 이상의 증상을 감소, 억제 또는 경감시키는데 유용할 수 있다.

방법은 파킨슨병, 알츠하이머병, 상처 치유 및 다발성 경화증과 같은 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용할 수 있는 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 방법은 또한 기관 재생 및 면역계의 복원 또는 보충에도 유용하다. 예를 들어, 분화의 상이한 단계에서의 세포, 예컨대 iPS 세포, 조혈 줄기 세포, 다능 세포 또는 단능 세포, 예컨대 전구체 세포, 예를 들어 상피 전구체 세포 등이 정맥내로 또는 국부 수술에 의해 투여될 수 있다. 방법은 다른 통상적인 방법, 예컨대 처방 의약 요법, 수술, 호르몬 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합되어 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 키트는 RNA, 세포, 및 RNA를 세포 내로 형질감염시키는 수단을 포함한다. RNA는 동결건조될 수 있거나 또는 용액 중에 있을 수 있다. 키트는 다른 물질, 예컨대 세포 배양 시약을 임의로 포함할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 키트는 개시된 방법에 따라 제조된 재분화, 탈분화 또는 재프로그램화된 세포를 제공하고, 나중의 사용을 위해 냉동 또는 동결되어 저장 및/또는 선적된다. 세포는 전형적으로 용액 중에 저장되어 생존율을 유지한다. 세포를 함유하는 키트는 세포가 4℃ 미만, 바람직하게는 -20℃ 미만으로 유지되도록 드라이 아이스를 함유하는 냉각기 내에서와 같이 생존율에 부합되는 방법을 사용하여 저장 또는 선적되어야 한다.

키트는 임의로 하기 중 1종 이상을 포함한다: 생물활성제, 배지, 부형제; 및 시린지, 바늘, 실, 거즈, 붕대, 소독제, 항생제, 국부 마취제, 진통제, 수술용 실, 가위, 스칼펠, 멸균 유체 및 멸균 용기 중 1종 이상. 키트의 성분은 개별 포장될 수 있으며 멸균될 수 있다. 키트는 일반적으로 용기, 예를 들어 시판하는데 적합한 플라스틱, 카드보드 또는 금속 용기에 제공된다. 임의의 키트는 사용 지침서를 포함할 수 있다. 방법은 신경변성 질환, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병 및 다발성 경화증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용할 수 있는 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 기관 재생 및 면역계의 복원 또는 보충에도 유용하다. 예를 들어, 분화의 상이한 단계에서의 세포, 예컨대 iPS 세포, 조혈 줄기 세포, 다능 세포 또는 단능 세포, 예컨대 전구체 세포, 예를 들어 상피 전구체 세포 등이 정맥 내로 또는 국부 수술에 의해 투여될 수 있다. 방법은 다른 통상적인 방법, 예컨대 처방 의약 요법, 수술, 호르몬 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합되어 사용될 수 있다.

본 개시내용의 측면은 줄기 세포의 배양 시스템 및 상처 치료를 위한 피부 조직 세포의 생산을 위한 분화 방법, 및 관절염, 루푸스 및 다른 자가면역-관련 질환의 치료를 위한 줄기 세포 요법을 제공한다.

실시예

본 발명은 이제 하기 실시예를 참조로 하여 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되고, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않으며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 자명한 모든 변형을 포괄한다.

실시예 1 - IVT 주형의 생성

시험관내 전사 (IVT) 주형에서의 선형 PCR-산물의 생성을 위한 플라스미스 구축물을 라이게이션 독립적 클로닝(Ligation Independent Cloning (LIC))을 사용하여 구축하였다. 본 발명자들은 먼저 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 삽입물을 수용하도록 설계된 삽입 부위가 플랭킹되어 있는 5' 및 3' 비번역 부위 (UTR)가 혼입된 모 플라스미드 (pIVT)를 구축하였다. ORF-플랭킹 서열은 문헌 [Warren et al., Cell Stem Cell, 2010]에 기재되어 있으며, 낮은 2차 구조 리더 및 강한 코작(Kozak) 부위 (5' UTR) 및 뮤린 α-글로빈 3' UTR을 포함한다. 5' 오버행을 보유하는 PIVT 벡터의 선형화된 버전을 테일링된 프라이머를 사용하여 플라스미드로부터 증폭시킨 2종의 PCR 산물의 재어닐링에 의해 생산하였다. 상보적 오버행을 갖는 ORF PCR 산물을 유사한 절차에 의해 생산하고, 벡터 PCR 산물과 풀링하고, 유전자-특이적 구축물 (pIVT-KLF4 등)을 클로닝하기 위해 열 쇼크에 의해 DH5α 박테리아 내로 형질전환시켰다. 문헌 [Warren et al., Cell Stem Cell, 2010]에 기재된 바와 같이, 생성된 플라스미드를 T7 프로모터, UTR-플랭킹된 ORF 및 폴리A 테일의 부가를 일으키기 위한 T120 테일 (서열 식별 번호: 1)이 혼입된 선형 IVT 주형을 제조하기 위해 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. T120 테일 (서열 식별 번호: 1) 영역은 테일링된 역방향 프라이머 (T120CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA (서열 식별 번호: 2))의 사용을 통해 도입하였다. M3O 및 VPx3 융합 구축물을 위해, 전사활성화 도메인-코딩 서열을 테일링된 프라이머를 사용한 PCR에 의해 ORF에 부가하였다. PCR 산물 주형 스톡을 ~100 ng/uL의 농도로 유지하였다.

실시예 2 - mRNA 칵테일의 생산

mRNA 합성 과정이 도 5에 요약되어 있다. 높은 백분율의 캡핑된 전사체를 생성하기 위해 ARCA 캡 유사체 대 GTP의 4:1 비를 사용하여 IVT 반응으로 합성 mRNA를 생성하였다. 뉴클레오티드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물 중 CTP의 5m-CTP로의 및 UTP의 슈도-UTP로의 전체 치환을 사용하여 RNA 산물의 면역원성을 감소시켰다. 캡 유사체 및 변형된 NTP를 트리링크 바이오테크놀로지스(Trilink Biotechnologies)로부터 구입하였다. IVT 반응을 수행하는데 사용된 메가스크립트(MEGAscript) T7 키트 (암비온(Ambion))에 제공되는 표준 NTP를 대체하기 위한 2.5x NTP 혼합물을 제조하였다 (15:15:3.75:3.75:3.75 mM의 ARCA:ATP:5m-CTP:GTP:슈도-UTP). 각각의 40 uL IVT 반응물은 16 uL NTP 혼합물, 4 uL 10x T7 완충제, 16 uL DNA 주형 및 4 uL T7 효소를 포함하였다. 반응물을 37℃에서 4-6시간 인큐베이션한 다음, 2 uL TURBO DNase로 37℃에서 추가 15분 동안 처리한 후, 메가클리어(MEGAclear) (암비온) 스핀 칼럼 상에서 정제하여, RNA 산물을 100 uL의 부피로 용리시켰다. 캡핑되지 않은 전사체로부터 면역원성 5' 트리포스페이트 모이어티를 제거하기 위해, 10 uL의 안타르크틱 포스파타제(Antarctic Phosphatase) 반응 완충제 및 3 uL의 안타르크틱 포스파타제 (NEB)를 각각의 프렙에 첨가하였다. 포스파타제 반응물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, IVT 산물을 재정제하였다. RNA 수율을 나노드롭(Nanodrop) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))으로 정량화하고, 프렙을 TE pH 7.0 (암비온)의 첨가에 의해 100 ng/uL의 표준화된 작업 농도로 최종 조정하였다. 목적하는 화학양론적 비로 다양한 RF를 나타내는 프렙을 풀링함으로써 RNA 칵테일을 조립하였다. 사용된 각각의 RF의 분획은 각 전사체의 예측된 분자량을 고려한 것이었으며, 3x 몰 농도로 포함된 Oct4와 그의 유래물을 제외하면 모든 RF가 등몰이었다. 짧은 수명의 핵화 단량체 LanYFP 형광 단백질을 코딩하는 mRNA의 10% 스파이크를 칵테일에 첨가하여 재프로그램화 시험 동안 형질감염 효능의 모니터링을 용이하게 하였다. 다른 실시양태에서, mRNA는 또한 총 우라실의 25% 또는 10%로 2-티오-우라실을 사용하여 생산하였다 (도 6 참조).

실시예 3 - 세포 및 배양 배지

재프로그램화의 표적이되는 세포는 BJ 신생 섬유모세포 (ATCC), HDF-f 태아 섬유모세포, HDF-n 신생 섬유모세포 및 HDF-a 성체 섬유모세포 (사이언셀(ScienCell)), 및 XFF 무-이종 신생 섬유모세포 (밀리포어(Millipore))를 포함하였다. 증식 배양을 BJ, HDF 및 XFF 세포 각각에 대해 BJ 배지 (DMEM +10% FBS), 사이언셀 섬유모세포 배지, 및 피브로그로(FibroGRO) 무-이종 인간 섬유모세포 증식 배지 (밀리포어)에서 수행하였다. 사용된 피더 세포는 3001G 조사된 신생 인간 포피 섬유모세포 (글로벌스템(GlobalStem)) 및 피브로그로 미토마이신 C-불활성화된 무-이종 인간 신생 섬유모세포 (밀리포어)였다. 무-이종 피더-기반 및 무-피더 재프로그램화 시험에 적절한 세포 계대배양 단계를 무-동물 산물 세포 해리 시약인 트립엘이 셀렉트(TrypLE Select) (깁코(Gibco))를 사용하여 수행하였다.

실시예 4 - 인간 섬유모세포의 재프로그램화

기재된 모든 재프로그램화 실험을 제조업체의 지시에 따라 셀스타트(CELLstart) (깁코) 무-이종 기질로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 수행하였다. 글로벌스템 피더를 FBS-함유 BJ 배지를 사용하여 초기 BJ 재프로그램화 실험에서 웰당 250K로 플레이팅하였다. 일부 나중의 피더-기반 시험에서, 시딩 밀도를 증가시키고, 신규 RF 칵테일을 사용하면서 접하게 되는 고 소모율에 대해 반응하여 거의-전면생장의 피더 층을 지속시키기 위한 노력으로 배지 교체 동안 피더를 즉석에서 보충하였다. 무-이종 피더를 사용 시에 혈청이 없는 플루리톤-기반 재프로그램화 배지에 플레이팅하였다. 표적 세포를 플루리톤 무-혈청 배지 (스템젠트(Stemgent)) + 항생제, 플루리톤 보충제 및 200 ng/ml B18R 인터페론 억제제 (이바이오사이언스(eBioscience))에 플레이팅하였다. 재프로그램화 동안 및 재프로그램화 후에 매일 배지를 교체하고, 최종 형질감염 다음 날에 B18R 보충을 중단하였다. 재프로그램화 동안 세포를 신선한 피더 상에 분할시킨 실험에서, 10 uM Y27632 (스템젠트)를 재플레이팅에 사용되는 배지에 포함시켰다. 형질감염을 표적 세포의 시딩 다음 날에 시작하고, 문헌에 지시된 지속기간 동안 24-시간 간격으로 반복하였다. 달리 언급되지 않으면, 매일 배지 교체 4시간 전에 RNAiMAX (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 각각의 웰에 1200 ng의 RNA 용량을 전달하였다. RNAiMAX-기반 형질감염 칵테일을 무-칼슘/마그네슘 DPBS 중 100 ng/uL RNA를 5 x로, 및 동일한 희석제 중 RNA ug당 5 uL의 RNAiMAX를 10x로 희석하여 제조하고, 10 ng/uL RNA/비히클 현탁액을 생산하도록 풀링하고, 15분 실온 인큐베이션 후에 배양 배지로 분배하였다. 스템펙트 시약 (스템젠트)을 사용하는 형질감염을 위해, RNA 및 스템펙트 (RNA ug당 4 uL)를 스템펙트 완충제 중에 혼합하여 10 ng/uL의 RNA 농도를 제공하였다. 혼합물을 15분 동안 인큐베이션한 다음, 배양 배지로 전달하거나 나중의 사용을 위해 냉동시켰다.

다른 실시양태에서, 인간 섬유모세포의 재프로그램화를 또한 플루리톤 이외의 다른 배지, 예를 들어 대립유전자의 재프로그램화 배지에서 수행하였다 (도 7 참조). 일부 실험에서 B18R을 전혀 사용하지 않았고, 다른 실험에서는 단지 형질감염의 일부에만 사용하였다.

실시예 5 - iPSC 콜로니의 특징화

iPSC 콜로니 생산성을 평가하기 위해, 재프로그램화 배양물을 DPBS (칼슘/마그네슘 함유) 중 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시키고, DPBS (칼슘/마그네슘 함유) 중 100x 희석된 스테인얼라이브(StainAlive) TRA-1-60 알렉사(Alexa) 488 항체 (스템젠트)로 면역염색하였다. 만능성에 대한 분자적 및 기능적 검증을 위해 콜로니 선별, 증식, 및 후속 면역염색 및 3계열 분화 검정을 수행하였다. DNA 핑거프린팅 및 핵형 분석을 수행하였다. 1종 초과의 마우스 모델 세트에서 기형종 형성을 수행하고 확인하였다. 이로써 줄기 세포의 만능성을 입증하였다.

iPSC가 약 9일 내, 때때로 짧게는 6일 또는 심지어 5일 내에도 생산될 수 있는 방식으로, 표적 세포를 조작된 재프로그램화 인자 및 비-조작된 재프로그램화 인자의 조합과 접촉시키는, 비-줄기 세포에서 만능 줄기 세포로의 고 효율적 재프로그램화를 위한 신규 방법이 개시되어 있다. 이들 iPS 세포는 무-피더, 무-이종 및 무-풋프린트 iPSC로서 생산될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 극적으로 증가된 재프로그램화 효율에 추가로, 신규 기술은 또한 임의의 바이러스 또는 벡터와 접촉되지 않으므로 생성된 iPSC가 "클린"하다는 점에서 모든 이전에 공지된 기술과 상이하다. 본 발명의 유용성은 세포 및 발달 연구, 뿐만 아니라 임상 적용에서의 줄기 세포 확립, 분화, 유용성을 수반하는 사실상 모든 영역에서 찾을 수 있다. 유사한 절차가 또한 지정 분화 또는 전환분화에도 유용할 수 있다.

실시예 6 - 시노몰구스 원숭이 섬유모세포의 재프로그램화

시노몰구스 원숭이 섬유모세포를 사용하는 재프로그램화 실험을 제조업체의 지시에 따라 셀스타트 (깁코) 기질로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 수행하였다. 표적 세포를 알레렐 바이오테크(Allele Biotech)의 무-혈청 배지 + 항생제에 플레이팅하였다. B18R을 사용하거나 사용하지 않으면서 12 연속일 동안 신선한 배지와 함께 전달된 2-티오-변형된 mRNA/형질감염 시약 혼합물을 사용하는 재프로그램화 동안 및 그 후에 매일 배지를 교체하였다 (도 8). 원숭이 iPSC의 콜로니는 제9일에 나타나기 시작하였고, 제12일에 성숙하고 치밀한 콜로니 단계에 도달하였다.

SEQUENCE LISTING <110> ALLELE BIOTECHNOLOGY AND PHARMACEUTICALS, INC. <120> FEEDER-FREE DERIVATION OF HUMAN-INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS WITH SYNTHETIC MESSENGER RNA <130> F6035-00038 <140> PCT/US2015/033275 <141> 2015-05-29 <150> 14/292,317 <151> 2014-05-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 <210> 2 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 cttcctactc aggctttatt caaagacca 149

Claims (32)

1. 단리된 체세포를 조성물로 형질감염시켜 체세포를 재프로그램화하거나 탈분화시키는 단계를 포함하는, 체세포를 탈분화시키거나 재프로그램화하는 방법이며, 여기서 상기 조성물은
   N-말단 MyoD 전사활성 도메인에 융합된 재프로그램화 인자 Oct4를 코딩하는 합성 mRNA, 및
   재프로그램화 인자 Sox2, Klf4, Myc, Nanog 및 Lin28을 코딩하는 합성 mRNA
   의 유효량을 포함하는 것이고,
   상기 합성 mRNA는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되어 전사로부터의 임의의 오염 비-mRNA 종 또는 dsRNA 구조를 형성할 수 있는 이상 RNA 종이 제거된 것이며,
   체세포는 재프로그램화되거나 탈분화되는 것인
   방법.
2. 제1항에 있어서, 세포가 웰 내에 밀도 구배로 시딩된 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
4. 제1항에 있어서, 세포가 비-인간 영장류 세포인 방법.
5. 제1항에 있어서, 세포가 시노몰구스 원숭이 세포인 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포가 레서스 원숭이 세포인 방법.
7. 제1항에 있어서, 세포가 개코원숭이 세포인 방법.
8. 제1항에 있어서, 세포가 개 세포인 방법.
9. 제1항에 있어서, 세포가 말 세포인 방법.
10. 제1항에 있어서, 세포가 소 세포인 방법.
11. 제1항에 있어서, 세포가 돼지 세포인 방법.
12. 제1항에 있어서, 세포가 양 세포인 방법.
13. 제1항에 있어서, 합성 mRNA가, 일렬 삼중으로 N-말단 MyoD 전사활성화 도메인에 융합된 Oct4를 코딩하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 합성 mRNA가 VP16 전사활성화 도메인에 융합된 Oct4를 코딩하는 것인 방법.
15. 표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더(feeder-free) 표면 상에서 25 k 내지 250 k 세포/웰의 밀도로 성장시키는 단계, 및
    제1항에 기재된 합성 mRNA 중 어느 1종 이상을 약 50 ng 내지 약 800 ng/ml 범위의 용량으로 사용하여 세포를 형질감염시키는 단계
    를 포함하는, 포유동물 세포를 재프로그램화하는 방법.
16. 제1항에 있어서,
    표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더 표면 상에서 50 k, 75 k, 100 k 또는 150 k 세포/웰의 밀도로 성장시키는 단계, 및
    제1항에 기재된 합성 mRNA 중 어느 1종 이상을 약 50 ng 내지 약 800 ng/ml 범위의 mRNA 용량으로 사용하여 세포를 1회 초과로 형질감염시키며, 여기서 형질감염의 나중 시점보다 더 이른 시점에 보다 낮은 mRNA 용량을 사용하는 것인 단계, 및
    계대배양 없이 iPSC를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
17. 제1항에 있어서,
    표적 세포를 표준 6-웰 플레이트 내 무-피더 표면에서 15 k, 30 k, 50 k, 75 k, 100 k, 150 k, 250 k, 500 k 세포/웰 중 어느 하나로부터 선택된 밀도로 성장시키며, 여기서 각각의 웰의 부피를 0.5 ml 내지 5 ml의 적절한 배지가 되도록 조정하는 것인 단계, 및
    제1항에 기재된 합성 mRNA 중 어느 1종 이상을 약 50 ng 내지 800 ng/ml 범위의 mRNA 용량으로 사용하여 세포를 1회 초과로 형질감염시키며, 여기서 형질감염의 나중 시점보다 더 이른 시점에 보다 낮은 mRNA 용량을 사용하는 것인 단계, 및
    세포의 계대배양 없이 iPSC를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 무-이종(Xeno-free)인 방법.
19. 제1항에 있어서, 1종 이상의 인자가 mRNA, 조절 RNA, siRNA, miRNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 체세포가 적어도 2종의 상이한 RNA로 형질감염되는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 체세포가 단능, 다능, 만능 및 분화 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
22. 제1항에 있어서, 1종 이상의 RNA가 체세포에서 단능, 다능 또는 만능 세포로의 탈분화를 유도하는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 형질감염된 세포가, 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포로서 배양 중에 유지되는 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, 형질감염된 세포가, 유도된 만능 줄기 세포를 형성하고,
    iPS 세포를 유도하여 분화 세포를 형성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
25. 제1항의 방법에 따라 시험관내에서 탈분화된 세포를 포함하는, 환자에서 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 치료하거나 억제하기 위한 제약 조성물.
26. 제1항에 있어서, 조성물이 Rarg 및 LrH-1 전사활성화 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 제1항에 있어서, 합성 mRNA가 2-티오-우라실을 포함하는 것인 방법.
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