KR20190073440A - Ｒｎａ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도 - Google Patents

Ｒｎａ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도 Download PDF

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Abstract

전례 없는 효율성과 기능성으로 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 간세포를 유도하거나, 또는 생산하는 신규한 방법. 본 발명의 핵심은 이전에 알려지지 않은 방식으로 만능에서 중내배엽에, 내배엽에, 간세포에까지 이르는 경로를 따라 다중 임계 분화 결정 지점에서 실험적으로 발견된 mRNA를 사용하는 것이다.

Description

ＲＮＡ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 11월 16일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/423,113의 이익을 주장하고, 상기 출원은 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 개시내용은 세포 밀도, 시약 농도, 및 mRNA의 특정 조합의 특정 조합 및 범위을 이용하여 동역학적으로 제어되는 세포 성장 과정을 통한 만능 줄기 세포로부터의 간세포 유도를 지시하는 것에 관한 것이다.
인간 줄기 세포의 생성 및 그 결과로 일어나는 분화에서의 최근의 노력을 통해 세포 운명의 가소성, 인간 질환 모델, 및 임상 치료제에 관한 패러다임이 바뀌었다. 체세포로부터 제조된 배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 이 둘 모두는 그의 상응하는 1차 세포와 구별이 어려운 특정 세포 유형들로 분화할 수 있으며, 그의 목록은 증가하고 있다. 그 결과, 줄기 세포는 새로운 인간 세포 요법 개발에 매우 유망하다. iPSC는 세포의 무제한적인 이용가능성, 세포를 수득하는 절차의 비침습성, 및 각 치료법을 개별 환자에게 면역 매칭함으로써 면역억제성 약물로부터의 자유를 부여할 수 있는 잠재력에 기인하여 개인 맞춤형 의약 분야에서 특정의 잠재성을 보여준다.
다양한 인간 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 세포 대체 요법 개발에 많은 연구 비용이 소비되고 있다. 예를 들어, 대개는 말기 간 부전으로 이어지는, 간 섬유증 및 경화증과 같은 간 질환은 기증된 인간 간 기관 또는 기관 유래 간세포의 이식에 의해 치료될 수 있다. 그러나, 신뢰할 수 있는 기증자 간 공급을 찾는 것이 극복해야 할 중요한 난관으로서 남아 있다. 현재, 많은 학술 및 산업 단체들이, 고가이고, 유효 용량 제어가 어려운, 재조합 단백질 형태의 다중의 재조합 성장 인자를 이용하여 ESC 또는 iPSC가 간세포가 되도록 지시하는 방법을 개발하고 있다.
비용 부담 및 비일관성을 완화시키기 위해, 일부 연구원들은 성장 인자 수용체의 효능제 또는 길항제로서 신호 경로에 영향을 줄 수 있는 소분자를 찾는 시도를 해오고 있다. 비록 성장 인자보다는 전형적으로 더 저렴하기는 하지만, 소분자의 주된 단점 하나는 그들이 의도되지 않는 표적, 예컨대, 세포막 결합 수용체, 세포내 세포 기관, 또는 게놈 성분 등에 비특이적으로 영향을 미칠 수 있다는 점이다.
전형적인 분화 프로토콜의 또 다른 중요한 구성 요소는 영양소 (지질, 아미노산, 탄수화물, 비타민 등), 적절한 염 농도, pH 완충제, 임계 요소, 및 일반 단백질 인자, 예컨대, 인슐린 또는 혈청 알부민으로 구성될 수 있는 세포 배양용 배지이다. 상이한 유형의 세포는 영양소 및 배지 성분의 요건이 상이하며, 세포 유형 특이적 성장 인자 및 신호전달을 위한 소분자에 의해 추가로 더 복잡해진다.
줄기 세포 유래 조직 세포의 임상적 적용에서, 확립된 분화 배지의 대부분의 성분은 예를 들어, 성장 인자는 특별한 절차에 의해 제조되어야 하고, 개별 인증이 필요하다는 것과 같은, 현행 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (cGMP) 규제하에 개별 인증이 요구된다.
본 개시내용은 세포 밀도, 시약 농도, 및 mRNA의 조합의 특정 조합을 사용하여 분화/유도의 지시을 제어하는, 세포 성장 동역학 및 연관된 파라미터를 조정함으로써 줄기 세포 분화를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목표를 달성하고, 본 발명의 목적에 따라, 본원에서 구현되고, 광범위하게 기술되는 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제1 조합은 FoxA2 mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제1 조합은 Sox17 mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제1 조합은 FoxA2 및 Sox17 mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제1 조합은 FoxA2, Sox17, GATA4, 및 GATA6 mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제2 조합은 Hex mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제2 조합은 Tbx3 mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제2 조합은 Tbx3 및 Hex mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제2 조합은 Tbx3, GATA4, GATA6, 및 Hex mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제3 조합은 HNF1a mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제3 조합은 HNF4a mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 mRNA의 제3 조합은 HNF4a, HNF1a, HNF6, CEB/Pa, 및 CEB/Pb mRNA를 포함하는 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 출발 세포는 체액 또는 조직으로부터 수거된 것인, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는, 질환, 장애, 또는 기형 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 질환, 장애, 또는 기형 치료를 필요로 하는 대상체 내로 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포, 및 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는, 질환, 또는 기형 치료용 조성물 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애, 또는 기형을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 질환, 장애, 또는 기형 치료를 필요로 하는 대상체 내로 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포, 및 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는, 질환, 또는 기형 치료용 조성물 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 수용자 대상체로부터 유래된 것인, 질환, 장애, 또는 기형을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 질환, 장애, 또는 기형 치료를 필요로 하는 대상체 내로 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포, 및 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는, 질환, 또는 기형 치료용 조성물 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 출발 세포는 수용자로부터 수거된 것인, 질환, 장애, 또는 기형을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계; (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및 (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 간세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계; (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; 및 (c) 유효 용량의 내배엽 특이적 mRNA에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽으로 향하도록 하는 단계를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포로부터 내배엽 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 원하는 분화 결과를 달성할 수 있도록 세포 밀도 및 분열 속도를 관리하는 것에 관한 신규한 가능화 프로세스를 제공한다. 일부 측면에서, 프로세스는 예를 들어, 타이밍, 첨가 순서, RNA 용량 및 RNA의 형질감염 동안 상이한 RNA 사이의 비율, 및 그의 지속 시간 또는 반복 횟수의 최적화를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 추가로 배양 베쓸 표면 및 환경 조건, 예컨대, 산소 농도 선택에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 원하는 세포를 선택하거나, 또는 전체 집단 중 그의 비율을 증강시키는 프로세스 및 방법, 및 분화된 세포의 냉동보존 및 재배양 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법은 3차원 단계를 통해 간세포를 성숙시키는, 간소화된 프로토콜 및 효율적 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 줄기 세포 조작으로부터 생산된, 성숙한 분화된 간세포는 글리코겐을 분비한다. 한 측면에서, 본 발명은 생체내에서 작용하는, 더욱 크게 기능성이고, 더욱 성숙된 간세포를 생산하는 새로 개발된 프로토콜을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 성숙한 간세포는 다양한 간 질환, 병태 및 손상의 요법에 유용하다.
특정 실시양태에서, 줄기 세포 유도를 통해 성숙하고, 기능성 간세포를 생산하는 예시적 방법은 본원 실시예에서 설명되고, 기술된 바와 같은 방식 및 단계에 의해 재현될 수 있다. mRNA를 적당한 용량 및 전달 조건에서 임계 운명 변환점에 있는 세포와 접촉시킴으로써, 및 다량의 고가의 성장 인자를 사용하지 않고 더 적은 비용으로 매우 높은 효율을 달성하였다. mRNA는 기능성 단백질을 코딩함으로써 세포 및 발생 사건을 지시하는 데 더욱 특이적이기 때문에, 개시된 방법은 인간 간 세포를 생산하는 데 있어 임의의 공지된 방법에 비하여 훨씬 더 강건하며, 이는 간 질환, 병태 및 손상 치료에서의 인간 요법을 위한 기틀을 마련하고 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한, 대개는 순도, 안정성, 및 독성이 다른, 성장 인자 수용체의 효능제 또는 길항제로서 신호 경로에 영향을 주는 소분자를 사용하지 않거나, 또는 감소된 양으로 사용함으로써 세포 운명을 결정하는 신규한 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 방법은 적절하게 공급된, 분화 지시 유전자의 mRNA 사용을 통해 분화 배지 확립이 간단하다는 주된 이점을 제공한다. 이는 한 번에 하나의 구성 성분을 제거 또는 첨가함으로써 수행되는 "분화 배지"의 고된 시험인 선행 접근법과 대조를 이룬다. 한 측면에서, mRNA 및 적절한 배지의 최적의 조합 뿐만 아니라, 본원에 개시된 다른 파라미터는 분화된, 기능성 간세포 생산 프로세스를 간소화할 수 있고, 이는 본 발명의 필수적인 부분이다.
추가로, 다른 방법은 또한 인증서를 교부받아야 하고/거나, GMP 실행을 이용하여 생산되어야 하는, 예컨대, 혈청, 또는 매트리겔과 같은 동물 제품에 의존한다. 본 발명의 또 다른 측면은 주로, 균일한 인증 및 품질 관리 프로세스에 적합한 단일 유형의 분자를 기반으로 하는 새로운 방법을 생성하는 것이다.
본 개시내용은 조직 특이적 분화에서 마스터 제어 유전자 또는 중요한 전사 인자의 고효율적이고, 제어가 잘 이루어지는 발현을 이용하는 분화 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 상기 인자는 제공된 전형적 사례를 통해 입증된, 적절하게 변형 및 정제된 mRNA 형태로 만능 줄기 세포 내로 도입된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 줄기 세포를 상이한 유형의 세포로 향하도록 하는 데 최적화된, 중요한 세포 운명 인자 및 전사활성화 도메인과 통상의 전사 인자 (TF) 사이의 융합을 이용하는 단계; 합성 메신저 RNA (mRNA)로서 상기 인자를, 트랜스진을 적절한 수준으로 발현시키는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 만능 줄기 세포 내로 도입하는 단계; 고효율로 특이적 분화에 이르게 하는 최적화된 조건하에서 세포를 유지시킴으로써 만능 상태 또는 전구체 상태의 줄기 세포 또는 전구 세포가 특정 계통 또는 조직 세포 유형을 향해 유도되도록 하는 단계를 포함하는, 세포 분화를 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 줄기 세포를 상이한 유형의 세포로 향하도록 하는 데 최적화된, 중요한 세포 운명 인자 및 전사활성화 도메인과 통상의 전사 인자 (TF) 사이의 융합을 포함하는, 중요한 세포 운명 유전자를 발현하는 줄기 세포 (총칭하여 줄기 세포로 언급됨)를 생성하는 단계; 합성 메신저 RNA (mRNA)로서 상기 인자를, 트랜스진을 적절한 수준으로 발현시키는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 만능 줄기 세포 내로 도입하는 단계; 고효율로 특이적 분화에 이르게 하는 최적화된 조건하에서 세포를 유지시키는 단계 중 적어도 하나를 포함하는, 만능 상태 또는 전구체 상태의 줄기 세포 또는 전구 세포를 특정 계통 또는 조직 세포 유형을 향해 변경시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 바와 같은, 실험적으로 검증된 조건하에서 iPSC를 출발 세포로서 배양하여 상기 세포를 분화를 위한 출발 세포로서 제조하는 단계; b) 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; c) 개시된 용량에서의 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 내배엽 특화 유전자의 mRNA를 사용하여 분화 세포를 내배엽으로 향하도록 하는 단계; d) 추가로, 형질감염을 통해 추가의 유전자의 mRNA 또는 유전자의 mRNA의 조합을 사용하여 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계; e) 추가로, 추가의 또 다른 유전자의 mRNA 또는 유전자의 mRNA의 조합을 이용하여 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 간세포를 수득하는 단계를 포함하는, iPSC로부터 분화된 간세포를 생산하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 바와 같은, 실험적으로 검증된 조건하에서 iPSC를 출발 세포로서 배양하여 상기 세포를 분화를 위한 출발 세포로서 제조하는 단계; b) 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; c) 개시된 용량에서의 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 내배엽 특화 유전자의 mRNA를 사용하여 분화 세포를 내배엽으로 향하도록 하는 단계를 포함하는, iPSC로부터 내배엽 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 목표 및 이점은 부분적으로 하기 설명에 기재될 것이며, 이는 부분적으로는 설명으로부터 명백해질 수 있거나, 또는 본 발명의 실시예에 의해 학습될 수 있다. 본 발명의 목표 및 이점은 특히 첨부된 청구범위에서 주목된 요소 및 조합에 의해 실현 및 달성될 것이다.
상기의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명, 둘 모두 단지 예시적이고, 설명하기 위한 것이며, 주장하는 바와 같이, 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서에 포함되어 있고, 그의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 수개의 실시양태를 예시하고, 기술내용과 함께, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 신청 및 필요한 수수료 지불시에 사무국에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 상기 측면 및 이점은 첨부된 도면을 참조로 하여 하기 상세하게 설명되는 기술내용으로부터 자명해질 수 있으며, 여기서:
도 1a는 상이한 출발 밀도로부터의 내배엽 세포를 보여주고, 내배엽 유도의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 1b는 다양한 밀도 (예컨대, 실시예에 기술된 바와 같은 저밀도 내지 고밀도)의 Sox17 mRNA를 사용함으로써 iPSC로부터 유도된 내배엽 세포를 보여주고, 내배엽 유도의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 2는 상이한 내배엽 세포 밀도로부터 출발한, 클러스터를 형성하는 간 전구 세포를 보여주고, 간 전구체 유도의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다. 도 2a는 세포 밀도/유도와 연관된 클러스터를 나타낸 예시도를 보여주는 것이다. 도 2b는 세포 밀도/유도와 연관된 클러스터를 나타낸 예시도를 보여주는 것이다. 도 2c는 세포 밀도/유도와 연관된 클러스터를 나타낸 예시도를 보여주는 것이다.
도 3은 단층 배양물 중 간 전구 세포로부터 직접 유래된 간세포를 보여주고, 간세포 유도의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 4는 간세포로 성숙되는, 3차원 (3D) 구체로서 성장한 간 전구 세포를 보여주고, 3D 구체 형태의 간세포 성숙의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 5는 간세포 구체인 세포 (좌측의 H&E)가 글리코겐에 대하여 양성 (우측의 PAS)이라는 것을 보여주고, 글리코겐 분비에서 작용하는 3D의 간세포의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다. 도 5a는 간세포/글리코겐을 나타낸 예시도를 보여주는 것이다. 도 5b는 간세포/글리코겐을 나타낸 예시도를 보여주는 것이다.
도 6은 간세포 마커를 제시하는 간세포 구체인 세포를 보여주고, 특이적인 세포 마커를 나타내는, 인간 iPSC로부터 유래된 내배엽 및 간세포의 예시적인 실시양태를 도시한 것이다. 도 6a는 AFP 염색을 보여주는 것이고, 도 6b는 A1 항-트립신을 보여주는 것이다.
도 7은 단층 배양물로서 재플레이팅된 3D 간 전구 세포 구체로부터 직접 유래된 간세포를 보여주고, 3D 구체를 통해 생성된 인간 간세포가 단층으로 재플레이팅될 수 있고, 성숙한 간세포 형태를 나타낼 수 있다는 것을 나타낸 예시적인 실시양태를 도시한 것이다.
도 8은 출발 집단 중 2백만 개의 iPSC를 옵티미제이션 2, OC-100 프로세싱 어셈블리(Optimization 2, OC-100 processing assembly)에 설치된 맥스사이트 STX를 사용하여 형질감염시킨 것을 보여주는 것이다. 형질감염 후 24시간째에 EVOS 영상화 시스템을 이용하여 10X으로 사진 촬영하였다. 도 8a는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다. 도 8b는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다. 도 8c는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다. 도 8d는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다. 도 8e는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다. 도 8f는 예시적인 형질감염과 연관된 iPSC의 예시도를 보여주는 것이다.
본 발명을 기술할 때, 본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 관련 기술분야에서 인식된 그의 통상의 의미를 가진다. 하기 기술내용이 본 발명의 구체적인 실시양태 또는 특정 용도에 대한 것이므로, 이는 단지 예시적인 것이며, 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기 기술내용은 본 발명의 정신 및 범주에 포함되는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포괄하는 것으로 의도된다.
근육 (MyoD), 눈 (Pax6), 및 발생 생물학의 다른 분야에서의 연구에 기초하여 "마스터 제어" 유전자, 즉, 한 중요한 유전자 (전형적으로, 한 전사 인자 유전자, 종종, 함께 작용하는 소수의 유전자들)가 발생 동안 세포 및 조직의 운명, 및 최종적으로는 전체 기관 형성을 결정할 수 있다는 개념이 일반적으로 받아들여지고 있다. 줄기 세포에서 발현되는 선정된 전사 인자 군의 발현에 의해 분화된 세포는 만능 상태로 복귀될 수 있다는 신야 야마나카의 발견을 통해 장기간의 다단계 운명 변화를 거쳐 세포를 구동시키는 데 있어 소수의 중요한 전사 인자의 영향력이 입증되었다. iPSC 세대에 대해 다른 그룹에 의해 이루어진 연구는 재프로그래밍 인자 선택을 확장시켰고, 그 결과, 재프로그래밍 목적으로 전사 인자 선택에 있어서 일부 변형이 허용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 야마나카의 원 연구에서, 세포 형질전환에 영향을 주기 위해서는 재프로그래밍 인자의 장기간 발현이 요구되는 바, 재프로그래밍 인자의 발현은 게놈 내로 통합된 바이러스 벡터의 적용을 통해 달성되었다. 통합된 바이러스 카세트로부터의 재활성화된 발현의 가능성은 심지어 시험관내 연구에 대해서도 관심사가 되는 동시에, 수반되는 게놈 변형은 iPSC의 치료적 적용에 대하여 중요한 장애를 나타낸다. 본 발명자 그룹에 의해 가장 최근에 개시된 바와 같은, mRNA 형질감염을 재프로그래밍에 적용시키는 것은 특히 흥미로운데, 그 이유는 상기 시스템을 통해서 간단하게는 세포 배양 배지에 첨가된 전사체의 종류를 변경시킴으로써 재프로그래밍 칵테일 및 심지어는 개별 성분 인자의 발현이 짧은 시간 프레임 내에서 조정될 수 있도록 할 수 있기 때문이다. 일단 특정 인자의 형질감염이 종료되고 나면, 세포질 내 mRNA의 급속 붕괴로 인해 표적 세포 내의 이소성 발현은 빠르게 중지된다. 비록 mRNA가 표적 세포 내에서 지속되지는 않지만, 형질감염된 DNA의 경우에서와 같은 속도 제한 핵 전위를 필요로 하지 않고, 바이러스 벡터를 통합하지 않으면서, 세포질 내에서 직접 번역될 수 있는 그의 능력은 mRNA의 짧은 반감기를 그 이상으로 보상함으로써 작은 시간창 내에서 고도로 효율적이면서, 우수한 발현이 일어나게 하며, 이는 세포 운명 결정에 중요하다.
장시간 지속되는 DNA 벡터, 예컨대, 에피솜 플라스미드는 세포 운명 변경을 위해 사용될 때, 무작위적인 게놈 통합의 임의의 위험을 감소시키기 위해서는 위닝(weaning)을 필요로 한다. RNA 바이러스 또는 바이러스-유도체, 예컨대, 센다이(Sendai) 바이러스 또는 베네수엘라 말 뇌염 (VEE) 바이러스는 심지어 변형된 비감염성 RNA 레플리콘이 되도록 스트리핑이 된 이후에도, 숙주 게놈 내에 숨어 있는 바이러스 요소와 재조합하기 쉬운 바이러스 요소를 여전히 보유한다. 음성 데이터 형태의 증거를 장황하게 찾지 않고서는 세포에서 바이러스 벡터를 제거하였다고 완벽하게 확신하기는 항상 어렵다. 본 발명은 mRNA 기반 세포 운명 결정의 이점을 지시된 분화에 적용시키는 것을 목표로 하는 다중의 발명 단계를 개시한다. 요약하면, 본 개시내용은 간소화된 세포 분화 지시 방법에서 1회 또는 다회 라운드에 걸친 이소성 전사 인자 발현을 교시한다.
그럼에도 불구하고, mRNA 기반 줄기 세포 분화에 대한 기술상의 장애가 존재한다. 모든 줄기 세포 유형 및 배양 배지가 효율적인 mRNA 전달에 동일하게 도움을 주는 것은 아니며, 이는 현재 mRNA 기반 분화에 방해가 되고 있다. 줄기 세포, 특히, 대부분의 인간 줄기 세포주는 형질감염 내성 패치를 형성하지 않고는 배양하기가 상당히 어렵다는 것 또한 널리 알려져 있다. 대부분의 세포가 변형된 mRNA에 의해 형질감염될 수 있는 조건하에서 만능 줄기 세포를 성장시킬 수 있다는 것이 본 발명의 교시의 일부이다. 또 다른 실시양태에서, RNA 및 형질감염 시약 (이 둘 모두 독성과 연관되어 있다)의 용량은, 세포 운명 변경 프로세스에 의해 야기되는 아폽토시스 유발성 및 세포증식 억제 영향력에 직면하여 표적 세포의 생존능을 지원하면서, 마스터 제어 유전자가 효과를 발휘할 수 있는 수준으로 세포에 제공되어야 한다.
따라서, 앞서 공지된 줄기 세포 분화 방법과 연관된 문제들에 비추어 볼 때, 본원에 기술된 신규한 방법, 물질 및 프로토콜은 개선된 프로세스 효율 및 생성된 세포의 품질로 iPSC 또는 ESC로부터 상이한 세포 유형을 생산한다. 본 발명은 표적 줄기 세포에 전달된 TF mRNA의 강화를 통해 유의적인 개선을 달성하였다. 본 발명은 또한 피더 세포 또는 임의의 다른 잠재적 이종-오염 시약의 사용 없이, 인간 줄기 세포로부터 무-풋프린트(footprint-free) 조직 세포의 생산을 지원하는 신규 프로토콜을 제공한다. 신규 프로토콜은 변형된 mRNA의 이점을 확대시키고, 줄기 세포 유도 기술의 치료 적용에 남아있는 걸림돌을 해결하는 데 도움을 줄 것이다.
만능 상태에서부터 종점의 분화된 상태로의 분화는 대개 수주 내지 심지어 수개월이라는 시간 프레임이 소요되면서, 다단계에 걸쳐 진행된다는 것을 고려해 볼 때, 성장 인자 기반의 단계식 전략법은 본질적으로 비효율적이며, 장황하다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 근본적으로 간세포 생성을 유도하는 데 성장 인자의 필요성을 제거한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 줄기 세포를 상이한 유형의 세포로 향하도록 하는 데 최적화된, 중요한 세포 운명 인자 및 전사활성화 도메인과 통상의 전사 인자 (TF) 사이의 융합을 포함하는, 중요한 세포 운명 유전자를 발현시키고 (총칭하여 줄기 세포로 언급됨); 합성 메신저 RNA (mRNA)로서 상기 인자를, 트랜스진을 적절한 수준으로 발현시키는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 만능 줄기 세포 내로 도입하고; 이전에는 달성불가능했던 효율로 특이적 분화에 이르게 하는 최적화된 조건하에서 세포를 유지시킴으로써 만능 상태 또는 전구체 상태의 줄기 세포 또는 전구 세포를 특정 계통 또는 조직 세포 유형을 향해 변경시키는 것에 관한 것이다. mRNA 도입을 통해 발현되는 인자로는 또한 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 신호 펩티드 및 세포 운명에 영향을 주는 분비된 인자 또는 변형 효소를 포함할 수 있다. 유사한 방법을 사용하여, 분화를 지시하기 위해 마이크로RNA (miRNA) 또는 다른 비-단백질-코딩 RNA를 세포 상태 이행하에 있는 세포 내로 도입할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다른 방법들과 비교하였을 때, 본 발명은 간세포로의 줄기 세포 분화에 관여하는 시간, 비용 및 노력을 크게 감소시킨다.
본 발명은 중요한 세포 운명 인자를 포함하고, 줄기 세포를 상이한 유형의 세포로 향하도록 하는 데 최적화된, 중요한 세포 운명 유전자를 발현시키는 단계; 합성 메신저 RNA (mRNA)로서 상기 인자를, 트랜스진을 적절한 수준으로 발현시키는 방법에 의해 바람직한 밀도로 배양된 만능 줄기 세포 내로 도입하는 단계; 고효율로 특이적 분화에 이르게 하는 최적화된 조건하에서 세포를 유지시키는 단계 중 적어도 하나를 포함하는, 만능 상태 또는 전구체 상태의 줄기 세포 또는 전구 세포를 특정 계통 또는 조직 세포 유형을 향해 변경시키는 방법을 기술한다.
특정 실시양태에서, 완전히 안정화된, 증식된 iPSC를 제공한다.
특정 실시양태에서, 단리 후 iPSC의 10+ 계대에 걸쳐 진행될 수 있는 에피솜 또는 RNA 바이러스 (예컨대, 센다이)를 제거할 필요가 없다.
특정 실시양태에서, 프로세스는 무-피더(feeder-free)이다.
특정 실시양태에서, 프로세스는 모든 합성 또는 인간 시약을 포함하고, 인간이 아닌 동물 유래 성분은 포함하지 않는, 무-이종(xeno-free)이다.
특정 실시양태에서, 프로세스는 (대개는 에피솜 경우에 일어나는) DNA의 게놈 내로의 무작위적인 통합은 없는, 무-풋프린트이다.
특정 실시양태에서, 프로세스는 환자 특이적 출발 조직 및/또는 게놈 편집을 통해 완전히 맞춤화된 유전자 배경을 얻는다.
또 다른 실험에서, 하기 표 1에 개요된 프로세스에 대한 대안으로, 현탁액 중에서 구체로서 성장된 iPSC 세포를 플레이트의 표면 상에 플레이팅하지 않고, 전기천공을 이용하여 (예를 들어, 맥스사이트(MaxCyte) STX 전기천공장치를 이용하여) 직접 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 구체인 2백만 개의 출발 iPSC를 현탁액 중에서 상이한 mRNA, 예컨대, Sox17 또는 Pax6으로 형질감염시키거나, 또는 모의 형질감염시켰다. 도 8에서 시험된 mRNA 양은 2,500 ng이었다. 이어서, 세포를 Sox17 형질감염의 경우, NBM 중에서, 또는 Pax6 형질감염의 경우, KSR을 포함하는 MEM알파(MEMalpha) 중에서 성장시켰다. 형질감염은 1, 2, 3, 4, 5회, 또는 심지어는, 이행이 더욱 장기간이 소요된다면 그 초과로 반복될 수 있다. 결과로서, Sox17 mRNA의 1차 형질감염 후, 세포 클러스터는 유의적으로 더 작고, 덜 조밀해진 구체가 되었고, 이로써, 정의된 "가장자리" 또는 외부 경계를 잃게 되었다. 그에 반해, 모의 형질감염된 구체는 2D 사진에서 뚜렷하게 육안으로 관찰가능한 외부 "가장자리"를 보이면서, 잘 정의된 상태 그대로 유지된다. 비형질감염된 또는 모의 형질감염된 iPSC의 더 작은 구체는 투명한 외관을 가지지만, 그에 반해 더 큰 구체는 세포층이 두꺼운 바, 덜 투명하게 보인다. 비교하면, Pax6 (신경 분화 TF) mRNA로 형질감염된 iPSC 구체는 외배엽, 즉, 신경 전구 세포를 향해 진행되었고, 그의 구체는 모의 형질감염된 것보다 더욱 어두워졌고, 덜 선명한 "가장자리"를 가졌지만, Sox17 형질감염된 것보다는 크기가 더 컸고, 더욱 잘 정의된 경계를 가졌다.
동일한 원리 및 유사한 방법에 의해, 배엽층 특이적 중간 세포, 예컨대, 내배엽 세포, 및 더욱 하류의 중간 세포, 예컨대, 간세포 전구 세포, 췌장 전구 세포 등은 또한 구체 형태로 추가의 TF mRNA로 형질감염될 수 있다. 이러한 방식으로 형질감염된 세포는 소분자, 성장 인자, 또는 세포 배양물 중의 다른 요소로부터의 독성에 대하여 더 큰 내성을 가지며, 이는 일반적으로 화학 시약을 사용하는 2D 형질감염보다 분화에서 더욱 큰 효율성을 보여야 한다. 이전에 과학 공개문헌에서는 볼 수 없었던 상기와 같은 관찰 결과는 전기천공 장비 시험 동안 우연히 얻게 되었고, 이는 본 개시내용의 일부로서 가능화 방법으로서의 역할을 하였다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기에서 다수의 용어를 정의한다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 예컨대, 단수 용어는 단지 단수의 엔티티만을 지칭하는 것이 아니라, 예시를 위해 그의 구체적인 예가 사용될 수 있는 일반 분류를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 용어는 본 발명의 구체적인 실시양태를 기술하기 위해 사용되지만, 청구범위에서 개요되는 것을 제외하면, 그의 사용이 본 발명의 범위를 정하는 것은 아니다.
"간세포 유사 세포"라는 용어는 간세포와 특징을 공유하는 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 간세포 유사 세포는 추가로 형태학적 특징에 의해서 뿐만 아니라, 특이적 마커 특징에 의해 정의된다. 유도 만능 줄기 세포 유래 간세포 유사 세포는 간세포와 유사한 특징 (마커 및 호르몬 특징 포함)을 공유하는 바, 유도 만능 줄기 세포 유래 간세포 유사 세포는 유도 만능 줄기 세포 유래 간 세포 또는 간세포와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"배상체"란, 만능 세포로부터 유래된 세포의 응집체를 지칭하는 것으로, 여기서, 세포 응집은 세포가 표면에 부착하지 못하게 방해하여 전형적인 콜로니 성장을 형성하는 임의의 방법에 의해 개시될 수 있다. 본원에서 사용되는, "배상체"란, 포유동물 공급원으로부터의 배아의 포배기 단계로부터 유래된 배아 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 만능 줄기 세포의 3차원 구상 응집체를 지칭한다. 배상체는 체세포 핵 이식, 또는 유도 만능 줄기 세포를 수득하기 위한 체세포의 재프로그래밍을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 임의의 기술을 통해 유래된 배아 줄기 세포로부터 형성될 수 있다.
본원에서 사용되는, "유도 만능 줄기 세포"라는 용어는 체세포 (예컨대, 성체 체세포)로부터 유래된 만능 줄기 세포를 지칭한다. 유도 만능 줄기 세포는 임의의 성체 세포 유형을 형성할 수 있는 그의 분화 능력에서는 배아 줄기 세포와 유사하지만, 배아로부터 유래된 것은 아니다.
본원에서 사용되는, "세포," "세포주," 및 "세포 배양물"은 자손을 포함한다. 고의적 또는 우발적 돌연변이에 기인하여 모든 자손은 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 점도 이해하여야 한다. 기능 또는 생물학적 특성이 원래 형질전환 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 변이체 자손도 포함된다.
본원에서 사용되는, "조성물"은 활성제, 및 불활성 (예를 들어, 검출가능한 작용제 또는 표지)이거나, 예컨대, 애주번트와 같이 활성인 적어도 하나의 다른 화합물 또는 분자의 조합을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "배양하는"이란, 세포가 세포 군으로서 증식할 수 있고, 노화를 피할 수 있는 조건하에서 세포를 유지시키는 것을 지칭한다. "배양하는"이라는 것은 또한 세포가 또한 또는 대안적으로 분화하는 조건을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, "차별적으로 발현된"이란, 정상 또는 대조군 세포에서의 동일한 유전자 또는 조절인자 영역에 의한 RNA 생산 수준과 비교하여, 게놈의 유전자 또는 조절 영역으로부터 전사된, mRNA, tRNA, miRNA, siRNA, snRNA, 및 piRNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는, RNA, 또는 유전자에 의해 코딩된 단백질 생성물의 차별적인 생산을 지칭한다. 또 다른 맥락에서, "차별적으로 발현된"이란, 세포 또는 조직에서 뉴클레오티드 서열 또는 단백질이 정상 또는 대조군 세포와 비교하여 상이한 시간적 및/또는 공간적 발현 프로파일을 가진다는 것 또한 지칭한다.
본원에서 사용되는, "과다발현된" 또는 "과다발현"이란, 정상 또는 대조군 세포에서의 RNA 또는 단백질 생성물의 발현 수준과 비교하여 유전자에 의해 코딩된 RNA 또는 단백질 생성물의 증가된 발현 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "과소발현된" 또는 "과소발현"이란, 정상 또는 대조군 세포에서의 RNA 또는 단백질 생성물의 발현 수준과 비교하여 유전자에 의해 코딩된 RNA 또는 단백질 생성물의 감소된 발현 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "분화하다" 또는 "분화"란, 전구체 또는 전구 세포 (즉, 간 전구 세포)가 특정 세포 유형, 예컨대, 간세포로 분화되도록 하는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "유효량"은 세포, 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 유익한 또는 원하는 생물학적, 정서적, 의학적, 또는 임상적 반응에 영향을 주기 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 복용으로 투여될 수 있다. 본 용어는 정상적인 생리 기능을 증강시키는 데 효과적인 양 또한 그의 범주 내에 포함한다.
본원에서 사용되는, 세포와 관련하여 "증식" 또는 "증식된"이란, 동일하거나, 또는 동일하지 않을 수도 있는, 초기 세포 집단으로부터의 한 특징적인 세포 유형 또는 세포 유형들의 개수 증가를 지칭한다. 증식을 위해 사용되는 초기 세포는 증식으로부터 생성된 세포와 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 증식된 세포는 초기 세포 집단의 생체외 또는 시험관내 성장 및 분화에 의해 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는, "발현"이란, 폴리뉴클레오티드가 RNA 전사체로 전사되도록 하는 프로세스를 지칭한다. mRNA 및 다른 번역된 RNA 종과 관련하여, "발현"이란, 전사된 RNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되도록 하는 프로세스 또는 프로세스들 또한 지칭한다.
본원에서 사용되는, "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPS 세포" 또는 "iPSC"는 비-만능 세포로부터 인공적으로 유래되는 (비자연적으로 유래되는) 다중 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "무통합 iPS 세포"란, 비-만능 세포의 게놈 내로 통합된 외인성 트랜스진을 함유하지 않는 iPS 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "단리된"이란, 자연상에서는 보통 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편과 회합되어 있는 구성 성분, 세포 등으로부터 분리된 것을 의미한다. 비자연적으로 발생된 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편은 그와 그의 자연적으로 발생된 카운터파트와의 구별을 위해 "단리"를 필요로 하지는 않는다.
본원에서 사용되는, "농축된"이란, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 분자가 그의 자연적으로 발생된 카운터파트의 것보다 부피당 분자의 농도 또는 개수가 크다는 점에서 그의 자연적으로 발생된 카운터파트로부터 구별가능하다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "희석된"이란, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 분자가 그의 자연적으로 발생된 카운터파트의 것보다 부피당 분자의 농도 또는 개수가 적다는 점에서 그의 자연적으로 발생된 카운터파트로부터 구별가능하다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "분리된"이란, 원래의 공급원 또는 집단으로부터 물리적으로 분할됨에 따라, 분리된 화합물, 작용제, 입자, 또는 분자는 더 이상 원래의 공급원 또는 집단의 일부분으로서 간주될 수 없는 상태를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 치료 목적의 "포유동물"이란, 인간, 가축 및 농장 동물, 인간이 아닌 영장류, 및 동물원 동물, 스포츠용 동물 또는 애완 동물, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 개, 말, 고양이, 및 소를 비롯한, 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "줄기 세포"란, 다중 세포 유형으로 분화할 수 있는 임의의 자기 재생 전능, 만능 세포 또는 다능 세포 또는 전구 세포 또는 전구체 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "전능"이란, 세포가 유기체에서 배아외, 또는 태반 세포도 포함하는 모든 세포 유형으로 분화할 수 있고, 그를 생성시킬 수 있다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "만능"이란, 세포가 배아외, 또는 태반 세포를 제외한, 임의의 태아 또는 성체 세포 유형을 비롯한, 유기체를 구성하는 모든 세포 유형으로 분화할 수 있고, 그를 생성시킬 수 있다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "다능"이란, 세포가 1개 초과의 세포 유형으로 발생할 수 있지만, 그가 발생될 수 있는 세포 유형에 있어서 만능 세포보다 더 많은 제한을 받는 것을 지칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "대상체," "개체," 또는 "환자"란, 척추동물 유기체를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "실질적으로 순수한 세포 집단"이란, 명시된 세포 마커 특징 및 분화 잠재능을 가진 세포 집단이 전체 세포 집단을 구성하는 세포의 약 50%, 바람직하게, 약 75-80%, 더욱 바람직하게, 약 85-90%, 및 가장 바람직하게, 적어도 약 95%인 세포 집단을 지칭한다. 따라서, "실질적으로 순수한 세포 집단"이란, 지시된 검정 조건하에서 명시된 세포 마커 특징 및 분화 잠재능을 보이지 않는 세포를 약 50% 미만, 바람직하게, 약 20-25% 미만, 더욱 바람직하게, 약 10-15% 미만, 및 가장 바람직하게, 약 5% 미만으로 함유하는 세포 집단을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "전-분화"란, 전구체 세포 또는 전구 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포)가, 추가로 최종의 이펙터 세포 (예컨대, 간세포)로 분화할 수 있는 잠재능을 가지는 중간 세포 유형, 예컨대, 간 전구 세포로 분화되도록 하는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "치료적"이란, 질환, 장애, 병태, 또는 부작용을 치료, 치유, 및/또는 호전시키는 것, 또는 질환, 장애, 병태, 또는 부작용의 진행 속도를 감소시키는 것을 지칭한다. 본 용어는 정상적인 생리 기능을 증강시키는 것, 완화 치료, 및 질환, 장애, 병태, 또는 부작용의 부분적 치료 또한 그의 범주 내에 포함한다.
본원에서 사용되는, "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 일반적으로 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환, 그의 증상 또는 병태를 예방 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방인 것일 수 있고/거나, 질환, 병태, 증상, 또는 질환에 기인하는 부작용의 부분적으로 완전 치유라는 점에서 치료적인 것일 수 있다. 본원에서 사용되는, "치료"라는 용어는 포유동물, 특히, 인간에서의 임의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 취약할 수 있지만, 아직은 질환을 앓는 것으로 진단받지 않은 대상체에서 질환이 발생하지 못하게 막는 것; (b) 질환을 억제시키는 것; 즉, 그의 발생을 정지시키는 것; 또는 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉, 질환 및/또는 그의 증상 또는 병태를 완화 또는 호전시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는, "치료"라는 용어는 치료적 치료 및 예방 또는 예방적 조치, 둘 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상으로는 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애를 예방하고자 하는 대상도 포함한다.
본원에서 사용되는, "예방적"이란, 진단 미확정인 경우라도, 또는 질환 또는 병태가 여전히 준임상적 단계에 있는 동안, 질환 또는 병태가 발생하기 전에 질환 또는 병태를 방해, 또는 정지시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "활성제"란, 생물학적으로 활성이거나, 또는 그를 투여받는 대상체에 대해 생물학적 또는 생리적 효과를 유도하는 물질, 화합물, 또는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "제약상 허용되는 담체"란, 활성제인 본 개시내용의 연골세포, 또는 본 개시내용의 연골세포를 함유하는 조성물과 함께 공동으로 투여되고, 동물용 및/또는 인간용으로, 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 받았거나, 또는 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있는 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
세포 유형
예시적인 세포 유형으로는 예를 들어, 내배엽 세포, 간 전구 세포, 및 간세포를 포함할 수 있다.
배양 베쓸로 적합한 표면의 예로는 iPSC용으로는 비트로네틴(Vitronetin), E-카드헤린(E-cadherin), 코닝® 신테맥스® II(Corning® Synthemax® II) 또는 매트리겔을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 내배엽용으로는 매트리겔을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 간 전구 세포용으로는 매트리겔 또는 콜라겐(Collagen)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 측면에서, 체세포를 탈분화시키거나 또는 재프로그래밍하는 예시적인 방법은 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, 및 Lin28로부터 선택되는 합성 mRNA 재프로그래밍 인자 중 임의의 하나 이상의 것 및 전사활성화 도메인을 사용하여 체세포를 재프로그래밍하거나, 또는 탈분화시키는 것을 포함할 수 있다. IPSC 조정을 위한 방법 및 조성물은 USSN 13/893,166 및 USSN 14/292,317에 기술되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 현탁 세포 배양 사용 프로토콜이 존재하며, 상기 현탁 배양을 위해 저 세포-부착 배양 플레이트 및 베쓸이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 최적의 유도 조건을 위해 환경 조건, 예컨대, 산소 농도가 조정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 원하는 세포의 선택, 또는 전체 세포 배양 집단 중의 그의 전면생장률(%) 또는 세포 밀도 증강 프로세스 및 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 간세포 유사 세포의 냉동보존 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 분화된 세포 중 일부는 보관 동안 최적의 세포 생존율을 위해 냉동보존된다. 일부 실시양태에서, 보관 동안 세포 생존율을 증가시키기 위해 배양 배지에 HSA 및 DMSO가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 배양 배지 중 10% DMSO와 함께 2.5% HSA가 사용될 수 있다. 상기 적용을 사용하여 보관시 생존율을 추가로 개선시키기 위해 세포 개수가 최적화될 수 있다.
분화된 세포의 재배양 방법 또한 제공한다. 세포는 상업적으로 이용가능한 대부분의 베쓸: 예컨대, T75 플라스크, T25 플라스크, 6-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 중에서 재배양될 수 있다. 세포는 상이한 적용에 대해서는 상이한 세포 밀도로 재배양될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 세포에 가해지는 물리적 응력을 관리함으로써 분화 프로세스 전 기간에 걸쳐 처리 동안 생존율을 개선시키는 방법을 제공한다. 분화 동안 예컨대, iPSC와 같은, 특정 세포 유형은 매우 작다. 이러한 작은 세포는 원심력에 대해 감수성이 매우 높다. iPSC는 과도한 원심력에 대해 감수성이 매우 높다. 분화 동안 예컨대, iPSC 및 내배엽 단계 세포와 같은, 일부 세포 유형은 매우 큰 점성을 갖는다. 이들 세포는 전단력에 대해 감수성이 매우 높다. 이들 세포를 처리할 때, 10 mL 피펫을 사용하여 임의의 소형 팁 사용을 피하였고, 세포를 위아래로 반복하여 피펫팅하는 것을 피하였다. 유지를 위해, 상기 세포를 콜로니로서 배양한 후, 이어서, 단일 세포 대신 클러스터로 해리시킬 수 있다. 분화를 위해, 만약 단일 세포가 필요할 경우, 세포 분리 이전에 해리를 종료하고, 해리 용액을 제거하고, 잔류 해리 용액이 세포를 추가로 해리시킬 수 있도록 할 수 있다. 이러한 프로토콜이 세포 배양에서 보편적으로 사용된다.
본 명세서 내에서 인용된 참고문헌의 교시에 비추어 본 명세서는 가장 완전하게 이해된다. 본 명세서 내의 실시양태는 본 발명의 실시양태의 예시를 제공하며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 통상의 기술자는 다수의 다른 실시양태도 본 발명에 포함된다는 것을 쉽게 이해한다. 본 개시내용에서 인용된 모든 공개문헌 및 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 참조로 포함된 물질이 본 명세서와 모순되거나, 또는 그와 불일치하는 범위 내에서는 본 명세서가 임의의 상기 물질을 대신하게 될 것이다. 본원의 임의의 참고문헌 인용이 상기 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
달리 명시되지 않는 한, 청구범위를 비롯한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건 등의 정량을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에서 "약"이라는 용어로 수식될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 달리 반대로 명시되지 않는 한, 수치 파라미터는 근사값이고, 이는 본 발명이 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 및 본 청구범위의 범주에 대한 등가물의 원칙을 적용하는 것을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 유효 자릿수 및 일반 반올림 접근법에 비추어 해석되어야 한다.
"하나"라는 용어가 본 청구범위 및/또는 본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때, 상기 단어의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상의," "적어도 하나의," 및 "1개 또는 그 초과"라는 의미와도 일치한다. 비록 본 개시내용은 오직 양자 택일만 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하지만, 본 청구범위에서 "또는"이라는 용어 사용은 명확하게 명시되지 않는 한, 오직 양자 택일만 또는 양자 택일은 상호 배타적이라는 것을 지칭하는 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, 연속된 요소들 앞의 "적어도"라는 용어는 연속된 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상의 실험만을 사용해서도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이해하거나, 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 발명의 실시 또는 시험에서 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의이 방법 및 물질이 사용될 수는 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기술된다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 명세서의 고려 사항 및 본원에 개시된 본 발명의 실시로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범주 및 정신은 하기 청구범위에 명시되는 것으로 의도된다.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조로 하여 기술된다. 이들 실시예는 오직 예시 목적으로만 제공되고, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않으며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 자명한 모든 변형을 포함한다.
성숙한, 분화된 간세포를 생산하기 위한 일부 실시양태에서, 출발 세포, 배양 베쓸, 코팅, 해리제, 배지 명칭 및 주요 성분, 예시적인 6 웰 플레이트에 대한 시딩 밀도, 및 산소 수준을 포함하는 예시 파라미터를 하기 표 I에서 제공한다.
<표 1>
간세포 분화
Figure pct00001
실시예 1: iPSC로부터의 내배엽 세포 생성
분화를 시작하도록 iPSC를 표준 크기의 6-웰 세포 배양 플레이트 (약 9.5 ㎠ 성장 면적/웰) 또는 표준 크기의 12-웰 세포 배양 플레이트 (약 3.8 ㎠ 성장 면적/웰)에 플레이팅하였다. 다른 크기의 배양 배쓸 또한 임의적으로 적용가능하며, 종종, 시약 사용 효율 및 시간 효율이 더 높은 것에 기인하여 6-웰 또는 12-웰 플레이트보다 더 바람직할 수 있다.
(표준의 상업적으로 이용가능한) 6-웰 플레이트에서, 1 x 105개/웰 내지 4 x 105개/웰인 세포 집단 크기가 성공적으로 사용되었다. 가장자리가 선명하고, 잘 정의되어 있으며, 여기서, 세포는 조밀한, 전형적인 iPSC 콜로니가 충분히 존재하고, 콜로니는 과다성장하지 않았을 때, iPSC는 분화 준비가 된 것으로 간주되었다. 상기 기준을 사용하여 생산된 본 발명의 iPSC의 품질은, 본 발명의 iPSC 세포주를 다른 연구원들에 의해 다른 방법을 사용하여 생산된 iPSC 세포주와 비교하였을 때, 분화에 중요한 것으로 입증되었다.
이 단계의 iPSC를 중내배엽 계통 세포로 분화하도록 유도하였다. 비록 대부분의 현행 분화 프로토콜은 부착된 단층 세포 사용을 선호하기는 하지만, 현탁 배양 시스템이 상기 단계에서 규모를 확장하는 데 매우 유용하였다는 것을 발견하게 되었다. 유도를 위해 현탁 성장된 iPSC는 화학 독성에 대해 더욱 큰 내성을 보였고, 더 후속된 단계에서 재플레이팅하기 더 쉬운 것으로 나타났다. iPSC 현탁 세포 성장을 촉진시키기 위해 울트라-로우 어테치먼트(Ultra-Low Attachment) 플레이트 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 또는 다른 저 부착 플레이트를 사용하였다.
iPS 세포를 계대배양해야 할 때, 낮은 세포독성을 유발하였고, iPSC의 작은 클러스터를 더 많이 생성하였고, 현탁 배양이 요구된다면, 빠르게 구체를 형성할 수 있는 프로토콜을 이용하여 iPSC 콜로니를 해리시키는 것이 중요하였다. 37℃에서 5분 동안, TripLE™ (써모피셔(ThermoFisher)), 어큐타제(Accutase) (라이프 테크놀러지(Life Technology)), 또는 DPBS 중 0.1 mM, 종종 0.5 mM, 또는 1 mM의 EDTA (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 해리시킴으로써 EDTA를 이용하여 iPSC를 해리시켰다. 1 내지 2분, 및 종종 본 단계의 경우, 최대 10 내지 20분을 포함하는, 다양한 해리 시간이 성공적으로 사용되었다. 일부 실시양태에서, 해리 시간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18,19, 20, 또는 25분, 또는 언급된 시간 중 임의의 둘 사이의 임의의 시간 범위일 수 있다.
배지의 경우, 10-50 uM 인슐린 및 5% KSR을 포함하는 MEMa, DMEM/F12, 및 DMEM B27을 시험하였고, 본 분화 단계에서 기술된 바와 같은 결과를 달성하였다. 이어서, Wnt, BMP4, 및 액티빈 A 경로 유전자의 기능을 탈억제시키는 GSK3 억제제, 예컨대, CHIR99021, CHIR98014, BIO 또는 GSK 억제제 IX, 및 SB-216763의 존재에 의해 iPSC가 만능 단계를 떠나 중내배엽을 향해 분화하도록 유도하였다. 일부 측면에서, 인슐린의 농도는 예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 uM, 또는 언급된 농도 중 임의의 둘 사이의 임의의 값 또는 범위일 수 있다. GSK3 억제제는 1, 2, 3일 시간창으로 수행되었고, 시간, 및 예를 들어, 5 mM, 8 mM, 10 mM 등인 억제제의 농도 선택시, 품질 분석으로서 FoxA2, CXCR4 양성 세포 계수가 사용되었다.
한 실험에서, 이어서, 스템젠트 트랜스펙션 리에이전트(Stemgent Transfection Reagent) (스템젠트)를 이용하여 세포를 약 20 ng/웰 용량의, FoxA2, 및/또는 Sox17 mRNA로 형질감염시켰다. 상기 형질감염을 GATA4 mRNA, 및/또는 GATA6 mRNA를 이용하는 것도 포함하여 수행하였고, 스템젠트 트랜스펙션 리에이전트 또는 상업적으로 이용가능한 다른 형질감염 시약을 사용하여, 종종 10배 더 높은 mRNA 용량으로 3, 4, 5 및 6회 반복하였다. 본 단계에 있는 세포는 상이한 mRNA 형질감염 시간 및 출발 밀도로부터 iPSC로부터 유래된, 중간엽 세포보다 상피 세포에 더 가까운 형태를 보였다 (도 1).
또 다른 실험에서, 표 1에 개요된 프로세스에 대한 대안으로, 현탁액 중에서 구체로 성장된 iPSC 세포를 플레이트 표면 상에 플레이팅하지 않고, 전기천공을 이용하여 (예를 들어, 맥스사이트 STX 전기천공장치를 이용하여) 직접 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 구체인 2백만 개의 출발 iPSC를 현탁액 중에서 상이한 mRNA, 예컨대, Sox17 또는 Pax6으로 형질감염시키거나, 또는 모의 형질감염시켰다. 도 8에서 시험된 mRNA 양은 2,500 ng이었다. 이어서, 세포를 Sox17 형질감염의 경우, NBM 중에서, 또는 Pax6 형질감염의 경우, KSR을 포함하는 MEM알파 중에서 성장시켰다. 형질감염은 1, 2, 3, 4, 5회, 또는 심지어는, 이행이 더욱 장기간이 소요된다면 그 초과로 반복될 수 있다. 결과로서, Sox17 mRNA의 1차 형질감염 후, 세포 클러스터는 유의적으로 더 작고, 덜 조밀해진 구체가 되었고, 이로써, 정의된 "가장자리" 또는 외부 경계를 잃게 되었다. 그에 반해, 모의 형질감염된 구체는 2D 사진에서 뚜렷하게 육안으로 관찰가능한 외부 "가장자리"를 보이면서, 잘 정의된 상태 그대로 유지된다. 비형질감염된 또는 모의 형질감염된 iPSC의 더 작은 구체는 투명한 외관을 가지지만, 그에 반해 더 큰 구체는 세포층이 두꺼운 바, 덜 투명하게 보인다. 비교하면, Pax6 (신경 분화 TF) mRNA로 형질감염된 iPSC 구체는 외배엽, 즉, 신경 전구 세포를 향해 진행되었고, 그의 구체는 모의 형질감염된 것보다 더욱 어두워졌고, 덜 선명한 "가장자리"를 가졌지만, Sox17 형질감염된 것보다는 크기가 더 컸고, 더욱 잘 정의된 경계를 가졌다.
동일한 원리 및 유사한 방법에 의해, 배엽층 특이적 중간 세포, 예컨대, 내배엽 세포, 및 더욱 하류의 중간 세포, 예컨대, 간 전구 세포, 췌장 전구 세포 등은 또한 구체 형태로 추가의 TF mRNA로 형질감염될 수 있다. 이러한 방식으로 형질감염된 세포는 소분자, 성장 인자, 또는 세포 배양물 중의 다른 요소로부터의 독성에 대하여 더 큰 내성을 가지며, 이는 일반적으로 화학 시약을 사용하는 2D 형질감염보다 분화에서 더욱 큰 효율성을 보여야 한다. 이전에 과학 공개문헌에서는 볼 수 없었던 상기와 같은 관찰 결과는 전기천공 장비 시험 동안 우연히 얻게 되었고, 이는 본 개시내용의 일부로서 가능화 방법으로서의 역할을 하였다.
실시예 2: 내배엽 세포로부터의 간 전구 세포 생성
내배엽 세포를 상업적 세포 배양 베쓸 상에 플레이팅한다. 도 2에 제시된 실험에서 6-웰 플레이트를 사용하였지만, 다른 웰 크기도 적용가능하다. 플레이트를 매트리겔 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 미리 코팅시킨 후, 이어서, 1 x 105 - 1 x 106개의 세포를, 8 mM D-글루코스로 보충된 DMEM/F12 또는 MCDB131에 플레이팅하였다. 종종, 본 단계에서 1% DMSO을 첨가하는 것이 간 전구 세포 생성 효율을 증가시키는 데 도움이 된다는 것을 관찰하게 되었다.
한 실험에서, 이어서, 세포를 Hex 및/또는 Tbx3 mRNA로 형질감염시켰다. 추가로, 배양 배지 중에서 스템젠트 트랜스펙션 리에이전트 (스템젠트)를 이용하여 세포를 50 ng/웰 용량의, GATA4에 대한 mRNA, GATA6에 대한 mRNA로 형질감염, 또는 더욱 강력한 효과를 위해 공동 형질감염시켰고, 스템젠트 트랜스펙션 리에이전트 또는 상업적으로 이용가능한 다른 형질감염 시약을 사용하여, 10 ng/웰 정도로 낮은 용량 내지 200 ng/웰 정도로 높은 용량으로 2회, 3회 또는 그 초과 반복하였다. 일부 측면에서, 스템젠트 농도는 예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 ng/웰, 또는 언급된 양 중 임의의 둘 사이의 임의의 양일 수 있다. 상기 양은 또한 다른 웰 부피에 맞게 조정될 수 있다. 본 단계에 있는 세포는 내배엽 세포보다 더 어둡게 보였고, 간 전구 세포의 클러스터를 형성하는 경향을 보였다 (도 2).
실시예 3: 간 전구 세포로부터의 간세포 생성
간 전구 세포를 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 또는 콜라겐 I (시그마(Sigma))로 미리 코팅된 6-웰 또는 다른 플레이트 중 DMEM/F12, MEMa, 또는 DMEM B27에서 배양하였다. 다른 유사한 부착 세포 배양 배지 또한 사용에 적합하다.
간 전구 세포를 200 ng/mL B18R로 보충된 배양 배지 중에서 스템젠트 트랜스펙션 리에이전트 (스템젠트)를 이용하여 10-200 ng/웰 용량의, HNF1a, HNF4a, HNF6, CEB/Pa, 또는 CEB/Pb mRNA로 추가로 형질감염시켰다. 스템젠트의 용량은 또한 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 ng/웰, 또는 언급된 양 중 임의의 둘 사이의 임의의 양일 수 있다. 상기 양은 또한 다른 웰 부피에 맞게 조정될 수 있다. 대부분의 상업적으로 이용가능한 형질감염 시약 또한 적용가능하다. 본 단계에서 전구 세포를 더 낮은 밀도로 간세포 배지에 계대배양함으로써 간세포를 수득하였다 (도 3).
실시예 4: 3차원 구체 형태의 간세포
해리 및 재플레이팅하는 대신, 간 전구 세포를 1주 내지 2개월 동안, 또는 더 장기간 동안 계속해서 성장시켰고, 그 기간 동안 클러스터링된 전구 세포는 계속해서 3차원 (3D) 구체를 형성하였고, 현탁액 내로 이동하였다 (도 4).
본 단계에 있는 3D 형태의 세포를 글리코겐 발현 (도 5), 및 항체에 의한 간 세포 마커 염색 (도 6)에 의해 시험하였다. 글리코겐, AFP, 트립신의 양성 염색을 통해 세포가 성숙한 간 세포 단계에 도달하였다는 것을 확인하게 되었다.
상기 3D 구체 형태의 간세포를 어큐타제, TrypLE 또는 다른 해리 시약으로 해리시키고, 실시예 3에서와 같이 코팅된 표면에 재플레이팅하였다. 이는 단층 배양물에서의 추가 분열 없이 바로 종점의 분화된 간세포 형태를 보였다 (도 7).
실시예 5: 동물 모델에서의 iPSC 유래 간세포 기능
본 발명에 따라 생산된 성숙한 간세포의 기능을 추가로 시험하기 위해, iPSC 유래 간세포의 간 기능을 간 질환 또는 손상 마우스 모델, 예컨대: 1) 담즙 정체 간 손상에 대해 외과적 담관 결찰 (BDL) 마우스 모델, 2) 담즙 정체 간 손상에 대해 MDR2/Tgfbr2/Il2ra 유전자 변형된 마우스 모델, 3) 담즙 정체 간 손상에 대한 대안적으로 DDC-변형 식단, ANIT-변형 식단 또는 d-갈락토사민-유도성 마우스 모델, 4) NASH 간 손상에 대해 고칼로리 식단 유도성 마우스 모델, 5) NASH 간 손상에 대해 ob/ob, nSREBP-1c 또는 PTEN 유전자 변형된 마우스 모델, 6) NASH 간 손상에 대한 대안적으로 MCDD/CDAA 마우스 모델, 또는 7) 독성 간 손상에 대해 CCl4/TAA/DEN/DMN 유도성 마우스 모델에서 시험한다.
추가로, ALD (알콜 유도성), 자가면역 간염 (AIH) 및 바이러스 감염성 간 질환도 모두, 본 발명에 의해 생성된 간세포가 동물 모델 사용을 포함하는 이식을 통해 처리할 수 있는 공중 위생상의 주요 사안이다.
인간이 아닌 영장류 모델, 예컨대,: 1) 고칼로리 식단 유도성 원숭이 간 손상 모델, 2) CCl4 유도성 원숭이 간 손상 모델, 3) BDL 원숭이 간 손상 모델을 사용하여 개시된 간세포의 기능을 시험한다.
전달 경로: 간세포 또는 구체를 간 내로 주입한다.
시험: 알부민, AST, ALT, 빌리루빈 및 히알루로난의 혈중 수준을 측정하고 (2, 4, 8, 12, 16, 24주째); 염증 유발성 시토카인, 예컨대, IL-8, TNFa, MCP-1의 혈중 수준을 측정하고 (2, 4, 8, 12, 16, 24주째); 섬유증, 간세포, 쿠퍼 세포/대식세포 이식 부위, 및 HCC 마커의 IHC를 수행한다.
실시예 6: 간 질환, 예컨대, 만성 간 부전을 앓는 인간 환자 치료에서의 iPSC 유래 간세포
cGMP 절차하에 맞도록 적합화된 개시된 프로토콜을 사용하여 인간 iPSC 유래 간세포를 이용하는 임상 시험을 다른 세포 요법을 참조로 하여 동물 연구에 따라 수행한다. 제조된 간 세포, 또는 3D 간 세포 기반의 소형 기관을 간, 또는 인체 다른 부분, 예컨대, 근육, 결합 조직, 또는 다른 기관의 특정 부위로 전달하여 효험을 달성한다.

Claims (20)

  1. (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계;
    (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계;
    (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계;
    (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계;
    (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및
    (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계
    를 포함하는, 줄기 세포의 간세포로의 분화를 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제1 조합이 FoxA2 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제1 조합이 Sox17 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제1 조합이 FoxA2 및 Sox17 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제1 조합이 FoxA2, Sox17, GATA4, 및 GATA6 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제2 조합이 Hex mRNA를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제2 조합이 Tbx3 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제2 조합이 Tbx3 및 Hex mRNA를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제2 조합이 Tbx3, GATA4, GATA6, 및 Hex mRNA를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제3 조합이 HNF1a mRNA를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제3 조합이 HNF4a mRNA를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 제3 조합이 HNF4a, HNF1a, HNF6, CEB/Pa, 및 CEB/Pb mRNA를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 출발 세포가 대상체의 체액 또는 조직으로부터 수거된 것인 방법.
  14. 제1항의 방법에 의해 수득된 세포.
  15. 제14항의 세포를 포함하는, 질환, 장애, 또는 기형 치료용 조성물.
  16. 질환, 장애, 또는 기형 치료를 필요로 하는 대상체 내로 제14항의 세포 및 제15항의 조성물 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애, 또는 기형을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 수용자 대상체로부터 유래된 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 출발 세포가 수용자로부터 수거된 것인 방법.
  19. (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계;
    (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계;
    (c) 유효 용량의 mRNA의 제1 조합에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽 세포로 향하도록 하는 단계;
    (d) 추가로, mRNA의 제2 조합에 의한 형질감염을 통해 상기 내배엽 세포를 간 전구 세포로 향하도록 하는 단계;
    (e) 추가로, mRNA의 제3 조합을 이용하여 상기 간 전구 세포를 간세포로 성숙시키는 단계; 및
    (f) 전구 세포 클러스터를 단층으로 계대배양함으로써, 또는 상기 간 전구 세포로부터 형성된 클러스터를 수집하고, 단층으로 재플레이팅함으로써 상기 간세포를 수득하는 단계
    를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 간세포를 생산하는 방법.
  20. (a) 분화를 위한 조건하에서 유도 만능 줄기 세포를 출발 세포로서 배양하는 단계;
    (b) 상기 출발 세포가 만능 상태를 이탈하여 중내배엽 계통을 향해 유도하는 단계; 및
    (c) 유효 용량의 내배엽 특이적 mRNA에 의한 배양 세포 형질감염을 통해 및 특정 시간창 내에서 분화 세포를 내배엽으로 향하도록 하는 단계
    를 포함하는, 유도 만능 줄기 세포로부터 내배엽 세포를 생산하는 방법.
KR1020197013915A 2016-11-16 2017-11-16 Ｒｎａ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도 KR102586507B1 (ko)

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