BR112019009997A2 - método para induzir diferenciação de células-tronco em células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis a glicose, célula, composição para tratar a doença, distúrbio ou malformação, método para tratar doença, distúrbio, ou malformação e método para produzir as células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose induzidas - Google Patents
método para induzir diferenciação de células-tronco em células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis a glicose, célula, composição para tratar a doença, distúrbio ou malformação, método para tratar doença, distúrbio, ou malformação e método para produzir as células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose induzidas Download PDFInfo
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Abstract
um novo método de indução ou produção de células beta pancreática a partir de células-tronco pluripotente induzidas humanas em uma eficiência não procedente e funcionalidade. o núcleo da invenção é o uso de mrnas experimentalmente descobertos em pontos de decisão de diferenciação crítica múltipla junto a pluripotente para mesendoderma para endoderma para células endócrinas pancreáticas para a rota das células beta pancreáticas de uma maneira previamente desconhecida.
Description
MÉTODO PARA INDUZIR DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO EM CÉLULAS BETAS PANCREÁTICAS SECRETORAS DE INSULINA SENSÍVEIS A GLICOSE, CÉLULA, COMPOSIÇÃO PARA TRATAR A DOENÇA, DISTÚRBIO OU MALFORMAÇÃO, MÉTODO PARA TRATAR DOENÇA, DISTÚRBIO, OU MALFORMAÇÃO E MÉTODO PARA PRODUZIR AS CÉLULAS BETAS PANCREÁTICAS SECRETORAS DE INSULINA SENSÍVEIS À GLICOSE INDUZIDAS
Campo da invenção [0001] A presente descrição refere-se à direção da indução de células beta pancreáticas a partir de células tronco pluripotentes através do processo de crescimento de célula cineticamente controlado utilizando combinações especificas e faixas de densidade celular, concentrações de reagentes, e combinações especificas de mRNAs.
Antecedentes da invenção [0002] Os esforços recentes na geração e consequente diferenciação de células-tronco humanas têm alterado paradigmas relacionados à plasticidade do destino (fate) celular, modelos para doenças humanas, e clinica terapêutica. Ambas, as células-tronco embriônicas (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) feitas a partir de células somáticas podem ser diferenciadas em uma lista aumentada de tipos de células especificas indistinguíveis a partir de suas células primárias correspondentes. Como resultado, as células-tronco são muito promissoras para o desenvolvimento de novas terapias celulares humanas. As iPSCs mostram potencial particular no campo da medicina personalizada devido a disponibilidade ilimitada de células, a nãoinvasividade do procedimento para obter as células, e o potencial para combinação imune de cada tratamento para os
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2/55 pacientes individuais, garantindo a liberdade a partir de fármacos imunossupressores.
[0003] Milhares de dólares em pesquisa estão sendo gastos no desenvolvimento de terapias de reposição celular para tratar ou prevenir várias doenças humanas. Por exemplo, a autoimunidade induz os pacientes com diabete tipo 1 (T1D) a perder suas células beta pancreáticas - e assim, sua capacidade de responder aos níveis de glicose no sangue e a produzir sua própria insulina. Portanto, os pacientes T1D podem se beneficiar grandemente a partir da reposição de suas células beta produtoras de insulina, bem como outras células endócrinas, foram realizadas com algum sucesso, mas descoberta de fornecimento confiável de doadores de pancreases permanece um obstáculo para contornar. Agora, muitos grupos acadêmicos e industriais tem desenvolvido caminhos para dirigir ESCs ou iPSCs para tornar células progenitoras pancreáticas, destinadas para criar células beta secretoras de insulina na esperança de eventualmente usar a terapia de célula tronco para aquela célula responsive a glicose produtora de insulina derivada. Entretanto, muitos destes métodos conhecidos no domínio público pelo tempo desta descoberta podería não gerar células-beta pancreáticas secretoras de insulina madura ou completamente funcional.
[0004] Para aliviar os encargos de custos e inconsistências, aqueles técnicos no assunto frequentemente recorrem às descobertas de pequenas moléculas que podem influenciar as rotas sinais como um agonista ou antagonistas dos receptores do fator de crescimento, substituindo assim, os fatores de crescimento. As moléculas pequenas são tipicamente muito mais baratas do que os fatores de
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3/55 crescimento. Entretanto, uma desvantagem maior das pequenas moléculas é o efeito não-especifico, elas podem exercer sobre os alvos não pretendidos, tais como receptores ligados à membrana celular, organelas intracelular, ou componentes genômicos, etc..
[0005] Um outro componente chave de um protocolo de diferenciação típica é o meio para cultivo de células, que pode ser composto de nutrientes (lipídios, aminoácidos, carboidratos, vitaminas, etc.), concentrações adequadas de sais, agentes de tampão de pH, elementos críticos, e fatores de proteínas comuns, tais como insulina ou albumina do soro. Os tipos diferentes de células têm requerimentos diferentes de nutrientes e meio componentes e é ainda complicado pelos fatores de crescimento específicos ao tipo de molécula e as moléculas pequenas para sinalização. Portanto, um meio de diferenciação especial é, frequentemente, cuidadosamente testado pela remoção ou adição de um componente em um período.
[0006] Em aplicações clínicas de célula tronco derivada de células de tecido, mais componentes do meio de diferenciação estabelecido requerer certificação individual de acordo com os regulamentos atuais de boas práticas de fabricação (cGMP), por exemplo, fatores de crescimento necessários para ser produzido pelos procedimentos especiais e requerer certificação individual. Do mesmo modo, algumas moléculas pequenas adicionadas ao meio de diferenciação específico são produzidas através dos processos de síntese química especial que varia na pureza, estabilidade, e toxicidade. No campo da cultura de células tronco, alguns protocolos previamente publicados também depende dos produtos animais tais como soro
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4/55 ou Matrigel.
Sumário da invenção [0007] Apesar dos avanços recentes na produção de células beta pancreáticas derivadas de iPSC, métodos eficientes para gerar consistentemente as células beta produtoras de insulina são ainda sob desenvolvimento. Muitos protocolos atuais requerem o uso de combinações dos fatores de crescimento, hormônios, citocinas, peptídeos sinais e outras moléculas sinais intercelulares (coletivamente referido aos fatores de crescimento para simplicidade neste texto) em cada etapa ao longo da cascata de diferenciação para produzir as célulasbeta produtoras de insulina. Infelizmente, quando fornecido como polipeptídios purificados, os fatores de crescimento são geralmente onerosos, instáveis, e inconsistentes a partir de batelada-por-batelada, tornando ele difícil de usar. Adicionalmente, devido a função dos fatores de crescimento de uma maneira combinatorial altamente específica ainda, cada estágio de diferenciação é ditado por um conjunto diferente de fatores de crescimento, que é difícil e dispendioso para otimizar. Um dos objetivos da invenção atual foi fundamentalmente remover a necessidade por fatores de crescimento na direção da geração de células beta pancreáticas.
[0008] A presente descrição provê métodos para induzir a diferenciação da célula tronco pela modulação de cinéticas de crescimento celular e parâmetros associados, onde a combinação específica da densidade celular, concentrações reagentes, e combinações de mRNAs são usadas para controlar a direção diferenciação/indução.
[0009] Para conseguir o objetivo e de acordo com o
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5/55 propósito da invenção, como configurado e amplamente descrito aqui, um aspecto da invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotente induzidas sob as condições para diferenciação;
(b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir as células de diferenciação em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro das janelas de tempo especificas; 9d) dirigir adicionalmente ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas dentro de células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com as células beta pancreática que são responsive ao meio de glicose e capaz de secretar a insulina na resposta.
[0010] Em uma concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma
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6/55 dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção das células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas para o meio de glicose e capaz de secretar insulina na resposta, sendo que a primeira combinação de mRNAs compreende mRNAs FoxA2.
[0011] Em uma outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensível a glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas para o meio de glicose e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que dita primeira combinação de mRNAs compreende mRNAs FoxA2 e Soxl7.
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7/55 [0012] Em uma outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação das células tronco em células beta pancreática secretora de insulina sensível a glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que a primeira combinação de mRNAs compreende mRNAs Fox Ά2, Soxl7, GATA4, e GATA6.
[0013] Em uma outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensível à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma
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8/55 dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que a segunda combinação de mRNAs compreende mRNAs PDX1, Hlxb9, Ptfla, ixll HNFla e b, e Sox9.
[0014] Em uma outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que a terceira combinação de mRNAs compreende pelo menos um dos mRNAs PDX1, NKX6.1, NKX2.2; Pax6, Pax4,
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Hlxb9, e Ngn3.
[0015] Em uma outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que o mRNA para realizar um compromisso de destino da célula beta pancreática compreende pelo menos um dos mRNAs NKX6.1, MAFA, ou MAFA.
[0016] Em outra concretização, a invenção refere-se a um método para induzir a diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis a glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em
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10/55 direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de secretar insulina em resposta, sendo que as células de partida são colhidas a partir do fluido corpóreo ou tecido.
[0017] Um aspecto da invenção refere-se a uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células betas pancreáticas secretoras de insulina sensível à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capaz de
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11/55 secretar insulina em resposta.
[0018] Um aspecto da invenção refere-se à composição para tratar a doença, distúrbio ou malformação compreendendo uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especificas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs;
(e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta.
[0019] Um aspecto da invenção refere-se a um método para tratar doença, distúrbio ou malformação compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo necessitando do mesmo, pelo menos uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado
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12/55 pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especificas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta e uma composição para tratamento de uma doença, distúrbio ou malformação compreendendo uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreática secretora de insulina e sensível à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especificas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são
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13/55 responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta.
[0020] Em uma concretização, a invenção refere-se a um método para tratar uma doença, distúrbio ou malformação compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo necessitando do mesmo, pelo menos uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta e uma composição para tratamento de uma doença, distúrbio ou malformação compreendendo uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreática secretora de insulina e sensível à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para
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14/55 diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta, sendo que dita célula é derivada do indivíduo receptor.
[0021] Em uma concretização, a invenção refere-se a um método para tratamento de doença, distúrbio, ou malformação, compreendendo a etapa de administração do indivíduo necessitando de pelo menos uma célula obtida por um método para indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreática secretora de insulina sensíveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células
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15/55 progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta e uma composição para tratamento de uma doença, distúrbio ou malformação compreendendo uma célula obtida por um método de indução da diferenciação de células tronco em células beta pancreática secretora de insulina e sensivel à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especificas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta, sendo que ditas células de partida são colhidas a partir do receptor.
[0022] Um método para produzir as células beta pancreáticas secretoras de insulina sensiveis à glicose, compreendendo as etapas de: (a) cultivar as células tronco pluripotentes
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16/55 induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especificas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta.
[0023] Consequentemente, a presente descrição também provê novos métodos para conseguir a determinação do destino celular sem ou reduzido uso de moléculas pequenas. Um beneficio maior da invenção atual é a simplicidade de estabelecer o meio de diferenciação através do uso de mRNAs propriamente fornecidos de gentes dirigindo a diferenciação. A combinação ótima de mRNAs e meio apropriado, entretanto, podem ainda beneficiar o processo e é uma parte integral da invenção atual. Um outro incentivo atrás da invenção atual é criar um novo método que é primariamente baseado sobre um tipo único de molécula apropriado para uniformizar a certificação e qualidade do processo controle.
[0024] Na descrição atual, a descrição apresenta novos processos capacitantes que envolvem como a densidade celular e taxa de divisão deve ser gerenciada para conseguir os
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17/55 resultados de diferenciação desejados. Ademais, os ensinamentos descritos, a otimização do tempo, ordem de adição, doses de RNA e proporções entre os RNAs diferentes durante a transfecção de RNAs, e sua duração ou número de repetições. A invenção refere-se ainda as escolhas da superfície do recipiente de cultura e condições do meio, tais como concentração de oxigênio. A invenção inclui ainda processos e métodos de seleção de células desejadas ou aperfeiçoamento de sua porcentagem na população total, e métodos de criopreservação e re-cultura de células diferenciadas.
[0025] A presente invenção provê método para indução e/ou produção de células tronco e diferenciação pela modulação da cinética do crescimento celular e parâmetros associados onde combinação especifica de densidade celular, concentrações de reagentes, e combinações de mRNAs são usados para controlar a direção do diferenciação/indução. Em um aspecto, a invenção atual provê um novo protocolo desenvolvido para produção funcional e mais células-beta maduras que funcionam in vitro, e métodos de uso de células nas terapias para indicações envolvendo vários tipos de tipos de diabetes, Tipo I e Tipo II.
[0026] Em certas concretizações, o protocolo de indução de célula-tronco exemplificative, pode ser representado pelo regime e etapas como descrito e representado nos exemplos abaixo. Em alguns aspectos desta invenção, uma eficiência muito alta foi conseguida e custos menores sem usar grandes quantidades de fatores de crescimento, pelo contato mRNAs com células tronco em pontos de alteração do destino critico na dose certa e condições de liberação. Devido aos mRNAs são
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18/55 mais específicos na direção celular e eventos de desenvolvimento, via proteínas funcionais codificantes, o método descrito é surpreendentemente mais robusto do que qualquer métodos conhecidos na criação de células-beta pancreática funcional, pavimentando assim, um caminho para tratar diabetes e outros condições relacionado a diabetes em indivíduos humano ou mamíferos.
[0027] A presente descrição provê métodos de diferenciação que utiliza a expressão altamente eficiente e bem controlada dos genes mais controle ou fatores de transcrição chave na diferenciação específica do tecido. Mais especificamente, esses fatores são introduzidos em células tronco pluripotentes na forma de adequadamente modificado e moléculas mRNA purificada demonstrados através do exemplificado provido.
[0028] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para induzir a diferenciação celular compreendendo: utilizar os fatores de destino celular chave e fusões entre fatores de transcrição convencional (TFs) com domínios de transativação, otimizado para direção das células tronco em direção aos tipos diferentes de células; introduzindo estes fatores como mensageiros sintéticos RNA (mRNA) dentro de células tronco pluripotentes cultivados na densidade preferida pelos métodos que resultam em níveis apropriados de expressão de transgenes; manter células sob condições otimizadas para resultar em alta eficiência da diferenciação específica onde o estado pluripotente ou estado progenitor das células tronco ou células progenitoras é induzido em direção à linhagem específica ou tipo de célula de tecido.
[0029] Em um aspecto, a presente descrição provê um método
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19/55 para produção de estado pluripotente ou estado progenitor de células tronco ou células progenitoras capazes de ser induzidas em direção a uma linhagem especifica ou tipo de célula de tecido usando um método para compreender a indução celular: utilizando fatores de destino celular chave e fusões entre os fatores de transcrição convencionais (TFs) com dominies de transativação, otimizado para dirigir as células tronco em direção aos tipos diferentes de células; introduzir estes fatores como RNA mensageiro sintético (mRNA) dentro de células tronco pluripotentes cultivadas na densidade preferida pelos métodos que resultam em niveis apropriados de expressão de transgenes; mantendo células sob condições otimizadas para resultar em alta eficiência de diferenciação específica.
[0030] Em um aspecto, a presente descrição provê um método para produzir células beta pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose induzidas, o método compreendendo: (a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação; (b) induzir as referidas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma; (c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas; (d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs; (e) maturar ainda ditas células pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com ainda um outro gene ou com combinação de genes de mRNAs; e (f) coletar
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20/55 os conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas a glicose no meio e capazes de secretar insulina em resposta.
[0031] Em um outro aspecto, a descrição provê métodos para alterar o estado pluripotente ou estado progenitor de células tronco ou células progenitoras em direção a um tipo de linhagem especifica ou tipo de célula de tecido, compreendendo pelo menos um de: gerando os genes de destino celular critico expressando células tronco (coletivamente referido como células tronco), incluindo fatores de destino celular chave e fusões entre fatores de transcrição convencionais (TFs) com domínios de transativação, otimizado para direção de células tronco em direção aos tipos diferentes de células; introduzir estes fatores como RNA mensageiro sintético (mRNA) dentro das células tronco pluripotentes cultivado na densidade preferida pelo método que resulta em níveis apropriados de expressão transgenes, mantendo células sob condições otimizada para resultar na eficiência de diferenciação específica.
[0032] Objetos adicionais e vantagens a invenção será representado em parte na descrição que seguem, e em parte será óbvio a partir da descrição, ou pode ser ensinado pela prática da invenção. Os objetivos e vantagens da invenção serão realizados e ligados por meio de elementos e combinações particularmente apontados nas reivindicações anexas.
[0033] Deve ser entendido que ambas, a descrição geral acima e a seguir a descrição detalhada são exemplificaiivos e explicativos apenas e não são restritivos da invenção, como reivindicado.
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21/55 [0034] Os desenhos que acompanham que são incorporados em e constituem uma parte deste relatório, ilustram várias concretizações da invenção e juntos com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.
Breve descrição dos desenhos [0035] O pedido de patente ou patente depositado contém pelo menos um desenho executado em cores. As cópias desta patente ou publicação do pedido de patente com os desenhos coloridos serão providos pelo Órgão durante o requerimento e pagamento das taxas necessárias.
[0036] Os aspectos acima mencionados e vantagens desta invenção podem tornar-se aparente a partir da descrição detalhada a seguir com referência aos desenhos que acompanham o pedido no qual:
[0037] A figura 1Ά mostra células endoderma a partir de diferentes densidades de partida e ilustra uma concretização exemplificativa da indução de endoderma;
[0038] A figura 1B mostra células de endoderma induzidas a partir de IPSCs pelo uso de mRNA Soxl7 em várias densidades (por exemplo, a partir de densidade baixa para alta como descrita no Exemplo) e ilustra uma concretização exemplificativa da indução de endoderma;
[0039] A figura 2 mostra as células progenitoras hepáticas iniciadas a partir de densidades celulares endoderma diferentes formando o conjunto e ilustra uma concretização exemplificativa da indução de progenitora hepática. A figura 2Ά mostra uma vista exemplificativa da densidade celular/conjunto associado com a indução. A figura 2B mostra uma vista exemplificativa da densidade celular/conjunto associado com a indução. A figura 2C mostra uma vista
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22/55 exemplificativa da densidade celular durante a indução. A figura 2D mostra uma vista exemplificativa da densidade celular durante a indução.
[0040] A Figura 3 mostra as células endócrinas pancreáticas iniciando a partir de densidades celulares endoderma diferentes, formando conjuntos e ilustra uma concretização exemplificativa da indução endócrina pancreática. A figura 3 A mostra uma vista de densidade celular exemplificativa/conjunto durante a indução. A figura 3C mostra uma vista de densidade celular/conjunto exemplificativo durante a indução;
[0041] A figura 4 mostra células endócrinas pancreáticas maduras em cultura e conjuntos produzidos que boiam e ilustram uma concretização exemplificativa de maturação endócrina pancreática. A figura 4A mostra uma vista de maturação celular exemplificativa durante a indução. A figura 4B mostra uma vista de maturação celular exemplificativa durante a indução. A figura 4C mostra uma vista de maturação celular exemplificativa durante a indução;
[0042] A figura 5A mostra morfologia de conjunto celular beta pela fase de contraste e ilustram uma concretização exemplificativa de formação de conjunto do tipo ilhotas de célula beta pancreática;
[0043] A figura 5B mostra a coloração de insulina (verde) das células betas 10 dias após a diferenciação (Dapi é mostrado em azul) e ilustra uma concretização exemplificativa da formação do conjunto do tipo ilhota de célula beta pancreática;
[0044] A figura 6 mostra as células beta e endoderma derivadas de iPSCs humana mostrando marcadores de célula
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23/55 especifica. A figura 6Ά mostra células endoderma com o verde: CXCR4 e o azul: DAPI referência nuclear. A figura 6B mostra células endoderma com o verde: FOXAl; azul: DAPI, o vermelho: membrana celular Phalloidin. A figura 6 C mostra diferenciação celular beta, dia 10, verde: insulina, azul: DPI nuclear. A figura 6D mostra a diferenciação de célula beta dia 8, verde: nuclear NKX6.1 vermelho: membrana celular PHalloidin;
[0045] A figura 7 mostra a produção de insulina estimulada pela glicose de derivados químicos (protocolo Melton) versus mRNA derivado (protocolo Allele) de células beta (células recebidas de uma série de testes de glicose 1 hora após) e ilustram ilhotas beta pancreáticas criadas in vitro mostram secreção de insulina sensíveis à glicose;
[0046] A figura 8 mostra dois milhões de iPSCs na população de partida foram transfectadas usando MaxCyte STX, representada na otimização 2, arranjo de processamento OC100. As fotos foram tomadas 24 horas após a transfecção usando um sistema de imagem EVOS em 10X. A figura 8Ά mostra uma vista representativa de iPSC durante o protocolo de transfecção exemplificativa. A figura 8B mostra uma vista representativa do iPSC durante o protocolo de transfecção exemplificativa. A figura 8C mostra uma vista representativa do iPSC durante o protocolo de transfecção exemplificativa. A figura 8D mostra uma vista representativa do iPSC durante o protocolo de transfecção exemplificativa. A figura 8E mostra uma vista representativa do iPSC associado com o protocolo de transfecção exemplificativa. A figura 8F mostra uma vista representativa do iPSC durante o protocolo de transfecção exemplificativa; e
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24/55 [0047] A figura 9 mostra ilhotas de célula beta grandes formadas em 3D a partir do cultivo 2D no final da diferenciação de célula beta pancreática mediada pelo mRNA. A figura 9A mostra uma vista representativa das células beta associadas com a diferenciação. A figura 9B mostra uma vista representativa das células beta associadas com a diferenciação.
Descrição detalhada da invenção [0048] Quando descrevendo a presente invenção, todos os termos não definidos aqui têm seus significados comuns reconhecidos no estado da técnica. Para a extensão daquela descrição dada a seguir, deve ser entendido uma concretização específica ou um uso particular da invenção, como sendo ilustrativa apenas, e não limitativa da invenção reivindicada. A descrição a seguir pretende cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes que são incluídos no espírito e escopo da invenção.
[0049] O conceito daquele gene de controle máster, ou seja, um gene chave (tipicamente um gene do fator de transcrição, algumas vezes um número menor de genes trabalhando juntos) podem decidir o destino das células e tecidos e, eventualmente, a formação de um órgão inteiro durante o desenvolvimento, foi geralmente ser aceito com base nos estudos no músculo (MyoD), olho (Pax6) , e outros campos de desenvolvimento da biologia. A descoberta de Shinya Yamanaka que diferenciou células pode ser revertida em um estado pluripotente pela expressão de um grupo selecionado dos fatores de transcrição expressos nas células tronco demonstraram o poder de um número pequeno de fatores de transcrição chave nas células de direção através de uma
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25/55 mudança de destino de múltiplos estágios prolongada. 0 trabalho por outros grupos sobre a geração de iPSC expandido na escolha de reprogramação dos fatores e mostrou que algumas variações podem ser toleradas na escolha do fator de transcrição para o propósito de reprogramação. No trabalho original de Yamanaka, a expressão dos fatores de reprogramação foi conseguida através da aplicação de vetores virais que integram dentro do genoma devido à expressão prolongada destes fatores é requerido para a transformação do efeito celular. A modificação atendente do genoma representa uma barreira importante para aplicação terapêutica de iPSCs, embora a possibilidade de expressão reativada a partir dos cassetes virais integrados é uma preocupação mesmo para estudos in vitro. A aplicação da transfecção mRNA para reprogramação como mais atualmente descrito pelo grupo inventor atual é um apelo particular como este sistema permite a expressão de reprogramação de coquetel e mesmo os fatores de componentes individuais para ser modulado nas estruturas de curto tempo simplesmente pela mudança, na qual os transcritos são adicionados ao meio de cultivo celular. Uma vez que a transfecção de um fator particular é terminada, a expressão ectópica dentro das células alvos cessa rapidamente devido ao decaimento rápido do mRNA no citoplasma. Apesar de o mRNA não persistir na célula alvo, sua capacidade de ser diretamente traduzido no citoplasma, sem a necessidade de limitar a taxa de translocação nuclear como no caso do DNA transf ectados e integrar os vetores virais, mais do que compensar a media vida curta dos mRNAs para resultar em expressão altamente eficiente, mas bem dentro de uma janela de tempo curta, que é critico para a
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26/55 determinação do destino celular.
[0050] Os vetores de DNA duradouros, tais como plasmídeos epissomais, quando usados para a alteração do destino celular, requerem o desmame para reduzir qualquer risco de integração genômica aleatória. As viroses de RNA ou derivados virais, tais como vírus Sendai ou vírus da encefalite equina Venezuelana (VEE), mesmo após ser despido para ser uma replicação de RNA não-infecciosa modificada, ainda carrega elementos virais, propenso a recombinar com os elementos virais escondidos no genoma hospedeiro, é sempre difícil ser complemente garantido que as células sejam livres de vetores virais sem descobertas tediosas de provas na forma de dados negativos. A presente invenção descreve múltiplas etapas inventivas destinadas a aplicação das vantagens da determinação do destino celular a base de mRNA para dirigir a
diferenciação. Em resumo, | a presente descrição | ensina | uma | |
rodada única ou múltipla da | expressão do | fator de | transcrição | |
ectópica em um método | aperfeiçoado | para | dirigir | a |
diferenciação celular. | ||||
[0051] Todavia, existem | barreiras | técnicas | para | a |
diferenciação de célula tronco a base de | mRNA. Nem todos | os |
tipos de célula tronco e meio de cultura são igualmente condutivos para a liberação eficiente do mRNA, e este é atualmente um impedimento para a diferenciação a base de mRNA. É também comumente sabido que as células-tronco, particularmente, muitas linhas de célula tronco humanas, são ainda difíceis de cultivar sem a formação de parcelas resistentes a transfecção. É parte dos ensinamentos da presente invenção que as células tronco pluripotentes podem ser crescidas sob condições que muitas das células podem ser
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27/55 transfectadas com os mRNAs modificados. Em outras concretizações, a dose de RNA e reagente de transfecção (ambos os quais sendo associados com toxicidade) deve ser provida para as células em niveis capazes de exercer o controle máster dos efeitos dos genes enquanto suporta a viabilidade das células alvo em face das forças próapoptóticas e citostáticas construídas pelo processo de alteração do destino celular.
[0052] Consequentemente, em vista dos problemas associados com os procedimentos de diferenciação das células troncos conhecidas, os novos métodos, materiais, e protocolos descritos aqui produzem tipos diferentes de célula a partir de iPSCs ou ESCs com eficiência melhorada do processo e qualidade de células resultantes. A presente invenção conseguiu melhora significante através da potencialização do mRNA TF liberado às células tronco alvos. A presente invenção também provê novos protocolos que suportam a produção de células de tecido livre de pegadas (footprint) a partir de células tronco humanas sem o uso de células alimentadoras ou qualquer outro reagente potencialmente xeno-contaminado. O novo protocolo estendido dos benefícios do mRNA modificado e ajuda claramente a manter os bloqueios para a aplicação terapêutica da tecnologia de derivação da célula tronca.
[0053] Dado que a diferenciação a partir de pluripotente para estado terminalmente diferenciado frequentemente toma múltiplas etapas, requerendo uma estrutura de tempo de várias semanas até meses, o fator de crescimento baseado, em estratégias graduais é intrinsicamente ineficiente e tediosa. Consequentemente, concretizações da presente invenção remove, fundamentalmente, a necessidade de fatores e crescimento na
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28/55 geração de células betas pancreáticas.
[0054] Mais especificamente, esta invenção refere-se a alteração do estado pluripotente ou estado progenitor de células tronco ou células progenitor em direção a uma linhagem específica ou tipo de célula de tecido por expressão crítica dos genes de destino celular (coletivamente referido como células tronco), incluindo fatores de destino de célula chave e fusões entre os fatores de transcrição convencional (TFs) com domínios de transativação, otimizado para dirigir as células tronco em direção aos tipos diferentes de células; introdução destes fatores como RNA mensageiro sintético (mRNA) em células tronco pluripotentes cultivados na densidade preferida pelos métodos que resultam em níveis apropriados de expressão transgenes, mantendo células sob condições otimizadas para resultar na eficiência previamente inatingível de diferenciação específica. Os fatores expressos através da introdução de mRNA pode também incluir fatores de crescimento, citocinas, hormônios, peptídeos sinais e outro destino celular influenciando fatores secretados ou enzimas de modificação. Usando procedimentos similares, microRNA (miRNAs) ou outros RNAs codificante da não-proteína pode ser introduzido dentro de células sob a transição do estado da célula de modo a dirigir a diferenciação. Comparado a outros métodos que são conhecidos da técnica, a presente invenção reduziu drasticamente o tempo, custo, e os esforços envolvidos na diferenciação da célula tronco dentro em células beta.
[0055] Esta invenção descreve um método para alterar o estado pluripotente ou estado progenitor de células tronco ou células progenitoras em direção a uma linhagem específica ou
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29/55 tipo de célula de tecido específica, compreendendo pelo menos um de: expressar os genes do destino celular críticos, incluindo fatores do destino celular chave, e otimizado para dirigir as células tronco em direção a diferentes tipos de células; introduzir estes fatores como RNA mensageiro sintético (mRNA) em células tronco pluripotentes cultivadas na densidade preferida através de métodos que resultam em níveis apropriados da expressão transgenes; manter a célula sob condições otimizados para resultar em alta eficiência da diferenciação específica.
[0056] Em certas concretizações, as iPSCs expandidas completamente estabilizadas são providas.
[0057] Em certas concretizações, não existe necessidade de limpar os epissomas ou vírus RNA (por exemplo, Sendai), que pode tomar 10+ passagens de iPSCs após isolamento.
[0058] Em certas concretizações, o processo é um alimentador livre.
[0059] Em certas concretizações, o processo é xeno-livre, compreendendo todos os reagentes sintéticos ou reagentes humanos e não componentes derivados de animais não-humanos.
[0060] Em certas concretizações, o processo é livre de impressão tendo nenhuma integração aleatória e DNA em genoma (como frequentemente acontece com epissomal).
[0061] Em certas concretizações, o processo resultando em um antecedente genético completamente personalizado via tecido de partida específico ao paciente e/ou editar o genoma.
[0062] Em um outro experimento, como uma alternativa para o processo destacado na Tabela 1, as células iPSC crescidas como esferas em suspensão foram transfectadas diretamente
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30/55 usando eletroporação, (por exemplo, usando eletroporador MaxCyte STX) sem revestimento (plating) sobre a superfície de uma placa. Em uma concretização, 2 milhões de iPSCs de partida nas esferas foram transfectados em suspensão com diferentes mRNAs, por exemplo, Soxl7 ou Pax6, ou transfectados simulado (mock). A quantidade de mRNA testado na figura 8 foi 2500 ng. As células foram então crescidas NBM no caso de transfecção Soxl7, ou MEMalpha com KSR no caso de transfecção Pax6. A transfecção pode ser repetida 1, 2, 3, 4, 5 ou ainda mais vezes se a transição ocorrer em longos periodos de tempo. Como resultado, após a primeira transfecção de mRNA Soxl7, o conjunto de células torna-se significativamente menor e esferas menos compactas, perdem o contorno definido ou limite externo. Em contraste, as esferas transfectadas simuladas mantêm bem definida, mostrando claramente o contorno externo visivel nas fotos 2D. As esferas menores das iPSCs não transfectadas ou transfectadas simuladas tem uma aparência transparente, enquanto aquelas maiores parecem menos transparente por serem espessas nas camadas celulares. Para comparação, as esferas iPSC transfectadas com mRNA Pax6 (uma diferenciação neural TF) progrediu em direção ao ectoderma, ou seja, células progenitoras neural dos quais as esferas torna-se mais escuras e tem um contorno mais acentuado do que os transfectados simulados, mas foram maiores no tamanho e tem limites mais definidas do que os Soxl7 transfectados.
[0063] Pelo mesmo principio e métodos similares, células intermediárias de camada especifica germinativa tais como células endodermas, e mais células intermediárias a jusante tais como células progenitoras hepatócitos, células
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31/55 progenitoras pancreáticas, etc., podem também ser transfectadas com mRNAs TF adicionais em esferas. As células transfectadas desta maneira são mais resistentes para toxicidade a partir de moléculas menores, fatores de crescimento, ou outros elementos em cultura celular, e deve ser em geral mais eficiente na diferenciação do que a transfecção 2D usando reagentes químicos. Esta observação, invisível em publicações científicas, foi feita inadvertidamente durante um teste de um equipamento de eletroporação, e serviu como um método de apoio como parte da descrição atual.
Definições [0064] Para facilitar o entendimento desta invenção, um número de termos é definido abaixo. Os termos definido aqui tem significado como comumente entendido por um técnico no assunto nas áreas relevantes da presente invenção. Os termos tais como um, uma, e o, a não são pretendidos como referindo apenas a uma entidade singular, mas incluindo a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia aqui é usada para descrever concretizações específicas da invenção, mas seu uso não delimita a invenção, exceto como delineado nas reivindicações.
[0065] O termo célula do tipo célula beta pretende significar uma célula dividindo características, com uma célula beta pancreática. As células do tipo célula beta são ainda definidas pelas características morfológicas, bem como por características de marcador específico. Como células do tipo célula beta derivada de célula-tronco pluripotente induzidas dividem características similares (incluindo
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32/55 características de marcador e hormonal) com células beta pancreáticas, células do tipo célula beta derivada de célula tronco pluripotente induzidas podem ser usados intercaladamente com célula beta derivada de célula tronco pluripotente induzida.
[0066] Um corpo embrióide refere-se a um agregado de células derivadas a partir de células pluripotentes, onde a agregação celular pode ser iniciada por qualquer método que previne as células a partir da adesão à superfície para formar os crescimentos de colônias típicas. Como usado aqui, corpo embrióide refere-se a um agregado esferoide tridimensional de células tronco pluripotentes, incluindo, mas não limitado às células tronco embriônicas derivadas a partir do estágio de blastócitos de embriões a partir de fontes de mamíferos. Um corpo embrióide pode ser formado a partir de células tronco embriônicas derivado através de qualquer técnica geralmente conhecida da técnica, incluindo, mas não limitada à transferência de células somáticas nucleares ou reprogramação de células somáticas para resultar em células tronco pluripotentes induzidas.
[0067] Como usado aqui, o termo células tronco pluripotente induzidas refere-se a uma célula tronca pluripotente derivada a partir de uma célula somática (por exemplo, uma célula somática adulta). As células de tronco pluripotente induzidas são similares às células tronco embriônicas em sua habilidade de diferenciação para formar qualquer tipo de célula adulta, mas não são derivadas de um embrião.
[0068] Como usado aqui, célula, linha celular, e cultura celular incluem progênie. Também é entendido que
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33/55 toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a deliberar ou mutações inadvertidas. Variante de progênies que tem a mesma função ou propriedade biológica, como classificado para as células originalmente transformadas é incluida.
[0069] Como usado aqui, composição refere-se a uma combinação de agente ativo e pelo menos um outro composto ou molécula, inerte (por exemplo, um agente detectável ou marcador) ou ativo, tal como um adjuvante.
[0070] Como usado aqui, cultivar refere-se as células de manutenção sob condições nas quais eles podem proliferar e evitar a senescência como um grupo de células, cultivar pode também incluir condições nas quais as células também ou alternativamente diferenciar.
[0071] Como usado aqui, diferencialmente expressas refere-se à produção diferencial de RNA, incluindo, mas não limitado a mRNA, tRNA, miRNA, siRNA, snRNA, e piRNA transcritos a partir de um gene ou região regulatória de um genoma ou o produto de proteina codificado por um gene como comparado ao nivel de produção de RNA pelo mesmo gene ou região regulatória em uma célula normal ou uma célula controle. Em um outro contexto, diferencialmente expressa também refere-se as sequências de nucleotídeos ou proteinas em uma célula ou tecido que tem perfis de expressões temporais diferentes e/ou expressões espaciais quando comparado a uma célula normal ou célula controle.
[0072] Como usado aqui, super-expressa ou superexpressão refere-se a um nivel de expressão aumentada de um RNA ou produto de proteina codificado por um gene quando comparado ao nivel de expressão do RNA ou produto de proteina
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34/55 em urn normal ou célula controle.
[0073] Como usado aqui, sob-expresso ou sob-expressão refere-se a um nivel de expressão diminuído de um RNA ou produto de proteína codificado por um gene quando comparado com o nível de expressão do RNA ou produto de proteína em uma célula normal ou controle.
[0074] Como usado aqui, diferenciado ou diferenciação, refere-se ao processo pelo qual o precursor ou célula progenitores (ou seja, células progenitores hepáticas) diferenciada em tipos de célula especifica, por exemplo, células beta pancreáticas.
[0075] Como usado aqui, quantidade efetiva é uma quantidade suficiente para efetuar benefícios ou respostas biológicas desejadas, emocionais, médicas, ou respostas clínicas de uma célula, tecido, sistema, animal, ou humana. Uma quantidade efetiva pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações, ou dosagens. O termo também inclui, dentro de seu escopo, quantidades efetivas para melhorar a função fisiológica normal.
[0076] Como usado aqui, expansão ou expandido no contexto das células, refere-se a um aumento no número de um tipo de célula característica, ou tipos celulares, a partir de uma população inicial de células, que pode ou não pode ser idêntica. As células iniciais usadas para expansão necessária não sendo a mesma que as células geradas a partir da expansão. Por exemplo, as células expandidas podem ser produzidas pelo crescimento ex vivo ou in vitro e diferenciação da população inicial de células.
[0077] Como usado aqui, expressão refere-se ao processo pelo qual polinucleotídios são transcritos em transcritos de
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RNA. No contexto de mRNA e outras espécies de RNA traduzidos, expressão também refere-se ao processo ou processos pelos quais o RNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptideos, polipeptidios, ou proteínas.
[0078] Como usado aqui, célula tronco pluripotente induzida ou célula iPS ou iPSC refere-se a uma célula capaz de diferenciação em múltiplos tipos de célula que é artificialmente derivado (não naturalmente derivada) a partir de uma célula não-pluripotente.
[0079] Como usado aqui, integração livre de célula iPS refere-se a uma célula iPS que não contém um transgenes exógeno integrado dentro do genoma da célula nãopluripotente .
[0080] Como usado aqui, isolado significa separado a partir dos constituintes, celular e de outra forma, no qual o polinucleotidio, peptideo, polipeptidio, proteína, anticorpo, ou fragmento dos mesmos, são normalmente associado como na natureza. Um polinucleotidio de ocorrência não natural, polinucleotidio, peptideo, polipeptidio, proteína, anticorpo, ou fragmentos dos mesmos, não requerem isolamento para distinguir ele a partir de sua contraparte de ocorrência natural.
[0081] Como usado aqui, concentrado refere-se a uma molécula, incluindo mas não limitado a um polinucleotidio, peptideo, polipeptidio, proteína, anticorpo, ou fragmento do mesmo, que é distinto a partir de sua contraparte de ocorrência natural na qual a concentração ou número de molécula por volume é maior que aquela de sua contraparte de ocorrência natural.
[0082] Como usado aqui, diluído refere-se a uma molécula
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36/55 incluindo, mas não limitada, a um polinucleotidio, peptideo, polipeptidio, proteina, anticorpo, ou fragmento do mesmo, que é distinto a partir de sua contraparte de ocorrência natural na qual a concentração ou o número de moléculas por volume é menor que sua contraparte de ocorrência natural.
[0083] Como usado aqui, separado refere-se ao estado de ser fisicamente dividido a partir da fonte original ou população tal que o composto separado, agente, particula, ou molécula pode não mais ser considerada parte da fonte original ou população.
[0084] Como usado aqui, mamífero para o propósito de tratamentos, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humano, animais domésticos e de fazenda, primatas não-humanos, e de zoológico, de esportes, ou animais domésticos, tais como, mas não limitados a, cachorros, cavalos, gatos e gato.
[0085] Como usado aqui, célula tronco refere-se a qualquer célula pluripotente, totipotente auto-renovável, ou célula multipotente ou célula progenitora ou célula precursora que é capaz de diferenciar em tipos de células múltiplas.
[0086] Como usado aqui, totipotente refere-se às células que podem diferenciar e dar origem a todos os tipos de células em um organismo, mais as células extra-embriônicas, ou placentária.
[0087] Como usado aqui, pluripotente refere-se às células que podem diferenciar e dar origem a todos os tipos de célula que fazem um organismo, incluindo qualquer tipo de célula fetal ou adulta, exceto para as células extra-embriônicas, ou placentária.
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37/55 [0088] Como usada aqui, multipotente refere-se as células que podem desenvolver em mais do que um tipo de célula, mas são muito mais limitadas do que as células pluripotentes nos tipos de célula que podem desenvolver.
[0089] Como usado aqui intercaladamente, indivíduo, paciente, sujeito refere-se a um organismo vertebrado.
[0090] Como usado aqui, população celular substancialmente pura refere-se a uma população de células tendo um marcador de características celulares especificas e potencial de diferenciação que é de cerca de 50%, preferivelmente, cerca de 75-80%, mais preferivelmente, cerca de 85-90%, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% das células fazendo um total da população celular. Assim, uma população celular substancialmente pura refere-se a uma população de células que contém menos que cerca de 50%, preferivelmente, menos que cerca de 20-25%, mais preferivelmente, menos que cerca de 1015%, e mais preferivelmente, menos que cerca de 5% de células que não participam de uma característica de marcador especificada e potencial de diferenciação sob condições de ensaio designadas.
[0091] Como usado aqui, pré-diferenciação refere-se ao processo pelo qual o precursor ou células progenitora (por exemplo, célula tronco pluripotente) diferenciar em tipos de célula intermediária, por exemplo, células progenitoras pancreáticas, que tem o potencial para diferenciar ainda em células efetoras finais (por exemplo, células beta).
[0092] Como usado aqui, terapêutico refere-se ao tratamento, cura, e/ou melhora de uma doença, distúrbio, condição, ou efeito colateral, ou para diminuir na taxa de avanço de uma doença, distúrbio, condição ou efeito
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38/55 colateral. 0 termo também inclui dentro de seu escopo a melhora da função fisiológica normal, tratamento paliativo, e
remediação parcial | de uma doença, | distúrbio, | condição | ou |
efeito colateral. | ||||
[0093] Os termos | tratamento e | tratamento | ' como usado | |
aqui se referem | geralmente à | obtenção de | um efeito | |
farmacológico desejado e/ou efeito | fisiológico | desejado. | 0 | |
efeito pode ser | profilático em | termos de prevenção | ou | |
prevenção parcial | de uma doença, | sintoma, ou | condição | do |
mesmo, e/ou pode | ser terapêutico | em termos | de uma cura | |
parcial ou completa de uma doença, condição, | sintoma, | ou |
efeito colateral atribuído á doença. 0 termo tratamento como usado aqui cobre qualquer tratamento em um mamífero, particularmente um humano, e inclui: (a) prevenção da doença a partir da ocorrência em um indivíduo que pode ser prédisposto à doença, mas não foi ainda diagnosticado como tendo, (b) inibição da doença, ou seja, controlar seu desenvolvimento, ou (c) aliviar a doença, ou seja, atenuar ou melhorar a doença e/ou seus sintomas ou condições. 0 termo tratamento como usado aqui se refere a ambos os tratamentos, terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles necessitando de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido.
[0094] Como usado aqui, preventivo refere-se à obstrução ou interrupção de uma doença ou condição antes de ocorrer, mesmo se não diagnosticada, ou enquanto a doença ou condição está ainda na fase subclinica.
[0095] Como usado aqui, agente ativo refere-se a uma substância, composto, ou molécula, que é biologicamente
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39/55 ativa, ou de outra forma induzir um efeito biológico ou fisiológico em um indivíduo ao qual está sendo administrado.
[0096] Como usado aqui, veículo farmaceuticamente aceitável refere-se ao diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual um agente ativo, condrócitos da presente descrição, ou composição contendo condrócitos da presente descrição é administrado em conjunto com e que é aprovado por uma agência regulatória do governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopeia norte-americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e/ou humanas.
[0097] | A menos | que | de outro modo definido | aqui, todos os | |
termos | técnicos | e | científicos usados | aqui | tem o mesmo |
significado que | o comumente entendido | por | um técnico no | ||
assunto. | |||||
Tipos de | células | ||||
[0098] | Exemplos | de | tipos celulares | podem | incluir, por |
exemplo, | células | endoderma, células | progenitoras |
pancreáticas, células endócrina pancreáticas, e células beta. [0099] Exemplos de superfícies apropriadas para recipientes de cultura incluem, mas não estão limitados a, Vitronetin, Ecadherin, Corning® Synthemax® II ou Matrigel para iPSCs, incluem mas não estão limitados ao Matrigel para endoderma, e incluem, mas não estão limitados ao Matrigel ou Colágeno para células progenitoras pancreáticas e células endócrinas pancreáticos.
[0100] Em um aspecto, um método exemplificative para diferenciação ou reprogramação de células somáticas podem incluir o uso de qualquer um ou mais de um fator de reprogramação mRNA sintético selecionado de Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, e Lin28 e domínios de transativação, onde a
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40/55 célula somática é reprogramada ou de-diferenciada. Os métodos e composições para modulação IPSC estão descritos nos pedidos US No. 13/893,166 e US 14/292,317, o conteúdo das quais sendo incorporado aqui por referência.
[0101] Em certas concretizações, existem protocolos para uso de culturas de célula suspensa, e placas de cultura de baixa ligação celular e recipientes podem ser usados para tais culturas de suspensão.
[0102] Em certas concretizações, as condições ambientais tais como concentração de oxigênio pode ser modulada para condições de indução ótima.
[0103] Em certas concretizações, os processos e métodos de seleção de células desejadas ou melhora de sua porcentagem de confluência ou densidade celular na população de cultura celular total são providas.
[0104] Em certas concretizações, os métodos de criopreservação de células do tipo célula beta diferenciada são providos. Em algumas concretizações, as células diferenciadas são criopreservadas para viabilidade celular ótima durante ou após o armazenamento, por exemplo, através a provisão de meio de cultura compreendendo HSA e/ou DMSA. Em algumas concretizações, o meio de cultura compreendendo, por exemplo, 2,5% de HSA com 10% de DMSO em meio de cultura podem ser provido. Em algumas concretizações, os números de célula pode ser otimizado para a melhora adicional de viabilidade durante ou após armazenamento.
[0105] Os métodos de re-cultivo das células diferenciadas também são providos. As células podem ser re-cultivadas em muitos recipientes de cultura, por exemplo, frasco T75, frasco T25, placa de 6-poços, placa de 96 poços, Células
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41/55 podem ser re-cultivadas em densidades celulares diferentes para aplicações diferentes.
[0106] Em certas concretizações, a presente descrição também provê métodos para gerenciar tensão física sobre as células durante o manuseio através do processo de diferenciação, melhorando assim a viabilidade. Certos tipos de células durante a diferenciação são muito pequenas, do tipo iPSCs. Estas células pequenas são muito sensíveis à força centrífuga. As iPSCs são muito sensíveis à força centrífuga excessiva. Alguns tipos de células durante a diferenciação são muito viscosas (sticy), tipo iPSCs e células em estágio endoderma. Estas células são muito sensíveis às forças de cisalhamento. Quando do manuseio destas células, uma pipeta de 10 mL foi usada para evitar o uso de quaisquer pontas pequenas e evitar a pipetagem das células para cima e para baixo repetidamente. Para manutenção, estas células podem ser cultivadas como colônias, e então dissociadas como conjuntos, ao invés de células únicas. Para diferenciação, se células únicas são necessárias, uma pode terminar a dissociação antes das células separarem, remover a solução de dissociação, e deixar a solução de dissociação residual dissociar mais as células. Este protocolo é comumente utilizado em cultura celular.
[0107] O relatório será melhor compreendido à luz dos ensinamentos das referências citadas dentro do relatório. As concretizações dentro dos relatórios descritivos provem uma ilustração de concretizações da invenção e não devem ser construídos para limitar o escopo da invenção. O técnico no assunto reconhece que muitas outras concretizações são abrangidas pela invenção. Todas as publicações e patentes
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42/55 citadas neste relatório são incorporadas aqui por referência em sua íntegra. Para a extensão do material incorporado por referência contradizer ou ser inconsistente com este relatório descritivo, o relatório será suplantado em qualquer dos referidos materiais. A citação de qualquer referência aqui não será uma admissão de que tais referências são técnica anterior da presente invenção.
[0108] A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, as condições de reação, e assim por diante usadas no relatório, incluindo as reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo cerca de. Consequentemente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas acredita-se ser obtido pela presente invenção. No máximo, e não como uma tentativa de limitar o pedido da doutrina de equivalentes do escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser construído a luz do número de dígitos significantes e abordagens de arredondamento ordinário.
[0109] O uso da palavra um ou uma quando usado em conjunto com o termo compreendendo nas reivindicações e/ou no relatório pode significar um, mas também é consistente com o significado de um ou mais, pelo menos um, e 'um ou mais de um. O uso do termo ou nas reivindicações é usado para significar e/ou a menos que explicitamente indicado se refere às alternativas apenas ou alternativas são mutuamente exclusivas, apesar da descrição suportar uma definição que refere-se apenas alternativas e e/ou.
[0110] A menos que de outro modo indicado, o termo pelo
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43/55 menos precedentes de uma série de elementos deve ser entendido para referir-se a cada elemento nas séries. Os técnicos no assunto irão reconhecer, ou ser capazes de determinar o uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as concretizações especificas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes são pretendidos deve ser abrangida pelas reivindicações a seguir.
[0111] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Apesar de qualquer método e material similar ou equivalente àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferidos e materiais são agora descritos.
[0112] Outras concretizações da invenção serão aparentes aqueles técnicos no assunto a partir da consideração do relatório e prática da invenção descrita aqui. Deve ser entendido que o relatório e exemplos são considerados como exemplificaiivos apenas, com um escopo verdadeiro e espírito da invenção sendo indicado pelas reivindicações a seguir.
Exemplos [0113] A invenção é agora descrita com referência aos Exemplos a seguir. Estes exemplos são providos para o propósito de ilustração apenas, e a invenção não é limitada aqueles exemplos, mas sim abrangem todas as variações que são evidentes como um resultado dos ensinamentos providos aqui. Exemplo 1 - geração de células endoderma a partir de iPSCs: [0114] As iPSCs foram plaqueadas em placas de cultura celular de 6-poços de tamanho padrão (cerca de 9,5 cm2 área de crescimento/poço) ou placas de cultura celular de 12 poços
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44/55 de tamanho padrão (cerca de3,8 cm2 de área de crescimento/poço) para iniciar a diferenciação. Outros recipientes de cultura dimensionados são opcionalmente aplicáveis, bem como e algumas vezes pode ser mais preferidos sobre placas de 6 poços ou 12 poços devido a eficiência maior do uso de reagentes e tempo. Condições dos exemplos para o protocolo de eficiência maior para produção de células beta diferenciadas funcionais são providas na tabela de célula beta, abaixo, incluindo o estágio celular de partida, recipientes de cultura, revestimento, agente de dissociação, nome do meio e componentes principais, densidade de semeio para um exemplo de placa de 6 poços e nivel de oxigênio.
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Tabela 1
Diferenciação da célula Beta
2-6 dias | 1-3 dias | 1-3 dias | 3-6 dias | |
Estágio 1 | Estágio 2 | Estágio 3 | Estágio 4 | |
Células de partida | iPSCs | Endoderma | Células progenitoras pancreáticas | Células endócrinas pancreáticas |
Recipientes de cultura | Placa de ligação ultrabaixa/ Frasco | Placa de cultura / frasco | Placa de cultura / frasco | Placa de cultura / frasco |
Revestimento | Nenhum | Matrigel | Matrigel / Colágeno I | Matrigel / Colágeno I |
Dissociação | EDTA | TypLE | TypLE | TypLE |
Nomes dos mesios e componentes principais | MEMa, DMEM/F12, DMEM B27 10-50 uM Insulina | DMEM/F12, MCDB131 + 8mM Dglicose | DMEM/F12, MCDB131 + 20mM Dglicose | CMRL |
5% KSR | ||||
Transfecção com mRNA SOX17 | Transfecção com mRNA PDX1 | Transfecção com mRNA PDX1 e NKX6.1 | Transcrição mRNA NKX6.1 e MAFA | |
Densidade de semeio (Para placa de 6-poços) | 1 x 105 - 4 x 105 células por poço | 1 x 105 - 3 x 105 células por poço | 3 x 105 células por poço | 3 x 105 células por poço |
Oxigênio | Oxigênio normal | Oxigênio normal | Oxigênio normal | Oxigênio normal |
[0115] Em uma placa de 6-poços, as células de uma tamanho de população a partir de 1 x 105 a 4 x 105 por poço foi usada com sucesso. As iPSCs foram consideradas prontas para diferenciação quando existirem colônias de iPSCs tipicas o suficiente com bordas bem definidas acentuadas, onde as células são compactas e colônias não foram super-crescidas. A qualidade de iPSCs da presente invenção produzida usando
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46/55 estes critérios providos como sendo críticos para diferenciação quando as linhas iPSC da presente invenção foram comparadas com as linhas iPSC que foram produzidas por outros usos de outros métodos.
[0116] As iPSCs neste estágio foram induzidas para diferenciar em células da linhagem mesendoderma. Foi surpreendentemente determinada que os sistemas de cultura em suspensão foi muito útil para aumentar neste estágio mesmo se muitos protocolos usuais para diferenciação preferem usar as células em monocamadas ligadas. Mais especificamente, o crescimento de iPSCs em suspensão para indução foram mais resistentes à toxicidade química e foram facilmente replaqueados nos últimos estágios. As placas de ligação ultrabaixa (Sigma-Aldrich) ou outras placas de ligação baixas foram usadas para encorajar o crescimento celular em suspensão das iPSCs.
[0117] Quando as células iPS precisam ser passadas, foi importante dissociar as colônias iPSC com um protocolo que causou baixa citotoxicidade e resultou em mais conjuntos pequenas de iPSCs, que podem formar esferas rapidamente se a cultura suspensão é desejado, iPSCs foram dissociados usando TripLE™ (ThermoFisher), Accutase (Life Technology), ou EDTA por dissociação com EDTA de 0,1 mM, algumas vezes 0,5 mM, ou 1 mM em DPBS (Fisher Scientific), em 37°C pro 5 minutos. Várias vezes a dissociação foram suadas com sucesso, incluindo, em algumas concretizações, 1 a 2 minutos, e algumas vezes 10 a 20 minutos para esta etapa. Em alguns aspectos, o tempo de dissociação pode ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 minutos.
[0118] Para meio, mesma, DMEM/F12, e DMEMB27 forma testados
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47/55 com 10-50 μΜ da insulina e 5% de KSR foram apropriados para conseguir os resultados como desejado neste estágio de diferenciação. A iPSC foram então induzidas para conduzir o estágio pluripotente e diferenciar em mesendoderma pela presença de inibidores GSK3, tais como CHIR99021, CHIR98014, BIO ou GSK inibidor IX e SB-216763, que de-reprime as funções
de genes da | rota Wnt, BMP4, | e Activin A. em algumas | |||
concretizações | , a insulina | está | presente | em concentração | de |
cerca de, por | exemplo, 10, | 11, | 12, 13, | 14, 15, 16, 17, | 18, |
19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 | ou | 50 μΜ de | insulina, ou em | uma | |
faixa entre | qualquer um | dos | valores | acima citados. | Os |
inibidores GSK3 foram realizados em uma janela de tempo de 1, 2-, 3- dia e usou contadores de células positivas FoxA2, CXCR4 como análise de qualidade quando o tempo de escolha e concentrações de inibidores de, por exemplo, 5 mM, 8 mM, 10 mM, etc. Em algumas concretizações, os inibidores estão presentes em 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM, ou em uma faixa entre qualquer um dos valores acima citados.
[0119] Em um experimento, as células foram então transfectadas com mRNA FoxA2, e/ou Soxl7 em uma dose de 20 ng pro poço com reagente de transfecção Stemgent (Stemgent). Esta transfecção foi também realizada incluindo mRNA GATA4, e/ou GATA6, e foi repetida por 3, 4, 5 e 6 vezes, algumas vezes em uma dose de mRNA 10 vezes maior, usando o reagente de transfecção Stemgent ou outros reagentes de transfecção comercialmente disponível. As células neste estágio mostrou a morfologia que foram mais próximas das células epiteliais do que as células mesenquimal, derivada a partir de iPSCs a partir de tempos de transfecção do mRNA diferente e de densidade de partida (Figura 1) .
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48/55 [0120] Em um outro experimento, como uma alternativa para processar delineada na Tabela 1, o crescimento das células iPSC como esferas em suspensão foram diretamente transfectadas usando eletroporação, (por exemplo, usando o eletroporador MaxCyte STX) sem revestimento sobre a superfície de um aplaca. Em uma concretização, 2 milhões de iPSCs de partida em esferas foram transfectadas em suspensão com mRNA diferentes, por exemplo, Soxl7 ou Pax6, ou transfectadas simuladas. A quantidade de mRNA testado na figura 8 foi 2500ng. As células foram então crescidas em NBM no caso da transfecção Soxl7, ou MEMalpha com KSR no caso de transfecção Pax6. A transfecção pode ser repetida 1, 2, 3, 4, 5 ou ainda mais vezes se a transição levar períodos longos de tempo. Como resultado, após a primeira transfecção de mRNA Soxl7, o conjunto de célula torna-se esferas significativamente menor e menos compacta, perdendo o contorno definido ou limite externo. Em contraste, as esferas transfectadas simuladas mantém-se bem definida, mostrando contorno externo claramente visível em fotos 2D.
As esferas menores da iPSCs não-transfectadas ou transfectadas simuladas tem uma aparência transparente, enquanto umas parecem maiores menos transparente para ser espessas em camadas celulares. Para comparação, as esferas iPSC transfectadas com mRNA Pax6 (uma diferenciação neural TF) progrediu em direção a ectoderma, ou seja, células progenitoras neurais, das quais as esferas torna-se mais escuras e tem um contorno menos acentuado do que as transfectadas simuladas, mas foram maiores no tamanho e tiveram mais limites definidos do que os transfectados Soxl7. [0121] Pelo mesmo princípio e métodos similares, as células
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49/55 intermediárias de camada-específica germinativa tais como células endoderma, e mais células intermediárias a jusante, tais como células progenitoras hepáticas, células progenitoras pancreáticas etc., podem também ser transfectadas com mRNAs TF adicionais em esferas. As células transfectadas desta forma são mais resistentes à toxicidade a partir de moléculas pequenas, fatores de crescimento, ou outros elementos em cultura celular, e devem ser em geral mais eficientes na diferenciação do que a transfecção 2D usando reagentes químicos. Esta observação, invisível na publicação científica, foi feita inadvertidamente durante um teste de um equipamento de eletroporação, e serviu como um método de apoio, como parte da descrição atual.
Exemplo 2 - geração das células progenitoras pancreáticas a partir das células endoderma:
[0122] As células endoderma são plaqueadas sobre recipientes de cultura celular comercial. As placas de 6poços foram usadas na experimentação mostradas na Figura 2, mas outros tamanhos de poço comercialmente disponível padrão são apropriadas e aplicáveis. As placas pré-revestidas com Matrigel (BD Biosciences) , 1 x 105 - 1 x 106 células foram então plaqueadas em DMEM/F12 ou MCDB131 suplementados com 8 mM de D-glicose.
[0123] Em um experimento, as células foram então transfectados com mRNA PDX1. Adicionalmente, as células foram transfectadas ou co-transfectadas, por efeitos fortes, com mRNA para mRNA para Hlxb9, Ptfla, ixll, HNFla e b, e Sox9 em uma dose de cerca de 50 ng por poço com reagente de transfecção Stemgent (Stemgent) em meio de cultura, e repetida para 2, 3, ou mais vezes, nas doses variando de tão
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50/55 baixa quanto 10 ng e tão alta como 200 ng por poço, usando reagente de transfecção Stemgent ou outros reagentes de transfecção comercialmente disponível. Em algumas concretizações, a dose inicial ou dose repetida de Stemgent
pode | ser 10, 20, 30, 40, | 50, | 60, | 70, | 80, | 90, 100, 110, 120, |
130, | 140, 150, 160, 170, | 180, | 190, | ou | 200 | ng por poço, ou em |
uma | faixa entre qualquer | um | dos | valores | acima citados. As | |
células neste estágio parecem | mais | escuras | do que as células |
de endoderma e tendem a formar conjuntos (figura 2).
Exemplo 3 - geração de células endócrinas pancreáticas a partir de células progenitoras pancreáticas:
[0124] As células progenitoras pancreáticas foram cultivas em placas de 6-poços ou outras placas pré-revestidas com Matrigel (BD Biosciences) ou Colágeno I (Sigma) em DMEM/F12 ou MCDB131 suplementado com 8 mM de D-glicose. Outros meios de cultura celular ligadas similares é também apropriado par auso.
[0125] As células progenitoras pancreáticas foram transfectadas com PDX1, nkx6.1, E/OU nkx2.2; Pax6, Pax4, Hlxb9 Ngn3, o mRNA em uma dose de 10-200 ng por poço com o reagente de transfecção Stemgent (Stemgent) em meio de cultura suplementado com 200 ng/mL B18R. Em algumas concretizações, a dose de Stemgent pode ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 ng por poço, ou em uma faixa entre qualquer um dos valores acima citados. Mais reagentes de transfecção comercialmente disponíveis são também aplicáveis.
[0126] As células progenitoras pancreáticas foram opcionalmente tratadas neste estágio com uma série de fatores de crescimento para diferenciação adicional. As células foram
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51/55 cultivadas em meio S5 contendo MCDB131 + 20mM D-Glucose + 1.754 g/L NaHCO3 + 2% FAF-BSA + ITS-X 1:200 + 2mM Glutamax + 0.25mM Vitamin C + 1% Pen/Strep + Heparin 10 ug/ml (Sigma;
H3149) . As células foram tratadas com meio S5 com 0,25 uM Santl + 100 nM RA + 1 μΜ XXI (EMD Millipore) + 10 μΜ Alk5i II (Axxora) + 1 μΜ T3 (EMD Millipore) + 20 ng/ml Betacellulin (Thermo Fisher Scientific) cada outro dia por quatro dias. No quinto dia, as células foram tratadas com meio S5 com 25 nM RA + 1 μΜ XXI + 10 μΜ Alk5i II + 1 μΜ T3 + 20 ng/ml Betacellulin cada outro dia pro quatro dias.
[0127] Neste estágio, as células ainda aglomeradas tornamse flutuantes a partir da monocamada, um sinal precoce da diferenciação em e formação de células endócrinas pancreáticas (Figura 3).
Exemplo 4 - maturação das células endócrinas pancreáticas:
[0128] As células endócrinas pancreáticas foram cultivadas sem recipientes de cultura celular comercial. As placas 6poços foram usadas nestes experimentos, mas todos os outros tipos são também aplicáveis. As placas foram pré-revestidas com Matrigel (BD Bioscicences) ou com Colágeno I(Sigma) em CRML (Mediatech). As placas de ligação ultra-baixa ou frascos
foram usados | após os | conjuntes serem | colhidos. | ||
[0129] As | células | foram então | transfectadas | com | mRNA |
NKX6.l/MAFA | ou MAFA | em uma dose de | 10-200 ng por | poço | com |
reagente de | transfecção Stemgent | (Stemgent) em | meio | de |
cultura suplementado com 200 ng/mL B18R. As transfecções repetidas foram realizadas 3 vezes, e as transfecções adicionais opcionais podem ser realizados, se necessário. Outros reagentes de transfecção comercialmente disponíveis são também aplicáveis.
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52/55 [0130] As células endócrinas pancreáticas foram também tratadas com uma série de fatores de crescimento para maturação adicional. As células foram crescidas em meio S6 contendo CMRL 1066 suplementada (Mediatech; 99-603-CV) + 10% FBS (HyClone, VWR, 16777) + 1% Pen/Strep. As células foram tratadas com S6 com 10 mM de Alk5i II + 1 μΜ de T3 cada a dia por 14 dias.
[0131] Neste estágio, os conjuntos de células endócrinas pancreáticas, tais como células betas, formam conjuntos de tamanhos a partir de umas poucas dúzias a milhares de células auto-estimulantes a partir de uma monocamada de maturação de células endócrinas pancreáticas. As culturas celulares neste estágio foram mostradas como exemplos na figura 4. Estas células foram coradas com anticorpos contra o estágio celular especifico dos marcadores de proteina, tais como NKX6.1 e insulina, os resultados dos quais confirmaram que algumas destes células são de fato células beta pancreáticas (Figura 5) . Estas células também demonstraram marcadores de destino celular especifica ao longo desta rota de diferenciação induzida artificialmente para as células do tipo celular beta (Figura 6) . Além disso, os conjuntos de célula beta responderam a glicose adicionada ao meio de cultura e as células beta secretoras de insulina em resposta (Figura 7).
Exemplo 5 - células beta derivadas de iPSC respondem a glicose in vitro:
[0132] Os conjuntos de células formadas em estruturas tridimensionais a partir de células endócrinas pancreáticas em monocamadas, como mostrado na figura 4, foram colhidas e transferidas em tubos de 15 ml, 2 x 105 a 1 x 106 células pro tubo, e meio de crescimento foi removido por centrifugação
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53/55 (300g por 2 minutos) e lavadas com 1 ml por amostra de tampão Krebs (Melton, publicação de 2014) duas vezes. 3 ml de glicose inferior (2 mM) de meio Krebs foi adicionado às células e incubado por 2 horas. O meio foi removido por centrifugação, e as células foram lavadas 2 vezes com 1 ml de tampão Krebs por amostra. Um mL de Krebs de glicose baixa foi então adicionado para cada tubo e incubado por 30 minutos a 37 °C em um incubador, com a tampa deixada frouxa para permitir a troca de ar. Então o sobrenadante foi colhido por centrifugação para análise, as células foram então lavadas uma vez com 1 ml de tampão de Krebs, então incubada em tampão Krebs com glicose superior (20 mM) por 30 minutos, então centrifugado para coletar sobrenadante para análise. As células foram lavadas duas vezes antes de ir através do ciclo de alta-glicose-baixa glicose novamente, por um total de 3 vezes. Os sobrenadantes foram colhidos em cada etapa, combinando a partir de 4-6 repetições independentes, e foram avaliados quanto ao nível de insulina pelo uso de um kit ELISA produzido comercialmente (ALPCO) e leitor de placa (Tecan ou SpectroMax). O ensaio foi também realizado com células beta criadas essencialmente pelo protocolo Melton a seguir (2014) para comparação, e os resultados mostraram que as células beta criadas usando o método da presente invenção teve uma expressão de insulina na linha de base inferior, e a taxa de resposta da insulina maior para o aumento da glicose no meio comparado ao método Melton (Figura 7), que demonstra o inesperado e surpreendente característica vantajosa das concretizações da presente descrição.
Exemplo 6 - células beta derivadas de iPSC respondem à glicose em modelos animais:
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54/55 [0133] Para validar adicionalmente as funções das células beta pancreáticas maduras exemplificativas produzidas de acordo com a presente invenção, a função secretora da insulina responsiva à glicose das células beta pancreáticas derivadas do iPSC são testadas em modelos de camundongos com diabetes tais como: (1) camundongo NOD com modelo de diabetes do tipo 1 espontânea, (2) modelo de diabetes do tipo I induzida por STZ, (3) modelo de diabetes do tipo II ob/ob ou db/db, ou modelos de primatas não-humanos tais como: macacos induzidos com STZ/macacos Vervet ou modelos de diabetes do
tipo I | babuino, ou | macacos | induzidos | por dieta | de | alta |
gordura | ou espontânea/macacos | Velvet ou | modelos de | diabetes | ||
do tipo | II babuino. | |||||
[0134] | Rotas de | liberação | : esferas | de célula | beta |
pancreática exemplificativa são infundidas em figado ou cápsulas de rim, ou emento. Teste: insulina no soro sem estimulo de glicose (semana 2, 4, 8, 12, 16, 24) é medida, medidas é obtida sobre a insulina no soro sem estimulo de glicose (semana 2, 4, 8, 12, 16, 24), medida é tomada para a glicose no sangue dos animais em jejum (semana 2, 4, 8, 12, 16, 24); ICH do sitio de transplante para insulina é realizado e coloração é realizada para coloração de Cpeptídeo e glucagon. Os resultados demonstram sintomas de diabetes reverso ou controle tal como glicose do sangue alta e efeitos associados sobre o órgão.
Exemplo 7 - células beta derivadas de iPSC respondem a glicose no tratamento de pacientes com diabetes humana:
[0135] As triagens clinicas usando as células beta pancreática derivada iPSC humana usando os protocolos descritos adaptados para adequar sob os procedimentos cGMP
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55/55 são dosados de acordo com os estudos com animais com referência a outras terapias celulares, embora nenhuma terapia atual de célula beta pancreática derivada de iPSC em andamento, as células progenitoras pancreáticas derivadas de ESCs humano são neste momento sendo usados em triagens clinicas dirigidos ao tratamento do diabetes do tipo I. Autólogos, um tipo preferido, ou células beta alogeneicas derivadas de células iPS, são liberadas através da veia porta, por exemplo, para tratar o diabetes do tipo I induzidas, diabetes do tipo II simples, diabetes em estagio tardio quando uma célula beta própria da pessoa está no desmame ou passou por, ou outros tipos de doença relacionada ao mal funcionamento da célula beta. As células-beta exemplificativas fabricadas, produzidas de acordo com a prática da presente invenção, tal como descrito no presente relatório, são liberadas as outras partes do corpo humano, tal como músculo, tecidos conectivos, órgãos pancreáticos, ou certos sities de outros órgãos.
Claims (15)
1. Método para induzir diferenciação de células-tronco em células betas pancreáticas secretoras de insulina sensiveis a glicose, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
(a) cultivar as células tronco pluripotente induzida como células de partida sob condições para diferenciação;
(b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma;
(c) dirigir as células de diferenciação em direção às células endoderma através da transfecção da cultura celular com uma primeira combinação de mRNA em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo especifica;
(d) dirigir, ainda, ditas células endodermas em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs;
(e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células beta pancreáticas que são responsivas ao meio de glicose e capazes de secretar insulina na resposta.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida primeira combinação de mRNAs compreender mRNAs FoxA2.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a primeira combinação de mRNAs compreender mRNAs Soxl7.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida primeira combinação de mRNAs compreender mRNAs FoxA2 e Soxl7.
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5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida primeira combinação de mRNAs compreender mRNAs FoxA2, Soxl7, GATA4, e GATA6.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida segunda combinação de mRNAs compreender pelo menos uma mRNAs PDX1, NKX6.1, Ptfia, ixll, HNFla e b, e Sox9.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida terceira combinação de mRNAs compreender pelo menos um de mRNAs PDX1, NKX6.1, NKX2.2, Pax6, Pax4, Hlxb9, e Ngn3 .
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o mRNA para efetuar um esforço no destino de célula beta pancreática compreender pelo menos um de mRNAs NKX6.1, MAFA, OU MAFA.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as referidas células de partida serem colhidas a partir de um fluido corpóreo ou tecido de um indivíduo.
10. Célula, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método conforme definido na reivindicação 1.
11. Composição para tratar a doença, distúrbio ou malformação, caracterizada pelo fato de compreender a célula conforme definida na reivindicação 10.
12. Método para tratar doença, distúrbio, ou malformação, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar no indivíduo necessitando do mesmo pelo menos uma das células definidas na reivindicação 9, e a composição conforme definida na reivindicação 11.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a referida célula ser derivada a partir do
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3/3 indivíduo receptor.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de as ditas células de partida serem colhidas a partir do receptor.
15. Método para produzir as células betas pancreáticas secretoras de insulina sensíveis à glicose induzidas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
(a) cultivar as células tronco pluripotentes induzidas como células de partida sob condições para diferenciação;
(b) induzir ditas células de partida para sair do estado pluripotente em direção à linhagem mesendoderma;
(c) dirigir a diferenciação celular em direção às células endoderma através da transfecção de cultura celular com uma primeira combinação de mRNAs em uma dose efetiva e dentro de janelas de tempo específicas;
(d) dirigir ainda ditas células endoderma em direção às células progenitoras pancreáticas através da transfecção com uma segunda combinação de mRNAs.
(e) maturar ainda ditas células progenitoras pancreáticas em células endócrinas pancreáticas com uma terceira combinação de mRNAs; e (f) coletar conjuntos enriquecidos com células betas pancreáticas que são responsivas para o meio de glicose e capaz de secretar insulina em resposta.
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