TW201823454A - 以RNA藉由幹細胞分化誘導胰臟β細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種以前所未有之效率及功能由人類誘導之多能幹細胞誘導或產生胰臟β細胞的新穎方法。本發明之核心在於在多個臨界分化決定點使用實驗上發現之mRNA以先前未知之方式沿多能至中內胚層至內胚層至胰臟內分泌細胞至胰臟β細胞之路徑來實現。

Description

以RNA藉由幹細胞分化誘導胰臟β細胞
本發明係關於利用細胞密度、試劑濃度及mRNA之特定組合之特定組合及範圍經由動力學控制之細胞生長方法引導胰臟β細胞自多能幹細胞之誘導。
在人類幹細胞之產生及隨之而來的分化方面之最近成果已改變關於細胞命運之可塑性、人類疾病模型及臨床療法之範例。由體細胞製得之胚胎幹細胞(ESC)及誘導之多能幹細胞(iPSC)二者可分化成一系列日益增加之不可與其對應初生細胞區分之特定細胞類型。因此，幹細胞對於研發新的人類細胞療法而言非常有前景。iPSC在個體化用藥領域中展示特定潛力，歸因於細胞之無限可用性、獲得細胞之程序的非侵襲性及對個別患者免疫匹配各治療之可能性，從而給予免疫抑制藥物自由。 大批研究經費花費在研發治療或預防各種人類疾病之細胞置換療法上。舉例而言，自體免疫造成患有1型糖尿病(T1D)之患者損失其胰臟β細胞-且因此損失其響應血糖含量及產生其自身胰島素之能力。因此，T1D患者可極大受益於用外部源對其產生胰島素之β細胞的置換。已成功進行一些含有產生胰島素之β細胞以及其他內分泌細胞之人胰島的移植，但發現供體胰腺之可靠供應源仍然係待克服之巨大障礙。現在，許多學術及工業群體已研發引導ESC或iPSC變為胰臟祖細胞之方式，旨在產生胰島素分泌β細胞，希望最終將幹細胞療法用於衍生之產生胰島素之葡萄糖響應細胞。然而，到此申請之時間，大多數公有領域中已知之此等方法可能不會完全產生功能性或成熟的胰島素分泌胰臟β細胞。 為緩解成本負擔及不一致性，熟習此項技術者常常訴諸於發現可影響信號路徑之小分子作為生長因子受體之促效劑或拮抗劑，藉此以取代生長因子之方式。小分子通常遠比生長因子便宜。然而，小分子之主要不足之處在於非特異性影響，其可作用於非預期標靶，諸如細胞膜結合受體、胞內細胞器、或基因組組分等。 典型分化方案之另一關鍵組分係培養細胞之介質，該介質可由營養素(脂質、胺基酸、碳水化合物、維生素等)、適當濃度之鹽、pH緩衝劑、關鍵元素及諸如胰島素或血清白蛋白之常見蛋白因子組成。不同類型之細胞具有不同的營養素及介質組分需求且由用於信號傳遞之細胞類型特異性生長因子及小分子進一步複雜化。因此，專用「分化培養基」常常藉由每次移除或添加一種組分來費力地測試。 在幹細胞衍生之組織細胞之臨床應用中，所建立之分化介質的大多數組分需要在當前良好作業規範(cGMP)規章下之個體認證；例如，需要藉由專用程序製造生長因子且需要個體認證。同樣地，添加至特定分化介質中之一些小分子經由在純度、穩定性及毒性方面變化之專用化學合成方法製造。在幹細胞培養物之領域中，一些先前出版之方案亦依賴於動物產物，諸如血清或基質膠。
儘管最近在產生iPSC衍生之胰臟β細胞方面取得進展，但始終產生產生胰島素之β細胞的有效方法仍在研發。許多當前方案在沿著分化級聯之各步驟中需要使用生長因子、激素、細胞介素、信號肽及其他細胞間信號分子(在本文中為簡單起見總稱為生長因子)以產生產生胰島素之β細胞。不幸地，當作為純化多肽供應時，生長因子通常為昂貴的、不穩定的且批次間不相容，使得其難以使用。另外，因為生長因子以高度特定卻又組合之方式起作用，所以分化之各階段由不同組生長因子指示，此優化困難且昂貴。本發明之一個目標為在導引胰臟β細胞之產生中根本上移除對生長因子之需要。 本發明提供藉由調節細胞生長動力學及相關參數誘導幹細胞分化之方法，其中細胞密度、試劑濃度及mRNA之組合之特定組合用於控制分化/誘導方向。 為實現目的且根據本發明之目的，如本文所實施及廣泛地描述，本發明之一個態樣係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 在一個實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第一組合包含Sox17 mRNA。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA及Sox17 mRNA。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA、Sox17 mRNA、GATA4 mRNA及GATA6 mRNA。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第二組合包含PDX1、Hlxb9、Ptf1a、ixl1、HNF1a及HNF1b及Sox9 mRNA中之至少一者。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該mRNA之第三組合包含PDX1、NKX6.1、NKX2.2、Pax6、Pax4、Hlxb9及Ngn3 mRNA中之至少一者。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離朝向中內胚層譜系之多能狀態；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合之培養細胞轉染引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合之轉染引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中影響胰臟β細胞命運定型之mRNA包含NKX6.1、MAFA或MAFA mRNA中之至少一者。 在另一實施例中，本發明係關於一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該等起始細胞收集自體液或組織。 本發明之一個態樣係關於藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 本發明之一個態樣係關於一種用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 本發明之一個態樣係關於一種治療疾病、病症或畸形之方法，其包含以下步驟：向需要其之個體投與以下中之至少一者：藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群；及用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 在一個實施例中，本發明係關於一種治療疾病、病症或畸形之方法，其包含以下步驟：向需要其之個體投與以下中之至少一者：藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群；及用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該等細胞衍生自接受者個體。 在一個實施例中，本發明係關於一種治療疾病、病症或畸形之方法，其包含以下步驟：向需要其之個體投與以下中之至少一者：藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群；及用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含藉由誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法獲得之細胞，該方法包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群，其中該等起始細胞收集自接受者。 一種產生誘導之感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞之方法，其包含以下步驟：(a)在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞；(b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；(c)以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞；(d)進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；(e)進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及(f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 因此，本發明亦提供在不使用或減少使用小分子下實現細胞命運確定之新穎方法。本發明之主要益處係經由使用適當供應之引導分化之基因的mRNA簡化建立分化培養基。然而，mRNA及適當培養基之最佳組合仍可有益於過程且為本發明之整體部分。本發明背後之另一激勵為創建主要基於適合於均勻認證及品質控制方法之單一類型之分子的新方法。 在本發明中，本發明描述能夠實現之新穎方法，其涉及應如何控制細胞密度及分裂速率以獲得所需分化結果。本發明進一步教示優化時序、添加順序、RNA劑量及在RNA轉染期間不同RNA之間的比值以及其重複持續時間或數目。本發明進一步係關於培養容器之表面及環境條件，諸如氧濃度之選擇。本發明進一步包括選擇所需細胞或提高其在總群體中之百分比的製程及方法，以及冷凍保存及重新培養分化細胞之方法。 本發明提供藉由調節細胞生長動力學及相關參數用於誘導及/或產生幹細胞及分化之方法，其中細胞密度、試劑濃度及mRNA之組合的特定組合用於控制分化/誘導方向。在一個態樣中，本發明提供一種用於產生活體內起作用之功能性及更加成熟之β細胞的新近研發之方案，及將細胞用於療法以用於涉及各種類型之I型及II型糖尿病的指示之方法。 在某些實施例中，例示性幹細胞誘導方案可由如以下實例中所描述及闡述之療程及步驟表示。在本發明之一些太陽中，藉由以適當劑量及遞送條件使mRNA與關鍵命運變化點處之幹細胞接觸，在不使用大量生長因子下獲得極高效率及較低成本。因為藉助於編碼功能性蛋白，mRNA在引導細胞及發育事件中更具特異性，所以所揭示之方法在產生功能性胰臟β細胞中意外地比任何已知方法都更加穩固，藉此開闢一種治療人類或哺乳動物個體中之糖尿病及其他糖尿病相關病狀的方法。 本發明提供利用在組織特異性分化中之主控基因或關鍵轉錄因子之高效及受控良好表現的分化方法。更具體而言，此等因子呈經由所提供之範例表明之經適當修飾及純化的mRNA分子形式引入多能幹細胞中。 在一個態樣中，本發明提供一種誘導細胞分化之方法，其包含：利用具有轉活化域之習知轉錄因子(TF)之間的關鍵細胞命運因子及融合物，其經優化以用於引導幹細胞朝向不同類型之細胞；藉由產生適當轉基因表現量之方法以較佳密度將作為合成信使RNA (mRNA)之此等因子引入培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化之條件下以產生高效特異性分化，其中誘導幹細胞或祖細胞之多能狀態或先驅狀態朝向特定譜系或組織細胞類型。 在一個態樣中，本發明提供一種產生能夠使用細胞誘導方法誘導朝向特定譜系或組織細胞類型之幹細胞或祖細胞之多能狀態或先驅狀態的方法，該方法包含：利用具有轉活化域之習知轉錄因子(TF)之間的關鍵細胞命運因子及融合物，其經優化以用於引導幹細胞朝向不同類型之細胞；藉由產生適當轉基因表現量之方法以較佳密度將作為合成信使RNA (mRNA)之此等因子引入培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化之條件下以產生高效特異性分化。 在一個態樣中，本發明提供一種用於產生誘導之感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞之方法，該方法包含：a)在如本文所揭示之實驗驗證之條件下培養iPSC作為起始細胞，製備作為起始細胞之細胞用於分化；b)誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系；c)以所揭示之劑量且在特定時間窗內使用內胚層特異性基因之mRNA經由培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層；d)進一步經由轉染使用另一基因之mRNA分子或基因之mRNA分子之組合引導內胚層細胞朝向胰臟祖細胞；e)進一步用又一基因之mRNA或基因之mRNA之組合使胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及f)收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。 在另一態樣中，本發明提供用於改變幹細胞或祖細胞之多能狀態或先驅狀態朝向特定譜系或組織細胞類型之方法，該方法包含以下中之至少一者：產生表現關鍵細胞命運基因之幹細胞(總稱為幹細胞)，其包括具有轉活化域之習知轉錄因子(TF)之間的關鍵細胞命運因子及融合物，其經優化以用於引導幹細胞朝向不同類型之細胞；藉由產生適當轉基因表現量之方法以較佳密度將作為合成信使RNA (mRNA)之此等因子引入培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化之條件下以產生高效特異性分化。 本發明之其他目標及優勢將部分地闡述於下文描述中，且部分地顯見於該描述中，或可藉由本發明之實踐來習得。本發明之目標及優勢將藉助於隨附申請專利範圍中所特定指出之元素及組合來實現及獲得。 應瞭解，前文一般描述與以下實施方式僅為例示性及解釋性的且不限制所主張之本發明。 併入此說明書中且構成此說明書之一部分之隨附圖式說明本發明之若干實施例，且連同描述一起用以闡明本發明之原則。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2016年11月16日申請之美國臨時專利申請案第62/423,120號之權益，該申請案以引用之方式併入本文中。 當描述本發明時，本文中未定義之全部術語具有其在此項技術中認識之常見含義。在以下描述具有本發明之具體實施例或特定用途範圍內，意欲僅為說明性的且不限制所主張之發明。以下描述意欲涵蓋包括於本發明之精神及範疇中之所有替代方案、修改及等效者。 基於在肌肉(MyoD)、眼睛(Pax6)及發生生物學之其他領域中之研究，已總體接受以下概念：「主控」基因，亦即一個關鍵基因(通常為轉錄因子基因，有時少數一起工作之基因)在發育期間可決定細胞及組織之命運及最終整個器官之形成。Shinya Yamanaka之發現：分化細胞可藉由表現在幹細胞中表現之選定組之轉錄因子恢復至多能狀態表明少數關鍵轉錄因子驅動細胞經由冗長多階段命運變化之能量。其他群體對iPSC產生之研究擴增再程式化因子之選擇且展示出於程式化之目的轉錄因子選擇可容許一些變化。在Yamanaka之原始研究中，再程式化因子之表現經由應用整合於基因組中之病毒載體實現，因為需要此等因子之延長表現以影響細胞變形。基因組之伴隨修飾表示iPSC之治療性應用之重要障礙，同時自整合病毒卡匣之再活化表現之可能性甚至對於活體外研究而言亦為關注點。如由當前發明人群組最近揭示之將mRNA轉染應用於再程式化為尤其吸引人的，因為此系統允許再程式化混合物之表現及甚至僅藉由改變添加至細胞培養基中之轉錄物類型在短時間範圍內調節個體組分因子。一旦終止特定因子之轉染，靶細胞內之異位表現即由於細胞質內mRNA之快速衰減而迅速停止。儘管mRNA不繼續留存於靶細胞中，但其如在轉染DNA及整合病毒載體之情況下在無需速率限制核易位下於細胞質中直接翻譯之能力遠遠補償mRNA之短暫半衰期從而引起高效表現但很好地在小時間窗口內，此對於細胞命運確定而言至關重要。 當用於細胞命運變化時，諸如游離型質體之長效DNA載體需要斷乳以降低任何無規基因組整合之風險。諸如仙台病毒(Sendai virus)或委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis，VEE)病毒之RNA病毒或病毒衍生物甚至在經剝除成為經修飾之非感染性RNA複製子之後仍攜帶易於與隱藏在宿主基因組中之病毒元素再結合之病毒元素。在未頻繁發現呈負面資料形式之證明下始終難以完全確定細胞不含病毒載體。本發明揭示多個發明步驟，旨在將基於mRNA之細胞命運確定之優勢應用於引導分化。綜上所述，本發明教示在流線型方法中之單輪或多輪異位轉錄因子表現以引導細胞分化。 但是，基於mRNA之幹細胞分化存在技術壁壘。並非所有幹細胞類型及培養基同等有助於有效的mRNA遞送，且此目前為基於mRNA之分化的障礙。亦通常已知，幹細胞，尤其大多數人類幹細胞株在未形成抗轉染貼片下相對難以培養。本發明之教示內容之部分為多能幹細胞可在大多數細胞可用經修飾之mRNA轉染之條件下生長。在另一實施例中，將以能夠發揮主控基因影響同時在面對由細胞命運改變過程產生之促凋亡及細胞生長抑制力時支撐靶細胞之存活率的含量將RNA及轉染劑(兩者均有相關毒性)之劑量提供於細胞。 因此，鑒於與先前已知之幹細胞分化程序相關之問題，本文所述之新穎方法、材料及方案自iPSC或ESC產生不同細胞類型，具有改良之所得細胞之過程效率及質量。本發明經由增強遞送至標靶幹細胞之TF mRNA實現顯著改良。本發明亦提供支持在不使用飼養細胞或任何其他可能異種污染劑下自人類幹細胞產生無佔據面積組織細胞的新穎方案。新的方案擴展經修飾之mRNA之益處且幫助清除幹細胞衍生技術之治療性應用的剩餘障礙。 鑒於自多能至末端分化狀態之分化常常需要多個步驟，需要若干週至甚至若干月之時間範圍，基於生長因子之步進式策略本質上低效且繁瑣。因此，本發明之實施例為在導引胰臟β細胞之產生中根本上移除對生長因子之需要。 更具體而言，本發明涉及藉由以下改變幹細胞或祖細胞朝向特定譜系或組織細胞類型之多能狀態或先驅狀態之方法：表現關鍵細胞命運基因(總稱為幹細胞)，包括具有轉活化域之習知轉錄因子(TF)之間的關鍵細胞命運因子及融合物，其經優化以用於引導幹細胞朝向不同類型之細胞；藉由產生適當轉基因表現量之方法以較佳密度將作為合成信使RNA (mRNA)之此等因子引入培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化之條件下以產生先前未獲得之有效特異性分化。經由引入mRNA表現之因子亦可包括生長因子、細胞介素、激素、信號肽及影響分泌因子或修飾酶之其他細胞命運。使用類似程序，可在細胞狀態過渡下將微RNA (miRNA)或其他非蛋白質編碼之RNA引入細胞中以便引導分化。與此項技術中已知之其他方法相比，本發明顯著降低涉及幹細胞分化成β細胞之時間、成本及工作。 本發明描述一種改變幹細胞或祖細胞朝向特定譜系或組織細胞類型之多能狀態或先驅狀態之方法，其包含以下中之至少一者：表現關鍵細胞命運基因(共同稱為幹細胞)，包括具有轉活化域之習知轉錄因子(TF)之間的關鍵細胞命運因子及融合物，其經優化以用於引導幹細胞朝向不同類型之細胞；藉由產生適當轉基因表現量之方法以較佳密度將作為合成信使RNA (mRNA)之此等因子引入培養之多能幹細胞中；將細胞維持在經優化之條件下以產生高效特異性分化。 在某些實施例中，提供完全穩定的擴增iPSC。 在某些實施例中，不需要清除游離基因體或RNA病毒(例如仙台)，其可需要10+次iPSC後分離。 在某些實施例中，方法不含進料器。 在某些實施例中，方法不含異種，包含所有合成或人類試劑且不含非人類動物衍生之組分。 在某些實施例中，方法不含佔據面積：不具有DNA無規整合成基因組(如游離型常常發生)。 在某些實施例中，方法藉助於患者特異性起始組織及/或基因組編輯獲得完全自定義之基因背景。 在另一實驗中，如表1中概述之方法之替代方案，呈球形生長於懸浮液中之iPSC細胞在未於板表面上接種之情況下使用電穿孔(例如使用MaxCyte STX電穿孔儀)直接轉染。在一個實施例中，呈球形之2百萬起始iPSC於懸浮液中用不同mRNA，例如Sox17或Pax6轉染或模擬轉染。在圖8中測試之mRNA量為2500 ng。細胞隨後在Sox17轉染之情況下生長於NBM，或在Pax6轉染之情況下生長於具有KSR之MEMalpha。若過渡耗費較長時段，則轉染可重複1次、2次、3次、4次、5次或甚至更多次。結果，在Sox17 mRNA之第1次轉染之後，細胞集群變為顯著較小及較不緊湊之球形，損失確定「邊緣」或外部邊界。相比之下，模擬轉染之球形維持輪廊分明，在2D相片中清晰展示可見的外部「邊緣」。未經轉染或經模擬轉染之iPSC之較小球形具有透明外觀，而較大球形由於細胞層較厚看起來較不透明。相比之下，經Pax6 (神經分化TF) mRNA轉染之iPSC球形朝向外胚層(亦即神經祖細胞)發展，其球形與經模擬轉染之iPSC球形相比變得更暗且具有更不清晰之「邊緣」，但與經Sox17轉染之iPSC球形相比尺寸更大且具有更加確定之邊界。 藉由相同原理及類似方法，諸如內胚層細胞之生殖層特異性中間細胞及諸如肝細胞祖細胞、胰臟祖細胞等之更加下游之中間細胞亦可呈球形用其他TF mRNA轉染。此方式轉染之細胞對來自小分子、生長因子或細胞培養物中之其他元素之毒性更具有抵抗性，且一般而言在分化方面應比使用化學試劑之2D轉染更加有效。未見於科學出版物中之此觀測結果係在電穿孔設備之測試期間無意獲得，且作為本發明之部分充當能夠實現的方法。定義 為促進對本發明之理解，下文定義多個術語。本文所定義之術語具有如本發明相關領域之一般技術者通常理解之含義。諸如「一(a)、(an)」及「該」之術語並不意欲僅指單數實體，反而包括可用於說明之具體實例的一般類別。本文中之術語用於描述本發明之具體實施例，但其使用不對本發明定界，除了如申請專利範圍中所概述。 術語「β細胞樣細胞」欲意謂與胰臟β細胞共用特徵之細胞。β細胞樣細胞藉由形態特徵以及藉由特異性標記物特徵進一步界定。因為誘導之多能幹細胞衍生之β細胞樣細胞具有與胰臟β細胞之類似特徵(包括標記物及激素特徵)，所以誘導之多能幹細胞衍生之β細胞樣細胞可與誘導之多能幹細胞衍生之β細胞互換使用。 「胚狀體」係指衍生自多能細胞之細胞的聚集體，其中細胞聚集可藉由防止細胞黏附至表面以形成典型的集落生長之任何方法起始。如本文所用，「胚狀體」係指多能幹細胞之三維球形聚集體，包括但不限於衍生自來自哺乳動物來源之胚胎之囊胚階段的胚胎幹細胞。胚狀體可由經由此項技術中總體已知之任何技術衍生之胚胎幹細胞形成，包括但不限於為獲得誘導之多能幹細胞之體細胞之體細胞核轉移或再程式化。 如本文所用，術語「誘導之多能幹細胞」係指衍生自體細胞(例如成人體細胞)之多能幹細胞。誘導之多能幹細胞在其形成任何成人細胞類型之分化能力中類似於胚胎幹細胞，但不衍生自胚胎。 如本文所用，「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」包括子代。亦應理解由有意或無意突變所致，所有子代可能不會具有精確相同的DNA內含物。包括具有與最初轉型細胞中所篩檢之相同功能或生物特性的變異體子代。 如本文所用，「組合物」係指活性劑與至少一種其他惰性(例如，可偵測試劑或標記)或活性化合物或分子之組合，諸如佐劑。 如本文所用，「培養」係指將細胞維持在其中該等細胞可增殖且避免作為一組細胞衰老之條件下。「培養」亦可包括其中細胞亦或替代地分化之條件。 如本文所用，「差異表現」係指相比於藉由正常或對照細胞中之相同基因或調節區之RNA的產量含量，RNA之差異產量，該RNA包括自基因組或由基因編碼之蛋白質產物之基因或調節區轉錄的mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA及piRNA。在另一情形中，「差異表現」亦指細胞或組織中之核苷酸序列或蛋白質，該等核苷酸序列或蛋白質相比於正常或對照細胞具有不同的時間及/或空間表現圖譜。 如本文所用，「過度表現(overexpressed)或(overexpression)」係指相比於正常或對照細胞中之RNA或蛋白質產物之表現程度，由基因編碼之RNA或蛋白質產物之提高的表現程度。 如本文所用，「表現不足(underexpressed)或(underexpression)」係指相比於正常或對照細胞中之RNA或蛋白質產物之表現程度，由基因編碼之RNA或蛋白質產物之降低的表現程度。 如本文所用，「分化(differentiate)或(differentiation)」係指前驅體或祖細胞(亦即胰臟祖細胞)分化成特定細胞類型，例如胰臟β細胞之過程。 如本文所用，「有效量」係足以實現細胞、組織、系統、動物或人類之有益或所需生物、情感、醫藥或臨床反應的量。有效量可以一或多次投藥、施用或劑量形式來投與。該術語在其範疇內亦包括有效增強正常生理功能之量。 如本文所用，在細胞之情形下之「擴增(expansion)或(expanded)」係指特徵細胞類型或可能相同或可能不相同之來自原始細胞群之細胞類型的數目之增加。用於擴增之原始細胞不必與由擴增產生之細胞相同。舉例而言，擴增細胞可藉由原始細胞群之離體或活體外生長及分化產生。 如本文所用，「表現」係指聚核苷酸轉錄成RNA轉錄物之過程。在mRNA及其他經翻譯之RNA物種的情形下，「表現」亦指經轉錄之RNA隨後翻譯成肽、多肽或蛋白質之一或多個過程。 如本文所用，「誘導之多能幹細胞」或「iPS細胞」或「iPSC」係指人工衍生(非自然衍生)自非多能細胞之能夠分化成多個細胞類型之細胞。 如本文所用，「不含整合之iPS細胞」係指不含整合於非多能細胞之基因組中之外源性轉基因的iPS細胞。 如本文所用，「分離」意謂與成分、細胞及其他者分離，其中聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段通常天然與之相關。非天然產生之聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要「分離」以使其與其天然產生之對應物區分。 如本文所用，「濃縮」係指包括但不限於聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段之分子可與其天然產生之對應物區分，原因在於每體積之分子濃度或數目大於其天然產生之對應物之濃度或數目。 如本文所用，「稀釋」係指包括但不限於聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段之分子可與其天然產生之對應物區分，原因在於每體積之分子濃度或數目小於其天然產生之對應物之濃度或數目。 如本文所用，「分離」係指與原始源或群體物理分開之狀態，使得可不再考慮分離之化合物、試劑、顆粒或分子為原始源或群體之部分。 如本文所用，出於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農畜、非人類靈長類動物及動物園、運動或寵物動物，諸如但不限於狗、馬、貓及牛。 如本文所用，「幹細胞」係指能夠分化成多個細胞類型之任何自身更新分化全能、多能細胞或多潛能細胞或母細胞或前驅體細胞。 如本文所用，「分化全能」係指細胞，加胚胎外或胎盤細胞可分化且在生物體中產生所有細胞類型。 如本文所用，「多能」係指細胞可分化且產生構成生物體之所有細胞類型，該等細胞類型包括任何胚胎或成人細胞類型，不同之處在於胚胎外或胎盤細胞。 如本文所用，「多潛能」係指細胞可產生超過一種細胞類型，但在其可產生之細胞類型方面比多能細胞更加受限。 如在本文中可互換地使用，「個體(subject)」、「個體(individual)」或「患者」係指脊椎動物生物體。 如本文所用，「實質上純細胞群」係指為構成總細胞群之細胞之約50%、較佳約75-80%、更佳約85-90%、及最佳至少約95%的具有指定細胞標記物特徵及分化潛能之細胞群。因此，「實質上純細胞群」係指含有在指定分析條件下不呈現指定標記物特徵及分化潛能之細胞之少於約50%、較佳少於約20-25%、更佳少於約10-15%、且最佳少於約5%的細胞群。 如本文所用，「前分化」係指前驅體或祖細胞(例如多能幹細胞)分化成可能進一步分化為最終效應細胞(例如β細胞)之中間細胞類型，例如胰臟祖細胞的過程。 如本文所用，「治療性」係指治療、治癒及/或改善疾病、病症、病狀或副作用或係指降低疾病、病症、病狀或副作用之進展速率。該術語在其範疇內亦包括改善正常生理功能、緩解性治療及疾病、病症、病狀或副作用之局部補救。 如本文所用之術語「治療(treating)及(treatment)」總體上係指獲得所需藥理及/或生理效果。該效果就預防或部分預防疾病或其症狀或病況而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病、病狀、症狀或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用之術語「治療」涵蓋對哺乳動物，尤其人類之任何治療，且包括：(a)預防疾病在易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之個體中發生；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展；或(c)減輕疾病，亦即緩和或改善疾病及/或其症狀或病狀。如本文所用之術語「治療」係指治療性治療及預防性或防治性措施兩者。需要治療者包括已患有病症者以及待預防病症者。 如本文所用，「預防性」係指在疾病或病狀發生之前(即使未診斷)或在疾病或病狀仍處於亞臨床階段時妨礙或阻止疾病或病狀。 如本文所用，「活性劑」係指在生物學上具有活性或以其他方式誘導對投與個體之生物或生理影響之物質、化合物或分子。 如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」係指稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑，其中活性劑、本發明之軟骨細胞或含有本發明之軟骨細胞之組合物與其結合投與且其經聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或一般認可用於動物及/或人類的藥典中。 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與此項技術中之一般技術者通常所理解相同之含義。細胞類型 例示性細胞類型可包括例如內胚層細胞、胰臟祖細胞、胰臟內分泌細胞及β細胞。 用於培養容器之合適表面之範例包括但不限於玻璃連結蛋白、E-鈣黏附蛋白、用於iPSC之Corning® Synthemax® II或基質膠，包括但不限於用於內胚層之基質膠，且包括但不限於用於胰臟祖細胞及胰臟內分泌細胞之基質膠或膠原蛋白。 在一個態樣中，用於去分化或再程式化體細胞之例示性方法可包括使用選自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog及Lin28之合成mRNA再程式化因子及轉活化域中之任何一或多者，其中體細胞經再程式化或去分化。用於IPSC調節之方法和組合物描述於USSN 13/893,166及USSN 14/292,317中，其內容以引用之方式併入本文中。 在某些實施例中，本發明提供用於使用懸浮液細胞培養物之方案，且低細胞附著培養板及容器可用於此類懸浮培養物。 在某些實施例中，可針對最佳誘導條件調節諸如氧濃度之環境條件。 在某些實施例中，提供選擇所需細胞或提高其在總細胞培養物群體中之百分比匯合或細胞密度的製程及方法。 在某些實施例中，提供產生低溫保藏之分化β細胞樣細胞之方法。在一些實施例中，例如藉由提供包含HSA及/或DMSA之培養基低溫保藏分化細胞以在儲存期間或之後實現最佳細胞存活率。在一些實施例中，可提供在培養基中包含例如2.5% HSA及10% DMSO之培養基。在一些實施例中，可在儲存期間或之後優化細胞數量以進一步提高存活率。 亦提供再培養分化細胞之方法。細胞可在大多數培養容器中再培養：例如T75燒瓶、T25燒瓶、6孔板、96孔板。細胞可以不同細胞密度再培養以用於不同應用。 在某些實施例中，本發明亦提供用於在處理整個分化過程期間控制對細胞之物理應激的方法，藉此提高存活率。在分化期間某些細胞類型極小，如iPSC。此等小細胞對離心力極其敏感。iPSC對過高離心力極其敏感。在分化期間一些細胞類型極黏，如iPSC及內胚層階段細胞。此等細胞對剪切力極其敏感。當處理此等細胞時，使用10 mL吸管以避免使用任何小尖端且避免上下反覆移液細胞。為維持，可將此等細胞培養為群落且隨後解離為集群代替單細胞。為分化，若需要單細胞，則吾人可在細胞分離之前結束解離，移除解離溶液，且使殘餘解離溶液進一步解離細胞。此方案常用於細胞培養。 鑒於說明書內所引用之參考文獻之教示內容，最徹底理解本說明書。說明書內之實施例提供本發明之實施例之說明且不應視為限制本發明之範疇。熟練技術人員容易認識到本發明涵蓋許多其他實施例。在本發明中所引用之所有公開案及專利均以全文引用之方式併入。以引用的方式併入之材料達到與本說明書矛盾或不一致之程度時，本說明書將替代任何此類材料。然而，本文中任何參考文獻之引用並非承認此類參考文獻為本發明之先前技術。 除非另外指示，否則本說明書，包括申請專利範圍中所使用之表述成分數量、反應條件等之所有數字均應理解為在所有情況下皆由術語「約」修飾。因此，除非有相反指示，否則數值參數為近似值且可視試圖藉由本發明獲得之所需特性而變。至少且不試圖等效物原則之應用限制為申請專利範圍之範疇，各數值參數應根據有效數位之數目及普通捨入方法來解釋。 當與術語「包含」結合用於申請專利範圍及/或說明書中時，詞語「一(a/an)」之使用可意謂「一個(one)」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或超過一個」之含義相符。儘管本發明支持指代僅替代及「及/或」之定義，但除非明確指示為指代僅替代或替代相互排斥，否則術語「或」在申請專利範圍中之使用用於意謂「及/或」。 除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指該系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明之具體實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。 除非另外規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。雖然類似或等效於本文所述之方法及材料的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現對較佳方法及材料加以描述。 考慮本文中所揭示之本發明之說明書及實踐，熟習此項技術者將清楚本發明之其他實施例。僅希望說明書及實例被視為例示性的，其中本發明之真正範疇及精神藉由以下申請專利範圍指示。實例 現參考以下實例描述本發明。僅出於說明之目的提供此等實例，且本發明不限於此等實例，而係涵蓋由於本文提供之教示顯而易見之變化形式。實例 1 ： 自 iPSC 產生內胚層細胞 將iPSC接種於標準尺寸6孔細胞培養板(約9.5 cm2 生長面積/孔)或標準尺寸12孔細胞培養板(約3.8 cm2 生長面積/孔)中以開始分化。其他尺寸之培養容器視情況亦為可適用的且有時歸因於使用試劑及時間之更高效率可比6孔或12孔板更佳。用於產生功能性分化β細胞之高效方案之例示性條件提供於下文β細胞表中，包括起始細胞階段、培養容器、塗料、解離試劑、培養基名稱及主要組分、例示性6孔板之接種密度及氧含量。表 1 ： β 細胞分化 在6孔板中，已成功使用具有1 × 105 至4 × 105 /孔之群體規模之細胞。當存在足夠具有輪廊分明的清晰邊緣之典型iPSC群落時，認為iPSC準備分化，其中細胞為緊湊的且群落未過度生長。當本發明之iPSC株與藉由使用其他方法之其他者產生之iPSC株相比時，證明使用此等準則產生之本發明之iPSC的質量對於分化而言至關重要。 誘導在此階段之iPSC分化成中內胚層譜系細胞。意外地確定懸浮液培養系統極其適用於在此階段之規模擴大，儘管用於分化之最新方案傾向於使用附著單層細胞。更具體而言，生長於懸浮液中用於誘導之iPSC對化學毒性更具有抵抗性且在後續階段更易於再鍍。超低附著板(Sigma-Aldrich)或其他低附著板用於促進iPSC懸浮液細胞生長。 當需要傳代iPS細胞時，重要的為用引起低細胞毒性且產生更小iPSC集群之方案解離iPSC群落，該等iPSC群落可在需要懸浮液培養時迅速形成球形。在37℃下使用TripLETM (ThermoFisher)、Accutase (Life Technology)或藉由用DPBS中之0.1 mM、有時0.5 mM或1 mM EDTA解離之EDTA (Fisher Scientific)解離iPSC，歷時5分鐘。成功使用各種解離時間，包括在一些實施例中，1至2分鐘，及有時對此步驟10至20分鐘。在一些態樣中，解離時間可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分鐘。 對於培養基而言，用10-50 uM胰島素測試MEMa、DMEM/F12及DMEM B27且5% KSR適合於在此分化階段獲得所需要之結果。隨後藉由GSK3抑制劑，諸如CHIR99021、CHIR98014、BIO或GSK抑制劑IX及SB-216763之存在誘導iPSC離開多能階段且朝向中內胚層分化，該等抑制劑去抑制Wnt、BMP4及活化素A路徑基因之功能。在一些實施例中，胰島素以約例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50 uM胰島素，或在以上所述值中的任一者之間的範圍內的濃度存在。GSK3抑制劑在1天、2天、3天時間窗中進行且在選擇時間及例如5 mM、8 mM、10 mM等之抑制劑濃度時，使用FoxA2、CXCR4陽性細胞計數作為質量分析。在一些實施例中，抑制劑以5、6、7、8、9或10 mM或在以上所述值中之任一者之間的範圍內存在。 在一個實驗中，細胞隨後用Stemgent轉染劑(Stemgent)以20奈克/孔之劑量用FoxA2 mRNA及/或Sox17 mRNA轉染。亦進行包括GATA4 mRNA及/或GATA6 mRNA之此轉染，且使用Stemgent轉染劑或其他可在市面上購得之轉染試劑有時以高10倍之mRNA劑量重複3次、4次、5次及6次。在此階段之細胞展示相比於間葉細胞更接近上皮細胞之形態，其衍生自來自不同mRNA轉染次數及起始密度之iPSC (圖1)。 在另一實驗中，如表1中概述之方法之替代方案，呈球形生長於懸浮液中之iPSC細胞在未於板表面上接種之情況下使用電穿孔(例如使用MaxCyte STX電穿孔儀)直接轉染。在一個實施例中，呈球形之2百萬起始iPSC於懸浮液中用不同mRNA，例如Sox17或Pax6轉染或模擬轉染。在圖8中測試之mRNA量為2500 ng。細胞隨後在Sox17轉染之情況下生長於NBM，或在Pax6轉染之情況下生長於具有KSR之MEMalpha。若過渡耗費較長時段，則轉染可重複1次、2次、3次、4次、5次或甚至更多次。結果，在Sox17 mRNA之第1次轉染之後，細胞集群變為顯著較小及較不緊湊之球形，損失確定「邊緣」或外部邊界。相比之下，模擬轉染之球形維持輪廊分明，在2D相片中清晰展示可見的外部「邊緣」。未經轉染或經模擬轉染之iPSC之較小球形具有透明外觀，而較大球形由於細胞層較厚看起來較不透明。相比之下，經Pax6 (神經分化TF) mRNA轉染之iPSC球形朝向外胚層，亦即神經祖細胞發展，其球形與經模擬轉染之iPSC球形相比變得更暗且具有更不清晰之「邊緣」，但與經Sox17轉染之iPSC球形相比尺寸更大且具有更加確定之邊界。 藉由相同原理及類似方法，諸如內胚層細胞之生殖層特異性中間細胞及諸如肝祖細胞、胰臟祖細胞等之更加下游之中間細胞亦可呈球形用其他TF mRNA轉染。此方式轉染之細胞對來自小分子、生長因子或細胞培養物中之其他元素之毒性具有更高抵抗性，且一般而言在分化方面應比使用化學試劑之2D轉染更加有效。未見於科學出版物中之此觀測結果係在電穿孔設備之測試期間無意獲得，且作為本發明之部分充當能夠實現的方法。實例 2 ：自內胚層細胞產生胰臟祖細胞 將內胚層細胞接種於商業細胞培養容器上。6孔培養板用於圖2中所示之實驗，但其他可在市面上購得之標準孔尺寸亦為合適及可適用的。板用基質膠(BD Biosciences)預塗，隨後將1 × 105 - 1 × 106 個細胞接種於補充有8 mM D-葡萄糖之DMEM/F12或MCDB131中。 在一個實驗中，細胞隨後用PDX1 mRNA轉染。另外，細胞在培養基中用Stemgent轉染劑(Stemgent)以約50奈克/孔之劑量用Hlxb9、Ptf1a、ixl1、HNF1a及HNF1b以及Sox9 mRNA之mRNA轉染或共轉染以實現較強效果，且使用Stemgent轉染劑或可在市面上購得之其他轉染試劑以在低到10奈克/孔與高達200奈克/孔範圍內之劑量重複2次、3次或更多次。在一些實施例中，Stemgent之初始或重複劑量可為10奈克/孔、20奈克/孔、30奈克/孔、40奈克/孔、50奈克/孔、60奈克/孔、70奈克/孔、80奈克/孔、90奈克/孔、100奈克/孔、110奈克/孔、1120奈克/孔、130奈克/孔、140奈克/孔、150奈克/孔、160奈克/孔、170奈克/孔、180奈克/孔、190奈克/孔或200奈克/孔或在以上所述值中之任一者之間的範圍。在此階段之細胞比內胚層細胞呈現地更暗且傾向於形成集群(圖2)。實例 3 ： 自胰臟祖細胞產生胰臟內分泌細胞 胰臟祖細胞培養於用補充有8 mM D-葡萄糖之DMEM/F12或MCDB131中之基質膠(BD Biosciences)或膠原蛋白I (Sigma)預塗之6孔或其他板中。其他類似附著細胞培養基亦適合於使用。 胰臟祖細胞在補充有200 ng/mL B18R之培養基中以10-200奈克/孔之劑量用PDX1、NKX6.1及/或NKX2.2、Pax6、Pax4、Hlxb9 Ngn3 mRNA轉染。在一些實施例中，Stemgent之劑量可為10奈克/孔、20奈克/孔、30奈克/孔、40奈克/孔、50奈克/孔、60奈克/孔、70奈克/孔、80奈克/孔、90奈克/孔、100奈克/孔、110奈克/孔、1120奈克/孔、130奈克/孔、140奈克/孔、150奈克/孔、160奈克/孔、170奈克/孔、180奈克/孔、190或200奈克/孔，或在以上所述值中之任一者之間的範圍內。大多數可在市面上購得之轉染試劑亦為可適用的。 胰臟祖細胞視情況在此階段用一系列生長因子處理以進一步分化。細胞培養於含有以下各者之S5介質(Sigma；H3149)中：MCDB131 + 20 mM D-葡萄糖+ 1.754 g/L NaHCO3 + 2% FAF-BSA + ITS-X 1:200 + 2 mM Glutamax+ 0.25mM維生素C + 1% Pen/Strep + 肝素10 ug/ml。細胞每隔一天用具有0.25 uM Sant1 + 100 nM RA + 1 μM XXI (EMD Millipore) + 10 μM Alk5i II (Axxora) + 1 μM T3 (EMD Millipore) + 20 ng/ml β細胞調節素之S5介質(Thermo Fisher Scientific)處理，歷時四天。在第五天，細胞每隔一天用具有25 nM RA + 1 μM XXI + 10 μM Alk5i II + 1 μM T3 + 20 ng/ml β細胞調節素之S5介質處理，歷時四天。 在此階段，細胞進一步聚集且開始自單層漂浮，其為分化成且形成胰臟內分泌細胞之早期徵象(圖3)。實例 4 ：使胰臟內分泌細胞成熟化 將胰臟內分泌細胞培養於商業細胞培養容器上。6孔培養板用於此等實驗，但所有其他類型亦為可適用的。板用CMRL (Mediatech)中之基質膠(BD Biosciences)或膠原蛋白I (Sigma)預塗。在收集集群之後使用超低附著板或燒瓶。 此等細胞隨後在補充有200 ng/mL B18R之培養基中用Stemgent轉染劑(Stemgent)以10-200奈克/孔之劑量用NKX6.1/MAFA或MAFA mRNA轉染。進行3次重複轉染，且必要時可進行視情況選用之其他轉染。可在市面上購得之其他轉染試劑亦為可適用的。 胰臟內分泌細胞亦用一系列生長因子處理以進一步成熟化。使細胞生長於含有補充CMRL 1066 (Mediatech；99-603-CV) + 10% FBS (HyClone，VWR；16777) + 1% Pen/Strep之S6介質。細胞每隔一天用具有10 μM Alk5i II + 1 μM T3之S6處理，歷時14天。 在此階段，諸如β細胞之胰臟內分泌細胞之集群形成自成熟化胰臟內分泌細胞之單層自身上升之細胞的數十至數千規模之集群。在此階段之細胞培養物展示為圖4中之實例。此等細胞用針對細胞階段特異性蛋白質標記物，諸如NKX6.1及胰島素之抗體染色，其結果確認此等細胞中之一些實際上為胰臟β細胞(圖5)。此等細胞亦表明沿著β細胞樣細胞之此人工誘導之分化路徑的特異性細胞命運標記物(圖6)。此外，β細胞集群回應添加至培養基中之葡萄糖且β細胞分泌胰島素作為響應(圖7)。實例 5 ： 活體外響應葡萄糖之 iPSC 衍生之 β 細胞 收集如圖4中所示之由單層胰臟內分泌細胞形成之呈3維結構的細胞集群且轉移至15 ml試管中，每一試管2 ×105 至1 × 106 個細胞，且藉由離心(300 g，持續2分鐘)移除生長介質且每一樣品用1 ml Krebs緩衝液(Melton公開案2014)洗滌兩次。將3 ml低葡萄糖(2 mM)Krebs培養基添加至細胞中且培育2小時。藉由離心移除培養基，且細胞用每一樣品1 ml Krebs緩衝液洗滌2次。隨後將1 ml Krebs低葡萄糖添加至各試管中且於培育箱中在37℃下培育30分鐘，使蓋鬆開從而交換空氣。隨後藉由離心收集上清液以進行分析，隨後用1 ml Krebs緩衝液洗滌細胞一次，隨後在具有高葡萄糖(20 mM)之Krebs緩衝液中培育30分鐘，隨後離心以收集上清液從而進行分析。洗滌細胞兩次，之後再次經歷低葡萄糖-高葡萄糖循環，總計3次。在各步驟收集上清液，合併4-6次獨立重複且藉由使用商業上產生之ELISA套組(ALPCO)及板讀取器(Tecan或SpectroMax)分析胰島素含量。亦用基本上遵循Melton方案(2014)產生之β細胞進行分析以進行比較，且結果展示與Melton方法相比，使用本發明之方法產生之β細胞具有較低基線胰島素表現，且對葡萄糖增加具有較高之胰島素響應速率(圖7)，由此說明本發明之實施例之出乎意料及鄰人驚奇的有利特徵。實例 6 ： 在動物模型中響應葡萄糖之 iPSC 衍生之 β 細胞 為進一步核實根據本發明產生之例示性成熟胰臟β細胞之功能，在糖尿病小鼠模型中測試iPSC衍生之胰臟β細胞之葡萄糖響應性胰島素分泌功能，該等糖尿病小鼠模型諸如：1)NOD小鼠自發性1型糖尿病模型；2)STZ誘導之I型糖尿病模型；3)ob/ob或db/db II型糖尿病模型；或非人類靈長類動物模型，諸如：STZ誘導之短尾猿/綠色猴或狒狒I型糖尿病模型，或自發性或高脂膳食誘導之短尾猿/綠色猴或狒狒II型糖尿病模型。 遞送途徑：將例示性胰臟β細胞球形灌注於肝或腎膠囊或腸網膜中。測試：量測無葡萄糖刺激下之血清胰島素(第2週、第4週、第8週、第12週、第16週、第24週)；獲得對無葡萄糖刺激下之血清胰島素之量測(第2週、第4週、第8週、第12週、第16週、第24週)；獲得空腹動物之血糖之量測(第2週、第4週、第8週、第12週、第16週、第24週)；針對胰島素進行移植位點之ICH，且針對C-肽及升糖素染色進行染色。結果表明恢復或控制糖尿病症狀，諸如高血糖及器官之相關影響。實例 7 ： 在治療糖尿病人類患者中響應葡萄糖之 iPSC 衍生之 β 細胞 參考其他細胞療法根據動物研究給藥使用經調適以符合cGMP程序之所揭示之方案的使用人類iPSC衍生之胰臟β細胞之臨床試驗，儘管目前未進行iPSC衍生之胰臟β細胞療法，但衍生自人類ESC之胰臟祖細胞此刻正用於旨在治療I型糖尿病之臨床試驗中。當個人自身β細胞斷乳或消失時，將較佳類型自體或衍生自iPS細胞之同種異體β細胞遞送通過門靜脈例如以治療誘導I型糖尿病、瘦弱II型糖尿病、晚期糖尿病，或其他類型之β細胞故障相關之疾病類型。將根據如本發明中所描述之本發明之實踐所產生的例示性製造β細胞遞送至人體之其他部分，諸如肌肉、結締組織、胰臟器官或其他器官之某些部位。
專利或申請案檔案含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。 參考附圖自以下實施方式，本發明之前述態樣及優勢可變得顯而易見，其中： 圖1A展示來自不同起始密度之內胚層細胞且說明內胚層誘導之例示性實施例。 圖1B展示藉由使用各種密度(例如，如實例中所述之由低至高的密度)之Sox17 mRNA自iPSC誘導之內胚層細胞且說明內胚層誘導之例示性實施例。 圖2展示自不同內胚層細胞密度起始之彼等胰臟祖細胞且說明胰臟原始誘導之例示性實施例。圖2A展示在誘導期間例示性細胞密度之一個視圖。圖2B展示在誘導期間例示性細胞密度之一個視圖。圖2C展示在誘導期間例示性細胞密度之一個視圖。圖2D展示在誘導期間例示性細胞密度之一個視圖。 圖3展示形成集群之自不同內胚層細胞密度起始之胰臟內分泌細胞且說明胰臟內分泌誘導之例示性實施例。圖3A展示在誘導期間例示性細胞密度/集群之一個視圖。圖3B展示在誘導期間例示性細胞密度/集群之一個視圖。圖3C展示在誘導期間例示性細胞密度/集群之一個視圖。 圖4展示在培養物中成熟且產生漂浮集群之胰臟內分泌細胞且說明胰臟內分泌成熟之例示性實施例。圖4A展示在誘導期間例示性細胞成熟之一個視圖。圖4B展示在誘導期間例示性細胞成熟之一個視圖。圖4C展示在誘導期間例示性細胞成熟之一個視圖。 圖5A藉由相差展示β細胞集群之形態且說明胰臟β細胞胰島樣集群形成之例示性實施例。 圖5B展示分化10天後β細胞之胰島素染色(綠色)(Dapi以藍色展示)且說明胰臟β細胞胰島樣集群形成之例示性實施例。 圖6展示衍生自人類iPSC之內胚層及β細胞展示特異性細胞標記物。圖6A展示具有 綠色：CXCR4及藍色：DAPI核參考之內胚層細胞 。圖6B展示具有綠色：FOXA1；藍色：DAPI；紅色：毒傘素細胞膜之內胚層細胞。圖6C展示β細胞分化第10天，綠色：胰島素；藍色：DAPI核。圖6D展示β細胞分化第8天，綠色：核NKX6.1；紅色：毒傘素細胞膜。 圖7展示化學衍生(Melton方案)對mRNA衍生(對偶基因方案)之β細胞(隔1小時接受一系列葡萄糖激發之細胞)之葡萄糖刺激胰島素產量且說明活體外產生之胰臟β胰島呈現感測葡萄糖之胰島素分泌。 圖8展示使用MaxCyte STX轉染起始群體中之兩百萬iPSC，該MaxCyte STX設定在Optimization 2, OC-100加工總成。使用EVOS成像系統在10×下轉染後24小時採取相片。圖8A展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。圖8B展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。圖8C展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。圖8D展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。圖8E展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。圖8F展示在例示性轉染方案期間iPSC之代表性視圖。 圖9展示在mRNA介導之胰臟β細胞分化結束時自2D培養物在3D中形成之大β細胞胰島。圖9A展示與分化相關之β細胞之代表性視圖。圖9B展示與分化相關之β細胞之代表性視圖。

Claims (15)

  1. 一種誘導幹細胞分化成感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞的方法，其包含以下步驟： (a) 在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞； (b) 誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系； (c) 以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞； (d) 進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞； (e) 進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及 (f) 收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。
  2. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA。
  3. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第一組合包含Sox17 mRNA。
  4. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA及Sox17 mRNA。
  5. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第一組合包含FoxA2 mRNA、Sox17 mRNA、GATA4 mRNA及GATA6 mRNA。
  6. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第二組合包含PDX1 mRNA、Hlxb9 mRNA、Ptf1a mRNA、ixl1 mRNA、HNF1a mRNA及HNF1b mRNA以及Sox9 mRNA中之至少一者。
  7. 如請求項1之方法，其中該mRNA之第三組合包含PDX1 mRNA、NKX6.1 mRNA、NKX2.2 mRNA、Pax6 mRNA、Pax4 mRNA、Hlxb9 mRNA及Ngn3 mRNA中之至少一者。
  8. 如請求項1之方法，其中影響胰臟β細胞命運定型之該mRNA包含NKX6.1 mRNA、MAFA mRNA或MAFA mRNA中之至少一者。
  9. 如請求項1之方法，其中該等起始細胞收集自個體之體液或組織。
  10. 一種細胞，其藉由如請求項1之方法獲得。
  11. 一種用於治療疾病、病症或畸形之組合物，其包含如請求項10之細胞。
  12. 一種如請求項9之細胞及如請求項11之組合物的用途，其用於製造用以治療疾病、病症或畸形之藥劑中。
  13. 如請求項12之用途，其中該細胞衍生自接受者個體。
  14. 如請求項12之用途，其中該等起始細胞收集自該接受者。
  15. 一種產生誘導之感測葡萄糖之胰島素分泌胰臟β細胞之方法，其包含以下步驟： (a) 在分化條件下培養誘導之多能幹細胞作為起始細胞； (b) 誘導該等起始細胞脫離多能狀態朝向中內胚層譜系； (c) 以有效劑量且在特定時間窗內經由用mRNA之第一組合進行培養細胞轉染來引導分化細胞朝向內胚層細胞； (d) 進一步經由用mRNA之第二組合進行轉染來引導該等內胚層細胞朝向胰臟祖細胞； (e) 進一步用mRNA之第三組合使該等胰臟祖細胞成熟化為胰臟內分泌細胞；及 (f) 收集富含響應於環境葡萄糖且能夠分泌胰島素作為響應之胰臟β細胞的集群。
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