CN110055217B - 获得巨核细胞及血小板的方法 - Google Patents

获得巨核细胞及血小板的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110055217B
CN110055217B CN201910084668.1A CN201910084668A CN110055217B CN 110055217 B CN110055217 B CN 110055217B CN 201910084668 A CN201910084668 A CN 201910084668A CN 110055217 B CN110055217 B CN 110055217B
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
megakaryocytes
platelets
formula
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910084668.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110055217A (zh
Inventor
裴雪涛
覃金华
李艳华
张博文
岳�文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Institute Of Biomedicine
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Original Assignee
South China Institute Of Biomedicine
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Institute Of Biomedicine, Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical South China Institute Of Biomedicine
Priority to CN201910084668.1A priority Critical patent/CN110055217B/zh
Publication of CN110055217A publication Critical patent/CN110055217A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110055217B publication Critical patent/CN110055217B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了获得巨核细胞及血小板的培养基、组合试剂、试剂盒及其用途和获得巨核细胞及血小板的方法，所述获得巨核细胞及血小板的培养基包括：基础培养基；以及式(1)所示的化合物。利用本发明的培养基可以诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。

Description

获得巨核细胞及血小板的方法
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及获得巨核细胞及血小板的方法。更具体地，本发明涉及组合试剂、试剂盒、培养基及其用途和获得巨核细胞及血小板的方法。
背景技术
血小板是血液系统中成熟巨核细胞胞质片段化的活性产物，在机体止血、血栓形成、免疫调节等生理和病理过程中发挥重要作用。血小板减少是再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等血液系统疾病以及放化疗过程中常见的并发症，血小板输注是临床治疗血小板减少的唯一手段。目前，常规血小板制剂主要来源于无偿献血者捐献的全血进行分离制备或采用成分分离制备机采集而来，健康供者来源有限、血小板贮存时间短且易被污染是制约血小板供给的重要因素，很多患者需要反复多次输注血小板进一步导致供需矛盾日益尖锐，因此迫切需要寻求血小板新来源。
近几年新兴发展的谱系重编程(Lineage reprogramming)技术能够将一种体细胞直接转变成另一种成体干/祖细胞或体细胞，无需经过多能干细胞阶段，不仅避免了多能干细胞体内成瘤的隐患，而且规避了利用iPSC获取目的细胞存在的诱导过程复杂、周期长、效率低等问题。
然而，目前获得巨核细胞及血小板的方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
在目前大部分的重编程研究中，诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来很多安全性隐患。小分子化合物具有稳定、可控、廉价和安全的特性，在细胞重编程中的应用非常广泛。
有鉴于此，发明人尝试采用小分子化合物诱导红系细胞进行重编程，以便获得巨核细胞及血小板。但是，发明人发现，某些小分子化合物的诱导仍需要依赖于转录因子，或者虽然可以无需依赖转录因子，但是最终生成的血小板数量不多。进而，发明人经过深入研究发现，采用式(1)所示的化合物可以有效地使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，并且巨核细胞及血小板的得率高。进一步地，式(2)和式(3)所示的化合物以及丙戊酸的至少之一与式(1)所示化合物组合使用，能够进一步提高重编程效率，所得到的巨核细胞及血小板的得率更高。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种获得巨核细胞的培养基。根据本发明的实施例，基础培养基；以及式(1)所示的化合物。采用式(1)所示的化合物可以有效地使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，具有广泛地应用前景。
Figure BDA0001961359340000021
根据本发明的实施例，上述获得巨核细胞及血小板的培养基还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括下列的至少之一：式(2)所示的化合物、式(3)所示的化合物以及丙戊酸。
Figure BDA0001961359340000022
根据本发明的实施例，所述丙戊酸的浓度为0.1～0.3mM；所述式(1)所示化合物的浓度为0.3～0.7μM；所述式(2)所示化合物的浓度为0.02～0.07μM；所述式(3)所示化合物的浓度为0.2～0.7μM。
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自StemSpan培养基，所述培养基进一步包括：重组人干细胞因子；白细胞介素-3；白细胞介素-6；以及促血小板生长因子。
根据本发明的实施例，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种组合试剂。根据本发明的实施例，所述组合试剂包括：式(1)所示的化合物；以及下列的至少之一：式(2)所示的化合物、式(3)所示的化合物和丙戊酸。如前所述，采用式(1)所示的化合物可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，并且无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板。进一步地，式(2)和式(3)所示的化合物以及丙戊酸的至少之一与式(1)所示化合物组合使用，能够进一步提高重编程效率，提高巨核细胞和血小板的得率。
在本发明的又一方面，本发明提出了式(1)所示的化合物、前面所述培养基或组合试剂在获得巨核细胞及血小板中的用途。根据本发明的实施例，所述巨核细胞及血小板是通过将红系细胞进行重编程而获得的。如前所述，利用根据本发明实施例的试剂或培养基可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述的组合试剂。如前所述，利用根据本发明实施例的试剂盒可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得巨核细胞及血小板的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将红系细胞置于含有前面所述培养基中，进行培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。利用根据本发明实施例的方法能够获得大量巨核细胞及血小板，无需依赖转录因子，操作简便，成本低，适于规模化应用。
根据本发明的实施例，所述红系细胞是通过下列方式获得的：将单个核细胞用红系细胞诱导培养基进行培养，收集细胞，洗涤，重悬，以便得到第一重悬细胞液；向所述第一重悬细胞液中加入抗体，孵育，洗涤，重悬，以便得到第二重悬细胞液；将所述第二重悬细胞液进行流式分选，收集CD235a+CD41a-细胞，以便得所述红系细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞诱导培养基选自StemSpan培养基，进一步含有：重组人干细胞因子；促血红细胞生长素；胰岛素样生长因子-1；运铁蛋白；以及地塞米松。
根据本发明的实施例，所述重组人干细胞因子的浓度为80～120ng/ml；所述促血红细胞生长素的浓度为3～8U/ml；所述胰岛素样生长因子-1的浓度为30～60ng/ml；所述运铁蛋白的浓度为80～120μg/ml；所述地塞米松的浓度为0.8～1.5μM。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的脐血单个核细胞诱导分化获得的红系细胞流式检测CD235a和CD41a的示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的CD235a+CD41a-的红系细胞经过诱导后获得的细胞流式检测CD41a、CD42b和CD235a的示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的CD235a+CD41a-的红系细胞经过诱导后获得的细胞分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了组合试剂、试剂盒、培养基及其用途和获得巨核细胞及血小板的方法，下面将分别对其进行详细描述。
获得巨核细胞的培养基
根据本发明的实施例，基础培养基；以及式(1)所示的化合物。采用式(1)所示的化合物可以有效地使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，从而获得大量巨核细胞和血小板，具有广泛的应用前景。
Figure BDA0001961359340000051
根据本发明的实施例，培养基进一步包括下列的至少之一：式(2)所示的化合物、式(3)所示的化合物以及丙戊酸。式(2)和式(3)所示的化合物以及丙戊酸的至少之一与式(1)所示化合物组合使用，能够进一步提高重编程效率，所得到的巨核细胞及血小板的得率更高。由此，利用根据本发明实施例的试剂可以诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，从而获得大量巨核细胞和血小板，具有广泛地应用前景。
Figure BDA0001961359340000052
需要说明的是，式(1)所示化合物通常用作选择性的、非ATP竞争性的MEK抑制剂，式(2)所示化合物通常用作非核苷的DNA甲基转移酶抑制剂，式(3)所示化合物通常用作G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂。本发明对于式(1)～(3)所示化合物的获得方式不作严格限定，可以自行合成或者通过市售获得。根据本发明的优选实施例，三种化合物均通过市售获得，型号分别为PD0325901、RG108和Bix01294。
还需要说明的是，本发明所使用的“试剂”应作广义理解，既可以仅含有式(1)所示化合物，也可以同时含有式(2)、式(3)以及丙戊酸的至少之一和式(1)所示化合物。当含有至少两种组分时，对于组分的提供方式不作严格限定，既可以以混合物的形式提供，也可以分别独立地提供，待使用时，再混合一起，形成该试剂。
根据本发明的实施例，丙戊酸的浓度为0.1～0.3mM。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以有效地诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，从而获得大量的巨核细胞和血小板。若浓度过高，容易产生细胞毒性；若浓度过低，重编程效果不佳，巨核细胞得率偏低。
根据本发明的实施例，式(1)所示化合物的浓度为0.3～0.7μM。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以有效地诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，从而获得大量的巨核细胞和血小板。若浓度过高，容易产生细胞毒性；若浓度过低，重编程效果不佳，巨核细胞得率偏低。
根据本发明的实施例，式(2)所示化合物的浓度为0.02～0.07μM。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以有效地诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，从而获得大量的巨核细胞和血小板。若浓度过高，容易产生细胞毒性；若浓度过低，重编程效果不佳，巨核细胞得率偏低。
根据本发明的实施例，式(3)所示化合物的浓度为0.2～0.7μM。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以有效地诱导红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，从而获得大量的巨核细胞和血小板。若浓度过高，容易产生细胞毒性；若浓度过低，重编程效果不佳，巨核细胞得率偏低。
根据本发明的实施例，基础培养基选自StemSpan培养基，所述培养基进一步包括：重组人干细胞因子；白细胞介素-3；白细胞介素-6；以及促血小板生长因子。由此，以便促进红系细胞的生长代谢。
根据本发明的实施例，重组人干细胞因子(SCF)的浓度为30～60ng/mL。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，白细胞介素-3(IL-3)的浓度为10～30ng/mL。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，白细胞介素-6(IL-6)的浓度为30～60ng/mL。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，促血小板生长因子(TPO)的浓度为30～60ng/mL。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
组合试剂
在本发明的又一方面，本发明提出了一种组合试剂。根据本发明的实施例，该组合试剂包括：式(1)所示的化合物；以及下列的至少之一：式(2)所示的化合物、式(3)所示的化合物和丙戊酸。如前所述，采用式(1)所示的化合物可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，从而获得大量巨核细胞和血小板。进一步地，式(2)和式(3)所示的化合物以及丙戊酸的至少之一与式(1)所示化合物组合使用，能够进一步提高重编程效率，所得到的巨核细胞和血小板的得率更高，具有广泛地应用前景。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了式(1)所示的化合物、前面所述试培养基或组合试剂在获得巨核细胞及血小板中的用途。根据本发明的实施例，所述巨核细胞及血小板是通过将红系细胞进行重编程而获得的。如前所述，利用根据本发明实施例的化合物、组合试剂或培养基可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，从而获得大量巨核细胞和血小板，具有广泛地应用前景。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒含有前面所述的组合试剂。如前所述，利用根据本发明实施例的试剂盒可以使红系细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，从而获得大量巨核细胞和血小板，具有广泛地应用前景。
获得巨核细胞及血小板的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得巨核细胞及血小板的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将红系细胞置于含有前面所述培养基中，进行培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。利用根据本发明实施例的方法能够获得大量具有较高活性的巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，操作简便，成本低，适于规模化应用。
根据本发明的实施例，红系细胞是通过下列方式获得的：将单个核细胞用红系细胞诱导培养基进行培养，收集细胞，洗涤，重悬，以便得到第一重悬细胞液；向第一重悬细胞液中加入抗体，孵育，洗涤，重悬，以便得到第二重悬细胞液；将第二重悬细胞液进行流式分选，收集CD235a+CD41a-细胞，以便得所述红系细胞。由此，所得到的红系细胞纯度较好、得率较高、活性较强，适于更好地重编程为巨核细胞。
根据本发明的实施例，红系细胞诱导培养基选自StemSpan培养基，进一步含有：重组人干细胞因子；促血红细胞生长素；胰岛素样生长因子-1；运铁蛋白；以及地塞米松。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，重组人干细胞因子(SCF)的浓度为80～120ng/ml。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，促血红细胞生长素(EPO)的浓度为3～8U/ml。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的浓度为30～60ng/ml。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，运铁蛋白(Transferrin)的浓度为80～120μg/ml。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例，地塞米松的浓度为0.8～1.5μM。由此，以便进一步提高红系细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1单个核细胞诱导获得红系细胞及红系细胞的分选纯化
将单个核细胞用红系诱导培养基(StemSpan中添加100ng/ml SCF、5U/ml EPO、40ng/ml IGF-1、100μg/ml Transferrin、1μM地塞米松)培养7天。收集细胞，2000rpm离心5min，用PBS洗两次，重悬细胞，按照107/ml的浓度用PBS重悬细胞，分别加入CD235a-BV786和CD41a-APC抗体，按照每106细胞加2μl抗体，置于4℃冰箱孵育40mins；用PBS洗两次，按照107/ml的浓度用PBS重悬细胞，进行流式分选，收集CD235a+CD41a-群。
实验结果如图1显示，经过7天的诱导，CD235a+CD41a-比例为56.6％，以这群细胞作为重编程的起始细胞。
实施例2小分子化合物组合诱导红系细胞获得巨核细胞
将CD235a+CD41a-的红系细胞用巨核细胞诱导培养基培养，培养基成分为StemSpan中添加50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6和50ng/ml TPO，向其中加入小分子化合物组合：0.5μM PD0325901(式(1)所示化合物)、0.04μM RG108(式(2)所示化合物)、0.5μMBix01294(式(3)所示化合物)和0.2mM VPA(丙戊酸)。培养7天后，取106细胞用PBS洗两遍后，标记抗体并进行流式检测。具体流程如下：
1、重悬用上述培养基处理的细胞于1.5ml EP管中，每管加入100μl的PBS；
2、每管细胞加入CD41a-APC、CD42b-PE和CD235a-FITC抗体各1μl，放入4℃冰箱孵育40mins；
3、离心2000rpm，5mins；
4、PBS洗两遍，定容200～500μl，进行流式检测。
实验结果如图2显示，CD235a+CD41a-的红系细胞经过上述条件诱导后，出现了表达巨核细胞特异性标志CD41a和CD42b的细胞，而且红系细胞标志CD235a的表达率显著下降。
对比例1
按照实施例2的方法获得巨核细胞，区别在于：
分选获得CD235a+CD41a-的红系细胞，用不同小分子组合的培养基进行处理，培养基基础成分为StemSpan中添加50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6和50ng/ml TPO，向其中分别加入以下小分子化合物，具体分组如下：
Con组：0.2％DMSO。
4M组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、0.5μM PD0325901。
BRV组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA。
BRP组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.5μM PD0325901。
BVP组：0.5μM Bix01294、0.2mM VPA、0.5μM PD0325901。
RVP组：0.04μM RG108、0.2mM VPA、0.5μM PD0325901。
BR组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108。
BV组：0.5μM Bix01294、0.2mM VPA。
BP组：0.5μM Bix01294、0.5μM PD0325901。
RV组：0.04μM RG108、0.2mM VPA。
RP组：0.04μM RG108、0.5μM PD0325901。
VP组：0.2mM VPA、0.5μM PD0325901。
Bix组：0.5μM Bix01294。
RG组：0.04μM RG108。
VPA组：0.2mM VPA。
PD组：0.5μM PD0325901。
培养7天后，取106细胞用PBS洗两遍后，标记抗体并进行流式检测。具体流程如下：
1、重悬用上述培养基处理的细胞于1.5ml EP管中，每管加入100μl的PBS；
2、每管细胞加入CD41a-APC和CD42b-PE各1μl，放入4℃冰箱孵育40mins；
3、离心2000rpm，5mins；
4、PBS洗两遍，定容200～500μl，进行流式检测。
实验结果如图3显示，CD235a+CD41a-的红系细胞经过上述条件诱导后，4M组(即含有四个小分子化合物)的CD41a+细胞比例和CD41a+CD42b+细胞比例均高于其他分组。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种用于将红系细胞重编程为巨核细胞及血小板的培养基，其特征在于，所述培养基由基础培养基；以及
式(1)所示的化合物，
Figure FDA0002888851460000011
式(2)所示的化合物、式(3)所示的化合物以及丙戊酸组成，
Figure FDA0002888851460000012
其中，所述基础培养基选自添加有重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子的StemSpan培养基，
所述丙戊酸的浓度为0.1～0.3mM；
所述式(1)所示化合物的浓度为0.3～0.7μM；
所述式(2)所示化合物的浓度为0.02～0.07μM；
所述式(3)所示化合物的浓度为0.2～0.7μM；
所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；
所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；
所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；
所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
2.权利要求1所述的培养基在获得巨核细胞及血小板中的用途，其特征在于，所述巨核细胞及血小板是通过将红系细胞进行重编程而获得的。
3.一种获得巨核细胞及血小板的方法，其特征在于，包括：
将红系细胞置于含有权利要求1所述培养基中，进行培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红系细胞是通过下列方式获得的：
将单个核细胞用红系细胞诱导培养基进行培养，收集细胞，洗涤，重悬，以便得到第一重悬细胞液；
向所述第一重悬细胞液中加入抗体，孵育，洗涤，重悬，以便得到第二重悬细胞液；
将所述第二重悬细胞液进行流式分选，收集CD235a+CD41a-细胞，以便得所述红系细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红系细胞诱导培养基选自添加有重组人干细胞因子；
促血红细胞生长素；
胰岛素样生长因子-1；
运铁蛋白；以及
地塞米松的StemSpan培养基，
其中，所述重组人干细胞因子的浓度为80～120ng/ml；
所述促血红细胞生长素的浓度为3～8U/ml；
所述胰岛素样生长因子-1的浓度为30～60ng/ml；
所述运铁蛋白的浓度为80～120μg/ml；
所述地塞米松的浓度为0.8～1.5μM。
CN201910084668.1A 2019-01-29 2019-01-29 获得巨核细胞及血小板的方法 Active CN110055217B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910084668.1A CN110055217B (zh) 2019-01-29 2019-01-29 获得巨核细胞及血小板的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910084668.1A CN110055217B (zh) 2019-01-29 2019-01-29 获得巨核细胞及血小板的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110055217A CN110055217A (zh) 2019-07-26
CN110055217B true CN110055217B (zh) 2021-03-30

Family

ID=67316463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910084668.1A Active CN110055217B (zh) 2019-01-29 2019-01-29 获得巨核细胞及血小板的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110055217B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115354026B (zh) * 2022-08-16 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242146B (zh) * 2010-05-10 2015-11-25 高丽大学校产学协力团 组合物和用其产生诱导全能干细胞的方法
CN101864396B (zh) * 2010-05-17 2012-08-22 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN105229144A (zh) * 2013-02-22 2016-01-06 细胞动力学国际有限公司 通过组合的遗传工程和化学工程经由正向编程产生肝细胞
EP3483262B1 (en) * 2016-06-03 2021-11-17 Institue of Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, People's Liberation Army of China Small molecule compound combination for reprogramming digestive tract derived epithelial cells to endodermal stem/progenitor cells, reprogramming method and application

Also Published As

Publication number Publication date
CN110055217A (zh) 2019-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Young et al. Retention of quiescent hematopoietic cells with high proliferative potential during ex vivo stem cell culture
CN109652369B (zh) 利用外周血体外制备成熟红细胞的方法及制剂
CN102206610B (zh) 造血祖细胞的制备方法及其专用培养基
Jackson et al. Enforced expression of HOXB4 in human embryonic stem cells enhances the production of hematopoietic progenitors but has no effect on the maturation of red blood cells
US8993231B2 (en) Methods for stem cell production and therapy
CN110055217B (zh) 获得巨核细胞及血小板的方法
Boehm et al. The potential of human peripheral blood derived CD34+ cells for ex vivo red blood cell production
CN103509101B (zh) 一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基
CN112080469B (zh) T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用
NZ282999A (en) Extracorporeal cell culture and transplantation kit
EP1743024B1 (en) Method of expanding cord blood cells
CN107201338B (zh) 诱导造血干祖细胞增殖和红系分化的方法及其应用
CN110669732A (zh) 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途
CN110055220B (zh) 造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法
US20160158288A1 (en) Methods and compositions for expanding long-term hematopoietic stem cell populations
Cairo et al. The in vitro effects of stem cell factor and PIXY321 on myeloid progenitor formation (CFU-GM) from immunomagnetic separated CD34+ cord blood
US20060084170A1 (en) Cytokine-free growth and maintenance of progenitor cells
CN115029305A (zh) 猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途
CN116836921A (zh) 将t细胞诱导成巨核细胞的重编程方法
CN115927169B (zh) 用于扩增cd34+造血干细胞的培养液和体外扩增cd34+造血干细胞的方法
Miller et al. Ex vivo expansion of human and murine hematopoietic stem cells
CN113046310B (zh) 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
Rice et al. Hematopoietic stem cell expansion
CN104395460B (zh) 使间质干细胞不分化地增殖的方法、及浓缩间质干细胞的方法
McAdams et al. Hematopoietic Cells for Cellular and Gene Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant