CN116836921A - 将t细胞诱导成巨核细胞的重编程方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物领域，具体涉及将T细胞诱导成巨核细胞的重编程方法。本发明提出了用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基、用途和获得巨核细胞及血小板的方法，所述用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基包括：基础培养基；以及小分子化合物AZD4205。利用本发明的培养基可以诱导T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及将T细胞诱导成巨核细胞的重编程方法。更具体地，本发明涉及将T细胞诱导成巨核细胞的培养基及其用途和获得巨核细胞及血小板的方法。
背景技术
血小板是血液系统中成熟巨核细胞胞质片段化的活性产物，在机体止血、血栓形成、免疫调节等生理和病理过程中发挥重要作用。血小板减少是再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等血液系统疾病以及放化疗过程中常见的并发症，血小板输注是临床治疗血小板减少的唯一手段。目前，常规血小板制剂主要来源于无偿献血者捐献的全血进行分离制备或采用成分分离制备机采集而来，健康供者来源有限、血小板贮存时间短且易被污染是制约血小板供给的重要因素，很多患者需要反复多次输注血小板进一步导致供需矛盾日益尖锐，因此迫切需要寻求血小板新来源。
近几年新兴发展的谱系重编程(Lineage reprogramming)技术能够将一种体细胞直接转变成另一种成体干/祖细胞或体细胞，不需经过多能干细胞阶段，不仅避免了多能干细胞体内成瘤的隐患，而且规避了利用iPSC获取目的细胞存在的诱导过程复杂、周期长、效率低等问题。近年来，利用转录因子直接实现细胞命运转化从而获得巨核细胞和血小板的策略也取得了初步进展。2009年，Matsubara课题组同时过表达p45NF-E2、Maf G和Maf K 3个基因，可使小鼠和人的成纤维细胞转变成CD41+巨核样细胞，并在小鼠体内产生具有部分促凝血功能的血小板样颗粒(Ono Y,Wang Y,Suzuki H,et al.Induction of functionalplatelets from mouse and human fibroblasts by p45NF-E2/Maf[J].Blood,2012,120(18):3812-21.)。2015年，Siripin等利用FLI1和ERG两个转录因子将人骨髓中的成红细胞直接转化为成熟的巨核细胞(Siripin D,Kheolamai P,Y UP,etal.Transdifferentiation of erythroblasts to megakaryocytes using FLI1 and ERGtranscription factors[J].Thromb Haemost,2015,114(3):593-602.)。2016年，Pulicio等利用6个转录因子的组合(Gata2、Runx1、Gata1、Taj-1、Lmo2、c-Myc)将人和小鼠的成纤维细胞转变为巨核祖细胞(成熟巨核细胞的前体细胞)，这些巨核祖细胞可以进一步分化为成熟的巨核细胞及有功能的血小板(Pulecio J,Alejo-Valle O,Capellera-Garcia S,etal.Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors[J].Cell Rep,2016,17(3):671-683.)；范科尼贫血病人的成纤维细胞经基因校正后，利用这种方法也可以转变为巨核祖细胞。谱系重编程技术为获得巨核细胞和血小板提供了新的选择，然而，在目前大部分的重编程研究中，诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来很多安全性隐患。
小分子化合物具有稳定、可控、廉价和安全的特性，在细胞重编程中的应用非常广泛。单纯使用小分子化合物能够将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs，在谱系重编程的研究中，仅使用小分子化合物实现了小鼠和人的成纤维细胞向神经细胞的直接转化。这种完全使用化合物的重编程方式为细胞重编程提供了更为安全稳定的策略。
因此，筛选能够诱导体细胞重编程获得巨核细胞的小分子化合物，具有十分重要的临床意义和应用前景。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
在目前大部分的重编程研究中，诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来很多安全性隐患。小分子化合物具有稳定、可控、廉价和安全的特性，在细胞重编程中的应用非常广泛。
有鉴于此，发明人尝试采用小分子化合物诱导CD3+T细胞进行重编程，以便获得巨核细胞及血小板。但是，发明人发现，某些小分子化合物的诱导仍需要依赖于转录因子，或者虽然可以无需依赖转录因子，但是最终生成的CD41a+CD42b+细胞数量低，比例小，血小板数量也不多。进而，发明人经过深入研究发现，在诱导CD3+T细胞进行重编程的第一培养阶段，向培养基中加入AZD4205可以有效地使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，并且巨核细胞及血小板的得率较高。进一步地，Bix01294、RG108、PD0325901、VPA这四种小分子物质可以与AZD4205组合使用能够进一步提高重编程效率，所得到的巨核细胞及血小板的得率更高。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基。根据本发明的实施方案，所述培养基包括：
基础培养基；以及AZD4205。
采用小分子化合物AZD4205可以有效地使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施方案，上述用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基还可以具有下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施方案，所述培养基进一步包括：Bix01294、RG108、PD0325901、VPA。
根据本发明的实施方案，所述AZD4205的浓度为0.5～2μM。
根据本发明的实施方案，所述Bix01294的浓度为0.2～0.7μM。
根据本发明的实施方案，所述RG108的浓度为0.02～0.07μM。
根据本发明的实施方案，所述PD0325901的浓度为0.3～0.7μM。
根据本发明的实施方案，所述VPA的浓度为0.1～0.3mM。
根据本发明的实施方案，所述基础培养基选自StemSpan SFEM II培养基。
根据本发明的实施方案，所述培养基进一步包括：
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
根据本发明的实施方案，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合。根据本发明的实施方案，所述培养基组合包括：
第一方面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基，以及第二阶段诱导培养基，
其中，所述第二阶段诱导培养基包括：
基础培养基；
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
利用根据本发明的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合，其中，在诱导的第一阶段，利用用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基对T细胞进行初步诱导，并利用第二阶段诱导培养基进行第二阶段的诱导，从而使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施方案，上述用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合还可以具有下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施方案，所述基础培养基选自StemSpan SFEM II培养基；
根据本发明的实施方案，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
在本发明的第三方面，本发明提出了第一方面所述的将T细胞诱导成巨核细胞的培养基、第二方面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合在获得巨核细胞及血小板中的用途。根据本发明的实施方案，所述巨核细胞及血小板是通过将T细胞进行重编程而获得的。如前所述，利用根据本发明的将T细胞诱导成巨核细胞的培养基或用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合可以使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施方案，所述T细胞源自脐带血或者外周血。
在本发明的第四方面，本发明提出一种获得巨核细胞及血小板的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：
(1)将T细胞置于第一方面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基中，培养5～10天，获得第一阶段诱导细胞；
(2)将所述第一阶段诱导细胞置于第二方面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合中的第二阶段诱导培养基中，培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。
利用本发明的方法能够获得大量巨核细胞及血小板，无需依赖转录因子，操作简便，成本低，适于规模化应用。本发明提供的方法可以将T细胞利用无外源基因成分的小分子化合物诱导的方式重编程为巨核细胞，适用于临床前研究和临床应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明实施例1的4M重编程方案诱导脐带血T细胞向巨核细胞重编程的流程图和实验结果，其中图(a)显示了利用4M重编程体系诱导脐带血来源T细胞获得巨核细胞的诱导流程模式图；图(b)显示了流式细胞术检测重编程体系培养第0天、第7天、第14天的CD41a+和CD41a+CD42b+细胞比例变化情况；图(c)显示了重编程体系培养第0天、第7天、第14天的CD41a+和CD41a+CD42b+细胞比例及数量的数据统计，结果以表示；n＝3，**表示P<0.01；图(d)显示了qPCR检测重编程过程中不同时间点细胞中巨核细胞特异性基因表达变化情况，结果以/>表示；n＝3，**表示P<0.01；
图2显示了根据本发明实施例2的利用高内涵细胞成像系统对小分子化合物库筛选结果，其中图(a)显示了以脐带血来源T细胞作为起始细胞，筛选小分子化合物库的实验流程模式图；图(b)显示了利用高内涵成像系统分析来源于两个供体的两份样本获得的CD41a+CD42b+细胞阳性率的倍数变化，分别得到两个样本中促进CD41a+CD42b+比例上调的前20个小分子化合物，其中第二阶段未加入小分子化合物库中小分子进行培养的样本作为对照；
图3显示了根据本发明实施例2的利用流式细胞术对21个候选小分子化合物筛选结果，其中图(a)显示了利用流式细胞术筛选21个候选小分子化合物的实验流程模式图；图(b)显示了流式细胞术检测初筛获得21个候选小分子化合物对CD41a+CD42b+细胞比例的影响，其中第二阶段未加入候选小分子化合物进行培养的样本作为对照；
图4显示了根据本发明实施例2的对流式细胞术筛选获得的3个候选小分子化合物作用效果的进一步鉴定结果，其中图(a)显示了验证3个候选小分子化合物作用效果的实验流程图；图(b)显示了各组代表性细胞形态图，标尺为100μm，其中，第二阶段未加入候选小分子化合物进行培养的样本作为对照，白色箭头所指为前血小板；图(c)显示了流式细胞术检测3个候选小分子化合物对CD41a+CD42b+细胞比例及数量的影响。**表示P<0.01。3M:AZD4205、ERK-IN-2、Crenigacestat；
图5显示了根据本发明实施例3的流式细胞术确定小分子化合物AZD4205对重编程的作用效果，其中图(a)显示了确定小分子化合物AZD4205的作用阶段的实验流程模式图；图(b)显示了流式细胞术检测在不同阶段添加AZD4205对CD41a+CD42b+细胞比例的影响；图(c)显示了流式细胞术检测在不同阶段添加AZD4205得到的CD41a+CD42b+细胞比例的数据统计。**表示P<0.01；图(d)显示了流式细胞术检测在不同阶段添加AZD4205得到的CD41a+CD42b+细胞数量的数据统计。**表示P<0.01；
图6显示了根据本发明实施例4的重编程获得T细胞来源巨核细胞免疫荧光染色成像结果，标尺：20μm；
图7显示了根据本发明实施例4的流式细胞术检测巨核细胞倍性的结果；
图8显示了根据本发明实施例4的流式细胞术检测诱导获得诱导性血小板的产生结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
将T细胞诱导成巨核细胞的培养基
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基，包括：
基础培养基；以及AZD4205。
采用小分子化合物AZD4205可以有效地使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需转录因子参与，具有广泛地应用前景。
上述小分子化合物AZD4205的结构式为：
根据本发明一个具体的实施方案，所述培养基进一步包括：
Bix01294、RG108、PD0325901、VPA。
优选地，在基础培养基中额外加入Bix01294、RG108、PD0325901、VPA以及AZD420，能够进一步提升T细胞重编程为巨核细胞的效率，提升诱导获得的CD41a+CD42b+细胞(巨核细胞)的数量和比例，提高血小板数量。
上述小分子化合物PD0325901的结构式为：
上述小分子化合物RG108的结构式为：
上述小分子化合物Bix01294的结构式为：
小分子化合物VPA即为丙戊酸。
需要说明的是，式(1)所示化合物通常用作选择性的、非ATP竞争性的MEK抑制剂，式(2)所示化合物通常用作非核苷的DNA甲基转移酶抑制剂，式(3)所示化合物通常用作G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂。本发明对于式(1)～(3)所示化合物的获得方式不作严格限定，可以自行合成或者通过市售获得。
需要说明的是，培养基中含有的小分子化合物的提供方式不作严格限定，既可以以混合物的形式提供，也可以分别独立地提供，待使用时，再混合一起。
根据本发明一个具体的实施方案，所述AZD4205的浓度为0.5～2μM，所述Bix01294的浓度为0.2～0.7μM，所述RG108的浓度为0.02～0.07μM，所述PD0325901的浓度为0.3～0.7μM，所述VPA的浓度为0.1～0.3mM。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以进一步高效诱导T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，从而获得大量的巨核细胞和血小板。若浓度过高，容易产生细胞毒性；若浓度过低，重编程效果不佳，巨核细胞得率偏低。
根据本发明一个具体的实施方案，所述基础培养基并没有特别的限制，本领域已知的用于诱导获取巨核细胞的基础培养基都涵盖在本发明的基础培养基选择范围内，优选地，基础培养基为StemSpan SFEM II培养基。
根据本发明一个具体的实施方案，所述培养基进一步包括：
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
由此，以便促进T细胞的生长代谢。
根据本发明一个具体的实施方案，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。由此，以便进一步提高T细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合，包括：
前面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基，以及第二阶段诱导培养基，
其中，所述第二阶段诱导培养基包括：
基础培养基；
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
利用根据本发明的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合，其中，在诱导的第一阶段，利用用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基对T细胞进行初步诱导，并利用第二阶段诱导培养基进行第二阶段的诱导，从而使T细胞重编程为巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，可以获得大量巨核细胞及血小板，具有广泛地应用前景。
根据本发明一个具体的实施方案，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。由此，以便进一步提高T细胞的生物活性，从而更好地进行重编程，获得大量巨核细胞和血小板。
第二阶段诱导培养基中含有的基础培养基并没有特别的限制，本领域已知的用于诱导获取巨核细胞的基础培养基都涵盖在本发明的基础培养基选择范围内，优选地，基础培养基为StemSpan SFEM II培养基。
获得巨核细胞及血小板的方法
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种获得巨核细胞及血小板的方法，包括：
(1)将T细胞置于前面所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基中，培养5～10天，获得第一阶段诱导细胞；
(2)将所述第一阶段诱导细胞置于前面所述的第二阶段诱导培养基中，培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。
现有的诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来安全性隐患，限制了将来的临床转化。利用根据本发明实施方案的方法，通过在诱导培养基中加入能够诱导T细胞重编程为巨核细胞的小分子化合物，以非转录因子依赖的方式实现T细胞向巨核细胞的重编程，且能够获得大量具有较高活性的巨核细胞，并进一步生成血小板，无需依赖转录因子，操作简便，成本低，适于规模化应用。
需要说明的是，关于T细胞的来源并没有特别的限制，例如可以是直接购买的CD3+T细胞，或者基于脐血单个核细胞分选获得CD3+T细胞，或者是从外周血分选获得CD3+T细胞，不论什么来源的CD3+T细胞都可以用作上述方法的重编程起始细胞。关于两个培养阶段中，具体的培养天数，优选为7天，即第一阶段诱导7天，第二阶段诱导7天。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种获得巨核细胞及血小板的方法，包括：
(1)从血液标本中抽提单个核细胞，经CD3磁珠抗体标记后，利用磁力分选架，分选获得CD3+T细胞；
(2)用第一阶段诱导培养基(StemSpan SFEM II培养基，加入细胞因子30～60ng/mL SCF、30～60ng/mL TPO、10～30ng/mL IL-3、30～60ng/mL IL-6和小分子化合物0.2～0.7μMBix01294、0.02～0.07μM RG108、0.3～0.7μM PD0325901、0.1～0.3mM VPA、0.5～2μMAZD4205)培养上述分选获得CD3+T细胞，培养5～10天，每隔一天半量换液；
(3)收集细胞并将细胞接种于第二阶段诱导培养基(StemSpan SFEM II培养基，加入30～60ng/mL SCF、30～60ng/mL TPO、10～30ng/mL IL-3、30～60ng/mL IL-6)，继续培养5～10天，每隔一天半量换液；
(4)经过第二阶段诱导后获得的CD41a+CD42b+细胞即为巨核细胞。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1四小分子组合重编程方案诱导T细胞向巨核细胞重编程
从脐血单个核细胞中分选CD3+T细胞作为起始细胞，将基于Bix01294、RG108、PD0325901和VPA四个小分子化合物(文中简称“4M”)的成红细胞向巨核细胞重编程的两阶段诱导体系应用于诱导T细胞向巨核细胞重编程，参见图1(a)。
关于4M重编程方案诱导脐带血T细胞向巨核细胞重编程的实验方案如下：
(1)获取重编程的起始细胞
利用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞，细胞计数后，向细胞悬液中加入CD3磁珠抗体，抗体使用量为20μL/107个细胞，将抗体与细胞充分均匀混合，室温孵育15min。向混合物中加入10mL PBS，2000r/min离心5min，弃上清，加入1mL PBS将细胞沉淀重悬。利用磁力分选法分选获得CD3+T细胞。
(2)诱导CD3+T细胞获得巨核细胞
将CD3+T细胞用巨核细胞诱导培养基培养，培养基成分为StemSpan中添加50ng/mlSCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6和50ng/ml TPO，向其中加入小分子化合物组合：0.5μMPD0325901、0.04μM RG108、0.5μM Bix01294和0.2mM VPA(丙戊酸)，获得含有4M的培养基。培养7天后，取106细胞用PBS洗两遍后，标记抗体并进行流式检测。具体流程如下：
1、重悬用上述培养基处理的细胞于1.5ml EP管中，每管加入100μl的PBS；
2、每管细胞加入CD41a-APC、CD42b-PE和CD235a-FITC抗体各1μl，放入4℃冰箱孵育40mins；
3、离心2000rpm，5mins；
4、PBS洗两遍，定容200～500μl，进行流式检测。
利用流式细胞术对第0、7、14天的细胞进行检测，结果显示第7天CD41a+细胞比例为10.06％±0.43％，CD41a+CD42b+细胞比例为0.84％±0.09％，第14天CD41a+细胞比例为32.47％±3.37％，CD41a+CD42b+细胞比例为13％±0.21％，参见图1(b)和(c)。qPCR检测结果显示脐带血T细胞在诱导第0、7、14天，巨核细胞发育相关转录因子GATA1、GATA2、FOG1、MEIS1、TAL1、HOXC6以及巨核细胞特异性基因ITGA2B、ITGB3的表达水平显著提高，参见图1(d)。上述结果表明4M重编程方案能够诱导T细胞获得诱导性巨核细胞(inducedmegakaryocytes，iMKs)，但重编程效率较低。
实施例2促进T细胞向巨核细胞重编程效率的小分子化合物筛选
为了提高T细胞向巨核细胞诱导的效率，尤其是CD41a+CD42b+巨核细胞比例的提升，进一步利用高内涵成像筛选平台对小分子化合物库进行筛选，以优化重编程体系。将CD3+T细胞在含有4M的第一阶段培养基(培养基组成同实施例1中的含有4M的培养基)中诱导7天，在第二阶段开始加入信号通路调控小分子库(含有320个小分子化合物)中不同的小分子化合物(培养基中不含有4M小分子)，继续培养48h，然后用CD41a和CD42b的荧光抗体进行活细胞染色，利用高内涵成像系统进行分析，计算CD41a+CD42b+细胞比例的上调倍数，统计促进CD41a+CD42b+上调的前20个小分子化合物，培养流程如图2中(a)所示。以两批不同供体来源T细胞为起始细胞的筛选结果显示，排名前20的小分子化合物处理组CD41a+CD42b+细胞百分比均提高3倍以上，其中LY3214996、Y-33075、Crenigacestat在两批筛选试验中均显示出促进作用，如图2中(b)所示。
接下来，利用流式细胞术对上述候选小分子化合物进一步筛选。将脐血来源CD3+T细胞在含有4M的第一阶段培养基中诱导7天，在第二阶段开始加入上述两批实验中筛选出的均发挥促进作用以及分别排名前10的小分子化合物，继续培养48h，培养流程如图3中(a)所示。用流式细胞术检测CD41a+CD42b+细胞比例，按照CD41a+CD42b+细胞比例的上调倍数进行排序，结果显示AZD4205、ERK-IN-2、Crenigacestat提高CD41a+CD42b+细胞比例的效果较为显著，如图3中(b)所示。
进一步对这三个候选小分子化合物进行重复实验验证，将脐血CD3+T细胞在含有4M的第一阶段培养基中诱导7天，在第二阶段开始单独加入AZD4205、ERK-IN-2、Crenigacestat及这三个小分子的组合，为了观察小分子的长期作用，第二阶段培养7天后进行检测，参见图4中(a)图展示了培养流程。
光学显微镜下可见T细胞经过两阶段诱导后，部分细胞体积增大，且在诱导过程中形成了前血小板(白色箭头所指)，图4中(b)图。流式细胞术检测结果显示AZD4205处理后CD41a+CD42b+细胞比例最高，与对照组相比提高约2～3倍，且获得的CD41a+CD42b+细胞数量显著提高，参见图4中(c)图；三个小分子组合后诱导效果没有显著提高，反而由于小分子化合物对细胞毒副作用，使得总细胞数减少，参见图4中(c)图。在后续实验中将AZD4205用于T细胞向巨核细胞重编程的体系中。
实施例3小分子化合物AZD4205作用阶段的确定
为了优化T细胞向巨核细胞重编程的诱导体系，对筛选获得小分子化合物AZD4205的作用阶段及作用时间进行优化，参见图5中(a)图展示了培养流程。第一阶段，在4M的基础之上，加入AZD4205；同时在第二阶段也加入AZD4205，利用流式细胞术和细胞计数对CD41a+CD42b+细胞的比例及数量进行统计，结果参见图5中(b)图，表明第一阶段加入5M(Bix01294、RG108、PD0325901、VPA和AZD4205)、第二阶段加入4C诱导第14天CD41a+CD42b+细胞比例为26.47％±0.69％，与第一阶段加入4M(Bix01294、RG108、PD0325901、VPA)、第二阶段加入4C组相比，前者的CD41a+CD42b+细胞比例提高约1倍。在第二阶段继续添加AZD4205组与不添加组相比CD41a+CD42b+细胞比例及数量均无显著性差异，参见图5中(b)-(d)图。上述结果表明小分子化合物AZD4205的最佳作用阶段在第一阶段，因此，优化的T细胞向巨核细胞重编程方案为：第一阶段利用5M诱导7天，第二阶段去掉小分子化合物，利用4C(SCF、TPO、IL3、IL6)诱导7天。
实施例4T细胞来源的巨核细胞生物学特性的鉴定
对T细胞来源的巨核细胞(实施例3中第一阶段加入5M，第二阶段加入4C诱导第14天获得的CD41a+CD42b+细胞)的生物学特性进行了鉴定，免疫荧光结果显示T细胞经优化的重编程方案诱导后获得的巨核细胞表达CD41、PF4、THBS1、CD42b、vWF、α-Tubulin等巨核细胞特异性标志物，参见图6。
巨核细胞向血小板的分化成熟过程中伴随着细胞的多倍体化，用Hoechst33342(一种细胞核染料)标记细胞后用流式细胞术检测细胞倍性，结果显示T细胞来源的CD41a+CD42b+巨核细胞中4N及>4N的多倍体细胞约为14％，表明诱导获得巨核细胞随着染色质的复制，形成多倍体细胞，具有典型巨核细胞特征，参见图7。
为验证T细胞来源的巨核细胞的体外产板功能，将其利用含有50ng/ml SCF和50ng/ml TPO的StemSpan SFEM II培养基进一步诱导，培养7天后收集培养上清中血小板，通过流式细胞术对其检测，结果显示CD41a+血小板样颗粒占30％以上，表明T细胞来源的巨核细胞具有体外产板能力，参见图8。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基，其特征在于，包括：
基础培养基；以及AZD4205。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，进一步包括：
Bix01294、RG108、PD0325901、VPA。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述AZD4205的浓度为0.5～2μM；
任选地，所述Bix01294的浓度为0.2～0.7μM；
任选地，所述RG108的浓度为0.02～0.07μM；
任选地，所述PD0325901的浓度为0.3～0.7μM；
任选地，所述VPA的浓度为0.1～0.3mM。
4.根据权利要求2或3所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自StemSpanSFEMII培养基；
任选地，所述培养基进一步包括：
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；
任选地，所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；
任选地，所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；
任选地，所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
6.一种用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合，其特征在于，包括：
权利要求1～5中任一项所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基，以及第二阶段诱导培养基，
其中，所述第二阶段诱导培养基包括：
基础培养基；
重组人干细胞因子；
白细胞介素-3；
白细胞介素-6；以及
促血小板生长因子。
7.根据权利要求6所述的培养基组合，其特征在于，所述基础培养基选自StemSpanSFEMII培养基；
任选地，所述重组人干细胞因子的浓度为30～60ng/mL；
任选地，所述白细胞介素-3的浓度为10～30ng/mL；
任选地，所述白细胞介素-6的浓度为30～60ng/mL；
任选地，所述促血小板生长因子的浓度为30～60ng/mL。
8.权利要求1～5中任一项所述的将T细胞诱导成巨核细胞的培养基、权利要求6或7所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合在获得巨核细胞及血小板中的用途，其特征在于，所述巨核细胞及血小板是通过将T细胞进行重编程而获得的。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述T细胞源自脐带血或者外周血。
10.一种获得巨核细胞及血小板的方法，其特征在于，包括：
(1)将T细胞置于权利要求1～5中任一项所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基中，培养5～10天，获得第一阶段诱导细胞；
(2)将所述第一阶段诱导细胞置于权利要求6或7所述的用于将T细胞诱导成巨核细胞的培养基组合中的第二阶段诱导培养基中，培养5～10天，以便获得巨核细胞及血小板。
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