CN103509101B - 一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤:（1）处理代基质细胞；（2）得到永生化细胞;(3)将（2）步筛选出的胎肝细胞连续传代，得到细胞系；（4）得到总RNA；(5)反转录成cDNA；（6）做基因芯片分析;(7)选取能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞中高表达的基因序列；（8）将（7）检索核苷酸序列；（9）得到293T细胞;(10)得到293T细胞相对应的蛋白；(11)将(10)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中，验证能促进脐带血造血干细胞的体外增殖。其优点为，显著提高脐带血造血干细胞的扩增倍数，维持干细胞特性的目的。

Description

一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种扩增脐带血造血干细胞的蛋白及其培养基。
背景技术
造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用，是因为这类细胞具有自我更新、高度繁殖、向多个方向分化等能力，这也意味着造血干细胞在临床治疗恶性血液疾病上具有巨大应用价值。
目前，用以移植的造血干细胞主要有三种来源：骨髓，外周血和脐带血。骨髓和外周血是目前广泛应用的造血干细胞移植来源，但是存在配型困难，采集过程会给供者带来痛苦等问题。脐血移植在一定程度上避免了这些问题。但是对于成人而言，单份脐血的造血干细胞不够患者使用并且脐血造血干细胞相对于成体骨髓和外周血造血干细胞处于更加幼稚阶段，移植后病人造血功能恢复缓慢，增加了移植后病人的痛苦。因此体外扩增脐带血造血干细胞则是最有希望解决上述瓶颈的途径之一。
当前，进行体外扩增脐带血造血干细胞的主要方法是通过加入不同细胞因子组合（如干细胞生长因子-SCF、多效生长因子-PTN、Fms样酪氨酸激酶-3配体-FLT3L和血小板生成素-TPO）刺激脐带血造血干细胞的增殖。但是扩增得到的造血干细胞却在很大程度上失去了干细胞的特性或是自我更新的能力减弱或是向下游血液细胞分化的潜能丢失。
发明内容
为解决现有技术中脐血造血干细胞体外扩增倍数不高、不能维持干细胞特性的缺陷，本发明发现公开了一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基，实现显著提高脐带血造血干细胞的扩增倍数，维持干细胞特性的目的。
实现上述目的采用的技术方案为，本发明开发出了一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤，（1）从胎龄为11天的小鼠胎肝中分离出胎肝基质细胞；胎肝是哺乳动物个体发育过程中活力最强的造血器官，胎肝里面含有支持造血干细胞增殖的基质细胞；胎肝基质细胞在体外培养会贴壁生长；
（2）经步骤（1）分离出来的胎肝基质细胞，用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞后连续传代30次以上得到永生化基质细胞；
(3)将（2）步建立的永生化基质细胞，分别挑取单个的基质细胞100个并分别扩大培养，得到20株永生细胞；筛选出的细胞株在培养液中很好的传代，得到细胞系，进一步将这些细胞系分别与脐带血造血干细胞共培养，发现其中一株细胞对造血干细胞有增殖的作用且可维持干细胞特性；
（4）将（3）步筛选出的细胞做基因芯片分析，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在该细胞内高表达;在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段只位于ANGPTL7基因内；我们可以构建出该基因序列，精确的保证了应用其序列形成的细胞因子对脐带血造血干细胞的增殖作用；
(5)将（4）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;
（6）将（5）构建好的能表达目的蛋白ANGPTL7的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；
(7)将(6)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中培养脐带血造血干细胞最终验证ANGPTL7促进脐带血造血干细胞的体外增殖同时维持造血干细胞特性的功能。
所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。利用此培养基可以很好进行细胞传代、扩增并建立细胞系。
本发明还公开了包括上述细胞因子的培养基，该培养基为StemSpan培养基，培养基包括50-100ng/ml的SCF,20-50ng/ml TPO,50-100ng/ml FLT3L,50-100ng/ml PTN，
上述的培养基还包括200ng/ml-2ug/ml ANGPTL7蛋白。利用该培养基可以有效促进脐带血造血干细胞增殖，同时保持造血干细胞的特性。
综上，本发明的效果，能够显著提高脐带血造血干细胞的扩增倍数，并且能够使造血干细胞维持干细胞的特性，把利用本发明培养基培养出的脐带血造血干细胞移植到免疫缺陷鼠的体内，发现不仅提高了免疫缺陷鼠体内人体造血干细胞来源的细胞比率还缩短了脐带血造血干细胞重构免疫缺陷小鼠造血系统的时间。
附图说明
图1为利用本发明培养基和传统培养基培养造血干细胞的结果曲线图，曲线1为传统培养基的造血干细胞曲线，曲线2为本发明培养基的造血干细胞曲线；
图2为利用本发明培养基和传统培养基培养造血干细胞第12天的流式细胞分析仪的结果对比图谱，左侧为本发明的培养图谱，右侧为传统方法的培养图谱；
图3为利用本发明培养基和传统培养基培养造血干细胞的绝对数变化图，曲线3为本发明培养基的绝对数变化曲线，曲线4为传统培养基的绝对数变化曲线；
图4为利用本发明培养基和传统培养基培养后的脐血造血干细胞进入到小鼠体内，一个月后检测小鼠外周血中人源细胞的比例的对比图；左侧为利用本发明培养基后的脐血进入到小鼠体内，小鼠外周血中人源细胞比例的图谱，右侧为传统方法的图谱；
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容。
实施例一：本发明开发出的一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤，（1）从胎龄为11天的小鼠胎肝中分离出胎肝基质细胞；胎肝是哺乳动物个体发育过程中活力最强的造血器官，胎肝里面含有支持造血干细胞增殖的基质细胞；胎肝基质细胞在体外培养会贴壁生长；
（2）经步骤（1）分离出来的胎肝基质细胞，用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞后连续传代30次以上得到永生化基质细胞；
(3)将（2）步建立的永生化基质细胞，分别挑取单个的基质细胞100个并分别扩大培养，得到20株永生细胞；筛选出的细胞株在培养液中很好的传代，得到细胞系，进一步将这些细胞系分别与脐带血造血干细胞共培养，发现其中一株细胞对造血干细胞有增殖的作用且可维持干细胞特性；
（4）将（3）步筛选出的细胞做基因芯片分析，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在该细胞内高表达;在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段只位于ANGPTL7基因内；我们可以构建出该基因序列，精确的保证了应用其序列形成的细胞因子对脐带血造血干细胞的增殖作用；
(5)将（4）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;
（6）将（5）构建好的能表达目的蛋白ANGPTL7的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；
(7)将(6)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中培养脐带血造血干细胞最终验证ANGPTL7促进脐带血造血干细胞的体外增殖同时维持造血干细胞特性的功能。
所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。利用此培养基可以很好进行细胞传代、扩增并建立细胞系。
本发明还公开了包括上述细胞因子的培养基，该培养基为StemSpan培养基，培养基包括50ng/ml的SCF,20ng/ml TPO,50ng/mlFLT3L,50ng/ml PTN，
上述的培养基还包括200ng/ml ANGPTL7蛋白。
本发明公开的扩增造血干细胞的培养基，包括营养液和血清替代物StemSpan，血清替代物由Stem Cell试剂公司提供,产品编号为09655。所述培养基中的1%双抗，由life试剂公司提供，产品编号为1266328。
上述每毫升营养液中包括的SCF、TPO,FLT3L、PTN均是由PeproTech公司提供，产品编号依次为：300-07，300-18，300-19，405-15的产品。
利用本发明的培养基与传统的培养基相比，造血干细胞的扩增倍数增加到9-15倍，同时维持了造血干细胞的特性，以下试验证明本发明的培养基使造血干细胞的扩增倍数增加：
（1）从脐带血中分离外周血白细胞：将脐带血与生理盐水等比例混合，在离心管中加入待加入稀释血液二分之一体积的Ficoll-Hypaque，将稀释后的血液沿离心管壁缓缓叠加于分层液面上，注意保持液面的清楚，2500r/min离心20min，小心吸取中间云雾层细胞，再用无血清1640培养基或PBS清洗两次，分离出的细胞待用；
（2）细胞培养：将预先配制好的培养基培养脐带血外周白细胞放入CO2培养箱。每天半量换液，补充细胞因子和ANGPTL7并记录最初的细胞个数。取步骤（1）分离出的另一部分造脐带血白细胞，利用现有培养基培养，记录细胞个数；
（3）每三天对培养的细胞进行细胞计数流式检测，观察培养体系中细胞数量和CD34+CD38-的比例变化。发现第九天后利用本发明培养基中明显比传统培养方法快，并且培养到第十二天时CD34+CD38-的比例是传统培养基的2-3倍。到第十八天时传统培养基中CD34+CD38-细胞的绝对数增加了26倍，本发明培养基增加了90倍。结果如图1所示，曲线1为利用传统方法培养的结果，曲线2为本发明方法培养的，最开始分别种2x106个细胞，每三天对细胞进行计数，得到结果。如图2所示，左图中额外加了ANGPTL7，右图只含有SCF,TPO,FLT3L,PTNS的temSpan中培养第12天时的流式图，如图3所示，曲线3代表CD34+CD38-加了ANGPTL7培养基条件下的绝对数变化图，曲线,4代表CD34+CD38-未加本发明细胞因子的绝对数变化。
利用显微镜观察细胞集落形成能力：分别取等数量培养9天时的本发明和传统培养基培养的脐带血外周白细胞，发现本发明培养基中形成的克隆数和CFU-GEMM的克隆数是传统法的1.5倍和2倍。
如上表所示,把相同数目在额外加了ANGPTL7和未加ANGPTL7含有SCF,TPO,FLT3L,PTNS的StemSpan培养基中培养9天后的脐带血外周血细胞分别种在半固体培养基中,12天后计数细胞形成的克隆,其中造血干细胞形成的克隆为CFU-GEMM。
免疫缺陷鼠观察重构小鼠造血能力：分别取等数量的在本发明培养基和传统培养基中培养了7天的脐带血白细胞注射进入非致死量照射的免疫缺陷小鼠NOD/SCID体内，一个月后检测小鼠外周血中人源细胞的比例，在小鼠体内发现利用本培养基培养过的脐带血白细胞比例是传统培养基的40倍，结果如图4所示，把相同数目在，左图额外加了ANGPTL7和右图未加ANGPTL7含有SCF,TPO,FLT3L,PTNS的temSpan培养基中培养7天后的脐带血外周血细胞打到免疫缺陷小鼠NOD/SCID中，一个月后取两组小鼠外周血，检测人体造血细胞来源的细胞。
实施例二：本发明开发出的一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤，（1）从胎龄为11天的小鼠胎肝中分离出胎肝基质细胞；胎肝是哺乳动物个体发育过程中活力最强的造血器官，胎肝里面含有支持造血干细胞增殖的基质细胞；胎肝基质细胞在体外培养会贴壁生长；
（2）经步骤（1）分离出来的胎肝基质细胞，用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞后连续传代30次以上得到永生化基质细胞；
(3)将（2）步建立的永生化基质细胞，分别挑取单个的基质细胞100个并分别扩大培养，得到20株永生细胞；筛选出的细胞株在培养液中很好的传代，得到细胞系，进一步将这些细胞系分别与脐带血造血干细胞共培养，发现其中一株细胞对造血干细胞有增殖的作用且可维持干细胞特性；
（4）将（3）步筛选出的细胞做基因芯片分析，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在该细胞内高表达;在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段只位于ANGPTL7基因内；我们可以构建出该基因序列，精确的保证了应用其序列形成的细胞因子对脐带血造血干细胞的增殖作用；
(5)将（4）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;
（6）将（5）构建好的能表达目的蛋白ANGPTL7的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；
(7)将(6)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中培养脐带血造血干细胞最终验证ANGPTL7促进脐带血造血干细胞的体外增殖同时维持造血干细胞特性的功能。
所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。利用此培养基可以很好进行细胞传代、扩增并建立细胞系。
本发明还公开了包括上述细胞因子的培养基，该培养基为StemSpan培养基，培养基包括100ng/ml的SCF,50ng/ml TPO,100ng/mlFLT3L,100ng/ml PTN，
上述的培养基还包括2ug/ml ANGPTL7蛋白。利用实施例的方法和传统方法做扩增倍数的比较，经过多次试验，得到本发明的培养基是现有培养基扩增的9-15倍。
实施例三：本发明开发出的一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤，（1）从胎龄为11天的小鼠胎肝中分离出胎肝基质细胞；胎肝是哺乳动物个体发育过程中活力最强的造血器官，胎肝里面含有支持造血干细胞增殖的基质细胞；胎肝基质细胞在体外培养会贴壁生长；
（2）经步骤（1）分离出来的胎肝基质细胞，用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞后连续传代30次以上得到永生化基质细胞；
(3)将（2）步建立的永生化基质细胞，分别挑取单个的基质细胞100个并分别扩大培养，得到20株永生细胞；筛选出的细胞株在培养液中很好的传代，得到细胞系，进一步将这些细胞系分别与脐带血造血干细胞共培养，发现其中一株细胞对造血干细胞有增殖的作用且可维持干细胞特性；
（4）将（3）步筛选出的细胞做基因芯片分析，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在该细胞内高表达;在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段只位于ANGPTL7基因内；我们可以构建出该基因序列，精确的保证了应用其序列形成的细胞因子对脐带血造血干细胞的增殖作用；
(5)将（4）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;
（6）将（5）构建好的能表达目的蛋白ANGPTL7的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；
(7)将(6)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中培养脐带血造血干细胞最终验证ANGPTL7促进脐带血造血干细胞的体外增殖同时维持造血干细胞特性的功能。
所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。利用此培养基可以很好进行细胞传代、扩增并建立细胞系。
本发明还公开了包括上述细胞因子的培养基，该培养基为StemSpan培养基，培养基包括75ng/ml的SCF,30ng/ml TPO,65ng/mlFLT3L,70ng/ml PTN。
上述的培养基还包括800ng/ml ANGPTL7蛋白。
上述内容并非对本发明内容作出的限制，一切基于本发明内容作出的实质上的改变均应属于本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种制备扩增脐带血造血干细胞的细胞因子的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)从胎龄为11天的胚胎小鼠中分离出胎肝基质细胞,然后用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞；
(2)经步骤(1)转染后的细胞筛选出对脐带血造血干细胞有扩增作用的永生化细胞；
(3)将(2)步筛选出的胎肝细胞连续传代，得到细胞系，进一步检测该细胞系对脐带血造血干细胞的扩增作用及对维持干细胞特性的作用；
(4)经(3)步验证后，提取(3)步中筛选出来能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖的细胞3T3的总RNA；
(5)将(4)中提取的能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖的细胞3T3的总RNA反转录成cDNA；
(6)将(5)得到的cDNA做基因芯片分析；
(7)将(6)步得到的结果分析比较能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖细胞3T3的表达图谱，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞中高表达；
(8)将(7)的核苷酸序列在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段位于ANGPTL7基因内；
(9)将(8)筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞；
(10)将(9)构建好的能表达目的蛋白的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；
(11)将(10)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中，再利用这个含有目的蛋白的培养基培养脐带血造血干细胞验证ANGPTL7能促进脐带血造血干细胞的体外增殖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中将(2)步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10％血清、1％双抗的α-MEM培养基。
3.一种含有权利要求1制备方法得到的细胞因子的培养基，其特征在于，该培养基为StemSpan培养基，该培养基包括50-100ng/ml的SCF,20-50ng/ml TPO,50-100ng/ml FLT3L,50-100ng/ml PTN；在StemSpan培养基中还包括200ng/ml-2ug/ml的ANGPTL7蛋白。
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