CN113046310B - 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法 - Google Patents

摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法。所述培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素‑3；白介素‑6；泊洛沙姆188；以及芳香烃受体拮抗剂。本发明的培养基可以有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性，具有广泛地应用前景。

Description

摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及 方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法。
背景技术
血小板是血液中的有形成分，具有黏附、聚集和释放的功能，参与止血、维持血管壁完整、凝血和炎症反应，在疾病发展过程中扮演重要角色。多种原因可导致血小板减少，如肿瘤、再生障碍性贫血、血小板减少性紫瘫等，而血小板输注常作为辅助支持治疗的手段。造血干/祖细胞具有自我更新和多向分化潜能，体外模拟或部分模拟体内的造血过程能够使其定向诱导分化为巨核系细胞，可作为治疗血小板性疾病的新途径，以满足临床上对血小板的迫切需求。
由于脐带血中含有大量不成熟、免疫功低、增殖能力强的造血干细胞，采集对供者无害、无伦理、易于获得等可作为造血干细胞重要组织来源。
然而，目前的促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的体系还存在增殖慢、诱导分化效率低等问题。因此，仍需要研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法，利用该培养基可以有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性，具有广泛的应用前景。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188；以及芳香烃受体拮抗剂。
根据本发明实施例的培养基中，芳香烃受体拮抗剂(SR1)和泊洛沙姆188(P188)联用可以促进造血干细胞增值和巨核系细胞的诱导分化，由此，在含有血小板生成素(TPO)、重组人干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)的基础培养基中复配P188和SR1，可以有效促进造血干细胞的扩增并诱导分化为巨核系细胞，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性。
根据本发明的实施例，上述促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～30ng/mL；所述白介素-6的浓度为10～150ng/mL，优选30～70ng/mL；所述泊洛沙姆188的浓度为0.02～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL；所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自stemspan无血清培养基。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将单个核细胞接种于初始培养基中进行培养，以便获得巨核系细胞；所述初始培养基选自前面所述培养基。利用根据本发明实施例的方法培养所述单个核细胞，能够有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，操作简单、成本低、诱导分化效率高。
根据本发明的实施例，所述培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行10～17天，优选12～14天。
根据本发明的实施例，在培养期间的第5～9天时弃去部分培养基，再补加新鲜培养基，优选5～7天；所述新鲜培养基与所述初始培养基的组分(种类)相同，所述新鲜培养基中泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂的浓度与初始培养基中对应的浓度相同，其余各组分为初始培养基中对应的各组分浓度的0.5～4倍。
根据本发明的实施例，所述培养是在G-Rex培养装置中摇床进行。
根据本发明的实施例，所述摇床的转速为70～120rpm。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞选自脐带血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞的接种量为1×105个/cm2～10×105个/cm2。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的体外诱导的巨核系细胞数随诱导时间的变化图；
图2显示了根据本发明一个实施例的体外诱导的巨核系细胞数随诱导时间的变化图，其中A：st36PSR1静置组；B：st36PSR1摇动组；C：st36PSR1+GM-CSF+IL-11静置组；D：st36PSR1+GM-CSF+IL-11摇动组；
图3显示了根据本发明一个实施例的体外诱导12天巨核系细胞表型检测情况示意图，其中A：st36PSR1静置组；B：st36PSR1摇动组；C：st36PSR1+GM-CSF+IL-11静置组；D：st36PSR1+GM-CSF+IL-11摇动组。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基、促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法，下面将分别对其进行详细描述。
促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基
在本发明的一个方面，本发明提出一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188；以及芳香烃受体拮抗剂。
发明人发现，在含有血小板生成素(TPO)、重组人干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)和白介素-6的基础培养基中添加芳香烃受体拮抗剂(SR1)和泊洛沙姆188(P188)可以促进造血干细胞扩增和巨核系细胞诱导分化。上述培养基可以有效促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性。
根据本发明的实施例，所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～30ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述白介素-6的浓度为10～150ng/mL，优选30～70ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆188的浓度为0.02～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自stemspan无血清培养基。由此，以便造血干细胞更好地增殖和分化。
需要说明的是，本发明对stemspan无血清培养基、血小板生成素、重组人干细胞因子、白介素-3、白介素-6、泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂的来源不作严格限定，可以根据实际情况灵活选择。在一些实施例中，stemspan无血清培养基来源于stemcell公司、血小板生成素来源于沈阳三生制药有限公司、重组人干细胞因子来源于RD公司、白介素-3来源于RD公司、白介素-6来源于RD公司、泊洛沙姆188来源于sigma公司、芳香烃受体拮抗剂来源于stemcell公司，由此，可以进一步提高造血干细胞的增殖效率。
需要说明的是，本发明关于血小板生成素、重组人干细胞因子、白介素-3、白介素-6、泊洛沙姆188、以及芳香烃受体拮抗剂的浓度均是基于基础培养基体积而限定的。
促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将单个核细胞接种于初始培养基中进行培养，以便获得巨核系细胞；所述初始培养基选自前面所述培养基。利用根据本发明实施例的方法能够有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，操作简单、成本低、诱导分化效率高。
根据本发明的实施例，所述培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行10～17天。由此，以便造血干细胞更好地增殖和分化。其中，进行12～14天的效果最佳。
根据本发明的实施例，在培养期间的第5～9天时弃去部分培养基，再补加新鲜培养基，优选5～7天。发明人发现，更换培养基的时间会影响分化效果，在培养期间的第5～9天通过换液操作(即除去部分培养基，再补充一些新鲜培养基)，可以除去一些抑制细胞生长的代谢产物，补充新鲜成分，以供细胞更好地生长、分化，从而提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性。具体地，新鲜培养基与初始培养基的组分相同，新鲜培养基中泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂的浓度与初始培养基中对应的浓度相同，其余各组分为初始培养基中对应的各组分浓度的0.5～4倍。
根据本发明的实施例，所述培养是在G-Rex培养装置中摇床进行。G-Rex培养装置具有独特的气体交换膜及膜支撑结构，能够为细胞提供均匀的透气膜平面和良好对流环境，培养基液面高，细胞养分更为充足。针对摇动培养条件下，采用前面所述培养基以及培养条件(包括温度、培养总时间、更换培养基时机等)，可以有效地提高细胞扩增倍数及巨核系细胞表达量，以便获得数量更多、质量更高的巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述摇床的转速为70～120rpm。由此，可以进一步提高细胞扩增倍数及巨核系细胞表达量，以便获得数量更多、质量更高的巨核系细胞。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞选自脐带血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐血单个核细胞。由此，所得到的脐带血单个核细胞得率高、纯度好、活性强。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞的接种量为1×105个/cm2～10×105个/cm2。由此，以便为脐带血单个核细胞提供充足的营养成分及生长环境，促进其增殖及分化。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂，如脐带血，或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、材料
脐带血单个核细胞：将脐带血与6％羟乙基淀粉混合，沉降红细胞20～30min，取上清，离心，收集细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于生理盐水中，加入人淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐带血单个核细胞。
st36pSR1培养基：含50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6、1mg/mL的泊洛沙姆188、1μM的芳香烃受体拮抗剂的stemspan无血清培养基。
st36培养基：含50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6的stemspan无血清培养基。
st36SR1培养基：含50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6、1μM的芳香烃受体拮抗剂的stemspan无血清培养基。
st36p培养基：含50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6、1mg/mL的泊洛沙姆188的stemspan无血清培养基。
2、实验方法
脐带血单个核细胞平均分为4组，分别为st36pSR1组、st36组、st36SR1组、st36p组，其中，st36pSR1组采用st36pSR1培养基进行培养，st36组采用st36培养基进行培养，st36SR1组采用st36SR1培养基进行培养，st36p组采用st36p培养基进行培养。
采用低吸附细胞培养板将上述4组脐带血单个核细胞分别按3×106个/ml接种于2mL培养基中，3～4天补液，在37℃、5体积％CO2培养箱中培养。
3、实验结果
在培养的第10天，进行细胞计数、细胞存活率检测、以及利用流式细胞仪检测巨核系细胞表面标志的表达情况，结果见表1。其中，细胞数和细胞存活率采用Vi-CELL细胞活力分析仪检测。巨核系细胞表面标志的表达检测实验：吸取5×105～5×106个细胞加入Ep管中，PBS洗涤，细胞悬于PB中，加入CD41和CD42抗体，同时设阴性对照管，4℃避光孵育30min，PBS洗涤细胞，流式细胞仪检测。
表1存活率、细胞数、巨核系细胞细胞表面标志检测
检测指标 st36组 st36SR1组 st36p组 st36pSR1组
存活率(％) 94.00±0.57 93.80±0.99 90.20±0.78* 90.90±1.13
细胞数(×106) 10.92±0.52 9.64±0.12 11.20±0.32# 9.98±0.32
CD41/CD61(％) 23.04±0.95 33.46±0.37** 39.37±0.16*## 54.79±1.00**##&
CD41(％) 28.58±1.07 40.83±0.61** 47.84±0.54*## 64.05±0.86**##&&
注：与st36组组比，*相差显著，**相差非常显著；与st36SR1组比，#相差显著，##相差非常显著。与st36p组比，&相差显著。
由表1可知，在st36培养基的基础上，单加入芳香烃受体拮抗剂的st36SR1组，或单加入泊洛沙姆188的st36p组，其CD41/CD61、CD41的表达量均高于st36组，表明芳香烃受体拮抗剂、泊洛沙姆188均有利于巨核系细胞分化，且st36p组分化效率高于st36SR1组(p<0.01)。同时加入芳香烃受体拮抗剂和泊洛沙姆188的st36pSR1组，CD41表达量为(64.05±0.86)％，CD41阳性细胞数(6.39±0.09)×106最高，显著高于其他组。说明芳香烃受体拮抗剂和泊洛沙姆188两者合用效果更佳，能够有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化。
实施例2
1、材料
脐带血单个核细胞、st36pSR1培养基同实施例1，在此不再赘述。
2、实验方法
脐带血单个核细胞平均分为4组，分别为st36pSR1静置组、st36pSR1摇动组、st36pSR1+GM-CSF+IL-11静置组、st36pSR1+GM-CSF+IL-11摇动组。其中：
st36pSR1静置组采用G-Rex培养装置按2×105个/cm2接种于st36pSR1培养基中，在37℃、5体积％CO2培养箱中静置培养，于7d、12d、17d半量换液，补加含血小板生成素、重组人干细胞因子、白介素-3、白介素-6、泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂的stemspan培养基，使换液后的培养基中含有：50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6浓度、0.5mg/mL的泊洛沙姆188和0.5μM的芳香烃受体拮抗剂。
st36pSR1摇动组的培养条件同st36pSR1静置组，区别在于，置于转速为95rpm的摇床上进行摇动培养。
st36pSR1+GM-CSF+IL-11静置组的培养条件同st36pSR1静置组，区别在于，于7d、12d、17d更换培养基时，在基础培养基中进一步还加入粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子和白介素-11，使换液后的培养基中含有：50ng/mL的血小板生成素、50ng/mL的重组人干细胞因子、20ng/mL的白介素-3、50ng/mL的白介素-6浓度、0.5mg/mL的泊洛沙姆188、0.5μM的芳香烃受体拮抗剂、15ng/mL的粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子和25ng/mL的白介素-11。
st36pSR1+GM-CSF+IL-11摇动组的培养条件同st36pSR1+GM-CSF+IL-11静置组，区别在于，置于转速为95rpm的摇床上进行摇动培养。
需要说明的是，上述st36pSR1静置组和st36pSR1摇动组的培养方法均为一步法，st36pSR1+GM-CSF+IL-11静置组和st36pSR1+GM-CSF+IL-11摇动组的培养方法均为两步法。
3、结果
采用G-Rex培养装置，两种诱导体系以及静置和摇动两种培养模式诱导脐带血单个核细胞分化为巨核系细胞，图1是各组在不同诱导时间的巨核系细胞数变化图，图2、3分别是体外诱导12天、17天巨核系细胞表达情况，结果表明，随着诱导时间延长，各组细胞数逐渐增加，体外诱导12d，两摇动组的细胞数均高于静置培养组，有非常显著差别(P<0.01)，巨核系细胞表面标志CD41、CD41/CD42表达均高于静置培养组(P<0.01)，具体地，st36PSR1摇动组的CD41阳性细胞数为(36.38±0.12)×106，对应的st36PSR1静置组为(10.66±0.18)×106；st36PSR1+GM-CSF+IL-11摇动组的CD41阳性细胞数为(35.56±0.11)×106，对应的st36PSR1+GM-CSF+IL-11静置组为(12.95±0.20)×106，均差别非常显著。
巨核系细胞诱导17天，两摇动组相比，st36pSR1组CD41阳性细胞数为(36.64±0.69)×106，高于st36pSR1+GM-CSF+IL-11组(30.59±2.12)×106，有非常显著差别(P<0.01)。参见图3。
由上述结果可以看出，采用两种诱导体系，摇动培养模式体外诱导12天可获得更多的巨核系细胞，且摇动组细胞存活率与静置组相比无差别，表明摇动培养并不影响细胞存活。利用摇动培养模式诱导17天，st36pSR1诱导体系获得的巨核系细胞数量高于st36pSR1+GM-CSF+IL-11体系，而采用静置培养模式诱导17天，两种诱导体系获得的巨核系细胞数量无差别，均高于摇动组。由此，表明静置培养细胞扩增和诱导分化速度比摇动培养慢，两种培养模式获得巨核系细胞数量的高峰时间存在差异，静置培养需要更长的时间，花费更多的人力和物力。
综合考虑，选择st36pSR1诱导体系、摇动培养模式，体外诱导12天-14天，在短期内获得更多的巨核系细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的方法，其特征在于，包括：
将脐带血单个核细胞接种于初始培养基中在35～39℃及3～7体积％CO2下进行培养12～14天，所述脐带血单个核细胞的接种量为1×105个/cm2～10×105个/cm2，以便获得巨核系细胞，
其中，所述初始培养基包括：
基础培养基,所述基础培养基选自stemspan无血清培养基；
血小板生成素，所述血小板生成素的浓度为50ng/mL；
重组人干细胞因子，所述重组人干细胞因子的浓度为50ng/mL；
白介素-3，所述白介素-3的浓度为20ng/mL；
白介素-6，所述白介素-6的浓度为50ng/mL；
泊洛沙姆188，所述泊洛沙姆188的浓度为1mg/mL；以及
芳香烃受体拮抗剂，所述芳香烃受体拮抗剂为SR1，所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为1μM，
所述培养是在G-Rex培养装置中摇床进行，所述摇床的转速为70～120rpm，
于培养第7d、12d、17d时半量换液，弃去一半培养基，再补加新鲜培养基，
所述新鲜培养基与所述初始培养基的组分相同，所述新鲜培养基中泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂的浓度与初始培养基中对应的浓度相同，其余各组分为初始培养基中对应的各组分浓度的0.5～4倍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：
将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；
所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐血单个核细胞。
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