CN104919041A - 从干细胞中生成血红细胞和血小板 - Google Patents

从干细胞中生成血红细胞和血小板 Download PDF

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Abstract

本发明提供了制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法，包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养基中将MEP前体细胞分化为MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR激动剂。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，该干细胞是多潜能干细胞。在一些实施方式中，该MEP共表达CD41和CD235。在一些实施方式中，培养物中生产的MEP数目呈指数增加。还提供了制备血红细胞(RBC)的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。还提供了制备巨核细胞和/或血小板的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。本发明还提供了其中每毫升包含至少100万MEP的组合物以及其中至少50％的细胞是MEP的组合物等。

Description

从干细胞中生成血红细胞和血小板
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年8月15日提交的美国临时申请号61/683,246和2013年3月14日提交的美国申请号13/828,357的优先权，这两份申请的内容都通过引用纳入本文。
政府基金
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号HL107443、ES11624和ES007381资助完成。政府对本发明享有某些权利。
引言
输血是一种必需的细胞治疗，且血液供应的安全性和充足性受到国家和国际关注。仅在2009年，国家血液数据资源中心(National Blood Data Resource Center)报道血库机构收集了超过1700万单位的全血和红细胞，其中美国的医院每年为超过1500万的患者进行输血。由于血型抗原的丰富多态性，即使在发达国家中也长期缺乏供于一些患者组的血液。在美国，超过40％的镰状细胞贫血患者(其大部分是非洲血统)在输入来自供者(其大部分是高加索血统)的血液时经历免疫反应。偶发性血液供应短缺也会以与天灾或人祸相关联的方式出现。越来越受到关注的还有：血液供应可能因供者资格的新限制而削减，这是因为新的血液传播疾病被发现和/或出现并传播至新的地理位置。最后，数量日益增多的60岁以上个体的用血量预计将增加，这将导致2050年出现血液供应不足。
针对这些和其他原因，本领域中需要用于制备血红细胞和血小板的新方法。还需要用于制备髓系-红系祖细胞(MEP)的新方法，其例如能够产生血红细胞和/或血小板。
发明内容
发明人获得了新的观察结果，其涉及芳基烃受体(AhR)信号转导在血红细胞(RBC)和血小板以及作为RBC和血小板前体的细胞类型的分化过程中的作用。发明人已应用其发现以使本发明涉及如下领域：制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法、制备RBC的方法、制备巨核细胞(Mk)的方法和制备血小板的方法。发明人还已应用其发现以使本发明涉及以下领域：RBC、Mk、血小板、MEP、MEP前体细胞和包含这些细胞类型中至少一种的组合物。本发明还提供了向对象提供RBC、Mk和血小板中至少一种的方法以及根据对RBC、Mk和血小板中至少一种的作用筛选化合物的方法。还提供了通过给予AhR调节剂来增加RBC计数和增加血小板计数的方法。下文更完整地描述了本发明的这些和其他方面。
本发明提供了制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的新方法。在一些实施方式中，这些方法包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将MEP前体细胞分化为MEP。在一些实施方式中，该MEP前体细胞是多潜能干细胞(pluripotent stem cell)。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在这些方法的一些实施方式中，培养物不包含血清。在这些方法的一些实施方式中，培养物不包含饲养细胞。
在一些实施方式中，这些方法包括在选自BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、hSCF、FLT3、TPO和EPO中至少一种的蛋白质存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法包括在BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、hSCF、FLT3、TPO和EPO存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
在一些实施方式中，这些方法包括a)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养多潜能干细胞；b)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和KOSR的RPMI培养基中培养获自步骤a)的细胞；c)在补充有BMP-4、VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养获自步骤b)的细胞；d)在补充有VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养获自步骤c)的细胞；e)在补充有B27、N2-补充物、BSA、VEGF、bFGF、hSCF和Flt3配体的IMDM和Hams F12的混合物中培养获自步骤d)的细胞；以及f)在补充有B27、N2-补充物、BSA、VEGF、bFGF、hSCF、Flt3配体、hTPO、IL-6和EPO的IMDM与Hams F12的混合物中培养获自步骤e)的细胞。在一些实施方式中，培养步骤a)至e)中至少一步的培养基中还包含AhR拮抗剂。在一些实施方式中，培养步骤f)的培养基中还包含AhR激动剂。
在这些方法的一些实施方式中，多潜能干细胞选自胚胎干细胞(ES)、诱导性多潜能干细胞(iPSC)和细胞核移植生成的细胞。在一些实施方式中，iPCS细胞表达OCT4、KLF4、SOX2和cMYC。在一些实施方式中，MEP共表达CD41和CD235。在一些实施方式中，MEP不表达CD34。在一些实施方式中，培养物在10天内开始形成MEP细胞。在一些实施方式中，培养物在7天内开始形成MEP细胞。在一些实施方式中，培养物持续生成新的MEP细胞至少30天。在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目呈指数或基本呈指数增加，其中“基本呈指数”指在相对时期内有至少97％的理论“指数生长”。在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目在1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时、24小时、48小时、72小时或96小时的培养期间内呈指数增加。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少100万MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1000万MEP。在一些实施方式中，培养物中至少10％的细胞是MEP。在一些实施方式中，培养物中至少50％的细胞是MEP。在一些实施方式中，培养物生成至少1000万MEP。在一些实施方式中，培养物生成至少1亿MEP。
还提供了通过本发明的方法制备的MEP。
还提供了包含通过本发明的方法制备的MEP的细胞培养物。
还提供了制备血红细胞(RBC)的方法。在一些实施方式中，制备RBC的方法包括通过本发明的方法制备MEP并在足以制造RBC的条件下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基(specification media)中培养。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件还包括在红系细胞特化培养基中培养和在AhR激动剂存在的情况下培养。
在一些实施方式中，制备RBC的方法包括提供通过本发明方法制备的MEP并在足以制造RBC的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件还包括在红系细胞特化培养基中培养和在AhR激动剂存在的情况下培养。
在一些实施方式中，制备RBC的方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。该MEP可以来自任何来源。在一些实施方式中，这些方法还包括在红系细胞特化培养基中培养该MEP。
在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少100万个RBC。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1000万个RBC。在一些实施方式中，培养物中至少10％的细胞是RBC。在一些实施方式中，培养物中至少50％的细胞是RBC。在一些实施方式中，培养物生成至少1000万个RBC。在一些实施方式中，培养物生成至少1亿个RBC。
还提供了通过本发明的方法制备的RBC。
还提供了输注组合物，其包含通过本发明方法制备的RBC。
还提供了一种培养物，其包含通过本发明方法制备的RBC。
本发明还提供了制备巨核细胞(Mk)的方法。在一些实施方式中，这些方法包括：通过本发明的方法制备MEP并在足以制造Mk的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，这些方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP，并在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养该MEP。在一些这类实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些这类实施方式中，这些方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
在一些实施方式中，制备Mk的方法包括提供通过本发明方法制备的MEP并在足以制造Mk的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，这些方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP，并在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养该MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养MEP，并且还包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP并随后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
在一些实施方式中，制备Mk的方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。该MEP可以来自任何来源。在一些实施方式中，这些方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。
还提供了通过本发明的方法制备的Mk。
还提供了一种培养物，其包含通过本发明方法制备的Mk。
本发明还提供了制备血小板的方法。在一些实施方式中，制备血小板的方法包括通过本发明的方法制备MEP，在足以制造Mk的条件下培养该MEP，并在足以从Mk分化血小板的条件下培养该Mk。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP，并在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养该MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，在足以从Mk分化血小板的条件下培养Mk包括在AhR调节剂存在的情况下培养该Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在这些方法的一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养。
在一些实施方式中，制备血小板的方法包括提供通过本发明方法制备的MEP，在足以制造Mk的条件下培养该MEP，并在足以从Mk分化血小板的条件下培养该Mk。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP，并在巨核细胞特化培养基存在的情况下培养该MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，在足以从Mk分化血小板的条件下培养Mk包括在AhR调节剂存在的情况下培养该Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在这些方法的一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下培养Mk。
在一些实施方式中，制备血小板的方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。该MEP可以来自任何来源。在一些实施方式中，这些方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。在一些实施方式中，这些方法还包括在足以进行血小板分化的条件下培养所得的Mk。在一些实施方式中，在足以从Mk分化血小板的条件下培养Mk包括在AhR调节剂存在的情况下培养该Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在这些方法的一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下培养Mk。
还提供了从Mk分化血小板的方法。在一些实施方式中，这些方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方法中，该AhR调节剂增加了培养物中前血小板(proplatelet)形成的速率。
还提供了通过本发明的方法制备的血小板。
还提供了输注组合物，其包含通过本发明方法制备的血小板。
本发明还提供了每毫升包含至少100万MEP的组合物。在一些实施方式中，该组合物每毫升包含至少1000万MEP。在一些实施方式中，该组合物还包含巨核细胞-红系祖细胞。在一些实施方式中，该组合物还包含RBC。在一些实施方式中，该组合物还包含巨核细胞。在一些实施方式中，该组合物还包含血小板。
本发明还提供了包含细胞的组合物，其中至少10％的细胞是MEP。在一些实施方式中，至少50％的细胞是MEP。在一些实施方式中，该组合物每毫升包含至少100万MEP。在一些实施方式中，该组合物每毫升包含至少1000万MEP。在一些实施方式中，该组合物还包含巨核细胞-红系祖细胞。在一些实施方式中，该组合物还包含RBC。在一些实施方式中，该组合物还包含巨核细胞。在一些实施方式中，该组合物还包含血小板。在一些实施方式中，该组合物是细胞培养物。
本发明还提供了向有此需要的患者提供RBC的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的RBC的组合物输送至患者的循环系统内。
本发明还提供了治疗有此需要的患者中贫血的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的RBC的组合物输送至患者的循环系统内。在一些实施方式中，该贫血由至少一种以下情况所致：RBC生成受损、RBC破坏增加、失血和体液潴留(fluid overload)。在一些实施方式中，该贫血是由地中海贫血导致的。在一些实施方式中，该贫血是镰状细胞贫血。在一些实施方式中，该RBC与患者血型匹配。在一些实施方式中，该RBC由分离自患者的多潜能干细胞分化。
本发明还提供了向有此需要的患者提供血小板的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的血小板的组合物输送至患者的循环系统内。
本发明还提供了治疗有此需要的患者中血小板减少症的方法。在一些实施方式中，这些方法包括将包含通过本发明的方法制备的血小板的组合物输送至患者的循环系统内。在一些实施方式中，该血小板减少症是由至少一种以下情况所导致的：血小板生成减少、血小板破坏增加和药物。在一些实施方式中，该血小板与患者血型匹配。在一些实施方式中，该血小板由分离自患者的多潜能干细胞分化。
本发明还提供了根据对RBC的作用筛选化合物的方法。在一些实施方式中，这些方法包括a)通过本发明的方法制备RBC；b)使该RBC接触化合物，以及c)观察RBC中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得RBC前体细胞并从获自对象的RBC前体细胞制备该RBC。在一些实施方式中，该RBC前体细胞是体细胞。
本发明还提供了根据对RBC的作用筛选化合物的替代方法。这些方法包括a)提供通过本发明方法制备的RBC；b)使该RBC接触化合物，以及c)观察RBC中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得RBC前体细胞并从获自对象的RBC前体细胞制备该RBC。在一些实施方式中，该RBC前体细胞是体细胞。
本发明还提供了根据对Mk的作用筛选化合物的方法。在一些实施方式中，这些方法包括a)通过本发明的方法制备Mk；b)使该Mk接触化合物，以及c)观察Mk中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得Mk前体细胞并从获自对象的Mk前体细胞制备该Mk。在一些实施方式中，该Mk前体细胞是体细胞。
本发明还提供了根据对Mk的作用筛选化合物的替代方法。在一些实施方式中，这些方法包括a)提供通过本发明方法制备的Mk；b)使该Mk接触化合物，以及c)观察Mk中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得Mk前体细胞并从获自对象的Mk前体细胞制备该Mk。在一些实施方式中，该Mk前体细胞是体细胞。
本发明还提供了根据对血小板的作用筛选化合物的方法。在一些实施方式中，这些方法包括a)通过本发明的方法制备血小板；b)使该血小板接触化合物，以及c)观察血小板中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得血小板前体细胞并从获自对象的血小板前体细胞制备该血小板。在一些实施方式中，该血小板前体细胞是体细胞。
本发明还提供了根据对血小板的作用筛选化合物的替代方法。在一些实施方式中，这些方法包括提供通过本发明方法制备的血小板；b)使该血小板接触化合物，以及c)观察血小板中的变化。在一些实施方式中，该方法还包括从对象中获得血小板前体细胞并从获自对象的血小板前体细胞制备该血小板。在一些实施方式中，该血小板前体细胞是体细胞。
本发明还提供了增加哺乳动物中血小板计数的方法。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR激动剂。
本发明还提供了治疗哺乳动物中血小板减少症的方法。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR激动剂。
本发明还提供了制备血小板的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，该AhR拮抗剂具有增加培养物中前血小板生成率的作用。
附图简述
图1A至1B显示了对于人造血细胞分化基因组图谱绘制(dMap)数据的分析。对通过布罗德研究所(Broad Institute)的差异图谱门户(dMAP)获得的综合性微阵列数据进行了计算机分析。基于分级群聚对基因进行分选，其中以1-皮尔森相关作为距离度量，并以平均连锁作为聚类规则(1A)。通过盒须图对经标准化的各细胞群体(子群体)中AhR表达水平进行计算并显示。对于各群体，该图报道了AhR值分布的中值(粗中线)、中半部分(盒)和四分位差(IQR，“须”之间的距离)。通过标准方差分析(anova)测试各细胞群体间AhR表达水平的差异。
图2A至2B显示，在无饲养细胞、化学限定的条件下从诱导性多潜能干细胞(iPSC)形成巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的的过程生成了表达巨核细胞和红细胞系的特定标志物的细胞群体。(A)从iPSC至MEP阶段的分化策略。描绘起始粘附层和之后非粘附MEP的多态性变化和生成的培养物的相衬图像。(B)共表达CD235-PE(红细胞)和CD41-FITC(巨核细胞)的第13天的MEP的代表性FACS分析。(C)与红系细胞或巨核细胞特异性特化培养基接触5天的第13天的MEP的FACS分析。(D)未分化iPSC对比第13天MEP的qPCR分析。针对β-肌动蛋白对相对基因表达进行标准化。数据是三个重复孔的平均值+SD。*p<0.05。
图3A至3D显示了芳基烃受体(AhR)激动剂FICZ抑制凋亡并允许iPSC来源的MEP进行指数扩增：(A)来自第15天MEP+FICZ的活细胞对比死细胞(PI对比Hoechst)的代表性FACS点图。首先在FSC对比SSC中对点图进行门选，随后从该群体中门选PI+和PI-Hoechst+。FICZ增加了活细胞群体，如FSC和SSC(32.6％)以及PI-Hoechst+(97.7％)所示。(B)MEP群体+FICZ的代表性相衬图像。(C)MEPs+/-0.2μm FICZ的15天生长曲线。使用台盼蓝排除法对细胞进行手动计数。图形数据和相关统计学是每组三个独立实验的结果。(D)通过EDU掺入进行定量可知，与未处理的细胞相比，已使用AhR激动剂FICZ处理的第30天MEP具有更高的增殖性。
图4A和4B显示了AhR激动剂在人iPSC和MEP中诱导CYP1B1靶基因表达。(A)iPSC和MEP中AhR和β-肌动蛋白表达的Western印迹分析。(B)采用和不采用FICZ的iPSC和第15天MEP的qPCR数据。针对β-肌动蛋白水平对表达进行标准化。数据是三个重复孔的平均值+SD。*p<0.05，**p<0.005。
图5A至5F显示AhR介导了双潜能造血祖细胞的扩增和特化。(A)pHAGE2慢病毒受体构建体的示意图，其含有来自鼠CY1A1基因的小鼠乳腺肿瘤病毒旁侧二氧杂芑应答元件区(MMTV-DRE-MMTV)，其驱动NLS-dsRed或荧光素酶IRESzsGreen的表达(pHAGE2-MMTV-DRE-MMTV-NLS-dsRed-IRES-zsGreen和pHAGE2-MMTV-DRE-MMTV-荧光素酶-IRES-zsGreen)。(B)使用pHAGE2-MMTV-DRE-MMTV-NLS-dsRed-IRES-zsGreen感染的MEP中NLS-dsRED的FACS分析。感染的细胞是未处理的或使用5μM CH223191或0.4μMFICZ处理。(C)使用具有或不具有FICZ或CH223191的荧光素酶载体感染的细胞的相对荧光单位。(D)模拟感染或感染的细胞中zs-Green表达的相衬和荧光图像。(E)来自D13MEP+FICZ和/或CH223191的活细胞对比死细胞(PI对比Hoechst)的代表性流式细胞术点图。对于这些实验，在D6时使用已知的AhR抑制剂CH223191对MEP进行预处理，之后在D7时添加FICZ。(F)来自“E”的MEP的qPCR结果，针对β-肌动蛋白进行标准化。数据是三个重复孔的平均值+SD。*p<0.005。
图6A至6J显示连续的AhR激活使红细胞成熟，而抑制/拮抗促进巨核细胞发育/特化。(A)随时间变化的共表达CD235-PE和CD71-FITC的细胞的代表性FACS分析点图。(B)共表达CD235-PE和CD41-FITC的细胞的代表性FACS分析点图。(C)不成熟和成熟MEP的瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色。(D)表达血红蛋白的MEP+EPO细胞团块。(E)共表达CD235-PE和CD41-FITC+CH223191的细胞的代表性FACS分析点图。(F)组成型启动子Ef1α控制下的含AhR抑制子(AHRR)和zsGreen的pHAGE2慢病毒报告构建体(pHAGE2-Ef1α-AHRR-IRES-zsGreen)的示意图。(G)使用显示CD235-PE或CD41-PE表达的pHAGE2-Ef1α-AHRR-IRES-zsGreen或模拟物感染的细胞的代表性FACS点图。(H)AhR拮抗作用生成的巨核细胞的瑞氏-吉姆萨染色。(I)通过FACS对生成的巨核细胞进行的倍性分析。(J)表达标志共表达AhRR元件的细胞的zsGreen报告基因的大细胞(巨核细胞)的相图和荧光图象。
图7显示了标准(nominal)造血发育中所涉及AhR的示意图。AhR激动作用促使巨核细胞红系祖细胞(MEP)群体的生成和扩增。持续的AhR激动作用使得红细胞发育，而AhR拮抗作用优先使MEP成为巨核细胞。
图8A至8B显示了iPSC重编程中涉及基因和RBC分化中涉及基因的表达。(A)随着细胞直接分化为RBC，负责重编程过程的胚胎基因(包括Oct4、Sox2和Nanog)下调。(B)在该定向分化系统中红系特化的第15和30天，细胞表现出RBC输入相关关键基因的互补性大幅上调。
图9A和9B显示了人全血中球蛋白基因表达的质谱分光光度分析。显示了对照患者(A)和镰状细胞疾病患者(9B)的外周全血的分析。
图10显示了通过本发明方法制备的iPSC衍生的RBC中球蛋白基因表达的质谱分光光度分析。
图11显示了iPSC衍生的RBC接触0.5μM羟基脲HU导致胎儿血红蛋白(HbF；γ)的表达出现约4倍的升高，表明iPSC衍生的RBC对HbF诱导剂产生应答。
图12显示了AhR激动作用促进鼠骨髓中MEP生成和扩增。在+/-0.2μM FICZ中生长3天的去除红细胞的C57B6骨髓的代表性FACS分析点图。最初使用CD16/32Fc受体封闭物处理1x 10^5个细胞，随后直接偶联用于指定标志物的单克隆抗体。
图13A和13B显示了iPSC和MEP对AhR激动剂谱产生应答。(A)使用TCDD或β-NF处理4天的iPSC中CYP1B1的RT-PCR分析。数据是两个重复孔的平均值+SE且数值针对GAPDH进行标准化。(B)使用β-NF或FICZ处理的MEP中CYP1B1的RT-PCR分析。数据是两个重复孔的平均值+SE且数值针对GAPDH进行标准化。
图14显示了使用AhR拮抗作用制备的iPSC-Mk表达一系列标志性和特征性MK标志物。
图15显示了iPSC衍生的血小板与全血衍生的血小板显著相似。
图16A至16C显示了AhR激动剂FICZ在体内具有活性且导致正常小鼠中血小板计数增加。(A)使用逐周剂量递增方案(第1周：1mg/kg；第2周：2mg/kg；第3周：4mg/kg)每天使用悬浮在植物油中的FICZ对C57Bl6小鼠进行腹膜内注射。在三个时间点(第7、14和21天)对外周血进行Hemavet定量。有趣的是，立即接触较高剂量的FICZ且未经历第1周递增的小鼠表现出更直接和高水平的血小板应答。(B)第3周时间点后，处死小鼠并收获其肝以进行CYP1B1靶基因表达的定量RT-PCR分析。(C)第3周时间点后，处死小鼠并收获其脾以进行CYP1B1靶基因表达的定量RT-PCR分析。
图17显示了针对AhR构建体的短发卡RNA(RNAi)(底部)，其可在未分化和分化中的iPSC中打开(顶部)。
图18显示了Mk中构建体的激活导致前血小板形成的显著增加。
图19显示了AhR调节在培养的血红细胞(cRBC)和血小板分化过程中的作用的示意图。在该过程中，利用了AhR激动作用(AHR+)和AhR拮抗作用(AHR-)。
发明详述
除非另有说明，本方面所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非另有说明，单数术语包括复数且复数术语包括单数。通常，本文所述的生物化学、酶学、细胞和分子生物学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。本文引用的某些参考文献和其他文件均明确地通过引用纳入本文。此外，本文引用的所有Genbank或其他序列数据库记录均通过引用纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
除非另有说明，本发明的方法和技术一般遵循本领域熟知的传统方法进行并如若干一般的或更特定的参考文献中所述，所述参考文献贯穿本说明书引用和讨论。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约的格林出版联合公司(Green Publishing Associates)(1992，并补充至2002)；Taylor和Drickamer，Introduction to Glycobiology(《糖生物学简介》)，牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)(2003)；Worthington Enzyme Manual(《沃星顿酶学手册》)，沃星顿生物化学公司(Worthington Biochemical Corp.)，新泽西州富力赫德；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins(《生物化学手册：部分A蛋白质》)，第I卷，CRC出版社(1976)；Handbook of Biochemistry:SectionA Proteins(《生物化学手册：部分A蛋白质》)，第II卷，CRC出版社(1976)；Essentials of Glycobiology(《糖生物学要点》)，冷泉港出版社(1999)。
本发明涉及因特网上已公开的某些氨基酸和核酸序列的序列数据库条目(例如Genbank和UniProt记录)，以及因特网上的其他信息。本领域技术人员应理解因特网上的信息(包括序列数据库条目)会随时更新，例如用于表示特定序列的参考号会发生变化。当参考是针对序列信息的公共数据库或因特网上的其他信息时，应理解这类变化可以发生且因特网上信息的特定实施方式变化不定。因为本领域技术人员可通过在因特网上搜索来发现等同的信息，针对因特网网页地址或序列数据库条目的参考证明了所讨论信息的可获得性和公开传播。
在公开和描述本发明的组合物、方法和其他实施方式之前，应理解本文的术语只是用于描述具体实施方式的目的而并非旨在进行限制。必须指出，除非上下文另有明确说明，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代对象。
本文所用的术语“包含”与“包括”或“含有”同义，为封闭式或开放式表述，并不排除其它未列举的要素或方法步骤。
本文所用术语“体外”指在人工环境中(例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等)，而非在生物体(例如动物、植物或微生物)内发生的事件。
本文所用术语“体内”指在生物体(例如动物、植物或微生物)内发生的事件。
本文所有术语“分离的”指：(1)已与其最初形成时(天然或实验环境中)相关的至少一些组分分离的物质或实体，和/或(2)通过人工生成、制备和/或制造的物质或实体。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其最初相关的其他组分分离。在一些实施方式中，分离的实际是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或超过约99％纯。如本文中所用，如果某物质基本不含其他组分，则认为其是“纯”的。
本发明的MEP、RBC、巨核细胞和血小板提出是哺乳动物或有袋目动物细胞。本文中“哺乳动物”和“哺乳动物的”指任何哺乳动物纲的成员，包括但不限于所有灵长类动物(包括人)、啮齿类动物(包括小鼠和大鼠)、农场动物(包括猪、马、牛、绵羊和山羊)和陪伴动物(包括狗和猫)。
本文所用术语“肽”指短的多肽，例如其通常含有少于约50个氨基酸且更通常含有少于约30个氨基酸。本文中的该术语包括模拟结构和生物学功能的类似物和模拟物。
术语“多肽”包括天然产生和非天然产生的蛋白质、其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单聚体或多具体。此外，多肽可包含多个不同结构域，其中各结构域具有一种或多种不同活性。为避免疑问，“多肽”可以是超过两个氨基酸的任何长度。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”指特定的蛋白质或多肽，从本义或派生含义上说，其(1)与天然状态下伴随其的天然相关组分不相关，(2)以天然中未发现的纯物质形式存在，其中纯物质可以针对其他细胞材料的存在来判定(例如不含来自相同物种的其他蛋白质)，(3)由来自其他物种的细胞表达，或(4)不存在于天然中(例如，其是天然中发现的多肽的片段或者其包含天然中未发现的氨基酸类似物或衍生物或者不同于标准肽键的连接)。因此，化学合成或者在与其天然来源细胞不同的细胞系统中合成的多肽是与其天然相关组分“分离的”。使用本领域已知的蛋白质纯化技术，还可通过分离使多肽或蛋白质基本不含天然相关的组分。如本文所定义，“分离的”无需将所述蛋白质、多肽、肽或寡肽从其合成所在的细胞中物理移出。
本文所用术语“多肽片段”指具有缺失的多肽，例如与全长多肽(如天然产生的蛋白质)相比缺失氨基末端和/或羧基末端。在一个实施方式中，该多肽片段是连续序列，其中片段的氨基酸序列与天然产生的序列中相应位置相同。片段长度通常是至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，或至少12、14、16或18个氨基酸，或至少20个氨基酸，或至少25、30、35、40或45个氨基酸，或至少50或60个氨基酸，或至少70个氨基酸。
术语“融合蛋白”指包含与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为可对其进行构建以使其含有两个或更多个所需功能元件，所述功能元件可来自两种或更多种不同蛋白质。融合蛋白包含来自感兴趣多肽的至少10个连续氨基酸，或至少20或30个氨基酸，或至少40、50或60个氨基酸，或至少75、100或125个氨基酸。融合蛋白中包含的异源多肽长度通常是至少6个氨基酸，或至少8个氨基酸，或至少15、20或25个氨基酸。特别有用的是包含较大多肽的融合体，如IgG Fc区，甚至整个蛋白质，如含有绿色荧光蛋白(“GFP”)生色团的蛋白质。通过构建与编码不同蛋白质或肽的核酸序列框内融合的编码多肽或其片段的核酸序列并随后表达该融合蛋白，可重组生成融合蛋白。或者，可通过将多肽或其片段与另一蛋白质交联来化学生成融合蛋白。
如本文所用，如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二蛋白质的的核酸序列有相似的序列，则称蛋白质有“同源性”或对第二蛋白质是“同源的”。或者，如果两种蛋白质有相似的氨基酸序列，则其中一种蛋白质对第二蛋白质有同源性。(因此，术语“同源蛋白”定义成指两个蛋白质有相似的氨基酸序列。)如本文所用，氨基酸序列的两个区域之间的同源性(特别是涉及预测的结构类似性时)被视为暗示功能类似。
当“同源”用于蛋白质或肽时，应理解不一致的残基位点经常由于保守性氨基酸取代而不同。“保守性氨基酸取代”是一个氨基酸残基由另一个有相似化学属性(如电荷或疏水性)侧链(R基团)的氨基酸残基取代。通常，保守性氨基酸取代基本不改变蛋白的功能属性。在两个或多个氨基酸序列因保守性取代而互相不同的情况下，序列相同性或同源性程度的百分比可以调整以校正取代的保守特性。进行该调整的方法为本领域技术人员公知。参见例如Pearson,1994,Methods Mol.Biol.24:307-31和25:365-89。
以下六组各自含有可互相进行保守性取代的氨基酸：1)丝氨酸、苏氨酸；2)天冬氨酸、谷氨酸；3)天冬酰胺、谷氨酰胺；4)精氨酸、赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸，以及6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
多肽的序列同源性也称为序列相同性百分比，通常使用序列分析软件测量。参见例如遗传计算机组(GCG)的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊53705的威斯康星大学生物技术中心。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包含保守性氨基酸取代)的同源性量度来匹配相似序列。例如，GCG包含程序例如"Gap"和"Bestfit"，能用默认参数测定紧密相关多肽之间的序列同源性或序列相同性，所述紧密相关多肽例如来自不同生物种类或野生型蛋白质和其突变体之间的同源多肽。参见例如GCG 6.1版。
用于比较分子序列与包含大量不同生物体序列的数据库的示例性算法是计算机程序BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish和States,NatureGenet.3:266-272(1993)；Madden等，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang和Madden,Genome Res.7:649-656(1997))，特别是blastp或tblastn(Altschul等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。
BLASTp的示例性参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；打开缺口的成本：11(默认)；延伸缺口的成本：1(默认)；最大比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数目：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。用于同源性比较的多肽序列长度通常是至少约16个氨基酸残基，或至少约20个残基，或至少约24个残基，或至少约28个残基，或超过约35个残基。但检索包含来自大量不同生物体的数据库时，比较氨基酸序列是有用的。使用氨基酸序列检索数据库能通过本领域已知的blastp以外的算法来测量。例如，可使用GCG 6.1版中的程序FASTA来比较多肽序列。FASTA可提供查询序列与检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列相同性百分比。Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)。例如，可使用GCG6.1版(其通过引用纳入本文)提供的FASTA及其默认参数(字长为2和PAM250评分矩阵)来确定氨基酸序列之间的序列相同性百分比。
在一些实施方式中，当多聚体分子(如多肽序列或核酸序列)与另一分子的序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同性时，认为这两个分子是“同源的”。在一些实施方式中，当多聚体分子与另一分子的序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相似性时，认为这两个分子是“同源的”。术语“同源的”必定指至少两条序列(核苷酸序列或氨基酸序列)之间的比较。在一些实施方式中，如果两条核苷酸序列所编码的多肽在至少一个至少约20个氨基酸的延伸体(stretch)上具有至少约50％相同、至少约60％相同、至少约70％相同、至少约80％相同性或至少约90％相同性，则认为这两条核苷酸序列是同源的。在一些实施方式中，同源的核苷酸序列的特征是能够编码一段至少4-5个特定氨基酸。对于被认为同源的核苷酸序列，必须相对于另一序列考虑这些氨基酸的相同性和近似间距。在核苷酸序列长度小于60个核苷酸的一些实施方式中，通过编码至少4-5个特定氨基酸的延伸体的能力来确定同源性。在一些实施方式中，如果两条蛋白质序列在至少一个至少约20个氨基酸的延伸(stretch)上至少约50％相同、至少约60％相同、至少约70％相同、至少约80％相同或至少约90％相同，则认为这两条蛋白质序列是同源的。
如本文所用，“修饰的衍生物”指在一级结构序列上与参考多肽序列基本同源的多肽或其片段，但其包含例如体内或体外化学和生物化学修饰或者其整合有未发现于参考多肽中的氨基酸。这类修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(例如使用放射性核素标记)和多种酶修饰，其是本领域技术人员容易理解的。各种标记多肽的方法和各种用于该目的的取代基或标记是本领域熟知的且包括放射性同位素(如125I、32P、35S和3H)、结合标记的抗配体(antiligand)(如抗体)的配体、荧光团、化学发光剂、酶和用于特异性结合标记的配体的配对物的抗配体。标记的选择取决于所需敏感度、与引物偶联的难易程度、稳定性需要和可用的仪器。标记多肽的方法是本领域熟知的。参见例如Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约的格林出版联合公司(Green Publishing Associates)(1992，并补充至2002)。
如本文所用，“多肽突变体”或“突变蛋白质(mutein)”指与参考蛋白质或多肽(如天然或野生型蛋白质)的氨基酸序列相比，序列中含有一个或多个氨基酸插入、重复、缺失、重排或取代的多肽。突变蛋白质可具有一个或多个氨基酸点取代(其中某一位置的单个氨基酸变为另一个氨基酸)、一个或多个插入和/或缺失(其中在参考蛋白质的序列中分别插入或缺失了一个或多个氨基酸)和/或氨基或羧基末端或上述两个末端处氨基酸序列的截短。与参考蛋白质相比，突变蛋白质可具有相同或不同的生物活性。
在一些实施方式中，突变蛋白质与其对应的参考蛋白质具有例如至少85％的总体序列同源性。在一些实施方式中，突变蛋白质与野生型蛋白质具有例如至少90％的总体序列同源性。在其他实施方式中，突变蛋白质具有至少95％的序列相同性或者98％或99％或99.5％或99.9％的总体序列相同性。
本文所用术语“激动剂”指触发应答的试剂，该应答是至少一种由受体的内源性配体与受体结合所触发的应答。在一些实施方式中，该激动剂可直接或间接作用于第二试剂，该第二试剂本身调节受体活性。在一些实施方式中，至少一种受体应答是可使用试验(包括但不限于生理、药理和生物化学试验)测量的受体活性。示例性试验包括但不限于测量试剂与受体结合的试验、测量受体与底物(例如但不限于核受体与靶基因的调控元件)结合的试验、在mRNA或所得蛋白质水平测量对基因表达影响的试验以及直接或间接通过受体测量对所调控蛋白质活性影响的试验。例如，可通过监测AhR靶基因(如CYP1B1)的表达来测量AhR受体活性。
本文所用术语“拮抗剂”指抑制应答的试剂，该应答是由受体的激动剂与受体结合所触发的至少一种应答。在一些实施方式中，该拮抗剂可直接或间接作用于第二试剂，该第二试剂本身调节受体活性。在一些实施方式中，至少一种受体应答是可使用试验(包括但不限于生理、药理和生物化学试验)测量的受体活性。示例性试验包括但不限于测量试剂与受体结合的试验、测量受体与底物(例如但不限于核受体与靶基因的调控元件)结合的试验、在mRNA或所得蛋白质水平测量对基因表达影响的试验以及直接或间接通过受体测量对所调控蛋白质活性影响的试验。例如，可通过监测AhR靶基因(如CYP1B1)的表达来测量AhR受体活性。
本文所有术语“试剂”或“活性剂”指特定物质，包括但不限于化学化合物(如小分子或复合有机化合物)、蛋白质(如抗体或抗体片段或包含抗体片段的蛋白质)或生物体内在DNA或mRNA水平作用的遗传构建体。
本文所用术语“调节”和“调控”指改变或变更活性、功能或特征。术语“调节剂”指调节活性、功能或特征的试剂。例如，与不存在该试剂时对活性的作用相比，该试剂可通过提高或降低活性来调节活性。在一些实施方式中，增加活性、功能或特征的调节剂是激动剂。在一些实施方式中，增加活性、功能或特征的调节剂是拮抗剂。
本文所用术语“治疗”、“处理”和“缓解”指治疗性治疗，其中对象逆转、缓解、缓和、抑制或延缓和/或停止疾病或紊乱相关病症的进展或严重程度。该术语包括减少或缓解至少一种血细胞类型(如血小板)的数量缺乏或质量缺陷相关的病症、疾病或紊乱的至少一种不良作用或症状。如果减少了一种或多种症状或临床标志物，则治疗通常是“有效的”。或者，如果减少或暂停了疾病进展，则治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括至少进展延缓或症状恶化的停止(预测缺少治疗的情况下会出现上述情况)。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的缓解一种或多种症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解(部分或完全)。与疾病联用时，术语“治疗”、“处理”和“缓解”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括缓解性治疗)。
如本文所用，“共同给予”和“共同给药”指向哺乳动物给予至少两种试剂以治疗病症，其中在治疗剂量期间给予至少两种试剂，该治疗剂量期间与各试剂的至少一种剂量的给药重叠。例如，如果在第1天给予试剂A，在第二天给予试剂B并在第3天给予试剂A，则试剂A和B是共同给予的。治疗剂量期间可包含一种试剂的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多次给药。例如，给药可以每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次。
本发明介绍
HSC向全部八种血细胞系的分化是紧密调控且关键的生理过程，其在个体的生命期间以细微但重要的方式变化。该调控的破坏可对多种血细胞类型具有显著下游作用，可能导致脊髓发育不良、混合谱系白血病、CML、干细胞耗竭(exhaustion)、血小板减少症、贫血和其他血细胞疾病。然而，对控制原代人血细胞特化的分子机制的定义受到了阻碍，这是由于缺少足够数目的干细胞或祖细胞可以生长的平台和缺乏使这些细胞的分化导向末期细胞的实用且有效的技术。例如，一些团队已公开了从胚胎干细胞(ESC)和诱导性全能干细胞(iPSC)衍生巨核细胞(Mks)(1)和红系细胞(2)的原理验证示例。然而，导致这些细胞群体强力扩增以及可用于容易地研究分子信号驱动的细胞分化的模型系统的发展仍然有困难。
我们为解决这些重要的未满足需求而进行的概念方法旨在体外血细胞发育的天然顺序以衍生建立遗传上可溯源的基于iPSC的平台所需要的细胞类型数目和范围。本文所示该新平台的关键点是证明芳基烃受体(AhR)超活化能够使髓系-红系祖细胞长出并从iPSC生成Mk和红系细胞。
AhR是进化上保守的Per/ARNT/SIM(PAS)转录因子家族的成员。其是已知被内源性或外源性配体激活的仅有的PAS家族成员。PAS蛋白参与数种重要的生理过程。历史上，进化上保守的AhR的研究涉及多种普遍存在的环境污染物(包括二噁英、多氯联苯和多环芳烃)对其的激活以及随后反式激活细胞色素P450编码基因，其产物催化突变或毒性中间体的生成。然而，AhR领域目前正经历重要的典范转移(paradigm shift)，其起因是证明了AhR在不存在环境配体的情况下起重要的生理作用。例如，若干研究证明，AhR能够调控自身免疫应答、炎症、细胞生长、细胞迁移、凋亡和癌症进展。特别是关于造血细胞，若干优异的研究表明，AhR调控Th17细胞、调节性T细胞子集和肠相关T细胞的发育。
重要的是，最近的突破性研究表明，AhR在标准HSC生长和分化过程中起关键作用。例如，AhR-/-小鼠的特征是骨髓HSC数目增加和发生淋巴瘤的倾向相应增加。此外，AhR-/-小鼠生成数目减少的红细胞和血小板、较低倍性Mk和数目增加的B系和髓系细胞。这些结果得出了以下假说，即内源性配体激活的AhR调控干细胞生长和/或分化。
虽然有这些早期结果，但仍存在许多重要问题。具体而言，关于AhR调控Mk和红系细胞从双潜能祖细胞发育的作用，仍知之甚少。该过程中涉及AhR的证据是年轻的AhR-/-小鼠中HSC、红细胞和血小板的数目减少且随着AhR-/-小鼠老化血细胞库向髓系和B系细胞偏移。
为了以这些研究为基础并建立用于研究Mk和红系细胞分化的有效系统，我们开发了新颖、无饲养细胞且化学限定的实验方案，用于将iPSC的分化导向造血祖细胞及其后代。该系统的必需组分是使用强力的AhR激动剂6-甲酰吲哚(3,2-b)咔唑(FICZ)高度活化AhR。在一些实施方式中，本文所述的体外系统能够在培养物中捕获并扩增巨核细胞-红系祖细胞的纯群体，该纯群体在生成末期血红细胞(RBC)和Mk的体内发育期间瞬时存在。在一些实施方式中，在使用AhR调控从多潜能干细胞生成双潜能造血祖细胞及后代的过程中，该平台实现了前所未有的效率和一致性。除了证明AhR在MEP、Mk和RBC发育过程中的关键作用外，该平台还提供了重要且遗传上可溯源的系统，用于研究血细胞在多个限定发育阶段的分化。可能更重要的是，本文所述的平台代表了朝体外生成治疗性、患者特异性血小板和RBC所迈出的重要一步。
此外，这些工作表明，AhR在造血作用中具有生理和功能性作用，且双潜能造血祖细胞中受体的调控可指导细胞命运。
干细胞
干细胞是多细胞生物体中的细胞，其能够分裂并分化为多种特化细胞类型并能够自我更新以生成更多具有相同特性的干细胞。本文所用“多潜能干细胞”是具有分化为三种胚层中任意一种的潜能的干细胞：内胚层(例如内部胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖系统)和外胚层(例如表皮组织和神经系统)。多潜能干细胞可形成任何胎儿或成人细胞类型。对于本发明的目的，“多潜能干细胞”可包括全能干细胞，其是能够构建完整、可存活生物体的细胞。这些细胞由卵细胞和精细胞的融合生成。受精卵最初的数次分裂所形成的细胞也是全能的。多潜能干细胞包括但不限于胚胎干细胞(ES)、诱导性多潜能干细胞(iPSC)和体细胞核移植(SCNT)生成的细胞。
ES细胞是来源于早期哺乳动物胚胎囊胚的内细胞团的全能干细胞。衍生哺乳动物ES细胞的方法是本领域熟知的，多种已建立的ES细胞系可与本发明的某些实施方式联用。
iPSC是一种人工衍生自非多潜能细胞(通常是成年体细胞)的多潜能干细胞类型，其通过诱导特定基因的“强制”表达来实现。诱导性多潜能干细胞在许多方面类似于天然的多潜能干细胞(如胚胎干细胞(ES))，例如在一些实施方式中至少在以下一种方面类似：某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、加倍时间、拟胚体形成、畸胎瘤形成、可存活嵌合体形成以及效力和分红能力，但其与天然多潜能干细胞的全面关系仍有待评估。
通常通过将某些干细胞相关基因转染至非多潜能细胞(如成年成纤维细胞)中来衍生iPSC。转染通常是通过病毒载体实现的，如逆转录病毒。转染的基因可包括主要转录调节因子Oct-3/4(Pou5f1)和Sox2。转染后随时间变化，少量转染的细胞开始与多潜能干细胞在形态和生物化学上类似，并且通常通过形态选择、加倍时间、报告基因和抗生素选择中的至少一种进行分离。
在一些实施方式中，形成iPSC的方法包括使用编码Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4蛋白的开放阅读框转染体细胞。在一些实施方式中，形成iPSC的方法包括使用编码OCT4、SOX2、NANOG和LIN28蛋白的开放阅读框转染体细胞。在一些实施方式中，该转染包括向体细胞导入逆转录病毒载体。在替代性实施方式中，形成iPSC的方法包括使用促iPSC形成的至少一种小分子诱导剂处理体细胞。在一些实施方式中，形成iPSC的方法包括使用促iPSC形成的至少一种小分子诱导剂处理体细胞并使用编码iPSC形成的蛋白质诱导剂的开放阅读框转染体细胞。在这类实施方式中，至少一种蛋白质可选自Oct-3/4、SOX2、c-Myc、Klf4、NANOG和LIN28。
iPSC可形成多能干细胞(multipotent stem cell)。在造血细胞系中，iPSC或ES细胞可产生处于成血管状态的细胞。该成血管细胞随后产生造血干细胞，后者产生MEP细胞。
阅读本发明时，本领域技术人员应理解，任何能够分化为MEP的多潜能干细胞或多能干细胞都可用于本发明所述方法的实施方式以制备RBC和/或血小板。
造血细胞类型
所有细胞血液组分都来源于造血干细胞(HSC)。在健康的成年人中，每天产生约1011-1012个新的血细胞以维持外周循环的稳定状态水平。HSC存在于骨髓质(骨髓)中且具有独特的能力以产生所有不同的成熟血细胞类型。HSC是自我更新的：其增殖时，至少一些其子代细胞作为HSC保留，所以干细胞池不会被耗竭。然而，HSC的其他子代细胞(髓系和淋巴祖细胞)可各自进行任意替代性分化途径以生成一种或多种特定的血细胞类型，但不进行自我更新。HSC产生共同髓系祖细胞和共同淋巴祖细胞。本发明鉴定了共同髓系祖细胞下游的细胞类型髓系-红系祖细胞(MEP)，其产生血红细胞和巨核细胞(其转而分化成血小板)。
髓系-红系祖细胞
本文所用“髓系-红系祖细胞”(或MEP)是产生巨核细胞和红细胞的细胞。其最常见地来源于共同髓系祖细胞。在一些实施方式中，MEP的特征是红细胞系标志物血型糖蛋白A(在人中也称作CD235)蛋白(例如人中的Uniprot#P02724)和巨核细胞系标志物整联蛋白α2b(人中的CD41)蛋白(例如人中的Uniprot
#P08514)的共表达(Klimchenko等，Blood,2009,114(8):1506-17)在一些实施方式中，MEP不表达CD34。
血红细胞
血红细胞(或红细胞)是最常见的血细胞类型并且是脊椎生物中主要的通过循环系统将氧(O2)经由血流递送至身体组织的手段。其在肺或鳃中摄取氧并在通过体内毛细血管进行挤压时将其释放。RBC的细胞质富含血凝素，这是一种能够结合氧并赋予血液红色的含铁生物分子。
在人中，成熟的血红细胞是椭圆且柔性的两面凹的盘状物。其缺少细胞核和大多数细胞器，从而为血红蛋白提供最大的空间。每秒产生240万个新的红细胞。该细胞在骨髓中发育并在体内循环约100-120天，之后其组分被巨噬细胞回收。每次循环持续约20秒。人体中约四分之一的细胞是血红细胞。
在一些实施方式中，“血红细胞”是共表达血型糖蛋白A(在人中也称作CD235)蛋白(例如人中的Uniprot#P02724)和转铁蛋白受体(人中的CD71)蛋白(例如人中的Uniprot#P02786)的细胞(Hattangadi等，Blood,2011,118(24):6258-68)。在一些实施方式中，血红细胞还表达至少一种血红蛋白基因。在一些实施方式中，血红细胞表达胎儿血红蛋白(HbF)，以及成年类型血红蛋白的α和β亚基(HbA和HbB)。通常，该细胞类似造血祖细胞，并且随着成熟在尺寸上变小且显示染色质浓缩(两者也都是RBC成熟的迹象)。
巨核细胞
巨核细胞是负责生成凝血细胞(血小板)的骨髓细胞，其是正常血液凝结所必需的。巨核细胞通常占骨髓细胞的万分之一，但在某些疾病期间其数目可增加近10倍。通常，巨核细胞比典型的血红细胞大10-15倍，平均直径50-100μm。其成熟期间，巨核细胞的尺寸变大并复制其DNA而不进行胞质分裂，该过程称为核内有丝分裂。结果是，巨核细胞的细胞核变得非常大且分成小叶，其在光学显微镜下形成具有若干核的假象。在一些情况下，细胞核可含有至多64N DNA，或人细胞中正常DNA套数(complement)的32份拷贝。如同从中出芽的血小板那样，细胞质含有α-颗粒和致密体。
在一些实施方式中，“巨核细胞”是共表达整联蛋白α2b(人中的CD41)蛋白(例如人中的Uniprot#P08514)和糖蛋白Ib(人中的CD42)蛋白(例如人中的Uniprot#P07359)的细胞(Yu和Cantor，Methods Mol Biol,2012；788:291-303)。在一些实施方式中，巨核细胞表达GP1bα。在一些实施方式中，巨核细胞还表达vWF(维勒布兰德氏(von Willebrand’s)受体)以及CD62P(p选择素)。在一些实施方式中，“巨核细胞”是具有至少一种以下特征的细胞：特征性多倍性、进行核内复制以生成至少8N或至少16N的细胞的能力以及细胞表面处明显的前血小板挤出物(Kaushansky,J Clin Invest,2005Dec；115(12):3339-47)。在一些实施方式中，巨核细胞是2N或4N。
血小板
血小板(或凝血细胞)是小、形状不规则的透明细胞片段(即不具有含DNA细胞核的细胞)，直径2-3μm，来源于前体巨核细胞的片段化。血小板的平均寿命通常仅5-9天。血小板是生长因子的天然来源。其在哺乳动物的血液中循环并涉及止血，导致血凝块形成。
在一些实施方式中，通过成熟的巨核细胞标志物(如CD62P)的表达来鉴定血小板。对于功能性，进行血小板粘附试验内向外和外向内信号试验(inside out andoutside in signaling assays)，其中需要GPIIb/GPIIIa(CD41a/CD42b)复合物。
前体细胞
图19显示了多潜能干细胞分化为血小板或RBC期间形成的一系列细胞类型。对于图19中鉴定到的任意给定细胞类型，具有分化为给定细胞类型潜能的所有上游细胞类型都是给定细胞类型的“前体”细胞。因此，HSC的前体细胞包括PSC和成血管细胞。
出于本发明的目的，“MEP前体细胞”是任何具有分化为MEP潜能的细胞。该术语包括但不限于多潜能干细胞、成血管细胞、造血干细胞(HSC)和共同髓系祖细胞(CMP)。
出于本发明的目的，“巨核细胞前体细胞”是任何具有分化为巨核细胞潜能的细胞。该术语包括但不限于多潜能干细胞、成血管细胞、造血干细胞(HSC)、共同髓系祖细胞(CMP)和MEP。
出于本发明的目的，“血小板前体细胞”是任何具有分化为血小板潜能的细胞。该术语包括但不限于多潜能干细胞、成血管细胞、造血干细胞(HSC)、共同髓系祖细胞(CMP)、MEP和巨核细胞。
出于本发明的目的，“网状细胞前体细胞”是任何具有分化为网状细胞潜能的细胞。该术语包括但不限于多潜能干细胞、成血管细胞、造血干细胞(HSC)、共同髓系祖细胞(CMP)和MEP。
出于本发明的目的，“红细胞前体细胞”或“RBC前体细胞”是任何具有分化为网状细胞(也称为RBC)潜能的细胞。该术语包括但不限于多潜能干细胞、成血管细胞、造血干细胞(HSC)、共同髓系祖细胞(CMP)、MEP和网状细胞。
制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法
本发明还提供了从MEP前体细胞制备MEP的方法。在一些实施方式中，该MEP前体细胞是干细胞，如多潜能干细胞。如实施例中所示，发明人建立了用于在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP的方法和实验方案。不希望被任何理论所限制，发明人相信，使用干细胞作为起始细胞的实施例中所示方法也广泛地适用于使用成血管细胞、造血干细胞或共同髓系祖细胞。
在一些非限制性实施方式中，与现有技术的方法相比，这些方法可实现以下至少一项：以较快速率生成MEP和在培养物中较长时间内生成MEP。在一些实施方式中，MEP前体细胞(如多潜能干细胞)在芳基烃受体(AhR)调节存在的情况下分化为MEP。如实施例中所示，在一些实施方式中，分化过程期间培养物中存在的AhR激动剂能够使MEP实现指数生成。因此，在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目呈指数增长。因此，在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目在例如至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少30天的培养期间呈指数增长。
MEP前体细胞(例如多潜能干细胞)向MEP的分化是多步骤过程，这取决于所用MEP前体的类型。例如，如果MEP前体是多潜能干细胞，则PSC会经历一系列细胞命运决定，期间其从起始的多潜能状态分化为成血管(造血-内皮)状态、多能HSC状态、MEP命运。当然，如果成血管(造血-内皮)细胞或多能HSC细胞被用作分化MEP的起始细胞，可消除或修改该过程的原步骤。“在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将干细胞(如多潜能干细胞)分化为MEP”指在总细胞培养期间的至少一个子期间内，培养基中存在AhR调节剂。在一些实施方式中，该子期间选自1-12小时、3-12小时、6-12小时、6-24小时、12-24小时、1-2天、2-4天、3-6天、1-2周、2-4周和4-8周。在一些实施方式中，该子期间选自至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少2天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周和至少8周。在一些实施方式中，该MEP前体细胞是多潜能干细胞。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR激动剂。
在一些实施方法中，该AhR调节剂存在于整个培养期间。在一些实施方法中，MEP前体细胞的培养物在不存在AhR调节剂的情况下起始并在一定时间后添加AhR调节剂，所述一定时间选自：至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周和至少2周。在一些实施方法中，MEP前体细胞的培养物在不存在AhR调节剂的情况下起始并在一定时间后添加AhR调节剂，所述一定时间选自：12-24小时、1-2天、2-4天、3-6天、4-7天、5-10天、6-10天和7-10天。在一些实施方式中，该MEP前体细胞是多潜能干细胞。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR激动剂。
在一些实施方式中，将MEP前体细胞在AHR拮抗剂存在的情况下培养第一段时间，随后在AHR激动剂存在的情况下培养第二段时间。在一些实施方式中，该第一段时间选自1-12小时、3-12小时、6-12小时、6-24小时、12-24小时、1-2天、2-4天、3-6天、1-2周、2-4周和4-8周。在一些实施方式中，该第一段时间选自至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少2天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周和至少8周。在一些实施方式中，该第二段时间选自1-12小时、3-12小时、6-12小时、6-24小时、12-24小时、1-2天、2-4天、3-6天、1-2周、2-4周和4-8周。在一些实施方式中，该第二段时间选自至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少2天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周和至少8周。
在一些实施方式中，这些方法包括在不存在AhR调节剂的情况下培养第三段时间。在一些实施方式中，该第三段时间是在第一段时间之后并在第二段时间之前。在一些实施方式中，在存在至少一种以下蛋白质的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP：BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、vVEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、WNT3a(例如人中的Uniprot#P56704)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、FLT3(例如人中的Uniprot#P36888)、TPO(例如人中的Uniprot#P40225)和阿法依泊汀(EPOgen)(例如人中的Uniprot#P01588)。在一些实施方式中，一种或多种所述蛋白质被具有类似活性的其他蛋白质所取代。在一些实施方式中，上文所列举蛋白质之一被具有至少一种下述特性的蛋白质取代：是所列举蛋白质的片段、包含所列举蛋白质片段或整个所列举蛋白质的融合蛋白、所列举蛋白质的同源物、所列举蛋白质的修饰的衍生物或所列举蛋白质的突变蛋白质。在一些实施方式中，AhR激动剂在培养物中与至少一种因子共存。在一些实施方式中，通过不包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养的方法来使多潜能干细胞分化为MEP。
在一些实施方式中，通过包括在至少一种含有多种因子组合的培养基中进行培养的方法来使多潜能干细胞分化为MEP，所述培养基和多种因子组合包含选自下组的复合物：
a)补充有BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:Wnt3a的比例为约1:10:5)；
b)补充有BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和KOSR的RPMI培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
c)补充有BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
d)补充有VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)和bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基(在一些实施方式中VEGF:bFGF的比例为约3:1)；
e)补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12培养基的混合物(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体的比例为约2:4:4:1)；
f)补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和(例如人中的Uniprot#P40225)、IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12培养基的混合物(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体:hTPO:IL-6的比例为约5:10:10:2.5:10:1)；以及
g)补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)和AhR激动剂的IMDM与Hams F12培养基的混合物(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体:hTPO:IL-6的比例为约5:10:10:2.5:10:1)。
在一些实施方式中，通过包括在至少一种含有多种因子组合的培养基中进行培养的方法来使多潜能干细胞分化为MEP，所述培养基和多种因子组合包含选自下组的复合物：
a)补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、20-30ng/ml Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和10％无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:Wnt3a的比例为约1:10:5)；
b)补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、16-24ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和10％KOSR的RPMI培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
c)补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和16-24ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
d)补充有40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)和4-6ng/mlbFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基(在一些实施方式中VEGF:bFGF的比例为约3:1)；
e)补充有1％B27、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、12-18ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、4-6ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、80-120ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和20-30ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12培养基的混合物(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体的比例为约2:4:4:1)；
f)补充有B27、N2-补充剂、BSA、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、80-120ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、80-120ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、20-30ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和40-60ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、8-12ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、0.5-2U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12培养基的混合物(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体:hTPO:IL-6的比例为约5:10:10:2.5:10:1)；
g)补充有B27、N2-补充剂、BSA、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、80-120ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、80-120ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、20-30ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和40-60ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、8-12ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、0.5-2U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体:hTPO:IL-6的比例为约5:10:10:2.5:10:1)和AhR激动剂的IMDM与Hams F12培养基的混合物。
在一些实施方式中，通过包括在至少一种含有多种因子组合的培养基中进行培养的方法来使多潜能干细胞分化为MEP，所述培养基和多种因子组合包含选自下组的复合物：
a)补充有约5ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、约25ng/ml Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和约10％无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基；
b)补充有约5ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、约20ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和约10％KOSR的RPMI培养基；
c)补充有约5ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和约20ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基；
d)补充有约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和约5ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基；
e)补充有约1％B27、约0.5％N2-补充剂、约0.5％BSA、约15ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、约5ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、约100ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和约25ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12培养基的混合物；
f)补充有约1％B27、约0.5％N2-补充剂、约0.5％BSA、约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、约100ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、约100ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、约25ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和约50ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、约10ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、约0.5U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12培养基的混合物；以及
G)补充有约1％B27、约0.5％N2-补充剂、约0.5％BSA、约50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、约100ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、约100ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、约25ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和约50ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、约10ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、约0.5U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)和AhR激动剂的IMDM与Hams F12培养基的混合物。
在一些实施方式中，通过下述方法将多潜能干细胞在培养物中分化为MEP：
a)在补充有BMP-4、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养多潜能干细胞；
b)在补充有BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和KOSR的RPMI培养基中培养步骤a)中获得的细胞；
c)在补充有BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤b)中获得的细胞；
d)在补充有VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤c)中获得的细胞；
e)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤d)中获得的细胞；
f)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤e)中获得的细胞。
在一些实施方式中，培养步骤a)至e)中至少一步中所用培养基中还包含AhR拮抗剂。
在一些实施方式中，步骤f)所用培养基中还包含AhR激动剂。
在一些实施方式中，通过下述方法将多潜能干细胞在培养物中分化为MEP：
a)在补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/mlVEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、20-30ng/ml Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和10％无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养多潜能干细胞(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:Wnt3a的比例为约1:10:5)；
b)在补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/mlVEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、16-24ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和10％KOSR的RPMI培养基中培养步骤a)中获得的细胞(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
c)在补充有4-6ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、40-60ng/mlVEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和16-24ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤b)中获得的细胞(在一些实施方式中BMP-4:VEGF:bFGF的比例为约1:10:4)；
d)在补充有12-18ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)和4-6ng/mlbFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤c)中获得的细胞(在一些实施方式中VEGF:bFGF的比例为约3:1)；
e)在补充有1％B27、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、4-6ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、80-120ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和20-30ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤d)中获得的细胞(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体的比例为约2:4:4:1)；以及
f)在补充有1％B27、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、40-60ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、80-120ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、80-120ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、20-30ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和40-60ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、8-12ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、0.5-2U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤e)中获得的细胞(在一些实施方式中VEGF:bFGF:hSCF:Flt3配体:hTPO:IL-6的比例为约5:10:10:2.5:10:1)。
在一些实施方式中，培养步骤a)至e)中至少一步中所用培养基中还包含AhR拮抗剂。
在一些实施方式中，步骤f)所用培养基中还包含AhR激动剂。
在一些实施方式中，通过下述方法将多潜能干细胞在培养物中分化为MEP：
a)在补充有5ng/ml BMP-4、50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、25ng/ml Wnt3a(例如人中的Uniprot#P56704)和10％无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养多潜能干细胞；
b)在补充有5ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)、20ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)和10％KOSR的RPMI培养基中培养步骤a)中获得的细胞；
c)在补充有5ng/ml BMP-4(例如人中的Uniprot#P12644)、50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和20ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤b)中获得的细胞；
d)在补充有15ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692)和5ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)的StemPro 34培养基中培养步骤c)中获得的细胞；
e)在补充有1％B27、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、100ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、100ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)和25ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤d)中获得的细胞；以及
f)在补充有1％B27、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、50ng/ml VEGF(例如人中的Uniprot#P15692的)、100ng/ml bFGF(例如人中的Uniprot#P09038)、100ng/ml hSCF(例如人中的Uniprot#P21583)、25ng/ml Flt3配体(例如人中的Uniprot#P36888)和50ng/ml hTPO(例如人中的Uniprot#P40225)、10ng/ml IL-6(例如人中的Uniprot#P05231)、0.5U/ml阿法依泊汀(例如人中的Uniprot#P01588)的IMDM与Hams F12的混合物中培养步骤e)中获得的细胞。
在一些实施方式中，培养步骤a)至e)中至少一步中所用培养基中还包含AhR拮抗剂。
在一些实施方式中，步骤f)所用培养基中还包含AhR激动剂。
在一些实施方式中，在步骤a)之前，在iPSC培养基中培养多潜能干细胞，该iPSC培养基在MEF上适应24小时并补充有Rho激酶抑制剂和bFGF。
在一些实施方式中，对通过本文所述这些和其他方法制备的MEP进行分离。
在一些实施方式中，步骤a)持续约2天、步骤b)持续约1天、步骤c)持续约1天、步骤d)持续约2天、步骤e)持续约1天且步骤f)持续约1天。在一些实施方式中，还将细胞培养于步骤f)的培养基中，培养时间为：1-2天、2-4天、3-6天、1-2周、2-4周和4-8周。在一些实施方式中，还将细胞培养于步骤f)的培养基中，培养时间为：至少24小时、至少36小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周和至少8周。在一些实施方式中，还将细胞培养于步骤f)的培养基中，培养时间为：至少3个月、至少6个月、至少1年或无限期培养。在一些实施方式中，对步骤f)的细胞培养物进行分装并制成冻存储液。这类储液可周期性解冻以无限量供应形成分化的MEP细胞的细胞培养物。
在本发明的方法的一些实施方式中，多潜能干细胞培养物在7-10天内开始分化MEP。在一些实施方式中，所述培养基持续生成MEP细胞至少30天。在该过程期间，培养的细胞生长于包含AhR激动剂的培养基中。
在一些实施方式中，该培养物不包含血清。在一些实施方式中，该培养物不包含饲养细胞。在某些情况下，这类实施方式的无饲养细胞方面提供了某些优势。例如，在一些这类实施方式中，其降低了所得MEP被污染的风险，其降低了这类MEP所制备的血红细胞或血小板被污染的风险。该风险的降低在细胞的某些应用中是需要的。
在一些实施方式中，该部分D中实验方案所用的蛋白质是天然存在的蛋白质的修饰的衍生物和/或突变蛋白质。在一些实施方式中，所用蛋白质与通过Uniprot或本文所示其他数据库ID号鉴定的蛋白质序列之间具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的相同性。
在一些实施方式中，这些方法包括提供iPSC并使该iPSC分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法包括提供成血管细胞并使该成血管细胞分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法包括提供HSC并使该HSC分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法包括提供CMP并使该CMP分化为MEP。在一些实施方式中，分化为MEP包括在AhR拮抗剂中培养。在一些实施方式中，分化为MEP包括在AhR激动剂中培养。在一些实施方式中，分化为MEP包括在AhR拮抗剂中培养并在AhR激动剂中培养。在一些实施方式中，分化为MEP包括在AhR拮抗剂中培养第一段时间并在AhR激动剂中培养第二段时间。
制备血红细胞的方法
MEP(包括通过本发明方法生成的那些)具有分化为血红细胞的潜能。因此，本发明还提供了制备血红细胞的方法，包括提供MEP并在足以制造血红细胞的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，这些方法包括根据本发明的方法制备MEP并在足以制造Mk的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养。在其他实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养并在AhR激动剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，红系细胞特化培养基包含EPO。EPO可以来自本领域已知的任何合适来源，如购自R&D公司(目录编号#286-EP)或安进公司(阿法依泊汀(EPOgen))。红细胞生成素主要作用于血红细胞祖细胞和前体(其发现与人的骨髓中)，其通过保护这些细胞免受凋亡来促进其存活，从而促进确定的红细胞生成。红细胞生成素是主要的促红细胞生成因子，其与红系细胞从多能祖细胞中发育期间涉及的多种其他生长因子(IL-3、IL-6、糖皮质激素、SCF)协同作用。在本发明的一些实施方式中，红系细胞特化培养基包含EPO。在本发明的一些实施方式中，红系细胞特化培养基包含选自IL-3、IL-6、糖皮质激素和SCF的至少一种其他因子。因为通过本文所述方法生成的MEP可以被运输甚至可以冷冻、储存和/或被运输，本发明还使通过本发明方法制备的MEP分布至不同位置和/或不同使用者(user)，从而其可随后从MEP制备血红细胞。因此，本发明还提供了制备血红细胞的方法，包括提供使用本发明方法体外分化的MEP并在足以制造RBC的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养。在其他实施方式中，足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养并在AhR激动剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，红系细胞特化培养基包含EPO。
在一些实施方式中，对本领域已知的制备血红细胞的替代方法进行修改以在AhR激动剂存在的情况下培养细胞以制备血红细胞。一种示例性方法公开于FengMa等，PNAS，2008年9月2日，第105卷，第35号，第13087-13092页。Ma等使用鼠胎肝基质细胞(mFLSC)层以将人胚胎干细胞(hESC)分化为最终成熟的血红细胞。该mFLSC层从胚胎D15黑6鼠中制备，经扩增并辐照。hESC传代至含有明胶上mFLSC的孔上并在3mL的培养基(α-MEM、15％FBS、1mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸)中生长，每3天更换一次培养基。从该培养物中生成非粘附细胞并在不同天数收集。对于这些细胞，通过RT-PCR分析红系细胞基因表达，通过免疫荧光分析血红蛋白表达并通过集落培养分析分化潜能。他们发现其细胞早在第4天时就在共培养物中开始表达红系细胞标志物并且表达水平随时间增加，最终时间点为第18天。通过免疫荧光监测单个细胞中的β-球蛋白表达，其数目在第12-18天开始并增加。使用集落和悬浮培养观察进一步成熟。将来自共培养物的细胞置于含有30％FBS、1％去离子部分V BSA、0.1mM 2-巯基乙醇、α-MEM和人细胞因子混合物(100ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、100ng/mL IL-6、10ng/mL TPO、10ng/mL G-CSF和4U/mL EPO)的1.2％甲基纤维素中。12-14天后，收获红系细胞破裂物并在15％FBS、0.1mM 2-巯基乙醇、α-MEM和上文所列人细胞因子混合物的悬浮培养物中生长。如上文所述分析这些细胞的血红蛋白(免疫染色)、去核(May Grunwald-Giemsa染色)、氧解离(血分析仪)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。他们发现这些细胞能够去核并且于仅用共培养物生成的细胞相比具有升高的β-球蛋白表达。这些细胞与氧结合并具有与脐带血(cord blood)血红细胞类似的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。总之，Ma等能够证明，通过使用mFLSC共培养物并随后进行红系细胞成熟(在集落和悬浮培养物中)，可以由hESC制备表达β-球蛋白的去核的血红细胞。在一些实施方式中，对Ma等的方法进行了修改以包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养以由胚胎干细胞生成血红细胞。
另一种示例性方法公开于Giarratana等，Blood，2011年11月10日，第118卷，第19号，第5071-5079页。在这篇文章中，Giarratana等使用获自人供体的CD34+细胞以证明细胞扩增的可行性以及用于输注的应用。为进行扩增和导致细胞成熟，作者使用了3步方法。CD34+细胞获自使用GM-CSF和CSF刺激骨髓后的白细胞除去法(leukopheresis)。这些细胞培养在EDM(IMDM，330ug/ml转铁蛋白，10ug/mL rh胰岛素，2U/mL肝素，5％灭活的人血浆)中，在不同阶段加入多种细胞因子。在阶段1(第0-7天)中，EDM补充有氢化可的松、100ng/mL SCF、5ng/mL IL-3和3U/mL EPO。随后收获细胞并重悬于阶段2(第7-11天)培养基(EDM加100ng/mL SCF和3U/mL EPO)中。在第11天，再次收获细胞并重悬以进行阶段3(第11-18天)，其使用补充有3U/mL EPO的EDM培养基。该方法允许细胞扩增并使CD34+细胞成熟为网状细胞。作者比较了其培养的血红细胞(cRBC)与脐带血和成人血血红细胞的氧结合、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶活性以及细胞变形的能力。其cRBC的表现与脐带血RBC非常类似。将cRBC置于(小鼠或人)体内后，通过测定CD71表达缺失、细胞群和表面积，这些细胞能够完全成熟。他们还观察到细胞具有两面凹的形状。cRBC可以储存正常的时间范围(4周)而不丧失RBC特性。在一些实施方式中，对Giarratana等的方法进行了修改以包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养以由CD34+细胞生成血红细胞。
本发明所述方法还能够由任何来源的MEP制备血红细胞。例如，该MEP可获自供体骨髓。在一些实施方式中，该MEP首先通过例如FACS与骨髓中存在的其他细胞分离。或者，可培养全骨髓或其部分并通过在AhR激动剂存在的情况下进行培养来刺激MEP细胞形成。因此，还提供了制备血红细胞的方法，包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方式中，这些方法还包括在红系细胞特化培养基中培养该MEP。
在一些实施方式中，对通过本文所述这些和其他方法制备的RBC进行分离。在一些实施方式中，该RBC配制为用于向哺乳动物进行给药。
制备巨核细胞的方法
MEP(包括通过本发明方法生成的那些)具有分化为巨核细胞(Mk)的潜能。因此，本发明还提供了制备巨核细胞的方法，包括根据本发明的方法制备MEP并在足以制造Mk的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。在其他实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养并在AhR调节剂存在的情况下培养。在其他实施方式中，足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，与包括仅在AhR激动剂中培养或仅在AhR拮抗剂中培养的方法相比，该过程导致所生成的Mk总数增加。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，巨核细胞特化培养基包含TPO(例如人中的Uniprot#P40225)。人TPO可购自例如R&D公司(目录号#288-TP)或基因泰克公司(Genentech)(目录号#G140BT)。在一些实施方式中，巨核细胞特化培养基还包含基质衍生因子1(SDF1)。
在一些实施方式中，对本领域已知的制备Mk的替代方法进行修改以在AhR调节剂存在的情况下培养细胞以制备Mk和/或血小板。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。先前报道的人巨核细胞的分化实验方案分离了多潜能干细胞或人骨髓以用于体外扩增。骨髓实验方案起始于在限定的培养条件下从人对象的股骨中收集单核细胞(Schattner,M.等，Thrombopoietin-stimulated ex vivo expansionof human bone marrow megakaryocytes(血小板生成素刺激的人骨髓巨核细胞的离体扩增).Stem Cells.14,207-214.(1996))。体外培养和扩增后，使用磁性细胞分选对这些细胞进行分选，从而分离祖细胞池(CD34+)组分并用作巨核细胞分化的源材料。将这些细胞置于人或鼠辐照的骨髓基质上，所述基质用作粘附的基底并辅助CD34+群体成熟为巨核细胞。这些培养物生长于含有人血清和细胞因子混合物的多种排列(含有血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和白介素-3(IL-3))的培养基中。在该实验方案的创造性报告中，在早至涂板后12天时观察到由CD41a的蛋白质水平表达确定的巨核细胞群体。在一些实施方式中，对Schattner等的方法进行了修改以包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养以由CD34+细胞生成血红细胞。
用于从人多潜能干细胞(ESC或iPSC)分化Mk的实验方案也经修改以包括在AhR调节剂存在的情况下进行培养。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。例如，最近的工作证明，能够有效地优化使用人ES或iPS细胞作为源材料的分化实验方案。(Gaur,M.等，Megakaryocytes derived from human embryonicstem cells:a genetically tractable system to study megakaryocytopoiesis and integrinfunction(来源于人胚胎干细胞的巨核细胞：用于研究巨核细胞生成和整联蛋白功能的遗传上可溯源的系统).J Thromb Haemost.4,436-442.(2006))。与该方法的关键区别在于增添的与多潜能细胞的正确维持和传代以及调合诱导造血作用的细胞因子混合物的挑战相关的技术复杂因素。Gaur等通过使用与骨髓实验方案类似的策略解决了这些问题。即，将ESC置于骨髓基质上并使用高剂量的TPO。7天后，物理破碎被认为含有造血祖细胞的大集落以分离单细胞悬液中的祖细胞池。将这些细胞置于新鲜的基质单层上并保持于高TPO培养基中直至第11天分装，其涉及延长与胰蛋白酶和胶原酶的再次接触以尽可能好地分离悬浮液中的这些细胞。将细胞再次放置并其在早至15天时发现表达巨核细胞标志物并表现出高倍性。在一些实施方式中，对Gaur等的方法进行了修改以包括在AhR调节剂存在的情况下进行培养以由人多潜能干细胞生成血红细胞。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。
因为通过本文所述方法生成的MEP可以运输甚至可以冷冻、储存和/或运输，本发明还使通过本发明方法制备的MEP分布至不同位置和/或不同使用者，其随后继而从MEP制备巨核细胞。因此，本发明还提供了制备巨核细胞的方法，包括提供使用本发明方法体外分化的MEP并在足以制造巨核细胞的条件下培养该MEP。在一些实施方式中，足以制造巨核细胞的方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造巨核细胞的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。在其他实施方式中，足以制造巨核细胞的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养并在AhR调节剂存在的情况下培养。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，巨核细胞特化培养基包含TPO。
本发明所述方法还能够由任何来源的MEP制备巨核细胞。例如，该MEP可获自供体骨髓。在一些实施方式中，该MEP首先通过例如FACS与骨髓中存在的其他细胞分离。或者，可培养全骨髓或其部分并通过在AhR激动剂存在的情况下进行培养来刺激MEP细胞形成。因此，还提供了制备巨核细胞的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养任何来源的MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，这些方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。
在一些实施方式中，对通过本文所述这些和其他方法制备的Mk进行分离。在一些实施方式中，该Mk配制为用于向哺乳动物进行给药。
制备血小板的方法
MEP(包括通过本发明方法生成的那些)具有分化为巨核细胞的潜能，其继而在培养中自然地分化以形成血小板。因此，本发明还提供了制备血小板的方法，包括根据本发明的方法制备MEP、在足以制造Mk的条件下培养该MEP以制备Mk并在足以从Mk分化血小板的条件下培养该Mk。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。在其他实施方式中，足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养并在AhR调节剂存在的情况下培养。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，巨核细胞特化培养基包含TPO。
因为通过本文所述方法生成的MEP可以运输甚至可以冷冻、储存和/或运输，本发明还使通过本发明方法制备的MEP分布至不同位置和/或不同使用者(user)，从而其随后能够从MEP制备血小板。因此，本发明还提供了制备血小板的方法，包括提供使用本发明方法体外分化的MEP、在足以制造Mk的条件下培养该MEP以制备巨核细胞并在足以从Mk分化血小板的条件下培养该Mk。在一些实施方式中，足以制造巨核细胞的方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，足以制造巨核细胞的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。在其他实施方式中，足以制造巨核细胞的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养并在AhR调节剂存在的情况下培养。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，巨核细胞特化培养基包含TPO。
本文所述方法还能够从任何来源的MEP制备巨核细胞并因此能够从任何MEP来源制备血小板。例如，该MEP可获自供体骨髓。在一些实施方式中，该MEP首先通过例如FACS与骨髓中存在的其他细胞分离。或者，可培养全骨髓或其部分并通过在AhR激动剂存在的情况下进行培养来刺激MEP细胞形成。因此，本发明还提供了制备血小板的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP以制备Mk并在足以进行血小板分化的条件下培养该Mk。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方式中，足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。在一些实施方式中，这些方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养MEP。
在一些实施方式中，对通过本文所述这些和其他方法制备的血小板进行分离。在一些实施方式中，该Mk配制为用于向哺乳动物进行给药。
芳基烃受体(AhR)调节剂
芳基烃受体(“AhR”)是配体激活的碱性-螺旋-环-螺旋转录因子家族成员，已发现该家族可被多种结构不同的合成化合物和天然产生的化合物(如聚环芳烃、吲哚和类黄酮)激活。在不存在结合的配体的情况下，该AhR以潜在构象存在于细胞的胞质隔间(cytoplasmic compartment)中，所述胞质隔间与两分子的分子伴侣热激蛋白90、亲免素样蛋白、XAP2和hsp90相互作用蛋白p23相关。配体结合会引发一系列事件，包括易位至细胞核，释放hsp90以及ARNT和其他转录因子单体的异二聚化。配体结合的AhR-ARNT能够识别位于CYP1A1和其他应答基因启动子处称为二噁英应答元件(“DRE”)的共有序列。已知的AhR相关蛋白质示例包括但不限于hsp90p23、XAP2、p60、hsp70、p48、RelB和雌激素受体。
该AhR蛋白含有若干对功能重要的结构域并被分类为碱性螺旋-环-螺旋/Per-Arnt-Sim(bHLH/PAS)转录因子家族成员。bHLH基序位于蛋白质的N末端。bHLH超家族的成员具有两个功能上不同并高度保守的结构域。第一个是碱性区域(b)，其涉及转录因子与DNA的结合。第二个是螺旋-环-螺旋(HLH)区域，其促进蛋白质-蛋白质相互作用。AhR还含有两个PAS结构域(PAS-A和PAS-B)，其是200-350个氨基酸的延伸体，与最初在果蝇基因period(Per)和single minded(Sim)以及AhR的异二聚化伙伴芳基烃受体核易位体(ARNT)中发现的蛋白质结构域具有高度序列同源性。PAS结构域支持与其他含PAS结构域蛋白质的特异性次级相互作用，如同在与AhR和ARNT相互作用的情况下，从而形成杂合和纯合蛋白质复合物。AhR的配体结合稳定包含于PAS-B结构域中并含有若干对配体结合重要的保守残基。最后，富Q结构域位于蛋白质的C末端区域并涉及共激活因子招募和反式激活。
如本文所用，“AhR”或“芳基烃受体”至通常理解为来自任何哺乳动物的AhR或芳基烃受体的任何蛋白质，以及其变体和修饰的衍生物。在一些实施方式中，该AhR是被鉴定为Genbank标识物NP_001612的人类蛋白质，其通过引用纳入本文。
典型的信号转导期间，胞质AhR结合配体(如合适的小分子)，其促进AhR易位至细胞核并最终导致从头转录靶基因。AhR靶基因的启动子具有应答元件5’-TNGCGTG-3’，称为“AhR应答元件”或“AHRE”或者“药物应答元件”或“DRE”或者“外源性物质应答元件”或“XRE”。外源性物质代谢酶(例如细胞色素P450)的基因是熟知的AhR靶标。数百种其他基因也具有AHRE。对典型的AhR信号转导的生物化学的阐述揭示了能够精细调节AhR活性的若干参数。这些参数包括配体特征、衔接分子和转录共激活因子或共抑制因子，其调节AhR的非常规细胞特异性活性。
该AhR调节剂可以是任何物质，包括但不限于肽、多肽、蛋白质(如抗体或抗体片段)、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂质、糖或其天然产生或非天然产生的衍生物。无论其是否还符合一种或多种先前所列类别，AhR调节剂都可以是小有机分子或复合有机分子。
具有AhR激动剂和拮抗剂活性的分子是本领域熟知的并可用于本发明的方法。(参见例如Denison,M.S.,和S.R.Nagy.2003，“Activation of the aryl hydrocarbonreceptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals(由结构不同的外源性和内源性化学物质激活芳基烃受体)”Annu Rev Pharmacol Toxicol 43:309-334；以及Nguyen,L.P.,和C.A.Bradfield,2008,“The search for endogenous activators ofthe aryl hydrocarbon receptor(芳基烃受体的内源性激活因子的搜索)”Chemicalresearch in toxicology 21:102-116)。
一种可用于表征这类分子的活性或鉴定新分子的试验类型是基于细胞的体外试验。在一个示例中，使用AhR驱动的绿色荧光蛋白报告基因稳定地转染H1G1小鼠肝癌细胞系。向H1G1培养物中以滴定的浓度添加疑似AhR配体，持续18-48小时。随后在亮度计中定量GFP荧光。通过在添加感兴趣的化合物与已知的AhR配体(如-萘黄酮(BNF))后测试H1G1细胞中的GFP荧光来测定AhR拮抗剂活性。这类试验的示例描述于例如Nagy,S.R.,等，2002,“Identification of novel Ahreceptor agonists using a high-throughput green fluorescent protein-based recombinantcell bioassay(使用高通量基于绿色荧光蛋白的重组细胞生物试验鉴定新颖的Ah受体激动剂)”Biochemistry 41:861-868；以及Nagy,S.R.,等，2002,“Development of agreen fluorescent protein-based cell bioassay for the rapid and inexpensive detection andcharacterization of ah receptor agonists(研发用于快速和不昂贵地检测和表征ah受体激动剂的基于绿色荧光蛋白的细胞生物试验)”Toxicol Sci 65:200-210，上述各文献都通过引用纳入本文以用于全部目的。还参见Garrison等，1996,“Species-specificrecombinant cell lines as bioassay systems for the detection of2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals(用于检测2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英样化学品的生物试验系统中的物种特异性重组细胞系)”Fundamental andApplied Toxicology,30:194-203，其通过引用纳入本文以用于全部目的。
可用于表征测试试剂的AhR激动剂活性的示例性试验旨在提供包含MEP的细胞培养物并随后在EPO和测试试剂存在的情况下培养该细胞培养物并测量培养物中RBC的生成。任选地可提供至少一种对照培养物和/或可参考至少一种对照细胞培养物的结果。任选的细胞培养物通常是指以下培养物，其中包含MEP的类似细胞培养物在EPO而非测试试剂存在的情况下培养。或者或此外，可提供或参考对照培养物，其中包含MEP的类似细胞培养物在EPO和已知的AhR激动剂(如FICZ)存在的情况下培养。通过测试包含EPO和测试试剂的细胞培养物中RBC的生成，并任选地比较该培养物中RBC的生成与至少一种对照细胞培养物中RBC的生成，可确定测试试剂是否具有AhR激动剂活性。例如，如果包含EPO和测试试剂的细胞培养物中生成的RBC多于包含EPO但不包含测试试剂的对照培养物，则可通过该试验确定测试试剂具有AhR激动剂活性。
可用于表征测试试剂的AhR拮抗剂活性的示例性试验旨在提供包含MEP的细胞培养物并随后在至少一种以下培养物中培养该细胞培养物：1)包含EPO和测试试剂的细胞培养物；以及2)包含EPO、已知的AhR激动剂和测试试剂的细胞培养物。任选地可采用至少一种对照培养物和/或可参考至少一种对照细胞培养物的结果。任选的细胞培养物通常是指以下培养物，其中包含MEP的类似细胞培养物在存在EPO而非测试试剂、或者存在EPO和已知的AhR激动剂的情况下进行培养。通过测试如下培养物中至少一种中的RBC的生成：1)包含EPO和测试试剂的细胞培养物；以及2)包含EPO、已知的AhR激动剂和测试试剂的细胞培养物；并且任选地比较至少一种培养物中RBC的生成与至少一种对照细胞培养物中RBC的生成，可确定测试试剂是否具有AhR拮抗剂活性。例如，如果1)包含EPO和测试试剂的细胞培养物；以及2)包含EPO、已知的AhR激动剂和测试试剂的细胞培养物中至少一种培养物中生成的RBC少于包含EPO但不包含测试试剂的对照培养基和/或少于包含EPO和已知的AhR激动剂但不包含测试试剂的对照培养基，则可通过该试验确定测试试剂具有AhR拮抗剂活性。
可用于表征测试试剂的AhR拮抗剂活性的另一种示例性试验旨在提供包含MEP的细胞培养物并随后在TPO和测试试剂存在的情况下培养该细胞培养物并测量培养物中Mk和/或血小板的生成。任选地可提供至少一种对照培养物和/或可参考至少一种对照细胞培养物的结果。任选的细胞培养物通常是指以下培养物，其中包含MEP的类似细胞培养物在TPO而非测试试剂存在的情况下培养。或者或此外，对照培养物可以是指以下培养物，其中包含MEP的类似细胞培养物在TPO和已知的AhR激动剂(如FICZ)存在的情况下培养。通过测试包含TPO和测试试剂的细胞培养物中Mk和/或血小板的生成，并任选地比较该培养物中Mk和/或血小板的生成与至少一种对照细胞培养物中Mk和/或血小板的生成，可确定测试试剂是否具有AhR拮抗剂活性。例如，如果包含测试试剂和TPO的培养物所生成的Mk和/或血小板多于包含TPO但不包含测试试剂的对照培养物和/或多于包含TPO和已知的AhR激动剂但不包含测试试剂的对照培养物，则可通过该试验确定测试试剂具有AhR拮抗剂活性。
此外，标准生理学、药理学和生物化学方法也可用于测试试剂以鉴定具有调节AhR活性的生物活性的那些物质。这类试验包括例如生物化学试验(如结合试验、荧光偏振试验、基于FRET的共激活因子招募试验(通常参见Glickman等，J.Biomolecular Screening,7No.13-10(2002))以及基于细胞的试验(包括共转染试验))使用LBD-Gal 4嵌合体、蛋白质-蛋白质相互作用试验(参见Lehmann.等，J.Biol Chem.,272(6)3137-3140(1997))和基因表达试验。
高通量筛选系统是市售可得的，参见例如马萨诸塞州霍普金盾的赛玛公司(Zymark Corp.)；俄亥俄州门托的空气技术工业公司(Air Technical Industries)；加州富勒敦的贝克曼仪器公司(Beckman Instruments,Inc.)；马萨诸塞州纳替克的普莱斯系统公司(Precision Systems,Inc.)，其使这些试验在高通量模式下运行。这些系统一般能实现全部步骤的自动化，包括样品和试剂的吸移、液体分配、定时培育和最后在适合该测定的检测器上进行微量滴定板读数。这些可配置系统提供了高通量和快速启动，以及高度灵活性和用户定制化。这些系统的制造商提供各种高通量系统的详细方案。因此，例如，赛玛公司提供有关检测基因转录调节、配体结合等的筛选系统的技术信息。
不需要清洗或液体分离步骤的试验可用于高通量筛选系统并包括生物化学试验，如荧光偏振试验(参见例如Owicki,J.,Biomol Screen 2000年10月；5(5):297)、闪烁迫近试验(SPA)(参见例如Carpenter等，Methods Mol Biol 2002；190:31-49)和荧光共振能量转移(FRET)或基于时间分辨FRET的共激活因子招募试验(Mukherjee等，J Steroid Biochem Mol Biol 2002年7月；81(3):217-25；Zhou等，Mol Endocrinol.1998年10月；12(10):1594-604)。通常可使用全长受体或分离的配体结合结构域(LBD)进行这类试验。
如果可以使用荧光标记的配体，则荧光偏振试验提供了一种检测试剂与AhR结合的方法，该方法包括测量作为痕量标记配体被试剂取代的结果的荧光偏振变化。
还可使用闪烁迫近试验(SPA)，通过评估试剂与对受体具有已知亲和性的放射性标记配体的竞争程度，在均一试验形式中测量试剂与AhR结合的能力。在该方法中，在使放射性标记试剂接近闪烁体(如结合有AhR的含Ysi-铜珠)时，放射性标记试剂发射的放射能会生成光学信号。如果放射性标记试剂被AhR取代，则AhR结合的闪烁体发射的光量减少，这可以使用标准微板液体闪烁板读数仪(例如Wallac MicroBeta读数仪)容易地进行检测。
DNA结合试验可用于评价试剂调节AhR活性的能力。这些试验测量了核受体蛋白(包括AhR)结合已知受AhR调节基因的调控元件的能力。通常，该试验涉及在特定条件下混合能够与AhR相互作用的DNA序列和AhR蛋白，从而能够检测在试剂存在或不存在的情况下AhR蛋白的结合量。在激动剂存在的情况下，AhR结合调控元件。包括但不限于DNA酶足迹、凝胶迁移试验和染色质免疫沉淀的方法可用于测量与调控元件结合的AhR蛋白的量。
通常，可在该试验中将使用这些结合试验之一鉴定为结合AhR的分子直接鉴定为AhR的激动剂或拮抗剂，或者还可在例如基于细胞的试验中进行评估以确定结合试剂是激动剂还是拮抗剂。
除各种基于细胞的试验外，还可在筛选试验中成功地使用各方法以鉴定并表征本文所述试剂的特异性。这些方法包括共转染试验、易位试验和基因表达试验。
共转染试验策略的三种基本变化形式是使用全长AhR的试验、使用嵌合AhR(其包含与异源DNA结合结构域融合的AhR的配体结合结构域)的试验以及基于使用哺乳动物双杂交试验系统的试验。
基本的共转染试验是基于共转染至表达质粒的细胞中以在具有报告质粒的细胞中表达AhR，该报告质粒包含报告基因，其表达处于能够与该核受体相互作用的DNA序列的控制下。使用激动剂处理转染的细胞提高了该报告体的转录活性，其由报告基因的表达增加反映并可通过多种标准方法进行测量。
报告质粒可使用标准分子生物学技术构建，具体方法为将编码报告基因的cDNA置于合适的最小启动子下游。例如，为构建荧光素酶报告质粒，可将编码萤火虫荧光素酶的cDNA置于疱疹病毒胸苷激酶启动子的直接下游(位于胸苷激酶核苷酸序列的核苷酸残基-105至+51处)，其继而与多种应答元件相连。
多种共转染表达和报告质粒的方法是本领域技术人员熟知的并可用于共转染试验以将质粒导入合适的细胞类型。通常，这类细胞不会内源性表达与报告质粒中使用的应答元件相互作用的AhR。
多种报告基因系统是本领域已知的且包括例如碱性磷酸酶(Berger,J.,等(1988)Gene 661-10；Kain,S.R.(1997)Methods.Mol.Biol.6349-60)、β-半乳糖苷酶(参见Nolan等1991年12月3日授权的美国专利号5,070,012和Bronstein,I.,等，(1989)J.Chemilum.Biolum.499-111)、氯霉素乙酰基转移酶(参见Gorman等，Mol Cell Biol.(1982)21044-51)、β-葡糖醛酸糖苷酶、过氧化物酶、β-内酰胺酶(美国专利号5,741,657和5,955,604)、催化抗体、荧光素酶(美国专利5,221,623；5,683,888；5,674,713；5,650,289；5,843,746)和天然荧光蛋白(Tsien,R.Y.(1998)Annu.Rev.Biochem.67509-44)。
将包含AhR的配体结合结构域(LBD)的嵌合体应用于异源DNA结合结构域(DBD)扩展了基于细胞试验的多样性，其将所研究的AhR激活导向为限定的DNA结合结构域所识别的DNA结合元件(参见W095/18380)。在使用天然DNA结合结构域的生物应答或筛选窗不尽如人意的情况下，该试验扩展了基于细胞的共转染试验的应用。
通常，该方法类似于使用基本共转染试验的那些方法，不同之处在于使用嵌合构建体代替全长AhR。对于全长AhR，使用针对AhR LBD的激动剂处理转染的细胞提高了异源DNA结合结构域的转录活性，其反映为上述报告基因表达的升高。通常对于这类嵌合构建体，使用了来自限定的AhR或来自酵母或细菌来源的转录调节因子(如GAL 4和Lex A/UmuD超家族成员)的DNA结合结构域。
用于筛选试剂的第三种基于细胞的试验是哺乳动物双杂交试验，其测量了配体存在的情况下核受体与辅因子相互作用的能力。(例如，参见美国专利号5,667,973、5,283,173和5,468,614)。基本方法是建立三种质粒构建体，使AhR与相互作用蛋白质之间的相互作用与活细胞中的转录读取相结合。第一构建体是用于表达融合蛋白的质粒，该融合蛋白包含相互作用蛋白或者该蛋白质中含有相互作用结构域的一部分，其与GAL4DNA结合结构域融合。第二表达质粒包含编码与强转录激活结构域(如VP16)融合的AhR的DNA，且第三构建体包含报告质粒，其包含具有最小启动子和GAL4上游激活序列的报告基因。
一旦将全部三种质粒导入细胞，第一构建体中编码的GAL4DNA结合结构域允许融合蛋白与最小启动子上游的GAL4位点特异性结合。然而，由于单独的GAL4DNA结合结构域通常不具有强转录激活特性，报告基因的表达仅处于低水平。在配体存在的情况下，AhR-VP16融合蛋白可结合GAL4相互作用蛋白质融合蛋白，从而使强转录激活因子VP16接近报告基因的最小启动子区域和GAL4结合位点。该相互作用显著增强了报告基因的转录，其可对多种上述报告基因进行测量。因此，报告基因的转录受相互作用蛋白质与AhR之间以配体依赖的方式相互作用的驱动。
可以测试试剂诱导核蛋白受体(如AhR)的核定位的能力。在结合激动剂后，AhR从细胞质易位至细胞核。显微技术可用于显示并定量位于细胞核中的AhR量。在一些实施方式中，该试验使用与荧光蛋白融合的嵌合AhR。还可使用AhR特异性抗体和核蛋白提取物可通过western印迹对核AhR进行定量。
还可使用Nothern印迹、RT-PCR、寡核苷酸微阵列分析或高密度cDNA测序以分析RNA水平，从而评估试剂增强或减弱体内已知受AhR调节的基因的表达。Western印迹分析可用于测量AhR靶基因所编码蛋白质的表达。CYP1B1基因的表达受AhR调节。已知受AhR调控的其他基因包括CYP1A1、CYP1A2、TIPARP、ALDH1或ALDH3、TGF-b、VAV3、IL-18、PROM1、EREG、c-myc、EGR1、GSTA1、SFXN1和NQO1。
可通过上文所述方法测试作为AhR调节候选物的任何试剂。虽非必需，但通常以若干不同浓度测试各试剂，并实施一次或多次以使将被检出和识别的受体激活(如果存在)得以最优化。通常各试验进行例如三个重复并且实验误差的变化小于约15％。通常重复三次或更多次各实验，得到类似结果。
在一些实施方式中，可在动物中评价试剂或组合物对AhR基因表达的影响。给予试剂后，可获得多种组织以测定试剂对于直接或间接受AhR调控的活性的影响。
在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。可用于本发明方法的具有AhR拮抗剂活性的分子的非限制性示例包括：
α-萘黄酮；
1,4-二羟基蒽醌(醌茜)；
1.5-二羟基蒽醌(蒽绛酚)；
1.8-二羟基蒽醌(丹蒽醌)；
高良姜精；
白藜芦醇；
2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯基氮杂(o-甲基偶氮苯)-苯基)-胺(也称为“CH-223191”)；
4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚(也称作“SR1”)；
N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(也称为“GNF351”)；
2-(29-氨基-39-甲氧基苯基)-氧杂萘甲醇-4-酮(也称作“PD98059”)；
(Z)-3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基(methylidenyl)]-2-吲哚满酮(也称作“TSU-16”)；
2-(29-氨基-39-甲氧基苯基)-氧杂萘甲醇-4-酮(也称作“PD98059”)；以及
N-[2-(3H-吲哚-3-基)乙基]-9-异丙基-2-(5-甲基-3-吡啶基)嘌呤-6-胺(也称为“GNF351”)。
可用于本发明方法的具有AhR拮抗剂活性的分子的其他非限制性示例描述于WO 2012/015914中并包括2-{[2-(5-溴-2-呋喃基)-4-氧代-4H-色烯-3-基]氧基}乙酰胺(也称作“CB7993113”)和CMLD-2166：
CMLD-2166
在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR激动剂。可用于本发明方法的具有AhR激动剂活性的分子的非限制性示例包括：
6-甲酰基吲哚[3,2-b]咔唑(FICZ)；
多环芳族化合物；
卤化芳族烃；
平面多氯联苯；
嘌呤衍生物；
色氨酸及其代谢物；
脂氧素A4相关类二十烷酸；
靛玉红；
胆红素；
氨基黄酮；
β-萘黄酮；
1H-苯并咪唑；
5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亚磺酰基]苯并咪唑(也称为“奥美拉唑”)；
2-甲基-N-[4-硝基-3-(三氟甲基)苯基]-丙酰胺(也称作“氟他胺”)；
3,3-二吲哚甲烷；
1-烯丙基-7-三氟甲基-H-吲唑-3-基]-4-甲氧基苯酚
4-(3-氯-苯基)-嘧啶-2-基；
2-[[3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氨基]苯甲酸(也称为“曲尼司特”)；
反式-4-[1-(4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基)-2-苯基-1-丁烯基苯酚
2-(4-氯苯基)-4-氧代-4H-色烯-3-基乙基碳酸酯(也称为“CB7950998”)；以及
90282-01-B9(T5838025)。
90282-01-B9(T5838025)
AhR激动剂和拮抗剂所用浓度可根据激动剂或拮抗剂激动或拮抗AhR的效率而变化。通过应用本发明的教导，本领域技术人员能够确定所用AhR激动剂或拮抗剂的适当浓度。
6-甲酰基吲哚[3,2-b]咔唑(FICZ)通常以0.02-2.0μM的浓度用于培养物中的细胞。在一些实施方式中，FICZ以0.04-1.0uM的浓度使用。在一些实施方式中，FICZ以0.1-0.4uM的浓度使用。在一些实施方式中，FICZ以约0.02uM、约0.04uM、约0.06uM、约0.8uM、约0.1uM、约0.11uM、约0.12uM、约0.13uM、约0.14uM、约0.15uM、约0.16uM、约0.17uM、约0.18uM、约0.19uM、约0.2uM、约0.21uM、约0.22uM、约0.23uM、约0.24uM、约0.25uM、约0.26uM、约0.27uM、约0.28uM、约0.29uM、约0.30uM、约0.4uM、约0.5uM、约0.6uM、约0.7uM、约0.8uM、约0.9uM、约1.0uM的浓度使用。
CH223191通常以0.5-50uM的浓度用于培养物中的细胞。在一些实施方式中，CH223191以1.0-25uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以2.5-10uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约1uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约2uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约3uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约4uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约5uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约6uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约7uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约8uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约9uM的浓度使用。在一些实施方式中，CH223191以约10uM的浓度使用。
在一些实施方式中，以组合的方式使用一种以上激动剂和/或拮抗剂。
对于本发明，预期可通过任意方法实现AhR激动作用和/或拮抗作用，包括但不限于通过使用与AhR蛋白自身结合或相互作用的分子，或增强和/或减弱AhR蛋白表达的分子，以及增强和/或减弱AhR信号介导的细胞事件的分子。因此，AhR调节剂还包括质粒、DNA或RNA片段，其本身或者通过其编码的基因产物在转染、转导或进入哺乳动物细胞中后改变AhR表达或功能。
体外分化的造血细胞
在某些实施方式中，本文所述方法能够使细胞培养物与现有方法相比包含更多数目的MEP和更高比例的MEP。例如，发明人已证明，使用本发明的方法培养多潜能干细胞导致细胞培养物每毫升包含至少500,000MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少750,000MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.0x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.1x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.2x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.3x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.4x106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.5x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.6x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.7x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.8x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.9x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少2.0x 106MEP。在一些实施方式中，这类方法不包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养。
在包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养的某些实施方式中，本文所述方法能够使细胞培养物与现有方法相比包含甚至更多数目的MEP和更高比例的MEP。例如，发明人已证明，使用包括在AhR激动剂存在的情况下进行培养的本发明方法培养多潜能干细胞导致细胞培养物每毫升包含至少5x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少7.5x 106MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.0x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.1x107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.2x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.3x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.4x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.5x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.6x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.7x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.8x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1.9x 107MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少2.0x 107MEP。
在某些实施方式中，这些方法还提供了在单一细胞培养物中生成至少1x 106MEP、至少5x 106MEP、至少1x 107MEP、至少5x 107MEP、至少1x 108MEP或至少5x 108MEP。
在某些实施方式中，本方面的方法生成了包含MEP的细胞培养物，其中培养物中全部细胞中的大部分是MEP。在正常、稳态条件下，MEP代表了整个骨髓群体中的小于0.1％。相反地，本发明的方法生成了特定的细胞培养物，其中培养物中至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的细胞是MEP。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含以下情况中的至少1种、至少2种或全部3种：
A)MEP的浓度为至少500,000MEP/ml、至少750,000MEP/ml、至少1.0x 106MEP/ml、至少1.1x 106MEP/ml、至少1.2x 106MEP/ml、至少1.3x 106MEP/ml、至少1.4x 106MEP/ml、至少1.5x 106MEP/ml、至少1.6x 106MEP/ml、至少1.7x 106MEP/ml、至少1.8x 106MEP/ml、至少1.9x 106MEP/ml、至少2.0x 106MEP/ml、至少5x 106MEP/ml、至少7.5x 106MEP/ml、至少1.0x 107MEP/ml、至少1.1x107MEP/ml、至少1.2x 107MEP/ml、至少1.3x 107MEP/ml、至少1.4x 107MEP/ml、至少1.5x 107MEP/ml、至少1.6x 107MEP/ml、至少1.7x 107MEP/ml、至少1.8x107MEP/ml、至少1.9x 107MEP/ml或至少2.0x 107MEP/ml；
B)MEP的总数为至少1x 106MEP、至少5x 106MEP、至少1x 107MEP、至少5x 107MEP、至少1x 108MEP或至少5x 108MEP；以及
C)MEP占培养物中全部细胞的比例为培养物中至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的细胞是MEP。
在一些实施方式中，该培养物还包含血红细胞、巨核细胞和血小板中的至少一种。
在一些实施方式中，通过不包括基于至少一种蛋白质标志物的表达分选细胞的方法制备培养物。
体外分化的造血细胞的治疗性应用
通过本发明方法制备并由本发明提供的血红细胞和血小板可以治疗性应用以向有此需要的患者提供血红细胞和血小板。
血红细胞
血红细胞的常规应用是使因外伤或其他医学问题所致贫血患者恢复血液携氧能力。历史上，其曾作为全血的一部分输送，但在现代实践中，分开输送血红细胞和血浆组分。鉴定用于输注的相容血产品的方法是复杂的并且给予患者不相容的RBC将会致命。
用于输注的血红细胞通常与抗凝血剂混合且通常是提供营养素并保留活细胞功能的储存溶液，其储存于冷藏温度下。对于传统的血红细胞输注，从供体中收集血液后或在收集过程期间通过血液成分分离使细胞与血液的流体部分分离。收集后，产物有时被改性以符合特定患者要求。
进行血红细胞输注的主要原因是治疗贫血。贫血是一种当体内没有足够的携氧血红细胞时发生的病症。这表明身体组织和细胞未得到足够的氧。
一般来说，贫血可由血红细胞生成受损、RBC破坏增加(溶血性贫血)、失血和体液潴留(高血容量症)导致。这些原因中的一些可以相互作用以最终导致贫血。实际上，贫血的最常见原因是失血，但除非发生相对受损的RBC生成，否则通常不会导致任何持续症状。
来源于血红细胞生成受损的贫血可由如下情况导致：干细胞增殖和分化紊乱(其可由单纯的红细胞发育不全、发育不全性贫血、肾衰竭与红细胞生成素生成不足的贫血和内分泌疾病所致贫血导致)、成红细胞增殖和成熟紊乱(其可由恶性贫血、因维生素B12缺乏导致的一种形式的巨成红细胞贫血、叶酸缺乏的贫血、早产的贫血、铁缺乏贫血、地中海贫血、先天性红细胞生成障碍性贫血和肾衰竭的贫血)和其他机制(骨髓病性贫血或骨髓痨、骨髓增生异常综合征和慢性炎症的贫血)。
血红细胞破坏增加所致贫血通常归类为溶血性贫血。这些的一般特征是黄疸和乳酸脱氢酶水平升高。血红细胞破坏增多所致贫血通常由固有(血球内)异常(其可由遗传性球形红细胞症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症、丙酮酸激酶和己糖激酶缺乏、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏和谷胱甘肽合成酶缺乏导致)、血红蛋白病、镰状细胞性贫血、血红蛋白病导致的靶位的血红蛋白、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫疾病和对红细胞的机械外伤(如开放式心脏手术后)导致。
失血所致贫血可在导致急性失血的外伤或手术、导致慢性失血的胃肠道损伤、导致慢性失血的妇科紊乱和月经后发生。
本发明的血红细胞(如使用本发明方法制备的血红细胞)可用于向有此需要的患者(如贫血患者，如本文所述贫血类型的患者)提供血红细胞。通常，可通过以输注组合物(有时称作“浓集红细胞”)的形式进行输注来向患者提供血红细胞。本文所用“输注组合物”是包含血红细胞和提供营养素并保留活细胞功能的其他因子的组合物。在一些实施方式中，输注包含选自抗凝血剂、缓冲剂和营养素的至少一种组分。在一些实施方式中，其是缓冲的溶液，包含至少一种营养素和至少一种抗凝血剂。
在一些实施方式中，该患者需要治疗镰状细胞性贫血。
在一些实施方式中，该患者需要治疗地中海贫血。
在一些实施方式中，该血红细胞与患者血型匹配。
在一些实施方式中，该血红细胞是从体外分化的MEP细胞体外分化的血红细胞。在一些实施方式中，该MEP细胞是从获自患者的MEP前体细胞体外分化的。在一些实施方式中，该MEP细胞是从来源于患者体细胞的iPSC体外分化的。例如，该iPSC是来源于患者体细胞的iPSC，其随后用于制备MEO细胞，其随后任选地用于制备与患者基因组具有高度遗传相同性的血红细胞。在一些实施方式中，该RBC是从分离自患者的RBC前体细胞体外分化的。在一些实施方式中，该RBC前体细胞是例如HSC细胞和MEP细胞中的至少一种。在一些实施方式中，MEP和/或RBC的基因组与患者的基因组具有至少99％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.1％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.2％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.3％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.4％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.5％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.6％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.7％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.8％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.9％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.95％遗传相同性或与患者的基因组相同。
血小板
如果血流中血小板的数目过低，可能发生失血过多。然而，如果血小板的数目过高，可能形成血液凝块(血栓)，其可能阻碍血管并导致某些事件(如中风、心肌梗塞、肺血管阻塞或身体其他部分(如手臂或大腿的末端)的血管阻塞)发生。血小板的异常或疾病称作血小板病，其可以是血小板数目低(血小板减少症)、血小板功能下降(血小板机能不全)或血小板数目增加(血小板增多症)。存在减少血小板数目的疾病，如肝素诱发性血小板减少症(HIT)或血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，其通常导致形成血栓或凝块而非出血。
血小板输注通常给予经历白血病化疗、多发性骨髓瘤、患有再生障碍性贫血、AIDS、脾机能亢进、ITP、败血症、骨髓移植、放疗、器官移植或手术(如心肺转流术)的那些人。
血小板功能降低导致的血小板计数减少可以由至少以下一种原因导致：维生素B12缺乏、叶酸缺乏、白血病、脊髓发育不良综合征、肝衰竭中肝生成的血小板生成素减少、败血症、登革热和遗传综合征(如先天性低巨核细胞性血小板减少症(CAMT)、血小板减少性无桡骨综合征、范科尼贫血、巨血小板综合征、粒细胞异常蓝斑形成、灰色血小板综合征、奥尔波特综合征和威斯科特-奥尔德里奇综合征)。
血小板破坏增加导致的血小板计数减少可以由至少以下一种原因导致：特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、弥散性血管内凝血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、输血后紫癜、新生儿免疫性血小板减少症、脾机能亢进导致的血小板脾隔离症、登革热和HIV相关的血小板减少症。
血小板减少症也可由药物诱导，包括丙戊酸、氨甲蝶呤、卡铂、干扰素、异维甲酸、帕比司他、孟鲁司特钠、H2阻断剂和质子泵抑制剂。
本发明的血小板(例如使用本发明所述方法制备的血小板)可以用于向有此需要的患者(例如血小板减少症患者)提供血小板。通常，通过以输注组合物的形式进行输注来将血小板提供给患者。本文所用“输注组合物”是包含血小板和选自抗凝血剂、缓冲剂和营养素的至少一种第二组分的组合物。
在一些实施方式中，该血小板与患者血型匹配。
在一些实施方式中，该血小板是从体外分化的MEP细胞体外分化的血小板。在一些实施方式中，该MEP细胞是从来源于患者的MEP前体细胞体外分化的。在一些实施方式中，该MEP细胞是从来源于患者体细胞的iPSC体外分化的且该血小板也是从来源于患者的iPSC分化的。例如，该iPSC可以是来源于患者体细胞的iPSC，其随后用于制备MEP细胞，其随后任选地用于制备继而分化为血小板的巨核细胞。在一些实施方式中，该血小板是从分离自患者的血小板前体细胞体外分化的。在一些实施方式中，该血小板前体细胞是例如HSC细胞和MEP细胞中的至少一种。在许多这类实施方式中，巨核细胞与患者的基因组具有高度遗传相同性。在一些实施方式中，MEP和/或血小板的基因组与患者的基因组具有至少99％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.1％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.2％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.3％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.4％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.5％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.6％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.7％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.8％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.9％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99％遗传相同性、与患者的基因组具有至少99.95％遗传相同性或与患者的基因组相同。
使用体外分化的造血细胞进行试剂分析
本发明的方法能够生成大量的MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板。同样，这些方法和由其制备的细胞具有许多特征，其在某些实施方式中能够有利地应用于筛选方法，该筛选方法使用选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型。例如，在一些实施方式中，应用从多潜能干细胞来源分化的选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型可为涉及多种测试试剂的试验提供高度的均一性。在一些实施方式中，至少一种选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的细胞类型分化自多潜能干细胞的来源，其共有至少一种共同遗传因素，所述共同遗传因素选自血型基因型、次要组织相容性抗原基因型和主要组织相容性基因型。在一些实施方式中，选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型分化自多潜能干细胞，所述多潜能干细胞包含彼此之间具有至少99％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.1％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.2％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.3％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.4％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.5％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.6％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.7％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.8％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.9％遗传相同性的基因组、彼此之间具有至少99.95％遗传相同性的基因组或彼此之间相同的基因组。
因此，本发明提供了根据对于选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的效果来筛选测试试剂的方法，该至少一种细胞类型由本发明的方法制备或由本发明提供。在一些实施方式中，该方法包括：a)通过本发明的方法制备选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型；b)使选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型接触测试试剂；以及c)观察选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化。
在一些实施方式中，该方法还包括比较测试试剂存在的情况下选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化与在不包含测试试剂的对照条件下生长的类似细胞。
在一些实施方式中，该方法还包括d)使选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型接触对照试剂；f)观察对照试剂存在的情况下选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化，以及g)比较对照试剂存在的情况下选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化与测试试剂存在的情况下选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化。
在一些实施方式中，测试试剂存在的情况下选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的变化选自细胞增殖速率的变化、细胞死亡率的变化、至少一种基因表达水平的变化和细胞中至少一种蛋白质水平的变化。在一些实施方式中，该变化是毒性标志物水平的变化。在一些实施方式中，该变化选自速率或水平的升高或降低。
在一些实施方式中，可根据对于选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型的效果来筛选测试化合物。例如，如果选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型是由起始细胞制备的，该起始细胞是MEP前体细胞、血红细胞前体细胞、巨核细胞前体细胞和血小板前体细胞中的至少一种。如果前体细胞获自对象，则在许多实施方式中筛选的结果会与对象特别相关。例如，由于选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型会包含与对象基因组非常类似至基本相同的基因组，预期该选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型对化合物在将化合物给予对象后对化合物产生应答，应答方式非常类似于对象体内类似细胞的应答。
因此，在一些实施方式中，通过本发明的方法制备选自MEP、血红细胞、巨核细胞和血小板的至少一种细胞类型包括：从对象处获得MEP前体细胞、血红细胞前体细胞、巨核细胞前体细胞和血小板前体细胞中的至少一种。
AhR调节剂的治疗性应用
如实施例中所示，AhR拮抗作用导致MEP培养物中Mk特化和生成。该实施例还显示，向哺乳动物给予有效量的AhR激动剂增加了哺乳动物的血小板计数。这些数据共同证明，AhR激动作用和拮抗作用都在过程中起作用：AhR激动作用增加了MEP数目，其可随后继续生成更多的Mk和更多的血小板(以及更多的RBC)。此外，AhR拮抗剂似乎作用于非特化的Mk以提高内复制和血小板生成。
因此，本发明提供了增加哺乳动物中血小板计数的方法。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR调节剂。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR激动剂。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR拮抗剂。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR激动剂并向哺乳动物给予有效量的AhR拮抗剂。在一些实施方式中，给予AhR激动剂和AhR拮抗剂，AhR激动剂和AhR拮抗剂是共同给予的。在一些实施方式中，给予AhR激动剂和AhR拮抗剂，AhR激动剂和AhR拮抗剂是分开给予的。增加哺乳动物中血小板计数可有多种用途，包括例如治疗患有血小板减少症和/或具有血小板减少症风险的哺乳动物。因此，本发明还提供了治疗哺乳动物中血小板减少症的方法。在一些实施方式中，这些方法包括给予哺乳动物有效量的AhR激动剂。
本文中治疗方法和增加哺乳动物中血小板计数的方法中使用的药物组合物配制为含有治疗有效量的至少一种AhR受体调节剂。该药物组合物可用于例如以低血小板计数为特征的至少一种疾病状态。
在一些实施方式中，将至少一种AhR受体调节剂配制为合适的药物制剂，如溶液剂、混悬剂、片剂、分散性片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂或酏剂，用于口服给药或胃肠道外给药的无菌溶液或悬浮液中以及透皮贴制剂和干粉吸入器。通常，使用本领域已知的技术和方法将本文所述AhR调节剂配制为药物组合物(参见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms(《药物剂型导论》)，第4版，1985，126)。
在组合物中，有效浓度的一种或多种AhR调节剂或药学上可接受的衍生物与合适的药物运载体或载剂混合。
药学上可接受的衍生物包括酸、碱、烯醇醚和酯、盐、酯、水合物、溶剂合物和前药。选择衍生物使得其药代动力学特性在至少一种特性上优于对应的中性试剂。可在配制前对AhR调节剂进行衍生化。
组合物中AhR调节剂的浓度适用于递送特定量，该量能够在给药后治疗至少一种以例如血小板计数减少和/或正常血小板功能下降为特征的疾病状态的一种或多种症状。
通常，例如但不限于，该组合物配制为单次剂量给药。为配制组合物，将AhR调节剂的重量分数以有效的浓度溶解、悬浮、分散或混合于选择的载剂中，使得治疗的疾病得以缓解或缓和。适用于给予AhR调节剂的药物运载体或载剂包括适用于特定给药方式的任何这类本领域技术人员已知的运载体。
此外，AhR调节剂可配制为组合物中唯一的活性试剂或可与其他活性试剂混合。脂质体混悬剂(包括组织靶向的脂质体)也可用作药学上可接受的运载体。这些制剂可根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，可如美国专利号4,522,811中所述制备脂质体制剂。简言之，可通过在烧瓶内干燥蛋黄磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(摩尔比7:3)来形成脂质体(如多室囊泡(MLV))。添加缺失二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中本发明提供的AhR调节剂的溶液并摇晃烧瓶直至脂质膜分散。清洗所得囊泡以除去未包封的AhR调节剂，通过离心沉淀并随后重悬于PBS中。
活性AhR调节剂被包含在药学上可接受的运载体中，其含量足以在对患者不产生不希望的副作用的情况下起治疗上有用的效果。可在本文和国际专利申请公开号99/27365和00/25134所述的体外和体内系统中通过测试各试剂经验地确定治疗有效浓度，并随后外推至用于人的剂量。
药物组合物中活性AhR调节剂的浓度取决于该活性剂的吸收、失活和排出率、该试剂的生理化学特性、剂量方案和给予的量以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，给予的量足以治疗以血小板计数减少和血小板功能下降中至少一种为特征的至少一种疾病状态。
通常，治疗有效剂量应生成例如约0.1ng/ml至约50-100μg/ml的活性剂血清浓度。该药物组合物通常应提供了每天每千克体重约0.001mg至约2000mg的AhR调节剂，如每天每千克体重约0.01mg至约200mg的AhR调节剂，或每天每千克体重约0.1mg至约20mg的AhR调节剂，或每天每千克体重约1mg至约10mg的AhR调节剂，或每天每千克体重约1mg至约5mg的AhR调节剂。制备了药物剂量单位形式以提供每剂量单位形式约1mg至约1000mg，如约10至约500mg的活性剂或试剂组合。
该活性剂可以一次性给予，或者可以分成多个较小的剂量以时间间隔给予。应理解，精确的剂量和治疗持续时间是待治疗疾病状态的函数，并且可使用已知的测试方法或由体内或体外测试数据外推来根据经验地确定。需要注意的是，浓度和剂量还会根据待缓解的病症严重程度而变化。还应理解，对于任何具体的对象，应当随着时间根据个体的需求以及给予或监督组合物给予的个人的专业判断来调节具体的给药方案，本文所列据的浓度范围仅仅是示例性的，不会对所要求保护的方法的范围或实施方式构成限制。
因此，有效浓度或量的一种或多种AhR X调节剂或其药学上可接受的衍生物与用于全身性、局部性或局部给药的合适药物运载体或载剂混合以形成药物组合物。以特定的量包含AhR调节剂，该量能够有效地治疗以血小板计数减少和/或血小板功能下降为特征的至少一种疾病状态。药物组合物中活性剂的浓度取决于活性剂的吸收、失活和排出率、剂量方案、给药量、特定制剂以及本领域技术人员已知的其它因素。
该组合物旨在通过合适途径给予，包括但不限于口服、胃肠道外、直肠、局部和局部。对于口服给药，可使用胶囊剂和片剂。该组合物可以是液体、半液体或固体状态并以适用于各给药途径的方式配制。
用于胃肠道外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬液可包括任意组合形式的任意以下组分：无菌稀释剂，包括但不限于注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他合适材料制成的单剂量或多剂量小瓶中。
在试剂表现出溶解性不足的情况下，可使用增溶剂的方法。这类方法是本领域技术人员已知的，且包括但不限于使用共溶剂(如二甲亚枫(DMSO))、使用表面活性剂(如)或溶解在碳酸氢钠水溶液中。药学上可接受的试剂衍生物还可用于配制有效的药物组合物。
在混合或添加试剂后，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等。所得混合物的形式取决于多种因素，包括预期的给药方式和所选运载体或载剂中试剂的溶解性。可通过经验确定有效浓度，其足以治疗以血小板计数减少和/或血小板功能下降为特征的至少一种疾病的一种或多种症状。
提供了药物组合物用于以单位剂型给予人和动物，如片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠道外溶液剂或混悬剂和口服溶液剂或混悬剂以及油-水乳液，其含有合适量的试剂或其药学上可接受的衍生物。药物治疗性活性剂及其衍生物通常配制为单位剂型或多重剂型并以上述剂型进行给药。本文中，单位剂型指适于人类和动物对象且如本领域已知单独包装的物理上离散的单位。各单位剂量含有预定量的治疗活性剂，其与所需药物运载体、载剂或稀释剂联用时足以产生需要的治疗效果。单位剂型的示例包括安瓿和注射器和单独包装的片剂或胶囊剂。单位剂型可以逐份给予或给予多份。多重剂型是包装在单个容器内的多个相同的单位剂型，从而以分开的单位剂型形式给予。多重剂型的示例包括小瓶、片剂或胶囊剂瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多重剂型是包装上不分离的多个单位剂型。
除活性剂以外，组合物还可含有以下物质，例如但不限于：稀释剂(如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素)；润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石)以及粘结剂(如淀粉、天然树胶、如阿拉伯胶明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其他这类本领域技术人员已知的粘结剂)。药学上可给予的液体组合物可通过例如以下方式制备：将上文所述的活性提取物以及任选的药用佐剂溶解、分散或混合在运载体(例如但不限于水、盐水、水性右旋糖、甘油、二醇、乙醇等)中，从而形成溶液或悬浮液。如果需要，给予的药物组合物可还包含少量无毒辅助物质，如润湿剂、乳化剂、或增溶剂、pH缓冲剂等，例如但不限于乙酸、柠檬酸钠、环糊精衍生物、单月桂酸去水山梨糖醇酯、三乙醇胺乙酸酯、三乙醇胺油酸酯和其他这类试剂。制备这种剂型的实际方法是已知的，或对于本领域技术人员而言是显而易见的；例如参见Remington's PharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)，美国宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Company)，第15版，1975。在任何情况下，给予的组合物或制剂将含有一定量足以缓解治疗对象的症状的活性试剂。
可制备包含0.005％-100％范围内的活性剂的剂型或组合物，余量由非毒性运载体补足。对于口服给药，可通过掺入任何常用的辅料来形成药学上可接受的无毒性组合物，所述辅料是例如但不限于药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、纤维素衍生物、交联羧甲基纤维素钠、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁或糖精钠。这类组合物包括溶液剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、粉末剂和缓释制剂，例如但不限于植入和微囊化递送系统，和生物可降解、生物相容的聚合物，如胶原、乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸等。用于制备这些组合物的方法是本领域技术人员已知的。设想的组合物含有0.001％-100％活性剂，如0.1-85％，或者如75-95％。可使用运载体制备活性剂或药学上可接受的衍生物，所述运载体保护试剂免于在体内被迅速消除，如延时释放制剂或包衣。该组合物可包含其他活性剂以获得所需的特性组合。AhR调节剂或其药学上可接受的衍生物还可优选地与另一种本领域中已知在治疗以血小板计数减少和/或血小板功能下降为特征的至少一种疾病方面有价值的药剂联用进行给药以用于治疗性或预防性目的。
口服药物剂型包括例如但不限于固体、凝胶和液体。固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和整装粉剂。口服片剂包括压缩、可咀嚼的锭剂和片剂，其可以是肠溶包衣、糖包衣或薄膜包衣的。胶囊剂可以是硬或软的明胶胶囊剂，而颗粒剂或粉末剂可以非泡腾剂或泡腾剂的形式与本领域技术人员已知的其他成分组合一起提供。
在一些实施方式中，制剂可以是固体剂型，如胶囊剂或片剂。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的试剂：粘结剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂和调味剂。
粘结剂的示例包括，例如但不限于，微晶纤维素、黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶、蔗糖和淀粉糊料。润滑剂包括，例如但不限于，滑石、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石松粉和硬脂酸。稀释剂包括，例如但不限于，乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸二钙。助流剂包括，例如但不限于，胶体二氧化硅。崩解剂包括，例如但不限于，交联羧甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括，例如但不限于，任何通过认证的水溶性Fl)和C染料，其混合物和悬浮在氧化铝水合物上的不溶于水的ID和C染料。甜味剂包括，例如但不限于，蔗糖、乳糖、甘露醇和人工甜味剂(如糖精)和任意数目的喷雾干燥调味剂。调味剂包括，例如但不限于，从植物(如水果)中提取的天然调味剂和产生令人愉快感觉的合成的试剂混合物(例如但不限于欧薄荷和水杨酸甲酯)。润湿剂包括，例如但不限于，单硬脂酸丙二醇酯、失水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯十二烷基醚。肠溶包衣包括，例如但不限于，脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、氨化虫胶和乙酸邻苯二甲酸纤维素。薄膜包衣包括，例如但不限于，羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和乙酸邻苯二甲酸纤维素。
如果需要口服给药，可以组合物的形式提供试剂，该组合物保护试剂免于被胃的酸性环境破坏。例如，该组合物可配制为肠溶包衣，其在胃中保持完整性并在肠中释放活性剂。该组合物还可配制为与抗酸剂或其他这类成分联用。
当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含液体运载体(如脂肪油)。此外，剂量单位形式可含有多种其他材料，其修饰剂量单位的物理形式，例如糖和其他肠溶试剂的包衣。这些试剂还可作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂(wafer)、喷洒剂、香口胶等的组分给予。除活性剂外，糖浆剂还可含有作为调味剂的蔗糖和其他防腐剂、染料和着色剂和调味剂。
活性材料还可与不损伤所需作用的其他活性材料混合，或者与补充所需作用的材料混合，如抗酸剂、H2阻断剂和利尿剂。
片剂中包含的药学上可接受的运载体是粘结剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂和润湿剂。由于肠溶包衣，肠溶包衣片剂耐受胃酸并在中性或碱性的肠中溶解或崩解。糖包衣片剂是压缩的片剂，其中施加了不同层的药学上可接受的物质。薄膜包衣片剂是压缩的片剂，其已包被有聚合物或其他合适涂层。多种压缩片剂是通过一个以上压缩循环制备的，其使用先前所述的药学上可接受的物质。着色剂也可用于上述剂型。调味剂和甜味剂用于压缩片剂、糖衣、多重压缩和可咀嚼的片剂。调味剂和甜味剂可用于制备可咀嚼片剂和锭剂。
液体口服剂型包括水性溶液剂、乳液剂、混悬剂、溶液剂和/或由非泡腾颗粒和非泡腾颗粒重建的非泡腾制剂重建的混悬剂。水性溶液剂包括例如酏剂和糖浆剂。乳液是水包油或油包水。
酏剂是澄清、甜味、水醇制剂。酏剂中使用的药学上可接受的运载体包括溶剂。糖浆剂是浓缩的糖(例如蔗糖)的水溶液，并且可含有防腐剂。乳液是双相系统，其中一种液体是分散在整个另一种液体的小球的形式中。乳液中使用的药学上可接受的运载体是非水性液体、乳化剂和防腐剂。混悬剂使用药学上可接受的助悬剂和防腐剂。待重建为液体口服剂型的非泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。待重建为液体口服剂型的非泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和甜味剂可用于任意上述剂型。
溶剂包括，例如但不限于，甘油、山梨糖醇、乙醇和糖浆。防腐剂的示例包括，例如但不限于，甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。用于乳液的非水性液体包括，例如但不限于，矿物油和棉花籽油。乳化剂包括，例如但不限于，明胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、膨润土和表面活性剂(如去水山梨糖醇单油酸酯)。助悬剂包括，例如但不限于，羧甲基纤维素钠、果胶、黄蓍胶、硅酸镁铝和阿拉伯胶。稀释剂包括，例如但不限于，乳糖和蔗糖。甜味剂包括，例如但不限于，蔗糖、糖浆、甘油和人工甜味剂(如糖精)。润湿剂包括，例如但不限于，单硬脂酸丙二醇酯、失水山梨糖醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯十二烷基醚。有机酸包括，例如但不限于，柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括，例如但不限于，碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括，例如但不限于，任何通过认证的水溶性FD和C染料，及其混合物。调味剂包括，例如但不限于，从植物(如水果)中提取的天然调味剂和产生令人愉快感觉的合成的试剂混合物。
对于固体剂型，将例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或悬浮液包封在明胶胶囊中。这类溶液及其制备和包封公开于美国专利号4,328,245、4,409,239和4,410,545。对于液体剂型，使用足量的药学上可接受的液体运载体(如水)稀释例如聚乙二醇中的溶液，使其易于测量以进行给药。
或者，液体或半固体口服制剂可通过以下方式制备：将活性剂或盐溶解或分散在植物油、二醇、甘油三酯、丙二醇酯(例如碳酸丙烯酯)和其他这类运载体中，并将这些溶液或悬浮液包封到硬或软明胶胶囊壳中。其他有用的制剂包括美国专利号Re 28,819和4,358,603所列的那些。简言之，这类制剂包括但不限于含有下述物质的那些制剂：本发明提供的试剂、二烷基化单或聚烷撑二醇(包括但不限于1,2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的近似平均分子量)和一种或多种抗氧化剂(如丁羟甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨糖醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯和二硫代氨基甲酸酯/盐)。
其他制剂包括但不限于：包含药学上可接受的缩醛的水性醇溶液。这些制剂中使用的醇是任意药学上可接受的具有一个或多个羟基的水混溶性溶剂，包括但不限于丙二醇和乙醇。缩醛包括但不限于低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，如二乙醇缩乙醛(acetaldehyde diethyl acetal)。
可以如本领域技术人员已知的那样对片剂和胶囊剂进行包衣以修饰或维持活性成分的溶解。因此，例如且不限于，可使用常规的肠溶可消化包衣(如水杨酸苯酯、蜡和乙酸邻苯二甲酸纤维素)对其进行包衣。
对于通常以注射为特征的胃肠道外给药，本发明还包括皮下、肌肉内和静脉内。可以常规形式制备注射剂，作为液体溶液或悬浮液、适用于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式或作为乳液。合适的赋形剂包括，例如但不限于，水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果需要，待给予的药物组合物还可含有少量的非毒性辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂和其他这类试剂，例如乙酸钠、去水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
本发明还包括缓释或延释系统的植入，从而维持恒定的剂量水平(参见例如美国专利号3,710,795)。简言之，AhR调节剂分散在固体内部基质中，所述固体内部基质是例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑尼龙、增塑聚对苯二甲酸乙二醇酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙二醇、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、碳酸硅共聚物、亲水聚合物(如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶)、胶原、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外部聚合物膜围绕，所述外部聚合物膜是例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、乙酸乙烯酯与氯乙烯共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离子交联聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡胶、表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物，其不溶于体液。试剂在释放率控制步骤中扩散通过外部聚合物膜。这种胃肠外组合物中包含的活性剂的百分数高度依赖于其特殊性质，以及试剂的活性和对象的需要。
胃肠道外给予AhR调节剂包括静脉内、皮下和肌肉内给予。用于胃肠道外给药的制剂包括准备注射的无菌溶液、无菌干燥可溶性产品(如冻干的粉末)、准备在使用前与溶剂混合的物质(包括皮下片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与载剂混合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳液。该溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠和增溶剂(葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
胃肠道外制剂中使用的药学上可接受的运载体包括水性载剂、非水性载剂、抗微生物剂、等渗剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬和分散剂、乳化剂、掩蔽或螯合剂和其他药学上可接受的物质。
水性载剂包括，例如但不限于，氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳糖化林格注射剂。非水性载剂包括，例如但不限于，植物来源的非挥发油、棉花籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必须向多重剂量容器中包装的胃肠道外制剂中添加抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，其包括苯酚或甲酚、柳硫汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括，例如但不限于，氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(80)。金属离子的掩蔽或螯合剂包括EDTA。药用运载体还包括，例如但不限于，用于水混溶性载剂的乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可调节药用活性剂的浓度，使得注射剂可提供有效量以产生所需的药用效果。精确的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和病症，这是本领域已知的。
单位剂量胃肠道外制剂包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。用于胃肠道外给药的制剂应该是无菌的，如本领域已知和实践的那样。
示例性地，静脉内或动脉内输注含有活性剂的无菌水溶液是有效的给药方式。另一个实施方式是按需要注射含有活性剂的无菌水性或油性溶液或悬浮液以产生所需的药用效果。
设计注射剂以用于局部和全身性给药。通常，治疗有效的剂量配制为含有至少约0.1％w/w至最多约90％w/w或更高的浓度，如超过1％w/w的活性剂，递送至受治疗的组织。该活性剂可以一次性给予，或者可以分成多个较小的剂量以时间间隔给予。应理解，精确的剂量和治疗持续时间是待治疗组织的函数，并且可使用已知的测试方法或由体内或体外测试数据外推来经验地确定。需要注意的是，浓度和剂量还会根据待治疗个体的年龄而变化。还应理解，对于任何具体的对象，应当随着时间根据个体的需求以及给予或监督制剂给予的个人的专业判断来调节具体的给药方案，本文所列据的浓度范围仅仅是示例性的，不会对所要求保护的制剂的范围或实施方式构成限制。
试剂可以微粉化或其他合适的形式悬浮，或者可以衍生化，例如以产生更可溶的活性产物或产生前药或其他药学上可接受的衍生物。所得混合物的形式取决于多种因素，包括预期的给药方式和所选运载体或载剂中试剂的溶解性。有效浓度足以缓解病症的症状并可通过经验确定。
可重建冻干粉末以作为溶液、乳液或其他混合物或制备为固体或凝胶进行给药。
通过在合适的溶剂中溶解本发明通过的试剂或其药学上可接受的衍生物来制备无菌、冻干的粉末。该溶剂可含有赋形剂，其提高了粉末或由粉末制备的重建溶液的稳定性或其他药理性质。可使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和其他合适的试剂。该溶剂还可含有缓冲剂，如柠檬酸、磷酸钠或磷酸钾或其他这类本领域技术人员已知的缓冲剂，其通常是约中性pH。所需的制剂由依次无菌过滤溶液随后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干而提供。通常，将所得溶液分配至小瓶中进行冻干。各小瓶含有，例如但不限于，试剂的单次剂量(10-1000mg，如100-500mg)或多次剂量。冻干的粉末可在适当条件下储存，如在约4℃至室温下。
使用注射用水重建该冻干粉末提供了胃肠道外给药中使用的制剂。对于重建，向每毫升无菌水或其他合适运载体中添加约1-50mg(如约5-35mg，例如约9-30mg)冻干粉末。精确量取决于所选试剂。可通过经验确定这类量。
如描述的那样制备局部混合物用于局部和全身性给药。所得混合物可以是溶液剂、混悬剂、乳液剂等并配制为乳膏剂、凝胶剂、油膏剂、乳液剂、溶液剂、酏剂、洗剂、混悬剂、酊剂、糊料剂、泡沫剂、气溶胶剂、滴灌剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何其他适用于局部给药的制剂。
试剂或其药学上可接受的衍生物可配制为气溶胶剂用于局部应用，如通过吸入(参见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用于递送治疗炎性疾病(特别是哮喘)的类固醇的气溶胶剂)。这些用于给药至呼吸道的制剂可以是用于喷雾器的气溶胶或溶液形式，或是用于吹入的微细粉末，其单独给予或与惰性运载体(如乳糖)联用。在这类情况下，制剂的颗粒将，例如但不限于，具有小于约50微米的直径，例如小于约10微米。
试剂可配制为用于局部应用，例如用于以凝胶剂、乳膏剂和洗剂的形式局部应用至皮肤和粘膜(如眼中)或应用至眼或用于脑池内或脊柱内应用。局部给药被考虑为透皮递送并还可考虑为给予至眼或粘膜，或用于吸入治疗。还可给予单独或与其他药学上可接受的赋形剂联用的活性剂的鼻溶液。
这些溶液，特别是旨在进行眼科应用的那些，可以配制为，例如但不限于，约0.01％至约10％等渗溶液，pH为5-7，具有适当的盐。
本发明还包括其他给药途径，如透皮贴片和直肠给药。
透皮贴片，包括离子电渗和电泳装置，是本领域技术人员熟知的。例如，这类贴片公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957。
用于直肠给药的药用剂型是用于全身性作用的直肠栓剂、胶囊剂和片剂。本文使用的直肠栓剂指用于插入直肠的固体，其在体温下熔解或变软从而释放一种或多种药理学或治疗性活性成分。用于直肠栓剂的药学上可接收的物质是基料(base)或提高熔点的试剂和载剂。基料的示例包括可可油(可可豆油)、甘油-明胶、碳蜡(聚氧乙烯二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可使用多种基料的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鳕鱼肝油和蜡。可通过压缩方法或通过模塑制备直肠栓剂。直肠栓剂的典型重量是，例如但不限于，约2-3gm。
使用相同的药学上可接受的物质并通过与口服给药制剂相同的方法制备用于直肠给药的片剂和胶囊剂。
AhR调节剂或其药学上可接受的衍生物还可配制为靶向待治疗对象身体的特定组织、受体或其他区域。许多这类靶向方法是本领域技术人员熟知的。本发明中包括这类靶向方法以用于即用型组合物。对于靶向方法的非限制性示例，参见例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在一些实施方式中，脂质体悬浮液(包括组织靶向脂质体，如肿瘤靶向脂质体)也适合用作药学上可接受的运载体。其可根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，可如美国专利号4,522,811中所述制备脂质体制剂。简言之，可通过在烧瓶内干燥蛋黄磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(摩尔比7:3)来形成脂质体(如多室囊泡(MLV))。添加缺失二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中本发明所提供试剂的溶液并摇晃烧瓶直至脂质膜分散。清洗所得囊泡以除去未被包封的试剂，通过离心沉淀并随后重悬于PBS中。
该方法中使用的AhR调节剂或药学上可接受的衍生物可包装为制品，其含有包装材料、该包装材料内的AhR调节剂或其药学上可接受的衍生物(其可有效地调节AhR活性或治疗以血小板计数减少和/或血小板功能下降为特征的至少一种疾病状态的一种或多种症状)和标记物(其用于显示AhR调节剂或组合物或其药学上可接受的衍生物被用于调节AhR的活性以治疗以血小板计数减少和/或血小板功能下降为特征的至少一种疾病状态的一种或多种症状)。
本发明提供的制品含有包装材料。用于包装药用产品的包装材料是本领域技术人员已知的。参见美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药用包装材料的示例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、包、小瓶、容器、注射器、瓶和任何适用于所需制剂和期望的给药和治疗方式的包装材料。
实施例
以下实施例用于更完整地描述本发明的使用方式。这些实施例用于说明目的，而不应用于限制本发明的真正范围。
实验方法
iPSC衍生和培养条件
通过转导hSTEMCCA慢病毒来实现iPSC衍生。如先前所述，通过将编码人OCT4、KLF4、SOX2和cMYC的cDNA连接至pHAGE慢病毒质粒中来构建hSTEMCCA慢病毒载体(Somers,A.等，Generation of transgene-free lungdisease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviralstem cell cassette(使用单个可切除慢病毒干细胞盒生成无转基因肺疾病特异性人诱导性多潜能干细胞).Stem Cells28,1728-1740(2010))。通过共转染五个质粒将慢病毒包装在293T细胞中并具有先前公开的超速离心实验方案进行浓缩(Sommer,C.A.等，Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential ofiPS cells generated with a single excisable vector(重编程转基因的切除提高了单个可切除载体所生成的iPS细胞的分化潜能).Stem Cells28,64-74(2010)；Sommer,C.A.等，Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette(使用单个慢病毒干细胞盒生成诱导性多潜能干细胞).Stem Cells27,543-549(2009))。外周血单核细胞(PBMC)用作iPSC生成的源材料。从参与人员抽取外周血(4ml)至BD真空药瓶中(362760)。将样品在37℃下以1800rcf离心25分钟，并将所得暗黄层收集至15ml Falcon管中。使用PBS清洗细胞并进行细胞计数以确保分离了1x10^6个细胞以用于培养。将细胞重悬于2ml的扩增培养基中，其由QBSF-60(定量生物公司(Quality Biological)160-204-101)、50ng/ml hSCF(R&D公司255-SC-010)、10ng/ml hIL-3(R&D公司203-IL-010)、2U/ml hEPOgen(安进公司(Amgen))、40ng/ml hIGF-1(R&D公司291-GI-050)、50ug/ml抗坏血酸(西格玛公司(Sigma)A4403)、100ug/ml原代细胞抗生素(Primocin)(英韦沃基公司(Invivogen)ant-pm-2)和1μM地塞米松(西格玛公司(Sigma)D4902)组成。8-9天后，向培养基中添加聚凝胺(5ug/ml)并以范围为1-10的MOI向培养物中添加hSTEMCCA慢病毒。24小时后，将接种的培养物以2250g离心90分钟并弃去聚凝胺培养基。随后将细胞置于经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)上并在“iPSC培养基”培养约15天，该iPSC培养基包含DMEM F12(英杰公司(Invitrogen)11330057)、10ng/ml bFGF(R&D公司233-FB-025)、1ng/ml Rho激酶抑制剂(卡曼化学公司(Cayman Chemical)10005583)、20％无血清替代物(KOSR)(英杰公司10828028)和100ug/ml原代细胞抗生素。随后挑取克隆并扩大至长期培养物中。
将iPSC定向分化为中胚层细胞命运
将高传代的iPSC置于基质胶包被的6孔版上在iMEF上适应24小时并补充有2ng/ml Rho激酶抑制剂和20ng/ml bFGF的iPSC培养基中。两天后，使用中胚层D0-1培养基代替iPSC培养基，该中胚层D0-1培养基是：补充有5ng/ml hBMP-4(R&D公司314-BP-010)、50ng/ml hVEGF(R&D公司293-VE-010)、25ng/mlhWnt3a(R&D公司287-TC-500)和10％KOSR的RPMI(英杰公司A1049101)。在第2天时，使用中胚层D2培养基代替中胚层D0-1培养基，该中胚层D2培养基是补充有5ng/ml hBMP-4、50ng/ml hVEGF、20ng/ml bFGF和10％KOSR的RPMI。中胚层D3培养基由以下物质组成：StemPro 34(英杰公司10639011)、5ng/mlhBMP-4、50ng/ml hVEGF和20ng/ml bFGF。用于第4和第5天的中胚层培养基由以下物质组成：StemPro 34、15ng/ml hVEGF和5ng/ml bFGF。第6天中胚层培养基：74％IMDM(英杰公司12330061)、24％Hams F12(密迪亚泰克公司(Mediatech)10-080-CV)、1％B27补充剂(英杰公司12587-010)、0.5％N2-补充剂(英杰公司17502-048)、0.5％BSA(西格玛公司A3059)、50ng/ml hVEGF、100ng/ml bFGF、100ng/ml hSCF(R&D公司255-SC-010)、25ng/ml hFlt3配体(R&D公司308-FKN-005)。第7天培养基：24％Hams F12、1％B27补充剂、0.5％N2-补充剂、0.5％BSA、50ng/ml hVEGF、100ng/ml bFGF、100ng/ml hSCF、25ng/ml hFlt3配体、50ng/ml hTPO(基因泰克公司(Genentech G140BT))、10ng/ml IL-6(R&D公司206-IL-010)、0.5U/ml hEPOgen和0.2uM 6-甲酰吲哚[3,2-b]咔唑(FICZ)(圣克鲁兹公司(Santa Cruz)SC300019)。第7天后，每天向培养物中添加.5ml的第7天培养基而不吸除前一天的培养基。所有基底培养基化合物都包含2mM L-谷氨酰胺(英杰公司25030081)、4x10^-4M单硫代甘油(西格玛公司M1753)、100ug/ml原代细胞抗生素和50ug/ml抗坏血酸。在第10-13天时收集悬浮液中的细胞并分析或者分装以进行长期培养。
慢病毒载体生成和应用
设计PCR引物以扩增来自AHR活性报告构建体pGudLuc1.1的MMTV-DRE(小鼠乳腺肿瘤病毒/来自鼠CY1A1基因的二噁英应答元件区)的启动子区，其中5’和3’末端分别具有整合的SpeI和NotI切割位点。随后通过切除Ef1α启动子并与SpeI和NotI消化的MMTV-DRE连接来将限制型酶消化的PCR产物插入pHAGE2慢病毒Ef1α-dsRed(NLS)-IRES-ZsGreen质粒和pHAGE2慢病毒Ef1α-去稳定化ZsGreen。此外，将AHR抑制子克隆至pHAGE2慢病毒Ef1α-dsRed(NLS)-IRES-ZsGreen。设计引物以从基于HPV422的构建体扩增底鳉(f.heteroclitus)AHRR编码区，其中5’和3’位点分别整合有NotI/BamHI切割位点。切除dsRed(NLS)插入并将消化的AHRR连接至前述载体。
如先前所公开的那样对VSV-G假型慢病毒颗粒进行包装和浓缩(Murphy,G.J.,Mostoslavsky,G.,Kotton,D.N.和Mulligan,R.C.Exogenous control of mammaliangene expression via modulation of translational termination(通过调节翻译终点对哺乳动物基因表达的外源性控制).Nat Med.12,1093-1099.Epub 2006Aug 1096.(2006))。将细胞感染过夜并随后通过本文所述的荧光显微镜和流式细胞术监测dsRed和ZsGreen基因表达。
AHR小分子竞争试验
AHR小分子激动剂6-甲酰吲哚[3,2-b]咔唑(FICZ)和AHR竞争型抑制剂CH223191用于这些试验。在第6天以5uM(1x)和2.5uM(0.5x)将CH223191添加至中胚层培养物。在第7天将0.2uM FICZ添加至培养物并每天添加培养基。DMSO用作载剂对照。
定量RT-PCR
根据生产商说明书使用RNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取RNA并使用无DNA试剂盒(安碧公司(Ambion)AM1906)进行DNA酶处理。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)4368814)进行逆转录以生成cDNA。使用针对AHR(Hs00169233_m1)、CYP1B1(Hs002382916_s1)、HBA(Hs00361191_g1)、HBB(Hs00758889_s1)、HBG(Hs01629437_s1)、vWF(Hs00169795_m1)、PF4(Hs00427220_g1)、NF-E2(Hs00232351_m1)和CD62P(Hs00927900_m1)的Taqman探针进行cDNA的定量(实时)PCR扩增并在应用生物系统公司StepOne仪器上运行。针对β-肌动蛋白(Hs99999903_m1)对相对基因表达进行标准化。
流式细胞术
将约10^5个细胞收集、离心并重悬于含0.5％BSA的PBS中。将样品在室温下与人抗体(包括CD41a-FITC(BD 555466)、CD235-PE(BD 555570)、CD71-FITC(BD 555536))孵育30分钟，清洗并3300rpm离心7分钟，并重悬于具有碘化丙啶的含0.5％BSA的PBS中。使用Cellquest Pro软件在BD FACScalibur上运行样品并通过FloJo 8.7分析。对于倍性分析，使用含1.5％NP-40(波士顿生物制品公司(Boston Bioproducts)P-872)和62.5ug/ml碘化丙啶的PBS处理细胞，之后立即进行FACScalibur解调。对于鼠骨髓，样品首先在室温下与鼠偶联的抗体CD16/32(BD 553142)孵育5分钟，之后与c-Kit-PE(BD 553355)、CD41a-FITC(BD 553848)、Ter119-PE(BD 553673)孵育30分钟。对于细胞活力试验，收集2-3x 10^5个细胞，重悬在补充有5％FBS的含8.8ug/ml Hoecsht 33342的PBS中。随后将样品在黑暗中37℃孵育15分钟，清洗并重悬于含1ug/ml碘化丙啶的5％FBS中。使用FACSDiva软件在LSR-II仪器上运行样品并通过FloJo 8.7分析。
基因表达分析
分析的数据对应于从dMAP网站(www.broadinstitute.org/dmap)下载的RMA加工、批次标准化的表达概况。这包括代表15个不同造血细胞群体(38个子群体)的212个实验中8958个Entrez标注基因的表达水平。该数据被投射到37个手动标记的AhR靶标加AhR本身和对应于定义HSC至Mk/红系细胞分化途径的5个群体(11个子群体)的72个实验的空间。基于分级群聚对基因进行分选，其中以1-皮尔森相关作为距离度量，并以平均连锁作为聚类规则(Eisen,M.B.,Spellman,P.T.,Brown,P.O.和Botstein,D.Cluster analysis and display ofgenome-wide expression patterns(全基因组表达模式的聚类分析和显示).Proc NatlAcad Sci U SA95,14863-14868(1998))(图1a)。通过盒须图对经标准化的各细胞群体(子群体)中AhR表达水平进行计算机化和显示(图1b)。对于各群体，该图报道了AhR数值分布的中值(粗中线)、中半部分(盒)和四分位差(IQR，“须”之间的距离)。通过标准方差分析(anova)测试各细胞群体间AhR表达水平的差异。
统计学分析
结果表示为三次重复实验的平均值±标准差。用斯氏t检验确认统计学显著性。
体内研究
使用逐周剂量递增方案(第1周：1mg/kg；第2周：2mg/kg；第3周：4mg/kg)每天使用悬浮在植物油中的FICZ对C57Bl6小鼠进行腹膜内注射。在所有三个时间点(第7、14和21天)对外周血进行Hemavet定量血细胞技术，以测定血细胞计数。3周时间点后，处死小鼠并收获肝和脾用于定量RT-PCR分析。
实施例1：人造血细胞分化基因组作图(dMap)数据的分析
作为评估AhR受体在造血细胞中可能功能的路线图，我们分析了“dMAP”数据集(www.broadinstitute.org/dmap)(Novershtern,N.等，Densely interconnectedtranscriptional circuits control cell states in human hematopoiesis(密集相互联系的转录回路控制人造血作用中的细胞状态).Cell144,296-309(2011))，这是一个可从公共渠道获得的来自71种不同的纯化的人造血细胞群体的表达概况纲要。出于我们的目的，我们关注HSC至Mk/红系细胞分化路径，并且我们分析了推定的AhR靶标的人工监管列表的表达。进行分级聚类以评价AhR及其靶标的共表达模式。该分析显示，从HSC至MEP细胞阶段，上调的原始干细胞中Ahr mRNA表达(图1)。红系细胞聚集为2个细胞组，其具有上调或下调的Ahr。Mk中Ahr水平持续上调。约14种推定的AhR靶基因(包括显著输入干细胞的若干基因，如c-myc、EGR1和ALDHA1)的水平相对Ahr水平协同地受到调节。其他重要的造血特异性基因(如NFE2，一种红系和Mk系的关键调节因子)也显示相对Ahr的协同差异表达。这些结果证明Ahr表达在造血祖细胞中明显并表明AhR在人双潜能MEP的发育过程中起重要作用。这些数据清楚地显示了人造血系统中的AhR表达，使我们得出以下假说：可在体外系统中利用AhR激活作用以大幅增强并指导造血祖细胞的生成和分化。
实施例2：从诱导性多潜能干细胞(iPSC)中生成巨核细胞-红系祖细胞(MEP)
该实施例显示了从诱导性多能潜干细胞(iPSC)至巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的无饲养细胞、化学限定生成过程，并证明这些细胞表达巨核细胞和红细胞系的特定标志物。我们希望开发一种新颖、无饲养细胞、化学限定的系统，用于从人iPSC生成造血祖细胞，该系统无需使用基质细胞系或异源试剂，并且会导致能够生成多种临床相关、高纯度造血细胞。该平台开发中使用的方法遵循发育的胚胎所提供的路线图。由于ESC和iPSC类似于早期囊胚胚胎中的多潜能、未分化细胞，可使用早期胚胎中活跃的信号指导ESC和iPSC的体外分化。由于人拟胚体形成过程中已知的变异性(Bratt-Leal,A.M.,Carpenedo,R.L.和McDevitt,T.C.Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem celldifferentiation(对拟胚体微环境进行工程改造以指导胚胎干细胞分化)Biotechnology progress25,43-51(2009))，我们的实验方案使用优化的2D培养系统以在10-13天内生成双潜能造血祖细胞(图2A)。该平台中的关键要素是在第7天使添加强AhR配体FICZ。生成MEP的时间范围显著短于前述实验方案中所述的那些(Takayama,N.等，Generation of functional platelets from human embryonicstem cells in vitro via ES-sacs,VEGF-promoted structures that concentratehematopoietic progenitors(通过浓缩造血祖细胞的ES囊、VEGF促进的结构从人胚胎干细胞中体外生成功能性血小板)Blood111,5298-5306(2008)；Gekas,C.和Graf,T.Induced pluripotent stem cell-derived human platelets:one step closer to the clinic(诱导性多潜能干细胞衍生的人血小板：向临床再近一步)The Journal ofexperimental medicine207,2781-2784(2010))并且不需要任何细胞分级或进一步处理细胞。在该系统中，分化的iPSC生成基于内皮细胞的粘附层，其中非粘附性造血细胞在第7天时开始从其中产生(图2A)。如第15天时的免疫表型分析所判断的那样，这些细胞中超过50％具有CD235-血型糖蛋白A(红细胞系)和CD41(Mk系)共表达，表明已生成双潜能MEP(图2B)。与未分化的iPSC相比，这些细胞还上调了球蛋白基因表达并表达了一系列标志性Mk标志物(图2D)。此外，通过使用含有EPO的红系细胞特化培养基和含有TPO的Mk特化培养基，iPSC衍生的MEP经历最终命运选择以成为阐述的红细胞或Mk(图2C)。
实施例3：芳基烃受体(AhR)激动剂FICZ允许iPSC来源的MEP进行指数扩增
由于无法生成足够的、临床相关量的细胞，iPSC技术向临床应用的转化受阻。甚至对于基础研究，可通过iPSC的直接分化生成的造血细胞的数目和质量也会受到限制(Chang,K.H.,Bonig,H.和Papayannopoulou,T.Generation andcharacterization of erythroid cells from human embryonic stem cells and inducedpluripotent stem cells:an overview(来自人胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞的红系细胞的生成和表征：综述)Stem Cells Int.2011,791604.Epub 792011年10月791626.(2011))。本文中，我们证明AhR激动剂FICZ能够使iPSC衍生的MEP进行指数扩增。与未处理的对照样品相比，通过溴化丙啶染色和Hoecsht染料排除法判断，FICZ处理的第30天MEP表现出显著较少的细胞死亡，从而允许该群体进行指数扩增(图3A和B)。如这些图中所示，FICZ处理的细胞具有增强的活力并且其中经历凋亡的细胞较少。还在FICZ存在或不存在的情况下使15天MEP生长并计算各群体的生长速率。与未处理的细胞相反，FICZ处理的MEP在2周生长期间中显示对数扩增(图3C)。
在随后的实验中，在30天MEP中掺入N-乙基-N-亚硝基脲(EDU)以比较FICZ处理的MEP和对照未处理的MEP的增殖。EDU是一种标记化学品，其插入细胞的DNA中并显示增殖痕迹。如图3D所示，已使用AhR激动剂FICZ处理的第30天MEP的增殖性远高于未处理的细胞。
实施例4：AhR激动剂诱导人iPSC和MEP中的CYP1B1靶基因表达
为表征未分化的iPSC和直接分化的MEP中的AhR表达和功能，在这些群体中通过Western印迹测定AhR蛋白水平。AhR在第30天和第60天MEP中强力表达(图4A)。然而，在iPSC群体中通过western印迹无法检测到AhR蛋白，我们假定AhR在iPSC中以极低水平表达，即低于使用Western印迹所用抗体能够检测的水平。未测试该假说，通过定量RT-PCR评估了iPSC或作为阳性对照的MEP中FICZ诱导标准AhR靶基因CYP1B1的能力。使用FICZ处理后，未分化的iPSC和直接分化的MEP都显示统计学显著的CYP1B1表达增加，强烈表明AhR受体实际上在这些细胞中表达(图4B)。值得注意的是，这些细胞群体还对其他AhR激动剂(包括原型环境AhR配体，2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD))产生应答(图13)。
实施例5：AhR介导双潜能造血祖细胞的扩增和特化
为定量可能由内源性AhR配体介导的AhR转录活性，我们将人AhR应答启动子(67,68)克隆至编码核定位dsRed和ZsGreen或荧光素酶和ZsGreen的慢病毒报告载体中(图5A)。这些双重基因“AhR报告体”允许转导效率的标准化、消除自发荧光的任何影响并允许量化AhR转录活性。以10的多重性感染(MOI)使用报告慢病毒转导或模拟感染第30天MEP并使其在含有0.2μM FICZ的基础培养基中生长72小时。随后在三种不同生长条件下生长MEP以评估该细胞群体中AhR的活性：1)由0.2μM FICZ组成的稳态条件；2)FICZ浓度增加至0.4μM；或3)0.2μMFICZ加5μM已知的AhR抑制剂CH223191(Kim,S.H.等，Novel compound2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide(CH-223191)prevents 2,3,7,8-TCDD-induced toxicity by antagonizing the arylhydrocarbon receptor(新颖的化合物2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(2-甲基-4-邻甲苯基氮杂-苯基)-胺)(CH-223191)通过拮抗芳基烃受体防止了2,3,7,8-TCDD诱导的毒性)Mol Pharmacol.69,1871-1878.Epub 2006年3月1815.(2006))。与模拟感染的MEP相反，AhR报告体感染的群体显示dsRed表达的适度增加，表明报告体中二噁英应答元件在MEP中被反式激活(图5B)。在对报告体感染的MEP使用增量的AhR激动剂FICZ(0.4μM)时，注意到DsRed表达显著升高，表明FICZ能够在原代、iPSC衍生的、直接分化的MEP中反式激活AhR受体(图5B、5C)。还通过免疫荧光显微镜在视觉上确认了该结果，其中仅在使用0.4μM FICZ处理的MEP中观察到ZsGreen+细胞(图5D)。重要的是，在对报告体感染的群体使用含5μM已知AhR抑制剂CH223191的生长培养基时，观察到DsRed表达的显著下降(低于模拟感染的群体中的表达水平)，进一步表明FICZ介导的转录活性在iPSC衍生、直接分化的MEP中是通过AhR受体调节的(图5B)。使用编码荧光素酶慢病毒主链定量地确定了这些结果(图5C)。
为确定FICZ介导的AhR受体反式激活是否造成iPSC延时的MEP的指数扩增，使用已知的AhR抑制剂CH223191进行先前所述的Hoecsht/溴化丙啶凋亡试验。如前文中图3所示，FICZ处理后较少的细胞被溴化丙啶染色(例如15.5％对比8.09％)(图5E)。相反地，在使用5μM CH223191对细胞预处理24小时时，PI+细胞的百分比与载剂或FICZ处理的培养物基本相同。没有观察到CH223191+FICZ处理的细胞的显著扩增。有趣的是，在添加FICZ前使用较低剂量的抑制剂(2.5μM)预处理细胞时，细胞仍然能够扩增，表明iPSC衍生、直接分化的MEP中该激动剂/拮抗剂相互作用和AhR受体的结合是剂量依赖的(图5E)。通过qRT-PCR测试CH223191阻断诱导CYP1B1的能力，从而确认其效力(图5F)。
实施例6：连续的AhR激活促使血红细胞成熟而抑制/拮抗作用促进巨核细胞发育
先前的研究表明，AhR在造血细胞发育和功能中其关键作用，可能包括造血干细胞的生长和分化。已证明AhR激活导致MEP群体的指数扩增(图3)，我们随后试图确定AhR是否也有助于MEP分化为RBC或巨核细胞。基于造血发育期间AhR的已提出但尚不清楚限定的功能，我们进行了一系列实验以阐明AhR在双潜能造血祖细胞及其所得后代中的功能。
在我们先前的研究中，我们注意到iPSC衍生的MEP的指数扩增(图3)，我们注意到的AhR介导的效果使我们能够在延长的时间(大于120天)内培养细胞。FICZ存在的情况下在无饲养细胞添加中维持的MEP的免疫表型表明连续的AhR激动作用下存在逐步的红系细胞特化和成熟。如图6A所示，大部分早期传代(第15天)iPSC衍生的MEP表达CD71(转铁蛋白受体)，而这些细胞中的小部分还表达CD235(血型糖蛋白A)，显示未成熟红细胞表型。在长时间接触FICZ(30天)的条件下，这些细胞开始下调CD71的表达且较多比例的细胞表达CD235，显示较成熟的表型(图6A)。由于这些细胞在具有AhR激动作用的基本生长条件下持续特化为红系细胞，持续成熟导致生成含有少量巨核细胞系细胞的较均一群体。该群体几乎是完全CD235+的(图6B)。这些iPSC衍生的红细胞群体显示功能性成熟，这是通过评价其对缺氧条件作出应答(图6C)和生成血红蛋白(图6D)的能力得出的。例如，在低氧(5％O2)下培养以刺激应激红细胞生成时，细胞开始表现出标志性成熟成红细胞的特征，包括细胞尺寸变小和细胞核内染色质浓缩(图6C)。更突出地，在对细胞进行离心时，观察到亮红色的沉淀，表明生成血红蛋白。在向培养物中添加额外的EPO时，观察到沉淀中出现了更多的红细胞(图6D)。
由于我们系统中的默认途径似乎允许iPSC衍生的MEP在AhR激动作用下特化并成熟为红细胞系，我们假设进一步的AhR调节会促使其他Mk系的发育。为测试该假说，我们进行了研究，使用受体的小分子抑制和AhR抑制蛋白的强制表达来产生AhR拮抗作用。在第一组实验中，向基本细胞因子调节下生长的第30天MEP群体中添加已知的AhR拮抗剂CH2223191。与其中几乎没有观察到CD41阳性巨核细胞系细胞的载剂处理的对照群体相反，使用AhR抑制剂处理的MEP产生了小但确定的CD41+巨核细胞系细胞群体(图6E)。在第二组实验中，我们构建并实验了编码AhR抑制元件(AhRR)以及ZsGreen报告体的慢病毒载体(图6F)。在一些我们的研究中，该AhRR元件强力并特异性地抑制了基线或AhR激动剂诱导的AhR转录活性(Hahn,M.E.,Allan,L.L.和Sherr,D.H.Regulation of constitutiveand inducible AHR signaling:complex interactions involving the AHR repressor(组成型和诱导型AHR信号的调控：涉及AHR抑制因子的复杂相互作用)BiochemPharmacol77,485-497(2009)；Evans,B.R.等，Repression of aryl hydrocarbon receptor(AHR)signaling by AHR repressor:role of DNA binding and competition for AHRnuclear translocator(受AHR抑制因子抑制的芳基烃受体(AHR)信号：DNA结合的作用和竞争AHR核易位体)Mol Pharmacol73,387-398(2008))。与仅使用组成活性ZsGreen报告体转导的模拟感染的MEP相反，使用AhRR慢病毒感染的细胞产生了大量的CD41+巨核细胞系细胞(图6G)。有趣的是，虽然AhRR转导的群体能够产生巨核细胞系细胞，其也含有较少的CD235+细胞，表明iPSC衍生的MEP中的AhR拮抗作用起始了从红系细胞至巨核细胞系特化的转录转变(transcriptional switch)(图6G)。为进一步研究通过iPSC衍生的MEP中的AhR拮抗作用生成的巨核细胞系细胞，使用不连续的BSA梯度(0、1.5、3％)分离成熟的Mk。显然，通过AhRR过表达抑制AhR活性后生成了大、CD41+、多倍性Mk(图6H)。这些细胞显示了成熟Mk的标志性特征，包括内复制至8N和16N的能力(图6I)和在细胞表面上存在前血小板挤出物(图6H)。此外，与模拟感染的对照相反，在早期和晚期MEP培养物中都观察到表达AhRR的Mk(图6J)。
图7显示了MEP分化和扩增中AhR激动作用功能和从MEP分化RBC和巨核细胞过程中AhR激动作用和拮抗作用功能的示意图。
实施例7：iPSC衍生的RBC的表征
对iPSC重编程中所涉及基因和RBC分化中所涉及基因的表达进行了分析以进一步表征根据实施例6的方法制备的iPSC衍生的RBC。结果显示，随着细胞直接分化为RBC，负责重编程过程的胚胎基因(包括Oct4、Sox2和Nanog)下调(图8A和未显示的数据)。
在该定向分化策略中红系细胞特化的第15和30天，细胞表现出RBC输入相关关键基因的互补性上调(图8B)。
通过微阵列分析，第15天和第30天iPSC衍生的RBC上调了一组血红蛋白(α1和γ2)以及红系细胞调控中涉及的其他基因(p45，NFE2；c-Myb；Kruppel样因子1，KLF-1；α血红蛋白稳定蛋白，AHSP和CD235，血型糖蛋白A)。此外，BCL-11A在分化后下调，其与红系细胞成熟相当。
实施例8：iPSC衍生的RBC的表征
在正常的造血发育中，胚胎球蛋白(ε和ζ)在发育早期表达并在出生前下调。Α球蛋白在出生前后都以高水平表达。胎儿血红蛋白(γ)在出生前以高水平表达，并迅速下调(5岁时的表达小于约5％)。成人球蛋白(β)与胎儿血红蛋白交互表达并且是成人细胞中表达的血红蛋白中的主要形式。重要的是，增加成人中胎儿血红蛋白的能力缓解了镰状细胞贫血的症状。
我们利用质谱分光光度分析来研究使用本发明方法由iPSC衍生的RBC生成的球蛋白类型。图9显示了对照患者(图9A)和镰状细胞疾病患者(图9B)的全外周血分析结果。可以看到明显的α球蛋白、γ球蛋白和β球蛋白(成人球蛋白)的峰。在镰状细胞患者中，可清楚地看到生成镰状细胞(血红蛋白S)的突变(图9B)。图10显示了第30天iPSC衍生的RBC的类似分析的结果。主要表达的蛋白质是球蛋白。这些细胞明显强力表达α。有趣的是，细胞在分化的胚胎/胎儿阶段明显，其中其表达胚胎球蛋白(ε和ζ)以及胎儿球蛋白(γ；存在两个峰是因为存在两种γ的同种型)，但不表达成人球蛋白(β)。先前尚未以这种方式分析过iPSC衍生的RBC，并且这些质谱分光光度分析提供了细胞在蛋白水平表达适当基因的证据。
实施例9：iPSC衍生的RBC对HbF诱导剂产生应答
增加成人中胎儿血红蛋白的能力缓解了镰状细胞贫血的症状。羟基脲(HU)是仅有的可能通过起始应激红细胞生成(该过程中新的红细胞在应激下快速生成；由于其是最新出现的RBC，其表达较多的胎儿血红蛋白)来完成上述功能的FDA批准的药物。如上文讨论的那样，我们的iPSC衍生的RBC已经表达了胎儿血红蛋白，因此问题在于细胞能否对HU产生应答(并可因此用作针对新的HbF诱导剂的患者特异性筛选平台)。如图11所示，使iPSC衍生的RBC接触0.5μM HU导致胎儿血红蛋白(γ)的表达出现4倍的增加(图11中HBG)。该数据表明细胞确实对治疗性剂量的HU产生应答。
实施例10：AhR激动作用促进鼠骨髓中的MEP生成和扩增
为确定AhR激动作用是否导致鼠系统中来自骨髓前体(与iPSC相反)的MEP生成和扩增，在存在或不存在载剂或0.2μM FICZ的条件下将来自C57BL/6小鼠的去除红细胞的骨髓培养3天。显著地，与载剂处理的对照相反，在仅3天的FICZ处理后就在培养物中观察到不同的原代、CD41+/Ter119+MEP群体(图12)。
实施例11：iPSC衍生的Mk上调关键巨核细胞特异性基因
为进一步表征根据本发明方法制备的iPSC衍生的Mk，在使用不连续BSA梯度进行纯化后进行了定量PCR分析。使用AhR拮抗作用制备的iPSC-Mk表达一系列标志性和特征性MK标志物(图14)。通过定量PCR分析，这些细胞表达标志性和特征性Mk标志物，如CD62P(P-选择素)、血小板因子4(PF4)、GPIIb和GPV。
实施例12：iPSC衍生的Mk产生功能性血小板
使用了流式细胞术以比较来自全血的血小板和iPSC衍生的血小板。结果显示iPSC衍生的血小板与全血衍生的血小板显著相似。FSC对比SSC概况非常类似，且iPSC衍生的血小板表达标志性血小板标志物GPIX、GPIb和P-选择素(图15)。
实施例13：AhR激动剂FICZ在体内具有活性并导致正常小鼠中血小板计数增加
为确定FICZ处理或整个动物是否影响RBC或血小板生成，使用逐周剂量递增方案(第1周：1mg/kg；第2周：2mg/kg；第3周：4mg/kg)每天使用悬浮在植物油中的FICZ对C57Bl6小鼠进行腹膜内注射。与模拟注射的小鼠或仅使用载剂模拟感染的小鼠不同，如外周血的Hemavet定量试验所测试的那样，注射了FICZ的小鼠在全部3个时间点(第7、14和21天)都显示血小板计数增加(图16A)。有趣的是，立即接触较高剂量的FICZ(4mg/kg)且未经历第1周递增的小鼠表现出更直接和高水平的血小板应答。该研究中没有小鼠在白细胞(WBC)或血红细胞(RBC)计数方面显示显著差异(未显示)。在3周时间点后，处死小鼠并收获肝和脾。CYP1B1靶基因表达的定量RT-PCR分析表明FICZ处理的动物的肝和脾中存在强力上调，确认我们已在体内达到了生物学上有意义的FICZ剂量(图16B和16C)。
实施例14：iPSC细胞中的AhR抑制
生成了iPSC细胞系，其允许使用分子方法选择性下调AhR的表达。图17显示了使用的构建体，其含有针对AhR的短发夹RNA(RNAi)，其在使用多西环素诱导剂处理细胞时表达。还打开了红色荧光报告体以追踪该表达。图17中顶部的图显示可在未分化的细胞中和分化的第5天时打开RNAi。
针对AhR的RNAi在使用本发明方法制备的末期MK中激活。结果是，与表达杂乱RNAi序列(SCR)的对照细胞相比，前血小板生成增加。荧光报告体的图象如图18(顶部)所示，且图示了前血小板形成的显著增加(图18(底部))。
该结果显示，Mk中AhR的抑制增加了来自Mk的血小板成熟。因此，AhR拮抗作用驱动MEP分化为Mk并随后促进Mk至血小板的分化。
讨论：
我们的结果表明，AhR在标准造血发育中具有生理和功能性作用，且双潜能造血祖细胞中受体的调控可指导细胞命运。我们证明了一种新颖的方法，用于在无血清和饲养细胞限定培养物条件下使多潜能干细胞定向分化为能够最终特化为Mk或红系细胞的MEP。
作为这些研究的起始点，我们利用了人造血细胞分化基因组(dMap)阵列数据作为路线图来评价AhR在造血细胞中可能的作用。这些分析是强力工具，表明AhR在血小板发育中起重要作用并与先前的研究以及大量本文所示数据一致。
虽然一些团队以及公开了从ESC和iPSC衍生造血细胞的原理询证示例，但这些实验方案对技术要求很高并导致生成有限数目的细胞。我们的概念方法旨在体外模拟发育的天然顺序以得出建立有效的基于iPSC的平台所需的细胞类型范围和数目。该实验方案利用了相对简单的2D培养方法且无需形成拟胚体，这在使用人多潜能干细胞时通常是问题较多的步骤。此外，该实验方案较短(约10天)，完全化学限定且不需要外源性饲养细胞或生长因子，从而使GMP生成和临床转化成为可能。
重要的是，我们还发现，在我们的定向分化方案中使用非毒性芳基烃受体激动剂显著增加了MEP和所得细胞的数目。这是一项非常重要的发现，因为已对传统、进化上保守的AhR在环境化学物质诱导的毒性中的功能进行了研究，且在我们的系统中显示其复杂地涉及至少两种关键血细胞类型的生长和分化过程。在向我们的培养物中添加强力AhR平台FICZ后，我们观察到在数周内MEP从几千个细胞指数扩增至一百万个细胞。重要的是，使用高度特异性AhR抑制剂确认了AhR在MEP群体至的作用。该细胞对数扩增似乎是减少的细胞死亡的函数并且与表明AhR可控制凋亡的先前研究一致。
有趣的是，贯穿这项工作中使用的AhR配体FICZ是Rannug及同事最先描述的色氨酸的光代谢物(Rannug,U.等，Structure elucidation of two tryptophan-derived,high affinity Ah receptor ligands(两种色氨酸衍生、高亲和性Ah受体配体的结构解析)Chem Biol.2,841-845.(1995))。基于显示FICZ普遍性的先前研究(Wincent,E.等，The suggested physiologic aryl hydrocarbon receptor activator and cytochromeP4501substrate 6-formylindolo[3,2-b]carbazole is present in humans(已提出的人中存在的生理芳基烃受体激活因子和细胞色素P4501底物6-甲酰吲哚[3,2-b]咔唑)JBiol Chem 284,2690-2696(2009))以及我们的显示该配体体内活性的数据，FICZ参与体内调控造血作用并非不可思议，可能其他内源性AhR配体也起作用。使用AhR配体扩增MEP的能力还表明血细胞发育可能受多种环境配体的影响。
除了允许MEP的指数扩增外，我们的结果还表明，AhR条件还涉及红系细胞和Mk系细胞的进一步特化，其中AhR激动作用导致成红细胞的发育而AhR的拮抗作用或下调导致Mk发育。虽然红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)是RBC和血小板发育中的主要驱动因子，但本文的数据指出AhR这些细胞系的发育和特化过程中起独立于细胞因子的作用。
在我们的研究期间，我们衍生了已知表达Mk系和红系细胞标志物的推定的祖细胞。我们的实验中一项特别惊人的结果是开发出一种简单的实验方案，其用于快速和高效地衍生在AhR激动作用下指数扩增的推定的MEP。除了回答关于造血发育的基本生物学问题的能力，该项工作的有用结果是利用该体外平台进行血产品的临床相关生产。输血是一种必需的细胞治疗，且血液供应的安全性和充分性受到国家和国际关注。基于iPSC的系统(如本文所述的系统，其中可生成足够数量的细胞)能够允许血红细胞和血小板输送而没有免疫原性、污染或供应相关的问题。此外，从单一来源生成全部两种细胞群体的能力以及血小板和成熟RBC都不含有核遗传物质的事实降低了iPSC衍生细胞应用相关的安全性并为临床转化铺平了道路。
总之，我们提出了开发一种新颖、化学限定且无饲养细胞的方法，用于生成iPSC衍生的造血细胞。与现有方法相比，该方法允许指数上更多地生成RBCs和血小板，并且依赖使用造血祖细胞中特化的配体首次限定AhR受体在标准造血发育中的作用。
不希望受理论限制，部分基于本文报道的数据，我们限定了AhR激动作用和AhR拮抗作用在血小板和红细胞系分化过程中不同的作用。图19提供了示意图。图右侧显示了从造血干细胞(HSC)至血小板或红细胞(RBC)的分化途径。在图中，“AHR-”表示AhR的拮抗作用且“AHR+”表示AhR的激动作用。在成人(血液组织特异性)造血干细胞(HSC)中，AhR拮抗作用导致能够再生的细胞数目增加。使该群体接触AhR激动剂导致共同髓系祖细胞(CMP)和巨核细胞-红系祖细胞(Meg-红系祖细胞或MEP)的分化/特化以及数目指数增加。连续的AhR激动作用导致RBC生成，而相反地，AhR拮抗作用促进在MK最终特化的两个点上的血小板生成：从MEP至MK以及从成熟的MK至血小板。
图右侧显示的制备所有细胞类型的替代性方法涉及使用PSC(多潜能干细胞，例如iPSC)。iPSC向造血细胞系的特化受到中胚层和称为成血管细胞的造血/内皮前体形成的调节。成血管细胞中的AhR拮抗作用可能将那些细胞维持在多潜能状态。
在图19中，从iPSC至血小板或RBC的分化过程显示于20天中。使用示例性方法中生成这类细胞的近似天数来标记各阶段。例如，iPSC在第0天(D0)、HSC在第5天(D5)且MEPT在第10天(D10)。20天的总时间和各细胞类型开始出现的各单个时间仅用作示例。可改变本文所公开方法中的一些因素以改变时间线。
虽然参考具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。

Claims (141)

1.一种制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法，所述方法包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将MEP前体细胞分化为MEP。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
5.如权利要求1所述的方法，所述MEP前体细胞是多潜能干细胞。
6.如权利要求1所述的方法，所述培养物不包含血清。
7.如权利要求1所述的方法，所述培养物不包含饲养细胞。
8.一种制备MEP的方法，所述方法包括在BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、hSCF、FLT3、TPO和EPO存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
10.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
11.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
12.如权利要求8所述的方法，所述方法包括：
a)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养所述多潜能干细胞；
b)在补充有BMP-4、VEGF、bFGF和KOSR的RPMI培养基中培养步骤a)中获得的细胞；
c)在补充有BMP-4、VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养步骤b)中获得的细胞；
d)在补充有VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养步骤c)中获得的细胞；
e)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF、bFGF、hSCF和Flt3配体的IMDM和Hams F12混合物中培养步骤d)中获得的细胞；以及
f)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF、bFGF、hSCF、Flt3配体和hTPO、IL-6和阿法依泊汀的IMDM和Hams F12混合物中培养步骤e)中获得的细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中，培养步骤a)至e)中至少一步中的培养基中还包含AhR拮抗剂。
14.如权利要求12所述的方法，其中，步骤f)中的培养基还包含AhR激动剂。
15.如权利要求8所述的方法，所述多潜能干细胞选自胚胎干(ES)细胞、诱导性多潜能干细胞(iPSC)和细胞核移植生成的细胞。
16.如权利要求15所述的方法，所述iPSC细胞表达OCT4、KLF4、SOX2和cMYC。
17.如权利要求1所述的方法，所述MEP共表达CD41和CD235。
18.如权利要求1所述的方法，所述MEP不表达CD34。
19.如权利要求1所述的方法，所述培养物在10天内开始生成MEP细胞。
20.如权利要求19所述的方法，所述培养物在7天内开始生成MEP细胞。
21.如权利要求1所述的方法，所述培养基继续生成新的MEP细胞至少30天。
22.如权利要求1所述的方法，所述培养物中生成的MEP数目在24小时的培养期间内呈指数增长。
23.如权利要求1所述的方法，所述培养物每毫升包含至少100万MEP。
24.如权利要求1所述的方法，所述培养物每毫升包含至少1000万MEP。
25.如权利要求1所述的方法，所述培养物中至少10％的细胞是MEP。
26.如权利要求1所述的方法，所述培养物中至少50％的细胞是MEP。
27.如权利要求1所述的方法，所述培养物生成至少1000万MEP。
28.如权利要求1所述的方法，所述培养物生成至少1亿MEP。
29.一种MEP，其通过权利要求1所述的方法制备。
30.一种细胞培养物，其包含通过权利要求1所述方法制备的MEP。
31.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法制备MEP，以及
在足以制造RBC的条件下培养所述MEP。
32.如权利要求31所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP。
33.如权利要求31所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养。
34.如权利要求33所述的方法，所述足以制造RBC的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养。
35.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
提供权利要求29所述的MEP，以及
在足以制造RBC的条件下培养所述MEP。
36.如权利要求35所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP。
37.如权利要求35所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在红系细胞特化培养基中培养。
38.如权利要求37所述的方法，所述足以制造RBC的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养。
39.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养MEP。
40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括在红系细胞特化培养基中培养所述MEP。
41.如权利要求39所述的方法，所述培养物每毫升包含至少100万RBC。
42.如权利要求39所述的方法，所述培养物每毫升包含至少1000万RBC。
43.如权利要求39所述的方法，所述培养物中至少10％的细胞是RBC。
44.如权利要求39所述的方法，所述培养物中至少50％的细胞是RBC。
45.如权利要求39所述的方法，所述培养物生成至少1000万RBC。
46.如权利要求39所述的方法，所述培养物生成至少1亿RBC。
47.一种通过权利要求39所述方法制备的RBC。
48.一种输注组合物，其包含权利要求47所述的RBC。
49.一种培养物，其包含通过权利要求39所述方法制备的RBC。
50.一种制备巨核细胞(Mk)的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法制备MEP，以及
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP。
51.如权利要求50所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养所述MEP。
52.如权利要求51所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
53.如权利要求50所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
54.如权利要求50所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。
55.如权利要求54所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调节剂存在的情况下培养。
56.如权利要求55所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
57.如权利要求54所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
58.一种制备Mk的方法，所述方法包括：
提供权利要求29所述的MEP，以及
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP。
59.如权利要求58所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养所述MEP。
60.如权利要求59所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
61.如权利要求58所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
62.如权利要求58所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。
63.如权利要求62所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调节剂存在的情况下培养。
64.如权利要求63所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
65.如权利要求62所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
66.一种制备Mk的方法，所述方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。
67.如权利要求66所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养所述MEP。
68.如权利要求66所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
69.如权利要求68所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养所述MEP。
70.如权利要求66所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
71.如权利要求70所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养所述MEP。
72.一种Mk，其通过权利要求66所述的方法制备。
73.一种培养物，其包含通过权利要求66所述方法制备的Mk。
74.一种制备血小板的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法制备MEP；
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP；以及
在足以从Mk分化血小板的条件下培养所述Mk。
75.如权利要求74所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养所述MEP。
76.如权利要求75所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
77.如权利要求74所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
78.如权利要求74所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。
79.如权利要求78所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调节剂存在的情况下培养。
80.如权利要求79所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
81.如权利要求78所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
82.如权利要求74所述的方法，所述足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养。
83.一种制备血小板的方法，所述方法包括：
提供权利要求29所述的MEP；
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP；以及
在足以从Mk分化血小板的条件下培养所述Mk。
84.如权利要求83所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节剂存在的情况下培养所述MEP。
85.如权利要求84所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
86.如权利要求83所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
87.如权利要求83所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞特化培养基中培养。
88.如权利要求87所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调节剂存在的情况下培养。
89.如权利要求88所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
90.如权利要求87所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
91.如权利要求83所述的方法，所述足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养。
92.一种制备血小板的方法，所述方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP以制备Mk并在足以进行血小板分化的条件下培养所述Mk。
93.如权利要求92所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养所述MEP。
94.如权利要求92所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
95.如权利要求92所述的方法，所述足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养。
96.如权利要求92所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
97.如权利要求96所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中培养所述MEP。
98.如权利要求96所述的方法，所述足以从Mk分化血小板的条件包括在AhR拮抗剂存在的情况下进行培养。
99.一种血小板，其通过权利要求92所述的方法制备。
100.一种输注组合物，其包含权利要求99所述的血小板。
101.一种组合物，其每毫升包含至少100万MEP。
102.如权利要求101所述的组合物，其每毫升包含至少1000万MEP。
103.一种包含细胞的组合物，其中至少10％的所述细胞是MEP。
104.如权利要求103所述的组合物，其中至少50％的所述细胞是MEP。
105.如权利要求104所述的组合物，所述组合物每毫升包含至少100万MEP。
106.如权利要求105所述的组合物，所述组合物每毫升包含至少1000万MEP。
107.如权利要求101所述的组合物，所述组合物还包含RBC。
108.如权利要求101所述的组合物，所述组合物还包含巨核细胞。
109.如权利要求101所述的组合物，所述组合物还包含血小板。
110.如权利要求101所述的组合物，所述组合物是细胞培养物。
111.一种向有此需要的患者提供RBC的方法，所述方法包括：
将包含权利要求47所述的RBC的组合物输送至所述患者的循环系统。
112.一种治疗有此需要的患者中贫血的方法，所述方法包括：
将包含权利要求47所述的RBC的组合物输送至所述患者的循环系统。
113.如权利要求112所述的方法，所述贫血是由至少一种以下情况导致的：RBC生成受损、RBC破坏增加、失血和体液潴留。
114.如权利要求112所述的方法，所述贫血是由地中海贫血导致的。
115.如权利要求112所述的方法，所述贫血是镰状细胞贫血。
116.如权利要求111所述的方法，所述RBC与所述患者血型匹配。
117.如权利要求111所述的方法，所述RBC分化自从所述患者分离的RBC前体细胞。
118.一种向有此需要的患者提供血小板的方法，所述方法包括：
将包含权利要求99所述的血小板的组合物输送至所述患者的循环系统。
119.一种治疗有此需要的患者中血小板减少症的方法，所述方法包括：
将包含根据权利要求99所述制备的血小板的组合物输送至所述患者的循环系统。
120.如权利要求119所述的方法，所述血小板减少症是由至少一种以下情况导致的：血小板生成减少、血小板破坏增加和药物。
121.如权利要求118所述的方法，所述血小板与所述患者血型匹配。
122.如权利要求118所述的方法，所述血小板分化自从所述患者分离的血小板前体细胞。
123.一种根据对RBC的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)通过权利要求39所述的方法制备RBC；
b)使所述RBC接触所述化合物；以及
c)观察所述RBC中的变化。
124.一种根据对RBC的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求47所述的RBC；
b)使所述RBC接触所述化合物；以及
c)观察所述RBC中的变化。
125.一种根据对Mk的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)通过权利要求66所述的方法制备Mk；
b)使所述Mk接触所述化合物；以及
c)观察所述Mk中的变化。
126.一种根据对Mk的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求72所述的Mk；
b)使所述Mk接触所述化合物；以及
c)观察所述Mk中的变化。
127.一种根据对血小板的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)通过权利要求92所述的方法制备血小板；
b)使所述血小板接触所述化合物；以及
c)观察所述血小板中的变化。
128.一种根据对血小板的作用筛选化合物的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求99所述的血小板；
b)使所述血小板接触所述化合物；以及
c)观察所述血小板中的变化。
129.一种向有此需要的患者提供RBC的方法，所述方法包括：
将包含RBC的组合物输送至所述患者的循环系统，其中，至少一些所述RBC获自权利要求107所述的组合物。
130.一种治疗有此需要的患者中贫血的方法，所述方法包括：
将包含RBC的组合物输送至所述患者的循环系统，其中，至少一些所述RBC获自权利要求107所述的组合物。
131.一种向有此需要的患者提供血小板的方法，所述方法包括：
将包含血小板的组合物输送至所述患者的循环系统，其中，至少一些所述血小板获自权利要求109所述的组合物。
132.一种增加哺乳动物中RBC计数的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的AhR调节剂。
133.如权利要求132所述的方法，所述AhR调节剂是AhR激动剂。
134.一种增加哺乳动物中血小板计数的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的AhR调节剂。
135.一种治疗哺乳动物中血小板减少症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的AhR调节剂。
136.如权利要求134或135所述的方法，其中，向所述哺乳动物给予AhR激动剂。
137.如权利要求134或135所述的方法，其中，向所述哺乳动物给予AhR拮抗剂。
138.如权利要求134或135所述的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予AhR激动剂和AhR拮抗剂。
139.一种制备血小板的方法，所述方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养Mk。
140.如权利要求139所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
141.如权利要求140所述的方法，所述AhR拮抗剂具有提高所述培养物中前血小板生成率的作用。
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WO (1) WO2014028749A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107709546A (zh) * 2015-06-16 2018-02-16 国立大学法人京都大学 高功能性血小板的制造方法
CN113046310A (zh) * 2020-12-30 2021-06-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
WO2024108461A1 (zh) * 2022-11-24 2024-05-30 苏州血霁生物科技有限公司 一种分化血小板的方法、培养基及其应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201210857D0 (en) 2012-06-19 2012-08-01 Cambridge Entpr Ltd Transcription factor mediated programming towards megakaryocytes
US9074186B2 (en) 2012-08-15 2015-07-07 Boston Medical Center Corporation Production of red blood cells and platelets from stem cells
CA3177929A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
WO2014138485A1 (en) * 2013-03-08 2014-09-12 Irm Llc Ex vivo production of platelets from hematopoietic stem cells and the product thereof
JP6551963B2 (ja) * 2014-05-14 2019-07-31 国立大学法人京都大学 巨核球前駆細胞の製造方法
FR3039166B1 (fr) 2015-07-23 2018-10-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Progeniteurs de megacaryocytes cd34+cd41dim et leurs utilisations pour produire des plaquettes et/ou des mk portant des proplaquettes
BR112018007538A2 (pt) * 2015-10-15 2018-10-23 Celularity Inc células exterminadoras naturais e células ilc3 e usos das mesmas
EP3493820A4 (en) 2016-08-04 2020-04-22 Icahn School of Medicine at Mount Sinai PRODUCTION OF MEGACARYOCYTE COMPOSITIONS AND THROMBOCYTOPENIA TREATMENT THERAPIES
US20200179341A1 (en) * 2016-11-04 2020-06-11 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions for treating multiple myeloma and increasing antibody dependent cell cytotoxicity by targeting the aryl hydrocarbon receptor
WO2021228832A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Erytech Pharma Red cell extracellular vesicles (rcevs) containing cargoes and methods of use and production thereof
WO2023107477A1 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Trailhead Biosystems Inc. Methods and compositions for generating human erythroid progenitor cells
WO2024018018A1 (fr) * 2022-07-21 2024-01-25 Etablissement Francais Du Sang Utilisation d'un composé vitisine pour la production de cellules hématopoïétiques

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010039997A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Hematopoietic protection against chemotherapeutic compounds using selective cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitors
WO2011115308A1 (en) * 2010-03-18 2011-09-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into mesodermal cells
WO2012061146A1 (en) * 2010-10-25 2012-05-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the generation of platelets and methods of use thereof

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
USRE28819E (en) 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4328245A (en) 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5221623A (en) 1986-07-22 1993-06-22 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Use of bacterial luciferase structural genes for cloning and monitoring gene expression in microorganisms and for tagging and identification of genetically engineered organisms
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5070012A (en) 1988-03-30 1991-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monitoring of cells and trans-activating transcription elements
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5283179A (en) 1990-09-10 1994-02-01 Promega Corporation Luciferase assay method
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
EP0743520A3 (en) 1993-12-30 1999-11-10 The Salk Institute For Biological Studies Novel uses for GAL4-receptor constructs
JP3466765B2 (ja) 1994-07-27 2003-11-17 キッコーマン株式会社 ビオチン化ホタルルシフェラーゼ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼの製造法及び生物発光分析法
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
IL129242A0 (en) 1996-10-01 2000-02-17 Cima Labs Inc Taste-masked microcapsule compositions and methods of manufacture
US5955604A (en) 1996-10-15 1999-09-21 The Regents Of The University Of California Substrates for β-lactamase and uses thereof
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69839179T2 (de) 1997-10-28 2009-02-19 Bando Chemical Industries, Ltd., Kobe Dermatologisches pflaster und verfahren zur herstellung seiner basisschicht
US7101681B1 (en) 1997-11-21 2006-09-05 Amgen, Inc. Nuclear hormone receptor drug screens
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
EP1137940A4 (en) 1998-10-23 2004-06-02 Glaxo Group Ltd METHOD FOR IDENTIFYING LIGANDS OF NUCLEAR RECEPTORS
AU3877800A (en) 1999-03-30 2000-10-16 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
US6509380B1 (en) 2001-12-14 2003-01-21 Marshall University Research Corporation Method of treating iron overload with acetaminophen
EP2626415A3 (en) 2004-10-25 2014-04-16 Cellerant Therapeutics, Inc. Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof
PE20100362A1 (es) 2008-10-30 2010-05-27 Irm Llc Derivados de purina que expanden las celulas madre hematopoyeticas
WO2010108005A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 University Of Georgia Research Foundation Novel neural progenitors from pluripotent stem cells, methods of producing same and use to produce neural cells
US10314810B2 (en) 2010-07-27 2019-06-11 Trustees Of Boston University Aryl hydrocarbon receptor (AhR) modifiers as novel cancer therapeutics
US9074186B2 (en) 2012-08-15 2015-07-07 Boston Medical Center Corporation Production of red blood cells and platelets from stem cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010039997A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Hematopoietic protection against chemotherapeutic compounds using selective cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitors
WO2011115308A1 (en) * 2010-03-18 2011-09-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into mesodermal cells
WO2012061146A1 (en) * 2010-10-25 2012-05-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the generation of platelets and methods of use thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTHONY E. BOITANO ET AL.: "Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells", 《SCIENCE》 *
BRENDEN W. SMITH ET AL.: "The aryl hydrocarbon receptor directs hematopoietic progenitor cell expansion and differentiation", 《BLOOD》 *
CHAN-JUNG CHANG ET AL.: "Production of Embryonic and Fetal-Like Red Blood Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells", 《PLOS ONE》 *
MARIE-CATHERINE GIARRATANA ET AL.: "Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells", 《BLOOD》 *
STEPHAN LINDSEY AND ELEFTHERIOS T. PAPOUTSAKIS: "The aryl hydrocarbon receptor (AHR) transcription factor regulates megakaryocytic polyploidization", 《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》 *
YASUHIRO EBIHARA ET AL.: "Generation of red blood cells from human embryonic/induced pluripotent stem cells for blood transfusion", 《INT J HEMATOL》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107709546A (zh) * 2015-06-16 2018-02-16 国立大学法人京都大学 高功能性血小板的制造方法
CN113046310A (zh) * 2020-12-30 2021-06-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
CN113046310B (zh) * 2020-12-30 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
WO2024108461A1 (zh) * 2022-11-24 2024-05-30 苏州血霁生物科技有限公司 一种分化血小板的方法、培养基及其应用

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