JP2015528284A - 幹細胞からの赤血球および血小板の生成 - Google Patents

幹細胞からの赤血球および血小板の生成 Download PDF

Info

Publication number
JP2015528284A
JP2015528284A JP2015527637A JP2015527637A JP2015528284A JP 2015528284 A JP2015528284 A JP 2015528284A JP 2015527637 A JP2015527637 A JP 2015527637A JP 2015527637 A JP2015527637 A JP 2015527637A JP 2015528284 A JP2015528284 A JP 2015528284A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ahr
mep
culturing
cells
rbc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2015527637A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6506689B2 (ja
JP2015528284A5 (ja
Inventor
ジョージ ジェイ． マーフィー，
ジョージ ジェイ． マーフィー，
デイビッド エイチ． シェアー，
デイビッド エイチ． シェアー，
サラ エス． ロジール，
サラ エス． ロジール，
ブレンデン ダブリュー． スミス，
ブレンデン ダブリュー． スミス，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boston University
Original Assignee
Boston University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston University filed Critical Boston University
Publication of JP2015528284A publication Critical patent/JP2015528284A/ja
Publication of JP2015528284A5 publication Critical patent/JP2015528284A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6506689B2 publication Critical patent/JP6506689B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/655—Azo (—N=N—), diazo (=N2), azoxy (>N—O—N< or N(=O)—N<), azido (—N3) or diazoamino (—N=N—N<) compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本開示は、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）を作製する方法であって、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質の存在下の培養物において、ＭＥＰ前駆細胞をＭＥＰに分化させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養すること、および、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＥＰは、ＣＤ４１およびＣＤ２３５を共発現する。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１２年８月１５日に出願した米国仮出願第６１／６８３，２４６号および２０１３年３月１４日に出願した米国出願第１３／８２８，３５７号に対する優先権を主張する。これらの出願はいずれも、本明細書中に参考として援用される。
政府の資金援助
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約番号ＨＬ１０７４４３、ＥＳ１１６２４およびＥＳ００７３８１の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
序文
輸血は不可欠な細胞療法であり、血液供給の安全性および適性は国内外の関心事である。２００９年だけで、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｄａｔａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒは、血液バンク機関が１７００万単位超の全血および赤血球を採取し、米国の病院が年間で１５００万人超の患者に輸血したと報告した。血液型抗原の多型性が多くあるため、先進国においてさえ、一部の患者群のための血液が慢性的に不足している。米国では、鎌状赤血球貧血患者（大部分がアフリカ系である）の４０％超は、ドナー（ほとんどが白人系（ｄｅｃｅｎｔ）である）から血液を輸血されると免疫反応を経験する。血液の散発的な不足は、天災または人災に関連して起こる可能性もある。新たな血伝染性疾患が発見され、ならびに／または現れて新たな地域に広がると、ドナー資格に関する新たな規制によって血液供給が縮小し得る懸念も高まっている。最後に、６０歳超の者の数が増えることによる血液利用が増加して、２０５０年までに血液供給が不足すると予測される。
これらのおよび他の理由により、当技術分野では、赤血球および血小板を作製する新たな方法が必要とされている。例えば、赤血球および／または血小板の生成を可能にする骨髄系−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）を作製する新たな方法も必要とされている。
概要
本発明者らは、赤血球（ＲＢＣ）および血小板、ならびにＲＢＣおよび血小板の前駆体である細胞型の分化におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）シグナル伝達の役割に関する新規の観測を行った。本発明者らは、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）の作製方法、ＲＢＣの作製方法、巨核球（Ｍｋ）の作製方法および血小板の作製方法の分野において、本開示における本発明を提供するために本発明者らの知見を適用した。本発明者らはまた、ＲＢＣ、Ｍｋ、血小板、ＭＥＰ、ＭＥＰ前駆細胞およびこれらの細胞型の少なくとも１つを含む組成物の分野において、本開示における本発明を提供するために本発明者らの知見を適用した。本開示はまた、ＲＢＣ、Ｍｋおよび血小板の少なくとも１つを被験体に提供する方法、ならびにＲＢＣ、Ｍｋおよび血小板の少なくとも１つに対する効果について化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＡｈＲ調節物質を投与することによって、ＲＢＣ数を増加させる方法および血小板数を増加させる方法も提供される。本開示のこれらのおよび他の態様を以下でより詳細に説明する。
本明細書中に参考として援用される開示は、とりわけ、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）を作製する新たな方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質の存在下の培養物において、ＭＥＰ前駆細胞をＭＥＰに分化させることを含む。一部の実施形態では、ＭＥＰ前駆細胞は多能性間細胞である。一部の実施形態では、この方法は、ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養すること、および、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む。本発明の一部の実施形態では、培養物は血清を含まない。本発明の一部の実施形態では、培養物はフィーダー細胞を含まない。
一部の実施形態では、この方法は、ＢＭＰ−４、ｖＶＥＧＦ、ＷＮＴ３ａ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＴＰＯおよびＥＰＯから選択される少なくとも１つのタンパク質の存在下の培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させることを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＢＭＰ−４、ｖＶＥＧＦ、ＷＮＴ３ａ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＴＰＯおよびＥＰＯの存在下の培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させることを含む。一部の実施形態では、この方法は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質の存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ＭＥＰ前駆細胞をアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養すること、および、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、ａ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａおよびノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、前記多能性幹細胞を培養すること；
ｂ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ培地中で、工程ａ）から得られた該細胞を培養すること；
ｃ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｂ）から得られた該細胞を培養すること；
ｄ）ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｃ）から得られた該細胞を培養すること；
ｅ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦおよびＦｌｔ３リガンドを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｄ）から得られた該細胞を培養すること；ならびに
ｆ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ｈＴＰＯ、ＩＬ−６およびＥＰＯを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｅ）から得られた該細胞を培養すること
を含む。一部の実施形態では、培養工程ａ）〜ｅ）の少なくとも１つにおける前記培地は、ＡｈＲアンタゴニストをさらに含む。一部の実施形態では、工程ｆ）における前記培養培地はＡｈＲアゴニストをさらに含む。
一部の実施形態では、前記多能性幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および核移植によって生成された細胞から選択される。一部の実施形態では、前記ｉＰＣＳ細胞は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびｃＭＹＣを発現する。一部の実施形態では、前記ＭＥＰは、ＣＤ４１およびＣＤ２３５を共発現する。一部の実施形態では、前記ＭＥＰはＣＤ３４を発現しない。一部の実施形態では、前記培養物は、１０日以内にＭＥＰ細胞を作り始める。一部の実施形態では、前記培養物は、７日以内にＭＥＰ細胞を作り始める。一部の実施形態では、前記培養物は、新たなＭＥＰ細胞を少なくとも３０日間産生し続ける。一部の実施形態では、前記培養物において産生されるＭＥＰの数は、実質的に指数関数的に増加する。ここで、「実質的に指数関数的に」とは、相対的時間期間にわたる理論的「指数関数増殖」の少なくとも９７％を意味する。一部の実施形態では、培養物において産生されるＭＥＰの数は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間または９６時間の培養期間にわたって指数関数的に増加する。一部の実施形態では、前記培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む。一部の実施形態では、前記培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む。一部の実施形態では、前記培養物中の細胞の少なくとも１０％はＭＥＰである。一部の実施形態では、前記培養物中の細胞の少なくとも５０％はＭＥＰである。一部の実施形態では、前記培養物は少なくとも１０００万個のＭＥＰを産生する。一部の実施形態では、前記培養物は少なくとも１億個のＭＥＰを産生する。
本開示の方法によって作製されたＭＥＰもまた提供される。
本開示の方法によって作製されたＭＥＰを含む細胞培養物もまた提供される。
赤血球（ＲＢＣ）を作製する方法もまた提供される。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製する方法は、本開示の方法によってＭＥＰを作製すること、およびＲＢＣを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、赤血球特異化培地中で培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、赤血球特異化培地中で培養することおよびＡｈＲアゴニストの存在下で培養することをさらに含む。
一部の実施形態では、ＲＢＣを作製する方法は、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを提供すること、およびＲＢＣを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、赤血球特異化培地中で培養することを含む。一部の実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件は、赤血球特異化培地中で培養することおよびＡｈＲアゴニストの存在下で培養することをさらに含む。
一部の実施形態では、赤血球（ＲＢＣ）を作製する方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養することを含む。ＭＥＰは、任意の供給源由来であり得る。一部の実施形態では、この方法は、赤血球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む。
この方法の一部の実施形態では、前記培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＲＢＣを含む。一部の実施形態では、前記培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＲＢＣを含む。一部の実施形態では、前記培養物中の細胞の少なくとも１０％はＲＢＣである。一部の実施形態では、前記培養物中の細胞の少なくとも５０％はＲＢＣである。一部の実施形態では、前記培養物は少なくとも１０００万個のＲＢＣを産生する。一部の実施形態では、前記培養物は少なくとも１億個のＲＢＣを産生する。
本開示の方法によって作製されたＲＢＣもまた提供される。
本開示の方法によって作製されたＲＢＣを含む輸血組成物もまた提供される。
本開示の方法によって作製されたＲＢＣを含む培養物もまた提供される。
本開示はまた、巨核球（Ｍｋ）を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、本開示の方法によってＭＥＰを作製すること、およびＭｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、この方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、巨核球特異化培地の存在下でＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することおよび巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部のこのような実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部のこのような実施形態では、この方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。
一部の実施形態では、Ｍｋを作製する方法は、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを提供すること、およびＭｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、この方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含み、そしてＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。
一部の実施形態では、Ｍｋを作製する方法は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。前記ＭＥＰは、任意の供給源由来のものであり得る。一部の実施形態では、この方法は、巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む。
本開示の方法によって作製されたＭｋもまた提供される。
本開示の方法によって作製されたＭｋを含む培養物もまた提供される。
本開示はまた、血小板を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、血小板を作製する方法は、本開示の方法によってＭＥＰを作製すること、Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること、および該Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で前記Ｍｋを培養することは、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記Ｍｋを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質はＡｈＲアンタゴニストである。この方法の一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件は、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で前記Ｍｋを培養することを含む。
一部の実施形態では、血小板を作製する方法は、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを提供すること、Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること、および該Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、巨核球特異化培地の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養することは、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記Ｍｋを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。この方法の一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件は、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。
一部の実施形態では、血小板を作製する方法は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。前記ＭＥＰは、任意の供給源由来であり得る。一部の実施形態では、この方法は、巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、得られたＭｋを、血小板に分化させるのに十分な条件下で培養することを含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で前記Ｍｋを培養することは、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記Ｍｋを培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。この方法の一部の実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な前記条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件は、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む。
Ｍｋから血小板を分化させる方法もまた提供される。一部の実施形態では、この方法は、前記ＭｋをＡｈＲ調節物質の存在下で培養することを含む。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、培養物中の血小板前駆細胞の形成速度を増大させる。
本開示の方法によって作製される血小板もまた提供される。
本開示の方法によって作製された血小板を含む輸血組成物もまた提供される。
本開示はまた、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む。一部の実施形態では、前記組成物は、巨核球赤血球前駆細胞をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、ＲＢＣをさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、巨核球をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、血小板をさらに含む。
本開示はまた、細胞を含む組成物を提供し、ここで、該細胞のうちの少なくとも１０％は、ＭＥＰである。一部の実施形態では、前記細胞のうちの少なくとも５０％は、ＭＥＰである。一部の実施形態では、前記組成物は、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む。一部の実施形態では、前記組成物は、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む。一部の実施形態では、前記組成物は、巨核球赤血球前駆細胞をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、ＲＢＣをさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、巨核球をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、血小板をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は細胞培養物である。
本開示はまた、ＲＢＣの提供を必要とする患者にＲＢＣを提供する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、本開示の方法によって作製されたＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む。
本開示はまた、貧血の処置を必要とする患者における貧血を処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、この方法は、本開示の方法によって作製されたＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む。一部の実施形態では、前記貧血は、ＲＢＣの産生減少、ＲＢＣ産生の障害、ＲＢＣ破壊の増加、失血および体液過剰のうちの少なくとも１つによって引き起こされる。一部の実施形態では、前記貧血はサラセミアによって引き起こされる。一部の実施形態では、前記貧血は、鎌状赤血球貧血である。一部の実施形態では、前記ＲＢＣは、前記患者に適合した血液型である。一部の実施形態では、前記ＲＢＣは、前記患者から単離された多能性幹細胞から分化したものである。
本開示はまた、血小板の提供を必要とする患者に血小板を提供する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、本開示の方法によって作製された血小板を含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む。
本開示はまた、血小板減少症の処置を必要とする患者における血小板減少症を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、本開示の方法によって作製された血小板を含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む。一部の実施形態では、前記血小板減少症は、血小板産生の減少、血小板破壊の増加、および薬の少なくとも１つによって引き起こされる。一部の実施形態では、前記血小板は、前記患者に適合した血液型である。一部の実施形態では、前記血小板は、前記患者から単離された多能性幹細胞から分化したものである。
本開示はまた、ＲＢＣに対する効果について化合物をスクリーニングする方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、ａ）本開示の方法によってＲＢＣを作製すること；ｂ）該ＲＢＣを該化合物と接触させること；およびｃ）該ＲＢＣの変化を観察することを含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体からＲＢＣ前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該ＲＢＣ前駆細胞から該ＲＢＣを作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記ＲＢＣ前駆細胞が体細胞である。
本開示はまた、ＲＢＣに対する効果について化合物をスクリーニングする別の方法を提供する。この方法は、ａ）本開示の方法によって作製されたＲＢＣを提供すること；ｂ）該ＲＢＣを該化合物と接触させること；およびｃ）該ＲＢＣの変化を観察すること
を含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体からＲＢＣ前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該ＲＢＣ前駆細胞から該ＲＢＣを作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記ＲＢＣ前駆細胞は体細胞である。
本開示はまた、Ｍｋに対する効果について化合物をスクリーニングする方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）本開示の方法によってＭｋを作製すること、ｂ）該Ｍｋを該化合物と接触させること、およびｃ）該Ｍｋの変化を観察することを含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体からＭｋ前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該Ｍｋ前駆細胞から該Ｍｋを作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋ前駆細胞は体細胞である。
本開示はまた、Ｍｋに対する効果について化合物をスクリーニングする別の方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）本開示の方法によって作製したＭｋを提供すること、ｂ）該Ｍｋを該化合物と接触させること、およびｃ）該Ｍｋの変化を観察することを含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体からＭｋ前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該Ｍｋ前駆細胞から該Ｍｋを作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記Ｍｋ前駆細胞は体細胞である。
本開示はまた、血小板に対する効果について化合物をスクリーニングする方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）本開示の方法によって血小板を作製すること、ｂ）該血小板を該化合物と接触させること、およびｃ）該血小板の変化を観察することを含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体から血小板前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該血小板前駆細胞から該血小板を作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記血小板前駆細胞は体細胞である。
本開示はまた、血小板に対する効果について化合物をスクリーニングする別の方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）本開示の方法によって作製した血小板を提供すること、ｂ）該血小板を該化合物と接触させること、およびｃ）該血小板の変化を観察することを含む。一部の実施形態では、この方法は、被験体から血小板前駆細胞を得ること、および該被験体から得た該血小板前駆細胞から該血小板を作製することをさらに含む。一部の実施形態では、前記血小板前駆細胞は体細胞である。
本開示はまた、哺乳類の血小板数を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＡｈＲアゴニストを該哺乳類に投与することを含む。
本開示はまた、哺乳類における血小板減少症を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＡｈＲアゴニストを該哺乳類に投与することを含む。
本開示はまた、血小板を作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭｋを培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。一部の実施形態では、前記ＡｈＲアンタゴニストは、前記培養物中の巨核球胞体突起の産生速度を増加させる効果を有する。
図１Ａは、ヒト造血細胞分化ゲノムマッピング（ｄＭａｐ）データの分析を示す。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍａｐ Ｐｏｒｔａｌ（ｄＭＡＰ）を通じて入手した包括的なマイクロアレイデータのコンピュータ分析を実施した。距離メトリックとして１−ピアソン相関による階層的クラスタリング、および凝集ルール（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ ｒｕｌｅ）として平均連結法に基づいて、遺伝子を分類した（１Ａ）。各細胞集団（亜集団）内における正規化したＡｈＲ発現レベルを計算し、箱髭図を用いて描出した（１Ｂ）。各集団について、プロットは、ＡｈＲ値分布の中央値（中ほどの太線）、中央半分（箱）および四分位数間範囲（ＩＱＲ、「髭」間の距離）を報告する。標準的な分散分析（ａｎｏｖａ）によって、細胞集団間のＡｈＲ発現レベルの差異を試験した。 図１Ｂは、ヒト造血細胞分化ゲノムマッピング（ｄＭａｐ）データの分析を示す。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍａｐ Ｐｏｒｔａｌ（ｄＭＡＰ）を通じて入手した包括的なマイクロアレイデータのコンピュータ分析を実施した。距離メトリックとして１−ピアソン相関による階層的クラスタリング、および凝集ルール（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ ｒｕｌｅ）として平均連結法に基づいて、遺伝子を分類した（１Ａ）。各細胞集団（亜集団）内における正規化したＡｈＲ発現レベルを計算し、箱髭図を用いて描出した（１Ｂ）。各集団について、プロットは、ＡｈＲ値分布の中央値（中ほどの太線）、中央半分（箱）および四分位数間範囲（ＩＱＲ、「髭」間の距離）を報告する。標準的な分散分析（ａｎｏｖａ）によって、細胞集団間のＡｈＲ発現レベルの差異を試験した。
図２Ａは、フィーダーフリーの化学的に定義された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣ）由来巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）産生が、巨核球および赤血球系統の両方の固有マーカー（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）を発現する細胞集団を産生することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣからＭＥＰ段階への分化戦略。形態学的変化、ならびに最初の付着層とそれに続く非接着性ＭＥＰの両方の産生を示す培養物の位相差画像。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥ（赤血球）およびＣＤ４１−ＦＩＴＣ（巨核球）を共発現する１３日目ＭＥＰの代表的なＦＡＣＳ分析。（Ｃ）赤血球または巨核球に特異的な特異化培地（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）のいずれかに５日間曝露した１３日目ＭＥＰのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）未分化ｉＰＳＣ対１３日目ＭＥＰのｑＰＣＲ分析。相対的遺伝子発現をβ−アクチンに対して正規化した。データは、三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５。 図２Ｂは、フィーダーフリーの化学的に定義された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣ）由来巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）産生が、巨核球および赤血球系統の両方の固有マーカー（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）を発現する細胞集団を産生することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣからＭＥＰ段階への分化戦略。形態学的変化、ならびに最初の付着層とそれに続く非接着性ＭＥＰの両方の産生を示す培養物の位相差画像。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥ（赤血球）およびＣＤ４１−ＦＩＴＣ（巨核球）を共発現する１３日目ＭＥＰの代表的なＦＡＣＳ分析。（Ｃ）赤血球または巨核球に特異的な特異化培地（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）のいずれかに５日間曝露した１３日目ＭＥＰのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）未分化ｉＰＳＣ対１３日目ＭＥＰのｑＰＣＲ分析。相対的遺伝子発現をβ−アクチンに対して正規化した。データは、三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５。 図２Ａ〜２Ｂは、フィーダーフリーの化学的に定義された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣ）由来巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）産生が、巨核球および赤血球系統の両方の固有マーカー（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）を発現する細胞集団を産生することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣからＭＥＰ段階への分化戦略。形態学的変化、ならびに最初の付着層とそれに続く非接着性ＭＥＰの両方の産生を示す培養物の位相差画像。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥ（赤血球）およびＣＤ４１−ＦＩＴＣ（巨核球）を共発現する１３日目ＭＥＰの代表的なＦＡＣＳ分析。（Ｃ）赤血球または巨核球に特異的な特異化培地（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）のいずれかに５日間曝露した１３日目ＭＥＰのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）未分化ｉＰＳＣ対１３日目ＭＥＰのｑＰＣＲ分析。相対的遺伝子発現をβ−アクチンに対して正規化した。データは、三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５。 図２Ａ〜２Ｂは、フィーダーフリーの化学的に定義された人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ｉＰＳＣ）由来巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）産生が、巨核球および赤血球系統の両方の固有マーカー（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）を発現する細胞集団を産生することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣからＭＥＰ段階への分化戦略。形態学的変化、ならびに最初の付着層とそれに続く非接着性ＭＥＰの両方の産生を示す培養物の位相差画像。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥ（赤血球）およびＣＤ４１−ＦＩＴＣ（巨核球）を共発現する１３日目ＭＥＰの代表的なＦＡＣＳ分析。（Ｃ）赤血球または巨核球に特異的な特異化培地（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）のいずれかに５日間曝露した１３日目ＭＥＰのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）未分化ｉＰＳＣ対１３日目ＭＥＰのｑＰＣＲ分析。相対的遺伝子発現をβ−アクチンに対して正規化した。データは、三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５。
図３Ａは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストＦＩＣＺがアポトーシスを阻害して、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にすることを示す：（Ａ）１５日目ＭＥＰ＋ＦＩＣＺからの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なＦＡＣＳドットプロット。プロットを最初にＦＳＣ対ＳＳＣでゲーティングし、次いで、ＰＩ＋およびＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋の集団からゲーティングした。ＦＳＣおよびＳＳＣ（３２．６％）ならびにＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋（９７．７％）によって描写したように、ＦＩＣＺは生細胞集団を増加させる。（Ｂ）ＭＥＰ集団＋ＦＩＣＺの代表的な位相差画像。（Ｃ）１５日目ＭＥＰ＋／−０．２μｍ ＦＩＣＺの成長曲線。トリパンブルー排除を使用して、細胞を手動で計数した。グラフィックデータおよび関連統計値は、１群当たり３回の独立した実験の結果である。（Ｄ）ＥＤＵ取り込みによって定量したところ、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは、未処理細胞よりも増殖性である。 図３Ｂは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストＦＩＣＺがアポトーシスを阻害して、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にすることを示す：（Ａ）１５日目ＭＥＰ＋ＦＩＣＺからの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なＦＡＣＳドットプロット。プロットを最初にＦＳＣ対ＳＳＣでゲーティングし、次いで、ＰＩ＋およびＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋の集団からゲーティングした。ＦＳＣおよびＳＳＣ（３２．６％）ならびにＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋（９７．７％）によって描写したように、ＦＩＣＺは生細胞集団を増加させる。（Ｂ）ＭＥＰ集団＋ＦＩＣＺの代表的な位相差画像。（Ｃ）１５日目ＭＥＰ＋／−０．２μｍ ＦＩＣＺの成長曲線。トリパンブルー排除を使用して、細胞を手動で計数した。グラフィックデータおよび関連統計値は、１群当たり３回の独立した実験の結果である。（Ｄ）ＥＤＵ取り込みによって定量したところ、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは、未処理細胞よりも増殖性である。 図３Ｃは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストＦＩＣＺがアポトーシスを阻害して、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にすることを示す：（Ａ）１５日目ＭＥＰ＋ＦＩＣＺからの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なＦＡＣＳドットプロット。プロットを最初にＦＳＣ対ＳＳＣでゲーティングし、次いで、ＰＩ＋およびＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋の集団からゲーティングした。ＦＳＣおよびＳＳＣ（３２．６％）ならびにＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋（９７．７％）によって描写したように、ＦＩＣＺは生細胞集団を増加させる。（Ｂ）ＭＥＰ集団＋ＦＩＣＺの代表的な位相差画像。（Ｃ）１５日目ＭＥＰ＋／−０．２μｍ ＦＩＣＺの成長曲線。トリパンブルー排除を使用して、細胞を手動で計数した。グラフィックデータおよび関連統計値は、１群当たり３回の独立した実験の結果である。（Ｄ）ＥＤＵ取り込みによって定量したところ、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは、未処理細胞よりも増殖性である。 図３Ｄは、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）アゴニストＦＩＣＺがアポトーシスを阻害して、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にすることを示す：（Ａ）１５日目ＭＥＰ＋ＦＩＣＺからの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なＦＡＣＳドットプロット。プロットを最初にＦＳＣ対ＳＳＣでゲーティングし、次いで、ＰＩ＋およびＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋の集団からゲーティングした。ＦＳＣおよびＳＳＣ（３２．６％）ならびにＰＩ−Ｈｏｅｃｈｓｔ＋（９７．７％）によって描写したように、ＦＩＣＺは生細胞集団を増加させる。（Ｂ）ＭＥＰ集団＋ＦＩＣＺの代表的な位相差画像。（Ｃ）１５日目ＭＥＰ＋／−０．２μｍ ＦＩＣＺの成長曲線。トリパンブルー排除を使用して、細胞を手動で計数した。グラフィックデータおよび関連統計値は、１群当たり３回の独立した実験の結果である。（Ｄ）ＥＤＵ取り込みによって定量したところ、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは、未処理細胞よりも増殖性である。
図４Ａは、ＡｈＲアゴニストが、ヒトｉＰＳＣおよびＭＥＰにおけるＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子の発現を誘導することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣおよびＭＥＰにおけるＡｈＲおよびβ−アクチンタンパク質発現のウエスタンブロット分析。（Ｂ）ＦＩＣＺの有無の場合におけるｉＰＳＣおよび１５日目ＭＥＰのｑＰＣＲデータ。発現をβ−アクチンレベルに対して正規化している。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。 図４Ｂは、ＡｈＲアゴニストが、ヒトｉＰＳＣおよびＭＥＰにおけるＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子の発現を誘導することを示す。（Ａ）ｉＰＳＣおよびＭＥＰにおけるＡｈＲおよびβ−アクチンタンパク質発現のウエスタンブロット分析。（Ｂ）ＦＩＣＺの有無の場合におけるｉＰＳＣおよび１５日目ＭＥＰのｑＰＣＲデータ。発現をβ−アクチンレベルに対して正規化している。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
図５Ａは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。 図５Ｂは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。 図５Ｃは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。 図５Ｄは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。 図５Ｅは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。 図５Ｆは、ＡｈＲが両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介することを示す。（Ａ）ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄまたはルシフェラーゼＩＲＥＳ ｚｓＧｒｅｅｎ（ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎおよびｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の発現を駆動するマウスＣＹ１Ａ１遺伝子（ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ）由来のダイオキシン応答エレメント領域に隣接するマウス乳腺腫瘍ウイルスを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｂ）ｐＨＡＧＥ２−ＭＭＴＶ−ＤＲＥ−ＭＭＴＶ−ＮＬＳ−ｄｓＲｅｄ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させたＭＥＰにおけるＮＬＳ−ｄｓＲＥＤのＦＡＣＳ分析。感染細胞を処理せず、または５μＭ ＣＨ２２３１９１もしくは０．４μＭ ＦＩＣＺで処理した。（Ｃ）ＦＩＣＺまたはＣＨ２２３１９１の有無の場合における、ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞の相対蛍光単位。（Ｄ）モック感染細胞または感染細胞におけるｚｓ−Ｇｒｅｅｎ発現の位相差画像および蛍光画像。（Ｅ）１３日目のＭＥＰ＋ＦＩＣＺおよび／またはＣＨ２２３１９１からの、生細胞対死細胞（ＰＩ対Ｈｏｅｃｈｓｔ）の代表的なフローサイトメトリードットプロット。これらの実験のために、６日目に、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１でＭＥＰを前処理してから、７日目にＦＩＣＺを添加した。（Ｆ）「Ｅ」からのＭＥＰのｑＰＣＲ結果をβ−アクチンに対して正規化したもの。データは、三連のウェルの平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．００５。
図６Ａは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｂは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｃは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｄは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｅは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｆは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｇは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｈは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｉは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。 図６Ｊは、継続的なＡｈＲ活性化が赤血球の成熟を可能にする一方で、阻害／アンタゴニスト作用が巨核球の発生／特異化を促進することを示す。（Ａ）経時的にＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ７１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｂ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣを共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｃ）未成熟ＭＥＰおよび成熟ＭＥＰのライト−ギムザ染色。（Ｄ）ＭＥＰ＋ＥＰＯのヘモグロビン発現細胞ペレット。（Ｅ）ＣＤ２３５−ＰＥおよびＣＤ４１−ＦＩＴＣ＋ＣＨ２２３１９１を共発現する細胞の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。（Ｆ）構成的プロモーターＥｆ１α（ｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎ）の制御下にあるＡｈＲリプレッサー（ＡＨＲＲ）およびｚｓＧｒｅｅｎを含有するｐＨＡＧＥ２レンチウイルスレポーター構築物の概略図。（Ｇ）モックまたはｐＨＡＧＥ２−Ｅｆ１α−ＡＨＲＲ−ＩＲＥＳ−ｚｓＧｒｅｅｎを感染させた細胞であって、ＣＤ２３５−ＰＥまたはＣＤ４１−ＰＥ発現を示す細胞の代表的なＦＡＣＳドットプロット。（Ｈ）ＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球のライト−ギムザ染色。（Ｉ）産生された巨核球のＦＡＣＳによる倍数性分析。（Ｊ）ＡｈＲＲエレメントを共発現する細胞を標識するｚｓＧｒｅｅｎレポーターを発現する大細胞（巨核球）の位相画像および蛍光画像。
図７は、基準の（ｎｏｍｉｎａｌ）造血発生におけるＡｈＲ関与の機構図を示す。ＡｈＲアゴニスト作用は、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）集団の産生および増殖を可能にする。継続的なＡｈＲアゴニスト作用（ａｇｏｎｉｓｍ）は赤血球の発生を許容するのに対して、ＡｈＲアンタゴニスト作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）は、ＭＥＰが巨核球になるように選択的に方向付ける。
図８Ａは、ｉＰＳＣの再プログラミングに関与する遺伝子、およびＲＢＣの分化に関与する遺伝子の発現を示す。（Ａ）細胞がＲＢＣに定方向に分化すると、再プログラミング過程に関わる胚性遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇなどを含む）がダウンレギュレートされる。（Ｂ）この定方向分化系における赤血球特異化（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の１５日目および３０日目において、これらの細胞は、ＲＢＣへの欠くことのできない移入のための遺伝子の相補的で大きなアップレギュレーションを示す。 図８Ｂは、ｉＰＳＣの再プログラミングに関与する遺伝子、およびＲＢＣの分化に関与する遺伝子の発現を示す。（Ａ）細胞がＲＢＣに定方向に分化すると、再プログラミング過程に関わる胚性遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇなどを含む）がダウンレギュレートされる。（Ｂ）この定方向分化系における赤血球特異化（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の１５日目および３０日目において、これらの細胞は、ＲＢＣへの欠くことのできない移入のための遺伝子の相補的で大きなアップレギュレーションを示す。
図９Ａは、ヒト全血におけるグロビン遺伝子発現の質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。対照患者（Ａ）および鎌状赤血球症を患っている患者（９Ｂ）の末梢全血の分析を示す。 図９Ｂは、ヒト全血におけるグロビン遺伝子発現の質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。対照患者（Ａ）および鎌状赤血球症を患っている患者（９Ｂ）の末梢全血の分析を示す。
図１０は、本開示の方法によって作製したｉＰＳＣ由来ＲＢＣにおけるグロビン遺伝子発現の質量分析を示す。
図１１は、ｉＰＳＣ由来ＲＢＣを０．５μＭ ヒドロキシウレアＨＵに曝露すると、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ；ガンマ）の発現が約４倍増加することを示しており、これは、ｉＰＳＣ由来ＲＢＣがＨｂＦ誘導物質に対して応答性であることを示している。
図１２は、ＡｈＲアゴニスト作用が、マウス骨髄におけるＭＥＰ産生および増殖を促進することを示す。＋／−０．２μＭ ＦＩＣＺにおいて３日間成長させた赤血球除去Ｃ５７Ｂ６骨髄の代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロット。最初に、１×１０５個の細胞をＣＤ１６／３２ Ｆｃ受容体ブロックで処理し、続いて、指定マーカーについて直接コンジュゲートしたモノクローナル抗体で処理した。
図１３Ａは、ｉＰＳＣおよびＭＥＰが様々なＡｈＲアゴニストに対して応答性であることを示す。（Ａ）ＴＣＤＤまたはβ−ＮＦで４日間処理したｉＰＳＣにおけるＣＹＰ１Ｂ１のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、二連の（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルの平均＋ＳＥであり、値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化したものである。（Ｂ）β−ＮＦまたはＦＩＣＺで処理したＭＥＰにおけるＣＹＰ１Ｂ１のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、二連のウェルの平均＋ＳＥであり、値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化したものである。 図１３Ｂは、ｉＰＳＣおよびＭＥＰが様々なＡｈＲアゴニストに対して応答性であることを示す。（Ａ）ＴＣＤＤまたはβ−ＮＦで４日間処理したｉＰＳＣにおけるＣＹＰ１Ｂ１のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、二連の（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルの平均＋ＳＥであり、値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化したものである。（Ｂ）β−ＮＦまたはＦＩＣＺで処理したＭＥＰにおけるＣＹＰ１Ｂ１のＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、二連のウェルの平均＋ＳＥであり、値は、ＧＡＰＤＨに対して正規化したものである。
図１４は、ＡｈＲアンタゴニスト作用を使用して作り出したｉＰＳＣ−Ｍｋが、一連の顕著で特徴的なＭＫマーカーを発現することを示す。
図１５は、ｉＰＳＣ由来血小板が、全血に由来するものと極めて類似することを示す。
図１６Ａは、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺがインビボで活性であり、正常マウスにおいて血小板数の増加をもたらすことを示す。（Ａ）毎週用量漸増スキーム（１週目：１ｍｇ／ｋｇ；２週目：２ｍｇ／ｋｇ；３週目：４ｍｇ／ｋｇ）を使用して、植物油に懸濁したＦＩＣＺをＣ５７Ｂ６マウスに毎日腹腔内注射した。３つの時点（７日目、１４日目および２１日目）において、末梢血の出血をＨｅｍａｖｅｔで定量した。興味深いことに、より高用量のＦＩＣＺに直ぐに曝露し、１週目の漸増を受けなかったマウスは、より迅速で多くの血小板応答を示した。（Ｂ）３週の時点（ｔｈｅ ３ ｗｅｅｋ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの肝臓を取り出した。（Ｃ）３週の時点の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの脾臓を取り出した。 図１６Ｂは、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺがインビボで活性であり、正常マウスにおいて血小板数の増加をもたらすことを示す。（Ａ）毎週用量漸増スキーム（１週目：１ｍｇ／ｋｇ；２週目：２ｍｇ／ｋｇ；３週目：４ｍｇ／ｋｇ）を使用して、植物油に懸濁したＦＩＣＺをＣ５７Ｂ６マウスに毎日腹腔内注射した。３つの時点（７日目、１４日目および２１日目）において、末梢血の出血をＨｅｍａｖｅｔで定量した。興味深いことに、より高用量のＦＩＣＺに直ぐに曝露し、１週目の漸増を受けなかったマウスは、より迅速で多くの血小板応答を示した。（Ｂ）３週の時点（ｔｈｅ ３ ｗｅｅｋ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの肝臓を取り出した。（Ｃ）３週の時点の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの脾臓を取り出した。 図１６Ｃは、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺがインビボで活性であり、正常マウスにおいて血小板数の増加をもたらすことを示す。（Ａ）毎週用量漸増スキーム（１週目：１ｍｇ／ｋｇ；２週目：２ｍｇ／ｋｇ；３週目：４ｍｇ／ｋｇ）を使用して、植物油に懸濁したＦＩＣＺをＣ５７Ｂ６マウスに毎日腹腔内注射した。３つの時点（７日目、１４日目および２１日目）において、末梢血の出血をＨｅｍａｖｅｔで定量した。興味深いことに、より高用量のＦＩＣＺに直ぐに曝露し、１週目の漸増を受けなかったマウスは、より迅速で多くの血小板応答を示した。（Ｂ）３週の時点（ｔｈｅ ３ ｗｅｅｋ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの肝臓を取り出した。（Ｃ）３週の時点の後にマウスを屠殺し、ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにそれらの脾臓を取り出した。
図１７は、未分化ｉＰＳＣおよび分化ｉＰＳＣ（上）において作動し得るＡｈＲ構築物のショートヘアピンＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（下）を示す。
図１８は、Ｍｋにおける構築物の活性化が、巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）形成の劇的な増加を引き起こすことを示す。
図１９は、培養赤血球（ｃＲＢＣ）および血小板の分化におけるＡｈＲ調節の役割の概略図を示す。この過程では、ＡｈＲアゴニスト作用（ＡＨＲ＋）およびＡｈＲアンタゴニスト作用（ＡＨＲ−）の両方が用いられる。
詳細な説明
本明細書で特に定義されていない限り、本開示に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上必要ではない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションの技術に関して使用される命名法は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。本明細書で引用される特定の参考文献および他の文書は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。加えて、本明細書で引用される全てのＧｅｎｂａｎｋおよび他の配列データベースの記録は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書を適用する。材料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。
特に指示がない限り、本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法にしたがって、ならびに本明細書全体にわたって引用および議論されている様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
本開示は、インターネット上で公開されている特定のアミノ酸配列および核酸配列の配列データベースエントリ（例えば、ＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔの記録）、ならびにインターネット上の他の情報を参照する。当業者であれば、配列データベースエントリを含むインターネット上の情報が随時更新されていること、および例えば特定の配列を参照するのに使用した参照番号が変わり得ることを理解する。インターネット上の配列情報または他の情報の公開データベースを参照する場合、このような変更が起こる可能性があり、インターネット上の情報の特定の実施形態が一定ではない可能性があることを理解すべきである。当業者であれば、インターネット上で検索することによって同等の情報を発見し得るので、インターネットウェブページアドレスまたは配列データベースエントリを参照することにより、問題の情報の利用可能性および一般普及度が証明される。
本組成物、方法および他の実施形態を開示および記載する前に、本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的または開放的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、記載されていないさらなるメンバー、要素または方法工程を除外しない。
本明細書で使用される場合、「インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」という用語は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内ではなく人工的な環境（例えば、試験管または反応容器で、細胞培養物で、ペトリ皿で、など）で起こる事象を指す。
本明細書で使用される場合、「インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）」という用語は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内で起こる事象を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）それが最初に生成された場合に会合していた成分の少なくとも一部から分離されたか（天然または実験的状況に関わらず）、ならびに／または（２）人の手によって生成、調製および／もしくは製造された物質または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用物質（ａｇｅｎｔ）は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。
本開示のＭＥＰ、ＲＢＣ、巨核球および血小板は、典型的には、哺乳動物の細胞または有袋類の細胞である。本明細書で使用される場合、「哺乳類」および「哺乳類の」は、限定されないが、ヒトを含むすべての霊長類；マウスおよびラットを含む齧歯類；ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む家畜；ならびにイヌおよびネコを含むコンパニオンアニマルを含む分類学的クラスの哺乳類の任意のメンバーを指す。
「ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０個未満のアミノ酸、より典型的には約３０個未満のアミノ酸を含有するものを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、構造的機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣する類似体および模倣体を包含する。
「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク質の両方、ならびにそれらの断片、変異体、誘導体および類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、それぞれが１つ以上の別個の活性を有するいくつかの異なるドメインを含み得る。疑義を防ぐために、「ポリペプチド」は、２超の任意の長さのアミノ酸であり得る。
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起原または派生物の源に基づいて（１）そのネイティブな状態でそれに付随する天然に会合していた成分と会合していないか、（２）天然に見出されない純度（この場合、純度は、他の細胞材料の存在に関して判断され得る）（例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を含まない）で存在しているか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるものであるか、または（４）天然に存在しない（例えば、天然に見出されるポリペプチドの断片であるか、または天然に見出されないアミノ酸の類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成されたか、またはそれが天然に由来する細胞と異なる細胞システム（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ）で合成されたポリペプチドは、その天然に会合していた成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することによって、天然に会合していた成分を実質的に含まないようにされ得る。このように定義されるように、「単離された」は、このように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、それが合成された細胞から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド断片」という用語は、全長ポリペプチド、例えば天然に存在するタンパク質と比較して、欠失、例えば、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列の対応する位置と同一である連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸長、または少なくとも１２、１４、１６もしくは１８アミノ酸長、または少なくとも２０アミノ酸長、または少なくとも２５、３０、３５、４０もしくは４５アミノ酸、または少なくとも５０もしくは６０アミノ酸長、または少なくとも７０アミノ酸長である。
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列にカップリングされたポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質に由来し得る２つ以上の所望の機能的要素を含有するよう構築され得るので有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドに由来する少なくとも１０個の連続アミノ酸、または少なくとも２０個もしくは３０個のアミノ酸、または少なくとも４０個、５０個もしくは６０個のアミノ酸、または少なくとも７５個、１００個もしくは１２５個のアミノ酸を含む。融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、通常、少なくとも６アミノ酸長、または少なくとも８アミノ酸長、または少なくとも１５、２０もしくは２５アミノ酸長である。ＩｇＧ Ｆｃ領域などのより大きなポリペプチド、そしてさらには緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）クロモフォア含有タンパク質などのタンパク質全体を含む融合体は、特に有益である。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームで、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって組換え生成され得る。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を代替のタンパク質と架橋することによって化学的に生成され得る。
本明細書で使用される場合、あるタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、このタンパク質は、第２のタンパク質との「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」を有するか、または第２のタンパク質と「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」である。あるいは、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有する場合、あるタンパク質は、第２のタンパク質との相同性を有する。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。）本明細書で使用される場合、（特に、予測された構造的類似性に関する）アミノ酸配列の２つの領域間の相同性は、機能の類似性を示すと解釈される。
「相同」がタンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと認識される。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する代替のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質について、配列同一性の割合または相同性の程度を上方調整して補正し得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１ ａｎｄ ２５：３６５−８９を参照のこと。
以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン、トレオニン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン；４）アルギニン、リジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、および６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
配列同一性の割合とも称されるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して、類似配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含有しており、これをデフォルトパラメータで使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチドなどの近縁のポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。
特定のポリペプチド配列を、異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の例示的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）； Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６−２７２ （１９９３）； Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−１４１ （１９９６）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９−６５６ （１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））である。
ＢＬＡＳＴｐの例示的なパラメータは以下のとおりである：期待値（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）：１０（デフォルト）；フィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップ開始コスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ）：１１（デフォルト）；ギャップ伸長コスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ）：１（デフォルト）；最大アラインメント（Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）：１００（デフォルト）；ワードサイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：１１（デフォルト）；表示数（Ｎｏ．ｏｆ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）：１００（デフォルト）；ペナルティマトリックス（Ｐｅｎａｌｔｙ Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、または少なくとも約２０残基、または少なくとも約２４残基、または少なくとも約２８残基、または約３５残基超である。多数の異なる生物に由来する配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列の比較が有用であり得る。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、当技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１に含まれるプログラムのＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列との間の最も重複する領域のアライメントおよび配列同一性の割合を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性の割合は、ＧＣＧバージョン６．１（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されているそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）でＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子（例えば、ポリペプチド配列または核酸配列）は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である場合、互いに「相同」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％類似である場合、互いに「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は必ず、少なくとも２つの配列（ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）間の比較を指す。いくつかの実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一または少なくとも約９０％同一である場合、相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、相同ヌクレオチド配列は、一意的に特定の少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。相同であるとみなそうとするヌクレオチド配列について、これらのアミノ酸の互いに対する同一性および隣接間隔の両方を考慮しなければならない。長さが６０ヌクレオチド未満のヌクレオチド配列のいくつかの実施形態では、一意的に特定の少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力によって、相同性が決定される。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質配列は、そのタンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一または少なくとも約９０％同一である場合、相同であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、「改変誘導体」は、一次構造配列が参照ポリペプチド配列と実質的に相同であるが、例えば、インビボもしくはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含むか、または参照ポリペプチドに見出されないアミノ酸を取り込んだポリペプチドまたはその断片を指す。当業者であれば容易に認識するように、このような改変としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種による標識および様々な酵素的改変が挙げられる。このような目的に有用な様々なポリペプチド標識方法および置換基または標識が当技術分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの放射性同位体、標識抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドが挙げられる。標識の選択は、必要な感度、プライマーとのコンジュゲーションの容易性、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチド標識方法は当技術分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」は、その配列が、天然または野生型タンパク質などの参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列または置換を含有するポリペプチドを指す。ムテインは、ある位置の単一アミノ酸が代替のアミノ酸に変化した１つ以上のアミノ酸点置換、１つ以上のアミノ酸が参照タンパク質の配列においてそれぞれ挿入もしくは欠失されている１つ以上の挿入および／もしくは欠失、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端いずれかまたは両方における短縮型アミノ酸配列を有し得る。ムテインは、参照タンパク質と比較して、同じまたは異なる生物学的活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ムテインは、例えば、そのカウンターパート参照タンパク質と少なくとも８５％の全体的配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型タンパク質と少なくとも９０％の全体的配列相同性を有する。他の実施形態では、ムテインは、少なくとも９５％の配列同一性、または９８％もしくは９９％もしくは９９．５％もしくは９９．９％の全体的配列同一性を示す。
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、受容体の内因性リガンドがその受容体に結合することによって引き起こされる少なくとも１つの反応である反応を引き起こす作用物質を指す。いくつかの実施形態では、アゴニストは、それ自体が受容体の活性を調節する第２の作用物質に対して直接的または間接的に作用し得る。いくつかの実施形態では、受容体の少なくとも１つの反応は、限定されないが、生理学的、薬理学的および生化学的アッセイを含むアッセイを用いて測定され得る受容体の活性である。例示的なアッセイとしては、限定されないが、受容体に対する作用物質の結合、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に対する受容体（例えば限定されないが、標的遺伝子の核受容体および調節エレメント）の結合、ｍＲＮＡまたは得られたタンパク質レベルでアッセイされる遺伝子発現に対する効果、および受容体によって直接的または間接的に調節されるタンパク質の活性に対する効果を測定するアッセイが挙げられる。例えば、ＡｈＲ受容体活性は、ＣＹＰ１Ｂ１などのＡｈＲ標的遺伝子の発現をモニタリングすることによって測定され得る。
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、受容体のアゴニストがその受容体に結合することによって引き起こされる少なくとも１つの反応である反応を阻害する作用物質を指す。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、それ自体が受容体の活性を調節する第２の作用物質に対して直接的または間接的に作用し得る。いくつかの実施形態では、受容体の少なくとも１つの反応は、限定されないが、生理学的、薬理学的および生化学的アッセイを含むアッセイを用いて測定され得る受容体の活性である。例示的なアッセイとしては、限定されないが、受容体に対する作用物質の結合、基質に対する受容体（例えば限定されないが、標的遺伝子の核受容体および調節エレメント）の結合、ｍＲＮＡまたは得られたタンパク質レベルでアッセイされる遺伝子発現に対する効果、および受容体によって直接的または間接的に調節されるタンパク質の活性に対する効果を測定するアッセイが挙げられる。例えば、ＡｈＲ受容体活性は、ＣＹＰ１Ｂ１などのＡｈＲ標的遺伝子の発現をモニタリングすることによって測定され得る。
本明細書で使用される場合、「作用物質」または「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）」という用語は、限定されないが、化合物、例えば低分子もしくは複雑な有機化合物、タンパク質、例えば抗体もしくは抗体断片、もしくは抗体断片を含むタンパク質、または生体内においてＤＮＡもしくはｍＲＮＡレベルで作用する遺伝子構築物を含む物質を指す。
本明細書で使用される場合、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」および「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、活性、機能または特徴を変化または改変することを指す。「調節物質」という用語は、活性、機能または特徴を調節する作用物質を指す。例えば、作用物質は、その作用物質の非存在下における活性に対する効果と比較して、活性を増加または減少させることによって活性を調節し得る。いくつかの実施形態では、活性、機能または特徴を増加させる調節物質は、アゴニストである。いくつかの実施形態では、活性、機能または特徴を増加させる調節物質は、アンタゴニストである。
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「改善」という用語は、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を回復、緩和、改善、阻害、遅延および／または止めることが目的の治療処置を指す。前記用語は、血小板などの少なくとも１つの血液細胞型の数不足または品質欠陥に関連する状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症候を軽減または緩和することを含む。処置は、一般に、１つ以上の症候または臨床マーカーが軽減される場合に「有効」である。あるいは、処置は、疾患進行が軽減または中断される場合に「有効」である。すなわち、「処置」は、症候またはマーカーの改善だけではなく、処置がない場合に予想される症候の進行または悪化を停止または少なくとも減速すること（ａ ｃｅｓｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔ ｌｅａｓｔ ｓｌｏｗｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｒ ｗｏｒｓｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍｓ）も含む。検出可能または検出不可能にかかわらず、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、１つ以上の症候の緩和、疾患程度の縮小、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的または完全にかかわらず）が挙げられる。疾患に関する「処置する（ｔｒｅａｔ）」「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「改善」という用語はまた、疾患の症候または副作用からの解放（待機処置を含む）を提供することを含む。
本明細書で使用される場合、「共投与される（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒｅｄ）」および「共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、状態を処置するために、少なくとも２つの薬剤（ａｇｅｎｔ）を哺乳類に投与することを指し、少なくとも２つの薬剤は、少なくとも１用量の各薬剤の投与が重なる治療投与期間にわたって投与される。例えば、薬剤Ａを１日目に投与し、薬剤Ｂを２日目に投与し、薬剤Ａを３日目に投与する場合、薬剤ＡおよびＢは共投与される。治療投与期間は、薬剤の１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回またはそれより多い投与を含み得る。投与は、例えば、毎日、週３回、週２回、毎週、２週間毎または毎月であり得る。
Ａ．本開示の序文
ＨＳＣの全８種の血液細胞系統への分化は厳密に調節されており、個体の一生の間にわずかだが重要な方法で変化する重要な生理学的過程である。この調節の破壊は、複数の造血細胞型に対して重大な下流効果を有し、潜在的には骨髄異形成、混合型白血病（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＣＭＬ、リンパ腫、幹細胞の枯渇、血小板減少症、貧血および他の血液細胞障害につながり得る。しかしながら、一次ヒト血液細胞の特異化を制御する分子機構の定義は、十分な数の幹細胞または前駆細胞を成長させ得るプラットフォームが不足していること、およびそれらの細胞が最終期の細胞に分化するように方向付けるための実用的かつ効率的な技術が欠如していることによって妨げられている。例えば、いくつかのチームが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの巨核球（Ｍｋ）（１）および赤血球系細胞（２）の誘導に関する原理証明例を公開している。しかしながら、これらの細胞集団のロバストな増殖をもたらし、細胞分化を駆動する分子シグナルを容易に研究し得るモデル系の開発が問題となっている。
この明白な、満たされていない必要性に対処する本発明者らの概念的アプローチは、遺伝学的に扱いやすいｉＰＳＣベースのプラットフォームを作り出すのに必要な細胞型の数および範囲を得るために、天然の造血細胞発生シーケンスをインビトロで模倣することであった。本明細書に示されているように、この新たなプラットフォームの重要な要素は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の過剰活性化が、骨髄系−赤血球前駆細胞の成長ならびにｉＰＳＣからのＭｋおよび赤血球系細胞の生成を可能にすることの実証である。
ＡｈＲは、進化的に保存されたＰｅｒ／ＡＲＮＴ／ＳＩＭ（ＰＡＳ）転写因子ファミリーのメンバーである。それは、内因性または外因性リガンドによって活性化されることが公知である唯一のＰＡＳファミリーメンバーである。ＰＡＳタンパク質は、いくつかの重要な生理学的過程に寄与する。歴史的には、進化的に保存されたＡｈＲは、ダイオキシン、ポリ塩化ビフェニルおよび多環式芳香族炭化水素を含む様々な普遍的環境汚染物質によるその活性化と、それに続くシトクロムＰ４５０コード遺伝子（この産物は、変異原性または毒性中間体の産生を触媒する）のトランス活性化との関連で研究された。しかしながら、ＡｈＲは、環境リガンドの非存在下で重要な生理学的役割を果たすという実証を受けて、ＡｈＲの分野では最近大きなパラダイムシフトが起こっている。例えば、いくつかの研究により、ＡｈＲは、自己免疫反応、炎症、細胞成長、細胞遊走、アポトーシスおよびがんの進行の調節に寄与することが実証されている。具体的には、造血細胞に関して、いくつかの高プロファイル研究により、ＡｈＲは、Ｔｈ１７細胞、調節性Ｔ細胞サブセットおよび腸関連Ｔ細胞の発生を調節することが実証されている。
重要なことに、最近の画期的な研究により、ＡｈＲは、基準のＨＳＣ成長および分化において重要な役割を果たすことが示唆されている。例えば、ＡｈＲ−／−マウスは、骨髄ＨＳＣ数の増加、およびそれに応じたリンパ腫発症傾向の増加を特徴とする。さらに、ＡｈＲ−／−マウスは、減少した数の赤血球および血小板、低倍数性のＭｋ、ならびに増加した数のＢ系統細胞および骨髄細胞を産生する。これらの結果から、内因性リガンドによって活性化されたＡｈＲは、幹細胞の成長および／または分化を調節するという仮説が導かれた。
これらの初期結果にもかかわらず、多くの重要な疑問が依然として残っている。具体的には、両能性前駆細胞からのＭｋまたは赤血球系細胞の発生に対するＡｈＲ調節の効果はほとんど知られていない。若齢ＡｈＲ−／−マウスにおけるＨＳＣ、赤血球および血小板の数の減少、ならびにＡｈＲ−／−マウスの年齢とともに骨髄細胞およびＢ系統細胞に向けての血液細胞レパートリーのバランスが傾くこと（ｓｋｅｗｉｎｇ）によって、ＡｈＲがこの過程に関与することが示唆されている。
これらの研究に基づいて、Ｍｋおよび赤血球細胞の分化を研究するためのロバストな系を開発するために、本発明者らは、ｉＰＳＣを造血前駆細胞およびその子孫への定方向分化のための、フィーダーフリーの化学的に定義された新規プロトコールを開発した。この系の必要なエレメントは、強力なＡｈＲアゴニストである６−ホルミルインドール（３，２−ｂ）カルバゾール（ＦＩＣＺ）を用いてＡｈＲを過剰活性化することであることが示された。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるインビトロ系は、最終期の赤血球（ＲＢＣ）およびＭｋの生成において、インビボ発生中に一時的に存在する純粋な巨核球−赤血球前駆細胞集団の培養物においての捕獲および増殖を可能にする。いくつかの実施形態では、このプラットフォームは、ＡｈＲ調節を使用して多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）からの両能性造血前駆細胞および子孫の産生を誘導することにおいて、これまでにない効率および一貫性を可能にする。ＭＥＰ、ＭｋおよびＲＢＣの発生におけるＡｈＲの重要な役割を実証することに加えて、前記プラットフォームは、複数の、発生の所定の期で血液細胞分化を研究するための重要かつ遺伝学的に扱いやすい系を提供する。おそらく最も重要なことに、本明細書で提示されるプラットフォームは、治療用の患者特異的血小板およびＲＢＣのインビトロ生成に向けた重要な工程を意味する。
さらに、本研究では、ＡｈＲは造血において生理学的および機能的な役割を有すること、ならびに両能性造血前駆細胞におけるこの受容体を調節することにより細胞の発生運命を方向付け得ることを示す。
Ｂ．幹細胞
幹細胞は、分裂して様々な特殊な細胞型に分化し得る多細胞生物中の細胞であって、自己再生して、同じ特性を有するより多くの幹細胞を産生し得る細胞である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかに分化する潜在能力を有する幹細胞である：内胚葉（例えば、胃内層、胃腸管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器系）および外胚葉（例えば、表皮組織および神経系）。多能性幹細胞は、任意の胎児細胞型または成体細胞型を生じさせ得る。本開示の目的のために、「多能性幹細胞」は、生きている完全な生物を構築し得る細胞である全能性幹細胞を含み得る。これらの細胞は、卵および精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生される細胞も全能性である。多能性幹細胞としては、限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によって生成された細胞が挙げられる。
ＥＳ細胞は、初期哺乳類の胚の胚盤胞の内部細胞塊に由来する全能性幹細胞である。本開示の特定の実施形態と併せて使用され得る多数の樹立ＥＳ細胞系のように、哺乳類のＥＳ細胞を誘導する方法は当技術分野で周知である。
ｉＰＳＣは、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、非多能性細胞−典型的には、成体体細胞−から人工的に誘導された多能性幹細胞の一種である。多くの態様では、人工多能性幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞などの天然多能性幹細胞に類似し、例えばいくつかの実施形態では、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存能力のあるキメラの形成、ならびに効力および分化可能性の少なくとも１つが類似するが、天然多能性幹細胞との完全な関係が依然として評価される。
ｉＰＳＣは、典型的には、特定の幹細胞関連遺伝子を成体線維芽細胞などの非多能性細胞にトランスフェクトすることによって誘導される。トランスフェクションは、典型的には、レトロウイルスなどのウイルスベクターを介して達成される。トランスフェクト遺伝子としては、マスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）およびＳｏｘ２が挙げられ得る。トランスフェクト後、時間の経過と共に、少数のトランスフェクト細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似するようになり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、レポーター遺伝子および抗生物質選択の少なくとも１つによって単離される。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４タンパク質をコードするオープンリーディングフレームで体細胞をトランスフェクトすることを含む方法によって形成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードするオープンリーディングフレームで体細胞をトランスフェクトすることを含む方法によって形成される。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、レトロウイルスベクターを体細胞に導入することを含む。代替的な実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのｉＰＳＣ形成低分子誘導物質で体細胞を処理することを含む方法によって形成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのｉＰＳＣ形成低分子誘導物質で体細胞を処理すること、およびｉＰＳＣ形成タンパク質誘導物質をコードするオープンリーディングフレームで体細胞をトランスフェクトすることを含む方法によって形成される。このような実施形態では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８から選択され得る。
ｉＰＳＣは、多分化能幹細胞を生じさせ得る。造血系において、ｉＰＳＣまたはＥＳ細胞は、血管芽細胞状態（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｉｃ ｓｔａｔｅ）の細胞を生じさせ得る。次いで今度は、前記血管芽細胞が造血幹細胞を生じさせ、これがＭＥＰ細胞を生じさせる。
本開示を読んだ当業者には明らかであるように、ＭＥＰに分化することができる任意の多能性幹細胞または任意の多分化能幹細胞は、ＲＢＣおよび／または血小板を作製するために、本明細書に開示される方法の実施形態で使用され得る。
Ｃ．造血細胞の種類
すべての細胞性血液成分は、造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。健常成人では、末梢循環中の定常状態レベルを維持するために、約１０１１〜１０１２個の新たな血液細胞が毎日産生される。ＨＳＣは骨（骨髄）の髄質に存在し、様々な成熟血液細胞型のすべてを生じさせるユニークな能力を有する。ＨＳＣは増殖のときに自己再生し、それらの娘細胞の少なくとも一部はＨＳＣのままであるので、幹細胞のプールは枯渇しない。しかしながら、ＨＳＣの他の娘（骨髄前駆細胞およびリンパ前駆細胞）は、１つ以上の特定の種類の血液細胞の産生をもたらす選択的分化経路のいずれかにそれぞれコミットすることができるが、自己再生することはできない。ＨＳＣは、骨髄系共通前駆細胞およびリンパ系共通前駆細胞を生じさせる。本開示は、赤血球および巨核球（今度は、これが血小板に分化し得る）を生じさせ得る骨髄系共通前駆細胞（骨髄系−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）と称される）の下流の細胞型を同定する。
１．骨髄系−赤血球前駆細胞
本明細書で使用される場合、「骨髄系−赤血球前駆細胞」（またはＭＥＰ）は、巨核球および赤血球を生じさせる細胞である。それは、最も一般的には、骨髄系共通前駆細胞に由来する。いくつかの実施形態では、ＭＥＰは、赤血球系マーカーのグリコホリンＡ（ヒトではＣＤ２３５としても公知である）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０２７２４）および巨核球系マーカーのインテグリンアルファ２ｂ（ヒトではＣＤ４１）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０８５１４）の共発現を特徴とする（Ｋｌｉｍｃｈｅｎｋｏら、Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４（８）：１５０６−１７）。いくつかの実施形態では、ＭＥＰはＣＤ３４を発現しない。
２．赤血球
赤血球（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は最も一般的な種類の血液細胞であり、循環系を通る血流を介して酸素（Ｏ２）を身体組織に送達する脊椎動物生物の主な手段である。それらは肺または鰓の酸素を取り込み、体の毛細血管を通り抜ける際にそれを放出する。ＲＢＣの細胞質は、ヘモグロビン（これは酸素に結合することができ、血液の赤色の原因である鉄含有生体分子である）が豊富である。
ヒトでは、成熟赤血球は、楕円形で柔軟性のある両凹円板である。ヘモグロビンのための最大限の空間を提供するために、それらは細胞核およびほとんどのオルガネラを欠く。１秒当たり２４０万個の新たな赤血球が産生されている。この細胞は骨髄で発生し、体内で約１００〜１２０日間循環してから、それらの成分はマクロファージによって再利用される。各循環には約２０秒間かかる。ヒトの体内の細胞の約４分の１が赤血球である。
いくつかの実施形態では、「赤血球」は、グリコホリンＡ（ヒトではＣＤ２３５としても公知である）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０２７２４）およびトランスフェリン受容体（ヒトではＣＤ７１）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０２７８６）を共発現する細胞である（Ｈａｔｔａｎｇａｄｉら、Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１８（２４）：６２５８−６８．）。いくつかの実施形態では、赤血球は、少なくとも１つのヘモグロビン遺伝子をさらに発現する。いくつかの実施形態では、赤血球は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）、ならびに成人型ヘモグロビンのアルファおよびベータサブユニット（ＨｂＡおよびＨｂＢ）の両方を発現する。典型的には、この細胞は造血前駆細胞に似ており、成熟するとサイズが減少し、クロマチン凝縮を示す（ＲＢＣ成熟の兆候でもある）。
３．巨核球
巨核球は、正常な血液凝固に必要な血液栓球（血小板）の産生に関わる骨髄細胞である。巨核球は、通常、骨髄細胞の１／１０，０００を占めるが、特定の疾患の経過の間に数がほぼ１０倍に増加し得る。一般に、巨核球は典型的な赤血球よりも１０〜１５倍大きく、平均で直径５０〜１００μｍである。その成熟中に、巨核球はサイズが成長し、核内有糸分裂と称される過程において細胞質分裂を伴わずにそのＤＮＡを複製する。その結果、巨核球の核は非常に大きくて分葉状になり得、光学顕微鏡下では、数個の核があるという誤った印象を与え得る。いくつかの場合では、核は、ヒト細胞では最大６４ＮのＤＮＡ、または３２コピーの正常なＤＮＡ相補体を含有し得る。細胞質は、それから出芽して分離する血小板と同じように、α−顆粒およびデンスボディを含有する。
いくつかの実施形態では、「巨核球」は、インテグリンアルファ２ｂ（ヒトではＣＤ４１）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０８５１４）およびグリコプロテインＩｂ（ヒトではＣＤ４２）タンパク質（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０７３５９）を共発現する細胞である（Ｙｕ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１２；７８８：２９１−３０３）。いくつかの実施形態では、巨核球は、ＧＰ１ｂアルファを発現する。いくつかの実施形態では、巨核球は、ｖＷＦ（フォンウィルブランド受容体）およびＣＤ６２Ｐ（ｐセレクチン）をさらに発現する。いくつかの実施形態では、「巨核球」は、特徴的な倍数性、細胞産生において少なくとも８Ｎまたは少なくとも１６Ｎまで核内倍加する（ｅｎｄｏｒｅｐｌｉｃａｔｅ）能力、および細胞表面における顕著な巨核球胞体突起突出の少なくとも１つを示す細胞である（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００５ Ｄｅｃ；１１５（１２）：３３３９−４７）。いくつかの実施形態では、巨核球は２Ｎまたは４Ｎである。
４．血小板
血小板または栓球は、直径２〜３μｍの小さな不規則形状の明瞭な細胞断片（すなわち、ＤＮＡを含有する核を有しない細胞）であり、前駆体巨核球の断片化から生じる。血小板の平均寿命は、通常、わずか５〜９日間である。血小板は、天然の成長因子源である。それらは哺乳類の血中を循環し、血栓形成につながる止血に関与する。
いくつかの実施形態では、血小板は、ＣＤ６２Ｐなどの成熟巨核球マーカーの発現によって同定される。機能性のために、血小板接着アッセイが実施されるか、またはＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａ（ＣＤ４１ａ／ＣＤ４２ｂ）複合体を調べるインサイド・アウトのシグナル伝達アッセイおよびアウトサイド・インのシグナル伝達アッセイが実施される。
５．前駆細胞
図１９は、多能性幹細胞から血小板またはＲＢＣへの分化中に形成された一連の細胞型を示す。図１９で同定されている任意の所定の細胞型について、所定の細胞型に分化する潜在能力を有する上流の細胞型すべてが、その所定の細胞型の「前駆」細胞である。したがって、ＨＳＣの前駆細胞としては、ＰＳＣおよび血管芽細胞が挙げられる。
本開示の目的のために、「ＭＥＰ前駆細胞」は、ＭＥＰに分化する潜在能力を有する任意の細胞である。この用語は、限定されないが、多能性幹細胞、血管芽細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）および骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む。
本開示の目的のために、「巨核球前駆細胞」は、巨核球に分化する潜在能力を有する任意の細胞である。この用語は、限定されないが、多能性幹細胞、血管芽細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）およびＭＥＰを含む。
本開示の目的のために、「血小板前駆細胞」は、血小板に分化する潜在能力を有する任意の細胞である。この用語は、限定されないが、多能性幹細胞、血管芽細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、ＭＥＰおよび巨核球を含む。
本開示の目的のために、「網状赤血球前駆細胞」は、網状赤血球に分化する潜在能力を有する任意の細胞である。この用語は、限定されないが、多能性幹細胞、血管芽細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）およびＭＥＰを含む。
本開示の目的のために、「赤血球前駆細胞」または「ＲＢＣ前駆細胞」は、網状赤血球（ＲＢＣとしても公知である）に分化する潜在能力を有する任意の細胞である。この用語は、限定されないが、多能性幹細胞、血管芽細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、ＭＥＰおよび網状赤血球を含む。
Ｄ．巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）の作製方法
本開示はまた、ＭＥＰ前駆細胞からＭＥＰを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＥＰ前駆細胞は、多能性幹細胞などの幹細胞である。実施例で実証されているように、本発明者らは、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させるための方法およびプロトコールを確立した。いかなる理論にも縛られるものではないが、出発細胞として多能性幹細胞を使用する実施例で実証した方法は、血管芽細胞、造血幹細胞または骨髄系共通前駆細胞の使用にも広く適用可能であると考えられる。
いくつかの非限定的な実施形態では、前記方法は、培養物において、従来技術の方法と比較して速い速度でのＭＥＰの生成および長期間にわたるＭＥＰの生成の少なくとも１つを可能にする。いくつかの実施形態では、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）の存在下で、ＭＥＰ前駆細胞（例えば、多能性幹細胞）をＭＥＰに分化させる。実施例で実証されているように、分化過程中、ＡｈＲアゴニストが培養物に存在することにより、いくつかの実施形態ではＭＥＰを指数関数的に生成することが可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、培養物中の産生されたＭＥＰの数は、指数関数的に増加する。いくつかの実施形態では、培養物中の産生されたＭＥＰの数は、例えば、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間または少なくとも３０日間の培養期間にわたって指数関数的に増加する。
ＭＥＰ前駆細胞（例えば、多能性幹細胞）のＭＥＰへの分化は、使用されるＭＥＰ前駆体の種類（複数可）に応じて多段階過程であり得る。例えば、ＭＥＰ前駆体が多能性幹細胞である場合、ＰＳＣは、それが最初の多能性状態から血管芽細胞（造血−内皮）状態に、多分化能ＨＳＣ状態に、ＭＥＰ発生運命（ｆａｔｅ）に分化するにつれて、一連の細胞−発生運命決定を受ける。当然のことながら、血管芽（造血−内皮）細胞または多分化能ＨＳＣ細胞を出発細胞として使用してＭＥＰに分化させる場合、前記手順の最初の工程を除外または改変し得る。「アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質の存在下の培養物において多能性幹細胞などの幹細胞をＭＥＰに分化させる」は、ＡｈＲ調節物質が、全細胞培養期間の少なくとも一部の期間にわたって培養培地中に存在することを意味する。いくつかの実施形態では、一部の期間は、１〜１２時間、３〜１２時間、６〜１２時間、６〜２４時間、１２〜２４時間、１〜２日間、２〜４日間、３〜６日間、１〜２週間、２〜４週間および４〜８週間から選択される。いくつかの実施形態では、一部の期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも２日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間および少なくとも８週間から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＥＰ前駆細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアゴニストである。
いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、培養期間全体にわたって存在する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質の非存在下でＭＥＰ前駆細胞の培養を開始し、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間および少なくとも２週間から選択される期間後に、ＡｈＲ調節物質を添加する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質の非存在下でＭＥＰ前駆細胞の培養を開始し、１２〜２４時間、１〜２日間、１〜３日間、２〜４日間、３〜６日間、４〜７日間、５〜１０日間、６〜１０日間および７〜１０日間から選択される期間後に、ＡｈＲ調節物質を添加する。いくつかの実施形態では、ＭＥＰ前駆細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアゴニストである。
いくつかの実施形態では、ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を第１の期間にわたって培養し、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下で第２の期間にわたって培養する。いくつかの実施形態では、第１の期間は、１〜１２時間、３〜１２時間、６〜１２時間、６〜２４時間、１２〜２４時間、１〜２日間、２〜４日間、３〜６日間、１〜２週間、２〜４週間および４〜８週間から選択される。いくつかの実施形態では、第１の期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも２日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間および少なくとも８週間から選択される。いくつかの実施形態では、第２の期間は、１〜１２時間、３〜１２時間、６〜１２時間、６〜２４時間、１２〜２４時間、１〜２日間、２〜４日間、３〜６日間、１〜２週間、２〜４週間および４〜８週間から選択される。いくつかの実施形態では、第２の期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも２日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間および少なくとも８週間から選択される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ＡｈＲ調節物質の非存在下で第３の期間にわたって培養することを含む。いくつかの実施形態では、第３の期間は、第１の期間の後で第２の期間の前である。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ｖＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ＷＮＴ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、ＦＬＴ３（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）、ＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）およびＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在下の培養物において、多能性幹細胞をＭＥＰに分化させる。いくつかの実施形態では、前記タンパク質の１つ以上を、類似の活性を有する別のタンパク質で置き換える。いくつかの実施形態では、上記タンパク質の１つを、上記タンパク質の断片、上記タンパク質の断片もしくは上記タンパク質全体を含む融合タンパク質、上記タンパク質の相同体、上記タンパク質の改変誘導体、または上記タンパク質のムテインであることから選択される少なくとも１つの特徴を有するタンパク質で置き換える。いくつかの実施形態では、ＡｈＲアゴニストは、少なくとも１つの因子と一緒に培養物に存在する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含まない方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させる。
いくつかの実施形態では、因子の組み合わせを含む少なくとも１つの培養培地中で培養することを含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させ、培養培地および因子の組み合わせは、以下から選択される組成を含む：
ａ）ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）およびノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：Ｗｎｔ３ａの比は、約１：１０：５である）を補充したＲＰＭＩ培地；
ｂ）ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）およびＫＯＳＲ；（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＲＰＭＩ培地；
ｃ）ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）およびｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｄ）ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）およびｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約３：１である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｅ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）およびＦｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンドの比は、約２：４：４：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；
ｆ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンド：ｈＴＰＯ：ＩＬ−６の比は、約５：１０：１０：２．５：１０：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；ならびに
ｇ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）およびｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）およびＡｈＲアゴニスト（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンド：ｈＴＰＯ：ＩＬ−６の比は、約５：１０：１０：２．５：１０：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物。
いくつかの実施形態では、因子の組み合わせを含む少なくとも１つの培養培地中で培養することを含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させ、培養培地および因子の組み合わせは、以下から選択される組成を含む：
ａ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）および１０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：Ｗｎｔ３ａの比は、約１：１０：５である）を補充したＲＰＭＩ培地；
ｂ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、１６〜２４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）および１０％ＫＯＳＲ（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＲＰＭＩ培地；
ｃ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および１６〜２４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｄ）４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および４〜６ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約３：１である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｅ）１％Ｂ２７、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、１２〜１８ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、４〜６ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）および２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンドの比は、約２：４：４：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；
ｆ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、８〜１２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、０．５〜２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンド：ｈＴＰＯ：ＩＬ−６の比は、約５：１０：１０：２．５：１０：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；
ｇ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、８〜１２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、０．５〜２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンド：ｈＴＰＯ：ＩＬ−６の比は、約５：１０：１０：２．５：１０：１である）およびＡｈＲアゴニストを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物。
いくつかの実施形態では、因子の組み合わせを含む少なくとも１つの培養培地中で培養することを含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させ、培養培地および因子の組み合わせは、以下から選択される組成を含む：
ａ）約５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、約２５ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）および約１０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を補充したＲＰＭＩ培地；
ｂ）約５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、約２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）および約１０％ＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ培地；
ｃ）約５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および約２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｄ）約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および約５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地；
ｅ）約１％Ｂ２７、約０．５％Ｎ２−サプリメント、約０．５％ＢＳＡ、約１５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、約５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）および約２５ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；
ｆ）約１％Ｂ２７、約０．５％Ｎ２−サプリメント、約０．５％ＢＳＡ、約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、約１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、約２５ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および約５０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、約１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、約０．５Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物；ならびに
ｇ）約１％Ｂ２７、約０．５％Ｎ２−サプリメント、約０．５％ＢＳＡ、約５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、約１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、約１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、約２５ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および約５０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、約１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、約０．５Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）およびＡｈＲアゴニストを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２培地の混合物。
いくつかの実施形態では、以下を含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させる：
ａ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）およびノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
ｂ）ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）およびＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ培地中で、工程ａ）から得られた細胞を培養すること；
ｃ）ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）およびｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｂ）から得られた細胞を培養すること；
ｄ）ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）およびｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｃ）から得られた細胞を培養すること；
ｅ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）およびＦｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｄ）から得られた細胞を培養すること；ならびに
ｆ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）およびｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｅ）から得られた細胞を培養すること。
いくつかの実施形態では、培養工程ａ）〜ｅ）の少なくとも１つで使用される培養培地は、ＡｈＲアンタゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、工程ｆ）で使用される培養培地は、ＡｈＲアゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させる：
ａ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）および１０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ））（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：Ｗｎｔ３ａの比は、約１：１０：５である）を補充したＲＰＭＩ培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
ｂ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、１６〜２４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）および１０％ＫＯＳＲ（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＲＰＭＩ培地中で、工程ａ）から得られた細胞を培養すること；
ｃ）４〜６ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および１６〜２４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＢＭＰ−４：ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約１：１０：４である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｂ）から得られた細胞を培養すること；
ｄ）１２〜１８ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および４〜６ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦの比は、約３：１である）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｃ）から得られた細胞を培養すること；
ｅ）１％Ｂ２７、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）および２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンドの比は、約２：４：４：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｄ）から得られた細胞を培養すること；ならびに
ｆ）１％Ｂ２７、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および４０〜６０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、８〜１２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）、０．５〜２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）（いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ：ｂＦＧＦ：ｈＳＣＦ：Ｆｌｔ３リガンド：ｈＴＰＯ：ＩＬ−６の比は、約５：１０：１０：２．５：１０：１である）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｅ）から得られた細胞を培養すること。
いくつかの実施形態では、培養工程ａ）〜ｅ）の少なくとも１つで使用される培養培地は、ＡｈＲアンタゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、工程ｆ）で使用される培養培地は、ＡｈＲアゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、以下を含む方法によって、培養物において多能性幹細胞をＭＥＰに分化させる：
ａ）５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、２５ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ５６７０４）および１０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
ｂ）５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）および１０％ＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ培地中で、工程ａ）から得られた細胞を培養すること；
ｃ）５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−４（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１２６４４）、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｂ）から得られた細胞を培養すること；
ｄ）１５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）および５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｃ）から得られた細胞を培養すること；
ｅ）１％Ｂ２７、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）および２５ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｄ）から得られた細胞を培養すること；ならびに
ｆ）１％Ｂ２７、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ１５６９２）、１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０９０３８）、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２１５８３）、２５ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３リガンド（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３６８８８）および５０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０５２３１）および０．５Ｕ／ｍｌ ＥＰＯｇｅｎ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ０１５８８）を補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｅ）から得られた細胞を培養すること。
いくつかの実施形態では、培養工程ａ）〜ｅ）の少なくとも１つで使用される培養培地は、ＡｈＲアンタゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、工程ｆ）で使用される培養培地は、ＡｈＲアゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、工程ａ）の前に、ＭＥＦで２４時間馴化したｉＰＳＣ培地であって、ローキナーゼ（Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤およびｂＦＧＦを補充したｉＰＳＣ培地中で、多能性幹細胞を培養する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるこれらのおよび他の方法によって作製されたＭＥＰを単離する。
いくつかの実施形態では、工程ａ）は約２日間の期間であり、工程ｂ）は約１日間の期間であり、工程ｃ）は約１日間の期間であり、工程ｄ）は約２日間の期間であり、工程ｅ）は約１日間の期間であり、工程ｆ）は約１日間の期間である。いくつかの実施形態では、工程ｆ）の培地中で、細胞を、１〜２日間、２〜４日間、３〜６日間、１〜２週間、２〜４週間および４〜８週間の期間にわたってさらに培養する。いくつかの実施形態では、工程ｆ）の培地中で、細胞を、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも２日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間および少なくとも８週間の期間にわたってさらに培養する。いくつかの実施形態では、工程ｆ）の培地中で、細胞を、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間にわたってまたは無期限にさらに培養する。いくつかの実施形態では、工程ｆ）の細胞培養物を分けて冷凍ストックを作る。このようなストックを定期的に解凍して、分化ＭＥＰ細胞を形成する細胞培養物の無限供給を提供し得る。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の培養物は、７〜１０日以内にＭＥＰに分化し始める。いくつかの実施形態では、培養物は、ＭＥＰを少なくとも３０日間産生し続ける。その過程中の場合、ＡｈＲアゴニストを含む培地中で、培養細胞を成長させる。
いくつかの実施形態では、培養物は血清を含まない。いくつかの実施形態では、培養物はフィーダー細胞を含まない。このような実施形態のこのフィーダーフリーの態様は、特定の状況で特定の利点を提供する。例えば、いくつかのこのような実施形態では、それは、得られるＭＥＰの混入リスクを低減し、それにより、このようなＭＥＰから作製される赤血球または血小板の混入リスクが低減される。特定の細胞用途では、このリスク低減が望ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、このセクションＤにおけるプロトコールで使用されるタンパク質は、天然に存在するタンパク質の改変誘導体および／またはムテインである。いくつかの実施形態では、使用されるタンパク質は、本明細書で特定されるＵｎｉｐｒｏｔまたは他のデータベースＩＤ番号によって特定されるタンパク質配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ｉＰＳＣを提供すること、および前記ｉＰＳＣをＭＥＰに分化させることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、血管芽細胞を提供すること、および前記血管芽細胞をＭＥＰに分化させること含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＨＳＣを提供すること、および前記ＨＳＣをＭＥＰに分化させることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＭＰを提供すること、および前記ＣＭＰをＭＥＰに分化させることを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＰへの分化は、ＡｈＲアンタゴニストで培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＰへの分化は、ＡｈＲアゴニストで培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＰへの分化は、ＡｈＲアンタゴニストで培養すること、およびＡｈＲアゴニストで培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＰへの分化は、第１の期間にわたってＡｈＲアンタゴニストで培養すること、および、次いで、第２の期間にわたってＡｈＲアゴニストで培養することを含む。
Ｅ．赤血球の作製方法
本開示の方法によって生成されたものを含め、ＭＥＰは、赤血球に分化する潜在能力を有する。したがって、本開示はまた、赤血球を作製する方法であって、ＭＥＰを提供すること、および赤血球を作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、本開示の方法にしたがってＭＥＰを作製すること、および赤血球を作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な条件は、赤血球特異化培地中で培養することを含む。またさらなる実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下の赤血球特異化培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、赤血球特異化培地は、ＥＰＯを含む。（ＥＰＯは、例えば、当技術分野で公知の任意の適切な供給業者、例えば商業的にはＲ＆Ｄ（カタログ＃２８６−ＥＰ）またはＡｍｇｅｎ（ＥＰＯｇｅｎ）製のものであり得る）。エリスロポエチンは、赤血球前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）および前駆体（ｐｒｅｓｕｒｓｏｒ）（これらは、ヒトでは骨髄に見出される）に対して、これらの細胞をアポトーシスから保護することによりそれらの生存を促進して、最終的な赤血球生成（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）を促進することによって主な効果を及ぼす。エリスロポエチンは、多分化能前駆細胞からの赤血球系統の発生に関与する様々な他の成長因子（ＩＬ−３、ＩＬ−６、グルココルチコイド、ＳＣＦ）と協働する主な赤血球生成因子である。本開示のいくつかの実施形態では、赤血球特異化培地は、ＥＰＯを含む。本開示のいくつかの実施形態では、赤血球特異化培地は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、グルココルチコイドおよびＳＣＦから選択される少なくとも１つのさらなる因子を含む。本明細書に開示される方法によって生成されたＭＥＰは輸送することができ、さらには凍結、保存および／または輸送することができるので、本開示はまた、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを様々な場所および／または様々な使用者（今度は、該使用者がＭＥＰから赤血球を作製することができる）に分配することを可能にする。したがって、本開示はまた、赤血球を作製する方法であって、本開示の方法を使用してインビトロで分化させたＭＥＰを提供すること、およびＲＢＣを作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な条件は、赤血球特異化培地中で培養することを含む。またさらなる実施形態では、ＲＢＣを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下の赤血球特異化培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、赤血球特異化培地は、ＥＰＯを含む。
いくつかの実施形態では、赤血球を作製するために、当技術分野で公知の代替の赤血球作製方法を、ＡｈＲアゴニストの存在下で細胞を培養することを含むように改変する。１つの例示的な方法は、Ｆｅｎｇ Ｍａら、ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２，２００８，ｖｏｌ．１０５，ｎｏ．３５，ｐ１３０８７−１３０９２に開示されているものである。Ｍａらは、マウス胎仔肝臓間質細胞（ｍＦＬＳＣ）層を利用して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を最終成熟赤血球に分化させている。胎仔Ｄ１５ Ｂｌａｃｋ６マウスからｍＦＬＳＣ層を調製し、増殖させ、放射線照射した。ゼラチン上にｍＦＬＳＣを含有するウェル上でｈＥＳＣを継代し、３ｍＬの培地（α−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸）（３日毎に交換）中で成長させた。この培養物から非付着細胞を生成し、様々な日に収集した。赤血球遺伝子発現についてはＲＴ−ＰＣＲによって、ヘモグロビン発現については免疫蛍光法によって、および分化能についてはコロニー培養によって、これらの細胞を分析した。彼らは、それらの細胞が、早ければ共培養の４日目から赤血球マーカーを発現し始めて、時間の経過と共に（最終時点Ｄ１８）発現が増加したことを見出した。免疫蛍光法によって、個々の細胞においてβ−グロビンタンパク質発現を検出すると、１２〜１８日目から数が増加し始めた。さらに、コロニーおよび懸濁培養を使用して成熟を観察した。３０％ＦＢＳ、１％脱イオン化画分Ｖ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、α−ＭＥＭおよびヒトサイトカイン混合物（１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦおよび４Ｕ／ｍＬ ＥＰＯ）含有１．２％メチルセルロースに、共培養物由来の細胞を播いた。１２〜１４日後、赤血球バーストを回収し、１５％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、α−ＭＥＭおよび上記ヒトサイトカイン混合物の懸濁培養で成長させた。ヘモグロビン（免疫染色）、除核（メイ−グリュンワルド−ギムザ染色）、酸素解離（ｈｅｍｏｘ分析器）およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性について、これらの細胞を上記のように分析した。彼らは、これらの細胞が除核可能であり、共培養生成細胞と比較してβ−グロビンタンパク質の発現が増加したことを見出した。これらの細胞は酸素に結合し、臍帯血赤血球と類似のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有していた。全体的には、Ｍａらは、ｍＦＬＳＣ共培養と、それに続くコロニーおよび懸濁培養での赤血球成熟を利用することによって、β−グロビンを発現する除核赤血球をｈＥＳＣから生成し得ることを示すことができる。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞から赤血球を生成するために、Ｍａらの方法を、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含むように改変する。
別の例示的な方法は、Ｇｉａｒｒａｔａｎａら、Ｂｌｏｏｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，２０１１，ｖｏｌ．１１８，ｎｏ．１９，ｐ５０７１−５０７９に開示されているものである。この論文において、Ｇｉａｒｒａｔａｎａらは、ヒトドナーから得られたＣＤ３４＋細胞を使用して、細胞増殖および輸血使用の実現可能性を示している。細胞成熟を拡大して引き起こすために、著者らは、３段階のアプローチを利用している。ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦによる骨髄刺激後に、白血球フェレーシスからＣＤ３４＋細胞を得る。様々な段階において（ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ）、様々なサイトカインを含むＥＤＭ（ＩＭＤＭ、３３０ｕｇ／ｍｌホロトランスフェリン、１０ｕｇ／ｍＬ ｒｈインスリン、２Ｕ／ｍＬヘパリン、５％不活性化ヒト血漿）中で、これらの細胞を培養する。段階１（０〜７日目）において、ヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３および３Ｕ／ｍＬ ＥＰＯをＥＤＭに補充する。次いで、細胞を回収し、段階２（７〜１１日目）の培地ＥＤＭ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦおよび３Ｕ／ｍＬ ＥＰＯ中に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｅｄ）した。１１日目において、細胞を再度回収し、段階３（１１〜１８日目）のために、３Ｕ／ｍＬのＥＰＯを補充したＥＤＭ培地に再懸濁した。この方法論は、細胞増殖およびＣＤ３４＋細胞の網状赤血球への成熟を可能にする。著者らは、酸素結合、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸キナーゼ活性、ならびに細胞の変形能について、培養赤血球（ｃＲＢＣ）を臍帯血および成人血液の赤血球と比較している。ｃＲＢＣは、臍帯血ＲＢＣと非常に似た挙動を示した。ＣＤ７１発現、オルガネラおよび表面積の減少によって決定した場合、ｃＲＢＣをインビボ（マウスまたはヒト）に置くと、これらの細胞は完全に成熟することができる。彼らはまた、これらの細胞が両凹形状を示すことを観察した。ＲＢＣの特徴を失わずに、ｃＲＢＣを通常の時間枠（４週間）にわたって保存することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞から赤血球を生成するために、Ｇｉａｒｒａｔａｎａらの方法を、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含むように改変する。
本明細書に開示される方法はまた、任意の供給源由来の任意のＭＥＰから赤血球を作製することを可能にする。例えば、ＭＥＰは、ドナーの骨髄から得られ得る。いくつかの実施形態では、最初に、例えばＦＡＣＳによって、骨髄中に存在する他の細胞からＭＥＰを単離する。あるいは、全骨髄またはその一部を培養し、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することによってＭＥＰ細胞形成を刺激し得る。したがって、赤血球を作製する方法であって、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養することを含む方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、赤血球特異化培地中でＭＥＰを培養することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるこれらのまたは他の方法によって作製されたＲＢＣを単離する。いくつかの実施形態では、哺乳類に投与するために、ＲＢＣを製剤化する。
Ｆ．巨核球の作製方法
本開示の方法によって生成されたものを含め、ＭＥＰは、巨核球（Ｍｋ）に分化する潜在能力を有する。したがって、本開示はまた、巨核球を作製する方法であって、本開示の方法にしたがってＭＥＰを作製すること、およびＭｋを作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、巨核球特異化培地中でＭＥＰを培養することを含む。またさらなる実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下の巨核球特異化培地中で培養することを含む。またさらなる実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この過程は、ＡｈＲアゴニストで培養することのみ、またはＡｈＲアンタゴニストで培養することのみを含む方法と比較して、生成されるＭｋの総数を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、巨核球特異化培地は、ＴＰＯ（例えば、ヒトではＵｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４０２２５）を含む。ヒトＴＰＯは、例えば、Ｒ＆Ｄ（カタログ＃２８８−ＴＰ）またはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（カタログ＃Ｇ１４０ＢＴ）から商業的に入手され得る。いくつかの実施形態では、巨核球特異化培地は、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、Ｍｋおよび／または血小板を作製するために、当技術分野で公知の代替のＭｋ作製方法を、ＡｈＲ調節物質の存在下で細胞を培養することを含むように改変する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。以前に報告されているヒト巨核球形成用の分化プロトコールにより、インビトロ増殖のための多能性幹細胞またはヒト骨髄が単離された。骨髄プロトコールは、規定の培養条件で、ヒト被験体の大腿骨から単核細胞を採取することから始まる（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．１４，２０７−２１４．（１９９６）。インビトロでの培養および増殖後、前駆細胞プール（ＣＤ３４＋）画分が単離されるように、磁気細胞分離を使用してこれらの細胞を選別し、巨核球分化のための原料として使用する。これらの細胞をヒトまたはマウス照射骨髄間質（これは、接着基材として機能し、ＣＤ３４＋集団の巨核球成熟を助ける）上に播く。ヒト血清と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）を含有するサイトカインカクテルの様々な並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）とを含有する培地中で、これらの培養物を成長させる。このプロトコールの独創的で将来の発展を助ける報告では、ＣＤ４１ａのタンパク質レベルの発現によって定義された巨核球集団が、早ければ播いてから１２日後に観察された。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞から赤血球を生成するために、Ｓｃｈａｔｔｎｅｒらの方法を、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含むように改変する。
ヒト多能性幹細胞（ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）からＭｋを分化させるためのプロトコールも、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することを含むように改変し得る。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。例えば、最近の研究では、原料としてヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を使用する分化プロトコールを最適化するのに効率的であることが判明した（Ｇａｕｒ，Ｍ．ら、Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔｒａｃｔａｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．４，４３６−４４２．（２００６）．）。このアプローチの重要な違いは、多能性細胞の適切な維持および継代に関連するさらなる技術的問題、ならびに造血誘導に適したサイトカインカクテルを調合することの困難性である。Ｇａｕｒらは、骨髄プロトコールと同様の戦略を使用することによって、これらの問題を解決した。すなわち、ＥＳＣを骨髄間質上に播き、高用量のＴＰＯに曝した。７日後、単一細胞懸濁液中の前駆細胞プールを単離するために、造血前駆細胞を含有すると考えられる大きなコロニーを物理的に破壊した。細胞を新鮮な間質単層上に播き、１１日目に分割するまで高ＴＰＯ培地中で維持し、これをトリプシンおよびコラゲナーゼに再び長期曝露して、可能な限り最良に懸濁液中のこれらの細胞を単離した。細胞を再び再播種したところ、早ければ１５日目に巨核球マーカーを発現し、高倍数性を示すことが見出された。いくつかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞から赤血球を生成するために、Ｇａｕｒらの方法を、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することを含むように改変する。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。
本明細書に開示される方法によって生成されたＭＥＰは輸送することができ、さらには凍結、保存および／または輸送することができるので、本開示はまた、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを様々な場所および／または様々な使用者（今度は、該使用者がＭＥＰから巨核球を作製することができる）に分配することを可能にする。したがって、本開示はまた、巨核球を作製する方法であって、本開示の方法を使用してインビトロで分化させたＭＥＰを提供すること、および巨核球を作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、巨核球を作製するのに十分な方法は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、巨核球を作製するのに十分な条件は、巨核球特異化培地中で培養することを含む。またさらなる実施形態では、巨核球を作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下の巨核球特異化培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、巨核球特異化培地は、ＴＰＯを含む。
本明細書に開示される方法はまた、任意の供給源由来の任意のＭＥＰから巨核球を作製することを可能にする。例えば、ＭＥＰは、ドナーの骨髄から得られ得る。いくつかの実施形態では、最初に、例えばＦＡＣＳによって、骨髄中に存在する他の細胞からＭＥＰを単離する。あるいは、全骨髄またはその一部を培養し、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することによってＭＥＰ細胞形成を刺激し得る。したがって、巨核球を作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下で任意の供給源由来のＭＥＰを培養することを含む方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、前記方法は、巨核球特異化培地中でＭＥＰを培養することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるこれらのまたは他の方法によって作製されたＭｋを単離する。いくつかの実施形態では、哺乳類に投与するために、Ｍｋを製剤化する。
Ｇ．血小板の作製方法
本開示の方法によって生成されたものを含め、ＭＥＰは、巨核球（今度は、これが培養物において自然に分化して血小板を形成する）に分化する潜在能力を有する。したがって、本開示はまた、血小板を作製する方法であって、本開示の方法にしたがってＭＥＰを作製すること、Ｍｋを作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養すること、および前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で前記Ｍｋを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、巨核球特異化培地中でＭＥＰを培養することを含む。またさらなる実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下の巨核球特異化培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、巨核球特異化培地は、ＴＰＯを含む。
本明細書に開示される方法によって生成されたＭＥＰは輸送することができ、さらには凍結、保存および／または輸送することができるので、本開示はまた、本開示の方法によって作製されたＭＥＰを様々な場所および／または様々な使用者（今度は、該使用者がＭＥＰから血小板を作製することができる）に分配することを可能にする。したがって、本開示はまた、血小板を作製する方法であって、本開示の方法を使用してインビトロで分化させたＭＥＰを提供すること、巨核球を作製するのに十分な条件下で前記ＭＥＰを培養すること、および前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で前記Ｍｋを培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、巨核球を作製するのに十分な方法は、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、巨核球を作製するのに十分な条件は、巨核球特異化培地中で培養することを含む。またさらなる実施形態では、巨核球を作製するのに十分な条件は、ＡｈＲ調節物質の存在下の巨核球特異化培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、巨核球特異化培地は、ＴＰＯを含む。
本明細書に開示される方法はまた、任意の供給源由来の任意のＭＥＰから巨核球を作製することを可能にし、したがって、任意のＭＥＰ源から血小板を作製することも可能にする。例えば、ＭＥＰは、ドナーの骨髄から得られ得る。いくつかの実施形態では、最初に、例えばＦＡＣＳによって、骨髄中に存在する他の細胞からＭＥＰを単離する。あるいは、全骨髄またはその一部を培養し、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することによってＭＥＰ細胞形成を刺激し得る。したがって、血小板を作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養してＭｋを作製すること、および血小板を分化させるのに十分な条件下で前記Ｍｋを培養することを含む方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、Ｍｋを作製するのに十分な条件は、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、巨核球特異化培地中でＭＥＰを培養することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるこれらのまたは他の方法によって作製された血小板を単離する。いくつかの実施形態では、哺乳類に投与するために、Ｍｋを製剤化する。
Ｈ．アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質
アリール炭化水素受容体（「ＡｈＲ」）は、多環式芳香族炭化水素、インドール、およびフラボノイドなどの、多くの構造的に異なる合成および天然化合物によって活性化されることが見いだされている、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子のファミリーのリガンド活性化メンバーである。結合したリガンドの非存在下では、ＡｈＲは、分子シャペロン熱ショックタンパク質９０、イムノフィリン様タンパク質、ＸＡＰ２およびｈｓｐ９０相互作用タンパク質ｐ２３のうち２つの分子に会合する細胞の細胞質区画において潜在的立体構造で存在する。リガンド結合は、核への移行、ｈｓｐ９０の放出、およびＡＲＮＴおよび他の転写因子モノマーとのヘテロ二量体化を含む事象のカスケードを開始する。リガンドが結合したＡｈＲ−ＡＲＮＴ複合体は、ＣＰＹ１Ａ１のプロモーター領域に位置するダイオキシン応答エレメント（「ＤＲＥ」）と称されるコンセンサス配列および他の応答遺伝子を認識し、それにより転写を活性化することができる。ＡｈＲ会合タンパク質の公知の例としては、限定されないが、ｈｓｐ９０ ｐ２３、ＸＡＰ２、ｐ６０、ｈｓｐ７０、ｐ４８、ＲｅｌＢおよびエストロゲン受容体が挙げられる。
ＡｈＲタンパク質は、機能に重要ないくつかのドメインを含有し、転写因子の塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス／Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ（ｂＨＬＨ／ＰＡＳ）ファミリーのメンバーに分類される。ｂＨＬＨモチーフはタンパク質のＮ末端に位置する。ｂＨＬＨスーパーファミリーのメンバーは、２つの機能的に特徴的で高度に保存されたドメインを有する。第１のものは転写因子のＤＮＡへの結合に関与する塩基性領域（ｂ）である。第２のものはタンパク質−タンパク質相互作用を促進するヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）領域である。同様にＡｈＲに含まれるのは、２つのＰＡＳドメイン、ＰＡＳ−ＡおよびＰＡＳ−Ｂで、これらはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ）およびｓｉｎｇｌｅ ｍｉｎｄｅｄ（Ｓｉｍ）において、ならびにＡｈＲの二量体化の相手、アリール炭化水素受容体核輸送体（ＡＲＮＴ）において最初に見出されたタンパク質ドメインと高い配列相同性を示す２００〜３５０アミノ酸の長さである。ＡｈＲおよびＡＲＮＴの場合と同様に、ＰＡＳドメインは他のＰＡＳドメイン含有タンパク質との特定の二次相互作用を支持して、異型接合および同型接合タンパク質複合体が生成し得る。ＡｈＲのリガンド結合部位はＰＡＳ−Ｂドメイン内に含まれ、リガンド結合のために重要ないくつかの保存残基を含有する。最後に、グルタミン（Ｑ）リッチなドメインはタンパク質のＣ末端領域に位置し、活性化補助因子の動員およびトランス活性化に関与する。
本明細書で使用される場合、「ＡｈＲ」または「アリール炭化水素受容体」は、任意の哺乳類由来のＡｈＲまたはアリール炭化水素受容体と一般的に理解されている任意のタンパク質ならびにそのバリアントおよび改変誘導体を指す。いくつかの実施形態では、ＡｈＲは、Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＮＰ＿００１６１２（これは、参照により本明細書に組み込まれる）によって特定されるヒトタンパク質である。
標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）シグナル伝達中に、細胞質ゾルのＡｈＲは適切な低分子などのリガンドに結合し、これはＡｈＲの核への移行を促進し、最終的には標的遺伝子のデノボ転写を引き起こす。ＡｈＲ標的遺伝子のプロモーターは、「ＡｈＲ応答エレメント」もしくは「ＡＨＲＥ」または「薬物応答エレメント」もしくは「ＤＲＥ」または「生体異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ）応答エレメント」もしくは「ＸＲＥ」と称される応答エレメント５’−ＴＮＧＣＧＴＧ−３’を有する。生体異物−代謝酵素（例えば、シトクロムＰ４５０）の遺伝子は周知のＡｈＲの標的である。何百もの他の遺伝子もＡＨＲＥを有する。標準ＡｈＲシグナル伝達の生化学の解明により、ＡｈＲ活性を微調整し得るいくつかのパラメータが明らかになった。これらとしては、リガンド特性、アダプター分子およびＡｈＲの並外れた細胞特異的活性を調節するトランス活性化補助因子または補抑制物質が挙げられる。
ＡｈＲ調節物質は、限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、抗体または抗体断片など）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖またはそれらの天然に存在するかもしくは天然に存在しない誘導体を含む任意の物質であり得る。ＡｈＲ調節物質は、それが前記クラスの１つ以上にも相応しようとしなかろうと、有機低分子または複合有機分子であり得る。
ＡｈＲアゴニストおよびアンタゴニスト活性を有する分子は当技術分野で周知であり、本開示の方法で使用され得る（例えば、Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓ．Ｒ．Ｎａｇｙ．２００３，“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，”Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４３：３０９−３３４；およびＮｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｐ．，ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｂｒａｄｆｉｅｌｄ，２００８，“Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２１：１０２−１１６を参照のこと）。
このような分子の活性を特性決定するために、または新たな分子を同定するために使用され得るアッセイの一種は、細胞ベースのインビトロアッセイである。一例では、ＡｈＲによって駆動される緑色蛍光タンパク質レポーターでＨ１Ｇ１マウス肝癌系を安定トランスフェクトする。ＡｈＲリガンド候補をＨ１Ｇ１培養物に滴定濃度（ｔｉｔｔｅｒｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で１８〜４８時間にわたって添加する。次いで、ＧＦＰ蛍光をルミノメーターで定量する。目的の化合物および公知のＡｈＲリガンド（例えば、β−ナフトフラボン（ＢＮＦ））の両方を添加した後に、Ｈ１Ｇ１細胞におけるＧＦＰ蛍光をアッセイすることによって、ＡｈＲアンタゴニスト活性を決定する。このようなアッセイの例は、例えば、Ｎａｇｙ，Ｓ．Ｒ．ら、２００２，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｂｉｏａｓｓａｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：８６１−８６８；およびＮａｇｙ，Ｓ．Ｒ．ら、２００２，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ ６５：２００−２１０（これらはそれぞれ、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｇａｒｒｉｓｏｎら、１９９６，“Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｓ ｂｉｏａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，３０：１９４−２０３（これは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと。
試験作用物質（ｔｅｓｔ ａｇｅｎｔ）のＡｈＲアゴニスト活性を特性決定するのに使用され得る例示的なアッセイは、ＭＥＰを含む細胞培養物を提供し、次いで、ＥＰＯおよび試験作用物質の存在下で細胞培養物を培養し、培養物におけるＲＢＣ産生を測定することである。少なくとも１つの対照培養を必要に応じて行ってもよいし、および／または少なくとも１つの対照細胞培養の結果を参照してもよい。任意選択の対照培養は、典型的には、ＭＥＰを含む同様の細胞培養物を、試験作用物質ではなくＥＰＯの存在下で培養する培養である。あるいは、または加えて、ＭＥＰを含む同様の細胞培養物を、ＥＰＯおよび公知のＡｈＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）の存在下で培養する対照細胞培養を行ってもよいし、または参照してもよい。ＥＰＯおよび試験作用物質を含む細胞培養物におけるＲＢＣ産生についてアッセイし、必要に応じて、その培養物におけるＲＢＣ産生を、対照細胞培養物の少なくとも１つにおけるＲＢＣ産生と比較することによって、試験作用物質がＡｈＲアゴニスト活性を有するかを決定する。例えば、試験作用物質およびＥＰＯを含む培養物によるＲＢＣ産生が、ＥＰＯを含むが試験作用物質を含まない対照培養物よりも多くのＲＢＣを産生する場合、試験作用物質は、このアッセイによってＡｈＲアゴニスト活性を有すると決定される。
試験作用物質のＡｈＲアンタゴニスト活性を特性決定するのに使用され得る例示的なアッセイは、ＭＥＰを含む細胞培養物を提供し、次いで、１）ＥＰＯおよび試験作用物質を含む細胞培養物；ならびに２）ＥＰＯ、公知のＡｈＲアゴニストおよび試験作用物質を含む細胞培養物の少なくとも１つにおいて細胞培養物を培養することである。少なくとも１つの対照培養を必要に応じて行ってもよいし、および／または少なくとも１つの対照細胞培養の結果を参照してもよい。任意選択の対照培養は、典型的には、ＭＥＰを含む同様の細胞培養物を、試験作用物質ではなくＥＰＯの存在下で、またはＥＰＯおよび公知のＡｈＲアゴニストの存在下で培養する培養である。１）ＥＰＯおよび試験作用物質を含む細胞培養物；ならびに２）ＥＰＯ、公知のＡｈＲアゴニストおよび試験作用物質を含む細胞培養物の少なくとも１つにおけるＲＢＣ産生についてアッセイし、必要に応じて、少なくとも１つの培養物におけるＲＢＣ産生を、少なくとも１つの対照細胞培養物におけるＲＢＣ産生と比較することによって、試験作用物質がＡｈＲアンタゴニスト活性を有するかを決定する。例えば、１）ＥＰＯおよび試験作用物質を含む細胞培養物；ならびに２）ＥＰＯ、公知のＡｈＲアゴニストおよび試験作用物質を含む細胞培養物の少なくとも１つによるＲＢＣ産生が、ＥＰＯを含むが試験作用物質を含まない対照培養物よりも少ないＲＢＣ、ならびに／またはＥＰＯおよび公知のＡｈＲアゴニストを含むが試験作用物質を含まない対照培養物よりも少ないＲＢＣを産生する場合、試験作用物質は、このアッセイによってＡｈＲアンタゴニスト活性を有すると決定される。
試験作用物質のＡｈＲアンタゴニスト活性を特性決定するのに使用され得る代替の例示的なアッセイは、ＭＥＰを含む細胞培養物を提供し、次いで、ＴＰＯおよび試験作用物質の存在下で細胞培養物を培養し、培養物におけるＭｋおよび／または血小板産生を測定することである。少なくとも１つの対照培養を必要に応じて行ってもよいし、および／または少なくとも１つの対照細胞培養の結果を参照してもよい。任意選択の対照培養は、典型的には、ＭＥＰを含む同様の細胞培養物を、試験作用物質ではなくＴＰＯの存在下で培養する培養である。あるいは、または加えて、対照細胞培養は、ＭＥＰを含む同様の細胞培養物を、ＴＰＯおよび公知のＡｈＲアゴニスト（例えば、ＦＩＣＺ）の存在下で培養する培養である。ＴＰＯおよび試験作用物質を含む細胞培養物におけるＭｋおよび／または血小板産生についてアッセイし、必要に応じて、その培養物におけるＭｋおよび／または血小板産生を、対照細胞培養物の少なくとも１つにおけるＭｋおよび／または血小板産生と比較することによって、試験作用物質がＡｈＲアンタゴニスト活性を有するかを決定する。例えば、試験作用物質およびＴＰＯを含む培養物によるＭｋおよび／または血小板産生が、ＴＰＯを含むが試験作用物質を含まない対照培養物よりも多くのＭｋおよび／もしくは血小板を産生する場合、ならびに／またはＴＰＯおよび公知のＡｈＲアゴニストを含むが試験作用物質を含まない対照培養物よりも多くのＭｋおよび／もしくは血小板を産生する場合、試験作用物質は、このアッセイによってＡｈＲアンタゴニスト活性を有すると決定される。
加えて、作用物質を試験して、ＡｈＲの活性を調節する生物学的活性を有するものを同定するために、標準的、生理学的、薬理学的および生化学的な手順が利用可能である。このようなアッセイとしては、例えば、結合アッセイ、蛍光分極アッセイ、ＦＲＥＴベースの活性化補助因子動員アッセイ（一般にＧｌｉｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，７ Ｎｏ．１ ３−１０（２００２）を参照のこと）、ならびに細胞ベースのアッセイ（コトランスフェクションアッセイ、ＬＢＤ−Ｇａｌ４キメラの使用、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイ（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７２（６）３１３７−３１４０（１９９７）を参照のこと）を含む）および遺伝子発現アッセイなどの生化学的アッセイが挙げられる。
ハイスループットスクリーニング系は市販されており（例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡを参照のこと）、これらのアッセイをハイスループットモードで実行することを可能にする。これらの系は、典型的には、サンプルおよび試薬をピペッティングする工程、液体を分配して時間を計ったインキュベーション工程（ｌｉｑｕｉｄ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｔｉｍｅｄ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、およびアッセイのために適切な検出器（複数可）におけるマイクロプレートの最終読み取り工程を包含する全過程を、自動化する。これらの構成可能な系は、ハイスループットおよび迅速な作業開始ならびに高度な柔軟性およびカスタマイゼーションを提供する。このような系の製造業者は、様々なハイスループット系についての詳細なプロトコールを提供する。したがって、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写の調節、リガンド結合などを検出するためのスクリーニング系を記載する技術報告を提供する。
洗浄工程も液体分離工程も必要としないアッセイをハイスループットスクリーニング系に使用することができ、蛍光分極アッセイ（例えば、Ｏｗｉｃｋｉ，Ｊ．，Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ ２０００ Ｏｃｔ；５（５）：２９７を参照のこと）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２；１９０：３１−４９を参照のこと）、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイまたは時間分解ＦＲＥＴベース活性化補助因子動員アッセイ（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００２ Ｊｕｌ；８１（３）：２１７−２５；（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９８ Ｏｃｔ；１２（１０）：１５９４−６０４））などの生化学的アッセイが挙げられる。一般に、このようなアッセイは、受容体の全長または単離されたリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）のいずれかを使用して実施され得る。
蛍光標識リガンドが利用可能な場合、蛍光分極アッセイは、この作用物質による微量の標識リガンドの置換の結果として生じる蛍光分極の変化を測定することによって、ＡｈＲに対する作用物質の結合を検出する方法を提供する。
ホモジニアスアッセイ形式において、この作用物質が受容体に対する既知の親和性を有する放射性同位元素標識リガンドと競合し得る程度を、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して評価することによって、作用物質がＡｈＲに結合する能力も測定され得る。このアプローチにおいて、放射性同位元素標識作用物質によって放出される放射能は、それが、ＡｈＲが結合するシンチラント（Ｙｓｉ−銅含有ビーズなど）に近接させられた場合、光学シグナルを生じる。放射性同位元素標識作用物質がＡｈＲから離れた場合、ＡｈＲ結合シンチラントからの光放出量は減少し、例えば、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａリーダーなどの標準的マイクロプレート液体シンチレーションプレートリーダーを使用して、これを容易に検出し得る。
ＤＮＡ結合アッセイを使用して、作用物質がＡｈＲ活性を調節する能力を評価し得る。これらのアッセイは、ＡｈＲを含む核受容体タンパク質が、ＡｈＲによって調節されることが公知の遺伝子の調節エレメントに結合する能力を測定する。一般に、前記アッセイは、作用物質の存在下または非存在下におけるＡｈＲタンパク質の結合量を測定し得るような条件下で、ＡｈＲと相互作用し得るＤＮＡ配列と、ＡｈＲタンパク質とを結合させることを含む。アゴニストの存在下では、ＡｈＲは、調節エレメントに結合する。限定されないが、ＤＮＡｓｅフットプリンティング、ゲルシフトアッセイおよびクロマチン免疫沈降を含む方法を使用して、調節エレメントに結合したＡｈＲタンパク質の量を測定し得る。
一般に、これらの結合アッセイの１つを使用してＡｈＲに結合すると同定された分子は、ＡｈＲのアゴニストもしくはアンタゴニストとして前記アッセイで直接同定することもできるし、または例えば細胞ベースのアッセイでさらに評価して、前記結合剤がアゴニストもしくはアンタゴニストであるかを決定することもできる。
加えて、様々な細胞ベースのアッセイ方法論を上手く使用して、スクリーニングアッセイにおいて、本明細書に記載される作用物質の特異性を同定およびプロファイリングし得る。これらのアプローチとしては、コトランスフェクションアッセイ、トランスロケーションアッセイおよび遺伝子発現アッセイが挙げられる。
コトランスフェクションアッセイ戦略の３つの基本的な変形が存在する：全長ＡｈＲを使用するコトランスフェクションアッセイ、異種ＤＮＡ結合ドメインと融合したＡｈＲのリガンド結合ドメインを含むキメラＡｈＲを使用するコトランスフェクションアッセイ、および哺乳類のツーハイブリッドアッセイ系の使用に基づくアッセイ。
基本的なコトランスフェクションアッセイは、発現が核受容体と相互作用可能なＤＮＡ配列の制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを有する細胞においてＡｈＲを発現するための、細胞への発現プラスミドのコトランスフェクションに基づく。アゴニストでトランスフェクト細胞を処理することにより、レポーター遺伝子の発現の増加によって反映される受容体の転写活性（様々な標準的手順によって測定され得る）を増加させる。
標準的な分子生物学的技術を使用して、レポーター遺伝子をコードするｃＤＮＡを適切な最小プロモーターの下流に配置することによって、レポータープラスミドを構築し得る。例えば、ルシフェラーゼレポータープラスミドは、ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（チミジンキナーゼヌクレオチド配列のヌクレオチド残基−１０５〜＋５１に位置する）の直ぐ下流に配置し、次いでこれを様々な応答エレメントに連結することによって構築され得る。
発現プラスミドおよびレポータープラスミドをコトランスフェクトする多くの方法は、当業者に公知であり、適切な細胞型にプラスミドを導入するコトランスフェクションアッセイのために使用され得る。典型的には、このような細胞は、レポータープラスミドで使用される応答エレメントと相互作用するＡｈＲを内因的に発現しない。
多くのレポーター遺伝子系が当技術分野で公知であり、例えば、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊらに対し、（１９８８）Ｇｅｎｅ ６６ １−１０；Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３ ４９−６０），β−ガラクトシダーゼ（米国特許第５，０７０，０１２号（Ｎｏｌａｎら、１９９１年１２月３日発行）およびＢｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．Ｂｉｏｌｕｍ．４ ９９−１１１を参照のこと）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８２）２ １０４４−５１を参照のこと）、１３−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、１３−ラクタマーゼ（米国特許第５，７４１，６５７号および米国特許第５，９５５，６０４号）、触媒抗体、ルシフェラーゼ（米国特許第５，２２１，６２３号；米国特許第５，６８３，８８８号；米国特許第５，６７４，７１３号；米国特許第５，６５０，２８９号；および米国特許第５，８４３，７４６号）および天然蛍光タンパク質（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７ ５０９−４４）が挙げられる。
異種ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に対するＡｈＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含むキメラの使用は、定義されたＤＮＡ結合ドメインによって認識される定義されたＤＮＡ結合エレメントに対する問題のＡｈＲの活性化を指示することによって、細胞ベースのアッセイの多用途性を拡大する（国際公開第９５／１８３８０号を参照のこと）。このアッセイは、ネイティブのＤＮＡ結合ドメインを使用する生物学的応答またはスクリーニングウインドウが不十分である場合に、細胞ベースのコトランスフェクションアッセイの有用性を拡大する。
一般に、この方法論は、全長ＡｈＲの代わりにキメラ構築物が使用される点を除き、基本的なコトランスフェクションアッセイに使用される方法論と同様である。全長ＡｈＲを用いる場合、ＡｈＲ ＬＢＤのアゴニストを用いてトランスフェクトされた細胞の処理は、異種ＤＮＡ結合ドメインの転写活性を高め、これは上記レポーター遺伝子の発現の増加を反映する。典型的には、このようなキメラ構築物には、定義されたＡｈＲ由来のＤＮＡ結合ドメインまたは酵母もしくは細菌由来の転写調節物質（例えば、ＧＡＬ４およびＬｅｘＡ／ＵｍｕＤスーパーファミリーのメンバー）が使用される。
作用物質のスクリーニングに有用な第３の細胞ベースのアッセイは、リガンド存在下で核受容体が補因子と相互作用する能力を測定する哺乳類のツーハイブリッドアッセイである（例えば、米国特許第５，６６７，９７３号、米国特許第５，２８３，１７３号および米国特許第５，４６８，６１４号を参照のこと）。基本的なアプローチは、ＡｈＲが相互作用タンパク質と相互作用して生細胞内の転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅａｄｏｕｔ）にカップリングするのを可能にする３つのプラスミド構築物を作製することである。第１の構築物は、相互作用タンパク質を含む融合タンパク質、または相互作用ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合される）を含有するそのタンパク質の部分の発現のための、発現プラスミドである。第２の発現プラスミドは、ＶＰ１６などの強力な転写活性化ドメインに融合したＡｈＲをコードするＤＮＡを含み、第３の構築物は、最小のプロモーターを有するレポーター遺伝子およびＧＡＬ４上流活性化配列を含むレポータープラスミドを含む。
３つのプラスミドすべてが細胞に導入されると、第１構築物においてコードされるＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質を最小プロモーター上流のＧＡＬ４部位に特異的に結合させる。しかしながら、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、単独で強い転写活性化特性を有しないため、レポーター遺伝子の発現は低レベルでしか起こらない。リガンドの存在下では、ＡｈＲ−ＶＰ１６融合タンパク質は、ＧＡＬ４相互作用タンパク質融合タンパク質に結合し得、このＧＡＬ４相互作用タンパク質融合タンパク質は、強い転写活性化因子ＶＰ１６を、ＧＡＬ４結合部位およびレポーター遺伝子の最小プロモーター領域に近接させる。この相互作用は、レポーター遺伝子の転写を有意に増強し、このことは、上記ような様々なレポーター遺伝子について測定され得る。したがって、レポーター遺伝子の転写は、相互作用タンパク質とＡｈＲとの相互作用によって、リガンド依存的に駆動される。
ＡｈＲなどの核タンパク質受容体の核局在化を誘導する能力について、作用物質を試験し得る。アゴニストが結合すると、ＡｈＲは、細胞質から核に移動する。顕微鏡技術を使用して、核に位置するＡｈＲの量を可視化および定量し得る。いくつかの実施形態では、このアッセイは、蛍光タンパク質に融合したキメラＡｈＲを利用する。ＡｈＲ特異的抗体および核タンパク質抽出物を使用してウエスタンブロッティングによって、核のＡｈＲも定量し得る。
また、ＲＮＡレベルを分析するためのノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析または高密度ｃＤＮＡ配列決定を使用して、インビトロでＡｈＲによって調節されることが公知の遺伝子発現を増加または減少させる能力について作用物質を評価し得る。ウエスタンブロット分析を使用して、ＡｈＲ標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を測定し得る。ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の発現は、ＡｈＲによって調節される。ＡｈＲによって調節されることが公知のさらなる遺伝子としては、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＡＬＤＨ１またはＡＬＤＨ３、ＴＧＦ−ｂ、ＶＡＶ３、ＩＬ−１８、ＰＲＯＭ１、ＥＲＥＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＲ１、ＧＳＴＡ１、ＳＦＸＮ１およびＮＱＯ１が挙げられる。
上記方法によって、ＡｈＲ調節の候補である任意の作用物質を試験し得る。一般に、必ずしも必要ではないが、存在する場合には受容体の活性化が検出および認識される機会を最適化するために、いくつかの異なる濃度で作用物質を試験して１回以上投与する。典型的には、アッセイは、例えば三連で実施され、約１５％未満の実験誤差内で変動する。典型的には、各実験を約３回以上繰り返し同様の結果を得る。
いくつかの実施形態では、ＡｈＲ遺伝子発現に対する作用物質および組成物の効果を動物で評価し得る。作用物質の投与後に様々な組織を採取して、ＡｈＲによって直接的または間接的に調節される活性に対する作用物質の効果を決定し得る。
いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアンタゴニストである。ＡｈＲアンタゴニスト活性を有する分子であって、本開示の方法で使用され得る分子の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
α−ナフトフラボン；
１，４−ジヒドロキシアントラキノン（キニザリン）；
１，５−ジヒドロキシアントラキノン（アントラルフィン）；
１，８−ジヒドロキシアントラキノン（ダントロン）；
ガランギン；
レスベラトロール；
２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（２−メチル−４−ｏ−トリルアゾ−フェニル）−アミド（「ＣＨ−２２３１９１」としても公知である）；
４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール（「ＳＲ１」としても公知である）；
Ｎ−［２−（３Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−９−イソプロピル−２−（５−メチル−３−ピリジル）プリン−６−アミン（「ＧＮＦ３５１」としても公知である）；
２−（２９−アミノ−３９メトキシフェニル）−オキサナフタレン４−オン（「ＰＤ９８０５９」としても公知である）；
（Ｚ）−３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノン（「ＴＳＵ−１６」としても公知である）；
２−（２９−アミノ−３９−メトキシフェニル）−オキサナフタレン４−オン（「ＰＤ９８０５９」としても公知である）；および
Ｎ−［２−（３Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−９−イソプロピル−２−（５−メチル−３−ピリジル）プリン−６−アミン；（「ＧＮＦ３５１」としても公知である）。
ＡｈＲアンタゴニスト活性を有する分子であって、本開示の方法で使用され得る分子のさらなる非限定的な例は国際公開第２０１２／０１５９１４号に記載されており、２−｛［２−（５−ブロモ−２−フリル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル］オキシ｝アセトアミド（「ＣＢ７９９３１１３」としても公知である）およびＣＭＬＤ−２１６６：
が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡｈＲ調節物質は、ＡｈＲアゴニストである。ＡｈＲアゴニスト活性を有する分子であって、本開示の方法で使用され得る分子の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）；
多環芳香族化合物；
ハロゲン化芳香族炭化水素；
プラナーポリ塩化ビフェニル；
プリン誘導体；
トリプトファンおよびその代謝産物；
リポキシンＡ４関連エイコサノイド；
インジルビン；
ビリルビン；
アミノフラボン；
β−ナフトフラボン；
１Ｈ−ベンゾイミダゾール；
５−メトキシ−２−［［（４−メトキシ−３，５−ジメチル−２−ピリジニル）メチル］スルフィニル］ベンゾイミダゾール（「オメプラゾール」としても公知である）；
２−メチル−Ｎ−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパンアミド（「フルタミド」としても公知である）；
３，３−ジインドールメタン（３，３−ｄｉｎｄｏｌｅ ｍｅｔｈａｎｅ）；
１−アリル−７−トリフルオロメチル−Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−メトキシフェノール
４−（３−クロロ−フェニル）−ピリミジン−２−イル；
２−［［３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］アミノ］安息香酸（「トラニラスト」としても公知である）；
トランス−４−［１−（４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル）−２−フェニル−１−ブテニルフェノール
２−（４−クロロフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イルエチルカーボネート（「ＣＢ７９５０９９８」としても公知である）；と
９０２８２−０１−Ｂ９（Ｔ５８３８０２５）。
使用されるＡｈＲアゴニストおよびアンタゴニストの濃度は、そのアゴニストまたはアンタゴニストがどの程度効率的にＡｈＲをアゴナイズまたはアンタゴナイズするかに応じて変化する。本開示の教示を適用することによって、使用するのに適切なＡｈＲアゴニストまたはアンタゴニスト濃度を決定することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。
６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）は、典型的には、０．０２〜２．０μＭの濃度で培養中の細胞に使用される。いくつかの実施形態では、ＦＩＣＺは、０．０４〜１．０ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＦＩＣＺは、０．１〜０．４ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＦＩＣＺは、約０．０２ｕＭ、約０．０４ｕＭ、約０．０６ｕＭ、約０．８ｕＭ、約０．１ｕＭ、約０．１１ｕＭ、約０．１２ｕＭ、約０．１３ｕＭ、約０．１４ｕＭ、約０．１５ｕＭ、約０．１６ｕＭ、約０．１７ｕＭ、約０．１８ｕＭ、約０．１９ｕＭ、約０．２ｕＭ、約０．２１ｕＭ、約０．２２ｕＭ、約０．２３ｕＭ、約０．２４ｕＭ、約０．２５ｕＭ、約０．２６ｕＭ、約０．２７ｕＭ、約０．２８ｕＭ、約０．２９ｕＭ、約０．３０ｕＭ、約０．４ｕＭ、約０．５ｕＭ、約０．６ｕＭ、約０．７ｕＭ、約０．８ｕＭ、約０．９ｕＭ、約１．０ｕＭの濃度で使用される。
ＣＨ２２３１９１は、典型的には、０．５〜５０ｕＭの濃度で培養物中の細胞に使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、１．０〜２５ｕＭ５の濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、２．５〜１０ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約１ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約２ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約３ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約４ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約５ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約６ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約７ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約８ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約９ｕＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２２３１９１は、約１０ｕＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、複数のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを組み合わせて使用する。
本開示に関して、任意の方法によって、例えば限定されないが、ＡｈＲタンパク質それ自体に結合するかもしくはこれと相互作用する分子、またはＡｈＲタンパク質の発現を増加および／もしくは減少させる分子、ならびにＡｈＲシグナル伝達によって媒介される細胞事象を増加および／もしくは減少させる分子を使用することによって、ＡｈＲアゴニスト作用および／またはアンタゴニスト作用を達成し得ることが意図される。したがって、トランスフェクション、形質導入または代替の方法により哺乳類の細胞に侵入して、それら自体で、またはそれらがコードする遺伝子産物によってＡｈＲの発現または機能を改変するプラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片もＡｈＲ調節物質として挙げられる。
Ｉ．インビトロで分化した造血細胞
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、従来の方法よりも多数のＭＥＰおよび高割合のＭＥＰを含む細胞培養物の生成を可能にする。例えば、本発明者らは、本開示の方法を使用して多能性幹細胞を培養することにより、１ｍｌ当たり少なくとも５００，０００個のＭＥＰを含む細胞培養物が得られることを示した。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも７５０，０００個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．０×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．１×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．２×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．３×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．４×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．５×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．６×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．７×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．８×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．９×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも２．０×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含まない。
ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含む特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、従来の方法よりもさらに多数のＭＥＰおよび高割合のＭＥＰを含む細胞培養物の生成を可能にする。例えば、本発明者らは、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することを含む本開示の方法を使用して多能性幹細胞を培養することにより、１ｍｌ当たり少なくとも５×１０６個のＭＥＰを含む細胞培養物が得られることを示した。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも７．５×１０６個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．０×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．１×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．２×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．３×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．４×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．５×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．６×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．７×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．８×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも１．９×１０７個のＭＥＰを含む。いくつかの実施形態では、培養物は、１ｍｌ当たり少なくとも２．０×１０７個のＭＥＰを含む。
特定の実施形態では、前記方法はまた、単一の細胞培養で少なくとも１×１０６個のＭＥＰ、少なくとも５×１０６個のＭＥＰ、少なくとも１×１０７個のＭＥＰ、少なくとも５×１０７個のＭＥＰ、少なくとも１×１０８個のＭＥＰまたは少なくとも５×１０８個のＭＥＰの生成を提供する。
特定の実施形態では、本開示の方法は、ＭＥＰを含む細胞培養物であって、培養物中の全細胞の大部分がＭＥＰである細胞培養物を生成する。ＭＥＰは、通常の定常状態条件下では骨髄集団全体の０．１％未満に相当する。対照的に、本開示の方法は、培養物中の細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％がＭＥＰである細胞培養物を生成する。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、以下の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つすべてを含む：
Ａ）１ｍｌ当たり少なくとも５００，０００個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも７５０，０００個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．０×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．１×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．２×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．３×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．４×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．５×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．６×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．７×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．８×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．９×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも２．０×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも５×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも７．５×１０６個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．０×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．１×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．２×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．３×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．４×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．５×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．６×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．７×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．８×１０７個のＭＥＰ、１ｍｌ当たり少なくとも１．９×１０７個のＭＥＰまたは１ｍｌ当たり少なくとも２．０×１０７個のＭＥＰのＭＥＰ濃度；
Ｂ）少なくとも１×１０６個のＭＥＰ、少なくとも５×１０６個のＭＥＰ、少なくとも１×１０７個のＭＥＰ、少なくとも５×１０７個のＭＥＰ、少なくとも１×１０８個のＭＥＰまたは少なくとも５×１０８個のＭＥＰの総ＭＥＰ数；および
Ｃ）培養物中の全細胞に対するＭＥＰの割合であって、培養物中の細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％がＭＥＰである割合。
いくつかの実施形態では、培養物は、赤血球、巨核球および血小板の少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、培養物は、少なくとも１つのタンパク質マーカーの発現に基づいて細胞を選別することを含まない方法によって作製される。
Ｊ．インビトロで分化した造血細胞の治療用途
本開示の方法によって作製され、本開示によって提供される赤血球および血小板を治療的に使用して、赤血球または血小板を、それを必要とする患者に提供し得る。
１．赤血球
赤血球の一般的な用途は、外傷または他の医学的問題による貧血を患っている患者の血液への酸素運搬能力を回復させることである。歴史的には、それらは全血の一部として輸血されたが、現代の慣行では、赤血球および血漿成分が別々に輸血される。輸血用の適合血液製剤を特定する過程は複雑であり、不適合ＲＢＣを患者に与えることが死を招く可能性がある。
輸血用の赤血球は、抗凝固剤、および通常は栄養素を提供する保存液であって、冷蔵温度で保存される生細胞の機能を保持する保存液と混合されることが多い。従来の赤血球輸血の場合、ドナーから採血した後に、またはアフェレーシスによる採血過程中に血液の流体部分から細胞を分離する。特定の患者の要求を満たすために、生成物を採血後に改変することもある。
赤血球輸血が行われる主な理由は、貧血を処置するためである。貧血は、身体が十分な赤色の酸素運搬血液細胞を有しない場合に起こる状態である。これは、身体の組織および細胞が十分な酸素を獲得していないことを意味する。
大まかに言えば、貧血は、赤血球産生の障害、ＲＢＣ破壊の増加（溶血性貧血）、失血および体液過剰（ｆｌｕｉｄ ｏｖｅｒｌｏａｄ）（血液量過多）によって引き起こされ得る。これらのいくつかは相互作用して、最終的には貧血を引き起こし得る。実際、貧血の最も一般的な原因は失血であるが、ＲＢＣ産生の相対的障害が発症しない限り、これは通常はいかなる持続的な症候も引き起こさない。
赤血球産生の障害による貧血は、幹細胞の増殖および分化の障害（これは、赤芽球癆、再生不良性貧血、不十分なエリスロポエチン産生を伴う腎不全による貧血、および内分泌障害によって引き起こされる貧血によって引き起こされ得る）、赤芽球の増殖および成熟の障害（これは、悪性貧血、ビタミンＢ１２欠乏による巨赤芽球性貧血の一形態、葉酸欠乏による貧血、未熟児貧血、鉄欠乏性貧血、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血、および腎不全による貧血によって引き起こされ得る）、ならびに他の機構（骨髄癆性貧血または骨髄癆、骨髄異形成症候群、および慢性炎症による貧血）によって引き起こされ得る。
赤血球破壊の増加による貧血は、一般に、溶血性貧血に分類される。これらは、一般に、黄疸および乳酸デヒドロゲナーゼレベルの上昇を特徴とする。赤血球破壊の増加による貧血は、内因性（血球内）異常（これは、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、無βリポタンパク血症、ピルビン酸キナーゼおよびヘキソキナーゼ欠損症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症およびグルタチオン合成酵素欠損症、ヘモグロビン症、鎌状赤血球貧血、不安定なヘモグロビンを引き起こすヘモグロビン症、発作性夜間血色素尿症、自己免疫性疾患、および赤血球に対する機械的外傷、例えば開心術後のものなどによって引き起こされ得る）によって引き起こされ得る。
失血による貧血は、急性失血を引き起こす外傷または手術、慢性失血を引き起こす胃腸管病変、慢性失血を引き起こす婦人科障害、および月経の後に起こり得る。
本開示の赤血球、例えば本明細書に開示される方法を使用して作製された赤血球などを使用して、それを必要とする患者（例えば、本明細書に記載される種類の貧血などの貧血を患っている患者）に赤血球を提供し得る。一般に、赤血球は、輸血組成物の形態で輸血によって患者に提供される（「濃厚赤血球」と称されることもある）。本明細書で使用される場合、「輸血組成物」は、赤血球と、栄養素を提供する１つ以上の代替の因子であって、生細胞の機能を保持する因子とを含む組成物である。いくつかの実施形態では、輸血は、抗凝固剤、緩衝剤および栄養素から選択される少なくとも１つの成分を含む。いくつかの実施形態では、それは、少なくとも１つの栄養素および少なくとも１つの抗凝固剤を含む緩衝溶液である。
いくつかの実施形態では、患者は、鎌状赤血球貧血の処置を必要とする。
いくつかの実施形態では、患者は、サラセミアの処置を必要とする。
いくつかの実施形態では、赤血球は、患者の血液型に適合した血液型である。
いくつかの実施形態では、赤血球は、インビトロで分化したＭＥＰ細胞からインビトロで分化した赤血球である。いくつかの実施形態では、患者から得られたＭＥＰ前駆細胞から、ＭＥＰ細胞をインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、患者の体細胞由来のｉＰＳＣから、ＭＥＰ細胞をインビトロで分化させる。例えば、ｉＰＳＣは、患者の体細胞由来のｉＰＳＣであり得、次いでこれを使用してＭＥＰ細胞を作製し、次いで必要に応じてこれを使用して、患者のゲノムと高い遺伝的同一性を有する赤血球を作製する。いくつかの実施形態では、患者から単離されたＲＢＣ前駆細胞から、ＲＢＣをインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ前駆細胞は、例えば、ＨＳＣ細胞およびＭＥＰ細胞の少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＭＥＰおよび／またはＲＢＣのゲノムは、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．１％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．２％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．３％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．４％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．５％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．６％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．７％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．８％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．９５％同一であるか、または患者のゲノムと同一である。
２．血小板
血流中の血小板数が非常に少ない場合、過剰な出血が起こり得る。血小板数が非常に多い場合、血管を閉塞して、脳卒中、心筋梗塞、肺塞栓症、または身体の他の部分（例えば、腕または脚の先端）への血管の閉塞などの事象をもたらし得る血塊が形成し得る（血栓症）。血小板の異常または病気は血小板症と称され、少ない血小板数（血小板減少症）、血小板機能の低下（血小板無力症）、または血小板数の増加（血小板増加症）のいずれかであり得る。血小板数を減少させる障害、例えばヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）または血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）があり、これらは典型的には出血の代わりに血栓症または凝血塊を引き起こす。
従来は、白血病、多発性骨髄腫の化学療法を受けている者、再生不良性貧血、ＡＩＤＳ、脾機能亢進症、ＩＴＰ、敗血症を有する者、骨髄移植、放射線処置、臓器移植または手術、例えば心肺バイパスを受けている者に対して血小板輸血が行われる。
血小板産生の減少によって引き起こされる血小板数の減少は、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、白血病、骨髄異形成症候群、肝不全の肝臓によるトロンボポエチン産生の減少、敗血症、デング熱および遺伝性症候群、例えば先天性無巨核球性血小板減少症（ＣＡＭＴ）、血小板減少橈骨欠損症候群、ファンコニー貧血、ベルナール−スーリエ症候群、メイ−ヘグリン異常、グレイ血小板症候群、アルポート症候群およびウィスコット−アルドリッチ症候群の少なくとも１つによって引き起こされ得る。
血小板破壊の増加によって引き起こされる血小板数の減少は、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、播種性血管内凝固症候群、発作性夜間血色素尿症、抗リン脂質症候群、全身性エリテマトーデス、輸血後紫斑病、新生児同種免疫性血小板減少症、脾機能亢進症による血小板の脾臓隔離（ｓｐｌｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、デング熱およびＨＩＶ関連血小板減少症の少なくとも１つによって引き起こされ得る。
血小板減少症はまた、バルプロ酸、メトトレキサート、カルボプラチン、インターフェロン、イソトレチノイン、パノビノスタット、モンテルカストナトリウム、Ｈ２遮断薬およびプロトンポンプ阻害剤を含む薬によって誘導され得る。
本開示の血小板、例えば本明細書に開示される方法を使用して作製された血小板などを使用して、それを必要とする患者（例えば、血小板減少症を患っている患者）に血小板を提供し得る。一般に、血小板は、輸血組成物の形態で輸血によって患者に提供される。本明細書で使用される場合、「輸血組成物」は、血小板と、抗凝固剤、緩衝剤および栄養素から選択される少なくとも１つの第２の成分とを含む組成物である。
いくつかの実施形態では、血小板は、患者の血液型に適合した血液型である。
いくつかの実施形態では、血小板は、インビトロで分化したＭＥＰ細胞からインビトロで分化した血小板である。いくつかの実施形態では、患者由来のＭＥＰ前駆細胞から、ＭＥＰ細胞をインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、患者の体細胞由来のｉＰＳＣから、ＭＥＰ細胞をインビトロで分化させ、患者由来のｉＰＳＣから、血小板もインビトロで分化させる。例えば、ｉＰＳＣは、患者の体細胞由来のｉＰＳＣであり得、次いでこれを使用してＭＥＰ細胞を作製し、次いで必要に応じてこれを使用して巨核球（今度は、これが血小板に分化する）を作製する。いくつかの実施形態では、患者から単離された血小板前駆細胞から、血小板をインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、血小板前駆細胞は、例えば、ＨＳＣ細胞およびＭＥＰ細胞の少なくとも１つである。多くのこのような実施形態における巨核球は、患者のゲノムと高度な遺伝的同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＥＰおよび／または血小板のゲノムは、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．１％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．２％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．３％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．４％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．５％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．６％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．７％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．８％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９％同一であるか、患者のゲノムと遺伝的に少なくとも９９．９５％同一であるか、または患者のゲノムと同一である。
Ｋ．インビトロで分化した造血細胞を使用する作用物質の分析
本開示の方法は、大量のＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板の生成を可能にする。このようなものとして、これらの方法およびそれらによって作製された細胞は、特定の実施形態では、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を利用するスクリーニング手順での使用にそれらを有利にする多くの特徴を有する。例えば、いくつかの実施形態では、多能性幹細胞源から分化したＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を使用することにより、複数の試験作用物質が関与するアッセイに高度な均一性が提供される。いくつかの実施形態では、血液型の遺伝子型、マイナー組織適合性抗原の遺伝子型および主要組織適合性の遺伝子型から選択される少なくとも１つの共通の遺伝因子を共有する多能性幹細胞源から、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を分化させる。いくつかの実施形態では、互いに遺伝的に少なくとも９９％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．１％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．２％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．３％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．４％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．５％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．６％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．７％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．８％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．９％同一であるか、互いに遺伝的に少なくとも９９．９５％同一であるか、または互いに遺伝的に同一であるゲノムを含む多能性幹細胞から、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を分化させる。
したがって、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型であって、本開示の方法によって作製されたか、または本開示によって提供される少なくとも１つの細胞型に対する効果について試験作用物質をスクリーニングする方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、ａ）本開示の方法によって、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を作製すること；ｂ）ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される前記少なくとも１つの細胞型を試験作用物質と接触させること；およびｃ）ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される前記少なくとも１つの細胞型の変化を観察することを含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、試験作用物質の存在下におけるＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型の変化を、試験作用物質を含まない対照条件下で成長した類似の細胞と比較することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ｄ）ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を対照作用物質と接触させること；ｆ）前記対照作用物質の存在下におけるＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型の変化を観察すること、ならびにｇ）前記対照作用物質の存在下におけるＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型の前記変化を、試験作用物質の存在下におけるＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型の変化と比較することを含む。
いくつかの実施形態では、試験作用物質の存在下におけるＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型の変化は、細胞における細胞増殖速度の変化、細胞死速度の変化、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの変化、および少なくとも１つのタンパク質のレベルの変化から選択される。いくつかの実施形態では、変化は、毒性マーカーレベルの変化である。いくつかの実施形態では、変化は、速度またはレベルの増加および減少から選択される。
いくつかの実施形態では、それは、被験体由来のＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型に対する効果について化合物をスクリーニングするのに有用である。例えば、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を出発細胞から作製する場合、それは、ＭＥＰ前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球前駆細胞および血小板前駆細胞の少なくとも１つである。被験体から前駆細胞を得る場合、多くの実施形態では、スクリーニングの結果は、その被験体に特に関連する。例えば、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型が、被験体のゲノムと非常に類似のゲノムから実質的に同一のゲノム（ａ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｓｕｂｊｅｃｔ）を含む場合、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型は、化合物を被験体に投与した後の被験体におけるインビボでの類似細胞の応答と非常に似た形で、その化合物に応答すると予想される。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法によって、ＭＥＰ、赤血球、巨核球および血小板から選択される少なくとも１つの細胞型を作製することは、被験体からＭＥＰ前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球前駆細胞および血小板前駆細胞の少なくとも１つを得ることを含む。
Ｌ．ＡｈＲ調節物質の治療用途
実施例で示されているように、ＡｈＲアンタゴニスト作用は、培養物におけるＭＥＰのＭｋ特異化および産生をもたらす。実施例では、有効量のＡｈＲアゴニストを哺乳類に投与することにより、哺乳類の血小板数が増加することも示されている。総合すると、これらのデータは、ＡｈＲアゴニスト作用およびアンタゴニスト作用の両方が前記過程において役割を果たすことを実証している：ＡｈＲアゴニスト作用はＭＥＰの数を増加させ、次いでこれがより多くのＭｋおよびより多くの血小板（およびより多くのＲＢＣ）を産生し続け得る。また、ＡｈＲアンタゴニストは特定の（ａｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）Ｍｋに対して作用して、内複製および血小板産生を増加させるようである。
したがって、本開示は、哺乳類の血小板数を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量のＡｈＲ調節物質を哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量のＡｈＲアゴニストを哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量のＡｈＲアンタゴニストを哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量のＡｈＲアゴニストおよび有効量のＡｈＲアンタゴニストを哺乳類に投与することを含む。ＡｈＲアゴニストおよびＡｈＲアンタゴニストの両方を投与するいくつかの実施形態では、ＡｈＲアゴニスト（ＡｈＲ ａｇｏｎｓｔ）およびＡｈＲアンタゴニストを共投与する。ＡｈＲアゴニストおよびＡｈＲアンタゴニストの両方を投与するいくつかの実施形態では、ＡｈＲアゴニスト（ＡｈＲ ａｇｏｎｓｔ）およびＡｈＲアンタゴニストを別個に投与する。例として、血小板減少症を患っており、および／または血小板減少症のリスクを有する哺乳類を処置することを含め、多くの方法において、哺乳類における血小板数を増加させることは有用である。したがって、本開示はまた、哺乳類における血小板減少症を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量のＡｈＲアゴニストを哺乳類に投与することを含む。
前記処置方法、および本明細書において哺乳類の小板数を増加させる方法で使用するための医薬組成物は、治療有効量の少なくとも１つのＡｈＲ受容体調節物質を含有するように製剤化される。医薬組成物は、例えば、血小板数が少ないことを特徴とする少なくとも１つの疾患状態の処置に有用である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡｈＲ受容体調節物質は、適切な医薬調製物、例えば経口投与用の液剤、懸濁剤、錠剤、分散錠、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤もしくはエリキシル剤、または非経口投与用の滅菌液剤もしくは懸濁剤、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器へと製剤化される。典型的には、上記ＡｈＲ調節物質は、当技術分野で周知の技術および手順を使用して、医薬組成物に製剤化される（例えば、Ａｎｓｅｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８５，１２６を参照のこと）。
これらの組成物において、有効濃度の１つ以上のＡｈＲ調節物質もしくは薬学的に許容され得る誘導体は、適切な医薬キャリアもしくはビヒクルと混合される。
薬学的に許容され得る誘導体としては、酸、塩基、エノールエーテルおよびエステル、塩、エステル、水和物、溶媒和物およびプロドラッグ形態（ｐｒｏｄｒｕｇ ｆｏｕｌ）が挙げられる。誘導体は、その薬物動態特性が対応する中性薬剤の少なくとも１つの特徴よりも優れているように選択される。ＡｈＲ調節物質は、製剤化前に誘導体化され得る。
組成物中のＡｈＲ調節物質の濃度は、投与の際に、例えば、血小板数の減少および／または正常な血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態の症候の１つ以上を処置する量を送達するのに有効なものである。
典型的には、例として限定されないが、組成物は、単回投与量の投与のために製剤化される。組成物を製剤化するためには、処置される状態が緩和または改善されるような有効濃度で、ＡｈＲ調節物質の重量分率を選択ビヒクルに溶解、懸濁、分散または代替の方法で混合する。ＡｈＲ調節物質の投与に適切な医薬キャリアまたはビヒクルとしては、特定の投与様式に適切であることが当業者に公知の任意のキャリアが挙げられる。
加えて、ＡｈＲ調節物質は、単独の活性薬剤として組成物中に製剤化され得るか、または他の活性薬剤と組み合わされ得る。組織ターゲティングリポソームを含むリポソーム懸濁物もまた、薬学的に許容され得るキャリアとして適切であり得る。これらは、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように調製され得る。簡潔に言えば、卵のホスファチジルコリンおよび脳のホスファチジルセリン（モル比７：３）をフラスコ内部で乾燥させることによって、多重膜小胞（ＭＬＶ）などのリポソームを形成し得る。本明細書で提供されるＡｈＲ調節物質の二価陽イオン非含有リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）溶液を添加し、フラスコを脂質薄膜が分散するまで振盪する。得られた小胞を洗浄して、カプセル化されていないＡｈＲ調節物質を除去し、遠心分離によってペレット化し、次いでＰＢＳに再懸濁する。
活性ＡｈＲ調節物質は、処置される患者に対して望ましくない副作用がなく、治療上有用な効果を及ぼすのに十分な量で、薬学的に許容され得るキャリアに含まれる。本明細書ならびに国際特許出願公開第９９／２７３６５号および国際特許出願公開第００／２５１３４号に記載されているインビトロ系およびインビボ系で作用物質を試験することによって治療有効濃度を経験的に決定し得、次いで、ヒトのための投与量を推定し得る。
医薬組成物中の活性ＡｈＲ調節物質の濃度は、活性薬剤の吸収速度、不活化速度および排泄速度、該薬剤の物理化学的性質、投与スケジュールおよび投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。例えば、送達される量は、本明細書で記載されるように、血小板数の減少および血小板機能の低下の少なくとも１つを特徴とする少なくとも１つの疾患状態を処置するのに十分である。
典型的には、治療有効投与量は、例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０〜１００μｇ／ｍｌの血清濃度の活性薬剤をもたらすべきである。医薬組成物は、典型的には、１日当たり体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇ〜約２０００ｍｇの投与量のＡｈＲ調節物質、例えば１日当たり体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇの投与量のＡｈＲ調節物質、または１日当たり体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの投与量のＡｈＲ調節物質、または１日当たり体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの投与量のＡｈＲ調節物質、または１日当たり体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約５ｍｇの投与量のＡｈＲ調節物質を提供すべきである。医薬単位剤形は、単位剤形当たり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば約１０ｍｇ〜約５００ｍｇの活性薬剤または薬剤の組み合わせが提供されるように調製される。
活性薬剤は、一度に投与され得るか、またはいくつかのより小さな用量に分割して時間間隔をおいて投与され得る。正確な投与量および処置期間は、処置されている疾患状態の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に決定され得るか、またはインビボもしくはインビトロの試験データからの推定によって決定され得ると理解される。濃度および投与量の値は、緩和すべき状態の重症度によっても変化し得ることを留意すべきである。任意の特定の被験体のために、個体の必要性、および組成物の投与を実行または監督する者の専門的な判断にしたがって、具体的な投与計画を時間の経過と共に調整すべきこと、ならびに本明細書で示される濃度範囲は単なる例示であり、特許請求される方法の範囲または実施を限定するものではないことをさらに理解すべきである。
したがって、有効濃度または有効量の１つ以上のＡｈＲ Ｘ調節物質またはその薬学的に許容され得る誘導体を、全身投与、局所投与または局部投与に適切な医薬キャリアまたはビヒクルと混合して医薬組成物を形成する。ＡｈＲ調節物質は、血小板数の減少および／または血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態を処置するのに有効な量で含まれる。組成物中の活性薬剤の濃度は、活性薬剤の吸収速度、不活化速度、排泄速度、投与スケジュール、投与量、特定の製剤ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。
組成物は、適切な経路（例として限定されないが、経口、非経口、直腸、局所、および局部を含む）によって投与されることが意図される。経口投与の場合、カプセル剤および錠剤が使用され得る。組成物は、液体形態、半液体形態または固体形態であり、各投与経路に適切な様式で製剤化される。
非経口適用、皮内適用、皮下適用または局所適用に使用される液剤または懸濁剤は、任意の組み合わせで以下の成分のいずれかを含み得る：滅菌希釈剤（例として限定されないが、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒を含む）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、およびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、および重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；バッファ（例えば、アセテート、シトレート、およびホスフェート；ならびに張度調節剤（例えば、塩化ナトリウム、またはデキストロース）。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製、プラスチック製もしくは他の適切な材料から作られた単回用量もしくは複数回用量バイアルに封入され得る。
薬剤が不十分な溶解度を示す場合、薬剤を可溶化するための方法が使用され得る。このような方法は当業者に公知であり、限定されないが、共溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））の使用、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標））の使用、または水性炭酸水素ナトリウムへの溶解が挙げられる。薬剤の薬学的に許容され得る誘導体も、有効な医薬組成物を製剤化するのに使用され得る。
薬剤（複数可）の混合または添加の際、得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得る。得られる混合物の形態は、意図される投与様式、および選択されるキャリアまたはビヒクル中の薬剤の溶解度を含むいくつかの要因に依存する。有効な濃度は、血小板数の減少および／または血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態の１つ以上の症候を処置するのに十分なものであり、経験的に決定され得る。
医薬組成物は、適切な量の薬剤またはその薬学的に許容され得る誘導体を含有する単位剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口液剤または懸濁剤、および経口液剤または懸濁剤、ならびに油−水エマルジョン）でヒトおよび動物への投与のために提供される。薬学的治療活性薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）およびその誘導体は、典型的には、単位剤形または複数剤形で製剤化および投与される。単位用量形態（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ ｆｏａｍ）は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知のように、ヒトおよび動物被験体に適切な個別にパッケージされた物理的に別個の単位を指す。各単位用量は、必要な医薬キャリア、ビヒクルまたは希釈剤と一緒に、所望の治療効果をもたらすのに十分な所定量の治療活性薬剤を含有する。単位用量形態の例としては、アンプルおよびシリンジ、ならびに個別にパッケージされた錠剤またはカプセル剤が挙げられる。単位用量形態は、その分割をまたは複数を投与され得る。複数用量形態は、複数の同一の単位剤形が、単位用量形態に分けて投与すべき単一容器にパッケージされたものである。複数用量形態の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤の瓶、またはパイント瓶もしくはガロン瓶が挙げられる。したがって、複数剤形は、パッケージで分けられていない複数の単位用量である。
組成物は、活性薬剤とともに、例えば限定されないが、希釈剤（例えば、乳糖、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク）；および結合剤（例えば、デンプン、天然ゴム（例えば、アカシアゴム） ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロース、およびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当技術分野で公知の他の結合剤）を含有し得る。薬学的に投与され得る液体組成物は、例えば、上記活性薬剤および任意選択の薬学的アジュバンドをキャリア（例えば、例として限定されないが、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなど）に溶解、分散または別の方法で混合し、それにより溶液または懸濁液を形成することによって調製され得る。所望の場合は、投与される薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤、乳化剤、または可溶化剤）、ｐＨ緩衝液など（例えば、例として限定されないが、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン 酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン）および他のこのような剤を含有し得る。このような剤形を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照のこと。投与すべき組成物または製剤は、いずれの場合も、処置される被験体の症候を緩和するのに十分な量で一定量の活性薬剤を含有する。
０．００５％〜１００％の範囲で活性薬剤を含有し、残りは非毒性キャリアから構成される剤形または組成物が調製され得る。経口投与の場合、薬学的に許容され得る非毒性の組成物は、通常使用される賦形剤のいずれか（例えば限定されないが、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、滑石、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムまたはサッカリンナトリウムなど）を組み込むことによって形成される。このような組成物としては、液剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤（例えば、限定されないが、埋め込み剤（ｉｍｐｌａｎｔ）およびマイクロカプセル化送達システム）、ならびに生物分解性、生体適合性ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ酢酸など）が挙げられる。これらの組成物の調製方法は、当業者に公知である。意図される組成物は、０．００１％〜１００％、例えば０．１％〜８５％または例えば７５％〜９５％の活性薬剤を含有し得る。
活性薬剤または薬学的に許容され得る誘導体は、身体からの急速な排除に対して薬剤を保護するキャリア（例えば、徐放性調合物またはコーティング）を用いて調製され得る。所望の性質の組み合わせを得るために、組成物は他の活性薬剤を含有し得る。また、ＡｈＲ調節物質またはその薬学的に許容され得る誘導体は、血小板数の減少および／または血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態を処置するのに有益であることが一般分野で公知の別の薬理学的作用物質と一緒に、治療目的または予防目的で有利に投与され得る。
経口医薬剤形としては、例として限定されないが、固体、ゲルおよび液体が挙げられる。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤および混合散剤（ｂｕｌｋ ｐｏｗｄｅｒ）が挙げられる。経口錠剤としては、圧縮錠、チュアブルロゼンジ、および腸溶性コーティング、糖コーティングまたはフィルムコーティングされ得る錠剤が挙げられる。カプセルは、硬質ゼラチンカプセルでもよいし、または軟質ゼラチンカプセルでもよく、顆粒剤および散剤は、当業者に公知の他の成分と組み合わせて非発泡性形態または発泡形態で提供され得る。
いくつかの実施形態では、製剤は、固体剤形、例えばカプセル剤または錠剤である。錠剤、丸剤、カプセル剤、トロ−チ剤などは、以下の成分のいずれかまたは類似の性質の剤を含有し得る：結合剤；希釈剤；崩壊剤；滑沢剤；流動促進剤；甘味料；および香味剤。
結合剤の例としては、例として限定されないが、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、グルコース溶液、アカシア粘液、ゼラチン溶液、スクロースおよびデンプンペーストが挙げられる。滑沢剤としては、例として限定されないが、タルク、デンプン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、石松子およびステアリン酸が挙げられる。希釈剤としては、例として限定されないが、ラクトース、スクロース、デンプン、カオリン、塩、マンニトールおよびリン酸二カルシウムが挙げられる。流動促進剤としては、例として限定されないが、コロイド状二酸化ケイ素が挙げられる。崩壊剤としては、例として限定されないが、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、アルギン酸、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、ベントナイト、メチルセルロース、寒天およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。着色料としては、例として限定されないが、認可保証された水溶性のＦｌ色素およびＣ色素、それらの混合物；ならびにアルミナ水和物に懸濁した水不溶性ＩＤ色素およびＣ色素が挙げられる。甘味料としては、例として限定されないが、スクロース、ラクトース、マンニトールおよび人工甘味料（例えば、サッカリン）、ならびに任意の数の噴霧乾燥したフレーバーが挙げられる。香味剤としては、例として限定されないが、植物（例えば、果物）から抽出される天然のフレーバー、および快適な感覚を生じる作用物質（例えば限定されないが、ペパーミントおよびサリチル酸メチル）の合成混合物が挙げられる。湿潤剤としては、例として限定されないが、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコールおよびポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。腸溶性コーティングとしては、例として限定されないが、脂肪酸、脂肪、ワックス、シェラック、アンモニア処理シェラックおよび酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。フィルムコーティングとしては、例として限定されないが、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００および酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。
経口投与が望まれる場合、薬剤は、それを胃の酸性の環境から保護する組成物で提供され得る。例えば、組成物は、胃内でその完全性を維持し、腸で活性薬剤を放出する腸溶コーティングで製剤化され得る。組成物はまた、制酸剤または他のこのような成分と組み合わせて製剤化され得る。
単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上記種類の材料に加えて、液体キャリア（例えば、脂肪油）を含有し得る。加えて、単位剤形は、その投与量単位の物理的形態を改変する様々な他の材料（例えば、糖および他の腸溶性剤のコーティング）を含有し得る。薬剤はまた、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハ、スプリンクル（ｓｐｒｉｎｋｌｅ）、チューインガムなどの成分として投与され得る。シロップ剤は、活性薬剤に加えて、甘味料としてのスクロースおよび特定の保存剤、色素および着色料およびフレーバーを含有し得る。
活性材料はまた、所望の作用を損なわない他の活性材料と共に、または所望の作用を補完する材料（例えば、制酸剤、Ｈ２遮断薬および利尿剤）と共に混合され得る。
錠剤に含まれる薬学的に許容され得るキャリアは、結合剤、滑沢剤、希釈剤、崩壊剤、着色料、香味剤および湿潤剤である。腸溶性コーティング錠は、腸溶性コーティングにより胃酸作用に抵抗性であり、中性またはアルカリ性の腸で溶解または崩壊する。糖コーティング錠は、薬学的に許容され得る物質の異なる層が適用された圧縮錠である。フィルムコーティング錠は、ポリマーまたは他の適切なコーティングでコーティングされた圧縮錠である。多重圧縮錠（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｔａｂｌｅｔ）は、前述の薬学的に許容され得る物質を利用して複数回の圧縮サイクルによって作製された圧縮錠である。着色料も上記剤形で使用され得る。香味剤および甘味料は、圧縮錠、糖コーティング錠、多重圧縮錠およびチュアブル錠で使用される。香味剤および甘味料は、チュアブル錠およびロゼンジの形成で有用である。
液体の経口剤形としては、水性液剤、エマルジョン、懸濁剤、発泡性顆粒剤から再構成された液剤および／または懸濁剤、ならびに発泡性顆粒剤から再構成された発泡性調製物が挙げられる。水性液剤としては、例えば、エリキシル剤およびシロップ剤が挙げられる。エマルジョンは、水中油型または油中水型のいずれかである。
エリキシル剤は、加糖した澄明な水性アルコール調製物である。エリキシル剤で使用される薬学的に許容され得るキャリアとしては、溶媒が挙げられる。シロップ剤は糖（例えば、スクロース）の濃縮水性液剤であり、保存剤を含有し得る。エマルジョンは、一方の液体が他方の液体全体にわたって小球形態で分散している二相系である。エマルジョンで使用される薬学的に許容され得るキャリアは、非水性液体、乳化剤および保存剤である。懸濁剤は、薬学的に許容され得る懸濁化剤および保存剤を使用する。液体経口剤形に再構成すべき非発泡性顆粒剤で使用される薬学的に許容され得る物質としては、希釈剤、甘味料および湿潤剤が挙げられる。液体経口剤形に再構成すべき発泡性顆粒剤で使用される薬学的に許容され得る物質としては、有機酸および二酸化炭素源が挙げられる。着色料および香味剤が、上記剤形のいずれかで使用され得る。
溶媒としては、例として限定されないが、グリセリン、ソルビトール、エチルアルコールおよびシロップが挙げられる。保存剤の例としては、限定されないが、グリセリン、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ ａｄｄ）、安息香酸ナトリウムおよびアルコールが挙げられる。エマルジョンで利用される非水性液体としては、例として限定されないが、鉱油および綿実油が挙げられる。乳化剤としては、例として限定されないが、ゼラチン、アカシア、トラガカント、ベントナイト、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤が挙げられる。懸濁化剤としては、例として限定されないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ペクチン、トラガカント、Ｖｅｅｇｕｍおよびアカシアが挙げられる。希釈剤としては、例として限定されないが、ラクトースおよびスクロースが挙げられる。甘味料としては、例として限定されないが、スクロース、シロップ、グリセリンおよび人工甘味料（例えば、サッカリン）が挙げられる。湿潤剤としては、例として限定されないが、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコールおよびポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。有機酸としては、例として限定されないが、クエン酸および酒石酸が挙げられる。二酸化炭素源としては、例として限定されないが、重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムが挙げられる。着色料としては、例として限定されないが、認下証明された水溶性ＦＤ色素およびＣ色素、ならびにそれらの混合物のいずれかが挙げられる。香味剤としては、例として限定されないが、果物などの植物から抽出された天然フレーバー、および好ましい味覚を生じる作用物質の合成ブレンドが挙げられる。
固体剤形の場合、例えばプロピレンカーボネート、植物油またはトリグリセリドの溶液または懸濁液は、ゼラチンカプセル中に封入される。このような溶液ならびにその調製物および封入物は、米国特許第４，３２８，２４５号、米国特許第４，４０９，２３９号；および米国特許第４，４１０，５４５号に開示されている。液体剤形の場合、溶液（例えば、ポリエチレングリコールの溶液）を十分な量の薬学的に許容され得る液体キャリア（例えば、水）で希釈して、投与のために容易に計りとることができる。
あるいは、液体または半固体経口製剤は、活性薬剤をまたは塩を植物油、グリコール、トリグリセリド、プロピレングリコールエステル（例えば、プロピレンカーボネート）またはこのような他のキャリアに溶解または分散させ、これらの溶液または懸濁液を硬質ゼラチンカプセルシェルまたは軟質ゼラチンカプセルシェルに封入することによって調製され得る。他の有用な製剤としては、米国再発行特許第２８，８１９号および米国特許第４，３５８，６０３号に記載されているものが挙げられる。簡潔に言えば、このような製剤としては、限定されないが、本明細書で提供される薬剤、ジアルキル化モノアルキレングリコールまたはジアルキル化ポリアルキレングリコール、例えば限定されないが、１，２−ジメトキシメタン、ジグライム、トリグライム、テトラグライム、ポリエチレングリコール−３５０−ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール−５５０−ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール−７５０−ジメチルエーテル（ここで、３５０、５５０および７５０はポリエチレングリコールの近似の平均分子量を指す）、および１つ以上の抗酸化剤、例えばブチル化オキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、ヒドロキノン、ヒドロキシクマリン、エタノールアミン、レシチン、ケファリン、アスコルビン酸、リンゴ酸、ソルビトール、リン酸、チオジプロピオン酸およびそのエステル、ならびにジチオカルバメートを含有するものが挙げられる。
他の製剤としては、限定されないが、薬学的に許容され得るアセタールを含む水性アルコール溶液が挙げられる。これらの製剤で使用されるアルコールは、限定されないが、プロピレングリコールおよびエタノールを含む１つ以上のヒドロキシル基を有する任意の薬学的に許容され得る水混和性溶媒である。アセタールとしては、限定されないが、低級アルキルアルデヒドのジ（低級アルキル）アセタール、例えばアセトアルデヒドジエチルアセタールが挙げられる。
有効成分の溶解を改変するかまたは持続させるために、錠剤およびカプセル製剤を当業者に公知のようにコーティングし得る。したがって、例えば限定されないが、それらは、従来の腸溶性消化可能なコーティング（例えば、フェニルサリチル酸塩、ワックスおよび酢酸フタル酸セルロース）でコーティングされ得る。
一般に、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も本明細書で意図される。注射剤は、従来の形態で、液体液剤もしくは液体懸濁剤として、注射前の液体の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態として、またはエマルジョンとして調製され得る。適切な賦形剤としては、例として限定されないが、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールが挙げられる。加えて、所望の場合、投与すべき医薬組成物はまた、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、安定剤、溶解増強剤、および他のそのような剤（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンなど）を含有し得る。
一定レベルの投与量が維持されるような徐放系または持続放出系の埋め込み（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと）も本明細書で意図される。簡潔に言えば、ＡｈＲ調節物質は、固体の内部マトリックス、例えばポリメチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、可塑化または非可塑化ポリ塩化ビニル、可塑化ナイロン、可塑化ポリエチレンテレフタレート、天然ゴム、ポリイソプレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、シリコーンカーボネートコポリマー、親水性ポリマー、例えばアクリル酸およびメタクリル酸のエステルのヒドロゲル、コラーゲン、架橋ポリビニルアルコールおよび部分的に加水分解された架橋ポリ酢酸ビニル（これは、外側のポリマー膜、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／アクリル酸エチルコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリデン、エチレンおよびプロピレンとのコポリマー、イオノマーポリエチレンテレフタレート、ブチルゴム エピクロロヒドリンゴム、エチレン／ビニルアルコールコポリマー、エチレン／酢酸ビニル／ビニルアルコールターポリマー、ならびにエチレン／ビニルオキシエタノールコポリマー（これは、体液中で不溶性である）によって囲まれている）に分散されている。放出速度を制御する工程において、薬剤は外側のポリマー膜を通って拡散する。このような非経口組成物に含まれる活性薬剤の割合は、その特定の性質、ならびに薬剤の活性および被験体の要求に非常に依存する。
ＡｈＲ調節物質の非経口投与としては、静脈内投与、皮下投与および筋肉内投与が挙げられる。非経口投与用の調製物としては、いつでも注射できる滅菌液剤、使用直前に溶媒といつでも混合できる滅菌乾燥可溶性生成物（例えば、凍結乾燥粉末）（皮下注射用錠剤を含む）、いつでも注射できる滅菌懸濁剤、使用直前にビヒクルといつでも混合できる滅菌乾燥不溶性生成物、および滅菌エマルジョンが挙げられる。液剤は、水性または非水性のいずれかであり得る。
静脈内投与される場合、適切なキャリアとしては、生理食塩液またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、ならびにそれらの混合物）を含有する溶液が挙げられる。
非経口調製物で使用される薬学的に許容され得るキャリアとしては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、バッファ、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容され得る物質が挙げられる。
水性ビヒクルとしては、例として限定されないが、注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル液、注射用等張性デキストロース、注射用滅菌水、注射用デキストロースおよび乳酸リンゲル液が挙げられる。非水性非経口ビヒクルとしては、例として限定されないが、植物起源の不揮発性油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナッツ油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む複数回用量の容器にパッケージされた非経口調製物に、静菌性濃度または静真菌性濃度の抗菌剤を添加しなければならない。等張剤としては、例として限定されないが、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。バッファとしては、ホスフェートおよびシトレートが挙げられる。抗酸化剤としては、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁化剤および分散剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬キャリアとしてはまた、例として限定されないが、水混和性ビヒクル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。
所望の薬理学的効果をもたらすのに有効な量が注射によって提供されるように、薬学的に活性な薬剤の濃度を調整する。正確な用量は、当技術分野で公知のように、患者または動物の年齢、体重および状態に依存する。
単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針を備えるシリンジにパッケージされる。非経口投与用の調製物は、当技術分野で公知であり慣例であるように、滅菌されているべきである。
例として、活性薬剤を含有する滅菌水溶液の静脈内注入または動脈内注入は、有効な投与様式である。代替の実施形態は、所望の薬理効果をもたらすために必要なとおり、注射される活性薬剤を含有する滅菌水性または油性液剤または懸濁剤である。
注射剤は、局部投与および全身投与のために設計される。典型的には、治療有効投与量は、処置される組織（複数可）に対して、少なくとも約０．１％ｗ／ｗ〜最大約９０％ｗ／ｗ以上、例えば１％ｗ／ｗ超の濃度の活性薬剤を含有するように製剤化される。活性薬剤は、一度に投与され得るか、またはいくつかのより小さな用量に分割して時間間隔をおいて投与され得る。正確な投与量および処置期間は、処置されている組織の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に決定され得るか、またはインビボもしくはインビトロの試験データからの推定によって決定され得ると理解される。濃度および投与量の値は、処置される個体の年齢によっても変化し得ることを留意すべきである。任意の特定の被験体のために、個体の要求、および製剤の投与を実行または監督する者の専門的な判断にしたがって、具体的な投与計画を時間の経過と共に調整すべきこと、ならびに本明細書で示される濃度範囲は単なる例示であり、特許請求される製剤の範囲または実施を限定するものではないことをさらに理解すべきである。
薬剤を微粉化形態もしくは他の適切な形態で懸濁してもよいし、または誘導体化して例えばより可溶性の活性生成物を生成してもよいし、もしくはプロドラッグもしくは他の薬学的に許容され得る誘導体を生成してもよい。得られる混合物の形態は、意図される投与様式、および選択されるキャリアまたはビヒクル中の薬剤の溶解度を含むいくつかの要因に依存する。有効濃度は、状態の症候を改善するのに十分なものであり、経験的に決定され得る。
投与のために、凍結乾燥粉末を溶液、エマルジョンおよび他の混合物に再構成してもよいし、または固体もしくはゲルとして製剤化してもよい。
凍結乾燥滅菌粉末は、本明細書で提供される薬剤またはその薬学的に許容され得る誘導体を適切な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、粉末またはその粉末から調製される再構成溶液の安定性または他の薬理学的要素を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤としては、限定されないが、デキストロース、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な剤が挙げられる。溶媒はまた、典型的にはほぼ中性ｐＨで、緩衝剤、例えばクエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム、または当業者に公知のこのような他の緩衝剤を含有し得る。続いて、溶液を濾過滅菌した後、当業者に公知の標準条件下で凍結乾燥することによって、所望の製剤が提供される。一般に、得られた溶液は、凍結乾燥用のバイアルに分配される。各バイアルは、例として限定されないが、単回投与量の薬剤（１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば１００ｍｇ〜５００ｍｇ）または複数回投与量の薬剤を含有する。凍結乾燥粉末は、適切な条件下、例えば約４℃〜室温で保存され得る。
注射用水でこの凍結乾燥粉末を再構成することにより、非経口投与に使用するための製剤が得られる。再構成のために、滅菌水または他の適切なキャリア１ｍＬ当たり、約１ｍｇ〜５０ｍｇ、例えば約５ｍｇ〜３５ｍｇ、例えば約９ｍｇ〜３０ｍｇの凍結乾燥粉末を添加する。正確な量は、選択される薬剤に依存する。このような量は、経験的に決定され得る。
局所投与および全身投与の場合、局所混合物を記載されているように調製する。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、エマルジョン、液剤、エリキシル剤、ローション剤、懸濁剤、チンキ、ペースト剤、泡状物（ｆｏａｍ）、エアゾール剤、灌注剤（ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ）、スプレー剤、坐薬、包帯、皮膚パッチまたは局所投与に適切な他の任意の製剤として製剤化される。
薬剤またはその薬学的に許容され得る誘導体は、例えば吸入による局所適用のためにエアゾール剤として製剤化され得る（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、米国特許第４，４１４，２０９号および米国特許第４，３６４，９２３号を参照すると、炎症性疾患（特に、喘息）の処置に有用なステロイドを送達するためのエアゾール剤が記載されている）。気道投与用のこれらの製剤は、噴霧器用のエアゾールまたは溶液の形態であり得るか、または単独でもしくは不活性キャリア（例えば、ラクトース）と組み合わせて吹送するための微粉末としてであり得る。このような場合、製剤の粒子は、例として限定されないが、約５０ミクロン未満の直径、例えば約１０ミクロン未満の直径を有する。
薬剤は、局部適用または局所適用、例えば皮膚および粘膜（例えば、眼）に対する局所適用のために、ゲル、クリームおよびローションの形態で、眼適用のために、または槽内適用または脊髄内適用のために製剤化され得る。局所投与は、経皮送達の場合、また眼もしくは粘膜への投与の場合、または吸入療法について意図される。活性薬剤のみの、または活性薬剤を薬学的に許容され得る他の賦形剤と組み合わせた点鼻液剤も投与され得る。
これらの液剤（特に、眼科用途を目的とするもの）は、例として限定されないが、適切な塩を含む約０．０１％〜約１０％の等張液（ｐＨ約５〜７）として製剤化され得る。
他の投与経路、例えば経皮パッチおよび直腸投与も本明細書で意図される。
微小電気泳動デバイスおよび電気泳動デバイスを含む経皮パッチは当業者に周知である。例えば、このようなパッチは、米国特許第６，２６７，９８３， 米国特許第６，２６１，５９５号、米国特許第６，２５６，５３３号、米国特許第６，１６７，３０１号、米国特許第６，０２４，９７５号、米国特許第６，０１０７１５号、米国特許第５，９８５，３１７号、米国特許第５，９８３，１３４号、米国特許第５，９４８，４３３号、および米国特許第５，８６０，９５７号に開示されている。
直腸投与用の薬学的投薬薄片（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｔｈｉｎ’ｓ）は、全身効果のための直腸坐薬、直腸カプセルおよび直腸錠剤である。本明細書で使用される直腸坐薬は、体温で融解または軟化して１つ以上の薬理有効成分または治療有効成分を放出する直腸挿入用の固体本体を意味する。直腸坐薬で利用される薬学的に許容され得る物質は、融点を上げるための基剤またはビヒクルおよび剤である。基剤の例としては、カカオ脂（ｃｏｃｏａ ｂｕｔｔｅｒ）（カカオ脂（ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｏｉｌ））、グリセリン−ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）、および脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの適切な混合物が挙げられる。様々な基剤の組み合わせが使用され得る。坐薬の融点を上げるための剤としては、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸坐薬は、圧縮方法または成形によって調製され得る。直腸坐薬の典型的な重量は、例として限定されないが、約２〜３ｇｍである。
直腸投与用の錠剤およびカプセル剤は、経口投与用の製剤と同じ薬学的に許容され得る物質を使用して同じ方法によって製造される。
ＡｈＲ調節物質またはその薬学的に許容され得る誘導体は、処置すべき被験体の特定の組織、受容体または他の身体領域にターゲティングされるように製剤化され得る。このような多くのターゲティング方法は、当業者に公知である。このようなターゲティング方法は、本組成物における使用のために本明細書で意図される。ターゲティング方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、米国特許第６，２７４，５５２号、米国特許第６，２７１，３５９号、米国特許第６，２５３，８７２号、米国特許第６，１３９，８６５号、米国特許第６，１３１，５７０号、米国特許第６，１２０，７５１号、米国特許第６，０７１，４９５号、米国特許第６，０６０，０８２号、米国特許第６，０４８，７３６号、米国特許第６，０３９，９７５号、米国特許第６，００４，５３４号、米国特許第５，９８５，３０７号、米国特許第５，９７２，３６６号、米国特許第５，９００，２５２号、米国特許第５，８４０，６７４号、米国特許第５，７５９，５４２号、および米国特許第５，７０９，８７４号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングリポソームなどの組織ターゲティングリポソームを含むリポソーム懸濁液も、薬学的に許容され得るキャリアとして適切であり得る。これらは、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように調製され得る。簡潔に言えば、卵のホスファチジルコリンおよび脳のホスファチジルセリン（モル比７：３）をフラスコ内側で乾燥させることによって、多重膜小胞（ＭＬＶ）などのリポソームを形成し得る。本明細書で提供される薬剤の二価陽イオン非含有リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）溶液を添加し、フラスコを脂質薄膜が分散するまで振盪する。得られた小胞を洗浄して、カプセル化されていない薬剤を除去し、遠心分離によってペレット化し、次いでＰＢＳに再懸濁する。
前記方法に使用するためのＡｈＲ調節物質または薬学的に許容され得る誘導体は、パッケージ材料と、前記パッケージ材料内のＡｈＲ調節物質またはその薬学的に許容され得る誘導体（これは、ＡｈＲ活性を調節するために、または血小板数の減少および／もしくは血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態の１つ以上の症候を処置するために有効である）と、前記ＡｈＲ調節物質もしくは組成物またはそれらの薬学的に許容され得る誘導体が、ＡｈＲ活性を調節するために、血小板数の減少および／もしくは血小板機能の低下を特徴とする少なくとも１つの疾患状態の１つ以上の症候を処置するために使用されることを示すラベルとを含有する製品としてパッケージされ得る。
本明細書で提供される製品は、パッケージ材料を含有する。医薬品をパッケージするのに使用されるパッケージ材料は、当業者に周知である。例えば、米国特許第５，３２３，９０７号、米国特許第５，０５２，５５８号および米国特許第５，０３３，２５２号を参照のこと。医薬パッケージ材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、ならびに選択された製剤ならびに意図される投与および処置の様式に適切な任意のパッケージ材料が挙げられる。
以下の実施例は、本発明の使用方法をより詳細に説明するのに役立つ。これらの実施例は例示目的で示すものであり、本発明の真の範囲を限定するものではない。
Ａ．実験手順
１．ｉＰＳＣの誘導および培養条件
ｈＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスの形質導入によって、ｉＰＳＣの誘導を達成した。以前に記載されているように（Ｓｏｍｅｒｓ，Ａ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８，１７２８−１７４０（２０１０））、ヒトＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびｃＭＹＣをコードするｃＤＮＡをｐＨＡＧＥレンチウイルスプラスミドにライゲーションすることによって、ｈＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスベクターを構築した。５つのプラスミドをコトランスフェクトすることによって、レンチウイルスを２９３Ｔ細胞内にパッケージし、以前に公開されている超遠心分離プロトコール（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８，６４−７４（２０１０）；Ｓｏｍｍｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７，５４３−５４９（２００９））によって濃縮した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｉＰＳＣ生成のための原料として使用した。ヒト参加者から末梢血（４ｍｌ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒバイアル（３６２７６０）に採取した。サンプルを１８００ｒｃｆ、３７℃で２５分間遠心分離し、得られたバフィーコートを１５ｍｌファルコンチューブに回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、計数して、培養のために１×１０６個の細胞が単離されたことを確実にした。ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １６０−２０４−１０１）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ ２５５−ＳＣ−０１０）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ ２０３−ＩＬ−０１０）、２Ｕ／ｍｌ ｈＥＰＯｇｅｎ（Ａｍｇｅｎ）、４０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ ２９１−ＧＩ−０５０）、５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ４４０３）、１００ｕｇ／ｍｌプリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ａｎｔ−ｐｍ−２）および１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ｄ４９０２）からなる２ｍｌの増殖培地に細胞を再懸濁した。８〜９日後、ポリブレンを培地に添加し（５ｕｇ／ｍｌ）、ｈＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスを１〜１０の範囲のＭＯＩで培養物に添加した。２４時間後、接種培養物を２２５０ｇで９０分間スピンし、ポリブレン培地を廃棄した。次いで、細胞を照射マウス胚線維芽細胞（ｉＭＥＦ）上にまき、ＤＭＥＭ Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１３３００５７）、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２３３−ＦＢ−０２５）、１ｎｇ／ｍｌローキナーゼ阻害剤（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ １０００５５８３）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０８２８０２８）および１００ｕｇ／ｍｌプリモシンを含む「ｉＰＳＣ培地」中で約１５日間培養した。次いで、クローンを採取し、長期培養で増殖させた。
２．ｉＰＳＣの中胚葉細胞発生運命への定方向分化
ｉＭＥＦで２４時間馴化して、２ｎｇ／ｍｌローキナーゼ阻害剤および２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したｉＰＳＣ培地を有するマトリゲルコーティング６ウェルプレートに、高継代ｉＰＳＣをまいた。２日後、ｉＰＳＣ培地を中胚葉Ｄ０−１培地（５ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ ３１４−ＢＰ−０１０）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２９３−ＶＥ−０１０）、２５ｎｇ／ｍｌ ｈＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ ２８７−ＴＣ−５００）および１０％ＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１０４９１０１））で置き換えた。２日目に、中胚葉Ｄ０−１培地を中胚葉Ｄ２培地（５ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ−４、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦおよび１０％ＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ）で置き換えた。中胚葉Ｄ３培地は、以下のものから構成されていた：ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０６３９０１１）、５ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ−４、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ。４日目および５日目の中胚葉培地は、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、１５ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦおよび５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦから構成されていた。６日目の中胚葉培地：７４％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３３００６１）、２４％ＨａｍｓＦ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０−０８０−ＣＶ）、１％Ｂ２７ サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７−０１０）、０．５％Ｎ２−サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２−０４８）、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ３０５９）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ ２５５−ＳＣ−０１０）、２５ｎｇ／ｍｌ ｈＦｌｔ３ リガンド（Ｒ＆Ｄ ３０８−ＦＫＮ−００５）。７日目の培地：７４％ＩＭＤＭ、２４％ＨａｍｓＦ１２、１％Ｂ２７サプリメント、０．５％Ｎ２−サプリメント、０．５％ＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ｈＦｌｔ３リガンド、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｇ１４０ＢＴ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ２０６−ＩＬ−０１０）、０．５Ｕ／ｍｌ ｈＥＰＯｇｅｎおよび０．２ｕＭ ６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ３０００１９）。７日目の後、前日の培地を吸引せずに、５ｍｌの７日目の培地を培養物に毎日添加した。すべての基本培地ミックスには、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５０３００８１）、４×１０−４Ｍモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ Ｍ１７５３）、１００ｕｇ／ｍｌプリモシンおよび５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸が含まれていた。懸濁液中の細胞を回収して、１０〜１３日目にアッセイし、または長期培養のために分割した。
３．レンチウイルスベクターの作製および適用
ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ切断部位がそれぞれ５’および３’末端に組み込まれたＡＨＲ活性レポーター構築物ｐＧｕｄＬｕｃ１．１から、ＭＭＴＶ−ＤＲＥ（マウス乳腺腫瘍ウイルス／マウスＣＹ１Ａ１遺伝子由来のダイオキシン応答エレメント領域）プロモーター領域を増幅するように、ＰＣＲプライマーを設計した。次いで、Ｅｆ１αプロモーターを切り出し、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ消化ＭＭＴＶ−ＤＲＥにライゲーションすることによって、制限酵素消化ＰＣＲ産物を、ｐＨＡＧＥ２レンチウイルスＥｆ１α−ｄｓＲｅｄ（ＮＬＳ）−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎプラスミドおよびｐＨＡＧＥ２レンチウイルスＥｆ１α−不安定化ＺｓＧｒｅｅｎに挿入した。加えて、ＡＨＲリプレッサーをｐＨＡＧＥ２レンチウイルスＥｆ１α−ｄｓＲｅｄ（ＮＬＳ）−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎにクローニングした。ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ切断部位がそれぞれ５’および３’部位に組み込まれたＨＰＶ４２２ベースの構築物から、ｆ．ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓのＡＨＲＲコード領域を増幅するように、プライマーを設計した。ｄｓＲｅｄ（ＮＬＳ）インサートを切り出し、消化ＡＨＲＲを上記ベクターにライゲーションした。
以前に公開されているように（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ，Ｇ．，Ｋｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｎ．＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１２，１０９３−１０９９．Ｅｐｕｂ ２００６ Ａｕｇ １０９６．（２００６））、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルス粒子をパッケージおよび濃縮した。細胞に一晩感染させ、続いて、本文書に示されているように蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって、ｄｓＲｅｄおよびＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子発現をモニタリングした。
４．ＡＨＲ低分子競合アッセイ
ＡＨＲ低分子アゴニストの６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）およびＡＨＲ競合阻害剤のＣＨ２２３１９１をこれらのアッセイに使用した。６日目に、ＣＨ２２３１９１を中胚葉培養物に５ｕＭ（１×）および２．５ｕＭ（０．５×）で添加した。７日目に、０．２ｕＭ ＦＩＣＺを培養物に添加し、培地を毎日添加した。ＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。
５．定量ＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ１９０６）を使用してＤＮａｓｅ処理した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３６８８１４）を使用して、ｃＤＮＡへの逆転写を実施した。ＡＨＲ（Ｈｓ００１６９２３３＿ｍ１）、ＣＹＰ１Ｂ１（Ｈｓ００２３８２９１６＿ｓ１）、ＨＢＡ（Ｈｓ００３６１１９１＿ｇ１）、ＨＢＢ（Ｈｓ００７５８８８９＿ｓ１）、ＨＢＧ（Ｈｓ０１６２９４３７＿ｓ１）、ｖＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＰＦ４（Ｈｓ００４２７２２０＿ｇ１）、ＮＦ−Ｅ２（Ｈｓ００２３２３５１＿ｍ１）およびＣＤ６２Ｐ（Ｈｓ００９２７９００＿ｍ１）に対するＴａｑｍａｎプローブを使用して、ｃＤＮＡの定量（リアルタイム）ＰＣＲ増幅を実施し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅマシンで処理した。相対的遺伝子発現をＢ−アクチン（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）に対して正規化した。
６．フローサイトメトリー
約１０５個の細胞を収集し、スピンし、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁した。ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ ５５５４６６）、ＣＤ２３５−ＰＥ（ＢＤ ５５５５７０）、ＣＤ７１−ＦＩＴＣ（ＢＤ ５５５５３６）を含むヒト抗体と共にサンプルを周囲温度で３０分間インキュベートし、洗浄し、３３００ｒｐｍで７分間スピンし、１ｕｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含む０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁した。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒでサンプルを処理し、ＦｌｏＪｏ８．７によって分析した。倍数性分析の場合、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ照合の直前に、１．５％ＮＰ−４０（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐ−８７２）および６２．５ｕｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳで細胞を処理した。マウス骨髄の場合、最初に、マウスコンジュゲート抗体ＣＤ１６／３２（ＢＤ ５５３１４２）と共にサンプルを周囲温度で５分間インキュベートしてから、ｃ−Ｋｉｔ−ＰＥ（ＢＤ ５５３３５５）、ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ ５５３８４８）、Ｔｅｒ１１９−ＰＥ（ＢＤ ５５３６７３）と共に３０分間インキュベートした。細胞生存率アッセイの場合、２〜３×１０５個の細胞を収集し、５％ＦＢＳを補充した８．８ｕｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｓｈｔ３３３４２を含むＰＢＳに再懸濁した。次いで、サンプルを３７℃の暗所で１５分間インキュベートし、洗浄し、１ｕｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含む５％ＦＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えるＬＳＲ−ＩＩマシンでサンプルを処理し、ＦｌｏＪｏ８．７によって分析した。
７．遺伝子発現分析
分析したデータは、ｄＭａｐウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｄｍａｐ）からダウンロードしたＲＭＡ処理バッチ正規化Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）発現プロファイルに対応する。これには、１５個の区別可能な造血細胞集団（３８個の亜集団）に相当する２１２回の実験にわたる８９６８個のＥｎｔｒｅｚのアノテート遺伝子の発現レベルが含まれている。手動でキュレーションした３７個のＡｈＲ標的＋ＡｈＲそれ自体、および５個の集団（１１個の亜集団）に対応する７２回の実験のスペースに前記データを投影させて、ＨＳＣからＭｋ／赤血球への分化経路を明らかにした。距離メトリックとして１−ピアソン相関による階層的クラスタリング、および凝集ルールとして平均連結法に基づいて、遺伝子を分類した（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｐ．Ｔ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．＆ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ ９５，１４８６３−１４８６８（１９９８）．）（図１ａ）。各細胞集団（亜集団）内における正規化したＡｈＲ発現レベルを計算し、箱髭図を用いて描出した（図１ｂ）。各集団について、プロットは、ＡｈＲ値分布の中央値（中ほどの太線）、中央半分（箱）および四分位数間範囲（ＩＱＲ、「髭」間の距離）を報告する。標準的な分散分析（ａｎｏｖａ）によって、細胞集団間のＡｈＲ発現レベルの差異を試験した。
８．統計分析
三連で実施した実験の平均値±標準偏差として、結果を示す。スチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を確認した。
９．インビボ研究
毎週用量漸増スキーム（１週目：１ｍｇ／ｋｇ；２週目：２ｍｇ／ｋｇ；３週目：４ｍｇ／ｋｇ）を使用して、植物油に懸濁したＦＩＣＺをＣ５７Ｂ６マウスに毎日腹腔内注射した。３つの時点（７日目、１４日目および２１日目）の全てにおいて、末梢血の出血をＨｅｍａｖｅｔで定量することによって、血液細胞数を定量した。３週の時点の後にマウスを屠殺し、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のために肝臓および脾臓を取り出した。
実施例１：ヒト造血細胞分化ゲノムマッピング（ｄＭａｐ）データの分析
造血細胞におけるＡｈＲ受容体の考えられる役割を評価するためのロードマップとして、本発明者らは、「ｄＭａｐ」データセット（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｄｍａｐ）（Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ，Ｎ．ら、Ｄｅｎｓｅｌｙ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌ ｓｔａｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ １４４，２９６−３０９（２０１１））（これは、７１個の区別可能な精製されたヒト造血細胞集団の発現プロファイルに関する公的に利用可能な概要である）を分析した。本発明者らの目的のために、本発明者らはＨＳＣからＭｋ／赤血球への分化経路に注目し、本発明者らは、手動でキュレーションした推定ＡｈＲ標的リストの発現を分析した。階層的クラスタリングを行って、ＡｈＲおよびその標的の共発現パターンを評価した。この分析により、ＨＳＣからＭＥＰ細胞段階において、原始幹細胞ではＡｈｒ ｍＲＮＡ発現がアップレギュレートされていることが明らかになった（図１）。Ａｈｒがアップレギュレートしたかまたはダウンレギュレートしたかのいずれかにより、赤血球系細胞を２つの細胞群にクラスタ化した。Ｍｋでは、Ａｈｒレベルが一貫してアップレギュレートしていた。幹細胞への有意な移入のためのいくつか（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＲ１およびＡＬＤＨＡ１）を含め、約１４個の推定ＡｈＲ標的遺伝子のレベルは、Ａｈｒレベルと協調して調節されていた。他の重要な造血特異的遺伝子、例えばＮＦＥ２（これは、赤血球系統およびＭｋ系統の両方の重要な調節因子である）も、ＡｈＲとの協調的な差次的発現を示した。これらの結果により、造血前駆細胞ではＡｈＲ発現が明白であることが示され、ＡｈＲがヒト両能性ＭＥＰの発生において役割を果たし得ることが示唆された。ヒト造血系全体にわたるＡｈＲ発現を明確に実証するこれらのデータにより、本発明者らは、インビトロ系でＡｈＲ活性化を使用して、造血前駆細胞の産生を大きく増強し、造血前駆細胞の分化を方向付け得るという仮説を立てた。
実施例２：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）の生成
本実施例では、フィーダーフリーの化学的に定義された、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）の生成を実証し、これらの細胞が巨核球および赤血球系統の両方の固有マーカーを発現することを示す。本発明者らは、間質細胞系および異種因子を使用する必要がなく、多数の臨床的に関連する高純度造血細胞を産生する能力をもたらし得る、ヒトｉＰＳＣからの造血前駆細胞の生成のためのフィーダーフリーの化学的に定義された新規な系を開発することに努めた。このプラットフォームの開発に用いたアプローチは、発生中の胚によって提供されるロードマップに従う。ＥＳＣおよびｉＰＳＣは初期胚盤胞胚の多能性未分化細胞に似ているので、インビトロでＥＳＣおよびｉＰＳＣの分化を方向付けるために、初期胚で活性なシグナルを利用した。ヒト胚様体形成の変動性が公知であるので（Ｂｒａｔｔ−Ｌｅａｌ，Ａ．Ｍ．，Ｃａｒｐｅｎｅｄｏ，Ｒ．Ｌ．＆ ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｔ．Ｃ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２５，４３−５１（２００９））、本発明者らのプロトコールは、１０〜１３日以内に両能性造血前駆細胞を産生するように最適化した２Ｄ培養系を利用した（図２Ａ）。このプラットフォームの重要な要素は、７日目に強力なＡｈＲリガンドＦＩＣＺを添加することであった。ＭＥＰ生成の時間枠は、以前に記載されているプロトコール（Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ＥＳ−ｓａｃｓ，ＶＥＧＦ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ １１１，５２９８−５３０６（２００８）；Ｇｅｋａｓ，Ｃ．＆ Ｇｒａｆ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｃｌｏｓｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０７，２７８１−２７８４（２０１０））で言及されたものよりも有意に短く、細胞の分画もさらなる操作も必要としない。この系では、分化中のｉＰＳＣは内皮細胞ベースの接着層を産生し、これから非接着造血細胞が７日目に現れ始める（図２Ａ）。１５日目に免疫表現型検査によって判定したところ、これらの細胞の５０％超がＣＤ２３５−グリコホリンＡ（赤血球系統）およびＣＤ４１（Ｍｋ系統）を共発現しており、これは、両能性ＭＥＰが生成されたことを示唆している（図２Ｂ）。また、未分化ｉＰＳＣとの比較では、これらの細胞はグロビン遺伝子発現をアップレギュレートし、一連の特徴的なＭｋマーカーを発現している（図２Ｄ）。さらに、ＥＰＯを含有する赤血球特異化培地またはＴＰＯを含有するＭｋ特異化培地を使用することにより、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰは、成熟赤血球またはＭｋのいずれかになるための最終的な発生運命選択を受ける（図２Ｃ）。
実施例３：アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アゴニストＦＩＣＺは、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にする
臨床的に関連する十分な量の細胞が生成不可能であることによって、ｉＰＳＣ技術の臨床応用への転換が妨げられている。基礎研究の場合でさえ、ｉＰＳＣの定方向分化によって生成され得る造血細胞の数および品質は限定的な場合がある（Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｈ．，Ｂｏｎｉｇ，Ｈ．＆ Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．２０１１，７９１６０４．Ｅｐｕｂ ７９２０１１ Ｏｃｔ ７９１６２６．（２０１１））。本実施例では、本発明者らは、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺが、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にする能力を有することを実証する。ヨウ化プロピジウム染色およびＨｏｅｃｓｈｔ色素排除によって判定したところ、未処理対照サンプルとの比較では、ＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは有意に少ない細胞死を示し、この集団の指数関数的な増殖を可能にした（図３ＡおよびＢ）。これらのプロットで実証されているように、ＦＩＣＺ処理細胞では両方とも生存率が増加しており、アポトーシスを受ける細胞がより少ない。また、ＦＩＣＺの存在の有無の下で１５日目ＭＥＰを成長させ、各集団の成長速度を計算した。未処理細胞とは対照的に、ＦＩＣＺ処理ＭＥＰは、２週間の成長期間にわたって対数的な増殖を示した（図３Ｃ）。
その後の実験では、３０日目ＭＥＰにおけるＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＤＵ）の取り込みを使用して、ＦＩＣＺ処理ＭＥＰおよび対照未処理ＭＥＰの増殖を比較した。ＥＤＵは、細胞のＤＮＡに取り込まれて（ｉｎｔｅｒｃｏｌａｔｅｓ）増殖の明確な追跡を可能にする標識化学物質である。（図３Ｄ）に示されているように、ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺで処理した３０日目ＭＥＰは、未処理細胞よりもはるかに増殖性である。
実施例４：ＡｈＲアゴニストは、ヒトｉＰＳＣおよびＭＥＰにおけるＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現を誘導する
未分化ｉＰＳＣおよび定方向に分化したＭＥＰの両方においてＡｈＲの発現および機能性を特性決定するために、これらの集団においてウエスタンブロットによって、ＡｈＲタンパク質レベルを決定した。３０日目および６０日目ＭＥＰでは、ＡｈＲ受容体はロバストに発現していた（図４Ａ）。しかしながら、ｉＰＳＣ集団では、ウエスタンブロッティングによってＡｈＲタンパク質は検出されなかったので、本発明者らは、ｉＰＳＣでは、ＡｈＲは極めて低レベルで発現していた（すなわち、ウエスタンブロットに使用した抗体による検出可能レベル未満）と仮定した。この仮説を試験するために、ｉＰＳＣまたはＭＥＰ（陽性対照として）において、ＦＩＣＺがプロトタイプのＡｈＲ標的遺伝子ＣＹＰ１Ｂ１を誘導する能力を定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＦＩＣＺによる処理後、未分化ｉＰＳＣおよび定方向に分化したＭＥＰの両方がＣＹＰ１Ｂ１発現の統計的に有意な増加を示したが、これは、これらの細胞では、ＡｈＲ受容体が実際に発現していることを強く示唆している（図４Ｂ）。特に、これらの細胞集団は、プロトタイプの環境ＡｈＲリガンド２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ（ｐ）ダイオキシン（ＴＣＤＤ）を含む他のＡｈＲアゴニストにも応答性であった（図１３）。
実施例５：ＡｈＲは、両能性造血前駆細胞の増殖および特異化を媒介する
おそらくは内因性ＡｈＲリガンドによって媒介されるＡｈＲ転写活性を定量するために、本発明者らは、核局在ｄｓＲｅｄおよびＺｓＧｒｅｅｎまたはルシフェラーゼおよびＺｓＧｒｅｅｎのいずれかをコードするレンチウイルスレポーターベクターにヒトＡｈＲ応答性プロモーター（６７、６８）をクローニングした（図５Ａ）。これらの二重遺伝子「ＡｈＲレポーター」は、形質導入効率の正規化を可能にし、自己蛍光の影響を無効にし、ＡｈＲ転写活性の定量を可能にする。３０日目ＭＥＰに、感染多重度（ＭＯＩ）１０でレポーターレンチウイルスを形質導入するかまたはモックを感染させ、０．２μＭ ＦＩＣＺを含有する基本培地中で７２時間成長させた。次いで、この細胞集団におけるＡｈＲ活性を評価するために、ＭＥＰを３つの異なる成長条件に供した：１）０．２μＭ ＦＩＣＺからなる定常状態条件；２）ＦＩＣＺ濃度を０．４μＭに増加；または３）０．２μＭ ＦＩＣＺ＋５μＭの公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｏ−ｔｏｌｙｌａｚｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ａｍｉｄｅ（ＣＨ−２２３１９１）ｐｒｅｖｅｎｔｓ ２，３，７，８−ＴＣＤＤ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９，１８７１−１８７８．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｍａｒ １８１５．（２００６））。モック感染ＭＥＰとは対照的に、ＡｈＲレポーター感染集団はｄｓＲｅｄ発現のわずかな増加を示したが、これは、そのＭＥＰでは、レポーターのダイオキシン応答エレメントがトランス活性化されていたことが示唆された（図５Ｂ）。増量したＡｈＲアゴニストＦＩＣＺ（０．４μＭ）にレポーター感染ＭＥＰを供すると、ＤｓＲｅｄ発現の有意な増加が示されたが、これは、初代ｉＰＳＣ由来の定方向に分化したＭＥＰにおいて、ＦＩＣＺがＡｈＲ受容体をトランス活性化することができることを実証している（図５Ｂ、５Ｃ）。また、免疫蛍光顕微鏡によってこの結果を視覚的に確認したところ、０．４μＭ ＦＩＣＺで処理したＭＥＰにおいてのみＺｓＧｒｅｅｎ＋細胞が認められた（図５Ｄ）。重要なことに、５μＭの公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１を含有する成長培地にレポーター感染集団を供すると、ＤｓＲｅｄ発現の有意な減少（モック感染集団における発現レベル未満）が認められたが、これは、ｉＰＳＣ由来の定方向に分化したＭＥＰでは、ＦＩＣＺ媒介性の転写活性はＡｈＲ受容体によって媒介されることを実証している（図５Ｂ）。ルシフェラーゼをコードするレンチウイルス骨格を使用して、これらの結果を定量的に確認した（図５Ｃ）。
ＡｈＲ受容体のＦＩＣＺ媒介性トランス活性化がｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖に関わっていたかを決定するために、公知のＡｈＲ阻害剤ＣＨ２２３１９１を使用して、前記Ｈｏｅｃｓｈｔ／ヨウ化プロピジウムアポトーシスアッセイを実施した。先に図３に示したように、ＦＩＣＺ処理後には、ヨウ化プロピジウムで染色された細胞がより少ない（例えば、１５．５％対８．０９％）（図５Ｅ）。対照的に、５μＭ ＣＨ２２３１９１で細胞を２４時間前処理すると、ＰＩ＋細胞の割合がビヒクルまたはＦＩＣＺ処理培養物とほぼ同じであった。ＣＨ２２３１９１＋ＦＩＣＺ処理細胞の有意な増殖は観察されなかった。興味深いことに、より低用量の阻害剤を使用（２．５μＭ）して細胞を前処理してからＦＩＣＺを添加すると、細胞は依然として増殖することができたが、これは、ｉＰＳＣ由来の定方向に分化したＭＥＰにおけるアゴニスト／アンタゴニスト相互作用およびＡｈＲ受容体の結合が用量依存的であることを示唆している（図５Ｅ）。ｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイしたＣＹＰ１Ｂ１誘導を遮断する能力によって、ＣＨ２２３１９１の有効性を確認した（図５Ｆ）。
実施例６：持続的なＡｈＲの活性化は赤血球細胞の成熟を可能にするが、阻害／アンタゴニスト作用は巨核球の発生を促進する
以前の研究は、ＡｈＲが、おそらくは造血幹細胞の成長および分化を含む造血細胞の発生および機能において重要な役割を果たし得ることを示唆している。ＡｈＲの活性化はＭＥＰ集団の指数関数的な増殖をもたらすことが示されたので（図３）、次いで、本発明者らは、ＡｈＲがＭＥＰのＲＢＣまたは巨核球への分化にも寄与するかを決定する立場にあった。造血発生中のＡｈＲの役割が提案されているが、まだ明確には定義されていないことを考慮して、本発明者らは、両能性造血前駆細胞およびその結果として得られるそれらの子孫におけるＡｈＲの役割を解明するために一連の実験を行った。
本発明者らがｉＰＳＣ由来ＭＥＰの指数関数的な増殖を認めた本発明者らの先の研究（図３）では、本発明者らが認めたＡｈＲ媒介性の効果により、細胞を長期間（１２０日間超）にわたって培養することができた。ＦＩＣＺ存在下のフィーダーフリー条件で維持したＭＥＰの免疫表現型検査により、持続的なＡｈＲアゴニスト作用下における進行性の赤血球特異化および成熟が明らかになった。図６Ａで実証されているように、初期継代（１５日目）ｉＰＳＣ由来ＭＥＰの大部分はＣＤ７１（トランスフェリン受容体）を発現しており、これらの細胞の一部はＣＤ２３５（グリコホリンＡ）も発現していたが、これは、未成熟赤血球表現型を示唆している。ＦＩＣＺへの長期曝露（３０日間）下では、これらの細胞はＣＤ７１発現をダウンレギュレートし始め、細胞の大部分がＣＤ２３５を発現していたが、これは、より成熟した表現型を示唆している（図６Ａ）。ＡｈＲアゴニスト作用を含む基本成長条件下では、これらの細胞は赤血球系統に特異化し続けたので、成熟が続いて、巨核球系細胞がほとんど含まれていないより均一な集団が得られた。この集団は、ほぼ全部がＣＤ２３５＋であった（図６Ｂ）。低酸素条件に対する応答能力（図６Ｃ）およびヘモグロビン産生能力（図６Ｄ）によって評価したところ、これらのｉＰＳＣ由来赤血球集団は機能的な成熟を示した。例えば、ストレス赤血球生成をシミュレートするために低酸素（５％Ｏ２）下で培養すると、細胞は、成熟赤芽球の特徴的な特徴（細胞サイズの減少および細胞核内のクロマチン凝縮を含む）を示し始めた（図６Ｃ）。より顕著なことに、細胞を遠心分離すると鮮やかな赤色のペレットが認められたが、これは、ヘモグロビン産生を示唆している。さらなるＥＰＯを培養物に添加すると、ペレットにおいてさらに多くの赤血球が認められた（図６Ｄ）。
本発明者らの系におけるデフォルト経路は、ＡｈＲアゴニスト作用下においてｉＰＳＣ由来ＭＥＰの赤血球系統への特異化および成熟を可能にするようであるので、本発明者らは、さらなるＡｈＲ調節により、代替のＭｋ系統を発生させることができると仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、この受容体の低分子阻害およびＡｈＲリプレッサータンパク質の強制発現の両方を使用して、ＡｈＲアンタゴニスト作用を可能にする研究を行った。第１の実験セットでは、基本サイトカイン条件で成長させた３０日目ＭＥＰ集団に、公知のＡｈＲアンタゴニストＣＨ２２２３１９１を添加した。実質的にはＣＤ４１陽性巨核球系細胞が認められなかったビヒクル処理対照集団とは対照的に、ＡｈＲ阻害剤で処理したＭＥＰは、少ないが明確なＣＤ４１＋巨核球系細胞集団を産生した（図６Ｅ）。第２の実験セットでは、本発明者らは、ＺｓＧｒｅｅｎレポーターと共にＡｈＲリプレッサーエレメント（ＡｈＲＲ）をコードするレンチウイルスベクターを構築および利用した（図６Ｆ）。本発明者らの研究のいくつかでは、このＡｈＲＲエレメントは、ベースラインまたはＡｈＲアゴニスト誘導性ＡｈＲ転写活性のいずれかを強力かつ特異的に阻害した（Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｅ．，Ａｌｌａｎ，Ｌ．Ｌ．＆ Ｓｈｅｒｒ，Ｄ．Ｈ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＡＨＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ＡＨＲ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７７，４８５−４９７（２００９）；Ｅｖａｎｓ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＨＲ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ＡＨＲ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＨＲ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３，３８７−３９８（２００８））。構成的に活性なＺｓＧｒｅｅｎレポーターのみを形質導入したモック感染ＭＥＰとは対照的に、ＡｈＲＲレンチウイルスを感染させた細胞は、有意な数のＣＤ４１＋巨核球系細胞を産生した（図６Ｇ）。興味深いことに、ＡｈＲＲ形質導入集団は巨核球系細胞を産生することができたが、それらはＣＤ２３５＋細胞をほとんど含有しておらず、これは、ｉＰＳＣ由来ＭＥＰにおけるＡｈＲアンタゴニスト作用が、赤血球から巨核球系統への特異化の転写スイッチを起動したことを示唆している（図６Ｇ）。ｉＰＳＣ由来ＭＥＰにおけるＡｈＲアンタゴニスト作用によって産生された巨核球系細胞をさらに研究するために、非連続ＢＳＡ勾配（０、１．５、３％）を使用して成熟Ｍｋを単離した。注目すべきことに、ＡｈＲＲ過剰発現によってＡｈＲ活性を抑制した後、大きなＣＤ４１＋倍数性Ｍｋが産生された（図６Ｈ）。これらの細胞は、成熟Ｍｋの特徴的な特徴（８Ｎおよび１６Ｎに核内倍加する能力（図６Ｉ）、ならびに細胞表面における巨核球胞体突起突出の存在（図６Ｈ）を含む）を示した。さらに、モック感染対照とは対照的に、初期および後期ＭＥＰ培養物の両方において、ＡｈＲＲを発現する大きなＭｋが観察された（図６Ｊ）。
図７は、ＭＥＰの分化および増殖におけるＡｈＲアゴニスト作用の役割、ならびにＭＥＰからのＲＢＣおよび巨核球の分化におけるＡｈＲアゴニスト作用およびアンタゴニスト作用の役割の機構図を示す。
実施例７：ｉＰＳＣ由来ＲＢＣの特性決定
実施例６の方法にしたがって作製したｉＰＳＣ由来ＲＢＣをさらに特性決定するために、ｉＰＳＣの再プログラミングに関与する遺伝子、およびＲＢＣの分化に関与する遺伝子の発現を分析した。結果は、細胞がＲＢＣに定方向に分化するにつれて、再プログラミング過程に関わっている胚性遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇなどを含む）がダウンレギュレートされることを示している（図８Ａおよびデータは示さず）。
この定方向分化戦略における赤血球特異化の１５日目および３０日目において、これらの細胞は、ＲＢＣへの欠くことのできない移入のための遺伝子の相補的なアップレギュレーションを示す（図８Ｂ）。
マイクロアレイ分析によれば、１５日目および３０日目のｉＰＳＣ由来ＲＢＣは、ヘモグロビン（アルファ１およびガンマ２）、および赤血球系統の調節に関与する他の遺伝子（ｐ４５、ＮＦＥ２；ｃ−Ｍｙｂ；クルッペル様因子１、ＫＬＦ−１；アルファヘモグロビン安定化タンパク質、ＡＨＳＰ；およびＣＤ２３５、グリコホリンＡ）のパネルをアップレギュレートしている。加えて、ＢＣＬ−１１Ａは分化の際にダウンレギュレートされており、これは赤血球の成熟と相応している。
実施例８：ｉＰＳＣ由来ＲＢＣの特性決定
正常な造血発生では、胚性グロビン（イプシロンおよびゼータ）は発生の初期に発現され、出生前にダウンレギュレートされる。アルファグロビンは、出生の前後両方において高レベルで発現される。胎児ヘモグロビン（ガンマ）は出生前に高レベルで発現され、急速にダウンレギュレートされる（５歳までに発現は５％未満）。成人グロビン（ベータ）は胎児ヘモグロビンと相反して発現され、成体細胞で発現されるヘモグロビンの優勢型である。重要なことに、成人における胎児ヘモグロビンを増加させる能力は、鎌状赤血球貧血の総体的症状を改善する。
本発明者らは質量分析を利用し、本開示の方法を使用してｉＰＳＣ由来ＲＢＣによって産生されるグロビンの種類を研究した。図９において、対照患者（図９Ａ）および鎌状赤血球症を患っている患者（図９Ｂ）の末梢全血の分析結果。アルファグロビン、ガンマグロビンおよびベータグロビン（成人グロビン）の明確なピークが明白である。鎌状赤血球患者では、鎌状赤血球（ヘモグロビンＳ）を産生する変異が明確に現れている（図９Ｂ）。３０日目ｉＰＳＣ由来ＲＢＣに関する同様の分析の結果を図１０に示す。主に発現しているタンパク質はグロビンである。明らかに、細胞はアルファをロバストに発現している。興味深いことに、細胞は、外見上は、胚性グロビン（イプシロンおよびゼータ）および胎児（ガンマ；ガンマのアイソフォームは２つあるので、ここでは２つのピークがある）の両方を発現するが、成人グロビン（ベータ）を発現しないという点で分化の胚期／胎児期にある。ｉＰＳＣ由来ＲＢＣはこの方法でこれまでに分析されておらず、これらの質量分析は、これらの細胞がタンパク質レベルで適切な遺伝子を発現する証拠を提供する。
実施例９：ｉＰＳＣ由来ＲＢＣは、ＨｂＦ誘導物質に応答する
成人における胎児ヘモグロビンを増加させる能力は、鎌状赤血球貧血の総体的症状を改善する。ヒドロキシウレア（ＨＵ）は、おそらくはストレス赤血球生成（これは、新たな赤血球がストレス下で急速に生まれる過程である；それらは最近出現したＲＢＣであり、やや多くの胎児ヘモグロビンを発現する）を開始することによってこれを行う唯一のＦＤＡ承認薬である。上述のように、本発明者らのｉＰＳＣ由来ＲＢＣは胎児ヘモグロビンを既に発現するので、これらの細胞がＨＵ応答性であるか（そしてそれ故に、新規なＨｂＦ誘導物質のための患者特異的なスクリーニングプラットフォームとして使用することができるか）否かについての疑問が生じた。図１１に示されているように、ｉＰＳＣ由来ＲＢＣを０．５μＭ ＨＵに曝露することにより、胎児ヘモグロビン（ガンマ）の発現が４倍増加する（図１１のＨＢＧ）。このデータは、これらの細胞が、治療用量のＨＵに対して実際に応答することを例証している。
実施例１０：ＡｈＲアゴニスト作用は、マウス骨髄におけるＭＥＰの産生および増殖を促進する
ＡｈＲアゴニスト作用が、マウス系において（ｉＰＳＣとは対照的に）骨髄前駆体からのＭＥＰの産生および増殖をもたらすかを決定するために、ビヒクルまたは０．２μＭ ＦＩＣＺの存在下または非存在下で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の赤血球除去骨髄を３日間培養した。注目すべきことに、ビヒクル処理対照とは対照的に、ＦＩＣＺ処理のわずか３日後の培養物では、区別可能な初代ＣＤ４１＋／Ｔｅｒ１１９＋ＭＥＰ集団が認められた（図１２）。
実施例１１：ｉＰＳＣ由来Ｍｋは、重要な巨核球特異的遺伝子をアップレギュレートする
本開示の方法にしたがって作製したｉＰＳＣ由来Ｍｋをさらに特性決定するために、非連続ＢＳＡ勾配を使用して精製した後に定量ＰＣＲ分析を実施した。ＡｈＲアンタゴニスト作用（ＡｈＲ ａｎａｔａｇｏｎｉｓｍ）を使用して作ったｉＰＳＣ−Ｍｋは、一連の特徴的で特有のＭｋマーカーを発現する。（図１４）。定量ＰＣＲ分析によれば、これらの細胞は、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＧＰＩＩｂおよびＧＰＶなどの特徴的で特有のＭｋマーカーを発現する。
実施例１２：ｉＰＳＣ由来Ｍｋは、機能的な血小板を産生する
フローサイトメトリーを使用して、全血由来血小板およびｉＰＳＣ由来血小板を比較した。その結果から、ｉＰＳＣ由来血小板は、全血由来のものと非常に類似していることが明らかである。ＦＳＣ対ＳＳＣプロファイルは極めて類似しており、ｉＰＳＣ由来血小板は、特徴的な血小板マーカーＧＰＩＸ、ＧＰＩｂおよびＰ−セレクチンを発現する（図１５）。
実施例１３：ＡｈＲアゴニストＦＩＣＺはインビボで活性であり、正常マウスにおける血小板数の増加をもたらす
ＦＩＣＺ処理または動物そのものがＲＢＣまたは血小板の産生に影響を与えるかを決定するために、毎週用量漸増スキーム（１週目：１ｍｇ／ｋｇ；２週目：２ｍｇ／ｋｇ；３週目：４ｍｇ／ｋｇ）を使用して、植物油に懸濁したＦＩＣＺをＣ５７Ｂ６マウスに毎日腹腔内注射した。３つの時点（７日目、１４日目および２１日目）すべてにおいて、末梢血の出血をＨｅｍａｖｅｔによる定量によってアッセイしたところ、モック注射マウス、またはビヒクルのみを注射したマウスとは対照的に、ＦＩＣＺを注射したマウスは血小板数の増加を示した（図１６Ａ）。興味深いことに、より高用量のＦＩＣＺ（４ｍｇ／ｋｇ）に直ぐに曝露し、１週目の漸増を受けなかったマウスは、より迅速で多くの血小板応答を示した。本研究では、白血球（ＷＢＣ）数または赤血球（ＲＢＣ）数のいずれかについて有意な変動を示したマウスはいなかった（示さす）。３週の時点の後にマウスを屠殺し、肝臓および脾臓を取り出した。ＣＹＰ１Ｂ１標的遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＦＩＣＺ処理動物の肝臓および脾臓におけるロバストなアップレギュレーションが明らかになったが、これは、本発明者らが、インビボにおいて生物学的に有意義なＦＩＣＺ用量を見出したことを裏付けている（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。
実施例１４：ｉＰＳＣ細胞におけるＡｈＲ阻害
分子アプローチを使用して、ＡｈＲ発現を選択的にダウンレギュレートすることを可能にするｉＰＳＣ細胞系を生成した。図１７は使用した構築物を示しており、これは、ドキシサイクリン誘導剤で細胞を処理すると発現されるＡｈＲに対するショートヘアピンＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含有する。発現を追跡するために、赤色蛍光レポーターも作動させる。図１７の上のパネルは、ＲＮＡｉが、未分化細胞においておよび分化５日目に作動し得ることを示す。
本開示の技術を使用して作製した最終期のＭｋにおいて、ＡｈＲに対するＲＮＡｉを活性化した。その結果、スクランブルＲＮＡｉ配列（ＳＣＲ）を発現する対照細胞と比較して、巨核球胞体突起の産生が増加している。蛍光レポーターの画像を図１８（上）に示し、巨核球胞体突起形成の劇的な増加をグラフで示す（図１８（下））。
この結果は、ＭｋにおけるＡｈＲの阻害が、Ｍｋからの血小板成熟を増加させることを実証している。したがって、ＡｈＲアンタゴニスト作用はＭＥＰがＭｋに分化するのを駆動し、次いでＭｋの血小板への分化を促進するようにも作用する。
考察：
本発明者らの結果は、ＡｈＲが基準の造血発生において生理学的および機能的な役割を有すること、ならびに両能性造血前駆細胞におけるこの受容体を調節することにより細胞の発生運命を方向付け得ることを示している。本発明者らは、血清およびフィーダーフリーの定義された培養条件において、多能性幹細胞をＭＥＰ（これは、最終的にはＭｋおよび／または赤血球系細胞に特異化することができる）への定方向分化のための新規な方法論を実証している。
これらの研究の出発点として、本発明者らは、造血細胞におけるＡｈＲの考えられる役割を評価するためのロードマップとして、ヒト造血細胞分化ゲノム（ｄＭａｐ）アレイデータを利用した。これらの分析は、ＡｈＲが血液細胞の発生において重要な役割を果たすことを示唆した強力なツールであり、以前の研究および本明細書で提示した相当な量のデータと一致していた。
いくつかのチームが、ＥＳＣおよびｉＰＳＣからの造血細胞の誘導に関する原理証明例を公開しているが、これらのプロトコールは技術的に要求の厳しいものであり、その結果生成される細胞の数が限られている。本発明者らの概念的アプローチは、ロバストなｉＰＳＣベースのプラットフォームを作り出すのに必要な細胞型の範囲および数を引き出すために、天然の発生シーケンスをインビトロで模倣することであった。このプロトコールは比較的簡易な２Ｄ培養アプローチを利用し、ヒト多能性幹細胞を使用する場合に問題となることが多い工程である胚様体形成の必要性を排除する。さらに、このプロトコールは短くて（約１０日間）、完全に化学的に定義されたものであり、生体異物のフィーダー細胞および成長因子を必要としないので、ＧＭＰ生成および臨床転換が実現可能になる。
重要なことに、本発明者らはまた、本発明者らの定方向分化スキームにおいて非毒性のアリール炭化水素受容体アゴニストを使用することにより、ＭＥＰおよび得られる細胞の数が劇的に増加することを見出した。従来は、進化的に保存されたＡｈＲは、環境化学物質誘導性の毒性におけるその役割について研究されてきたという点で、これは極めて重要な発見であり、本発明者らの系では、それは、少なくとも２つの重要な血液細胞型の成長および分化に複雑に関与することが示されている。強力なＡｈＲリガンドＦＩＣＺを本発明者らの培養物に添加した後、本発明者らは、ＭＥＰが数週間で数千〜１０億個の細胞に指数関数的に増殖するのを観察した。重要なことに、高度に特異的なＡｈＲ阻害剤を使用して、ＭＥＰ集団におけるＡｈＲの役割を確認した。細胞のこの対数増殖は細胞死の減少の関数であるようであり、ＡｈＲがアポトーシスを制御し得ることを示唆する以前の研究と一致している。
興味深いことに、本研究を通じて利用したＡｈＲリガンドＦＩＣＺは、Ｒａｎｎｕｇらが最初に記載したトリプトファンの光代謝物である（Ｒａｎｎｕｇ，Ｕ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ，ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２，８４１−８４５．（１９９５））。このリガンドのインビボ活性を実証する本発明者らのデータと合わせて、ＦＩＣＺの普遍性を実証する以前の研究（Ｗｉｎｃｅｎｔ，Ｅ．ら、Ｔｈｅ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ６−ｆｏｒｍｙｌｉｎｄｏｌｏ［３，２−ｂ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４，２６９０−２６９６（２００９））に基づけば、ＦＩＣＺがインビボ造血の調節において役割を果たすことは想定不可能ではなく、おそらくは他の内在性ＡｈＲリガンドも役割を果たしている。ＡｈＲリガンドによるＭＥＰを増殖させる能力はまた、血液細胞の発生が様々な環境リガンドによって影響され得ることを示唆している。
ＭＥＰの指数関数的な増殖を可能にすることに加えて、本発明者らの結果は、ＡｈＲ調節が、赤血球およびＭｋ系統の両方のさらなる特異化にも関与し、ＡｈＲアゴニスト作用は赤芽球の発生に対して許容的であり、ＡｈＲのアンタゴニスト作用またはダウンレギュレーションはＭｋの発生をもたらすことを示している。エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）はＲＢＣおよび血小板の発生の主要駆動因子であるが、本明細書に示されているデータは、これらの系統の発生および特異化におけるＡｈＲの役割がサイトカイン非依存的であることを指摘している。
本発明者らの研究過程において、本発明者らは、Ｍｋおよび赤血球系統の両方のマーカーを発現することが公知の推定前駆細胞を誘導した。本発明者らの実験の特に印象的な成果は、ＡｈＲアゴニスト作用下で指数関数的に増殖する推定ＭＥＰを迅速かつ高効率に誘導するための簡易プロトコールの開発である。造血発生に関する基本的な生物学的疑問に答えることができるのに加えて、本研究の有用な成果は、このインビトロプラットフォームを臨床的に関連する血液製剤の生成に利用することである。輸血は不可欠な細胞療法であり、血液供給の安全性および適性は国内外の関心事である。十分な数の細胞を生成することができるｉＰＳＣベースの系、例えば本明細書に記載されるものは、免疫原性、混入または供給に関係する問題を伴わずに、赤血球および血小板の輸血を可能にし得る。さらに、単一の供給源から両方の細胞集団を産生する能力、ならびに血小板および成熟ＲＢＣは両方とも核遺伝材料を含有しないという事実は、ｉＰＳＣ由来細胞の使用による安全性の懸念を低減し、臨床転換の道を開く。
結論として、本発明者らは、ｉＰＳＣ由来造血細胞を生成するための化学的に定義されたフィーダーフリーの新規な方法論の開発を提示する。この方法論は、既存の方法論と比較して指数関数的により多くのＲＢＣおよび血小板の生成を可能にするものであり、造血前駆細胞中の特殊なリガンドを使用する基準の造血発生におけるＡｈＲ受容体の役割に関するその優れた明確化に第１に依拠する。
理論に縛られるものではないが、部分的には本明細書で報告したデータに基づいて、本発明者らは、血小板および赤血球系統の分化（ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｔｉｏｎ）におけるＡｈＲアゴニスト作用およびＡｈＲアンタゴニスト作用の区別可能な役割を定義した。概略図を図１９に示す。図の右側は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から血小板または赤血球（ＲＢＣ）への分化経路を示す。図中、「ＡＨＲ−」はＡｈＲのアンタゴニスト作用を示し、「ＡＨＲ＋」はＡｈＲのアゴニスト作用を示す。成人（血液組織特異的）造血幹細胞（ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＨＳＣ）では、ＡｈＲアンタゴニスト作用は、再増殖可能な細胞の数の増加をもたらす。この集団のＡｈＲアゴニストへの曝露は、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）および巨核球−赤血球前駆細胞（Ｍｅｇ−赤血球前駆細胞またはＭＥＰ）の分化／特異化およびそれらの数の指数関数的な増加をもたらす。ＭＫの最終特異化の２つの時点（ＭＥＰからＭＫ、およびさらには成熟ＭＫから血小板）において、持続的なＡｈＲアゴニスト作用はＲＢＣ産生をもたらすが、反対にＡｈＲアンタゴニスト作用は血小板産生を促進する。
図の右側部分に示されている細胞型のすべてを作製する代替の方法は、ＰＳＣ（多能性幹細胞；例えば、ｉＰＳＣ）の使用を含む。ｉＰＳＣから造血系統への特異化は、中胚葉および造血／内皮前駆体（血管芽細胞として公知である）の形成によって媒介される。血管芽細胞におけるＡｈＲアンタゴニスト作用は、それらの細胞を多分化能状態に維持するように作用する可能性がある。
図１９では、ｉＰＳＣから血小板（ｐｌａｔｅｔｌｅｔ）またはＲＢＣへの分化過程が２０日間として示されている。このような細胞が例示的な方法で生成されるであろうおおよその日数によって、各段階を名付けている。例えば、ｉＰＳＣは０日目（Ｄ０）、ＨＳＣは５日目（Ｄ５）およびＭＥＰＴは１０日目（Ｄ１０）である。２０日の総時間、および各細胞型の出現について示されている個々の時期は単なる例示である。タイムラインを変更するために、本明細書に開示される方法のいくつかの因子を変化させ得る。
本発明を、その特定の実施形態を参照して記載したが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更を行うことができ、均等物を置換することができることを理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、材料の組成、過程、方法の工程（複数可）を、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの改変を行うことができる。このような改変はすべて、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内であるとする。

Claims (141)

  1. 巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）を作製する方法であって、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節物質の存在下の培養物において、ＭＥＰ前駆細胞をＭＥＰに分化させることを含む、方法。
  2. ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養すること、および、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＭＥＰ前駆細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記培養物が血清を含まない、請求項１に記載の方法。
  7. 前記培養物がフィーダー細胞を含まない、請求項１に記載の方法。
  8. ＭＥＰを作製する方法であって、ＢＭＰ−４、ｖＶＥＧＦ、ＷＮＴ３ａ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＴＰＯおよびＥＰＯの存在下の培養物において、多能性幹細胞をＭＥＰに分化させることを含む、方法。
  9. ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  11. ＡＨＲアンタゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養すること、および、次いで、ＡＨＲアゴニストの存在下でＭＥＰ前駆細胞を培養することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  12. ａ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａおよびノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、前記多能性幹細胞を培養すること；
    ｂ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＫＯＳＲを補充したＲＰＭＩ培地中で、工程ａ）から得られた該細胞を培養すること；
    ｃ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｂ）から得られた該細胞を培養すること；
    ｄ）ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地中で、工程ｃ）から得られた該細胞を培養すること；
    ｅ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦおよびＦｌｔ３リガンドを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｄ）から得られた該細胞を培養すること；ならびに
    ｆ）Ｂ２７、Ｎ２−サプリメント、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｈＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、およびｈＴＰＯ、ＩＬ−６およびＥＰＯｇｅｎを補充したＩＭＤＭおよびＨａｍｓＦ１２の混合物中で、工程ｅ）から得られた該細胞を培養すること
    を含む、請求項８に記載の方法。
  13. 培養工程ａ）〜ｅ）の少なくとも１つにおける前記培地がＡｈＲアンタゴニストをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 工程ｆ）における前記培養培地がＡｈＲアゴニストをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記多能性幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および核移植によって生成された細胞から選択される、請求項８に記載の方法。
  16. 前記ｉＰＣＳ細胞がＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびｃＭＹＣを発現する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＭＥＰがＣＤ４１およびＣＤ２３５を共発現する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ＭＥＰがＣＤ３４を発現しない、請求項１に記載の方法。
  19. 前記培養物が１０日以内にＭＥＰ細胞を作り始める、請求項１に記載の方法。
  20. 前記培養物が７日以内にＭＥＰ細胞を作り始める、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記培養物が新たなＭＥＰ細胞を少なくとも３０日間産生し続ける、請求項１に記載の方法。
  22. 前記培養物において産生されるＭＥＰの数が、２４時間の培養期間にわたって指数関数的に増加する、請求項１に記載の方法。
  23. 前記培養物が、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記培養物が、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む、請求項１に記載の方法。
  25. 前記培養物中の細胞の少なくとも１０％がＭＥＰである、請求項１に記載の方法。
  26. 前記培養物中の細胞の少なくとも５０％がＭＥＰである、請求項１に記載の方法。
  27. 前記培養物が少なくとも１０００万個のＭＥＰを産生する、請求項１に記載の方法。
  28. 前記培養物が少なくとも１億個のＭＥＰを産生する、請求項１に記載の方法。
  29. 請求項１に記載の方法によって作製された、ＭＥＰ。
  30. 請求項１に記載の方法によって作製されたＭＥＰを含む、細胞培養物。
  31. 赤血球（ＲＢＣ）を作製する方法であって、
    請求項１に記載の方法にしたがってＭＥＰを作製すること、および
    ＲＢＣを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること
    を含む、方法。
  32. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、赤血球特異化培地中で培養することを含む、請求項３１に記載の方法。
  34. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 赤血球（ＲＢＣ）を作製する方法であって、
    請求項２９に記載の方法にしたがってＭＥＰを提供すること、および
    ＲＢＣを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること
    を含む、方法。
  36. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、赤血球特異化培地中で培養することを含む、請求項３５に記載の方法。
  38. ＲＢＣを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で培養することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 赤血球（ＲＢＣ）を作製する方法であって、ＡｈＲアゴニストの存在下でＭＥＰを培養することを含む、方法。
  40. 赤血球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記培養物が、１ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＲＢＣを含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記培養物が、１ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＲＢＣを含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記培養物中の細胞の少なくとも１０％がＲＢＣである、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記培養物中の細胞の少なくとも５０％がＲＢＣである、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記培養物が少なくとも１０００万個のＲＢＣを産生する、請求項３９に記載の方法。
  46. 前記培養物が少なくとも１億個のＲＢＣを産生する、請求項３９に記載の方法。
  47. 請求項３９に記載の方法によって作製された、ＲＢＣ。
  48. 請求項４７に記載のＲＢＣを含む、輸血組成物。
  49. 請求項３９に記載の方法によって作製されたＲＢＣを含む、培養物。
  50. 巨核球（Ｍｋ）を作製する方法であって、
    請求項１に記載の方法にしたがってＭＥＰを作製すること、および
    Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること
    を含む、方法。
  51. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項５１に記載の方法。
  53. ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項５０に記載の方法。
  54. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、巨核球特異化培地中で培養することを含む、請求項５０に記載の方法。
  55. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項５５に記載の方法。
  57. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  58. Ｍｋを作製する方法であって、
    請求項２９に記載のＭＥＰを提供すること、および
    Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること
    を含む、方法。
  59. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項５９に記載の方法。
  61. ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項５８に記載の方法。
  62. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、巨核球特異化培地中で培養することを含む、請求項５８に記載の方法。
  63. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項６３に記載の方法。
  65. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
  66. Ｍｋを作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養することを含む、方法。
  67. 巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項６６に記載の方法。
  69. 巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
  70. ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項６６に記載の方法。
  71. 巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 請求項６６に記載の方法によって作製された、Ｍｋ。
  73. 請求項６６に記載の方法によって作製されたＭｋを含む、培養物。
  74. 血小板を作製する方法であって、
    請求項１に記載の方法にしたがってＭＥＰを作製すること；
    Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること；および
    該Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養すること
    を含む、方法。
  75. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項７５に記載の方法。
  77. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項７４に記載の方法。
  78. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、巨核球特異化培地中で培養することを含む、請求項７４に記載の方法。
  79. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項７９に記載の方法。
  81. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項７８に記載の方法。
  82. 前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件が、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項７４に記載の方法。
  83. 血小板を作製する方法であって、
    請求項２９に記載のＭＥＰを提供すること；
    Ｍｋを作製するのに十分な条件下で該ＭＥＰを培養すること；および
    該Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養すること
    を含む、方法。
  84. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で前記ＭＥＰを培養することを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項８４に記載の方法。
  86. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項８３に記載の方法。
  87. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、巨核球特異化培地中で培養することを含む、請求項８３に記載の方法。
  88. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲ調節物質の存在下で培養することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項８８に記載の方法。
  90. Ｍｋを作製するのに十分な前記条件が、ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項８７に記載の方法。
  91. 前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件が、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項８３に記載の方法。
  92. 血小板を作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭＥＰを培養してＭｋを作製すること、および血小板を分化させるのに十分な条件下で該Ｍｋを培養することを含む、方法。
  93. 巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件が、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項９２に記載の方法。
  96. ＡｈＲアゴニストの存在下で前記ＭＥＰを培養すること、および、次いで、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項９２に記載の方法。
  97. 巨核球特異化培地中で前記ＭＥＰを培養することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記Ｍｋから血小板を分化させるのに十分な前記条件が、ＡｈＲアンタゴニストの存在下で培養することを含む、請求項９６に記載の方法。
  99. 請求項９２に記載の方法によって作製された、血小板。
  100. 請求項９９に記載の血小板を含む、輸血組成物。
  101. １ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む、組成物。
  102. １ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む、請求項１０１に記載の組成物。
  103. 細胞を含む組成物であって、該細胞の少なくとも１０％がＭＥＰである、組成物。
  104. 前記細胞の少なくとも５０％がＭＥＰである、請求項１０３に記載の組成物。
  105. １ｍｌ当たり少なくとも１００万個のＭＥＰを含む、請求項１０４に記載の組成物。
  106. １ｍｌ当たり少なくとも１０００万個のＭＥＰを含む、請求項１０５に記載の組成物。
  107. ＲＢＣをさらに含む、請求項１０１に記載の組成物。
  108. 巨核球をさらに含む、請求項１０１に記載の組成物。
  109. 血小板をさらに含む、請求項１０１に記載の組成物。
  110. 細胞培養物である、請求項１０１に記載の組成物。
  111. ＲＢＣの提供を必要とする患者にＲＢＣを提供する方法であって、請求項４７に記載のＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む、方法。
  112. 貧血の処置を必要とする患者における貧血を処置する方法であって、請求項４７に記載のＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む、方法。
  113. 前記貧血が、ＲＢＣ産生の障害、ＲＢＣ破壊の増加、失血および体液過剰の少なくとも１つによって引き起こされる、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記貧血がサラセミアによって引き起こされる、請求項１１２に記載の方法。
  115. 前記貧血が鎌状赤血球貧血である、請求項１１２に記載の方法。
  116. 前記ＲＢＣが、前記患者に適合した血液型である、請求項１１１に記載の方法。
  117. 前記ＲＢＣが、前記患者から単離されたＲＢＣ前駆細胞から分化したものである、請求項１１１に記載の方法。
  118. 血小板の提供を必要とする患者に血小板を提供する方法であって、請求項９９に記載の血小板を含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む、方法。
  119. 血小板減少症の処置を必要とする患者における血小板減少症を処置する方法であって、請求項９９の記載に従って作製された血小板を含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含む、方法。
  120. 前記血小板減少症が、血小板産生の減少、血小板破壊の増加、および薬の少なくとも１つによって引き起こされる、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記血小板が、前記患者に適合した血液型である、請求項１１８に記載の方法。
  122. 前記血小板が、前記患者から単離された血小板前駆細胞から分化したものである、請求項１１８に記載の方法。
  123. ＲＢＣに対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項３９に記載の方法によってＲＢＣを作製すること；
    ｂ）該ＲＢＣを該化合物と接触させること；および
    ｃ）該ＲＢＣの変化を観察すること
    を含む、方法。
  124. ＲＢＣに対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項４７に記載のＲＢＣを提供すること；
    ｂ）該ＲＢＣを該化合物と接触させること；および
    ｃ）該ＲＢＣの変化を観察すること
    を含む、方法。
  125. Ｍｋに対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項６６に記載の方法によってＭｋを作製すること；
    ｂ）該Ｍｋを該化合物と接触させること；および
    ｃ）該Ｍｋの変化を観察すること
    を含む、方法。
  126. Ｍｋに対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項７２に記載のＭｋを提供すること；
    ｂ）該Ｍｋを該化合物と接触させること；および
    ｃ）該Ｍｋの変化を観察すること
    を含む、方法。
  127. 血小板に対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項９２に記載の方法によって血小板を作製すること；
    ｂ）該血小板を該化合物と接触させること；および
    ｃ）該血小板の変化を観察すること
    を含む、方法。
  128. 血小板に対する効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）請求項９９に記載の血小板を提供すること；
    ｂ）該血小板を該化合物と接触させること；および
    ｃ）該血小板の変化を観察すること
    を含む、方法。
  129. ＲＢＣの提供を必要とする患者にＲＢＣを提供する方法であって、ＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含み、該ＲＢＣの少なくとも一部が、請求項１０７に記載の組成物から得られたものである、方法。
  130. 貧血の処置を必要とする患者における貧血を処置する方法であって、ＲＢＣを含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含み、該ＲＢＣの少なくとも一部が、請求項１０７に記載の組成物から得られたものである、方法。
  131. 血小板の提供を必要とする患者に血小板を提供する方法であって、血小板を含む組成物を該患者の循環系に輸血することを含み、該血小板の少なくとも一部が、請求項１０９に記載の組成物から得られたものである、方法。
  132. 哺乳類のＲＢＣ数を増加させる方法であって、有効量のＡｈＲ調節物質を該哺乳類に投与することを含む、方法。
  133. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアゴニストである、請求項１３２に記載の方法。
  134. 哺乳類の血小板数を増加させる方法であって、有効量のＡｈＲ調節物質を該哺乳類に投与することを含む、方法。
  135. 哺乳類における血小板減少症を処置する方法であって、有効量のＡｈＲ調節物質を該哺乳類に投与することを含む、方法。
  136. ＡｈＲアゴニストを前記哺乳類に投与する、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
  137. ＡｈＲアンタゴニストを前記哺乳類に投与する、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
  138. ＡｈＲアゴニストおよびＡｈＲアンタゴニストの両方を前記哺乳類に投与することを含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
  139. 血小板を作製する方法であって、ＡｈＲ調節物質の存在下でＭｋを培養することを含む、方法。
  140. 前記ＡｈＲ調節物質がＡｈＲアンタゴニストである、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記ＡｈＲアンタゴニストが、前記培養物中の巨核球胞体突起の産生速度を増加させる効果を有する、請求項１４０に記載の方法。

JP2015527637A 2012-08-15 2013-08-15 幹細胞からの赤血球および血小板の生成 Active JP6506689B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261683246P 2012-08-15 2012-08-15
US61/683,246 2012-08-15
US13/828,357 2013-03-14
US13/828,357 US9074186B2 (en) 2012-08-15 2013-03-14 Production of red blood cells and platelets from stem cells
PCT/US2013/055160 WO2014028749A2 (en) 2012-08-15 2013-08-15 Production of red blood cells and platelets from stem cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015528284A true JP2015528284A (ja) 2015-09-28
JP2015528284A5 JP2015528284A5 (ja) 2016-09-29
JP6506689B2 JP6506689B2 (ja) 2019-04-24

Family

ID=50100189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015527637A Active JP6506689B2 (ja) 2012-08-15 2013-08-15 幹細胞からの赤血球および血小板の生成

Country Status (9)

Country Link
US (6) US9074186B2 (ja)
EP (2) EP2909313B1 (ja)
JP (1) JP6506689B2 (ja)
CN (1) CN104919041B (ja)
AU (1) AU2013302512B2 (ja)
BR (1) BR112015003250B1 (ja)
CA (1) CA2882030C (ja)
IN (1) IN2015DN01402A (ja)
WO (1) WO2014028749A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015216853A (ja) * 2014-05-14 2015-12-07 国立大学法人京都大学 巨核球前駆細胞の製造方法
JP2018535666A (ja) * 2015-10-15 2018-12-06 セルラリティ インコーポレイテッド ナチュラルキラー細胞およびｉｌｃ３細胞ならびにそれらの使用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201210857D0 (en) 2012-06-19 2012-08-01 Cambridge Entpr Ltd Transcription factor mediated programming towards megakaryocytes
US9074186B2 (en) 2012-08-15 2015-07-07 Boston Medical Center Corporation Production of red blood cells and platelets from stem cells
EP2934555B1 (en) 2012-12-21 2021-09-22 Astellas Institute for Regenerative Medicine Methods for production of platelets from pluripotent stem cells
WO2014138485A1 (en) * 2013-03-08 2014-09-12 Irm Llc Ex vivo production of platelets from hematopoietic stem cells and the product thereof
SG11201710342TA (en) * 2015-06-16 2018-01-30 Univ Kyoto Method for producing highly functional platelets
FR3039166B1 (fr) * 2015-07-23 2018-10-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Progeniteurs de megacaryocytes cd34+cd41dim et leurs utilisations pour produire des plaquettes et/ou des mk portant des proplaquettes
US11713447B2 (en) 2016-08-04 2023-08-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Production of megakaryoctye compositions and therapies for treatment of thrombocytopenia
US20200179341A1 (en) * 2016-11-04 2020-06-11 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions for treating multiple myeloma and increasing antibody dependent cell cytotoxicity by targeting the aryl hydrocarbon receptor
US20230226218A1 (en) 2020-05-11 2023-07-20 Erytech Pharma Red Cell Extracellular Vesicles (RCEVs) Containing Cargoes and Methods of Use and Production Thereof
CN113046310B (zh) * 2020-12-30 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
CA3240230A1 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Trailhead Biosystems Inc. Methods and compositions for generating human erythroid progenitor cells
WO2024018018A1 (fr) * 2022-07-21 2024-01-25 Etablissement Francais Du Sang Utilisation d'un composé vitisine pour la production de cellules hématopoïétiques
WO2024108461A1 (zh) * 2022-11-24 2024-05-30 苏州血霁生物科技有限公司 一种分化血小板的方法、培养基及其应用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
USRE28819E (en) 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4328245A (en) 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5221623A (en) 1986-07-22 1993-06-22 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Use of bacterial luciferase structural genes for cloning and monitoring gene expression in microorganisms and for tagging and identification of genetically engineered organisms
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5070012A (en) 1988-03-30 1991-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monitoring of cells and trans-activating transcription elements
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5283179A (en) 1990-09-10 1994-02-01 Promega Corporation Luciferase assay method
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
JPH09504111A (ja) 1993-12-30 1997-04-22 ザ ソールク インスチチュート フォア バイオロジカル スタディズ Ｇａｌ４−受容体構築体の新規な使用
JP3466765B2 (ja) 1994-07-27 2003-11-17 キッコーマン株式会社 ビオチン化ホタルルシフェラーゼ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼの製造法及び生物発光分析法
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
CA2266629C (en) 1996-10-01 2002-04-16 Cima Labs Inc. Taste-masked microcapsule compositions and methods of manufacture
US5955604A (en) 1996-10-15 1999-09-21 The Regents Of The University Of California Substrates for β-lactamase and uses thereof
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
KR100719273B1 (ko) 1997-10-28 2007-05-18 반도 카가쿠 가부시키가이샤 피부 패치 시트 및 그것을 위한 베이스 시트의 제조 방법
US7101681B1 (en) 1997-11-21 2006-09-05 Amgen, Inc. Nuclear hormone receptor drug screens
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
JP2002528721A (ja) 1998-10-23 2002-09-03 グラクソ グループ リミテッド 核内受容体のリガンド用のアッセイ
WO2000057891A1 (en) 1999-03-30 2000-10-05 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
US6509380B1 (en) 2001-12-14 2003-01-21 Marshall University Research Corporation Method of treating iron overload with acetaminophen
BRPI0516969A (pt) 2004-10-25 2008-09-30 Cellerant Therapeutics Inc método de preparar uma composição terapêutica, composição terapêutica, e, método de tratar um paciente humano sofrendo de hematopoiese deficiente
WO2010039997A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Hematopoietic protection against chemotherapeutic compounds using selective cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitors
PE20100362A1 (es) 2008-10-30 2010-05-27 Irm Llc Derivados de purina que expanden las celulas madre hematopoyeticas
WO2010108005A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 University Of Georgia Research Foundation Novel neural progenitors from pluripotent stem cells, methods of producing same and use to produce neural cells
WO2011115308A1 (en) * 2010-03-18 2011-09-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into mesodermal cells
EP2598138B1 (en) 2010-07-27 2020-05-06 Trustees of Boston University Aryl hydrocarbon receptor (ahr) modifiers as novel cancer therapeutics
EP2633047A4 (en) 2010-10-25 2014-04-02 Philadelphia Children Hospital COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING BLOOD PLATES AND USE METHOD THEREFOR
US9074186B2 (en) 2012-08-15 2015-07-07 Boston Medical Center Corporation Production of red blood cells and platelets from stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. CLIN. INVEST., 2005, 115(12):3332-8, JPN6017024522 *
SCIENCE, 2010, 329(5997):1345-1348, JPN6017024520 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015216853A (ja) * 2014-05-14 2015-12-07 国立大学法人京都大学 巨核球前駆細胞の製造方法
JP2018535666A (ja) * 2015-10-15 2018-12-06 セルラリティ インコーポレイテッド ナチュラルキラー細胞およびｉｌｃ３細胞ならびにそれらの使用
JP2022023148A (ja) * 2015-10-15 2022-02-07 セルラリティ インコーポレイテッド ナチュラルキラー細胞およびｉｌｃ３細胞ならびにそれらの使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2909313A2 (en) 2015-08-26
US11124769B2 (en) 2021-09-21
US20180291344A1 (en) 2018-10-11
CN104919041A (zh) 2015-09-16
CN104919041B (zh) 2018-12-21
JP6506689B2 (ja) 2019-04-24
BR112015003250B1 (pt) 2021-08-31
AU2013302512B2 (en) 2019-05-23
EP3789483A1 (en) 2021-03-10
IN2015DN01402A (ja) 2015-07-03
US10544393B2 (en) 2020-01-28
US20150203819A1 (en) 2015-07-23
CA2882030C (en) 2022-03-22
AU2013302512A1 (en) 2015-03-05
CA2882030A1 (en) 2014-02-20
BR112015003250A2 (pt) 2018-02-14
US9896660B2 (en) 2018-02-20
WO2014028749A2 (en) 2014-02-20
US9074186B2 (en) 2015-07-07
US20140050711A1 (en) 2014-02-20
WO2014028749A3 (en) 2015-07-16
US9919009B2 (en) 2018-03-20
US20150335682A1 (en) 2015-11-26
EP2909313B1 (en) 2021-02-17
US20150335680A1 (en) 2015-11-26
EP2909313A4 (en) 2016-06-15
US20220177845A1 (en) 2022-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220177845A1 (en) Production of red blood cells and platelets from stem cells
Ou et al. SIRT1 deficiency compromises mouse embryonic stem cell hematopoietic differentiation, and embryonic and adult hematopoiesis in the mouse
Liang et al. Induction of Sertoli-like cells from human fibroblasts by NR5A1 and GATA4
Sachamitr et al. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into dendritic cells displaying tolerogenic properties and resembling the CD141+ subset
JP2022078215A (ja) 多能性幹細胞からｈｌａホモ接合免疫細胞への指向分化方法
JP2017512472A (ja) １型および２型糖尿病ならびに関連障害を治療するための組成物および方法
US20240018471A1 (en) Engineered red blood cells having rare antigen phenotypes
JP5751548B2 (ja) イヌｉＰＳ細胞及びその製造方法
EP3442544B1 (en) Enhanced gene delivery methods
US8404442B2 (en) Methods for identification of bone anabolic agents
WO2014168255A1 (ja) 巨核球の成熟化促進物質
US20230340419A1 (en) Methods for generation of mouse and human ureteric bud organoids and collecting duct organoids
Sutherland et al. LIF-dependent survival of embryonic stem cells is regulated by a novel palmitoylated Gab1 signalling protein
WO2021200901A1 (ja) Ｔ前駆細胞の製造方法
US20220275344A1 (en) Medium composition for enhancing wnt protein activity
Liang et al. Induction of Sertoli cells from human fibroblasts by NR5A1 and GATA4
Ng Phenotypic and Transcriptional Consequences of Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome (SBDS) Deficiency during Hematopoietic Development

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160812

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160812

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20170622

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170630

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170926

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20171129

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180514

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180813

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181012

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20181114

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190301

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190329

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6506689

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250