JP2018535666A - ナチュラルキラー細胞およびｉｌｃ３細胞ならびにそれらの使用 - Google Patents

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ジェイ． ハリリ，ロバート
ジェイ． ハリリ，ロバート
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Abstract

幹細胞動員因子を含む培地を用い、３段階増幅および分化法を使用してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。また本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を使用して腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、ならびにがんもしくはウイルス感染を有する個体に本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を投与することを含む、がんもしくはウイルス感染を有する個体を治療する方法が本明細書で提供される。

Description

本出願は、それぞれの開示がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月１５日に出願した（特許文献１）、２０１５年１２月３０日に出願した（特許文献２）および２０１６年１０月３日に出願した（特許文献３）の利益を主張するものである。
１． 分野
幹細胞動員因子を含む培地中の造血幹細胞または前駆細胞の集団からナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＩＬＣ３細胞の集団を製造する方法、例えば、胎盤の細胞からの、例えば、胎盤潅流液（例えば、ヒト胎盤潅流液）または他の組織、例えば、臍帯血もしくは末梢血からの造血幹細胞または前駆細胞から出発する幹細胞動員因子を含む培地中でＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を製造する３段階法が本明細書で提供される。例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制するために、または病原体感染、例えば、ウイルス感染を妨げるために本明細書で述べる胎盤潅流液、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞および／またはＮＫ前駆細胞を使用する方法が本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で述べる３段階法により製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞および／またはＮＫ前駆細胞を１つもしくは複数の免疫調節化合物と組み合わせて使用し、および／またはそれにより処理する。
２． 背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主要な構成要素を構成する細胞傷害性リンパ球である。
ＮＫ細胞は、インターフェロンまたはマクロファージ由来のサイトカインに反応して活性化される。一部の受容体、例えば、ＣＤ９４および２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、リガンド相互作用によっていずれの方向にも機能し得るが、ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、「活性化受容体」または「抑制性受容体」と見なされ得る、２種類の表面受容体により主として調節される。
ＮＫ細胞は、他の活性もあるが特に、腫瘍の宿主拒絶に役割を果たし、ウイルス感染細胞を殺滅することができることが示された。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質を欠くか、またはそのレベルの低下を示す細胞によって活性化された状態になり得る。自己クラスＩ ＭＨＣ発現のレベルの変化または低下を有するがん細胞は、ＮＫ細胞感受性の誘導をもたらす。活性化および増幅ＮＫ細胞ならびに場合によって末梢血からのＬＡＫ細胞は、進行がんを有する患者のｅｘ ｖｉｖｏ療法およびｉｎ ｖｉｖｏ治療の両方に用いられ、白血病のような骨髄関連疾患；乳がん；およびある特定の種類のリンパ腫に対してある程度の成功を収めた。
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を殺滅するというＮＫ細胞の有益な特性にもかかわらず、殺腫瘍機能を保持するナチュラルキラー細胞を製造し、増幅する効率的な方法を開発することが当技術分野で依然として必要である。
ＮＫ細胞は、自然リンパ球（ＩＬＣｓ）である。自然リンパ球は、その発生が転写因子ＩＤ２に依存する点において互いに関連している。ＩＬＣ３細胞として公知である、ＩＬＣの１つの型は、ＲＯＲγｔを発現し、ＩＬ−２２を産生し、ならびにパーフォリン、グランザイムおよび細胞死受容体のような細胞傷害性エフェクターを示すことなく、成体の免疫反応に役割を果たすと文献に記載されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
米国仮特許出願第６２／２４２，２４６号 米国仮特許出願第６２／２７２，９８４号 米国仮特許出願第６２／４０３，５７１号 米国特許出願公開第２０１０／０１８３５６４号 米国特許出願公開第２０１４／００２３６２６号 米国特許出願公開第２０１４／０１１４０７０号 米国特許第７，０４５，１４８号 米国特許第７，４６８，２７６号 米国特許出願公開第２００９／０１０４１６４号 米国出願公開第２００７／０１９００４２号 米国特許第５，３７２，５８１号 米国特許第５，４１５，６６５号 米国特許第７，１４７，６２６号 米国特許第７，２５５，８７９号 米国特許出願公開第２００７０２７５３６２号（米国特許第８，０５７，７８８号として発行） 米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号 米国特許第４，７９８，８２４号 米国特許第５，５５２，２６７号 米国特許第７，４９８，１７１号
モンタルド（Ｍｏｎｔａｌｄｏ）ら、２０１４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１：９８８−１０００ キリグ（Ｋｉｌｌｉｇ）ら、２０１４、Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：１４２ ウィザーズ（Ｗｉｔｈｅｒｓら）、２０１２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８９（５）：２０９４−２０９８ キム（Ｋｉｍ）ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００６、６９、１８７１−１８７８ アリクメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（２３）：５３３７−９（１９９８） サウサード（Ｓｏｕｔｈａｒｄ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４９（２）：２５１−２５７（１９９０） ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、２００５、Ｂｌｏｏｄ １０５：３０５１−３０５７ ラブニッツ（Ｒｕｂｎｉｔｚ）ら、２０１０、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８：９５５−９５９
３． 概要
細胞、例えば、造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞のような、造血細胞を増幅し、分化させて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。
一態様では、本明細書で述べる３つの段階を含むＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する方法（本明細書で「３段階法」と呼ぶ）が本明細書で提供される。本明細書で提供する３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、「３段階法により製造されたＮＫ細胞」、「３段階法により製造されたＩＬＣ３細胞」または「３段階法により製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞」と本明細書で呼ぶ。ある特定の実施形態では、前記方法は、１つもしくは複数のさらなるまたは中間のステップを含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、細胞を接触させる（または培養する）第４のまたは中間のステップを含まない。
一態様では、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、細胞の前記第１の集団を幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、その後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％、例えば、８０％が生存している、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地、第２の培地および第３の培地の少なくとも１つ、２つまたは３つすべては、ＧＢＧＭ（登録商標）培地でない。ある特定の実施形態では、第３の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の実施形態では、第３の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａであるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の第３の集団からＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、細胞の第４の集団を製造するステップを含み、細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
ある特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびエオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）を発現する。ある特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲγｔ）またはインターロイキン１受容体１（ＩＬ１Ｒ１）を発現しない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の第３の集団からＣＤ１１ａ−細胞を単離して、細胞の第４の集団を製造するステップを含み、細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＲＯＲγｔおよびＩＬ１Ｒ１を発現する。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、パーフォリンもＥＯＭＥＳも発現しない。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。
ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、哺乳類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹脂肪または前駆細胞は、霊長類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、イヌ細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、げっ歯類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、ヒト、霊長類、イヌまたはげっ歯類以外の哺乳動物由来の細胞である。
ある特定の態様では、第１の培地中で培養される造血幹細胞または前駆細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞である。ある特定の態様では、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤造血幹細胞または前駆細胞である。ある特定の態様では、胎盤造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液から得られる、または得ることができる（例えば、胎盤潅流液から単離された有核細胞から得られる、または得ることができる）。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血から得られる、または得ることができる。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、胎児肝臓細胞である。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、動員末梢血細胞である。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、骨髄細胞である。
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第１の培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、前記第１の培地は、添加されるＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、前記第１の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、前記第１の培地は、ＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、前記第１の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記Ｔｐｏは、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第１の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第２の培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、第２の培地は、添加されるＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、第２の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、第２の培地は、ＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、第２の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第２の培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第２の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
ある特定の態様では、前記第１の培地、前記第２の培地または前記第１および第２の培地に存在する幹細胞動員因子は、アリール炭化水素受容体阻害剤、例えば、アリール炭化水素受容体アンタゴニストである。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、デスベラトロールである。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、以下の式
の化合物
（式中、
Ｇ１は、ＮおよびＣＲ３から選択され、
Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、ＣＨおよびＮから独立に選択され、ただし、Ｇ３およびＧ４のうちの少なくとも１つは、Ｎであることを条件とし、ただし、Ｇ１およびＧ２は、両方がＮであるわけではないことを条件とし、
Ｌは、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）０−３−−、−−ＮＲ５ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２ＮＲ５ｂ−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２Ｓ−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−−および−−ＮＲ５ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−から選択され、Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、
Ｒ１は、水素、フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルおよびチアゾリルから選択され、Ｒ１の前記フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルまたはチアゾリルは、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、ハロ置換Ｃ１−４アルキル、ハロ置換Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ８ａ、−−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ８ａ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８ａ および−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８ａＲ８ｂから独立に選択される１〜３個の基により任意選択で置換することができ、Ｒ８ａおよびＲ８ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、ただし、Ｒ１およびＲ３は、両方が水素であるわけではないことを条件とし、
Ｒ２は、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６ａＲ６ｂ、−−ＮＲ９ａＣ（Ｏ）Ｒ９ｂ、−−ＮＲ６ａＣ（Ｏ）ＮＲ６ｂＲ６ｃ、フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルおよび１Ｈ−インダゾリルから選択され、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ６ｃは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、Ｒ２の前記フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルまたは１Ｈ−インダゾリルは、ヒドロキシ、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７ａＲ７ｂ、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂ、−−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂおよび−−ＮＲ７ａＳ（Ｏ）２Ｒ７ｂから独立に選択される１〜３個の基で任意選択で置換され、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキルおよびビフェニルから選択され、
Ｒ４は、Ｃ１−１０アルキル、プロパ−１−エン−２−イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルおよび１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルから選択され、前記アルキル、シクロプロピル、シクロヘキシル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、オキセタン−２−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−２−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルまたは１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキルおよびハロ置換Ｃ１−４アルキルから独立に選択される１〜３個の基で任意選択で置換することができる）またはその塩である。
ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）（４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール）である。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、化合物ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド］である。
ある特定の態様では、前記第１の培地、前記第２の培地または前記第１および第２の培地に存在する幹細胞動員因子は、ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体である。ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、
のうちの１つもしくは複数
またはその塩もしくはプロドラッグであり、式中、
Ｚは、
１）−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
３）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
４）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
５）−Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
６）−ＣＮ、
７）−ＳＲ、
８）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
９）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
１０）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
１１）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
１２）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
１３）−Ｌ、
１４）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
１５）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
１６）Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
１７）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
１８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
１９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、（Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で任意選択で置換されている、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つもしくは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、
Ｗは、
１）−Ｈ、
２）−ハロゲン、
３）−ＯＲ＜１＞、
４）−Ｌ−ＯＨ、
５）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
６）−ＳＲ＜１＞、
７）−ＣＮ、
８）−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
９）−ＮＨＲ＜１＞、
１０）−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
１１）−Ｌ−ＮＨ２、
１２）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
１３）−Ｌ−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
１４）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
１５）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
１６）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
１７）−Ｌ−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞
１８）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
１９）−Ｃ（０）ＮＨ２、
２０）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
２１）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
２２）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
２３）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、−ＮＨＣ（０）０Ｒ＜１＞、
−ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
−０Ｃ（０）ＮＨ２、
−０Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−０Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−０Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
−Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
−ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
−ＮＨＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
−ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−ＮＲＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
−ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）２ＮＨ２、
−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
−０Ｓ（０）２Ｒ１、
−Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
−Ｌ−ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
−Ｌ−）２ＮＲ＜１＞、
−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−アリール、
−Ｏ−Ｌ）２−ＮＲ＜１＞、
−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ ）Ｒ＜１＞、
Ｌおよびヘテロアリール基いずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリール、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−アリール、
−Ｓ−Ｌ）２ＮＲ１、
−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）’’−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
−ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
−Ｎ（Ｒ１）Ｌ）２−ＮＲ１、７６）−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）”−Ｎ（Ｒ１）ＲＡ、
７７）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
７８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
７９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
８０）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
８１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、２つのＲ＜１＞置換基が同じ窒素原子上に存在する場合、各Ｒ＜１＞置換基は、後に述べるＲ＜１＞の値のリストから独立に選択され、
ｎは、０、１、２、３、４または５に等しい整数であり、
（Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つまたは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、任意選択で環は、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で置換されており、
Ｌは、
１）−Ｃｉ〜６アルキル、
２）−Ｃ２〜６アルケニル、
３）−Ｃ２〜６アルキニル、
４）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
５）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
６）ヘテロシクリル、
７）−Ｃｉ〜６アルキル−Ｃ３〜７シクロアルキル、
８）−Ｃｉ〜６アルキル−ヘテロシクリル、
９）アリール、または
１０）ヘテロアリール
であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリール基は、１つもしくは２つのＲ＜Ａ＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
Ｒｉは、
１）−Ｈ、
２）−Ｃ１〜６アルキル、
３）−Ｃ２〜６アルケニル、
４）−Ｃ２〜６アルキニル、５）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
６）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
７）−Ｃ１〜５過フッ化、
８）−ヘテロシジル、
９）−アリール、
１０）−ヘテロアリール、
１１）−ベンジル、または
１２）５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル
であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、ペルフルオロ化アルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびベンジル基は、１つ、２つまたは３つのＲ＜Ａ＞またはＲ＜１＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
Ｒ２は、
１）−Ｈ、
２）−Ｃ１〜６アルキル、
３）−ＳＲ、
４）−Ｃ（０）Ｒ１、
５）−Ｓ（０）Ｒ１、
６）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
７）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
８）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
９）Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
１０）Ｌおよびアリール基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
１１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
１２）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合にはＬ基に任意選択で結合されており、
Ｒ＜Ａ＞は、
１）−ハロゲン、
２）−ＣＦｓ、３）−ＯＨ、
４）−ＯＲ＜１＞、
５）−Ｌ−ＯＨ、
６）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
７）−ＯＣＦｓ、
８）−ＳＨ、
９）−ＳＲ１、
１０）−ＣＮ、
１１）−ＮＯ２、
１２）−ＮＨ２、
１３）−ＮＨＲ＜１＞、
１４）−ＮＲ＜１＞Ｒ＜１＞、
１５）−Ｌ−ＮＨ２、
１６）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
１７）−Ｌ−ＮＲ＜４＞Ｒ＜１＞、
１８）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
１９）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
２０）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
２１）−Ｃ（０）ＯＨ、
２２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
２３）−Ｃ（０）ＮＨ２、
２４）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
２５）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
２６）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
２７）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
２８）−ＮＨＣ（０）ＯＲ＜１＞、
２９）−ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
３０）−ＯＣ（０）ＮＨ２、
３１）−ＯＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
３２）−ＯＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
３３）−ＯＣ（０）Ｒ＜１＞、
３４）−Ｃ（０）Ｒ１、３５）−ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
３６）−ＮＨＣ（０）ＮＨＲ１、
３７）−ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
３８）−ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
３９）−ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
４０）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
４１）−ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
４２）−ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
４３）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
４４）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
４５）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
４６）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
４７）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
４８）−０Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
４９）−Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
５０）−ベンジル、
５１）−Ｎ３、または
５２）−Ｃ（−Ｎ＝Ｎ−）（ＣＦ３）
であり、ベンジル基は、１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている。
ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、以下の化学構造
を有する。
ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、以下の化学構造
を有する。
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１００Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、約２２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
ある特定の態様では、第３の培地は、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦおよび１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含み、ＳＲ１を欠いている。
ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一般的に、特定する形で列挙する培地成分は、前記培地の組成不明の成分中の、例えば、血清中の可能な成分を指すものでない。例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、血清中に含まれない。さらに、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、血清中に含まれない。
ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地は、ヒト血清ＡＢを含む。ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、１％〜２０％のヒト血清ＡＢ、５％〜１５％のヒト血清ＡＢまたは約２、５もしくは１０％のヒト血清ＡＢを含む。
ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、２−メルカプトエタノールを含む。ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ゲンタマイシンを含む。
本明細書で述べる３段階法における、ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２の培地中で前記培養するステップの前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり前記第１の培地中で培養する。ある特定の実施形態では、細胞を、前記第３の培地中で前記培養するステップの前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり前記第２の培地中で培養する。ある特定の実施形態では、細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日間または３０日を超える期間にわたり前記第３の培地中で培養する。
本明細書で述べる３段階法における、一実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１の培地中で７〜１３日間培養して、細胞の第１の集団を製造し、細胞の前記第１の集団を前記第２の培地中で２〜６日間培養して、細胞の第２の集団を製造し、細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で１０〜３０日間培養する、すなわち、細胞を合計１９〜４９日間培養する。
本明細書で述べる３段階法における、一実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１の培地中で８〜１２日間培養して、細胞の第１の集団を製造し、細胞の前記第１の集団を前記第２の培地中で３〜５日間培養して、細胞の第２の集団を製造し、細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で１５〜２５日間培養する、すなわち、細胞を合計２６〜４２日間培養する。
本明細書で述べる３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１の培地中で１０日間培養して、細胞の第１の集団を製造し、細胞の前記第１の集団を前記第２の培地中で４日間培養して、細胞の第２の集団を製造し、細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で２１日間培養する、すなわち、細胞を合計３５日間培養する。
ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地および第３の培地中で前記培養するステップは、すべて静的培養条件下で、例えば、培養皿または培養フラスコ中で行われる。特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のうちの少なくとも１つで前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。ある特定の態様では、前記第１の培地および前記第２の培地中で前記培養するステップは、静的培養条件下で行われ、前記第３の培地中で前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。
ある特定の態様では、前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。他の態様では、前記培養するステップは、Ｇ−Ｒｅｘデバイスで行われる。さらに他の態様では、前記培養するステップは、ＷＡＶＥバイオリアクター中で行われる。
ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細を１×１０４〜１×１０５細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記造血幹細胞または前駆細を３×１０４細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する。
ある特定の態様では、細胞の前記第１の集団を５×１０４〜５×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第１の集団を１×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する。
ある特定の態様では、細胞の前記第２の集団を１×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。ある特定の態様では、細胞の前記第２の集団を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を約５×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、細胞の前記第２の集団をスピナーフラスコ中で約５×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を約３×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を静的培養で約３×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する。具体的な態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７５％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示すＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示すＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示すＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示すＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示すＩＬＣ３細胞を製造する。
ある特定の態様では、前記第３の培養するステップの後に、細胞の前記第３の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞の前記集団を凍結保存する。ある特定の態様では、前記第４の培養するステップの後に、細胞の前記第４の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞の前記集団を凍結保存する。
ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書で述べた３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が本明細書で提供される。したがって、本明細書で述べた３段階法により製造された単離ナチュラルキラー細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、ナチュラルキラー細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
ある特定の態様では、ＩＬＣ３細胞、すなわち、本明細書で述べた３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬＣ３細胞を含む細胞の集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
一実施形態では、単離ＮＫ前駆細胞集団が本明細書で提供され、前記ＮＫ前駆細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。具体的な実施形態では、ＮＫ前駆細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
別の実施形態では、単離成熟ＮＫ細胞集団が本明細書で提供され、前記成熟ＮＫ細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。具体的な実施形態では、成熟ＮＫ細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
別の実施形態では、単離ＩＬＣ３集団が本明細書で提供され、前記ＩＬＣ３細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。具体的な実施形態では、単離ＩＬＣ３集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
別の実施形態では、細胞集団が本明細書で提供され、前記細胞集団は、本明細書で述べた方法により製造される細胞の第３の集団である。別の実施形態では、細胞集団が本明細書で提供され、前記細胞集団は、本明細書で述べた方法により製造される細胞の第４の集団である。
別の実施形態では、単離ＮＫ細胞集団が本明細書で提供され、前記ＮＫ細胞は、活性化されており、前記活性化ＮＫ細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。具体的な実施形態では、単離ＮＫ集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適する、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト使用に適する医薬組成物に製剤化する。
したがって、別の態様では、腫瘍細胞の増殖を抑制するための、ウイルス感染を治療するための、またはがん、例えば、血液がんおよび充実性腫瘍を治療するための本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の使用が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞集団を免疫調節化合物、例えば、本明細書で述べる免疫調節化合物またはサリドマイドと接触させるか、または組み合わせて使用する。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞集団を免疫調節化合物、例えば、本明細書で述べる免疫調節化合物またはサリドマイドで処理するか、またはそれと組み合わせて使用する。
具体的な実施形態では、前記がんは、充実性腫瘍である。別の実施形態では、前記がんは、血液がんである。具体的な実施形態では、がんは、膠芽腫、原発性乳管癌、白血病、急性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肺癌、結腸腺癌、組織球性リンパ腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、前立腺がん、多発性骨髄腫または網膜芽腫である。より具体的な実施形態では、がんは、ＡＭＬである。より具体的な実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。
別の具体的な実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液、臍帯血または末梢血から得られる。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤から、例えば、胎盤潅流液から得られる。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血から得られない。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、末梢血から得られない。別の具体的な実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液および臍帯血、例えば、潅流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する混合細胞である。別の具体的な実施形態では、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離する。ある特定の実施形態では、混合細胞は、臍帯血および胎盤潅流液をプールすることまたは合わせることにより得ることができる。ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の容量比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。より具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を８．５：１．５（８５％：１５％）の比で合わせる。
ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を、総有核細胞（ＴＮＣ）含量により決定される、１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。
一実施形態では、したがって、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団の有効量の細胞を個体に投与するステップを含む、がんまたはウイルス感染を有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、がんは、充実性腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、血液がんである。具体的な実施形態では、血液がんは、白血病である。別の具体的な実施形態では、血液がんは、リンパ腫である。別の具体的な実施形態では、血液がんは、急性骨髄性白血病である。別の具体的な実施形態では、血液がんは、慢性リンパ球性白血病である。別の具体的な実施形態では、血液がんは、慢性骨髄性白血病である。ある特定の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている。他の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない。
具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞集団は、前記投与するステップの前に、免疫調節化合物、例えば、本明細書で述べる免疫調節化合物またはサリドマイドで処理した。具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞集団は、前記投与するステップの前に、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８、またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８で処理した。別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団は、前記投与するステップの前にＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数で前処理した。別の具体的な実施形態では、方法は、（１）本明細書で述べた３段階法を使用して製造した、有効量の単離ＮＫ細胞集団；および（２）有効量の免疫調節化合物またはサリドマイドを個体に投与するステップを含む。この文脈における「有効量」は、ＮＫ細胞集団および、任意選択で、免疫調節化合物またはサリドマイドを投与しなかった前記がんまたは前記感染を有する個体と比較して、前記がんまたは前記感染の１つもしくは複数の症状の検出可能な改善をもたらす、前記ＮＫ細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドの量を意味する。具体的な実施形態では、前記免疫調節化合物は、レナリドミドまたはポマリドミドである。別の実施形態では、方法は、抗がん化合物、例えば、下記の抗がん化合物のうちの１つまたは複数を個体に投与するステップをさらに含む。
別の実施形態では、治療有効量のＮＫ細胞集団を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞をＮＫ細胞集団における細胞と接触させるステップを含む腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が本明細書で提供される。以後、特に示さない限り、「近接」という用語は、所望の結果を生じさせるのに十分に近いことを意味するものであり、例えば、ある特定の実施形態では、近接という用語は、接触を意味する。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｅｘ ｖｉｖｏで行われる。他の実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる。治療有効量のＮＫ細胞集団を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞をＮＫ細胞集団における細胞と接触させるステップを含む腫瘍細胞の増殖を抑制する方法に複数のＮＫ細胞を使用することができる。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である。
一実施形態では、腫瘍細胞を複数のナチュラルキラー細胞と接触させるステップを含み、ナチュラルキラー細胞が本明細書で述べた方法により製造される、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法に使用する複数のナチュラルキラー細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがヒト個体において行われる。ある特定の実施形態では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。ある特定の実施形態では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非生得リンパ球（ＩＬＣ）療法が奏功しなかったＡＭＬを有する。ある特定の実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。ある特定の実施形態では、前記個体は、前記ＮＫ細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞または多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。ある特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１３８抗体または抗ＣＤ３２抗体とともに投与する。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ＮＫ細胞が凍結保存されているか、または凍結保存されていない。
ＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、全身または局所であり得る。具体的な実施形態では、投与は、非経口的である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたは足場を用いて実施する。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞の注射は、局所注射である。より具体的な実施形態では、局所注射は、充実性腫瘍（例えば、肉腫）中への直接的注射である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射器による注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、誘導送達による。具体的な実施形態では、注射による対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡検査、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴または放射線学により補助される。
具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップの前に、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団を免疫調節化合物、例えば、本明細書で、以下で述べる免疫調節化合物もしくはサリドマイド、ならびに／またはＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８もしくはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８で処理した。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップの前に、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団をＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数で処理した。別の具体的な実施形態では、有効量の免疫調節化合物、例えば、本明細書で、以下で述べる免疫調節化合物もしくはサリドマイドを腫瘍細胞と近接させる、例えば、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触させる。この文脈における「有効量」は、ＮＫ細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数の腫瘍細胞と比較して前記腫瘍細胞の検出可能な抑制をもたらすＮＫ細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドの量を意味する。別の具体的な実施形態では、方法は、有効量の抗がん化合物、例えば、以下で述べる抗がん化合物を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞を抗がん化合物と接触させるステップをさらに含む。
この方法の具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、血液がん細胞である。別の具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、膠芽腫細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、前立腺がん細胞または結腸直腸腺癌細胞である。より具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、ＡＭＬ細胞である。より具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップがｅｘ ｖｉｖｏで行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる。より具体的な実施形態では、前記ｉｎ ｖｉｖｏで接触させるステップまたは近接させるステップがヒトにおいて行われる。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、腎臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３３抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ２０抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ１３８抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３２抗体とともに投与する。
別の態様では、（１）レナリドミド；（２）メルファラン；および（３）個体における多発性骨髄腫を治療するのに有効である、ＮＫ細胞を個体に投与するステップを含む、多発性骨髄腫を有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるかまたは臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための、例えば、３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、前記投与するステップの前に増幅させた。別の実施形態では、前記レナリドミド、メルファランおよび／またはＮＫ細胞を互いに別個に投与する。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、本明細書で述べた、３段階法により製造される。
別の態様では、個体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するのに有効である、ＮＫ細胞（ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８による前処理によって任意選択で活性化させた）を個体に投与するステップを含む、ＡＭＬを有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記投与するステップの前に本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団をＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数により前処理した。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための、例えば、本明細書で示した３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。ＡＭＬを有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、本明細書で述べた、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により治療されるべきＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬを含む。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞または非生得リンパ球療法が奏功しなかったＡＭＬを有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている。別の態様では、治療有効量の（１）レナリドミド；（２）メルファラン；（３）フルダラビン；および（４）個体における慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療するのに有効である、ＮＫ細胞、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞集団を個体に投与するステップを含む、前記ＣＬＬを有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。上記の方法のいずれかの具体的な実施形態では、前記レナリドミド、メルファラン、フルダラビンおよび増幅ＮＫ細胞を前記個体に別個に投与する。ＣＬＬを有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、本明細書で述べた３段階法により製造される。
別の実施形態では、治療有効量のＩＬＣ３細胞集団を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞をＩＬＣ３細胞集団における細胞と接触させるステップを含む腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が本明細書で提供される。以後、特に示さない限り、「近接」という用語は、所望の結果を生じさせるのに十分に近いことを意味するものであり、例えば、ある特定の実施形態では、近接という用語は、接触を意味する。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｅｘ ｖｉｖｏで行われる。他の実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる。治療有効量のＩＬＣ３細胞集団を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞をＩＬＣ３細胞集団における細胞と接触させるステップを含む腫瘍細胞の増殖を抑制する方法に複数のＩＬＣ３細胞を使用することができる。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である。
一実施形態では、腫瘍細胞を複数のＩＬＣ３細胞と接触させるステップを含み、ＩＬＣ３細胞が本明細書で述べた方法により製造される、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法に使用する複数のＩＬＣ３細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがヒト個体において行われる。ある特定の実施形態では、前記方法は、前記ＩＬＣ３細胞を前記個体に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。ある特定の実施形態では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非生得リンパ球（ＩＬＣ）療法が奏功しなかったＡＭＬを有する。ある特定の実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。ある特定の実施形態では、前記個体は、前記ＩＬＣ３Ｋ細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である。ある特定の実施形態では、前記腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞または多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１３８抗体または抗ＣＤ３２抗体とともに投与する。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ＩＬＣ３細胞が凍結保存されているか、また凍結保存されていない。
ＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、全身または局所であり得る。具体的な実施形態では、投与は、非経口的である。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたは足場を用いて実施する。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。具体的な実施形態では、ＩＬＣ３細胞の注射は、局所注射である。より具体的な実施形態では、局所注射は、充実性腫瘍（例えば、肉腫）中への直接的注射である。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注射器による注射による。具体的な実施形態では、対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、誘導送達による。具体的な実施形態では、注射による対象へのＩＬＣ３細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡検査、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴または放射線学により補助される。
具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップの前に、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＩＬＣ３細胞集団を免疫調節化合物、例えば、本明細書で、以下で述べる免疫調節化合物もしくはサリドマイド、ならびに／またはＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８もしくはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８で処理した。具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップの前に、本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団をＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数で処理した。別の具体的な実施形態では、有効量の免疫調節化合物、例えば、本明細書で、以下で述べる免疫調節化合物もしくはサリドマイドを、さらに、腫瘍細胞と近接させる、例えば、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触させる。この文脈における「有効量」は、ＩＬＣ３細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数の腫瘍細胞と比較して前記腫瘍細胞の検出可能な抑制をもたらすＩＬＣ３細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドの量を意味する。別の具体的な実施形態では、方法は、有効量の抗がん化合物、例えば、以下で述べる抗がん化合物を腫瘍細胞と近接させるステップ、例えば、腫瘍細胞を抗がん化合物と接触させるステップをさらに含む。
この方法の具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、血液がん細胞である。別の具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、膠芽腫細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、前立腺がん細胞または結腸直腸腺癌細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップまたは近接させるステップがｅｘ ｖｉｖｏで行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる。より具体的な実施形態では、前記ｉｎ ｖｉｖｏで接触させるステップまたは近接させるステップがヒトにおいて行われる。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、腎臓腫瘍細胞である。具体的な実施形態では、前記腫瘍細胞は、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗ＣＤ３３抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗ＣＤ２０抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗ＣＤ１３８抗体とともに投与する。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞を抗ＣＤ３２抗体とともに投与する。
別の態様では、（１）レナリドミド；（２）メルファラン；および（３）個体における多発性骨髄腫を治療するのに有効である、ＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む、多発性骨髄腫を有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、臍帯血ＩＬＣ３細胞であるかまたは臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＩＬＣ３細胞である。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬＣ３細胞を製造するための、例えば、３段階法を使用してＩＬＣ３細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、前記投与するステップの前に増幅させた。別の実施形態では、前記レナリドミド、メルファランおよび／またはＩＬＣ３細胞を互いに別個に投与する。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、本明細書で述べた、３段階法により製造される。
別の態様では、個体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するのに有効である、ＩＬＣ３細胞（ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８による前処理によって任意選択で活性化させた）を個体に投与するステップを含む、ＡＭＬを有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記投与するステップの前に本明細書で述べた３段階法を使用して製造した単離ＮＫ細胞集団をＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数により前処理した。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、臍帯血ＩＬＣ３細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＩＬＣ３細胞である。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬＣ３細胞を製造するための、例えば、本明細書で示した３段階法を使用してＩＬＣ３細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。ＡＭＬを有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、本明細書で述べた、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により治療されるべきＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬを含む。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非ＩＬＣ３細胞または非生得リンパ球療法が奏功しなかったＡＭＬを有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ＩＬＣ３細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている。別の態様では、治療有効量の（１）レナリドミド；（２）メルファラン；（３）フルダラビン；および（４）個体における慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療するのに有効である、ＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＩＬＣ３細胞集団を個体に投与するステップを含む、前記ＣＬＬを有する前記個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、臍帯血ＩＬＣ３細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＩＬＣ３細胞である。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬＣ３細胞を製造するための、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用してＩＬＣ３細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。上記の方法のいずれかの具体的な実施形態では、前記レナリドミド、メルファラン、フルダラビンおよび増幅ＩＬＣ３細胞を前記個体に別個に投与する。ＣＬＬを有する個体を治療する方法のある特定の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、本明細書で述べた３段階法により製造される。
ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、凍結保存する、例えば、本明細書で述べる方法を使用して凍結保存する。ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、凍結保存媒体中、例えば、本明細書で述べる凍結保存媒体中で凍結保存する。具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ前駆細胞集団および／またはＮＫ細胞集団の凍結保存は、（１）本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ前駆細胞集団および／またはＮＫ細胞集団を含む細胞懸濁溶液を調製するステップ；（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に加えて、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ；（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得るステップ；および（４）凍結保存試料を−８０℃以下で保管するステップを含む。
上記の治療または腫瘍抑制の方法のある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞集団を、他のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血もしくは末梢血から単離された、または異なる方法により造血細胞から製造されたナチュラルキラー細胞と合わせる。具体的な実施形態では、ナチュラルキラー細胞集団を、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で別の供給源からの、または異なる方法により製造されたナチュラルキラー細胞と合わせる。
ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団は、凍結保存する、例えば、本明細書で述べる方法を使用して凍結保存する。ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団は、凍結保存媒体中、例えば、本明細書で述べる凍結保存媒体中で凍結保存する。具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３前駆細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団の凍結保存は、（１）本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３前駆細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を含む細胞懸濁溶液を調製するステップ；（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に加えて、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ；（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得るステップ；および（４）凍結保存試料を−８０℃以下で保管するステップを含む。
上記の治療または腫瘍抑制の方法のある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法により製造されたＩＬＣ３細胞集団を、他のＩＬＣ３細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血もしくは末梢血から単離された、または異なる方法により造血細胞から製造されたＩＬＣ３細胞と合わせる。具体的な実施形態では、ＩＬＣ３細胞集団を、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で別の供給源からの、または異なる方法により製造されたＩＬＣ３細胞と合わせる。
別の態様では、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む化学療法後の消化管を修復する方法が本明細書で提供される。複数のＩＬＣ３細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む化学療法後の消化管を修復する方法に使用することができる。
別の態様では、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む放射線から個体を保護する方法が本明細書で提供される。複数のＩＬＣ３細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む放射線から個体を保護する方法に使用することができる。方法のある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞を、骨髄移植の補助として使用する。
別の態様では、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む個体の胸腺を再構成する方法が本明細書で提供される。複数のＩＬＣ３細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む個体の胸腺を再構成する方法に使用することができる。
別の態様では、本明細書で述べた３段階法により製造される単離ＮＫ細胞を含む組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、造血細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または末梢血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ１６−である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％は、ＣＤ９４＋である。
ある特定の態様では、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞の集団が本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
ある特定の態様では、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳのうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ−である、ＩＬＣ３細胞の集団が本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンまたはＥＯＭＥＳのいずれも発現しない。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ２２６および／または２Ｂ４をさらに発現する。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１のうちの１つまたは複数をさらに発現する。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ２２６、２Ｂ４、ＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１を発現する。
ある特定の態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の第３の集団からＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を分離するステップ；ならびに（ｅ）ＣＤ１１ａ＋細胞をＣＤ１１ａ−細胞と５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０の比で合わせて、細胞の第４の集団を製造するステップを含む、ナチュラルキラー細胞およびＩＬＣ３細胞を含む細胞集団を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が２０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１０の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：２０の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５０の比で合わせられている。
ある特定の態様では、前記集団における複数のＮＫ細胞は、末梢血ナチュラルキラー細胞のように検出可能により高いレベルでｍｉｃｒｏＲＮＡＳ ｄｍｅ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３Ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８Ｋ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８Ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７５−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−２のうちの１つまたは複数を発現する。ある特定の態様では、前記集団における複数のＮＫ細胞は、末梢血ナチュラルキラー細胞より検出可能により低いレベルでｍｉｃｒｏＲＮＡＳ ｍｉＲ１８８−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−７ａ、ｍｉＲ−５３２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３２２およびｍｉＲ３４２−３ｐのうちの１つまたは複数を発現する。ある特定の態様では、前記集団における複数のＮＫ細胞は、末梢血ナチュラルキラー細胞と同等のレベルでｍｉｃｒｏＲＮＡＳ ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ３０ｃのうちの１つまたは複数を発現する。
具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、単一個体に由来する。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するナチュラルキラー細胞を含む。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、異なる少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数のナチュラルキラー細胞、すなわち、ＮＫ細胞よりも検出可能に多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを前記ＮＫ細胞が発現するのに十分な量で、かつ時間にわたり前記ＮＫ細胞を前記免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触または近接させた。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞を含む組成物は、免疫調節化合物もしくはサリドマイドをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、以下で述べる化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物である。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、レナリドミドである。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、ポマリドミドである。
別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞を含む組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
より具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞および別の供給源からの、または別の方法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の供給源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施形態では、ＮＫ細胞を別の供給源からの、または別の方法により製造されたナチュラルキラー細胞と約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせる。
別の具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および単離胎盤潅流液または単離胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞と異なる個体に由来する胎盤潅流液を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の細胞のすべてまたは実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％を超える）は、胎児細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤潅流液または胎盤潅流液細胞は、胎児細胞および母体細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の胎児細胞は、前記潅流液中の細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満を構成する。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、胎盤血管系内の０．９％ ＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、培養培地を含む。別の具体的な実施形態では、前記潅流液を処理して、赤血球を除去した。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物、例えば、以下で述べる免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
別の具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞および胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、組成物は、単離胎盤潅流液および単離胎盤潅流液細胞を含み、前記単離胎盤潅流液および前記単離胎盤潅流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤潅流液を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、少なくとも２個体に由来する胎盤潅流液を含む。胎盤潅流液細胞を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤潅流液細胞は、少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
別の態様では、例えば、本明細書で述べた３段階法のいずれかの実施形態により製造された、単離ＮＫ細胞集団を含む、組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤から、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または末梢血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ１６−である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％は、ＣＤ９４＋である。
別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離ＮＫ細胞は、単一個体に由来する。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するＮＫ細胞を含む。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、異なる少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。すなわち、前記造血幹細胞および前駆細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数のナチュラルキラー細胞、すなわち、ＮＫ細胞よりも検出可能に多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを前記ＮＫ細胞が発現するのに十分な量で、かつ時間にわたり前記ＮＫ細胞を前記免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触または近接させた。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物またはサリドマイドをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、以下で述べる化合物である。
別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
より具体的な実施形態では、組成物は、別の供給源からの、または別の方法により製造されたＮＫ細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の供給源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞集団を、別の供給源からの、または別の方法により製造されたＮＫ細胞と約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせる。
別の具体的な実施形態では、組成物は、ＮＫ細胞集団および単離胎盤潅流液または単離胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞集団と異なる個体に由来する胎盤潅流液を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の細胞のすべてまたは実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％を超える）は、胎児細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤潅流液または胎盤潅流液細胞は、胎児細胞および母体細胞を含む。より具体的な実施形態では、胎児細胞は、前記潅流液中の細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満を構成する。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、胎盤血管系内の０．９％ ＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、培養培地を含む。別の具体的な実施形態では、前記潅流液を処理して、赤血球を除去した。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物、例えば、以下で述べる免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
別の具体的な実施形態では、組成物は、ＮＫ細胞集団および胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、組成物は、単離胎盤潅流液および単離胎盤潅流液細胞を含み、前記単離胎盤潅流液および前記単離胎盤潅流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤潅流液を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、少なくとも２個体に由来する胎盤潅流液を含む。胎盤潅流液細胞を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤潅流液細胞は、少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
３．１． 用語
本明細書で使用される「免疫調節化合物」および「ＩＭｉＤ（商標）」という用語は、サリドマイドを包含しない。
本明細書で使用される「レナリドミド」は、３−（４’アミノイソインドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ名）または２，６−ピペリジンジオン，３−（４−アミノ−１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−（国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）名）を意味する。本明細書で使用される「ポマリドミド」は、４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンを意味する。
本明細書で使用される「多能性」（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）は、細胞について述べる場合、細胞が別の細胞型の細胞に分化する能力を有することを意味する。ある特定の実施形態では、「多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）」は、哺乳類の身体の約２６０の細胞型のサブセットに発達する能力を有する細胞である。多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）と異なり、多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）は、細胞型のすべてを形成する能力を有するわけではない。
本明細書で使用される「フィーダー細胞」は、第２の型の細胞を維持し、多分増殖させることができる環境を与えるために、第２の型の細胞と共培養される１つの型の細胞を意味する。いかなる理論にも拘束されるものでないが、フィーダー細胞は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、電気シグナル、有機分子（例えば、ステロイド）、核酸分子、増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）、他の因子（例えば、サイトカイン）および代謝栄養素を標的細胞に供給する。ある特定の実施形態では、フィーダー細胞は、単層に成長する。
本明細書で使用される、さらなる修正なしに、本明細書で述べた方法を使用して製造した「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ細胞」は、あらゆる組織供給源に由来するナチュラルキラー細胞を含む。
本明細書で使用される、さらなる修正なしに、本明細書で述べた方法を使用して製造した「ＩＬＣ３細胞」は、あらゆる組織供給源に由来するＩＬＣ３細胞を含む。
本明細書で使用される「胎盤潅流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部を、例えば、胎盤血管系内を通過させた潅流溶液を意味し、胎盤内の通過中に潅流溶液により収集された複数の細胞を含む。
本明細書で使用される「胎盤潅流液細胞」は、胎盤潅流液から単離された、または単離可能な有核細胞、例えば、総有核細胞を意味する。
本明細書で使用される「腫瘍細胞の抑制」、「腫瘍細胞の増殖の抑制」などは、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団を例えば、腫瘍細胞の集団と接触させるステップまたは近接させるステップにより、例えば、腫瘍細胞の集団を本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団と接触させるステップにより、例えば、腫瘍細胞の前記集団における１つまたは複数の腫瘍細胞を殺滅するステップにより、腫瘍細胞の集団の増殖を遅くすることを含む。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。他の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
本明細書で使用される「造血細胞」という用語は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
本明細書で使用される「組成不明の成分」は、その構成物質が一般的に示されていないまたは定量化されていない成分を指す培養培地の分野における専門用語である。「組成不明の成分」の例としては、制限なしに、血清、例えば、ヒト血清（例えば、ヒト血清ＡＢ）および胎児血清（例えば、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）またはウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）などがある。
本明細書で使用される「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照を上回って検出可能に存在すること；または定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超える形で検出可能であることを意味する。
本明細書で使用される「−」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照を上回って検出可能に存在しないこと；または定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超える形で検出可能ではないことを意味する。
以前のＮＫ細胞増幅培地（「ＮＫ細胞ｅｘｐ」）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と比較した、Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の（Ａ）増幅倍率、（Ｂ）細胞純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）、および（Ｃ）１０：１（Ｅ：Ｔ）比での細胞傷害性についての、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）またはＣＨ２２３１９１を１μＭ、１０μＭおよび３０μＭで使用する３段階法の効果を示す図である。 ＣＤ１１ａおよび天然細胞傷害性受容体ＮＫｐ３０、ｃ−レクチン受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、２Ｂ４、細胞溶解性メディエーターパーフォリンおよびグランザイムＢ、ならびにＮＫ細胞成熟および細胞溶解機能の調節因子、ＥＯＭＥＳの発現を示す、３段階法により産生されたＣＤ３−ＣＤ５６＋のゲートをかけた細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 腫瘍細胞株Ｋ５６２（ＣＭＬ）、ＨＬ−６０（ＡＭＬ）およびＲＰＭＩ８２２６（多発性骨髄腫）に対する３５日間の３段階ＮＫ細胞（ｎ＝１０）の細胞傷害性を示す図である。溶解は、１０：１のエフェクター対標的比で測定した。 パーフォリン（上）、細胞溶解性メディエーター、および脱顆粒のマーカーＣＤ１０７（下）の発現におけるＦＩＴＣアイソタイプ対照細胞と３段階ＮＫ細胞を比較する多色フローサイトメトリーを示す図である。 Ｋ５６２（ＣＭＬ）細胞と１：１の比で２４時間共培養した場合の３段階ＮＫ細胞（ｎ＝１１）によるサイトカイン産生を示す図である。 １：１のエフェクター対標的、インキュベーション後１５分、６３×の倍率での３段階ＮＫ細胞およびＫ５６２（ＣＭＬ）（Ａ）およびＲＰＭＩ８２２６（多発性骨髄腫）（Ｂ）細胞の共焦点画像化によってキャプチャーされたパーフォリンの分極を伴うＦアクチン免疫学的シナプスの形成を示す図である。細胞をホルムアルデヒドで固定し、ＦアクチンをＡｌｅｘａ−４８８コンジュゲートファロイジンで染色し、パーフォリン抗体に続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５色素コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で共染色を行った。腫瘍標的細胞もまた、細胞トラッカーバイオレット色素で染色した。矢印は、ＮＫ細胞、パーフォリン、および標的細胞を示す。 腫瘍細胞株Ｋ５６２（ＣＭＬ）、ＨＬ−６０（ＡＭＬ）およびＲＰＭＩ８２２６（多発性骨髄腫）に対する３段階ＮＫ細胞（ｎ＝３）の細胞傷害性を示す図である。溶解は、様々なエフェクター対標的比で測定した。 腫瘍細胞（Ｋ５６２またはＨＬ−６０）またはホルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ）１２−ミリステート１３−アセテート＋イオノマイシン（ＰＭＡ）で刺激時の３段階ＮＫ細胞（ｎ＝４）におけるＣＤ１０７ａ発現を示す図である。ＣＤ１０７ａ発現は脱顆粒のマーカーである。４人のドナーからの結果が示される。 腫瘍細胞（Ｋ５６２、ＨＬ−６０、またはＲＰＭＩ８２２６）またはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート＋イオノマイシン（ＰＭＡ）で刺激時の３段階ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ分泌（ｎ＝３）を示す図である。３人のドナーからの結果が示される。 初代ＡＭＬ標的細胞（Ａ１、Ａ２、およびＫＧ１ａ）に対する３段階ＮＫ細胞（ｎ＝２）のエフェクター対標的比３：１での細胞溶解活性を示す図である。２４時間のインキュベーションの結果を示す。２人のドナーからの結果が示される。 ＨＬ−６０（ＡＭＬ）腫瘍細胞株による刺激と比較した、初代ＡＭＬ標的細胞（ＡＭＬ１〜４およびＫＧ１ａ）で刺激時の３段階ＮＫ細胞（ｎ＝５）におけるＩＦＮγ分泌を示す図である。５人のドナーからの結果が示される。容易に比較するためにボックスが加えられている。 ＣＤ１１ａおよびＣＤ１１７の発現を示す、３段階法によって産生されたＣＤ３−ＣＤ５６＋のゲートをかけた細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。細胞の２つのサブセット、ＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−がボックス内に示されている。 ＣＤ５６およびＣＤ９４の発現を示す、図１２からのＣＤ１１ａ＋（右）およびＣＤ１１ａ−（左）細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 各々のサブセットについて、パーフォリン、ＥＯＭＥＳ、ＲＯＲγｔ、およびＩＬ１Ｒ１の発現レベルを示す、図１２からのＣＤ１１ａ＋（上）およびＣＤ１１ａ−（下）細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 フローサイトメトリーによって決定される、パーフォリン、グランザイムＢ、ＥＯＭＥＳ、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ１Ｒ１、ＲＯＲγｔおよびＡＨＲを発現するＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−の３段階細胞のパーセンテージの定量化を示す図である。結果は４人のドナーにわたって示される。 フローサイトメトリーによって決定される、サイトカインでの刺激に際して、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２２、ＩＬ−８およびＴＮＦαを発現するＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−の３段階細胞のパーセンテージの定量化を示す図である。結果は４人のドナーにわたって示される。グラフ上の棒グラフは、左から右に：ｉ）刺激なし、ｉｉ）ＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡｉ）での刺激、（ｉｉｉ）ＰＭＡｉおよびＩＬ２３での刺激、（ｉｖ）ＩＬ１２およびＩＬ１８での刺激、および（ｖ）ＩＬ１ｂおよびＩＬ２３での刺激を示す。 ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、およびＮＫＧ２Ｄと比較したＣＤ１１ａの発現を示す、３段階法によって産生されたＣＤ３−ＣＤ５６＋のゲートをかけた細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）およびＣＤ２４４（２Ｂ４）と比較したＣＤ１１ａの発現を示す、３段階法によって産生されたＣＤ３−ＣＤ５６＋のゲートをかけた細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 ＣＤ１６、ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲと比較したＣＤ１１ａの発現を示す、３段階法によって産生されたＣＤ３−ＣＤ５６＋のゲートをかけた細胞の多色フローサイトメトリーを示す図である。 フローサイトメトリーによって測定される、表６から示された第３の培地条件を使用した、（Ａ）ＣＤ５６および（Ｂ）ＣＤ１４／１５を発現する３段階細胞のパーセンテージならびに（Ｃ）ＲＯＲγｔおよび（Ｄ）パーフォリンを発現するＣＤ５６＋の３段階細胞のパーセンテージを示す図である。各々の条件について隣接するバーとして、２人のドナーからの結果が示される。 Ｋ５６２細胞の存在下の（Ａ）ＣＤ１１ａ＋および（Ｂ）ＣＤ１１ａ−細胞亜集団におけるＦＡＣＳを使用したＣＤ１０７ａ発現を示す図である。（Ｃ）のグラフは、ＣＤ５６＋ＣＤ３−の３段階ＮＫ細胞の４集団についての結果を示す。 Ｋ５６２細胞に対する３段階ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−集団のＣＤ１１ａ＋（陽性）およびＣＤ１１ａ−（陰性）亜集団の細胞傷害性を示す図である。エフェクター対標的細胞比が、ｘ軸上に示される。 Ｋ５６２標的細胞ならびにＣＤ１１ａ陽性および陰性エフェクター細胞（１：１のエフェクター：標的比率）の共培養の存在下および非存在下で行ったサイトカイン分泌分析を示す図である。陽性および陰性細胞亜集団の左手の棒グラフは、Ｋ５６２細胞非存在下での分泌を示し、一方、陽性および陰性細胞亜集団の右手の棒グラフは、Ｋ５６２細胞の存在下での分泌を示す。
５． 詳細な説明
造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞からＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を製造し、増幅する新規方法が本明細書で提供される。また造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞からＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する方法、例えば、３段階法が本明細書で提供される。ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造するために使用する造血細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）は、あらゆる供給源、例えば、制限なしに、胎盤、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓または肝臓から得ることができる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞またはＮＫ細胞集団および／もしくはＩＬＣ３細胞集団は、増幅造血細胞、例えば、造血幹細胞および／または造血前駆細胞から製造される。一実施形態では、造血細胞は、そのような細胞の供給源、例えば、胎盤、例えば、胎盤潅流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、肝臓（例えば、胎児肝臓）および／または骨髄から収集する。
ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造するために使用する造血細胞は、あらゆる動物種から得ることができる。ある特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞は、哺乳類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、霊長類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、イヌ細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、げっ歯類細胞である。
５．１ 造血細胞
本明細書で開示した方法において有用な造血細胞は、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞に分化することができる任意の造血細胞、例えば、前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞などであり得る。造血細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血、肝臓など、またはそれらの組合せのような組織供給源から得ることができる。造血細胞は、胎盤から得ることができる。具体的な実施形態では、造血細胞は、胎盤潅流液から得られる。一実施形態では、造血細胞は、臍帯血から得られない。一実施形態では、造血細胞は、末梢血から得られない。胎盤潅流液に由来する造血細胞は、胎児および母体造血細胞の混合物、例えば、母体細胞が造血細胞の総数の５％以上を構成する混合物を含み得る。ある特定の実施形態では、胎盤潅流液に由来する造血細胞は、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の胎児細胞を含む。
別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用してＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液、臍帯血、胎児肝臓、動員末梢血または骨髄から得られる。別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用してＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液および臍帯血、例えば、潅流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する混合細胞である。別の具体的な実施形態では、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離する。ある特定の実施形態では、混合細胞は、臍帯血および胎盤潅流液をプールすることまたは合わせることにより得ることができる。ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の容量比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。より具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を８．５：１．５（８５％：１５％）の比で合わせる。
ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を、総有核細胞（ＴＮＣ）含量による、１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。
別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して前記ＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血および胎盤潅流液の両方に由来するが、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離される。
ある特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。具体的な実施形態では、本明細書で開示した方法において有用な造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−である。より具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ２４−、ＣＤ５６−、ＣＤ６６ｂ−および／またはグリコホリンＡ−でのうちの１つまたは複数である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ２４−、ＣＤ５６−、ＣＤ６６ｂ−およびグリコホリンＡ−である。別のより具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−ＣＤ１１７−である。別のより具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−ＣＤ１１７−ＣＤ２３５−ＣＤ３６−である。
別の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ４５＋である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である。別の実施形態では、造血細胞は、Ｔｈｙ−１＋である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋である。別の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ１３３＋である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋またはＣＤ１３３＋Ｔｈｙ−１＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋造血細胞は、ＣＸＣＲ４＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋造血細胞は、ＣＸＣＲ４−である。別の実施形態では、造血細胞は、ＫＤＲ（血管増殖因子受容体２）について陽性である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋、ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋またはＴｈｙ−１＋ＫＤＲ＋である。ある特定の他の実施形態では、造血細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて陽性である（ＡＬＤＨ＋）。例えば、細胞は、ＣＤ３４＋ＡＬＤＨ＋である。
ある特定の他の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ４５−である。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞、例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−細胞は、ｍｉＲＮＡｓ ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４９および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−６１８の１つもしくは複数、またはすべてを発現する。
ある特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４−である。
造血細胞は、分化系列決定、または発達の自由さ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎａｉｖｅｔｅ）の欠乏を示すある特定のマーカーも欠き得る。例えば、別の実施形態では、造血細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ−である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｔｈｙ−１＋ＨＬＡ−ＤＲ−またはＡＬＤＨ＋ＨＬＡ−ＤＲ−である。別の実施形態では、造血細胞は、細胞系列マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびグリコホリンＡの１つもしくは複数、またはすべてについて陰性である。
したがって、造血細胞は、未分化状態を示すマーカーの存在に基づいて、または少なくとも一部の系列分化が起こったことを示す細胞系列マーカーの非存在に基づいて、本明細書で開示した方法に使用するために選択することができる。固有のマーカーの有無に基づいて、造血細胞を含む、細胞を単離する方法は、以下で詳細に述べる。
本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、実質的に均一な集団、例えば、単一組織供給源に由来する少なくとも約９５％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９９％の造血細胞を含む集団、または同じ造血細胞関連細胞マーカーを示す造血細胞を含む集団であり得る。例えば、様々な実施形態では、造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血または胎盤、例えば、胎盤潅流液に由来する少なくとも約９５％、９８％または９９％の造血細胞を含み得る。
本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、単一個体から、例えば、単一胎盤から、または複数の個体から得ることができ、例えば、プールすることができる。造血細胞を複数の個体から得て、プールする場合、造血細胞は、同じ組織供給源から得ることができる。したがって、様々な実施形態では、プールされた造血細胞は、すべて胎盤、例えば、胎盤潅流液に、すべて胎盤血に、すべて臍帯血に、すべて末梢血などに由来する。
本明細書で開示した方法に使用する造血細胞は、ある特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の組織供給源に由来する造血細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の供給源に由来する造血細胞を、本明細書における方法に使用するために合わせる場合、本明細書で述べた３段階法を使用してナチュラルキラー細胞を製造するために使用する複数の造血細胞は、胎盤、例えば、胎盤潅流液に由来する造血細胞を含む。様々な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞集団および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造するために使用する造血細胞は、胎盤に由来するおよび臍帯血に由来する；胎盤および末梢血に由来する；胎盤および胎盤血または胎盤および骨髄に由来する造血細胞を含む。一実施形態では、造血細胞は、臍帯血に由来する造血細胞と組み合わされた胎盤潅流液に由来する造血細胞を含み、臍帯血および胎盤は、同じ個体に由来する。すなわち、潅流液および臍帯血が一致している。造血細胞が２つの組織供給源に由来する造血細胞を含む実施形態では、供給源に由来する造血細胞は、例えば、１：１０、２：９、３：８、４：７、５：６、６：５、７：４、８：３、９：２、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１または９：１の比で合わせることができる。
５．１．１ 胎盤造血幹細胞
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、胎盤造血細胞である。一実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋である。具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、主として（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、主として（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞である。胎盤造血細胞は、分娩後哺乳類（例えば、ヒト）胎盤から当業者に公知の手段、例えば、潅流により得ることができる。
別の実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ４５−である。具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である。
５．２ ナチュラルキラー細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにナチュラルキラー細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団の製造
本方法によるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびにＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団の製造は、造血細胞の集団を増幅することを含む。細胞増幅中、造血細胞集団内の複数の造血細胞がＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞に分化する。一態様では、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造し、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造し、その後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％、例えば、少なくも８０％が生存している、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の第３の集団からＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、細胞の第４の集団を製造するステップを含み、細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
上記の実施形態のいずれかの、ある特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現する。ある特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＲＯＲγｔもＩＬ１Ｒ１も発現しない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
一態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の第３の集団からＣＤ１１ａ−細胞を単離して、またはＣＤ１１ａ＋細胞を除去して、細胞の第４の集団を製造するステップを含み、細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、ＩＬＣ３細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＲＯＲγｔおよびＩＬ１Ｒ１を発現する。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、パーフォリンもＥＯＭＥＳも発現しない。
５．２．１ ３段階法を使用したＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団の製造
一実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する３段階法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法によりＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造するための、本明細書で述べた、造血細胞の増幅および分化の方法は、１ミリリットル当たり約２×１０４から約６×１０６細胞の前記造血細胞を含む細胞集団を維持することステップを含む。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞を１×１０４〜１×１０５細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞を約３×１０４細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する。
ある特定の態様では、細胞の前記第１の集団を５×１０４〜５×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第１の集団を約１×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する。
ある特定の態様では、細胞の前記第２の集団を１×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。ある特定の態様では、細胞の前記第２の集団を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を約５×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、細胞の前記第２の集団をスピナーフラスコ中で約５×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を約３×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、細胞の前記第２の集団を静的培養で約３×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する。
ある特定の実施形態では、３段階法は、例えば、本明細書で述べたように、第１の培地中で規定の時間にわたり造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造することを含む第１の段階（「段階１」）を含む。ある特定の実施形態では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の実施形態では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。具体的な実施形態では、第１の培地のそれぞれは、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第１の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第１の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第１の培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第１の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第１の培地のそれぞれは、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第１の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）または両方を欠いている。
ある特定の実施形態では、その後、「段階２」において、例えば、本明細書で述べたように、第２の培地中で規定の時間にわたり前記細胞を培養して、細胞の第２の集団を製造する。ある特定の実施形態では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の実施形態では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第２の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第２の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第２の培地は、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第２の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の実施形態では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）または両方を欠いている。
ある特定の実施形態では、その後、「段階３」において、例えば、本明細書で述べたように、第３の培地中で規定の時間にわたり前記細胞を培養して、細胞の第３の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の実施形態では、第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の実施形態では、第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌのうちの１つ、２つまたは３つすべてを欠いている。具体的な実施形態では、第３の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第３の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第３の培地は、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠いている。
具体的な実施形態では、３段階法を使用して、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を製造する。ある特定の実施形態では、３段階法は、間質フィーダー細胞支持の非存在下で行われる。ある特定の実施形態では、３段階法は、外から添加されるステロイド（例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾンまたはその誘導体）の非存在下で行われる。
ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第１の培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド （Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な態様では、第１の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第１の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な態様では、第１の培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第１の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の態様では、前記Ｔｐｏは、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第１の培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１の培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第１の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αまたは両方を欠いている。
ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第２の培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、３段階法に使用する第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な態様では、第２の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第２の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な態様では、第２の培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第２の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の態様では、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第２の培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２の培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第２の培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第２の培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第２の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αまたは両方を欠いている。
ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦおよびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、幹細胞動員剤、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第３の培地は、幹細胞動員剤、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３の培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１００Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３の培地中に、ＳＣＦは、約２２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第３の培地は、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７， ２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている。ある特定の態様では、第３の培地は、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦおよび１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含み、ＳＲ１を欠いている。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、Ｆｌｔ−３Ｌのうちの１つ、２つまたは３つすべてを欠いている。
ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第３の培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
一般的に、個別に列挙する培地成分は、前記培地の組成不明の成分中の可能な成分を指すものでない。例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、血清中に含まれない。さらに、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、血清中に含まれない。
ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地は、ヒト血清ＡＢを含む。ある特定の態様では、前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、１％〜２０％のヒト血清ＡＢ、５％〜１５％のヒト血清ＡＢまたは約２、５もしくは１０％のヒト血清ＡＢを含む。
本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養する。本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、細胞を前記第２の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養する。本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、細胞を前記第３の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日間または３０日を超える期間にわたり培養する。
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２の培地中で前記培養するステップの前に、前記第１の培地中で７〜１３日間培養して、細胞の第１の集団を製造し；細胞の前記第１の集団を、前記第３の培地中で前記培養するステップの前に前記第２の培地中で２〜６日間培養して、細胞の第２の集団を製造し；細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で１０〜３０日間培養する、すなわち、細胞を合計１９〜４９日間培養する。
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２の培地中で前記培養するステップの前に、前記第１の培地中で８〜１２日間培養して、細胞の第１の集団を製造し；細胞の前記第１の集団を、前記第３の培地中で前記培養するステップの前に前記第２の培地中で３〜５日間培養して、細胞の第２の集団を製造し；細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で１５〜２５日間培養する、すなわち、細胞を合計２６〜４２日間培養する。
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２の培地中で前記培養するステップの前に、前記第１の培地中で約１０日間培養して、細胞の第１の集団を製造し；細胞の前記第１の集団を、前記第３の培地中で前記培養するステップの前に前記第２の培地中で約４日間培養して、細胞の第２の集団を製造し；細胞の前記第２の集団を前記第３の培地中で約２１日間培養する、すなわち、細胞を合計約３５日間培養する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する。具体的な態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する。
ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。
ある特定の態様では、３段階法は、ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す前記ＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す前記ＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す前記ＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す前記ＩＬＣ３細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す前記ＩＬＣ３細胞を製造する。
ある特定の態様では、前記第３の培養するステップの後、細胞の前記第３の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞および／またはＩＬＣ３細胞の前記集団を凍結保存する。ある特定の態様では、前記第４の培養するステップの後、細胞の前記第４の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞および／またはＩＬＣ３細胞の前記集団を凍結保存する。
ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書で述べた３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が本明細書で提供される。したがって、本明細書で述べた３段階法により製造された単離ナチュラルキラー細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも６０％のＣＤ１６−細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも８０％のＣＤ１６−細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも２０％のＣＤ９４＋細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも４０％のＣＤ９４＋細胞を含む。
ある特定の態様では、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞の集団が本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
ある特定の態様では、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳのうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞の集団が本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンまたはＥＯＭＥＳのいずれも発現しない。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ２２６および／または２Ｂ４をさらに発現する。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１のうちの１つまたは複数をさらに発現する。ある特定の態様では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ２２６、２Ｂ４、ＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１を発現する。
ある特定の態様では、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに（ｄ）細胞の前記第３の集団からＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を分離するステップ；ならびに（ｅ）ＣＤ１１ａ＋細胞をＣＤ１１ａ−細胞と５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０の比で合わせて、細胞の第４の集団を製造するステップを含む、ナチュラルキラー細胞およびＩＬＣ３細胞を含む細胞集団を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれもヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が２０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１０：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１０の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：２０の比で合わせられている。ある特定の態様では、細胞の第４の集団において、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５０の比で合わせられている。
５．３． 幹細胞動員因子
５．３．１．化学定義
本明細書に記載の幹細胞動員因子についての開示の理解を補助するために、多数の用語が下段にて定義される。
一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに本明細書に記載の生物学、細胞生物学、生化学、有機化学、医化学および薬理学に関する実験手順は、当技術分野において周知の、一般に用いられているものである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を一般に有する。
用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、前記誤差は、前記値が測定または決定される方法に一部依存する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「おおよそ」は、１、２、３または４標準偏差内を意味する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「おおよそ」は、所定の値または範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。
用語「アリール炭化水素受容体」または「ＡＨＲ」は、ヒトにおけるＡＨＲ遺伝子によりコードされているタンパク質、またはその変異体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３５８６９．２およびＡＡＨ７００８０．１を参照されたい）を意味する。
用語「アリール炭化水素受容体アンタゴニスト」、「ＡＨＲアンタゴニスト」、「アリール炭化水素受容体阻害剤」、または「ＡＨＲ阻害剤」は、アリール炭化水素受容体の活性をダウンレギュレートするまたは低下させる化合物を意味する。
用語「アルキル」は、直鎖状のまたは分岐した飽和一価炭化水素ラジカルを意味し、ここでのアルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルキル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルキルと分岐アルキルの両方を包含する。ある特定の実施形態では、アルキルは、炭素原子１〜２０個（Ｃ１〜２０）、１〜１５個（Ｃ１〜１５）、１〜１０個（Ｃ１〜１０）、もしくは１〜６個（Ｃ１〜６）を有する直鎖状の飽和一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した飽和一価炭化水素ラジカルである。本明細書で使用される直鎖状Ｃ１〜６および分岐Ｃ３−６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル（すべての異性体型を含む）、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル（すべての異性体型を含む）、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル（すべての異性体型を含む）、およびヘキシル（すべての異性体型を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ１〜６アルキルは、炭素原子１〜６個の直鎖状の飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。
用語「アルキレン」は、直鎖状のまたは分岐した飽和二価炭化水素ラジカルを意味し、ここでのアルキレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。例えば、Ｃ１〜６アルキレンは、炭素原子１〜６個の直鎖状の飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルキレンは、炭素原子１〜２０個（Ｃ１〜２０）、１〜１５個（Ｃ１〜１５）、１〜１０個（Ｃ１〜１０）、もしくは１〜６個（Ｃ１〜６）を有する直鎖状の飽和二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した飽和二価炭化水素ラジカルである。本明細書で使用される直鎖状Ｃ１〜６および分岐Ｃ３〜６アルキレン基は、「低級アルキレン」とも呼ばれる。アルキレン基の例としては、メチレン、エチレン、プロピレン（すべての異性体型を含む）、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ブチレン（すべての異性体型を含む）、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｔ−ブチレン、ペンチレン（すべての異性体型を含む）、およびヘキシレン（すべての異性体型を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルケニル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３、４または５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した一価炭化水素ラジカルを意味する。アルケニルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルケニル」は、当業者により認識されているように、「シス」および「トランス」立体配置、または代替的に、「Ｚ」および「Ｅ」立体配置を有すラジカルも包含する。本明細書で使用される用語「アルケニル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルケニルと分岐アルケニルの両方を包含する。例えば、Ｃ２〜６アルケニルは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルケニルは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した一価炭化水素ラジカルである。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、アリル、ブテニル、および４−メチルブテニルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルケニレン」は、１つまたは複数、一実施形態では１〜５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した二価炭化水素ラジカルを意味する。アルケニレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルケニレン」は、当業者により認識されているように、「シス」もしくは「トランス」立体配置もしくはこれらの混合配置、または代替的に、「Ｚ」もしくは「Ｅ」立体配置もしくはこれらの混合配置を有すラジカルを包含する。例えば、Ｃ２〜６アルケニレンは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルケニレンは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した二価炭化水素ラジカルである。アルケニレン基の例としては、エテニレン、アリレン、プロペニレン、ブテニレン、および４−メチルブテニレンが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルキニル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３、４または５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した一価炭化水素ラジカルを意味する。アルキニルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルキニル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルキニルと分岐アルキニルの両方を包含する。ある特定の実施形態では、アルキニルは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した一価炭化水素ラジカルである。アルキニル基の例としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）およびプロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ２〜６アルキニルは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。
用語「アルキニレン」は、１つまたは複数、一実施形態では１〜５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した二価炭化水素ラジカルを意味する。アルキニレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。例えば、Ｃ２〜６アルキニレンは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルキニレンは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した二価炭化水素ラジカルである。アルキニレン基の例としては、エチニレン、プロピニレン（すべての異性体型、例えば、１−プロピニレンおよびプロパルギレンを含む）、ブチニレン（すべての異性体型、例えば、１−ブチン−１−イレンおよび２−ブチン−１−イレンを含む）、ペンチニレン（すべての異性体型、例えば、１−ペンチン−１−イレンおよび１−メチル−２−ブチン−１−イレンを含む）、およびヘキシニレン（すべての異性体型、例えば、１−ヘキシン−１−イレンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「シクロアルキル」は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている、環式飽和または非芳香族不飽和、架橋または非架橋一価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、シクロアルキルは、環式不飽和架橋または非架橋一価炭化水素ラジカルである。ある特定の実施形態では、シクロアルキルは、炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、または３〜７個（Ｃ３〜７）を有する。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、デカリニル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「シクロアルキレン」は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている、環式二価炭化水素ラジカルを意味する。一実施形態では、シクロアルキル基は、飽和している、もしくは不飽和だが非芳香族の、および／または架橋している、および／もしくは非架橋の、および／または縮合している二環式の基である。ある特定の実施形態では、シクロアルキレンは、炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、または３〜７個（Ｃ３〜７）を有する。シクロアルキレン基の例としては、シクロプロピレン（例えば、１，１−シクロプロピレンおよび１，２−シクロプロピレン）、シクロブチレン（例えば、１，１−シクロブチレン、１，２−シクロブチレン、または１，３−シクロブチレン）、シクロペンチレン（例えば、１，１−シクロペンチレン、１，２−シクロペンチレン、または１，３−シクロペンチレン）、シクロヘキシレン（例えば、１，１−シクロヘキシレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、または１，４−シクロヘキシレン）、シクロヘプチレン（例えば、１，１−シクロヘプチレン、１，２−シクロヘプチレン、１，３−シクロヘプチレン、または１，４−シクロヘプチレン）、デカリニレン、およびアダマンチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香族炭化水素環を含有する、単環式芳香族炭素環基および／または多環式一価芳香族炭素環基を意味する。ある特定の実施形態では、アリールは、環原子６〜２０個（Ｃ６〜２０）、６〜１５個（Ｃ６〜１５）、または６〜１０個（Ｃ６〜１０）を有する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニル、およびテルフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、用語「アリール」は、環の１つが芳香族であり、その他が、飽和されていてもよく、部分不飽和であってもよく、または芳香族であってよい、二環式または三環式炭素環、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニル、またはテトラヒドロナフチル（テトラリニル）を意味する。アリールは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「アリーレン」は、少なくとも１つの芳香族炭素環を含有する、二価単環式芳香族基および／または二価多環式芳香族基を意味する。ある特定の実施形態では、アリーレンは、環原子６〜２０個（Ｃ６〜２０）、６〜１５個（Ｃ６〜１５）、または６〜１０個（Ｃ６〜１０）を有する。アリーレン基の例としては、フェニレン、ナフチレン、フルオレニレン、アズレニレン、アントリレン、フェナントリレン、ピレニレン、ビフェニレン、およびテルフェニレンが挙げられるが、これらに限定されない。アリーレンはまた、環の１つが芳香族であり、その他が、飽和されていてもよく、部分不飽和であってもよく、または芳香族であってよい、二環式または三環式炭素環、例えば、ジヒドロナフチレン、インデニレン、インダニレン、またはテトラヒドロナフチレン（テトラリニレン）を意味する。アリーレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「アラルキル」または「アリールアルキル」は、１つまたは複数のアリール基で置換されている一価アルキル基を意味する。ある特定の実施形態では、アラルキルは、炭素原子７〜３０個（Ｃ７〜３０）、７〜２０個（Ｃ７〜２０）、または７〜１６個（Ｃ７〜１６）を有する。アラルキル基の例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、および３−フェニルプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。アラルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「ヘテロアリール」は、各々がＯ、Ｓ、ＮおよびＰから独立に選択される１個または複数のヘテロ原子を環内に含有する少なくとも１つの芳香族環を含有する一価単環式芳香族基または一価多環式芳香族基を意味する。明確にするために、本明細書で使用される用語「アリール」および「ヘテロアリール」は相互排他的である、すなわち、「アリール」基は「ヘテロアリール」基を含まず、逆もまた同様である。ヘテロアリール基は、その芳香族環によって分子の残部に結合している。ヘテロアリール基の各環は、１もしくは２個のＯ原子、１もしくは２個のＳ原子、１〜４個のＮ原子、および／または１もしくは２個のＰ原子を含有することができるが、ただし、各環内のヘテロ原子の総数が４以下であること、および各環が少なくとも１個の炭素原子を含有することを条件とする。ある特定の実施形態では、ヘテロアリールは、５〜２０個、５〜１５個、または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例としては、フラニル、イミダゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、テトラゾリル、トリアジニル、およびトリアゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾピラニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フロピリジル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インドリジニル、インドリル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソベンゾチエニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、オキサゾロピリジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピリドピリジル、ピロロピリジル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、チアジアゾロピリミジル、およびチエノピリジルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリール基の例としては、アクリジニル、ベンゾインドリル、カルバゾリル、ジベンゾフラニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナントリジニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、およびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「ヘテロアリーレン」は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個または複数のヘテロ原子を環内に含有する少なくとも１つの芳香族環を含有する二価単環式芳香族基または二価多環式芳香族基を意味する。明確にするために、本明細書で使用される用語「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は相互排他的である、すなわち、「アリーレン」基は「ヘテロアリーレン」基を含まず、逆もまた同様である。ヘテロアリーレン基は、その芳香族環によって分子の残部に結合している。ヘテロアリーレン基の各環は、１もしくは２個のＯ原子、１もしくは２個のＳ原子、および／または１〜４個のＮ原子を含有することができるが、ただし、各環内のヘテロ原子の総数が４以下であること、および各環が少なくとも１個の炭素原子を含有することを条件とする。ある特定の実施形態では、ヘテロアリーレンは、５〜２０個、５〜１５個、または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリーレン基の例としては、フラニレン、イミダゾリレン、イソチアゾリレン、イソオキサゾリレン、オキサジアゾリレン、オキサジアゾリレン、オキサゾリレン、ピラジニレン、ピラゾリレン、ピリダジニレン、ピリジレン、ピリミジニレン、ピロリレン、チアジアゾリレン、チアゾリレン、チエニレン、テトラゾリレン、トリアジニレン、およびトリアゾリレンが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリーレン基の例としては、ベンゾフラニレン、ベンゾイミダゾリレン、ベンゾイソオキサゾリレン、ベンゾピラニレン、ベンゾチアジアゾリレン、ベンゾチアゾリレン、ベンゾチエニレン、ベンゾトリアゾリレン、ベンゾオキサゾリレン、フロピリジレン、イミダゾピリジニレン、イミダゾチアゾリレン、インドリジニレン、インドリレン、インダゾリレン、イソベンゾフラニレン、イソベンゾチエニレン、イソインドリレン、イソキノリニレン、イソチアゾリレン、ナフチリジニレン、オキサゾロピリジニレン、フタラジニレン、プテリヂニレン、プリニレン、ピリドピリジレン、ピロロピリジレン、キノリニレン、キノキサリニレン、キナゾリニレン、チアジアゾロピリミジレン、およびチエノピリジレンが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリーレン基の例としては、アクリジニレン、ベンゾインドリレン、カルバゾリレン、ジベンゾフラニレン、ペリミジニレン、フェナントロリニレン、フェナントリジニレン、フェナルサジニレン、フェナジニレン、フェノチアジニレン、フェノキサジニレン、およびキサンテニレンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリーレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、非芳香族環原子の１個または複数がヘテロ原子であり、これらのヘテロ原子の各々が、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰから独立に選択され、残りの環原子が炭素原子である少なくとも１つの非芳香族環を含有する一価単環式非芳香族環系または一価多環式環系を意味する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリルまたは複素環式基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個、または５〜６個の環原子を有する。ヘテロシクリル基は、その非芳香族環によって分子の残部に結合している。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリルは、スピロであってもよく、縮合していてもよく、または架橋していてもよい、単環式、二環式、三環式、または四環式環系であり、ここで、窒素または硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子が任意選択で四級化されていてもよく、一部の環が部分的にもしくは完全に飽和していてもよく、または芳香族であってもよい。ヘテロシクリルは、安定した化合物を生じさせる結果となるいずれのヘテロ原子または炭素原子で主構造に結合していてもよい。複素環式基の例としては、アゼピニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、β−カルボリニル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロピラニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、１，４−ジチアニル、フラノニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキシラニル、ピペラジニル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロロリジニル、ピロロリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロキノリニル、および１，３，５−トリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「ヘテロシクリレン」は、非芳香族環原子の１個または複数が、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子が炭素原子である少なくとも１つの非芳香族環を含有する二価単環式非芳香族環系または二価多環式環系を意味する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリレン基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個、または５〜６個の環原子を有する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリレンは、縮合または架橋していてもよい、単環式、二環式、三環式、または四環式環系であり、ここで、窒素または硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子が任意選択で四級化されていてもよく、一部の環が部分的にもしくは完全に飽和されていてもよく、または芳香族であってもよい。ヘテロシクリレンは、安定した化合物を生じさせる結果となるいずれのヘテロ原子または炭素原子で主構造に結合していてもよい。そのようなヘテロシクリレン基の例としては、アゼピニレン、ベンゾジオキサニレン、ベンゾジオキソリレン、ベンゾフラノニレン、ベンゾピラノニレン、ベンゾピラニレン、ベンゾテトラヒドロフラニレン、ベンゾテトラヒドロチエニレン、ベンゾチオピラニレン、ベンゾキサジニレン、β−カルボニレン、クロマニレン、クロモニレン、シンノリニレン、クマリニレン、デカヒドロイソキノリニレン、ジヒドロベンゾイソチアジニレン、ジヒドロベンゾイソオキサジニレン、ジヒドロフリレン、ジヒドロイソインドリレン、ジヒドロピラニレン、ジヒドロピラゾリレン、ジヒドロピラジニレン、ジヒドロピリジニレン、ジヒドロピリミジニレン、ジヒドロピロリレン、ジオキソラニリレン、１，４−ジチアニレン、フラノニレン、イミダゾリジニレン、イミダゾリニレン、インドリニレン、イソベンゾテトラヒドロフラニレン、イソベンゾテトラヒドロチエニレン、イソクロマニレン、イソクマリニレン、イソインドリニレン、イソチアゾリジニレン、イソオキサゾリジニレン、モルホリニレン、オクタヒドロインドリレン、オクタヒドロイソインドリレン、オキサゾリジノニレン、オキサゾリジニレン、オキシラニレン、ピペラジニレン、ピペリジニレン、４−ピペリドニレン、ピラゾリジニレン、ピラゾリニレン、ピロリジニレン、ピロリニレン、キヌクリジニレン、テトラヒドロフリレン、テトラヒドロイソキノリニレン、テトラヒドロピラニレン、テトラヒドロチエニレン、チアモルホリニレン、チアゾリジニレン、テトラヒドロキノリニレン、および１，３，５−トリチアニレンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「ハロゲン」、「ハロゲン化物」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素および／またはヨウ素を意味する。
用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２または３つのハロ基で置換されているアルキル基を意味し、この場合のアルキルは、本明細書で定義される通りである。ハロアルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルを意味し、この場合のアルキルは、本明細書で定義される通りである。
用語「ハロアルコキシ」は、−Ｏ−ハロアルキルを意味し、この場合のハロアルキルは、本明細書で定義される通りである。
用語「任意選択で置換されている」は、基または置換基、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、アリール、アリーレン、アラルキル（例えば、ベンジル）、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリレン基が、１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよいことを意味することを意図したものであり、前記１つまたは複数の置換基Ｑの各々は、例えば、（ａ）オキソ（＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、ハロ、およびニトロ（−ＮＯ２）、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル［これらの各々は、１つまたは複数の、一実施形態では１、２、３、４もしくは５つの置換基Ｑａで、さらに任意選択で置換されている］、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＣ（＝ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲｄ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−Ｐ（Ｏ）ＲａＲｄ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｒｄ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｄ）、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ［これらの式中の各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立に、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル（これらの各々は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａで任意選択で置換されている）であり、または（ｉｉｉ）ＲｂおよびＲｃは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルを形成し、前記ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルの各々は、１つまたは複数の、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａで、任意選択で置換されている］から独立に選択される。本明細書で使用される、置換されていてもよい本明細書に記載のすべての基は、別段の規定がない限り、「任意選択で置換されている」。
一実施形態では、各置換基Ｑａは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ；ならびに（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル；ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−Ｐ（Ｏ）ＲｅＲｈ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）Ｒｈ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）（ＯＲｈ）、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ［これらの式中の各Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、独立に、（ｉ）水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであるか、または（ｉｉ）ＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルを形成する］からなる群から独立に選択される。
ある特定の実施形態では、「光学活性の」および「鏡像異性的に活性の」は、約５０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９．５％以上、または約９９．８％以上の鏡像体過剰率を有する分子の一群を意味する。ある特定の実施形態では、化合物は、問題の２つの鏡像異性体の総重量に基づいて約９５％以上の望ましい鏡像異性体と約５％以下の然程好ましくない鏡像異性体とを含む。
光学活性化合物を記載する際、光学活性化合物のそのキラル中心の周りの絶対配置を示すために、接頭語ＲおよびＳが使用される。（＋）および（−）は、光学活性化合物の旋光性、すなわち、偏光面が光学活性化合物により回転される方向を示すために使用される。（−）という接頭語は、光学活性化合物が左旋性であること、すなわち、前記化合物が偏光面を左にまたは反時計回りに回転させることを示す。（＋）という接頭語は、光学活性化合物が右旋性であること、すなわち、前記化合物が偏光面を右にまたは時計回りに回転させることを示す。しかし、旋光性の符号、（＋）および（−）は、化合物の絶対配置、ＲおよびＳとは無関係である。
用語「同位体異型」は、化合物を構成する原子のうちの１個または複数に関して非天然の同位体比率を有する当該化合物を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、水素（１Ｈ）、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、炭素１１（１１Ｃ）、炭素１２（１２Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、炭素１４（１４Ｃ）、窒素１３（１３Ｎ）、窒素１４（１４Ｎ）、窒素１５（１５Ｎ）、酸素１４（１４Ｏ）、酸素１５（１５Ｏ）、酸素１６（１６Ｏ）、酸素１７（１７Ｏ）、酸素１８（１８Ｏ）、フッ素１７（１７Ｆ）、フッ素１８（１８Ｆ）、リン３１（３１Ｐ）、リン３２（３２Ｐ）、リン３３（３３Ｐ）、硫黄３２（３２Ｓ）、硫黄３３（３３Ｓ）、硫黄３４（３４Ｓ）、硫黄３５（３５Ｓ）、硫黄３６（３６Ｓ）、塩素３５（３５Ｃｌ）、塩素３６（３６Ｃｌ）、塩素３７（３７Ｃｌ）、臭素７９（７９Ｂｒ）、臭素８１（８１Ｂｒ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素１２７（１２７Ｉ）、ヨウ素１２９（１２９Ｉ）およびヨウ素１３１（１３１Ｉ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、安定した形態、すなわち、非放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、水素（１Ｈ）、重水素（２Ｈ）、炭素１２（１２Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、窒素１４（１４Ｎ）、窒素１５（１５Ｎ）、酸素１６（１６Ｏ）、酸素１７（１７Ｏ）、酸素１８（１８Ｏ）、フッ素１７（１７Ｆ）、リン３１（３１Ｐ）、硫黄３２（３２Ｓ）、硫黄３３（３３Ｓ）、硫黄３４（３４Ｓ）、硫黄３６（３６Ｓ）、塩素３５（３５Ｃｌ）、塩素３７（３７Ｃｌ）、臭素７９（７９Ｂｒ）、臭素８１（８１Ｂｒ）およびヨウ素１２７（１２７Ｉ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、不安定な形態、すなわち、放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、三重水素（３Ｈ）、炭素１１（１１Ｃ）、炭素１４（１４Ｃ）、窒素１３（１３Ｎ）、酸素１４（１４Ｏ）、酸素１５（１５Ｏ）、フッ素１８（１８Ｆ）、リン３２（３２Ｐ）、リン３３（３３Ｐ）、硫黄３５（３５Ｓ）、塩素３６（３６Ｃｌ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素１２９（１２９Ｉ）およびヨウ素１３１（１３１Ｉ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。当業者の判断に従って実行可能な場合、本明細書で提供されるような化合物中の、いずれの水素が例えば２Ｈであってもよく、またはいずれの炭素が例えば１３Ｃであってもよく、またはいずれの窒素が例えば１５Ｎであってもよく、またはいずれの酸素が例えば１８Ｏであってもよいことは、理解されるであろう。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、重水素（Ｄ）の非天然比率を有する。
用語「溶媒和物」は、溶質、例えば本明細書で提供される化合物、の１つまたは複数の分子と溶媒の１つまたは複数の分子とで形成された、化学量論量もしくは非化学量論量で存在する、複合体または凝集体を意味する。好適な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールおよび酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、溶媒は、薬学的に許容されるものである。一実施形態では、複合体または凝集体は、結晶形態である。別の実施形態では、複合体または凝集体は、非結晶形態である。溶媒が水である場合、溶媒和物は、水和物である。水和物の例としては、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、四水和物、および五水和物が挙げられるが、これらに限定されない。
句「その鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ」は、句「（ｉ）その中で言及されている化合物の鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしく同位体異型、（ｉｉ）その中で言及されている化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ、または（ｉｉｉ）その中で言及されている化合物の鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型の、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ」と同じ意味を有する。
５．３．２．幹細胞動員化合物
一実施形態では、幹細胞動員化合物は、アリール炭化水素受容体阻害剤、例えば、アリール炭化水素受容体アンタゴニストである。
別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（特許文献４）、（特許文献５）および（特許文献６）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、５，６−縮合ヘテロアリール化合物であり、前記特許文献の各々についての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式Ｉの化合物：
(I)
（式中、
Ｇ１は、ＮおよびＣＲ３であり、
Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、各々独立に、ＣＨおよびＮであり、ただし、Ｇ３およびＧ４の少なくとも一方がＮであり、Ｇ１およびＧ２の少なくとも一方がＮでないことを条件とし、
Ｌ１は、−ＮＲ１ａ−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）１〜３−、−ＮＲ１ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２ＮＲ１ｃ−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２Ｓ−、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、または−ＮＲ１ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、
Ｒ１は、（ｉ）水素であるか、または（ｉｉ）フェニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、イミダゾピリジニルもしくはベンゾチエニル（これらの各々は、１、２もしくは３つの置換基により任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、シアノ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａである）であり、
Ｒ２は、（ｉ）−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃ、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであるか、または（ｉｉ）フェニル、ピロロピリジン−３−イル、インドリル、チエニル、ピリジニル、１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、もしくはインダゾリル（これらの各々は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、ヒドロキシル、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜３ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＮＲ１ａＳ（Ｏ）２Ｒ１ｂ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂである）であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜４アルキル、またはビフェニルであり、ただし、Ｒ１およびＲ３の少なくとも一方が水素でないことを条件とし、
Ｒ４は、Ｃ１〜１０アルキル、プロパ−１−エン−２−イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチル、または１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルであり、これらの各々は、１、２もしくは３つの置換基で任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、またはＣ１〜４ハロアルキルであり、ならびに
各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、独立に、水素もしくはＣ１〜４アルキルであるか、またはＲ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成する）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
一実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、Ｇ２は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２およびＧ３は、各々Ｎであり、Ｇ４は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２およびＧ４は、各々Ｎであり、Ｇ３は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２は、ＣＨであり、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに実施形態では、式Ｉ中、
Ｇ１は、ＣＨであり、
Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、
Ｒ１は、１、２または３つの置換基により任意選択で置換されているベンゾチエニルであり、これらの置換基の各々は、独立に、シアノ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、
Ｒ２は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されているフェニルであり、これらの置換基の各々は、独立に、ヒドロキシル、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜３ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＮＲ１ａＳ（Ｏ）２Ｒ１ｂ、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであり、
Ｒ４は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキルであり、これらの置換基の各々は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキルまたはＣ１〜４ハロアルキルであり、
Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２−であり、ならびに
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＩの化合物：
(II)
（式中、Ｒ２およびＲ４は、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＩＩの化合物：
(III)
（式中、Ｒ２およびＲ４は、各々、本明細書で定義される通りであり、ならびにＲ５ａ、Ｒ５ｂおよびＲ５ｃは、各々独立に、水素、シアノ、メチル、ハロ、トリフルオロメチル、または−ＳＯ２ＣＨ３である）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、４−（２−（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）である：
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、１−メチル−Ｎ−（２−メチル−（４−（２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミドである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する、ＣＨ２２３１９１である：
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、ピリミド（４，５−ｂ）インドールである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＶの化合物：
(IV)
｛式中、
Ｚは、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ベンジル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
Ｗは、水素、ハロ、シアノ、Ｃ６〜１４アリール、ベンジル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−ＯＨ、−Ｌ−ＯＲ１ａ、−Ｌ−ＮＨ２、−Ｌ−ＮＨＲ１ａ、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−ＳＲ１ａ、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＲ１ａ、−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＯＲ１ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−ＮＲ１ｃＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−ＯＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、または−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ１ａであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレン、Ｃ２〜６アルケニレン、Ｃ２〜６アルキニレン、Ｃ３〜７シクロアルキレン、Ｃ６〜１４アリーレン、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリレン、Ｃ１〜６アルキレン−Ｃ３〜７シクロアルキレン、またはＣ１〜６アルキレン−ヘテロシクリレンであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１４アリール、ベンジル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、または−Ｌ−ヘテロシクリルであり、
各ｎは、独立に、１、２、３、４または５の整数であり、ならびに
各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、独立に、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２−〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであり、または（ｉｉｉ）Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成し、
各アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリレンは、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３または４つの置換基Ｑで任意選択で置換されており、各置換基Ｑは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル［これらの各々は、１つ複数の、一実施形態では１、２、３または４つの置換基Ｑａで、さらに任意選択で置換されている］、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＣ（＝ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲｄ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ［これらの式中、各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立に（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル（これらの各々は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａでさらに任意選択で置換されている）であり、または（ｉｉｉ）ＲｂおよびＲｃは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成し、前記ヘテロシクリルは、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａでさらに任意選択で置換されている］から独立に選択され、
各Ｑａは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ、ならびに（ｂ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ［これらの式中、各Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、独立して、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであり、または（ｉｉ）ＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成する］からなる群から独立して選択される｝
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式Ｖの化合物：
(V)
（式中、Ｒ６、Ｗ、およびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
一実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、
Ｚは、シアノ、ヘテロアリール、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、
Ｗは、ヘテロシクリル、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−ＮＨＲ１ａ、または−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ３〜７シクロアルキレンであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ベンジル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、または−Ｌ−ヘテロアリールであり、
各ｎは、独立に、１の整数であり、ならびに
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りであり、
各アルキル、アルキレン、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書で定義される通りの１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
別の実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、
Ｚは、シアノ、５員ヘテロアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−〜６アルキルであり、
Ｗは、ヘテロシクリル、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−ＮＨＲ１ａ、または−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ３〜７シクロアルキレンであり、
Ｒ６は、水素、メチル、ベンジル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、または−Ｌ−ヘテロアリールであり、
各ｎは、独立に、１の整数であり、ならびに
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りであり、
各アルキレン、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書で定義される通りの１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
一実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、Ｗは、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、または−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、Ｒ６、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、ＬおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＶＩの化合物：
(VI)
（式中、Ｘは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１ｃであり、Ｒ１ａ、Ｒ１ｃ、Ｒ６、ＬおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＶＩＩの化合物：
(VII)
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ６、Ｌ、ＸおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する化合物である：
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する化合物である：
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、レスベラトロール、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、アルファナフトフラボン、３’−メトキシ−４’−ニトロフラボン、３，４−ジメトキシフラボン、４’，５，７−トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、６−メチル−１，３，８−トリクロロジベンゾフラン、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、レスベラトロールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（Ｚ）−レスベラトロールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（Ｅ）−レスベラトロールである。
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である。
本明細書に記載の化合物のすべては、市販されているか、または本明細書で開示される特許または特許公報に記載されている方法に従って調製することができる。さらに、公知の分割剤もしくはキラルカラムおよび他の標準的な合成有機化学技術を使用して、光学的に純粋な化合物を不斉合成または分割することができる。幹細胞動員化合物、それらの調製法および使用に関する追加情報は、例えば、（特許文献４）、（特許文献５）および（特許文献６）、ならびに（非特許文献４）において見つけることができ、これらの参考文献の各々についての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
本明細書で提供される式、例えば、式Ｉ〜ＶＩＩ中の基または可変要素、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、Ｒ６、Ｘ、Ｌ、Ｌ１、Ｘ、Ｗ、Ｚおよびｎは、本明細書に記載の実施形態の中でさらに定義される。そのような基および／または可変要素について本明細書で提供される実施形態のすべての組合せは、本開示の範囲内である。
ある特定の実施形態では、Ｇ１は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＣＲ３であり、この式中のＲ３は、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｇ２は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｇ３は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｇ４は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ４は、ＣＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフラニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチエニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリミジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリダジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンゾイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイソキノリニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイミダゾピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンゾチエニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロロピリジン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているインドリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチエニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている１，２，４−トリアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−オキソイミダゾリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているインダゾリルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているビフェニルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているプロパ−１−エン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているシクロヘキシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているシクロプロピルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているオキセタン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンズヒドリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロフラン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルである。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）１〜３−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２ＮＲ１ｃ−であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２Ｓ−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで各々任意選択で置換されている、エチレン、プロピレンまたはブチレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルケニレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルキニレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ３〜７シクロアルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているシクロヘキシレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリーレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリーレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレン−Ｃ３〜７シクロアルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレン−ヘテロシクリレンである。
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｗは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｗは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリレンである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＯＨであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＮＨ２であり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬ、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｃおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＯＲ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＮＨ２であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｚは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルキニルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ３〜１０シクロアルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ７〜１５アラルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている５員ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているテトラゾイルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている１，２，４−オキサジアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、Ｘは、結合である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｓである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＮＲ１ｃであり、この式中のＲ１ｃは、本明細書で定義される通りである。
ある特定の実施形態では、ｎは、１である。ある特定の実施形態では、ｎは、２である。ある特定の実施形態では、ｎは、３である。ある特定の実施形態では、ｎは、４である。ある特定の実施形態では、ｎは、５である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物は、ＡＨＲのアンタゴニストとしての活性を示す。
本明細書で提供される化合物は、鏡像異性的に純粋であり、例えば、単一の鏡像異性体もしくは単一のジアステレオマーであってもよく、または立体異性体混合物、例えば、鏡像異性体の混合物、例えば、２つの鏡像異性体のラセミ混合物、もしくは２つ以上のジアステレオマーの混合物であってもよい。したがって、化合物のその（Ｒ）形態での投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでエピマー化される化合物については、前記化合物のその（Ｓ）形態での投与と等価であることが当業者に認識されよう。個々の鏡像異性体の従来の調製／単離技術としては、好適な光学的に純粋な前駆体からの合成、アキラル出発物質からの不斉合成、または鏡像異性体混合物の分割、例えば、キラルクロマトグラフィー、再結晶、分割、ジアステレオマー塩形成、もしくはジアステレオマー付加体への誘導体化、その後の分離が挙げられる。
５．４．ＮＫ細胞の単離
ナチュラルキラー細胞を単離する方法は当技術分野において公知であり、そのような方法を使用して、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞を単離することができる。例えば、ＮＫ細胞は、例えば、一実施形態ではＣＤ５６およびＣＤ３に対する抗体で、細胞を染色すること、およびＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞について選択することにより、単離または富化することができる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞について富化される。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、市販のキット、例えば、ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、単離することができる。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、ＮＫ細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞、を含む細胞集団内のＮＫ細胞以外の細胞の除去により、単離または富化することもできる。例えば、ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞を、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ ＤＲおよび／またはＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）のうちの１つまたは複数に対する抗体を使用して、非ＮＫ細胞マーカーを提示する細胞を枯渇させることにより、単離または富化してもよい。市販のキット、例えば、ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ネガティブアイソレーションを行うことができる。これらの方法により単離された細胞を、例えば、ＣＤ１１ａ＋細胞とＣＤ１１ａ−細胞、および／またはＣＤ１１７＋細胞とＣＤ１１７−細胞、および／またはＣＤ１６＋細胞とＣＤ１６−細胞、および／またはＣＤ９４＋とＣＤ９４−を分離するために、さらに選別してもよい。ある特定の実施形態では、細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法により製造された細胞は、ＣＤ１１ａ＋細胞とＣＤ１１ａ−細胞を分離するために選別される。具体的な実施形態では、ＣＤ１１ａ＋細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ１１ａ＋細胞について富化される。具体的な実施形態では、ＣＤ１１ａ−細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ１１ａ−細胞について富化される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１１７＋細胞とＣＤ１１７−細胞を分離するために選別される。具体的な実施形態では、ＣＤ１１７＋細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ１１７＋細胞について富化される。具体的な実施形態では、ＣＤ１１７−細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている３段階法を使用して産生された全細胞と比較して、ＣＤ１１７−細胞について富化される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１６＋細胞とＣＤ１６−細胞を分離するために選別される。具体的な実施形態では、ＣＤ１６＋細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ１６＋細胞について富化される。具体的な実施形態では、ＣＤ１６−細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている３段階法を使用して産生された全細胞と比較して、ＣＤ１６−細胞について富化される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ９４＋細胞とＣＤ９４−細胞を分離するために選別される。具体的な実施形態では、ＣＤ９４＋細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ９４＋細胞について富化される。具体的な実施形態では、ＣＤ９４−細胞が単離される。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている３段階法を使用して産生された全細胞と比較して、ＣＤ９４−細胞について富化される。ある特定の実施形態では、単離は、磁気分離を使用して行われる。ある特定の実施形態では、単離は、フローサイトメトリーを使用して行われる。
ＩＬＣ３細胞を単離する方法は当技術分野において公知であり、そのような方法を使用して、ＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞を単離することができる。例えば、ＩＬＣ３細胞は、例えば、一実施形態ではＣＤ５６、ＣＤ３およびＣＤ１１ａに対する抗体で、細胞を染色すること、およびＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−細胞について選択することにより、単離または富化することができる。ＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、ＩＬＣ３細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞、を含む細胞集団内のＩＬＣ３細胞以外の細胞の除去により、単離または富化することもできる。例えば、ＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞を、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ９４、ＣＤ１２３、ＨＬＡ ＤＲおよび／またはＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）のうちの１つまたは複数に対する抗体を使用して、非ＩＬＣ３細胞マーカーを提示する細胞を枯渇させることにより、単離または富化してもよい。これらの方法により単離された細胞を、例えばＣＤ１１７＋細胞とＣＤ１１７−細胞を分離するために、さらに選別してもよい。ＮＫ細胞は、例えば、一実施形態ではＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ９４およびＣＤ１１ａに対する抗体で、細胞を染色すること、およびＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について選択することにより、単離または富化することができる。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、ＮＫ細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞、を含む細胞集団内のＮＫ細胞以外の細胞の除去により、単離または富化することもできる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について富化される。
一実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−細胞について選択することにより単離または富化される。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−細胞について富化される。一実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＣＤ１１７＋細胞について選択することにより単離または富化される。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＣＤ１１７＋細胞について富化される。一実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＣＤ１１７＋ＣＤＩＬ１Ｒ１＋細胞について選択することにより単離または富化される。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＣＤ１１７＋ＣＤＩＬ１Ｒ１＋細胞について富化される。
一実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について選択することにより単離または富化される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について富化される。一実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ１１７−細胞について選択することにより単離または富化される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された全細胞と比較して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ１１７−細胞について富化される。
細胞分離は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または、一実施形態では、特異的抗体とコンジュゲートしたマイクロビーズを使用する磁気細胞選別により、遂行することができる。例えば、１つまたは複数の特異的抗体、例えば抗ＣＤ５６抗体、を含む磁気ビーズ（例えば、直径約０．５〜１００μｍ）に結合する粒子の能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して、細胞を単離してもよい。磁気細胞分離は、例えば、ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、行うことおよび自動化することができる。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む、様々な有用な修飾を、磁気マイクロスフェアに対して行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合して、結合させる。次いで、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を取り出す。一実施形態では、次いでこれらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再混合する。細胞を再び磁場に通し、両方の抗体に結合している細胞を単離する。次いで、そのような細胞をクローン単離のために別々のディッシュ、例えばマイクロターターディッシュに入れて希釈することができる。
５．５．胎盤潅流液
ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団は、任意の源、例えば、胎盤組織、胎盤潅流液、臍帯血、胎盤血、抹消血、脾臓、肝臓などからの、造血細胞、例えば造血幹または前駆細胞から製造することができる。ある特定の実施形態では、造血幹細胞は、胎盤潅流液からの造血幹細胞と、前記胎盤潅流液を生じさせるために使用されたのと同じ胎盤からの臍帯血からの造血幹細胞とを合わせたものである。例えば、（特許文献７）および（特許文献８）、ならびに（特許文献９）に開示されている方法により得ることができる、胎盤潅流液細胞を含む胎盤潅流液。前記特許文献の開示は、それら全体が本明細書に組み入れられている。
５．５．１．細胞収集組成物
造血幹または前駆細胞を単離することができる胎盤潅流液および潅流液細胞、あるいは腫瘍抑制に有用な、または腫瘍細胞、がんもしくはウイルス感染症を有する個体の処置に有用な胎盤潅流液および潅流液細胞、例えば、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書で提供される３段階法に従って製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団との組合せでの前記胎盤潅流液および潅流液細胞は、胎盤細胞収集組成物を使用する哺乳動物分娩後胎盤、例えばヒト分娩後胎盤の潅流により、収集することができる。潅流液は、任意の生理学的に許容される溶液、例えば、生理食塩水、培養培地、またはより複雑な細胞収集組成物を用いる胎盤の潅流により、胎盤から収集することができる。胎盤の潅流にならびに潅流液細胞の収集および保存に好適な細胞収集組成物は、関連する（特許文献１０）に詳細に記載されており、前記特許文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
細胞収集組成物は、幹細胞の収集および／または培養に好適な任意の生理学的に許容される溶液、例えば、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブス溶液、変性クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含むことができる。
細胞収集組成物は、収集時から培養時までの胎盤細胞の保存、すなわち胎盤細胞の死滅の防止、または胎盤細胞の死滅の遅延、死滅する細胞集団内の胎盤細胞の数の低減などに役立つ、１つまたは複数の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウム、降圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンもしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバミン酸、もしくはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素担持ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であり得る。
細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、神経プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼなどを含むことができる。そのような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）からのコラゲナーゼなど）、ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
細胞収集組成物は、殺菌または静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある特定の非限定的実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムもしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシンもしくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）菌、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，）などに対して活性である。
細胞収集組成物はまた、次の化合物のうちの１つまたは複数を含むことができる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、２０，０００ダルトンより高い分子量の高分子、一実施形態では、内皮完全性および細胞生存率を維持するのに十分な量で存在する前記高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、もしくは約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成もしくは天然に存在するコロイド、多糖類、例えばデキストラン、もしくはポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣもしくはビタミンＥ）、還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）、細胞へのカルシウム侵入を防止する薬剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）、ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）、抗凝固薬、一実施形態では残留血の凝固の防止を補助するのに十分な量で存在する前記抗凝固薬（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン）、またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドもしくはイソブチルアミロライド）。
５．５．２．胎盤の収集および処理
一般に、ヒト胎盤は、産後、その娩出直後に回収される。一実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセント後かつ患者の全病歴を聴取し、胎盤と関連付けた後に、患者から回収される。一実施形態では、前記病歴は、分娩後も継続する。
潅流液の回収前に、臍帯血および胎盤血は除去される。ある特定の実施形態では、分娩後に胎盤内の臍帯血が回収される。胎盤を従来の臍帯血回収プロセスに付してもよい。概して、針またはカニューレを使用して、重量を活用して、胎盤を瀉血する（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、（特許文献１１）；ヘッセル（Ｈｅｓｓｅｌ）ら、（特許文献１２）を参照されたい）。針およびカニューレを通常は臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかに揉んで胎盤からの臍帯血の排出を補助することができる。そのような臍帯血回収は、商業的に行われることもある、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ Ｉｎｃ．、Ｃｅｄａｒ Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＣｒｙｏＣｅｌｌ。一実施形態では、臍帯血回収中の組織破壊を最小にするためのさらなる操作がない、胎盤の落差脱血が行われる。
概して、胎盤は、臍帯血の回収および潅流液の収集のために分娩または出産室から別の場所、例えば研究室に輸送される。胎盤を滅菌断熱輸送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃で維持する）で、例えば、臍帯近位部をクランプした胎盤を滅菌ジップロックプラスチックバッグの中に入れ、次いでそれを断熱コンテナに入れることにより、輸送することができる。別の実施形態では、胎盤は、実質的に（特許文献１３）に記載されている通りの臍帯血採取キットで輸送される。一実施形態では、胎盤は、分娩の４〜２４時間後に研究室に配達される。ある特定の実施形態では、臍帯血回収前に臍帯近位部、例えば、胎盤円盤体（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｄｉｓｃ）への挿入４〜５ｃｍ（センチメートル）以内でクランプされる。他の実施形態では、臍帯近位部は、臍帯血回収後だが胎盤のさらなる処理前にクランプされる。
潅流液収集前の胎盤を無菌条件下、室温で、または５〜２５℃（摂氏）の温度で保管することができる。胎盤を４８時間より長い間保管してもよく、または一切の残留臍帯血を除去するための胎盤の潅流前に４〜２４時間の間保管してもよい。胎盤を抗凝固溶液中、５℃〜２５℃（摂氏）の温度で保管することができる。好適な抗凝固溶液は、当技術分野において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。一実施形態では、抗凝固溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、１：１０００溶液で１％ ｗ／ｗ）を含む。一部の実施形態では、瀉血された胎盤は、胎盤潅流液を収集する前３６時間以下、保管される。
５．５．３．胎盤潅流液
哺乳動物胎盤を潅流する方法および胎盤潅流液を得る方法は、例えば、ハリリ（Ｈａｒｉｒｉ）、（特許文献７）および（特許文献１４）に、ならびに（特許文献９）、（特許文献１０）および（特許文献１５）に開示されており、前記特許文献の開示はそれら全体が本明細書における参照により本明細書に組み入れられている。
潅流液は、胎盤血管系に潅流溶液、例えば、生理食塩水、培養培地または上記の細胞収集組成物を通すことにより得ることができる。一実施形態では、哺乳動物胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈のどちらかまたは両方に潅流溶液を通すことにより潅流される。例えば胎盤への重力流を使用して、胎盤を通る潅流溶液の流れを達成してもよい。例えば、潅流溶液は、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して、胎盤を通って強制的に送られる。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌接続器具に接続されているカニューレ、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレを挿入することができる。前記滅菌接続器具は、潅流マニホールドに接続されている。
潅流の準備の際、臍帯動脈および臍帯静脈が胎盤の最高点に位置するように胎盤を配向させることがきる。潅流溶液を胎盤血管系にまたは胎盤血管系および周囲組織に通すことによって、胎盤を潅流することができる。一実施形態では、臍帯動脈および臍帯静脈は、潅流溶液のリザーバに可撓性コネクタにより接続されているピペットに、同時に接続される。潅流溶液は、臍帯静脈および動脈に送られる。潅流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出し、および／または血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集される。潅流溶液を、臍帯開口部を通して導入し、母体の子宮壁と接合していた胎盤壁の開口部から流出または浸出させてもよい。別の実施形態では、潅流溶液は、臍帯静脈に通され、臍帯動脈から収集されるか、または臍帯動脈に通され、臍帯静脈から回収され、すなわち、胎盤血管系（胎児組織）のみに通される。
一実施形態では、例えば、臍帯動脈および臍帯静脈は、例えば、潅流溶液のリザーバに可撓性コネクタにより接続されているピペットに、同時に接続される。潅流溶液は、臍帯静脈および動脈に送られる。潅流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出し、および／または血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集される。潅流溶液を、臍帯開口部を通して導入し、母体の子宮壁と接合していた胎盤壁の開口部から流出または浸出させてもよい。「パン」法と呼ばれることもある、この方法により収集される胎盤細胞は、概して、胎児細胞と母体細胞の混合物である。
別の実施形態では、潅流溶液は、臍帯静脈に通され、臍帯動脈から収集されるか、または臍帯動脈に通され、臍帯静脈から収集される。「閉回路」法と呼ばれることもある、この方法により収集される胎盤細胞は、概して、ほぼ排他的に胎児のものである。
閉回路潅流法は、一実施形態では、次のように行うことができる。分娩後の胎盤を産後約４８時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上で切断する。臍帯を廃棄することができ、または処理して、例えば臍帯幹細胞を回収することおよび／もしくは生体材料の製造用に臍帯膜を加工することができる。潅流中、羊膜を保持することができ、または例えば指での鈍的切開を使用して、絨毛膜から分離することができる。羊膜を潅流前に絨毛膜から分離する場合、羊膜を、例えば、廃棄することができ、または処理して、例えば、酵素的消化により幹細胞を得ること、もしくは例えば羊膜生体材料、例えば、（特許文献１６）に記載されている生体材料を製造することができる。例えば滅菌ガーゼを使用して、胎盤から目に見える血餅および残留血をすべて取り除いた後、臍帯血管を、例えば、臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることにより、露出させる。血管を特定し、例えば、閉じたアリゲータークランプを各血管の切断端に通して前進させることにより、血管を開く。次いで、器具、例えば、潅流デバイスまたは蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを、胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプは、目的に適するいずれのポンプであってもよく、例えば、蠕動ポンプであってもよい。次いで、滅菌収集リザーバ、例えば、血液バッグ、例えば２５０ｍＬ採血バッグに接続されたプラスチックチューブを臍帯静脈に挿入する。あるいは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、収集リザーバへのチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで、ある容量の潅流溶液、例えば、約７５０ｍｌの潅流溶液で胎盤を潅流する。次いで、潅流液中の細胞を、例えば遠心分離により、収集する。
一実施形態では、潅流中、臍帯近位部をクランプし、より具体的には、胎盤円盤体への臍帯の挿入４〜５ｃｍ（センチメートル）以内でクランプすることができる。
瀉血プロセス中の哺乳動物胎盤からの潅流液の初回収集物は、臍帯血および／または胎盤血の残留赤血球で一般に着色されている。潅流液は、潅流が進むにつれてより無色になり、残留臍帯血球は、胎盤から洗い流される。一般に、３０〜１００ｍＬの潅流液が胎盤からの血液の初回フラッシュに適当であるが、観察結果次第でより多いまたはより少ない潅流液を使用してもよい。
ある特定の実施形態では、臍帯血は、潅流前に胎盤から（例えば、落差脱血により）除去されるが、胎盤は、残留血を除去するために溶液でフラッシュ（例えば、潅流）されない。ある特定の実施形態では、臍帯血は、潅流前に胎盤から（例えば、落差脱血により）除去され、胎盤は、残留血を除去するために溶液でフラッシュ（例えば、潅流）される。
胎盤を潅流するために使用される潅流液の容量は、収集されることになる胎盤細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤で行われることになる収集の回数などに依存して変わることがある。様々な実施形態では、潅流液の容量は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであり得る。概して、胎盤は、瀉血後に７００〜８００ｍＬの潅流液で潅流される。
胎盤を数時間から数日にわたって複数回潅流することができる。胎盤を複数回潅流することになる場合、胎盤をコンテナまたは他の好適な容器内で無菌条件下で維持または培養し、細胞収集組成物、または標準的な潅流溶液（例えば、抗凝固薬（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を伴うもしくは伴わない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ））、抗生物質、例えば、ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌで）を伴うもしくは伴わない、通常の生理食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」））で、潅流することができる。一実施形態では、単離された胎盤は、潅流液を収集せずに、ある期間、維持または培養され、例えば、前記胎盤は、潅流および潅流液収集前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間、または２もしくは３日以上の日数、維持または培養される。潅流された胎盤を、さらに１または複数回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上維持し、例えば７００〜８００ｍＬの潅流液で再び潅流することができる。胎盤を１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５または６時間ごとに１回、潅流することができる。一実施形態では、胎盤の潅流、および潅流溶液、例えば胎盤細胞収集組成物の回収は、回収される有核細胞の数が細胞１００個／ｍｌを下回るまで繰り返される。異なる時点での潅流液をさらに個々に処理して、細胞、例えば全有核細胞、の経時的集団を回収することができる。異なる時点からの潅流液をプールすることもできる。
５．５．４．胎盤潅流液および胎盤潅流液細胞
概して、単一の胎盤灌からの胎盤潅流液は、造血細胞を含む、約１億〜約５億個の有核細胞を含み、それらの造血細胞から、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を、本明細書で開示される方法により製造することができる。ある特定の実施形態では、胎盤潅流液または潅流液細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞を含む。そのような細胞は、より特異的な実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞または前駆細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋幹細胞または前駆細胞などを含むことができる。ある特定の実施形態では、潅流液または潅流液細胞は、それらからの造血細胞の単離前に凍結保存される。ある特定の他の実施形態では、胎盤潅流液は、または潅流液細胞は、胎児細胞のみを含むか、または胎児細胞と母体細胞の組合せを含む。
５．６．ＮＫ細胞
５．６．１．３段階法により製造されるＮＫ細胞
別の実施形態では、単離されたＮＫ細胞集団であって、前記ＮＫ細胞が上記の３段階法に従って製造される、ＮＫ細胞集団が本明細書で提供される。
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造される、単離されたＮＫ細胞集団であって、本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ前駆細胞集団、例えば、ＮＫ前駆細胞集団を製造するために使用される第３の培養ステップがＮＫ細胞集団を製造するために使用される第３の培養ステップより短い期間のものであったことを除いて同じ３段階法により製造されたＮＫ前駆細胞集団より、高いパーセンテージのＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む、ＮＫ細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、約７０％以上、一部の実施形態では７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ４６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１１ａ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ３０＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６１＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＤＮＡＭ−１＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＴ−ｂｅｔ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ１１７＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄ＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＮＫｐ４４＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ２４４＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、パーフォリンを発現する細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＥＯＭＥＳを発現する細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、グランザイムＢを発現する細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＴＮＦαを分泌する細胞を含む。
５．７．ＩＬＣ３細胞
５．７．１．３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞
別の実施形態では、単離されたＩＬＣ３細胞集団であって、上記の３段階法に従って製造されるＩＬＣ３細胞集団が本明細書で提供される。
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造される、単離されたＩＬＣ３細胞集団であって、本明細書に記載の３段階法により製造されたＩＬＣ３前駆細胞集団、例えば、ＩＬＣ３前駆細胞集団を製造するために使用される第３の培養ステップがＩＬＣ３細胞集団を製造するために使用される第３の培養ステップより短い期間のものであったことを除いて同じ３段階法により製造されたＩＬＣ３前駆細胞集団より、高いパーセンテージのＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含むＩＬＣ３細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、約７０％以上、一部の実施形態では７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団は、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ４６−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＩＬ１Ｒ１＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＲＯＲγｔ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１１ａ−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＴ−ｂｅｔ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＣＤ１１７＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄ−である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＮＫｐ３０−である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＣＤ２４４＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＤＮＡＭ−１＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＡＨＲを発現する細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、パーフォリンを発現しない細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＥＯＭＥＳを発現しない細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、グランザイムＢを発現しない細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＩＬＣ３細胞集団は、ＩＬ−２２および／またはＩＬ−８を分泌する細胞を含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載の３段階法により製造される細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を５０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を２０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を５：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１：５の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１：１０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１：２０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を１：５０の比で含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＣＤ１１ａ＋細胞とＣＤ１１ａ−細胞を５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０の比で合わせて細胞の混合集団を製造することにより、製造される。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、５０：１の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、２０：１の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１０：１の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、５：１の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：１の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：５の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：１０の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：２０の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：５０の比で合わせられたＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載の３段階法により製造される細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を５０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を２０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１０：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を５：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１：１の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１：５の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１：１０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１：２０の比で含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を１：５０の比で含む。
ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞集団は、ＮＫ細胞とＩＬＣ３細胞を５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０の比で合わせて細胞の混合集団を製造することにより、製造される。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、５０：１の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、２０：１の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１０：１の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、５：１の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：１の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：５の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：１０の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：２０の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞の混合集団は、１：５０の比で合わせられたＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞を含む。
５．８．胎盤潅流液との組合せでのＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞
本明細書に記載の３段階法によるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞および／または接着胎盤細胞との組合せで含む組成物であって、例えば、１個の腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖の抑制に使用するための組成物が本明細書でさらに提供される。
５．８．１．ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と潅流液または潅流液細胞との組合せ
本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団と胎盤潅流液および／または胎盤潅流液細胞との組合せを含む組成物が本明細書でさらに提供される。一実施形態では、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が補充された、ある容量の胎盤潅流液が本明細書で提供される。ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が補充された、ある容量の胎盤潅流液についての特定の実施形態では、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載されているような比で存在する。具体的な実施形態では、例えば、胎盤潅流液各１ミリリットルに、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上が補充される。別の実施形態では、胎盤潅流液細胞に、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が補充される。ある特定の実施形態では、胎盤潅流液細胞が、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と合わせられた場合、胎盤潅流液細胞は、一般に、細胞の総数の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％もしくは１％、約前記％超、または約前記％未満を構成する。ある特定の他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が、複数の胎盤潅流液細胞および／または混合ナチュラルキラー細胞と合わせられた場合、ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、またはＮＫ細胞集団は、一般に、細胞の総数の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％もしくは１％、約前記％超、または約前記％未満を構成する。ある特定の他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が、胎盤潅流液への補充に使用される場合、細胞が懸濁される溶液（例えば、生理食塩水、培養培地など）の容量は、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞が補充前に１ミリリットル当たり約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上の細胞に懸濁された場合、細胞を加えた潅流液の総容量の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％もしくは１％、約前記％超、または約前記％未満を構成する。
他の実施形態では、細胞の任意の上記組合せが、今後は臍帯血、または臍帯血からの有核細胞と合わせられる。
２つ以上の源、例えば２つ以上の胎盤から得られ、合わせられる、例えばプールされる、プール胎盤潅流液が本明細書でさらに提供される。そのようなプール潅流液は、各源からの潅流液のほぼ同容量を含んでいてもよく、または各源からの異なる容量を含んでいてもよい。各源からの相対容量は、無作為に選択されることもあり、または例えば、１つもしくは複数の細胞因子、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモンなどの濃度もしくは量、各源からの潅流液中の胎盤細胞の数、または各源からの潅流液の他の特性に基づくこともある。同じ胎盤の複数回の潅流からの潅流液を同様にプールしてもよい。
同様に、２つ以上の源、例えば２つ以上の胎盤から得られ、プールされる、胎盤潅流液細胞、および胎盤由来の中間ナチュラルキラー細胞が本明細書で提供される。そのようなプール細胞は、２つ以上の源からのほぼ同数の細胞を含んでいてもよく、またはプール源の１つもしくは複数からの異なる数の細胞を含んでいてもよい。各源からの細胞の相対数は、例えば、プールされることになる細胞中の１つまたは複数の特異的細胞型の数、例えば、ＣＤ３４＋細胞などの数に基づいて、選択することができる。
例えば、ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞またはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団の所定数あるいは潅流液の所定容量から予想される腫瘍抑制（すなわち能力）の程度または量を決定するためにアッセイされた、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、ならびにそのような細胞と胎盤潅流液および／または胎盤潅流液細胞の組合せが本明細書でさらに提供される。例えば、あるアリコートまたは試料番号の細胞を、別の方法では腫瘍細胞が増殖することになる条件下で、既知数の腫瘍細胞と接触または近接させ、ある期間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０週間以上）にわたって、胎盤潅流液、潅流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、またはそれらの組合せの存在下での腫瘍細胞の増殖速度を、潅流液、潅流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、またはそれらの組合せの非存在下での同数の腫瘍細胞の増殖と比較する。細胞の能力は、例えば、腫瘍細胞成長を、例えば約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％など、抑制するために必要とされる細胞数または溶液の容量として表すことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、医薬品グレードの投与可能な単位として提供される。そのような単位を個別の容量、例えば、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｎＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、７５ｍＬ、８０ｍＬ、８５ｍＬ、９０ｍＬ、９５ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬなどで提供することができる。そのような単位を、指定数の細胞、例えば、他のＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞または潅流液細胞との組合せでＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞またはＮＫ細胞および／またＩＬＣ３細胞集団、例えば、１ミリリットル当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上の細胞、または１単位当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の細胞を含有するように、提供することができる。具体的な実施形態では、単位は、１ミリリットル当たり約、少なくとも約、または最大で約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６個以上のＮＫ細胞、または１単位当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の細胞を含むことができる。そのような単位を、指定数のＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、またはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団、ならびに／または他の任意の細胞を含有するように提供することができる。
上記実施形態では、ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、またはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団、あるいはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞と、またはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団と、他のＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、潅流液細胞または潅流液との組合せは、レシピエントにとって自家である（すなわち、レシピエントから得られる）こともあり、またはレシピエントにとって同種異形である（すなわち、前記レシピエントとは別の少なくとも１個体から得られる）こともある。
ある特定の実施形態では、細胞の各単位は、容量、細胞数、細胞型、その単位が特定の細胞型について富化されているかどうか、および／または単位内の所定の細胞数もしくは単位の所定のミリリットル数についての能力、すなわち、その単位内の細胞が、腫瘍細胞の特定の型（単数もしくは複数）の増殖の測定可能な抑制を引き起こすかどうか、のうちの１つまたは複数を特定するために、標識される。
５．８．２．ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と接着胎盤幹細胞との組合せ
他の実施形態では、単独での、または胎盤潅流液もしくは胎盤潅流液細胞との組合せでの、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団に、単離された接着胎盤細胞、例えば、ハリリ（Ｈａｒｉｒｉ）、（特許文献７）および（特許文献１４）に、ならびに（特許文献１５）に例えば記載されているような胎盤幹細胞および胎盤複能性細胞が補充され、前記特許文献の開示はそれら全体が参照により本明細書に組み入れられている。ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞である具体的な実施形態では、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載されているような比で存在する。「接着胎盤細胞」は、細胞が組織培養面、例えば、組織培養プラスチックに接着していることを意味する。本明細書で開示される組成物および方法において有用な接着胎盤細胞は、一般に、栄養芽細胞でも、胚性生殖細胞でも、胚性幹細胞でもない。
単独での、または胎盤潅流液もしくは胎盤潅流液細胞との組合せでの、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団に、例えば、１ミリリットル当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上の接着胎盤細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の接着胎盤細胞を補充することができる。組合せでの接着胎盤細胞は、例えば、培養された接着胎盤細胞であって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０集団倍加の間、またはそれ以上、培養された接着胎盤細胞であり得る。
単離された接着胎盤細胞は、一次培養で培養されたとき、または細胞培養で増幅されたとき、組織培養基材、例えば、組織培養コンテナ表面（例えば、組織培養プラスチック）に接着する。培養液中の接着胎盤細胞は、中心細胞体から延びる多数の細胞質突起を有する、おおむね線維芽細胞様の星状の外観と考えられている。しかし、接着胎盤細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に区別可能である。接着胎盤細胞は、線維芽細胞より多数のそのような突起を示すからである。形態学的に、接着胎盤細胞は、培養液中でより丸みを帯びている、または玉石の形態を一般とる造血幹細胞とも区別可能である。
本明細書で提供される組成物および方法において有用な、単離された接着胎盤細胞、および接着胎盤細胞集団は、接着胎盤細胞を含む細胞または細胞集団を同定および／または単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書で提供される組成物および方法において有用な接着胎盤細胞および接着胎盤細胞集団は、胎盤から直接得られる接着胎盤細胞および接着胎盤細胞含有細胞集団、またはそれらの任意の部分（例えば、羊膜、絨毛膜、羊膜・絨毛膜板、胎盤絨毛叢、臍帯など）を含む。接着胎盤幹細胞集団は、一実施形態では、培養液中の接着胎盤幹細胞集団（すなわち、２つ以上の前記細胞）、例えば、コンテナ、例えばバッグ内の集団である。
接着胎盤細胞は、一般に、マーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００、および／またはＯＣＴ−４を発現し、ＣＤ３４も、ＣＤ３８も、ＣＤ４５も発現しない。接着胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）およびＨＬＡ−ＤＲも発現することができる。これらのマーカーは、接着胎盤細胞を同定するために、および接着胎盤細胞を他の細胞型と区別するために、使用することができる。接着胎盤細胞は、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現することができるので、間葉系幹細胞様特性を有することができる。ＣＤ３４、ＣＤ３８および／またはＣＤ４５の発現の欠如により、接着胎盤幹細胞は非造血幹細胞として同定される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離された接着胎盤細胞は、がん細胞増殖または腫瘍成長を検出可能に抑制する。
ある特定の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、単離された胎盤幹細胞である。ある特定の他の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、単離された胎盤複能性細胞である。具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるようにＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。より具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、複能性接着胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性を有する。より具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、さらにＣＤ２００＋である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
一実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋である。具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。より具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたとき、１つまたは複数の胚様体様体を産生する。
別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋である。前記集団の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。より具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたとき、１つまたは複数の胚様体様体を産生する。
別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋である。具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。より具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋でもある。別の具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたとき、１つまたは複数の胚様体様体も産生する。
別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記接着幹細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記接着幹細胞は、ＣＤ２００＋でもある。より具体的な実施形態では、前記接着幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋でもある。
別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で１つまたは複数の胚様体様体を産生する、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋幹細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。より具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−でもある。
別の実施形態では、接着胎盤幹細胞は、ＯＣＴ−４＋幹細胞であり、前記接着胎盤幹細胞は、胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたときに１つまたは複数の胚様体様体を産生し、前記幹細胞は、がん細胞増殖または腫瘍成長を検出可能に抑制するものとして同定されたものである。
様々な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、ＯＣＴ−４＋である。上記集団の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態では、前記単離された接着胎盤細胞は、増幅された、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回継代されたものである。
上記実施形態のいずれかについてのより具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的ＡＢＣトランスポータータンパク質；例えば、（非特許文献５）を参照されたい）を発現する。
別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１３３−。別の実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）を構成的に分泌する。
上述の単離された接着胎盤細胞の各々は、哺乳動物胎盤から直接得られたおよび単離された細胞、または培養され、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０回以上継代された細胞、またはこれらの組合せを含むことができる。上記の単離された接着胎盤細胞の腫瘍細胞抑制性の大部分のものは、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上、少なくとも前記個数、または前記個数以下の、単離された接着胎盤細胞を含むことができる。
５．８．３．接着胎盤細胞条件培地を含む組成物
また、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を含み、さらに条件培地を含む組成物であって、腫瘍抑制性であるか、またはがんもしくはウイルス感染症の処置に有効である組成物の使用が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載されているような比で存在する。本明細書に記載されているような接着胎盤細胞は、腫瘍細胞抑制性、抗がん性、または抗ウイルス性である条件培地、すなわち、検出可能な腫瘍細胞抑制効果、抗がん効果または抗ウイルス効果を有する細胞により分泌または排出された１つまたは複数の生体分子を含む培地を製造するために使用することができる。様々な実施形態では、条件培地は、細胞が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上増殖された（すなわち、培養された）、培地を含む。他の実施形態では、条件培地は、そのような細胞が集密度少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％にまたは集密度１００％まで成長した、培地を含む。そのような条件培地は、細胞の、例えば、胎盤細胞または別の種類の細胞の、別々の集団の培養を支持するために使用することができる。別の実施形態では、本明細書で提供される条件培地は、単離された接着胎盤細胞、例えば、単離された接着胎盤幹細胞または単離された接着胎盤複能性細胞、および単離された接着胎盤細胞以外の細胞、例えば、非胎盤幹細胞または複能性細胞が培養された培地を含む。
そのような条件培地を、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞のいずれかもしくは任意の組合せ、胎盤潅流液、または胎盤潅流液細胞と合わせて、腫瘍細胞抑制性、抗がん性または抗ウイルス性である組成物を形成することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、容量で半分未満、例えば、容量で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％もしくは１％、または約前記％値未満の条件培地を含む。
したがって、一実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と、単離された接着胎盤細胞の培養物からの培養培地とを含む組成物であって、前記単離された接着胎盤細胞が、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である、組成物が、腫瘍細胞の成長もしくは増殖を検出可能に抑制するか、または抗がん性もしくは抗ウイルス性である、組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、単離された接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるようにＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。より具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、複能性接着胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性を有する。より具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、さらにＣＤ２００＋である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−接着胎盤細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるように、さらにＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
別の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と、単離された接着胎盤細胞の培養物からの培養培地とを含む組成物であって、前記単離された接着胎盤細胞が、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現するか、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現するか、またはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現するか、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現するか、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団における１つもしくは複数の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたとき、補助する、またはＯＣＴ−４を発現し、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団における１つもしくは複数の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成を可能ならしめる条件下で培養されたとき、補助する、組成物であり、腫瘍細胞の成長もしくは増殖を検出可能に抑制するか、または抗がん性もしくは抗ウイルス性である、組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、組成物は、複数の前記単離された胎盤接着細胞をさらに含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記非胎盤細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば造血前駆細胞、例えば、抹消血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞または胎盤血造血前駆細胞を含む。非胎盤細胞は、幹細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞も含むことができる。非胎盤細胞は、成熟細胞または細胞株の１つまたは複数の型であることもできる。別の具体的な実施形態では、組成物は、抗増殖剤、例えば、抗ＭＩＰ−１αまたは抗ＭＩＰ−１β抗体を含む。
具体的な実施形態では、上記の細胞または細胞の組合せのうちの１つにより条件付けられた培養培地は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１の単離された接着胎盤細胞対腫瘍細胞比で複数の腫瘍細胞と共培養された複数の単離された接着胎盤細胞から得られる。例えば、条件培養培地または上清は、約１×１０５個の単離された接着胎盤細胞、約１×１０６個の単離された接着胎盤細胞、約１×１０７個の単離された接着胎盤細胞、もしくは約１×１０８個の単離された接着胎盤細胞、またはそれ以上を含む培養物から得ることができる。別の具体的な実施形態では、条件培養培地または上清は、約１×１０５〜約５×１０５個の単離された接着胎盤細胞および約１×１０５個の腫瘍細胞、約１×１０６〜約５×１０６個の単離された接着胎盤細胞および約１×１０６個の腫瘍細胞、約１×１０７〜約５×１０７個の単離された接着胎盤細胞および約１×１０７個の腫瘍細胞、または約１×１０８〜約５×１０８個の単離された接着胎盤細胞および約１×１０８個の腫瘍細胞を含む、共培養物から得られる。
５．９．細胞の保存
細胞、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団、または造血幹細胞もしくは前駆細胞を含む胎盤潅流液細胞を、保存することができる、すなわち、長期保管を可能ならしめる条件下、または例えばアポトーシスもしくは壊死による、細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
胎盤潅流液は、細胞収集組成物を胎盤の少なくとも一部に、例えば胎盤血管系に、通すことによって製造することができる。細胞収集組成物は、潅流液中に含有されている細胞を保存するように作用する１つまたは複数の化合物を含む。そのような胎盤細胞収集組成物は、関連する（特許文献１０）に記載されているような、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素担持ペルフルオロカーボンを含むことができ、前記特許文献の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
一実施形態では、潅流液、または胎盤細胞集団は、前記潅流液または細胞集団を、アポトーシス阻害剤と酸素担持ペルフルオロカーボンとを含む細胞収集組成物と近接させることにより、哺乳動物の、例えばヒトの、分娩後の胎盤から収集され、その際、前記アポトーシス阻害剤は、前記アポトーシス阻害剤と接触も近接もさせていない細胞集団と比較して胎盤細胞集団、例えば、接着胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞、の集団におけるアポトーシスを低減させるまたは防止するのに十分な量でおよび十分な時間、存在する。例えば、胎盤を細胞収集組成物で潅流することができ、胎盤細胞、例えば、全有核胎盤細胞が胎盤から単離される。具体的な実施形態では、アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は、接着胎盤細胞、例えば、接着胎盤幹細胞または接着胎盤複能性細胞の分化も増殖も調節しない。別の実施形態では、細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素担持ペルフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施形態では、細胞収集組成物は、エマルジョン中の前記アポトーシス阻害剤と前記酸素担持ペルフルオロカーボンとを含む。別の実施形態では、細胞収集組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞を細胞収集組成物と近接させる時点で約０℃〜約２５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞を細胞収集組成物と近接させる時点で約２℃〜１０℃、または約２℃〜５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記近接させることは、前記細胞の集団の輸送中に行われる。別のより具体的な実施形態では、前記近接させることは、細胞の前記集団の凍結および融解中に行われる。
別の実施形態では、胎盤潅流液および／または胎盤細胞を収集し、前記潅流液および／または細胞をアポトーシス阻害剤および臓器保存用化合物と近接させることにより、保存することができ、その際、前記アポトーシス阻害剤は、前記アポトーシス阻害剤と接触も近接もさせていない潅流液または胎盤細胞と比較して、細胞のアポトーシスを低減させるまたは防止するのに十分な量でおよび十分な時間、存在する。具体的な実施形態では、臓器保存用化合物は、ＵＷ溶液（（特許文献１７）に記載されており、ＶＩＡＳＰＡＮ（商標）としても公知である；（非特許文献６）も参照されたい）、またはシュテルン（Ｓｔｅｒｎ）ら、（特許文献１８）に記載されている溶液であり、前記参考文献の開示はそれら全体が参照により本明細書に組み入れられている。別の実施形態では、前記臓器保存用組成物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、胎盤細胞収集組成物は、酸素担持ペルフルオロカーボンを２相でまたはエマルジョンとしてさらに含む。
方法の別の実施形態では、胎盤細胞は、アポトーシス阻害剤および酸素担持ペルフルオロカーボン、臓器保存用化合部またはそれらの組合せを含む細胞収集組成物と、潅流中に近接される。別の実施形態では、胎盤細胞は、潅流による収集後に前記細胞収集化合物と近接される。
概して、胎盤細胞収集、富化および単離中の、低酸素に起因する細胞ストレスおよび機械的ストレスを最小にすることまたは無くすことが好ましい。したがって、方法の別の実施形態では、胎盤潅流液、または胎盤細胞集団は、正常血中酸素濃度未満である酸素濃度である低酸素条件に、収集、富化または単離中、前記保存中は６時間未満曝露される。より具体的な実施形態では、前記潅流液、または胎盤細胞集団は、前記保存中に２時間未満、前記低酸素条件に曝露される。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、収集、富化もしくは単離中、１時間未満、もしくは３０分未満、前記低酸素条件に曝露されるか、または低酸素条件に曝露されない。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞の集団は、収集、富化または単離中、剪断ストレスに曝露されない。
細胞、例えば、胎盤潅流液細胞、造血細胞、例えばＣＤ３４＋造血幹細胞、本明細書に記載の方法を使用して産生されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、本明細書で提供される単離された接着胎盤細胞を、例えば、小型コンテナ、例えばアンプルまたはセプタムバイアル、内の凍結保存媒体中で、凍結保存することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０４〜５×１０８個の濃度で凍結保存される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０６〜１．５×１０７個の濃度で凍結保存される。より具体的な実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７個の濃度で凍結保存される。
好適な凍結保存媒体としては、生理食塩水、培養培地（例えば、成長培地を含む）、または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９もしくはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）；ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、凍結保存媒体は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。凍結保存媒体は、さらなる薬剤、例えば、メチルセルロース、デキストラン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、トレハロースおよび／またはグリセロールを含むこともある。ある特定の実施形態では、凍結保存媒体は、約１％〜１０％ＤＭＳＯ、約２５％〜７５％デキストランおよび／または約２０〜６０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ある特定の実施形態では、凍結保存媒体は、約１％〜１０％ＤＭＳＯ、約２５％〜７５％トレハロースおよび／または約２０〜６０％ヒトＨＳＡを含む。具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％デキストランおよび４０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％デキストラン（生理食塩水中１０％ ｗ／ｖ）および４０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％トレハロースおよび４０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％トレハロース（生理食塩水中１０％ ｗ／ｖ）および４０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５を含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を含む。
本明細書で提供される細胞を、様々な方法のいずれによって、および細胞培養、増幅または分化のいずれの段階で、凍結保存してもよい。例えば、本明細書で提供される細胞を、起源組織もしくは臓器、例えば胎盤潅流液もしくは臍帯血、からの単離直後に凍結保存してもよく、または上で概要を述べた方法の第１、第２もしくは第３ステップ中もしくは後に凍結保存してもよい。ある特定の実施形態では、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、起源組織または臓器からの単離後、約１、５、１０、１５、２０、３０、４５分以内または約１、２、４、６、１０、１２、１８、２０または２４時間以内に凍結保存される。ある特定の実施形態では、前記細胞は、起源組織または臓器からの単離後、１、２または３日以内に凍結保存される。ある特定の実施形態では、前記細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、上記の第１の培地中で培養された後、凍結保存される。一部の実施形態では、前記細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、上記の第１の培地中で、および約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、第２の培地中で上記の通り培養された後、凍結保存される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞が、本明細書に記載の３段階法を使用して製造される場合、前記細胞は、第１の培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、および／または第２の培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、および／または第３の培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、凍結保存される。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造され、前記細胞は、第１の培地中で１０日間培養された後、第２の培地中で４日間培養された後、および第３の培地中で２１日間培養された後、凍結保存される。
一態様では、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団、例えば本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、の集団を凍結保存する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、前記方法は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップであって、細胞の前記第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、ステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ、ならびに（ｄ）細胞の前記第３の集団からＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む細胞の第４の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＩＬＣ３細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＩＬＣ３細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＩＬＣ３細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、ならびに（ｃ）幹細胞動員剤、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む細胞の第３の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＩＬＣ３細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
一実施形態では、前記方法は、（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ、ならびに（ｄ）細胞の前記第３の集団からＣＤ１１ａ−細胞を単離およびＣＤ１１ａ−細胞を単離して、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む細胞の第４の集団を製造するステップ、そして次に、前記ＩＬＣ３細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
本明細書で提供される細胞を速度制御フリーザーで、例えば、凍結保存中に約０．１、０．３、０．５、１または２℃／分で、冷却することができる。一実施形態では、凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、または約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存細胞を、使用のために融解する前に、液体窒素に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達したら、それらは、液体窒素保管場所に移される。凍結保存細胞を約２５℃〜約４０℃の温度で融解することができ、より具体的には約３７℃の温度で融解することができる。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日間凍結保存された後、融解される。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８カ月間凍結保存された後、融解される。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０年間凍結保存された後、融解される。
好適な融解媒体としては、生理食塩水、プラズマライト、培養培地（例えば、成長培地、例えばＲＰＭＩ培地を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、融解媒体は、媒体補充物（ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（例えば、栄養素、サイトカインおよび／または因子）のうちの１つまたは複数を含む。本明細書で提供される細胞の融解に好適な媒体補充物としては、例えば、限定ではないが、血清、例えば、ヒト血清ＡＢ、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）もしくはウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）、ビタミン類、ヒト血清アルブミン（ＨＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アミノ酸類（例えば、Ｌ−グルタミン）、脂肪酸類（例えば、オレイン酸、リノール酸もしくはパルミチン酸）、インスリン（例えば、組換えヒトインスリン）、トランスフェリン（鉄飽和型ヒトトランスフェリン）、β−メルカプトエタノール、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、サイトカイン類、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）またはヘパリンが挙げられる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法において有用な融解媒体は、ＲＰＭＩを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、プラズマライトを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約０．５〜２０％ＦＢＳを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約１、２、５、１０、１５または２０％ＦＢＳを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約０．５％〜２０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約１、２．５、５、１０、１５または２０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記融解媒体は、ＲＰＭＩおよび約１０％ＦＢＳを含む。別のより具体的な実施形態では、前記融解媒体は、プラズマライトおよび約５％ＨＳＡを含む。
本明細書で提供される凍結保存方法を、長期保管を可能ならしめるように、または例えばアポトーシスまたは壊死による、細胞死を阻害する条件下で、最適化することができる。一実施形態では、融解後の細胞は、例えば自動細胞計数器またはトリパンブルー法により判定して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％超の生存細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞は、約０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の死細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞は、約０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の早期アポトーシス細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞の約０．５、１、５、１０、１５または２０％は、例えばアポトーシスアッセイ（例えば、ＴＯ−ＰＲＯ３またはＡｎｎＶ／ＰＩ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓアッセイキット）により判定して、融解された後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日後にアポトーシスを受ける。ある特定の実施形態では、融解後の細胞は、本明細書で提供される方法を使用して培養、増幅または分化された後、再び凍結保存される。
５．１０．ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含む組成物
５．１０．１．３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の３段階法を使用して製造される単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または抹消血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも５０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団、例えば、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。ある特定の実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団内の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞である。ある特定の実施形態では、前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ１６−である。
本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏでの使用のために製剤化して医薬組成物にすることができる。そのような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩水またはｉｎ ｖｉｖｏ投与用の他の認知されている生理学的に許容される溶液中の、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載の任意のＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、５０％以上生存細胞を含む細胞集団（すなわち、集団内の細胞の少なくとも５０％が機能性であるか、または生存している）を含む。好ましくは、集団内の細胞の少なくとも６０％は、生存している。より具体的には、医薬組成物中の集団内の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は、生存している。
本発明の医薬組成物は、例えば生着を補助する、１つまたは複数の化合物；安定剤、例えば、アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどを含むことができる。
注射用溶液として製剤化される場合、一実施形態では、本発明の医薬組成物は、約１．２５％ＨＳＡおよび約２．５％デキストランを含む。細胞製品の投与に好適な他の注射用製剤を使用してもよい。
一実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、全身または局所投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、非経口投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与、または腫瘍内投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、デバイス、マトリックスまたは足場を用いた投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、注射に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、カテーテルによる投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、局所注射に好適である。より具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、充実性腫瘍（例えば、肉腫）への直接局所注射に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、注射器による注射に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、誘導送達による投与に好適である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、腹腔鏡検査、内視鏡検査、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴、または放射線学により補助される注射に好適である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含む、本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物は、医薬品グレードの投与可能な単位として提供される。そのような単位を個別の容量、例えば、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｎＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、７５ｍＬ、８０ｍＬ、８５ｍＬ、９０ｍＬ、９５ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬなどで提供することができる。そのような単位を、指定数の細胞、例えば、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、１ミリリットル当たり細胞１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上、または１単位当たり細胞１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上を含有するように、提供することができる。具体的な実施形態では、単位は、１ミリリットル当たり約、少なくとも約、または最大で約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６個以上のＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、または１単位当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の細胞を含むことができる。そのような単位を、指定数のＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、またはＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞集団、ならびに／または他の任意の細胞を含有するように提供することができる。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞およびＩＬＣ３細胞は、本明細書で提供される比で存在する。
別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞での処置が予定されている個体とは異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、同数のナチュラルキラー細胞、すなわち、前記免疫調節化合物またはサリドマイドと接触も近接もさせていないＮＫ細胞、より多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを検出可能に発現するのに十分な量および時間、免疫調節化合物またはサリドマイドと接触または近接させた。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物またはサリドマイドをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、下記の化合物である。例えば、（特許文献１９）を参照されたく、この特許文献の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、アミノ置換イソインドリンである。一実施形態では、免疫調節化合物は、３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオン、３−（４’アミノイソインドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン、または４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンである。別の実施形態では、免疫調節化合物は、ポマリドミドまたはレナリドミドである。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
（式中、ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方は、Ｃ＝ＯまたはＣＨ２であり、ならびにＲ２は、水素または低級アルキルである）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
（式中、
ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、他方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｓ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ３’または（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ８）アルキニルであり、
Ｒ３およびＲ３’は、独立に、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、またはＣ（Ｏ）ＯＲ５であり、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル−ＯＲ５、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、または（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、または（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ６の各出現は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、もしくは（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５であるか、またはＲ６基は、ヘテロシクロアルキル基を形成するように連結していてもよく、
ｎは、０または１であり、ならびに
＊は、キラル炭素中心を表す）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
（式中、
ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、他方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ２ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４の各々は、他のものとは無関係に、ハロ、炭素原子１〜４個のアルキル、もしくは炭素原子１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４のうちの１つは、ニトロもしくは−ＮＨＲ５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、もしくはＲ４の残りは、水素であり、
Ｒ５は、水素、または炭素１〜８個のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、炭素原子１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであり、
Ｒ’は、Ｒ７−ＣＨＲ１０−Ｎ（Ｒ８Ｒ９）であり、
Ｒ７は、ｍ−フェニレンもしくはｐ−フェニレン、または−（ＣｎＨ２ｎ）−（この式中のｎは、０〜４の値である）であり、
Ｒ８およびＲ９の各々は、他方とは無関係に見て、水素、もしくは炭素原子１〜８個のアルキルであるか、またはＲ８およびＲ９は、一緒に見て、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−（この式中のＸ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、もしくは−ＮＨ−である）であり、
Ｒ１０は、水素、炭素原子８個までのアルキル、またはフェニルであり、ならびに
＊は、キラル炭素中心を表す）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。
別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、下記の抗がん化合物の１つまたは複数をさらに含む。
より具体的な実施形態では、組成物は、別の源からの、または別の方法により製造された、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の源は、抹消血である。より具体的な実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団は、別の源からの、または別の方法により製造された、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などの比で合わせられる。
別の具体的な実施形態では、組成物は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団、ならびに単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞のいずれかを含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団とは異な個体に由来する胎盤潅流液を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の細胞のすべてまたは実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％を超える）は、胎児細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤潅流液または胎盤潅流液細胞は、胎児細胞および母体細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の胎児細胞は、前記潅流液中の細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満を構成する。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、胎盤血管系内の０．９％ ＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、培養培地を含む。別の具体的な実施形態では、前記潅流液を処理して、赤血球を除去した。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物、例えば、以下で述べる免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
別の具体的な実施形態では、組成物は、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団ならびに胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団とは異な個体に由来する。別の具体的な実施形態では、組成物は、単離胎盤潅流液および単離胎盤潅流液細胞を含み、前記単離胎盤潅流液および前記単離胎盤潅流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤潅流液を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、少なくとも２個体に由来する胎盤潅流液を含む。胎盤潅流液細胞を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤潅流液細胞は、少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
５．１１．３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞の使用
本明細書で提供される、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、がんを有する個体、例えば、充実性腫瘍細胞および／もしくは血液がん細胞を有する個体、またはウイルス感染症を有する人を処置する方法において使用することができる。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞の有効投薬量は、体重１キログラム当たり細胞１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７個以上の範囲である。本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法においても使用することができる。
５．１１．１．がんを有する個体の処置
一実施形態では、がん、例えば、血液がんまたは充実性腫瘍を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、がん、例えば、血液がんまたは充実性腫瘍を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載する３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団を、前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、個体のがんに対して活性のＮＫ細胞の欠乏を有する。具体的な実施形態では、方法は、前記個体に、単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞、例えば、治療有効量の胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞を投与することをさらに含む。別の具体的な実施形態では、方法は、前記個体に、有効量の免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、またはサリドマイドを投与することをさらに含む。本明細書で使用される「有効量」は、例えば、個体が罹患しているがんの１つもしくは複数の症状の、検出可能な改善、進行の緩和、または除去をもたらす量である。
ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはそれらの医薬組成物の投与は、全身的であってもよく、または局所的であってもよい。具体的な実施形態では、投与は、非経口的である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与、または腫瘍内投与による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたは足場を用いて行われる。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞の注射は、局所注射である。より具体的な実施形態では、局所注射は、充実性腫瘍（例えば、肉腫）中への直接的注射である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射器による注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、誘導送達による。具体的な実施形態では、注射による対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡検査、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴、または放射線学により補助される。
具体的な実施形態では、がんは、血液のがん、例えば、白血病またはリンパ腫である。より具体的な実施形態では、がんは、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、前駆Ｂ急性リンパ芽球性白血病、前駆体Ｔ急性リンパ芽球性白血病、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）、もしくは急性混合型白血病；慢性白血病、例えば、慢性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性単球性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、もしくはＢ細胞性前リンパ球性白血病；ヘアリー細胞リンパ腫；Ｔ細胞性前リンパ球性白血病；またはリンパ腫、例えば、組織球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞腫瘍（例えば、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着症、もしくは重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症（セザリー症候群）、皮膚原発性ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、皮膚原発性未分化大細胞リンパ腫もしくはリンパ腫様丘疹症）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫である。別の具体的な実施形態では、がんは、多発性骨髄腫または骨髄異形成症候群である。
ある特定の実施形態では、がんは、充実性腫瘍、例えば癌腫、例えば、腺癌、副腎皮質癌、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、乳管細胞癌、肺癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒色腫（例えば、悪性黒色腫）、非黒色腫皮膚癌、もしくは詳細不明の癌腫；類腺腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；内分泌腫瘍；ユーイング肉腫；生殖細胞腫瘍（例えば、精巣がん、卵巣がん、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、胚細胞腫など）；肝芽腫；肝細胞癌；神経芽腫；非横紋筋肉腫性軟部肉腫；骨肉腫；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；またはウィルムス腫瘍である。別の実施形態では、充実性腫瘍は、膵がんまたは乳がんである。他の実施形態では、充実性腫瘍は、聴神経腫瘍；星細胞腫（例えば、グレードＩ毛様細胞性星細胞腫、グレードＩＩ低グレード星細胞腫、グレードＩＩＩ未分化星細胞腫、もしくはグレードＩＶ多形性膠芽腫）；脊索腫；頭蓋咽頭腫；神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫、脳室上衣腫、混合型神経膠腫、視神経膠腫、もしくは上衣下腫）；膠芽腫；髄芽腫；髄膜腫；転移性脳腫瘍；乏突起神経膠腫；松果体芽腫；下垂体腫瘍；原始神経外胚葉性腫瘍；またはシュワン腫である。別の実施形態では、がんは、前立腺がんである。別の実施形態では、がんは、肝がんである。別の実施形態では、がんは、肺がんである。別の実施形態では、がんは、腎がんである。
ある特定の実施形態では、がん、例えば、血液がんまたは充実性腫瘍を有する個体、例えば、ナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体は、前記投与の前に骨髄移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、骨髄移植は、前記がんの処置におけるものであった。ある特定の他の実施形態では、骨髄移植は、前記がん以外の状態の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、個体は、前記骨髄移植に加えて免疫抑制剤を受けた。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、前記投与のときに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つまたは複数の症状を示す。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、ＧＶＨＤの症状が発現してしまう前に前記細胞の投与を受ける。
ある特定の具体的な実施形態では、がん、例えば、血液がんを有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１用量のＴＮＦα阻害剤、例えばＥＴＡＮＥＲＣＥＰＴ（登録商標）（Ｅｎｂｒｅｌ）を受けたことがある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記がんの診断の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月以内に前記用量のＴＮＦα阻害剤を受けた。具体的な実施形態では、ある用量のＴＮＦα阻害剤を受けたことがある個体は、急性骨髄性白血病を示す。より具体的な実施形態では、ある用量のＴＮＦα阻害剤を受けたことがあり、急性骨髄性白血病を示す個体は、血球の５番染色体長腕の欠失をさらに示す。別の実施形態では、がん、例えば、血液がんを有する個体は、フィラデルフィア染色体を示す。
ある特定の他の実施形態では、前記個体におけるがん、例えば、血液がんまたは充実性腫瘍には、１つまたは複数の抗がん薬が効かない。具体的な実施形態では、がんにはＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）が効かない。
ある特定の実施形態では、前記個体におけるがん、例えば、血液がんは、少なくとも１つの抗がん薬に応答し、この実施形態では、胎盤潅流液、単離された胎盤潅流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来の中間ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞、もしくは本明細書に記載のＮＫ細胞、および／またはそれらの組合せ、ならびに任意選択で免疫調節化合物は、補助的処置として、または前記抗がん薬との併用治療として加えられる。ある特定の他の実施形態では、がん、例えば、血液がんを有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１つの抗がん薬での処置を受け、再発している。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体は、難治性がんを有する。一実施形態では、本明細書に記載の細胞でのがん処置方法は、がんの再発を防ぐ（例えば、予防するまたは遅延させる）。一実施形態では、本明細書に記載のがん処置方法は、１カ月以上、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月以上、１年以上、２年以上、３年以上、または４年以上のがんの寛解をもたらす。
一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、（１）レナリドミド、（２）メルファラン、および（３）前記個体における多発性骨髄腫の処置に有効であるＮＫ細胞を投与することを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞、または臍帯血造血細胞、例えば造血幹細胞、から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。別の実施形態では、前記レナリドミド、メルファランおよび／またはＮＫ細胞は、互いに別々に投与される。多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で、細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の前記第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。
別の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する個体を処置する方法であって、前記個体にＮＫ細胞（単独のＩＬ２、または単独のＩＬ−１５、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８、またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８での前処置により任意選択で活性化されたもの）を投与することを含み、前記ＮＫ細胞が、前記個体におけるＡＭＬの処置に有効である方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された単離されたＮＫ細胞集団は、前記投与の前にＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数で前処置されたものである。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。ＡＭＬを有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により処置されることになるＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬ、または小児ＡＭＬを含む。難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬ、または小児ＡＭＬの処置のためにＮＫ細胞を投与するための当技術分野において公知の方法をこの目的に適応させることができる。例えば、（非特許文献７）；（非特許文献８）を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療に失敗したＡＭＬを有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、フルダラビン、シタラビン、または両方でコンディショニングされている。
一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、（１）レナリドミド、（２）メルファラン、および（３）前記個体における多発性骨髄腫の処置に有効であるＩＬＣ３細胞を投与することを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、臍帯血ＩＬＣ３細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＩＬＣ３細胞である。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬＣ３細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。別の実施形態では、前記レナリドミド、メルファランおよび／またはＩＬＣ３細胞は、互いに別々に投与される。多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の前記第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。
別の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する個体を処置する方法であって、前記個体にＩＬＣ３細胞（ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８、またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８での前処置により任意選択で活性化させたもの）を投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が、前記個体のＡＭＬの処置に有効である、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団は、前記投与の前にＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、またはＩＬ１５のうちの１つまたは複数で前処置されたものである。具体的な実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、臍帯血ＩＬＣ３細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＩＬＣ３細胞である。別の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、ＩＬＣ３細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。ＡＭＬを有する個体を処置する方法の、ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により処置されることになるＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬ、または小児ＡＭＬを含む。難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬ、または小児ＡＭＬの処置のためにＩＬＣ３細胞を投与するための当技術分野において公知の方法をこの目的に適応させることができる。例えば、（非特許文献７）；（非特許文献８）を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。ある特定の実施形態では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１つの非ナチュラルキラー細胞治療に失敗したＡＭＬを有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、フルダラビン、シタラビン、または両方でコンディショニングされている。
ＡＭＬを有する個体を処置する方法の、他の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の前記第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。
別の実施形態では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する個体を処置する方法であって、前記個体に、治療有効用量の（１）レナリドミド、（２）メルファラン、（３）フルダラビン、および（４）前記個体における前記ＣＬＬの処置に有効であるＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ細胞を投与することを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるか、または臍帯血造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。上記方法のいずれかについての具体的な実施形態では、前記レナリドミド、メルファラン、フルダラビンおよび増殖ＮＫ細胞は、前記個体に別々に投与される。ＣＬＬを有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の前記第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の前記第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップを含み、細胞の前記第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。ある特定の実施形態では、前記第１の培地および／または前記第２の培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている。ある特定の実施形態では、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている。具体的な実施形態では、前記第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠いており、前記第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１α、およびＦｌｔ３Ｌを欠いている。ある特定の実施形態では、第１の培地も、第２の培地も、第３の培地も、ヘパリン、例えば低分子量ヘパリンを含まない。
５．１１．２．腫瘍細胞増殖の抑制
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、前記腫瘍細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と前記腫瘍細胞を接触させることを含む方法が本明細書でさらに提供される。したがって、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、治療有効量のＮＫ細胞集団を前記腫瘍細胞と近接させる、例えば、前記腫瘍細胞を前記ＮＫ細胞集団の細胞と接触させることを含む方法において、複数のＮＫ細胞を使用することができる。任意選択で、単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞を、腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と近接させる。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物、例えば上記の免疫調節化合物、またはサリドマイドを、腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と近接させ、その結果、腫瘍細胞の増殖は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と近接させていない同じ型の腫瘍細胞と比較して検出可能に低減される。任意選択で、単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞を、免疫調節化合物と接触または近接させた腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と、近接させる。
また、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団を、前記腫瘍細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞と前記腫瘍細胞を接触させることを含む方法が本明細書で提供される。したがって、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、治療有効量のＩＬＣ３細胞集団を前記腫瘍細胞と近接させる、例えば、前記腫瘍細胞を前記ＩＬＣ３細胞集団の細胞と接触させることを含む方法において、複数のＩＬＣ３細胞を使用することができる。任意選択で、単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞を、腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞と近接させる。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物、例えば上記の免疫調節化合物、またはサリドマイドを、腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞と近接させ、その結果、腫瘍細胞の増殖は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞と近接させていない同じ型の腫瘍細胞と比較して検出可能に低減される。任意選択で、単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞を、免疫調節化合物と接触または近接させた腫瘍細胞および／または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞と、近接させる。
細胞に関して、本明細書において、ある特定の実施形態で使用される、「接触させること」または「近接させること」は、一実施形態では、胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団、ＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＩＬＣ３細胞集団、および／または単離された混合ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞との直接的な物理的、例えば細胞−細胞、接触を包含する。別の実施形態では、「接触させること」は、同じ物理的空間内に存在することを包含し、例えば、胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団、本明細書に記載のＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＩＬＣ３細胞集団、および／または単離された混合ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞と同じコンテナ（例えば、培養皿、マルチウェルプレート）内に置かれる。別の実施形態では、胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、または本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団、または本明細書に記載のＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＩＬＣ３細胞集団と、腫瘍細胞とを「接触させること」は、例えば、胎盤潅流液または細胞、例えば胎盤潅流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞、またはＩＬＣ３細胞を、個体、例えば、腫瘍細胞を有するヒト、例えばがん患者に注射または注入することにより果される。免疫調節化合物および／またはサリドマイドに関して「接触させること」は、例えば、細胞と免疫調節化合物および／またはサリドマイドを互いに直接物理的に接触させること、または同じ物理的体積（例えば、細胞培養コンテナまたは個体）の中に置くことを意味する。
具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、血液がん細胞、例えば、白血病細胞またはリンパ腫細胞である。より具体的な実施形態では、がんは、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性前骨髄球性白血病細胞、急性骨髄芽球性白血病細胞、急性巨核芽球性白血病細胞、前駆Ｂ急性リンパ芽球性白血病細胞、前駆体Ｔ急性リンパ芽球性白血病細胞、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）細胞、もしくは急性混合型白血病細胞；慢性白血病細胞、例えば、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、慢性単球性白血病細胞、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫細胞、もしくはＢ細胞性前リンパ球性白血病細胞；ヘアリー細胞リンパ腫；Ｔ細胞性前リンパ球性白血病細胞；またはリンパ腫細胞、例えば、組織球性リンパ腫細胞、リンパ形質細胞性リンパ腫細胞（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症細胞）、脾辺縁帯リンパ腫細胞、形質細胞腫瘍細胞（例えば、形質細胞性骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞、単クローン性免疫グロブリン沈着症、もしくは重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）細胞、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）細胞、濾胞性リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞、原発性滲出性リンパ腫細胞、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病細胞、アグレッシブＮＫ細胞白血病細胞、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型細胞、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫細胞、肝脾Ｔ細胞リンパ腫細胞、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫細胞、菌状息肉症（セザリー症候群）、皮膚原発性ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、皮膚原発性未分化大細胞リンパ腫もしくはリンパ腫様丘疹症）細胞、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫細胞、末梢性Ｔ細胞リンパ腫−非特定型−細胞、未分化大細胞リンパ腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫細胞である。別の具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞または骨髄異形成症候群細胞である。
具体的な実施形態では、腫瘍細胞は、充実性腫瘍細胞、例えば癌細胞、例えば、腺癌細胞、副腎皮質癌細胞、結腸腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳管細胞癌細胞、肺癌細胞、甲状腺癌細胞、上咽頭癌細胞、黒色腫細胞（例えば、悪性黒色腫細胞）、非黒色腫皮膚癌細胞、もしくは詳細不明の癌細胞；類腺腫細胞；線維形成性小円形細胞腫瘍細胞；内分泌腫瘍細胞；ユーイング肉腫細胞；生殖細胞腫瘍細胞（例えば、精巣がん細胞、卵巣がん細胞、絨毛癌細胞、内胚葉洞腫瘍細胞、胚細胞腫細胞など）；肝芽腫細胞；肝細胞癌細胞；神経芽腫細胞；非横紋筋肉腫性軟部肉腫細胞；骨肉腫細胞；網膜芽細胞腫細胞；横紋筋肉腫細胞；またはウィルムス腫瘍細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、膵がん細胞または乳がん細胞である。他の実施形態では、充実性腫瘍細胞は、聴神経腫瘍細胞；星細胞腫細胞（例えば、グレードＩ毛様細胞性星細胞腫細胞、グレードＩＩ低グレード星細胞腫細胞、グレードＩＩＩ未分化星細胞腫細胞、もしくはグレードＩＶ多形性膠芽腫細胞）；脊索腫細胞；頭蓋咽頭腫細胞；神経膠腫細胞（例えば、脳幹神経膠腫細胞、脳室上衣腫細胞、混合型神経膠腫細胞、視神経膠腫細胞、もしくは上衣下腫細胞）；膠芽腫細胞；髄芽腫細胞；髄膜腫細胞；転移性脳腫瘍細胞；乏突起神経膠腫細胞；松果体芽腫細胞；下垂体腫瘍細胞；原始神経外胚葉性腫瘍細胞；またはシュワン腫細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、前立腺がん細胞である。
本明細書で使用される「治療に有益な」および「治療上の利点」には、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍増殖の緩和または停止、転位性疾患の低減または予防、組織試料、例えば血液試料中の単位体積当たりのがん細胞数の低減、前記個体が有する特定のがんまたは腫瘍の任意の症状の臨床的改善、個体が有する特定のがんの任意の症状の悪化の緩和または停止などが含まれるが、これらに限定されない。
５．１１．３．ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびに他の抗がん剤を使用するがんの処置
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、１つまたは複数の他の抗がん剤を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。同様に、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、１つまたは複数の他の抗がん剤を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。加えて、または代替的に、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を使用する、がんを有する個体の処置は、１つまたは複数の他の抗がん剤を含む抗がん治療を補うために使用することができる。そのような抗がん剤は、当技術分野において周知であり、抗炎症剤、免疫調節剤、細胞傷害性薬剤、がんワクチン、化学療法薬、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ６ｉ（ＡＣＹ−２４１））、およびｓｉＲＮＡを含む。本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および任意選択で潅流液、潅流液細胞、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞以外のナチュラルキラー細胞に加えて、がんを有する個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体に投与することができる、具体的な抗がん剤には、これらに限定されるものではないが、以下のものが含まれる：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アドリアマイシン；アドルシル；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ（例えば；エルウィニア・クリサン（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎ）からのもの；Ｅｒｗｉｎａｚｅ）；アスペルリン；アバスチン（ベバシズマブ）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；セルビジン；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ジュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）塩酸塩；エルサミトルシン；Ｅｌｓｐａｒ；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；Ｉｄａｍｙｃｉｎ；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸エステル；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシ硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ；リボプリン；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；Ｔａｂｌｏｉｄ；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；Ｔｏｐｏｓａｒ；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；Ｔｒｅｘａｌｌ；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；およびゾルビシン塩酸塩。
他の抗がん薬には、これらに限定されるものではないが、以下のものが含まれる：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−アザシチジン；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン剤；前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィディコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏとも呼ばれる；イリノテカン）カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；ＣＣ−１２２；ＣＣ−２２０；ＣＣ−４８６；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベスシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロジデムニン（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｎｍｉｎ）Ｂ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン（例えば、Ｆｌｕｄａｒａ）；フルオロダウノルビシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ）塩酸塩；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ホモハリントニン（ＨＨＴ、オマセタキシンメペスクシナート）；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮ三酢酸塩；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルートテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ））；抗ＣＤ１９抗体；抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）；抗ＣＳ−１抗体（例えば、エロツズマブ（ＢＭＳ／ＡｂｂＶｉｅ））；抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ（Ｇｅｎｍａｂ／Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；抗ＣＤ１３８抗体（例えば、インダツキシマブ（Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ Ｄｒｅｉｅｉｃｈ））；抗ＰＤ−１抗体；抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））；抗ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、モナリズマブ（ＩＰＨ２２０１；Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ））；抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ（Ｏｎｃｏｍｅｄ／Ｃｅｌｇｅｎｅ））；抗ＤＬＬ４・抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体；抗ＲＳＰＯ３抗体；抗ＴＩＧＩＴ抗体；ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８またはｃｈ１４．１８）；抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ハーセプチン）；ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋マイコバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスティップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン（例えば、Ｆｌｏｘａｔｉｎ）；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；パーフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡ系免疫調節物質；プロテインキナーゼＣ阻害剤；微細藻類の、プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化されたレテリプチン；レニウムＲｅ １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビキノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ １模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテイトナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンビクロリド（ｂｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖器洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）ベラレゾール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン；ボロゾール；Ｗｅｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリン）；Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマー。
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、１つまたは複数の免疫チェックポイントモジュレーターを含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ−１、ならびに／またはＰＤ−Ｌ１を調節する。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）；誘導性Ｔ細胞共刺激分子）および／またはヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ−１、ならびに／またはＰＤ−Ｌ１である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＰＤ−１に結合する。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１に結合する抗体またはその抗体結合断片は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、小野薬品工業株式会社）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅｔｅｃｈ、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）；ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＤＲ−００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＨＲ１２１０、またはＩＮＣＳＨＲ１２１０；Ｉｎｃｙｔｅ、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。ある特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合断片は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ−３２８０Ａ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＬＡＧ−３に結合する。ある特定の実施形態では、ＬＡＧ−３に結合する抗体またはその抗体結合断片は、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＧＳＫ２８３１７８１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、またはＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＣＴＬＡ−４に結合する。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４に結合する抗体またはその抗体結合断片は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）、ＢＭＳ−７３４０１６、ＭＤＸ０１０、ＭＤＸ−１０１；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、またはトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＯＸ４０に結合する。ある特定の実施形態では、ＯＸ４０に結合する抗体またはその抗体結合断片は、ＭＥＤＩ６４６９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ０５６２（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、またはＫＨＫ４０８３（協和発酵キリン株式会社）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＧＩＴＲに結合する。ある特定の実施形態では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗体結合断片は、ＴＲＸ５１８（Ｌｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）またはＭＥＤＩ１８７３（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に結合する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に結合する抗体またはその抗体結合断片は、ＰＦ−２５６６（ＰＦ−０５０８２５６６；Ｐｆｉｚｅｒ）、またはウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＣＤ２７に結合する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２７に結合する抗体またはその抗体結合断片は、バルリルマブ（ｖａｒｉｌｕｍａｂ）（ＣＤＸ−１１２７；Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、レナリドミドまたはポマリドミドを含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、ＨＤＡＣ阻害剤を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＣＳ−１抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＣＤ３８抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＣＤ１３８抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＰＤ−１抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、ＣＣ−１２２を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、ＣＣ−２２０を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ）を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＤＬＬ４抗体・抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＲＳＰＯ３抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を含む抗がん治療レジメンの一部である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、がんを有する個体の処置は、ホモハリントニン（例えば、オマセタキシンメペスクシナート）を含む抗がん治療レジメンの一部である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞を使用する、がんを有する個体の処置は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についての抗がん治療レジメンの一部である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞を使用する、がんを有する個体の処置は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についての抗がん治療レジメンの一部である。一実施形態では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載の方法を使用し製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での１つまたは複数の抗体（例えば、上段に記載の抗体）の投与を含む。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または他のＢ細胞悪性腫瘍（リンパ腫および白血病）、神経芽腫、黒色腫、乳がんおよび頭頸部がんを含むがこれらに限定されない、いくつかの型のがんを、そのようなＡＤＣＣ法を使用して処置することができる。具体的な実施形態では、ＡＤＣＣ療法は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での、次の抗体のうちの１つまたは複数の投与を含む：抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ））、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８もしくはｃｈ１４．１８）、または抗ＥｒＢ２抗体（例えば、ハーセプチン）。一実施形態では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載の方法を使用し製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での抗ＣＤ３３抗体の投与を含む。一実施形態では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載の方法を使用し製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での抗ＣＤ２０抗体の投与を含む。一実施形態では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載の方法を使用し製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での抗ＣＤ１３８抗体の投与を含む。一実施形態では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載の方法を使用し製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と併用での抗ＣＤ３２抗体の投与を含む。
５．１１．４．ウイルス感染症の処置
別の実施形態では、ウイルス感染症を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載する３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、ウイルス感染症を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載する３段階法を使用して製造されたＩＬＣ３細胞集団を前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、個体のウイルス感染症に対して活性のＮＫ細胞または他の自然リンパ球系細胞の欠乏を有する。ある特定の具体的な実施形態では、前記投与は、単離された胎盤潅流液、単離された胎盤潅流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤由来の中間ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞、および／またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を個体に投与することをさらに含む。ある特定の具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を、前記投与の前に、免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、またはサリドマイドと接触または近接させる。ある特定の他の具体的な実施形態では、前記投与は、本明細書に記載の方法を使用して製造された前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞に加えて、免疫調節化合物、例えば、上記の免疫調節化合物、またはサリドマイドを前記個体に投与することを含み、前記量は、例えば、前記ウイルス感染症の１つもしくは複数の症状の検出可能な改善、そのような症状の進行の緩和、またはそのような症状の除去をもたらす量である。具体的な実施形態では、ウイルス感染症は、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｏｍｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科のウイルスによる感染症である。より具体的な実施形態では、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ２）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ８）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）ウイルス（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）もしくは帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、もしくはソゴトウイルス）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、または風疹ウイルスである。
他のより具体的な実施形態では、前記ウイルスは、アデノウイルスＡ種、血清型１２、１８もしくは３１；アデノウイルスＢ種、血清型３、７、１１、１４、１６、３４、３５もしくは５０；アデノウイルスＣ種、血清型１、２、５もしくは６；Ｄ種、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５１；Ｅ種、血清型４；またはＦ種、血清型４０もしくは４１である。
ある特定の他のより具体的な実施形態では、ウイルスは、アポイウイルス（ＡＰＯＩＶ）、アロア（Ａｒｏａ）ウイルス（ＡＲＯＡＶ）、バガザ（ｂａｇａｚａ）ウイルス（ＢＡＧＶ）、バンジウイルス（ＢＡＮＶ）、ボウボイ（Ｂｏｕｂｏｕｉ）ウイルス（ＢＯＵＶ）、カシパコア（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ）ウイルス（ＣＰＣＶ）、カレー島ウイルス（ＣＩＶ）、カウボーンリッジウイルス（ＣＲＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、エッジヒルウイルス（ＥＨＶ）、ガジェッツガリー（Ｇａｄｇｅｔｓ Ｇｕｌｌｙ）ウイルス（ＧＧＹＶ）、イリェウスウイルス（ＩＬＨＶ）、イスラエルシチメンチョウ髄膜脳脊髄炎ウイルス（ＩＴＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジュグラウイルス（ＪＵＧＶ）、フティアパウイルス（ＪＵＴＶ）、カダムウイルス（ＫＡＤＶ）、ケドウゴウウイルス（ＫＥＤＶ）、ココベラウイルス（ＫＯＫＶ）、クタンゴウイルス（ＫＯＵＶ）、キャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、メアバンウイルス（ＭＥＡＶ）、モドックウイルス（ＭＯＤＶ）、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス（ＭＭＬＶ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ）、ウンタヤウイルス（ＮＴＡＶ）、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）、ポワサンウイルス（ＰＯＷＶ）、リオブラボーウイルス（ＲＢＶ）、ロイヤルファームウイルス（ＲＦＶ）、サボヤウイルス（ＳＡＢＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、サル・ヴィエジャウイルス（ＳＶＶ）、サン・パーリータウイルス（ＳＰＶ）、ソマレズリーフ（Ｓａｕｍａｒｅｚ Ｒｅｅｆ）ウイルス（ＳＲＥＶ）、セピック（Ｓｅｐｉｋ）ウイルス（ＳＥＰＶ）、テンブスウイルス（ＴＭＵＶ）、マダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、チューレーニーウイルス（ＴＹＵＶ）、ウガンダＳウイルス（ＵＧＳＶ）、ウスツウイルス（ＵＳＵＶ）、ウェッセルスブロンウイルス（ＷＥＳＳＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヤウンデウイルス（ＹＡＯＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、ヨコセウイルス（ＹＯＫＶ）、またはジカウイルス（ＺＩＫＶ）である。
他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、ならびに任意選択で胎盤潅流液および／または潅流液細胞は、１つまたは複数の他の抗ウイルス剤を含む抗ウイルス治療レジメンの一部として、ウイルス感染症を有する個体に投与される。ウイルス感染症を有する個体に投与することができる具体的な抗ウイルス剤としては、イミキモド、ポドフィロックス、ポドフィリン、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、レチコロス（ｒｅｔｉｃｏｌｏｓ）、ノノキシノール−９、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドホビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）およびオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｕｍａｖｉｒ）；プロテアーゼ阻害剤類、例えば、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルもしくはサキナビル；ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤類、例えば、ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビンもしくはジドブジン；および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤類、例えば、ネビラピンもしくはエファビレンツが挙げられるが、これらに限定されない。
５．１１．５．ＩＬＣ３細胞についての他の処置使用
本明細書で提供されるすべての方法において使用することができるＩＬＣ３細胞が本明細書で提供される。ＩＬＣ３細胞を使用することができる例示的方法は、下記の態様で開示される。
別の態様では、化学療法後に消化管を修復する方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法によるものである、方法が本明細書で提供される。
別の態様では、放射線から個体を保護する方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記ＩＬＣ３細胞は、骨髄移植の補助剤として使用される。
別の態様では、個体の胸腺を再構成する方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。
別の態様では、個体における病原体に対する防御免疫を促進する方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。ある特定の態様では、病原体に対する防御免疫の促進は、腸管感染症を処置するために行われる。ある特定の態様では、病原体に対する防御免疫の促進は、腸管感染症を予防するために行われる。ある特定の態様では、腸管感染症は、シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）である。
別の態様では、腫瘍拒絶方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。
別の態様では、臓器形成中に組織の完全性を維持する方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。
別の態様では、組織修復方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。
別の態様では、炎症調節方法であって、複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、前記ＩＬＣ３細胞が本明細書に記載の３段階法により製造されたものである、方法が本明細書で提供される。
５．１１．６．投与
細胞、例えば、胎盤潅流液細胞、例えば、胎盤潅流液からの有核細胞、混合ナチュラルキラー細胞、ＩＬＣ３細胞および／または単離されたナチュラルキラー細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の数の決定と、免疫調節化合物、例えば免疫調節化合物、またはサリドマイドの量の決定とを、互いに独立に行うことができる。
ＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、全身的であってもよく、または局所的であってもよい。具体的な実施形態では、投与は、非経口的である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与、または腫瘍内投与による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたは足場を用いて行われる。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞の注射は、局所注射である。より具体的な実施形態では、局所注射は、充実性腫瘍（例えば、肉腫）中への直接的注射である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射器による注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、誘導送達による。具体的な実施形態では、注射による対象へのＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡検査、超音波、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴、または放射線学により補助される。
５．１１．６．１．細胞の投与
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団は、ウイルス感染症、がん、または腫瘍細胞を有する個体、例えば、腫瘍細胞、充実性腫瘍または血液がんを有する個体、例えばがん患者、に対する検出可能な治療上の利点をもたらす任意の量または数、例えば有効量で、前記個体に使用、例えば投与される。そのような細胞をそのような個体に細胞の絶対数により投与することができ、例えば、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を投与することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞をそのような個体に細胞の相対数により投与することができ、例えば、前記個体に、前記個体の１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を投与することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞をそのような個体に細胞の相対数により投与することができ、例えば、前記個体に、前記個体の１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、または５×１０８個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を投与することができる。本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を、そのような個体に、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞ならびに任意選択で胎盤潅流液細胞および／またはナチュラルキラー細胞（本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞以外のもの）の数と、前記個体における腫瘍細胞の数（例えば、推定数）との近似比に従って投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を、前記個体における腫瘍細胞の数に対して約、少なくとも約、または最大で約１：１、１：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１の比で、前記個体に投与することができる。そのような個体における腫瘍細胞の数は、例えば、個体に由来する組織の試料、例えば、血液試料、生検試料などにおける腫瘍細胞の数を計数することにより、推定することができる。例えば充実性腫瘍についての、具体的な実施形態では、前記計数は、近似腫瘍量を得るために腫瘍（単数または複数）の撮像と組み合わせて行われる。具体的な実施形態では、免疫調節化合物またはサリドマイド、例えば、有効量の免疫調節化合物またはサリドマイドが、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、任意選択で胎盤潅流液細胞および／またはナチュラルキラー細胞（本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞以外のもの）に加えて、個体に投与される。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞の増殖を例えば個体において抑制する方法；自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置の方法；またはウイルス感染症を有する個体の処置の方法；またはがんを有する個体、例えば、腫瘍細胞、血液がんもしくは充実性腫瘍を有する個体の処置の方法は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞と胎盤潅流液および／または胎盤潅流液細胞の１つまたは複数との組合せと、腫瘍細胞を近接させること、またはそのような組合せを前記個体に投与することを含む。具体的な実施形態では、方法は、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと近接させること、または前記個体に免疫調節化合物もしくはサリドマイドを投与することをさらに含む。
具体的な実施形態では、例えば、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏（例えば、ＮＫ細胞数の欠乏、またはがん、腫瘍もしくはウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞の反応性の欠乏）を有する個体の処置、またはがんもしくはウイルス感染症を有する個体の処置、または腫瘍細胞増殖の抑制は、単離された胎盤潅流液細胞もしくは胎盤潅流液が補充された、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞を、前記腫瘍細胞と近接させること、またはそのようなＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞を前記個体に投与することを含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造された、１ミリリットル当たり約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上のＮＫ細胞、または本明細書に記載の方法を使用して製造された１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上のＮＫ細胞に、１ミリリットル当たり約、もしくは少なくとも約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上の単離された胎盤潅流液細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の単離された胎盤潅流液細胞が補充される。他のより具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造された約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上のＮＫ細胞、または本明細書に記載の方法を使用して製造された１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上のＮＫ細胞に、約、もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｍＬの潅流液、または約１単位の潅流液が補充される。
別の具体的な実施形態では、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置；がんを有する個体の処置；ウイルス感染症を有する個体の処置；または腫瘍細胞増殖の抑制は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞と腫瘍細胞を近接させること、またはそのようなＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞を個体に投与することを含み、この場合、前記細胞に、接着胎盤細胞、例えば、接着胎盤幹細胞または複能性細胞、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着胎盤細胞が補充される。具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞に、１ミリリットル当たり約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個以上の接着胎盤幹細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個以上の接着胎盤細胞、例えば、接着胎盤幹細胞もしくは複能性細胞が補充される。
別の具体的な態様では、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置；がんを有する個体の処置；ウイルス感染症を有する個体の処置；または腫瘍細胞増殖の抑制は、免疫調節化合物またはサリドマイドと、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞とを併用して行われ、この場合、前記細胞に、条件培地、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着胎盤細胞により条件付けられた培地、例えば、潅流液１単位当たり、または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、もしくは１０１１個当たり、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．１、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬの幹細胞条件培養培地が補充される。ある特定の実施形態では、組織培養プラスチック接着胎盤細胞は、（特許文献８）および（特許文献１５）に記載されている複能性接着胎盤細胞であり、前記特許文献の開示は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている。別の具体的な実施形態では、方法は、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと近接させること、または個体に免疫調節化合物もしくはサリドマイドを投与することをさらに含む。
本明細書に記載の方法を使用して製造された前記ＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞に胎盤潅流液細胞が補充される、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置、がんを有する個体の処置、ウイルス感染症を有する個体の処置、または腫瘍細胞増殖の抑制である、別の具体的な実施形態では、潅流液細胞は、前記近接が行われる前に、ある期間、インターロイキン２（ＩＬ−２）と近接される。ある特定の実施形態では、前記期間は、前記近接を行う前約、少なくとも、または最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８時間である。
本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、ならびに任意選択で潅流液または潅流液細胞は、ウイルス感染症を有する個体、がんを有する個体、または腫瘍細胞を有する個体に、抗がん治療の過程で１回投与することができ、あるいは、治療中に複数回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間に１回、または１、２、３、４、５、６もしくは７日に１回、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６週間以上に１回投与することができる。細胞および免疫調節化合物またはサリドマイドが使用される実施形態では、免疫調節化合物またはサリドマイド、および細胞または潅流液を個体に、一緒に、例えば、同じ製剤で投与することができ、別々に、例えば、別々の製剤で、ほぼ同時に投与することができ、または別々に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしくはその日の異なる時点で投与することができる。同様に、細胞および抗ウイルス化合物または抗がん化合物が使用される実施形態では、抗ウイルス化合物または抗がん化合物、および細胞または潅流液を個体に、一緒に、例えば、同じ製剤で投与することができ、別々に、例えば、別々の製剤で、ほぼ同時に投与することができ、または別々に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしくはその日の異なる時点で投与することができる。本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、ならびに潅流液または潅流液細胞を、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および／もしくはＩＬＣ３細胞、潅流液、または潅流液細胞が、過去に個体に投与されたことがあるかどうかに関係なく、投与することができる。
６．キット
本明細書では、例えば、本明細書に記載の方法によって産生されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して産生したＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団を含む組成物のような、本明細書に記載の組成物の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数のコンテナを含む医薬パックまたはキットが提供される。そのようなコンテナに任意選択で付随するのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された書式の通知であり、その通知は、機関によるヒトへの投与のための製造、使用または販売の承認を反映するものである。
本明細書に包含されるキットは、本明細書に記載の方法、例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法および／または、例えば、血液癌のようながんを治療する方法、および／またはウイルス感染を治療する方法に従って使用することができる。一実施形態では、キットは、１つまたは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法またはその組成物によって産生されたＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載の３段階方法によって産生されるＮＫ細胞および／またはＩＬＣ３細胞集団、またはその組成物を含むキットが本明細書において提供される。
７．実施例
７．１．実施例１：造血幹細胞または前駆細胞からナチュラルキラー細胞を産生する３段階法
ＣＤ３４＋細胞は、示された日数間、以下の培地処方で培養され、細胞数、細胞生存率、ナチュラルキラー細胞分化の特徴付けおよび機能評価のアセスメントのために、細胞の一定分量が採取される。
段階１培地：４．５Ｕ／ｍＬの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、２５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＦｌｔ３Ｌ、２７ｎｇ／ｍＬ組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−７、０．０５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−６（５００倍）、０．２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（５０倍）、０．０１ｎｇ／ｍＬ組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（５００倍）、０．１０％ゲンタマイシン、および１から１０μｍ ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）を補充した９０％幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ）（ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標））、１０％ヒト血清−ＡＢ。
段階２培地：４．５Ｕ／ｍＬの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＦｌｔ３Ｌ、２７ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬ組換え体ヒトＩＬ−７、２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５、０．０５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−６（５００倍）、０．２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＧ−ＣＳＦ（５０倍）、０．０１ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５００倍）、０．１０％ゲンタマイシン、および１から１０μｍ ＳＲ１を補充した９０％ＳＣＧＭ、１０％ヒト血清−ＡＢ。
段階３培地：２２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦ、１０００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−７、２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５、０．０５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−６（５００倍）、０．２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＧ−ＣＳＦ（５０倍）、０．０１ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５００倍）、および０．１０％ゲンタマイシンを補充した９０％ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、１０％ヒト血清−ＡＢ、０．０２５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（５５ｍＭ）。
０日目に、段階１培地内に３×１０４細胞／ｍＬで細胞を播種し、細胞をＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋計数による純度ならびに７ＡＡＤ染色による生存率について試験する。５日目に、細胞を計数し、段階１培地を用いて、１×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。７日目に、細胞を計数し、段階１培地を用いて、１×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。
１０日目に、細胞を計数し、段階２培地中で１×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。１２日目に、細胞を計数し、段階２培地中で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。
あるいは、１４日目まで以下のプロトコールを使用する：０日目に細胞を段階１培地中７．５×１０３細胞／ｍＬで播種し、細胞をＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋計数による純度および７ＡＡＤ染色による生存率について試験する。７日目に、細胞を計数し、段階１培地で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。９日目に、細胞を計数し、段階２培地で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。１２日目に、細胞を計数し、段階２培地中で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。
スピナーフラスコ内での動的分化のために、１４日目に細胞を遠心分離して濃縮し、計数し、段階３培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。１７日目に、細胞を遠心分離し、計数し、段階３培地中で７．５×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。２１日目に、細胞を遠心分離し、計数し、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６およびＣＤ９４について表現型分析し、７ＡＡＤ染色により生存率についてアッセイし、段階３培地中に１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。２４日目に、細胞を計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。２５日目から２７日目まで、１日当たり５ｍＬの段階３培地ずつ、容量を追加する。２８日目に、細胞を計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。３１日目に、細胞を計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。３２日目から３４日目まで、１日当たり５ｍＬの段階３培地ずつ、容量を追加する。３５日目に、細胞を収穫し、計数し、表現型分析し、細胞傷害性についてアッセイする。
静的分化のために、１４日目に、細胞を遠心分離して濃縮し、計数し、段階３培地中で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。１７日目に、細胞を計数し、段階３培地中で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。１９日目に、細胞を計数し、段階３培地中で３×１０５細胞／ｍＬの濃度に播種する。２１日目に、細胞を遠心分離し、計数し、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、およびＣＤ９４について表現型分析し、７ＡＡＤ染色により生存率についてアッセイし、段階３培地中で５×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。２４日目に、細胞を遠心分離し、計数し、段階３培地中で７．５×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。２６日目に、細胞を計数し、段階３培地中で７．５×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。２８日目に、細胞を計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。３１日目に、細胞を遠心分離し、計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。３３日目に、細胞を遠心分離し、計数し、段階３培地中で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に播種する。３５日目に、細胞を収穫し、計数し、表現型分析し、細胞傷害性についてアッセイする。
収穫のために、細胞を４００×ｇで７分間スピンさせ、その後、等しい容量のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中にペレットを懸濁する。懸濁液を４００×ｇで７分間スピンさせ、得られたペレットを１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）、６０％ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（ｖ／ｖ）中に標的細胞濃度で懸濁させる。次いで、細胞を７０μｍのメッシュに通し、最終コンテナに充填し、細胞のアリコートを生存率、細胞傷害性、純度および細胞数について試験し、残りをパッケージする。
７．２．実施例２：３段階法におけるＳＲ−１およびＣＨ２２３１９１の濃度の評価
Ｓｔｅｍｒｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）は、１μＭ、１０μＭおよび３０μＭの濃度で、上の実施例１に概要を述べた３段階法を使用して、段階１および段階２培地の成分として評価した。３段階法における同じ濃度のＣＨ２２３１９１もまた評価した。１０μＭでのＳＲ−１は、試験した他の２つの濃度よりも高い細胞傷害性をもたらした。１０μＭおよび１μＭ濃度の両方でＳＲ−１およびＣＨ２２３１９１について、増幅倍率、細胞純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）、および１０：１（Ｅ：Ｔ）比でのＫ５６２細胞の細胞傷害性に匹敵する効果が観察された（図１Ａ〜Ｃ）。ＳＲ−１およびＣＨ２２３１９１の両方もまた、７日目および１４日目のＣＤ３４の発現に関して同様の効果および傾向を示した。
７．３．実施例３：３段階ＮＫ細胞の特徴付け
方法
ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載のように、トロンボポエチン、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２を含むサイトカインの存在下で３５日間培養し、３段階ＮＫ細胞を産生した。３段階ＮＫ細胞の表現型特性を決定するために多色フローサイトメトリーを使用した。３５のＮＫサブタイプおよび他の表面マーカー（表１参照）を利用する１１の６マーカーパネルを評価した。
細胞傷害性アッセイは、３段階ＮＫ細胞を腫瘍細胞株と４時間共培養することによって行った。さらに、上清を回収し、分泌されたパーフォリン、グランザイムおよびサイトカインを分析した。
細胞溶解活性をさらに調べるために、免疫シナプス形成をモニターした。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒバイオレット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ）を用いて、ＮＫ感受性標的細胞（Ｋ５６２、慢性骨髄性白血病細胞）を標識した。３７℃で１５分間カバースリップ上の培養培地に等容量および細胞数のＮＫエフェクター細胞（１×１０６個／ｍｌ）および標的細胞を懸濁することによって、ＮＫ細胞／標的細胞複合体を形成した。その後、細胞を３％メタノール不含ホルムアルデヒドで固定し、透過処理した。Ｆアクチンは、Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲートファロイジンで染色された（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ）。Ｆアクチンと共にパーフォリン、ＣＤ２、またはＬＦＡ−１抗体同時染色については、スライドを一次抗体で１時間インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５色素コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。共焦点画像化は、２つのＨｙＤ検出器を装備したインバート型ＤＭＩ ６０００顕微鏡を備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８ ＬＩＡｃｈｒｏｉｃｓコンパクトユニットを使用して行った。
結果
実施例１に記載の培養プロセスを使用して、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の高純度集団（８８．３％±６．３％）が日常的に達成された。３段階ＮＫ細胞は、ＣＤ１６およびＫＩＲの低／陰性発現によって証明される、発生途中の免疫表現型を示した。３段階ＮＫ細胞は、天然の細胞傷害性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４）、ｃレクチン受容体（ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６１）、ＤＮＡＭ−１、２Ｂ４、ＣＤ１１７およびＣＤ１１ａを発現した（図２）。細胞溶解性メディエーター（パーフォリンおよびグランザイム）およびＥＯＭＥＳ、ＮＫ細胞成熟および細胞溶解機能の調節因子、もまた、３段階ＮＫ細胞において検出された（図２）。
３段階ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血液腫瘍細胞株に対して細胞傷害性を示した。１０：１のエフェクター対標的比では、３段階ＮＫ細胞は、ＣＭＬ（Ｋ５６２、７０．３％±１４．８％）、ＡＭＬ（ＨＬ−６０、３１．０％±１７．８％）および複数の骨髄腫（ＲＰＭＩ８２６６、３２．４％±１９．５％）を含む、細胞株を溶解した（図３）。３段階ＮＫ細胞はまた、高いパーフォリン産生および高度の顆粒化を示した（図４）。Ｋ５６２細胞と１：１の比で２４時間共培養した場合、３段階ＮＫ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを含む機能性サイトカインを産生した（図５および表２）。
１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、３段階ＮＫ細胞は、腫瘍細胞と接触している場合、パーフォリンの分極を伴うＦアクチン免疫学的シナプスを形成することが共焦点画像化により明らかになったが（図６Ａ〜Ｂ）、このことは細胞溶解活性の高さを示している。
さらに、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｄａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫、ＮＫ殺滅に耐性であるリンパ芽球様細胞株）に対する３段階ＮＫ細胞の細胞傷害性は、７．３％±８．０％から３５．１％±５．７％であり、このことは、強力な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示している。
７．４．実施例４：３段階ＮＫ細胞のさらなる特徴付け
図７に示すように、様々なエフェクター対標的比でのＣＭＬ、ＡＭＬ、および多発性骨髄腫細胞（それぞれＫ５６２、ＨＬ−６０、およびＲＰＭＩ８２２６）に対する３段階ＮＫ細胞の細胞傷害性を試験した。Ｋ５６２、ＨＬ６０、またはＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）の存在下では、異なるレベルのＣＤ１０７ａ発現が観察され、脱顆粒の指標となる（図８）。同様に、３段階ＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生の増加は、Ｋ５６２およびＨＬ６０細胞株と共培養した場合、またはＰＭＡ刺激した際に観察された（図９）。初代ＡＭＬ標的の存在下、２４時間のインキュベーション後にエフェクター対標的比３：１で４０％までの特異的溶解が観察され、ＮＫ殺滅に対するＡＭＬ標的の示差的感受性が観察された（図１０）。腫瘍細胞株および一次標的にわたる広い範囲のＩＦＮγ産生レベル、ならびに３段階ＮＫ細胞および初代ＡＭＬ標的の両方に対するドナー変動が観察された（図１１）。
表３に示すように、３段階ＮＫ細胞は、様々な腫瘍細胞株または初代ＡＭＬ標的（ＡＭＬ１〜４）の存在下で、様々な細胞溶解性酵素およびサイトカインを産生することが示された。
要約すると、３段階ＮＫ細胞は、種々の腫瘍細胞株にわたって細胞溶解活性を示し、腫瘍細胞と接触している場合およびＰＭＡによる活性化の際に、脱顆粒能を示し、腫瘍細胞と共培養した場合、またはＰＭＡにより活性化された際に、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＡおよびグランザイムＢを分泌した。さらに、３段階ＮＫ細胞は、エフェクター対標的比３：１で初代ＡＭＬ標的に対して２４時間の細胞溶解活性を示し、初代ＡＭＬ細胞に対してＩＦＮγを分泌する能力を示した。
７．５．実施例５：３段階ＮＫ細胞の２つの集団
ＦＡＣＳを使用して、３段階ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−集団をＣＤ１１ａ対ＣＤ１１７プロットで評価し、２つの細胞集団を示した（図１２）。ＣＤ１１ａ−画分（ＩＬＣ３）はＣＤ９４−であることが示され、ＣＤ１１ａ＋画分（ＮＫ）はＣＤ９４−およびＣＤ９４＋細胞の両方を含むことが示された（図１３）。さらに、ＣＤ１１ａ−およびＣＤ１１ａ＋細胞は、パーフォリン、エオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲγｔ）およびインターロイキン−１受容体１（ＩＬ１Ｒ１）の発現に基づいて区別することができ、ＣＤ１１ａ＋細胞はパーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現するが、ＲＯＲγｔおよびＩＬ１Ｒ１を発現せず、ＣＤ１１ａ−細胞はＲＯＲγｔおよびＩＬ１Ｒ１を発現するが、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現しなかった（図１４）。ドナーの間でパーフォリン、グランザイムＢ、ＥＯＭＥＳ、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ１Ｒ１、ＲＯＲγｔおよびアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の一貫した発現パターンが示されたが、パーフォリン、グランザイムＢ、ＥＯＭＥＳ、およびＴ−ｂｅｔではＣＤ１１ａ＋細胞によって主に発現され、ならびにＩＬ１Ｒ１、ＲＯＲγｔおよびＡＨＲではＣＤ１１ａ−細胞によって主に発現された（図１５）。ＣＤ１１ａ＋集団は伝統的なＮＫ細胞であると仮定されたが、ＣＤ１１ａ−集団はＩＬＣ３細胞であると仮定された。
２つの集団の機能解析を行うために、ＩＣＣＳ（細胞内サイトカイン染色）アッセイを使用して、３段階ＮＫ細胞におけるサイトカイン発現を検出した。１）ＰＭＡ＋イオノマイシン、ＩＦＮγについてのトリガー、２）ＰＭＡ＋イオノマイシンおよびＩＬ−２３（ＩＬ−２２を検出するため）、ならびに３）サイトカインＩＬ−１２＋ＩＬ−１８およびＩＬ１ｂ／ＩＬ−２３を用いて、６時間刺激し、ＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−細胞をそれぞれ誘発した。その後、ＣＤ５６／ＣＤ３／ＣＤ１１７／ＣＤ１１ａ／ＣＤ９４の発現：ＮＫ特異的である、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＩＬＣ３特異的である、ＩＬ−２２、ＩＬ−８の内容において、以下のサイトカインを分析した。ＣＤ１１ａ＋細胞がＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを発現し、ＣＤ１１ａ−細胞がＩＬ−２２およびＩＬ−８を発現することが決定された（図１６）。ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞の両方がＴＮＦαを発現した（図１６）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２２／ＩＬ−８の発現は互いに排他的であり、ＴＮＦαはＩＬ−２２およびＩＬ−８と同時発現することができることが示された（図１６）。
３段階ＮＫサブセット集団における活性化受容体の発現もまた決定された。主要なＮＫ活性化受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、およびＮＫＧ２ＤはＣＤ１１ａ＋細胞でのみ発現されることが見出された（図１７）。ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）および２Ｂ４（ＣＤ２４４）はＣＤ１１ａ−細胞上で発現することができた（図１８）。ＣＤ１６およびＫＩＲの発現は低く、ＣＤ９４＋細胞に限定されていた（図１９）。３段階ＮＫ細胞におけるこれらの活性化受容体の全発現をいくつかのドナーについて表４に要約する。
３段階ＮＫ細胞中に存在するＣＤ１１ａ−細胞は、例えば、ＲＯＲγｔおよびＡＨＲに関してそれぞれＩＬＣ３細胞について先に記載した発現パターンおよび刺激の際のＩＬ−２２の分泌を再現する。しかしながら、３段階細胞に見出されるＣＤ１１ａ−（「ＩＬＣ３」）細胞集団は、ＩＬＣ３細胞について以前に記載されていない特性、例えばＴ−ｂｅｔ、ＴＮＦα、ＤＮＡＭ−１および２Ｂ４の発現を有する。
７．６．実施例６：３段階ＮＫ細胞の２つの集団の機能的評価
方法
３段階ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を、製造業者により提供されたプロトコールに従い、ＦＩＴＣセレクションキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃１８５５２）によりＣＤ１１ａ＋またはＣＤ９４＋細胞のいずれかを富化するために供した。富化の後、選択した集団の純度をＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃５６０８４２）、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃５６０１７６）、ＣＤ１１ａ− ＦＩＴＣ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃５５５３８３）、またはＣＤ９４−ＦＩＴＣ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ＃５５５３８８）により評価した。選択された集団の細胞傷害活性を、示されるような異なるＥ（エフェクター）：Ｔ（標的）比で、Ｋ５６２に対する４時間の細胞傷害性アッセイによって試験した。要約すると、Ｋ５６２細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃ ＰＫＨ２６−ＧＬ）で標識し、９６ウェルＵ底組織培養プレートに入れ、１０％ＦＢＳを補充した２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中に、示されるような異なるＥ：Ｔ比で、ＮＫ細胞とともにインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、細胞を収穫し、ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ Ｔ３６０５）を最終濃度１μＭの培養物に添加し、続いてＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを使用してＦＡＣＳ分析した。細胞傷害性は、全ＰＫＨ２６＋標的腫瘍細胞内の死細胞（ＰＫＨ２６＋ＴＯ−ＰＲＯ−３＋）のパーセンテージとして表した。
結果と考察
表５に示すように、ＣＤ１１ａ＋の９８％純度、またはＣＤ９４＋細胞の９１％が、富化手順を用いて達成された。ＣＤ１１ａ＋集団は、Ｅ：Ｔ比２．５：１でＫ５６２に対して最も高い細胞傷害性（６７．４％）を示す一方で、未分画の３段階ＮＫ細胞は、６１．３％の細胞傷害性を示し、ＣＤ１１ａ−細胞は、３６．０％の細胞傷害性を示した。
これらの結果は、ＮＫ富化ＣＤ１１ａ＋ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞が、Ｋ５６２細胞に対して高い細胞傷害性を示し、ＩＬＣ３富化ＣＤ１１ａ−ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞も、未分画細胞またはＮＫ富化細胞と比較してより低いレベルで細胞溶解活性を示すことを示す。ＣＤ１１ａ−ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞集団によって示される細胞傷害性は、前に記載したＩＬＣ３細胞と比較して、３段階ＩＬＣ３細胞の別のユニークな特性である。
７．７．実施例７：３段階ＮＫ細胞の純度および活性における様々なサイトカイン濃度の影響
合計１５の異なる条件を評価して、３段階ＮＫ細胞に見出される２つ（ＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−）の集団に対する実施例１の第３培地の様々な成分の効果を決定した。表６は、試験した異なる条件をまとめたものである。
細胞表面マーカーＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１１７、ＣＤ９４、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３４、およびＣＤ１４／ＣＤ１５ならびに細胞内マーカーＲＯＲγｔ、ＡＨＲ、およびパーフォリンを含む、０、７、１４、２１、２８および３５日目の評価に、フローサイトメトリーパネル（表７）を利用した。
２８日目の発現データを図２０Ａ〜Ｄに示す。１５条件にわたる結果の要約は、表８に見出すことができる。
要約すると、第３培地中の低ＳＣＦおよび第３培地中のＳＲ１の存在は、ＮＫ（ＣＤ１１ａ＋）細胞産生にとって有利であるが、第３培地中のＳＲ１の不在は、ＩＬＣ３（ＣＤ１１ａ−）細胞産生にとって有利であることが見出された。
７．８．実施例８：３段階ＮＫ細胞の２つの集団のさらなる特性決定および機能評価
ＦＡＣＳを使用して、３段階ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−集団をＣＤ１１ａ対ＣＤ１１７プロットで評価し、２つの細胞の集団、ＣＤ１１ａ−画分およびＣＤ１１ａ＋画分は、Ｋ５６２細胞の存在下において、ＣＤ１０７ａ発現によって区別することができることが示された（図２１Ａ〜Ｂ）。ＣＤ１１ａ＋画分は、Ｋ５６２細胞の存在下で有意に高いＣＤ１０７ａ＋画分によって測定されるように、脱顆粒が可能であることが示された（図２１Ｃ）。
３段階ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−集団の８１％画分を構成するＣＤ１１ａ＋細胞、および３段階ＮＫ細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−集団の５％画分を構成するＣＤ１１ａ−細胞を、Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性について試験した（図２２）。ＣＤ１１ａ＋富化集団は、ＣＤ１１ａ−富化集団と比較して、特に高いエフェクター：標的細胞比において高いＫ５６２細胞傷害性を示した（図２２）。
その後、エフェクター：標的比が１：１でのエフェクター細胞として、それぞれＫ５６２標的細胞およびＣＤ１１ａ陽性および陰性細胞とのオーバーナイトの同時培養によって、サイトカイン分泌分析を行った。次いで、上清を回収し、多重分析した。Ｋ５６２細胞の存在下および非存在下で、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、パーフォリン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２を含む特定の試験したサイトカインの発現において、ＣＤ１１ａ−およびＣＤ１１ａ＋細胞を区別することができた（表９および図２３）。サイトカインＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦβおよびＩＬ−１０は、低レベルで見出されるかまたは検出未満であった（表９）。
表１０は、上で特徴付けられたＣＤ１１ａ陽性および陰性細胞の要約を提供する。
均等物：
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本明細書で引用した全ての参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、本発明が先行発明によりその刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

Claims (243)

  1. ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
    （ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；
    （ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに
    （ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）のそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ
    を含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも８０％が生存している、方法。
  2. 細胞の前記第３の集団がＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む、請求項１記載の方法。
  3. 細胞の前記第３の集団がＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む、請求項１記載の方法。
  4. 細胞の前記第３の集団がＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む、請求項１記載の方法。
  5. 細胞の前記第３の集団がＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む、請求項１記載の方法。
  6. ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
    （ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；
    （ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに
    （ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ
    を含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法。
  7. 第３の培地が幹細胞因子（ＳＣＦ）を欠いている、請求項６記載の方法。
  8. 第３の培地がＬＭＷＨを欠いている、請求項７記載の方法。
  9. （ｄ）細胞の第３の集団〜ＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、細胞の第４の集団を製造するステップをさらに含み、
    細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む、請求項７記載の方法。
  10. 前記ナチュラルキラー細胞がパーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現する、請求項６〜９のうちいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ナチュラルキラー細胞がＲＯＲγｔもＩＬ１Ｒ１も発現しない、請求項６〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
  12. ＩＬＣ３細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
    （ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；
    （ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；ならびに
    （ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ
    を含み、細胞の第３の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、方法。
  13. 第３の培地が幹細胞動員剤を含む、請求項１２記載の方法。
  14. 第３の培地がＳＣＦを含む、請求項１２記載の方法。
  15. 第３の培地が幹細胞動員剤およびＳＣＦを含む、請求項１２記載の方法。
  16. ＩＬＣ３細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
    （ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；
    （ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；
    （ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに
    （ｄ）細胞の第３の集団〜ＣＤ１１ａ−細胞を単離して、細胞の第４の集団を製造するステップを含み、
    細胞の第４の集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ−であるＩＬＣ３細胞を含む、方法。
  17. 前記ＩＬＣ３細胞がＲＯＲγｔおよびＩＬ１Ｒ１を発現する、請求項１２〜１６のうちいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＩＬＣ３細胞がパーフォリンもＥＯＭＥＳも発現しない、請求項１２〜１７のうちいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記第３の培地が脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている、請求項１〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記造血幹細胞または前駆細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記造血幹細胞または前駆細胞がヒト細胞である、請求項２０記載の方法。
  22. 前記造血幹細胞または前駆細胞が霊長類細胞である、請求項２０記載の方法。
  23. 前記造血幹細胞または前駆細胞がイヌ細胞である、請求項２０記載の方法。
  24. 前記造血幹細胞または前駆細胞がげっ歯類細胞である、請求項２０記載の方法。
  25. 前記造血幹細胞または前駆細胞がヒト、霊長類、イヌまたはげっ歯類以外の哺乳動物由来の細胞である、請求項２０記載の方法。
  26. 前記造血幹細胞または前駆細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記造血幹細胞または前駆細胞が胎盤細胞である、請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記胎盤細胞が、ヒト胎盤潅流液から得られる、または得ることができる、請求項２７記載の方法。
  29. 前記胎盤細胞が、ヒト胎盤潅流液から単離された有核細胞から得られる、または得ることができる、請求項２７記載の方法。
  30. 前記造血幹細胞または前駆細胞が、臍帯血から得られる、または得ることができる、請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記造血幹細胞または前駆細胞が胎児肝臓細胞である、請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記造血幹細胞または前駆細胞が動員末梢血細胞である、請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記造血幹細胞または前駆細胞が骨髄細胞である、請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記Ｔｐｏが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在する、請求項１〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記Ｔｐｏが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在する、請求項３４記載の方法。
  36. 前記Ｔｐｏが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在する、請求項３４記載の方法。
  37. 前記ＩＬ−１５が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２の培地中に存在する、請求項１〜３６のうちいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＩＬ−１５が１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２の培地中に存在する、請求項３７記載の方法。
  39. 前記ＩＬ−１５が約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２の培地中に存在する、請求項３７記載の方法。
  40. 前記ＩＬ−２が１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する、請求項１〜３９のうちいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記ＩＬ−２が３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する、請求項１〜３９のうちいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ＩＬ−２が約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３の培地中に存在する、請求項１〜３９のうちいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれていない、請求項１〜４２のうちいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が血清中に含まれていない、請求項１〜４２のうちいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記幹細胞動員剤がアリール炭化水素受容体阻害剤である、請求項１〜４４のうちいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記アリール炭化水素受容体阻害剤がレスベラトロールである、請求項４５記載の方法。
  47. 前記アリール炭化水素受容体阻害剤が以下の式
    の化合物
    （式中、
    Ｇ１は、ＮおよびＣＲ３〜選択され、
    Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、ＣＨおよびＮ〜独立に選択され、ただし、Ｇ３およびＧ４のうちの少なくとも１つは、Ｎであることを条件とし、ただし、Ｇ１およびＧ２は、両方がＮであるわけではないことを条件とし、
    Ｌは、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）０−３−−、−−ＮＲ５ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２ＮＲ５ｂ−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２Ｓ−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−−および−−ＮＲ５ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−〜選択され、Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、水素およびＣ１−４アルキル〜独立に選択され、
    Ｒ１は、水素、フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルおよびチアゾリル〜選択され、Ｒ１の前記フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルまたはチアゾリルは、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、ハロ置換Ｃ１−４アルキル、ハロ置換Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ８ａ、−−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ８ａ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８ａ および−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８ａＲ８ｂ〜独立に選択される１〜３個の基により任意選択で置換することができ、Ｒ８ａおよびＲ８ｂは、水素およびＣ１−４アルキル〜独立に選択され、ただし、Ｒ１およびＲ３は、両方が水素であるわけではないことを条件とし、
    Ｒ２は、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６ａＲ６ｂ、−−ＮＲ９ａＣ（Ｏ）Ｒ９ｂ、−−ＮＲ６ａＣ（Ｏ）ＮＲ６ｂＲ６ｃ、フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルおよび１Ｈ−インダゾリル〜選択され、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ６ｃは、水素およびＣ１−４アルキル〜独立に選択され、Ｒ２の前記フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルまたは１Ｈ−インダゾリルは、ヒドロキシ、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７ａＲ７ｂ、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂ、−−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂおよび−−ＮＲ７ａＳ（Ｏ）２Ｒ７ｂ〜独立に選択される１〜３個の基で任意選択で置換され、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、水素およびＣ１−４アルキル〜独立に選択され、
    Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキルおよびビフェニル〜選択され、
    Ｒ４は、Ｃ１−１０アルキル、プロパ−１−エン−２−イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルおよび１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチル〜選択され、前記アルキル、シクロプロピル、シクロヘキシル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、オキセタン−２−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−２−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルまたは１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキルおよびハロ置換Ｃ１−４アルキル〜独立に選択される１〜３個の基で置換することができる）またはその塩である、請求項４５記載の方法。
  48. 前記アリール炭化水素受容体阻害剤がＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）（４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール）である、請求項４５記載の方法。
  49. 前記アリール炭化水素受容体阻害剤が化合物ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド］である、請求項４５記載の方法。
  50. 前記幹細胞動員剤がピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体である、請求項１〜４４のうちいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が
    のうちの１つもしくは複数
    またはその塩もしくはプロドラッグであり、式中、
    Ｚは、
    １）−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
    ２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
    ３）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    ４）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    ５）−Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
    ６）−ＣＮ、
    ７）−ＳＲ、
    ８）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
    ９）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
    １０）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    １１）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
    １２）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    １３）−Ｌ、
    １４）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
    １５）Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
    １６）Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
    １７）Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
    １８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
    １９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
    であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、（Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で任意選択で置換されている、Ｎ、ＯおよびＳ〜選択される１つもしくは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、
    Ｗは、
    １）−Ｈ、
    ２）−ハロゲン、
    ３）−ＯＲ＜１＞、
    ４）−Ｌ−ＯＨ、
    ５）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
    ６）−ＳＲ＜１＞、
    ７）−ＣＮ、
    ８）−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
    ９）−ＮＨＲ＜１＞、
    １０）−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
    １１）−Ｌ−ＮＨ２、
    １２）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
    １３）−Ｌ−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
    １４）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
    １５）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
    １６）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    １７）−Ｌ−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞
    １８）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
    １９）−Ｃ（０）ＮＨ２、
    ２０）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    ２１）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
    ２２）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
    ２３）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、−ＮＨＣ（０）０Ｒ＜１＞、
    −ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
    −０Ｃ（０）ＮＨ２、
    −０Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    −０Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    −０Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
    −Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
    −ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
    −ＮＨＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    −ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    −ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
    −ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    −ＮＲＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    −ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
    −ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
    −Ｓ（０）２ＮＨ２、
    −Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
    −Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    −Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
    −Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    −０Ｓ（０）２Ｒ１、
    −Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
    １つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
    Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
    Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
    Ｌおよびアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
    −Ｌ−ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
    −Ｌ−）２ＮＲ＜１＞、
    −Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
    Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
    Ｌおよびアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
    −Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリール、
    Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、
    Ｌおよびアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−アリール、
    −Ｏ−Ｌ）２−ＮＲ＜１＞、
    −Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ ）Ｒ＜１＞、
    Ｌおよびヘテロアリール基いずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
    Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
    １つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
    １つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリール、
    １つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリル、
    Ｌおよびアリール基のうちいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−アリール、
    −Ｓ−Ｌ）２ＮＲ１、
    −Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）’’−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
    １つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
    −ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
    −（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
    −Ｎ（Ｒ１）Ｌ）２−ＮＲ１、７６）−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）’’−Ｎ（Ｒ１）ＲＡ、
    ７７）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
    ７８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
    ７９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
    ８０）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
    ８１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
    であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、２つのＲ＜１＞置換基が同じ窒素原子上に存在する場合、各Ｒ＜１＞置換基は、後に述べるＲ＜１＞の値のリスト〜独立に選択され、
    ｎは、０、１、２、３、４または５に等しい整数であり、
    （Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳ〜選択される１つまたは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、任意選択で環は、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で置換されており、
    Ｌは、
    １）−Ｃｉ〜６アルキル、
    ２）−Ｃ２〜６アルケニル、
    ３）−Ｃ２〜６アルキニル、
    ４）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
    ５）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
    ６）ヘテロシクリル、
    ７）−Ｃｉ〜６アルキル−Ｃ３〜７シクロアルキル、
    ８）−Ｃｉ〜６アルキル−ヘテロシクリル、
    ９）アリール、または
    １０）ヘテロアリール
    であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリール基は、１つまたは２つのＲ＜Ａ＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
    Ｒｉは、
    １）−Ｈ、
    ２）−Ｃ１〜６アルキル、
    ３）−Ｃ２〜６アルケニル、
    ４）−Ｃ２〜６アルキニル、５）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
    ６）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
    ７）−Ｃ１〜５過フッ化、
    ８）−ヘテロシジル、
    ９）−アリール、
    １０）−ヘテロアリール、
    １１）−ベンジル、または
    １２）５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル
    であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、ペルフルオロ化アルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびベンジル基は、１つ、２つまたは３つのＲ＜Ａ＞またはＲ＜１＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
    Ｒ２は、
    １）−Ｈ、
    ２）−Ｃ１〜６アルキル、
    ３）−ＳＲ、
    ４）−Ｃ（０）Ｒ１、
    ５）−Ｓ（０）Ｒ１、
    ６）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    ７）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
    ８）Ｌおよびヘテロアリール基のうちいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
    ９）Ｌおよびヘテロシクリル基のうちいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
    １０）Ｌおよびアリール基のうちいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
    １１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
    １２）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
    であり、各置換基は、それが既に存在していない場合にはＬ基に任意選択で結合されており、
    Ｒ＜Ａ＞は、
    １）−ハロゲン、
    ２）−ＣＦｓ、３）−ＯＨ、
    ４）−ＯＲ＜１＞、
    ５）−Ｌ−ＯＨ、
    ６）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
    ７）−ＯＣＦｓ、
    ８）−ＳＨ、
    ９）−ＳＲ１、
    １０）−ＣＮ、
    １１）−ＮＯ２、
    １２）−ＮＨ２、
    １３）−ＮＨＲ＜１＞、
    １４）−ＮＲ＜１＞Ｒ＜１＞、
    １５）−Ｌ−ＮＨ２、
    １６）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
    １７）−Ｌ−ＮＲ＜４＞Ｒ＜１＞、
    １８）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
    １９）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
    ２０）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    ２１）−Ｃ（０）ＯＨ、
    ２２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
    ２３）−Ｃ（０）ＮＨ２、
    ２４）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    ２５）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
    ２６）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
    ２７）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
    ２８）−ＮＨＣ（０）ＯＲ＜１＞、
    ２９）−ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
    ３０）−ＯＣ（０）ＮＨ２、
    ３１）−ＯＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    ３２）−ＯＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    ３３）−ＯＣ（０）Ｒ＜１＞、
    ３４）−Ｃ（０）Ｒ１、３５）−ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
    ３６）−ＮＨＣ（０）ＮＨＲ１、
    ３７）−ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    ３８）−ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
    ３９）−ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
    ４０）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
    ４１）−ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
    ４２）−ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
    ４３）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
    ４４）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
    ４５）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
    ４６）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
    ４７）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    ４８）−０Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
    ４９）−Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
    ５０）−ベンジル、
    ５１）−Ｎ３、または
    ５２）−Ｃ（−Ｎ＝Ｎ−）（ＣＦ３）
    であり、ベンジル基は、１つ、２つまたは３つのＲ＜Ａ＞またはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている、請求項５０記載の方法。
  52. 前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
    を有する、請求項５０記載の方法。
  53. 前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
    を有する、請求項５０記載の方法。
  54. 前記第１の培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜５３のうちいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記第１の培地がＬＭＷＨを含まない、請求項１〜５４のうちいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記第１の培地が脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない、請求項５５記載の方法。
  57. 前記第１の培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む、請求項５４記載の方法。
  58. 前記第１の培地がＦｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む、請求項５５または５６記載の方法。
  59. 第１の培地中にＬＭＷＨが１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５４または請求項５７記載の方法。
  60. 第１の培地中にＬＭＷＨが４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５４または請求項５７記載の方法。
  61. 第１の培地中にＬＭＷＨが約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第１の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５４または請求項５７記載の方法。
  62. 第１の培地中にＦｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５５または請求項５８記載の方法。
  63. 第１の培地中にＦｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５５または請求項５８記載の方法。
  64. 第１の培地中にＦｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５５または請求項５８記載の方法。
  65. 前記第２の培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜６４のうちいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記第２の培地がＬＭＷＨを含まない、請求項１〜６５のうちいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記第２の培地が脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない、請求項６６記載の方法。
  68. 前記第２の培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれをさらに含む、請求項１〜６５のうちいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記第２の培地がＦｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれをさらに含む、請求項１〜６６のうちいずれか１項に記載の方法。
  70. 第２の培地中にＬＭＷＨが１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６５または請求項６８記載の方法。
  71. 第２の培地中にＬＭＷＨが４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６５または請求項６８記載の方法。
  72. 第２の培地中にＬＭＷＨが約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２の培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６５または請求項６８記載の方法。
  73. 第２の培地中にＦｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６６または請求項６９記載の方法。
  74. 第２の培地中にＦｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６６または請求項６９記載の方法。
  75. 第２の培地中にＦｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項６６または請求項６９記載の方法。
  76. 前記第３の培地がＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜７５のうちいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記第３の培地がＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む、請求項７６記載の方法。
  78. 第３の培地中にＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７６または請求項７７記載の方法。
  79. 第３の培地中にＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７６または請求項７７記載の方法。
  80. 第３の培地中にＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７６または請求項７７記載の方法。
  81. 第３の培地が１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている、請求項６〜１１および１９〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  82. 第３の培地が２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている、請求項６〜１１および１９〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  83. 第３の培地が２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５および１０μＭ ＳＲ１を含み、ＳＣＦを欠いている、請求項６〜１１および１９〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  84. 第３の培地が１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている、請求項１２〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  85. 第３の培地が２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている、請求項１２〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  86. 第３の培地が２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５を含み、ＳＲ１を欠いている、請求項１２〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  87. 第３の培地が２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７、２２ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦおよび１０００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含み、ＳＲ１を欠いている、請求項１２〜３３のうちいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦが第１の培地、第２の培地または第３の培地の組成不明の成分中に含まれていない、請求項５４〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦが血清中に含まれていない、請求項５４〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれもヒト血清ＡＢを含む、請求項１〜８９のうちいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも１％〜２０％のヒト血清ＡＢを含む、請求項９０記載の方法。
  92. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも５％〜１５％のヒト血清ＡＢを含む、請求項９０記載の方法。
  93. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも約１０％のヒト血清ＡＢを含む、請求項９０記載の方法。
  94. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも２−メルカプトエタノールを含む、請求項１〜９３のうちいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれもゲンタマイシンを含む、請求項１〜９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  96. 造血幹細胞を第１の培地中で７〜１３日間培養するステップを含む、請求項１〜９５のうちいずれか１項に記載の方法。
  97. 造血幹細胞を第１の培地中で８〜１２日間培養するステップを含む、請求項９６記載の方法。
  98. 造血幹細胞を第１の培地中で約１０日間培養するステップを含む、請求項９６記載の方法。
  99. 前記第２の培地中で細胞の前記第１の集団を２〜６日間培養するステップを含む、請求項１〜９５のうちいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記第２の培地中で細胞の前記第１の集団を３〜５日間培養するステップを含む、請求項１〜９５のうちいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記第２の培地中で細胞の前記第１の集団を約４日間培養するステップを含む、請求項１〜９５のうちいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記第３の培地中で細胞の前記第２の集団を１０〜３０日間培養するステップを含む、請求項１〜１０１のうちいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記第３の培地中で細胞の前記第２の集団を１５〜２５日間培養するステップを含む、請求項１〜１０１のうちいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記第３の培地中で細胞の前記第２の集団を約２１日間培養するステップを含む、請求項１〜１０１のうちいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記第１の培地、第２の培地および第３の培地中で前記培養するステップがすべて静的培養条件下で行われる、請求項１〜１０４のうちいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記第１の培地、第２の培地または第３の培地のうちの少なくとも１つで前記培養するステップがスピナーフラスコ中で行われる、請求項１〜１０４のうちいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記第１の培地および前記第２の培地中で前記培養するステップが静的培養条件下で行われ、前記第３の培地中で前記培養するステップがスピナーフラスコ中で行われる、請求項１〜１０４のうちいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記造血細胞を１×１０４〜１×１０５細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する、請求項１〜１０７のうちいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記造血細胞を約３×１０４細胞／ｍＬで前記第１の培地中に最初に接種する、請求項１０８記載の方法。
  110. 細胞の前記第１の集団を５×１０４〜５×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する、請求項１〜１０９のうちいずれか１項に記載の方法。
  111. 細胞の前記第１の集団を約１×１０５細胞／ｍＬで前記第２の培地中に最初に接種する、請求項１１０記載の方法。
  112. 細胞の前記第２の集団を１×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する、請求項１〜１１１のうちいずれか１項に記載の方法。
  113. 細胞の前記第２の集団を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する、請求項１１２記載の方法。
  114. 細胞の前記第２の集団を約５×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する、請求項１１２記載の方法。
  115. 細胞の前記第２の集団を約３×１０５細胞／ｍＬで前記第３の培地中に最初に接種する、請求項１１２記載の方法。
  116. 前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１１、１９〜８３および８８〜１１５のうちいずれか１項に記載の方法。
  117. 少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１１６記載の方法。
  118. 少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１１６記載の方法。
  119. 少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１１６記載の方法。
  120. 前記第１の培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２〜８０および８４〜１１５のうちいずれか１項に記載の方法。
  121. 少なくとも１０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２０記載の方法。
  122. 少なくとも５０，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２０記載の方法。
  123. 少なくとも７５，０００倍多いＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２０記載の方法。
  124. 少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜５、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  125. 少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜５、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  126. 少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜５、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  127. 少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜５、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  128. 少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１１、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  129. 少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１１、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  130. 少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１１、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  131. 少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１１、１９〜８３および８８〜１１９のうちいずれか１項に記載の方法。
  132. 少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２〜８０、８４〜１１５および１２０〜１２３のうちいずれか１項に記載の方法。
  133. 少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２〜８０、８４〜１１５および１２０〜１２３のうちいずれか１項に記載の方法。
  134. 少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むＩＬＣ３細胞を製造する、請求項１２〜８０、８４〜１１５および１２０〜１２３のうちいずれか１項に記載の方法。
  135. 少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ−ＩＬＣ３細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１２〜８０、８４〜１１５および１２０〜１２３のうちいずれか１項に記載の方法。
  136. 前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記ナチュラルキラー細胞が前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す、請求項１〜１１、１９〜８３、８８〜１１９および１２４〜１３１のうちいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す、請求項１３６記載の方法。
  138. 前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す、請求項１３６記載の方法。
  139. 前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す、請求項１３６記載の方法。
  140. 前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す、請求項１３６記載の方法。
  141. 前記ＩＬＣ３細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記ＩＬＣ３細胞が前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す、請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３および１３２〜１３５のうちいずれか１項に記載の方法。
  142. 前記ＩＬＣ３細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す、請求項１４１記載の方法。
  143. 前記ＩＬＣ３細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す、請求項１４１記載の方法。
  144. 前記ＩＬＣ３細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す、請求項１４１記載の方法。
  145. 前記ＩＬＣ３細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す、請求項１４１記載の方法。
  146. 前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１および１３６〜１４０のうちいずれか１項に記載の方法。
  147. 前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１および１３６〜１４０のうちいずれか１項に記載の方法。
  148. 前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１および１３６〜１４０のうちいずれか１項に記載の方法。
  149. 前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１および１３６〜１４０のうちいずれか１項に記載の方法。
  150. ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の後に細胞の前記集団を凍結保存するステップをさらに含む、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  151. ステップ（ｃ）の後に細胞の前記集団を凍結保存するステップをさらに含む、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  152. 前記第１の培地および／または前記第２の培地が白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠いている、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  153. 前記第３の培地がＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠いている、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  154. 前記第１の培地および前記第２の培地がＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地がＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  155. 第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれも脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  156. 第１の培地、第２の培地または第３の培地がヘパリンを含む、請求項１〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  157. 前記ヘパリンが低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である、請求項１５６記載の方法。
  158. ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の後に前記ナチュラルキラー細胞を凍結保存するステップをさらに含む、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１、１３６〜１４０および１４６〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法。
  159. 請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１、１３６〜１４０および１４６〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法により製造されるナチュラルキラー細胞の集団。
  160. 請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１、１３６〜１４０および１４６〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法により製造される、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団。
  161. 請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造されるＩＬＣ３細胞の集団。
  162. 請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造される、ＩＬＣ３細胞を含む細胞の集団。
  163. 請求項１〜８および１０〜１５のうちいずれか１項に記載の細胞の第３の集団を含む細胞の集団。
  164. 請求項９または請求項１６記載の細胞の第４の集団を含む細胞の集団。
  165. 腫瘍細胞を、請求項１〜５、１９〜８３、８８〜１１９、１２４〜１３１、１３６〜１４０および１４６〜１４９のうちいずれか１項に記載の方法により製造される複数のナチュラルキラー細胞と接触させるステップを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
  166. 前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１６５記載の方法。
  167. 前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１６５記載の方法。
  168. 前記接触させるステップがヒト個体において行われる、請求項１６７記載の方法。
  169. 前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与するステップを含む、請求項１６７記載の方法。
  170. 前記腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  171. 前記腫瘍細胞が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  172. 前記個体が再発性／難治性ＡＭＬを有する、請求項１７１記載の方法。
  173. 前記個体がＡＭＬに対する少なくとも１回の非生得リンパ球（ＩＬＣ）療法が奏功しなかったＡＭＬを有する、請求項１７１記載の方法。
  174. 前記個体が６５歳以上であり、第１寛解期にある、請求項１６５記載の方法。
  175. 前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、前記個体がフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている、請求項１６５〜１６８のうちいずれか１項に記載の方法。
  176. 前記腫瘍細胞が乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である、請求項１５９〜１６３のうちいずれか１項に記載の方法。
  177. 前記腫瘍細胞が原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である、請求項１５９〜１６３のうちいずれか１項に記載の方法。
  178. 前記腫瘍細胞が充実性腫瘍細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  179. 前記腫瘍細胞が肝臓腫瘍細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  180. 前記腫瘍細胞が肺腫瘍細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  181. 前記腫瘍細胞が膵臓腫瘍細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  182. 前記腫瘍細胞が腎臓腫瘍細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  183. 前記腫瘍細胞が多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である、請求項１６５〜１６９のうちいずれか１項に記載の方法。
  184. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３３抗体とともに投与する、請求項１６５〜１８３のうちいずれか１項に記載の方法。
  185. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ２０抗体とともに投与する、請求項１６５〜１８３のうちいずれか１項に記載の方法。
  186. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ１３８抗体とともに投与する、請求項１６５〜１８３のうちいずれか１項に記載の方法。
  187. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３２抗体とともに投与する、請求項１６５〜１８３のうちいずれか１項に記載の方法。
  188. 前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている、請求項１６５〜１８７のうちいずれか１項に記載の方法。
  189. 前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない、請求項１６５〜１８７のうちいずれか１項に記載の方法。
  190. 腫瘍細胞を、請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造される複数のＩＬＣ３細胞と接触させるステップを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
  191. 前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１９０記載の方法。
  192. 前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１９０記載の方法。
  193. 前記接触させるステップがヒト個体において行われる、請求項１９２記載の方法。
  194. 前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与するステップを含む、請求項１９２記載の方法。
  195. 前記腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  196. 前記腫瘍細胞が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  197. 前記個体が再発性／難治性ＡＭＬを有する、請求項１９６記載の方法。
  198. 前記個体がＡＭＬに対する少なくとも１回の非生得リンパ球（ＩＬＣ）療法が奏功しなかったＡＭＬを有する、請求項１９６記載の方法。
  199. 前記個体が６５歳以上であり、第１寛解期にある、請求項１９６記載の方法。
  200. 前記ＩＬＣ３細胞を投与する前に、前記個体がフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている、請求項１９６〜１９９のうちいずれか１項に記載の方法。
  201. 前記腫瘍細胞が乳がん細胞、頭頸部がん細胞または肉腫細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  202. 前記腫瘍細胞が原発性乳管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽腫細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  203. 前記腫瘍細胞が充実性腫瘍細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  204. 前記腫瘍細胞が肝臓腫瘍細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  205. 前記腫瘍細胞が肺腫瘍細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  206. 前記腫瘍細胞が膵臓腫瘍細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  207. 前記腫瘍細胞が腎臓腫瘍細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  208. 前記腫瘍細胞が多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である、請求項１９０〜１９４のうちいずれか１項に記載の方法。
  209. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３３抗体とともに投与する、請求項１９０〜２０８のうちいずれか１項に記載の方法。
  210. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ２０抗体とともに投与する、請求項１９０〜２０８のうちいずれか１項に記載の方法。
  211. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ１３８抗体とともに投与する、請求項１９０〜２０８のうちいずれか１項に記載の方法。
  212. 前記ナチュラルキラー細胞を抗ＣＤ３２抗体とともに投与する、請求項１９０〜２０８のうちいずれか１項に記載の方法。
  213. 前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ＩＬＣ３細胞が凍結保存されている、請求項１９０〜２１２のうちいずれか１項に記載の方法。
  214. 前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ＩＬＣ３細胞が凍結保存されていない、請求項１９０〜２１２のうちいずれか１項に記載の方法、請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造される複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む、化学療法後の消化管を修復する方法。
  215. 請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造される複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む、放射線〜個体を保護する方法。
  216. 前記ＩＬＣ３細胞を骨髄移植の補助として使用する、請求項２１０記載の方法。
  217. 請求項１２〜８０、８４〜１１５、１２０〜１２３、１３２〜１３５および１４１〜１４５のうちいずれか１項に記載の方法により製造される複数のＩＬＣ３細胞を個体に投与するステップを含む、個体の胸腺を再構成する方法。
  218. 前記ナチュラルキラー細胞がパーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞の集団。
  219. 前記ナチュラルキラー細胞がパーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のどれも発現しない、請求項２１９記載の集団。
  220. 前記ナチュラルキラー細胞がＴ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する、請求項２１９または２２０記載の集団。
  221. 前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ９４を発現する、請求項２１９〜２２１のうちいずれか１項に記載の集団。
  222. 前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ９４を発現しない、請求項２１９〜２２１のうちいずれか１項に記載の集団。
  223. 前記ＩＬＣ３細胞がＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうちの１つまたは複数を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳのうちの１つまたは複数を発現しない、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ−である、ＩＬＣ３細胞の集団。
  224. 前記ＩＬＣ３細胞がＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１を発現し、ＣＤ９４、パーフォリンまたはＥＯＭＥＳのどれも発現しない、請求項２２４記載の集団。
  225. 前記ＩＬＣ３細胞がＣＤ２２６および／または２Ｂ４をさらに発現する、請求項２２４または２２５記載の集団。
  226. 前記ＩＬＣ３細胞がＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１のうちの１つまたは複数をさらに発現する、請求項２２４〜２２６のうちいずれか１項に記載の集団。
  227. 前記ＩＬＣ３細胞がＣＤ２２６、２Ｂ４、ＩＬ−２２、ＴＮＦαおよびＤＮＡＭ−１を発現する、請求項２２４〜２２７のうちいずれか１項に記載の集団。
  228. ナチュラルキラー細胞およびＩＬＣ３細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
    （ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、細胞の第１の集団を製造するステップ；
    （ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２の培地中で細胞の第１の集団を培養して、細胞の第２の集団を製造するステップ；
    （ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨのそれぞれを欠いている第３の培地中で細胞の第２の集団を培養して、細胞の第３の集団を製造するステップ；ならびに
    （ｄ）細胞の第３の集団〜ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を分離するステップ；ならびに
    （ｅ）ＣＤ１１ａ＋細胞をＣＤ１１ａ−細胞と５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０の比で合わせて、細胞の第４の集団を製造するステップ
    を含む方法。
  229. 前記第１の培地および／または前記第２の培地がＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠いている、請求項２２９記載の方法。
  230. 前記第３の培地がＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ−３Ｌを欠いている、請求項２２９記載の方法。
  231. 前記第１の培地および前記第２の培地がＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記第３の培地がＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを欠いている、請求項２２９記載の方法。
  232. 第１の培地、第２の培地または第３の培地のどれも脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない、請求項２２９〜２３２のうちいずれか１項に記載の方法。
  233. 第１の培地、第２の培地または第３の培地がヘパリンを含む、請求項２２９〜２３２のうちいずれか１項に記載の方法。
  234. 前記ヘパリンが低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である、請求項２３４記載の方法。
  235. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５０：１の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  236. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が２０：１の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  237. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１０：１の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  238. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が５：１の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  239. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  240. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  241. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：１０の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  242. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：２０の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
  243. ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞が１：５０の比で合わせられている、請求項２２９記載の細胞の第４の集団。
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