CN108350429A - 用于将多能干细胞定向分化为免疫细胞的方法 - Google Patents

用于将多能干细胞定向分化为免疫细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于体细胞衍生的多能干细胞有效体外分化成造血前体细胞以及造血前体细胞进一步分化成各种髓样或淋巴样谱系的免疫细胞特别是T细胞、NK细胞和树突细胞的方法。多能细胞可以在确定的条件下维持和分化；因此，在某些实施方案中，不需要使用小鼠饲养细胞或血清来分化造血前体细胞。

Description

用于将多能干细胞定向分化为免疫细胞的方法
本申请要求于2015年10月20日提交的美国临时申请系列号62/244,101以及2016年10月5日提交的系列号62/404,470的优先权，两个申请的全部内容通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般而言涉及分子生物学领域。更具体地，涉及用于从体细胞衍生的诱导多能干细胞(iPSC)制备免疫细胞的方法和组合物。
2.相关技术的描述
已经开发了细胞治疗方法以增强宿主对肿瘤、病毒和细菌病原体的免疫应答。细胞治疗方法通常涉及T细胞的离体激活和扩增。这些类型的治疗的实例包括使用肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞，细胞毒性T细胞，扩增的肿瘤引流淋巴结细胞和各种其他淋巴细胞制剂。由于造血干细胞和祖细胞具有显著的医学潜力，已经做了大量工作来试图改善用于将造血祖细胞分化成免疫细胞如T细胞和NK细胞的方法。
在人中，诱导多能干(iPS)细胞通常由真皮成纤维细胞产生。然而，皮肤活组织检查的要求以及体外扩增成纤维细胞用于数次传代的需求使其成为产生患者特异性干细胞的麻烦来源。此外，以前用于重编程人体细胞的方法是不方便的，因为它们需要直接从人受试者获得体细胞，或将细胞维持在劳动密集型细胞培养体系中。因此，需要开发从替代来源诱导多能干细胞的方法，该方法简单、方便且易于获得。因此，血液样品可以是这样的来源，因为血液可以从患者或健康个体收集、存储或转移，例如从中央单元分配到一个或多个遥远的地方。因此，目前明确需要从体细胞重编程iPS细胞然后有效地将体细胞衍生的iPS细胞分化成免疫细胞如T细胞、NK细胞、T/NK细胞和树突细胞的方法。
发明概述
本公开内容的第一个实施方案提供了产生免疫细胞的方法，其包括获得多能干细胞(PSC)，其中所述PSC从体细胞群体重编程而来，将所述PSC分化成造血前体细胞(HPC)，以及在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生免疫细胞。
在一些方面，PSC是诱导多能干细胞(iPSC)。在其他方面，PSC是胚胎干细胞(ECS)。在一些方面，PSC基本上不含整合的外源病毒元件。
在某些方面，免疫细胞是淋巴样细胞。在具体的方面，淋巴样细胞是T细胞、B细胞和/或NK细胞。在一些方面，免疫细胞是髓样细胞。在具体方面，髓样细胞是树突细胞。
在一些方面，体细胞群体是哺乳动物体细胞群体。在特定方面，体细胞群体是人体细胞群体。在一些方面，体细胞群体是血细胞群体或皮肤细胞群体。在某些方面，血细胞群体未用外源施加的G-CSF动员。在某些方面，血细胞群体包含T细胞、B细胞和/或NK细胞。在一些方面，血细胞群体进一步定义为祖血细胞、外周血单核细胞或淋巴母细胞样细胞。在某些方面，血细胞群体分离自外周血、脐带血或淋巴样组织。在具体的方面，淋巴样组织包括骨髓、淋巴结或胎儿肝脏。在具体的方面，血细胞群体包含T细胞。在一些方面，T细胞在抗CD3抗体和/或抗CD28抗体存在下培养。在具体的方面，T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。在一些方面，T细胞是T辅助细胞1(TH1)细胞，T辅助细胞2(TH2)细胞，TH17细胞，细胞毒性T细胞，调节性T细胞，天然杀伤T细胞，幼稚T细胞，记忆T细胞或γδT细胞。
在某些方面，重编程包括将重编程因子导入体细胞群体。在一些方面，重编程包括将RNA、蛋白质或小分子导入体细胞群体。
在具体方面，体细胞群体是血细胞或皮肤细胞。在一些方面，重编程因子由一个或多个表达盒编码。在某些方面，重编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28的两个或更多个基因。在一些方面，重编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28的3、4、5或6个基因。在某些方面，所述一个或多个表达盒包含在选自病毒载体，游离载体和转座子的重编程载体中。在一些方面，病毒载体被进一步定义为逆转录病毒载体。在具体的方面，游离载体被进一步定义为基于Epstein-Barr病毒(EBV)的游离载体。在一些方面，重编程包括在确定的无饲养细胞条件下培养细胞。
在一些方面，HPC分化成每个HPC至少20个免疫细胞，如每个HSC至少30、40、50、60、70、70、90、100或更多个免疫细胞。在一些方面，PSC分化成每个PSC至少20个免疫细胞，例如每个PSC至少30、40、50或更多个免疫细胞。
在某些方面，使PSC分化成HPC包括以下顺序步骤：在包含至少一种生长因子的第一确定培养基中培养或维持多个基本上未分化的多能细胞，在不含或基本上不含IL-3、Flt3配体和GM-CSF的第二确定培养基中培养细胞，在足以扩增或促进多个细胞分化的包含BMP4、FGF2和VEGF的第三确定培养基中培养细胞，和在足以扩增或促进多个细胞分化的包含IL-3和Flt3配体的第四确定培养基中培养细胞。在一些方面，多个多能细胞分化成HPC。在一些方面，第二确定培养基包含blebbistatin。在某些方面，第二确定培养基还包含GSK3抑制剂。在一些方面，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一些方面，第二确定培养基还包含BMP4、VEGF和FGF2。在某些方面，在将细胞在第二确定培养基中孵育之前将细胞个体化。在一些方面，在第二确定培养基中孵育细胞、在第三确定培养基中培养细胞和在第四确定培养基中培养细胞使用胺培养板进行。在某些方面，第二确定培养基还包含VEGF和FGF2。在具体方面，第四确定培养基还包含一种或多种选自IL-3、IL-6、SCF、TPO和BMP4的细胞因子。在一些方面，第四确定培养基包含肝素。在一些方面，该方法包括在低于25％的氧，例如低于24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，10％或5％的氧的大气压下培养细胞。在一些方面，多个多能细胞形成胚状体(EB)。在某些方面，HPC表达CD34。在具体的方面，HPC表达至少两种来自CD43、CD34、CD31、CD41、CD235和CD45的标记。
在一些方面，促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进淋巴样分化的条件。在某些方面，表达CD34和CD43的HPC在促进淋巴样分化的条件下培养。在一些方面，培养细胞以促进淋巴样分化包括在确定的培养基中在包被有基质和Notch配体的表面上培养HPC，其中所述HPC表达选自CD34、CD43、CD7、DLL4、CD144和CD235的一种或多种细胞表面标记，并且在存在一种或多种细胞因子的情况下维持培养物，由此产生淋巴样细胞。在一些方面，HPC表达CD144、CD34、CD45和CD7。在特定方面，HPC表达CD144、CD34、CD45和CD7。
在另外的方面，淋巴样分化的第一步还包括分离表达一种或多种细胞表面标记的HPC。在一些方面，分离包括磁激活细胞分选(MACS)。在某些方面，细胞在低于5％的氧的大气压力下培养。在某些方面，细胞在约5％的氧的大气压力下培养。在一些方面，确定的培养基包含抗坏血酸和/或烟酰胺。在某些方面，抗坏血酸以50μM至1mM的浓度存在，例如90μM至100μM。在一些方面，烟酰胺以0.1mM至5mM的浓度存在。在一些方面，烟酰胺是烟酸。在一些方面，基质是细胞外基质蛋白。在一些方面，基质是retronectin，胶原蛋白，层粘连蛋白或纤连蛋白。在特定方面，基质是retronectin。在一些方面，Notch配体是DLL4。在某些方面，DLL4是DLL4：Fc嵌合蛋白。在具体方面，一种或多种细胞因子选自SCF、TPO、IL-7和Flt-3。在某些方面，第二步骤是一至六周，例如二至四周。在一些方面，淋巴样细胞表达选自CD8、CD7、CD45、CD5、CD4和CD3的一种或多种标记。在一些方面，超过5％的淋巴样细胞对于至少两种标记是阳性的。在特定方面，超过10％的淋巴样细胞对至少两种标记是阳性的。
在一些方面，促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进髓样分化的条件。在某些方面，在促进髓样分化的条件下培养HPC包括在包含TPO、SCF和Flt3配体的第一确定培养基中培养HPC，由此产生髓样细胞群体，并将细胞在基本上不含TPO、SCF和Flt3配体的第二确定培养基中孵育，从而产生富集的髓样细胞群体。在一些方面，第一确定培养基还包含IL-6和IL-3。在某些方面，第二确定培养基包含GM-CSF。在具体的方面，第一步骤中产生的至少50％的髓样细胞群体对CD45、CD43和CD31是阳性的。在一些方面，对于CD45、CD43和CD31阳性的髓样细胞群体基本上不表达CD34。在具体的方面，至少80％的富集的髓样细胞群体是CD43+、CD45+、CD31+和CD34-。在某些方面，第二步骤进行5至10天。
在某些方面，该方法还包括使富集的髓样细胞群体分化成树突细胞。在一些方面，将富集的髓样细胞群体分化为树突细胞包括在包含GM-CSF、IL-4和TNFα的确定培养基中培养富集的髓样细胞群体，从而产生树突细胞。在一些方面，确定的培养基还包含脂蛋白。在某些方面，树突细胞表达选自CD209、CD1a、HLA-DR、CD11c、CD14、CD83和CD86的一种或多种标记。在具体的方面，树突细胞基本上不表达CD12。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体的实施例仅仅是以示例的方式给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据该详细描述对于本领域技术人员将变得明显。
附图的简要说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合在此给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1D：(A)从iPSC衍生T、NK和NK/T细胞的无饲养细胞方法的示意图。通过3D过程将iPSC分化为具有淋巴样和髓样潜能的HPC，然后将第7-10天的祖细胞进行2D分化过程以产生T、NK和NK/T细胞。(B)从iPSC衍生树突细胞的无饲养细胞方法的示意图。通过3D过程将iPSC分化成具有淋巴样和髓样潜能的HPC，并且将第12天的祖细胞进一步分化以产生髓样祖细胞并进行逐步3D分化过程以产生树突细胞。(C)在分化的第12天时从各种血液细胞衍生的iPSC细胞系产生了HPC，以及显示了通过流式细胞术定量的CD43+/CD34+细胞的百分比。(D)来自第12天的iPSC的HPC产生效率显示为每输入数量的iPSC产生的HPC的绝对数量的比率。
图2：显示流式细胞术散点图，其识别第7-10天HPC的淋巴样分化过程中的淋巴样和淋巴样-髓样细胞群体。测定了T前体、NK和NK/T细胞的存在。
图3A-3D：(A)检测来自病毒和游离型重编程iPSC的淋巴样细胞的出现的代表性染色谱，包括脐带血衍生iPSC、病毒重编程T细胞iPSC(TiPSC)和游离型重编程祖血细胞iPSC(01279.107.3908)。就各种标记(包括CD5，CD7，CD45，CD3，CD56和CD8)的表面表达对细胞进行染色。通过流式细胞术在FSC-SSC和淋巴样分散门下定量细胞的百分比。(EB7＝第7天，EB8＝第8天，EB9＝第9天，EB10＝第10天，EB11＝第11天)。(B)第7-11天从TiPSC分化的HPC(顶部：总HPC；底部：CD43+ CD34+ HPC)进一步分化为淋巴样细胞，并对CD45、CD7和CD5的表面表达进行染色。通过流式细胞术在FSC-SSC和淋巴样细胞分散门上对细胞的百分比进行定量。(C)第7-11天从TiPSC产生的HPC(顶部：总HPC；底部：CD43+ CD34+ HPC)在低氧条件下分化并对CD56、CD8和CD3的表面表达进行染色。(D)显示了从TiPSC产生淋巴样细胞的效率(左：总计HPC；右：CD43+ CD34+ HPC)。
图4：分析从TiPSC(例如，病毒重编程的TiPSCs1E或游离型重编程的01279.107.3902)分化的第7-11天的HPC在从第7天到第11天的HPC分化的不同日期的CD43/CD34，CD34，Dll4，Dll4/CD144，CD31/CD144和CD235表达。显示了每组标记阳性的细胞百分比。CD43/CD34表达显示在左栏中，CD34显示在右栏，DLL4/CD144显示在底部的线，CD31/CD144显示在中间的线，CD235显示在顶部的线。
图5：在HPC分化期间检测淋巴样祖细胞的磁性分选策略的示意图。感兴趣的标记包括CD31，CD34，CD144，CD43，CD45，CD7，CD235FLK1(也称为KDR，VEGFR2，CD309)和DLL4。在分化的第8天，基于感兴趣的标记将细胞分选成各种级分，然后进行淋巴样分化过程。
图6A-6B：(A)显示了来自图5的磁性分选策略的细胞的每个阳性和阴性级分的CD3阳性细胞的百分比，未分选的细胞作为对照。(B)显示了来自图5的磁性分选策略的阳性和阴性级分的从HPC产生的T细胞的富集倍数，未分选的细胞作为对照。
图7A-7B：(A)显示了从TiPSC淋巴样分化4周后来自图5的磁性分选策略的细胞的每个阳性和阴性级分的CD3阳性细胞的百分比。(B)从TiPSCs1E细胞分化5周的FACS图。针对出现的淋巴样细胞的表达对CD3阳性细胞的流式细胞术分析是CD7+,CD5+,CD3+,CD8+,CD56+CD335+,CD161+,TCRαβ+,TCRγδ-，
图8A-8B：(A)阳性和阴性磁性分选级分的第16天的来自HPC的TiPC淋巴样分化过程的效率显示为输入HPC与输出淋巴样细胞的比率。(B)从阳性磁性分选级分开始的4周结束时的分化过程的累积效率。
图9A-9B：(A)分化第42天来源于iPSC 02179(MeCP2WT)的树突细胞的表型分析。将细胞针对髓样树突标记CD205，CD209，HLA-DR，CD1a，CD1c，CD80，CD11c，CD80，CD86和CD83的细胞表面表达进行染色。(B)用于定量在树突细胞上表达的各种细胞表面标记的表达的代表性FACS图直方图。
图10：将DQ TM卵清蛋白(DQ-OVA，Invitrogen)以1mg/ml溶于PBS中并以100μg/ml添加至iPSC衍生的DC。将细胞在37℃或4℃下孵育，用FACS缓冲液洗涤两次并在Accuri流式细胞仪上分析。与在4℃下的非特异性OVA摄取相比，通过iPSC衍生的DC证明了在37℃下的OVA的特异性摄取。
图11：代表hPCS的无饲养细胞和无血清T和NK细胞分化的图。通过在9天期间的聚集形成、中胚层诱导和HPC分化的连续步骤，将PSC首先在悬浮(3D)胚胎体(EB)培养物中分化为CD34+造血祖细胞(HPC)。使用直接CD34顺磁珠(Miltenyi Biotec)通过MACS分离CD34+细胞并在2周期间转移至DLL4+retronectin包被的平板以进行T/NK分化。在补充有单独的IL2或IL2与其他T细胞生长促进细胞因子(IL7，IL15，IL21)的组合的T-EM(ImmunoCult-XFT细胞扩增培养基(Stem Cell Technologies))中在抗-CD3 mAb(OKT3)+retronectin包被(均为0.5μg/cm2)的板上培养2周期间，T细胞可以被进一步扩增。缩写：SFDM，无血清分化培养基；TCDM，T细胞分化培养基；TCEM，T细胞扩增培养基；MACS，磁激活细胞分选。
图12：T/NK分化培养物的流式细胞术分析。在T/NK分化条件下2周后，PSC(1CTiPSC)衍生的CD34+细胞产生由低FSC/SSC参数(左侧点图)定义的典型淋巴样细胞群体。这种淋巴样细胞群体主要包含CD3+T和CD56+CD3-NK细胞(中间的点图)。T细胞群体包括CD4+和CD8+单阳性和双阳性细胞以及显著比例的双阴性细胞(右侧的点图)。
图13：分化过程中不同细胞群体的产率。每个细胞类型的产率表示为图中所示的细胞衍生的每个阶段的输出与输入绝对细胞数的比率。例如，1.5 CD34+细胞产率表明平均1.5(输出)个CD34+细胞可以衍生自1(输入)个PSC细胞。因此，102T细胞产率表明102(输出)个T细胞可以衍生自1(输入)个CD34+细胞。
图14：PSC衍生的T细胞的表型。在4周内分化和扩增的PSC衍生的T细胞(CD3+)表达α/βTCR(不是γ/δ或不变的Vα24 NKT TCR)和典型的T细胞标记CD5，CD27，CD7。它们还表达NK相关的(CD161，CD94)和激活(CD69)标记。
图15：PSC衍生的T细胞的扩增。固定的抗CD3抗体(iCD3)是最低限度需要的并且足以实现PSC衍生的T细胞的扩增(条形图)。单独(未显示)或组合地(sCD3+sCD28)或加入iCD3(iCD3+sCD28)时，可溶性刺激性CD3和CD28 mAb(sCD3，sCD28)无效。在扩增培养物中增殖的T细胞获得不规则形状的淋巴母细胞的特征形态(照片)。与相对不均匀的输入细胞群体相比，从2周T细胞扩增收获的细胞基本上是纯的CD3+ T细胞，其也表达CD56并获得CD8表达(流式细胞术点图)。
图16A-16H：(A)第8天HPC培养物的代表性照片：HPC从内皮层发芽。(B)2D HPC分化过程的示意图。(C)在分化的第7-10天从01279.107.3902(MeCP2 KO)细胞系产生HPC。(D)在分化的第7-10天从TiPSCs1E细胞系产生HPC。收获细胞并通过流式细胞术定量CD43/CD34细胞的百分比。(E)从iPSC产生HPC的效率。该过程的效率通过除以每个输入数量的iPSC产生的HPC的绝对数量来计算。(F)T前体和NK前体细胞的分析。在7-10天收集iPSC0.1279.107.3902(MeCP2 KO)产生的HPC并冷冻保存。将HPC解冻并以25K/cm2的密度涂布在Retronectin-DLL4包被的平板上。将细胞置于含有1％Glutamax，1％青霉素链霉素，95μML-抗坏血酸2-磷酸，50ng/mL干细胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)，Flt-3配体(Flt-3)和IL-7的无血清确定(SFD)培养基中在低氧条件下刺激淋巴样分化。每48小时用新鲜培养基喂养细胞，并在第14天使用冷PBS收获。将细胞染色以检测CD4，CD7，CD5，CD56，CD8和CD3的表面表达。在淋巴样分散门下通过流式细胞术定量细胞的百分比。量化T、NK和NK/T细胞的存在。(G)T前体和NK前体细胞的分析。将细胞染色以检测CD4，CD7，CD5，CD56，CD8和CD3的表面表达。在淋巴样分散门下通过流式细胞术定量细胞的百分比。(H)HPC产生T细胞的效率。该过程的效率通过除以每输入数量的HPC(CD43/34+)产生的T细胞的绝对数量(CD3+)来计算。
图17A-17C：(A)在E8培养基和低氧条件下使用适合于在基质胶或玻连蛋白上进行无饲养物生长的iPSC的3D HPC分化过程的示意图。HPC分化的第一阶段由BMP4、VEGF和FGF驱动4天，并且通过将细胞置于含有肝素，SCF，TPO，Flt-3配体，IL-3和IL-6的培养基中来驱动分化的第二阶段。(B)在雄性iPSC细胞系2.038中产生MeCP2 KO以产生9006(01279.107.003902)的改造策略。(C)源自用MeCP2 TALENS和供体质粒p1553转染的01279iPSC的MeCP2变体001、002、005和008的氨基酸比对的描述。所有变体(001、002、005和008)都不编码MethylCpG结合域。
图18A-18C：T前体和NK前体细胞iPSC Tips 1E的定量在HPC分化的第7-11天收获，并置于Ret-DLL4包被的平板上，以2.5x104/cm2的密度启动淋巴样分化。测定低氧条件(A)和常氧条件(B)下维持的01279(MeCP2WT)细胞中以及01279.107.3902细胞(MeCP2K0)(C)中的CD8+ CD3+(T细胞)，CD56+/CD8+(NK细胞)和CD56+/CD3+(NK/T细胞)的百分比。(A-B)NK细胞的阳性细胞百分比最高，其次是NK/T细胞和T细胞。(C)从第7天到第10天，阳性细胞百分比从高到低是T细胞，NK/T细胞和NK细胞。在第11天，阳性细胞的百分比最高的是NK细胞，然后是NK/T细胞和T细胞。
图19A-19C：鉴定体外产生的淋巴样细胞的门控策略。(A)来自成人外周血的淋巴细胞的总体散点图。(B)分化第18天的淋巴样细胞散点图。图示了FSC-SSC门和淋巴样门。(C)使用碘化丙锭对FSC-SSC散射和淋巴样散射内的活细胞进行门控。
图20：鉴定体外产生的淋巴样细胞的门控策略。显示了分化第18天的淋巴样细胞的散点图。图示了FSC-SSC门和淋巴样门。使用碘化丙锭在FSC-SSC散射和淋巴样散射中门控活细胞，随后通过流式细胞术染色CD7和CD5阳性细胞。
图21A-21B：定量HPC分化的第7-11天的NK(CD3-/CD56+)细胞并将其置于Ret-DLL4包被的平板上，以2.5×104/cm2的密度启动淋巴样分化。对于含有MeCp2WT和MeCp2KO状态的iPSC克隆测定了所有活的FSC-SSC门(A)和淋巴样门(B)下的双阳性，CD56+/CD3-的百分比。
示例性实施方案的描述
通过提供用于从已经从体细胞(例如，血细胞)起始群体重编程的诱导多能干细胞产生免疫细胞的高效方法，本发明克服了与现有技术相关的问题。本文的方法产生的免疫细胞可以包括T细胞，NK细胞，T/NK细胞和树突细胞。在一些方面，体细胞的起始群体包含T细胞。T细胞可以从各种来源分离，例如血液样品。
通过引入重编程因子，例如通过病毒或游离载体，将体细胞群体重编程为iPSC。然后将这些体细胞衍生的iPSC(例如，T细胞衍生的iPSC(TiPSC))分化为造血前体细胞。在一种方法中，分化过程涉及WNT活化，用造血诱导细胞因子培养和CD34+细胞分离。最后，HPC分化成免疫细胞，如淋巴样细胞(例如T、NK和T/NK细胞)和髓样细胞(例如树突细胞)。
向淋巴样细胞的分化可以通过使用RetroNectin和DLL-4作为无饲养细胞的基质。通过使用抗坏血酸以提高效率和成熟以及通过在低氧条件下培养可以进一步增强T细胞分化。有趣的是，发明人确定了HPC分化期间淋巴样细胞潜能的最佳时间范围(例如7-11天)。这些具有淋巴样细胞潜能的HPC可以通过CD34和CD43的表达来鉴定。另外，可以通过对标记CD144、CD34、CD45和CD7中的两个或更多个呈阳性的细胞级分进行分选来分离具有增强的淋巴样潜能的HPC。在一些方面，衍生树突细胞的祖细胞是在HPC分化的第16天左右出现的常见髓样祖细胞。
由体细胞衍生的PSC产生的淋巴样细胞可以包括保留其特征性T细胞受体(TCR)基因重排的T细胞，NK细胞和T/NK细胞，该特征可以被利用，例如，作为遗传追踪标记或用于再分化实验以研究人T细胞发育。本公开内容的一个特别的优点在于在分化的T细胞中可以保留的T细胞受体的重排和减少的V、D、J基因区段。这充当了T细胞衍生的iPS细胞的不同克隆群体的特定特征或“条形码”，并且还有助于将这些iPS细胞与未经历V(D)J重组的多能干细胞区分开。
因此，本公开内容的方法可以提供无限数量的免疫细胞，例如T细胞，NK细胞，T/NK细胞和树突细胞，用于广泛的应用，例如体内稳定移植，体外筛选化合物，和阐明血液学疾病和损伤的机制。
I.定义
如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸一起使用时，术语“外源的”是指已通过人工或天然的手段被引入细胞或生物体中的蛋白质、基因，核酸或多核苷酸；或相对于细胞而言，该术语是指分离并随后通过人工或天然手段引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可能来自不同的生物体，也可能来自同一生物体。作为非限制性实例，外源核酸是处于与它在天然细胞中的位置不同的染色体位置的核酸，或者在其他方面其侧翼是与天然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。
“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括指导一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的基因表达的一种或多种转录调控元件(例如启动子，增强子或与其功能等同的结构)。还可以包括附加元件，例如转录终止信号。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“载体”)是指包含待体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。
“质粒”是常见类型的载体，是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而复制。在某些情况下，它是环状和双链的。
“复制起点”(“ori”)或“复制起始”是DNA序列，例如在嗜淋巴疱疹病毒中的DNA序列，其在存在于细胞中的质粒中时能够保持质粒中的连接序列和/或是DNA合成启动处或附近的位点。作为例子，EBV(Ebstein-Barr病毒)的ori包括FR序列(30bp重复序列的20个不完全拷贝)，优选DS序列；然而，EBV中的其他位点结合EBNA-1，例如，Rep*序列可以替代DS作为复制起点(Kirshmaier和Sugden，1998)。因此，EBV的复制起点包括FR，DS或Rep*序列或通过核酸修饰的任何功能等同序列或由其衍生的合成的组合。例如，如Lindner等人，2008中具体描述的，本公开内容还可以使用EBV的基因工程复制起点，诸如通过插入或突变个体元件。
“编码”特定蛋白质的“基因”，“多核苷酸”，“编码区”，“序列”，“区段”，“片段”或“转基因”是当置于适当的调控序列的控制下时被转录的核酸分子，任选还可以在体外或体内翻译成基因产物，例如多肽。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA，来自原核或真核DNA的基因组DNA序列和合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3'端。
术语“控制元件”统指共同提供受体细胞中的编码序列的复制、转录、转录后加工和在翻译的启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、剪接点等。只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译，并非所有这些控制元件都需要存在。
术语“启动子”在本文中以其普通含义使用，是指包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中调控序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录。它可以含有调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可以结合的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“有效定位”，“有效连接”，“在控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。
“增强子”是指当位于启动子附近时，相对于由不存在增强子域的启动子产生的转录活性赋予增加的转录活性的核酸序列。
关于核酸分子的“有效连接”或“共表达”是指两个或更多个核酸分子(例如待转录的核酸分子，启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“有效连接”或“共表达”是指两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单一多肽链即融合多肽(其具有融合体的每种肽和/或多肽组分的至少一种性质)的方式连接。融合多肽优选是嵌合的，即由异源分子组成。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可以通过本领域已知的技术来确定。例如，通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序，通过两个多肽分子之间的序列信息的直接比较可以确定同源性。或者，通过在促进同源区域之间稳定双链体形成的条件下，通过多核苷酸杂交，随后用单链特异性核酸酶消化和消化片段的大小确定，可以确定同源性。如使用上述方法确定的，当至少大约80％，优选至少大约90％，最优选至少大约95％的核苷酸或氨基酸分别在确定长度的分子上匹配时，两个DNA或两个多肽序列彼此“基本上同源”。
术语“细胞”在本文中以其最广泛的含义使用，并且是指活体，其是多细胞生物体的组织结构单元，被将其与外部分离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和表达它的机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞，遗传修饰的细胞等)。
术语“干细胞”在本文中指细胞，其在合适的条件下能够分化成多种范围的特化细胞类型，而在其他合适的条件下能够自我更新并保持基本上未分化的多能状态。术语“干细胞”还包括多能细胞，多潜能细胞，前体细胞和祖细胞。示例性的人干细胞可以从获自骨髓组织的造血或间充质干细胞、获自胚胎组织的胚胎干细胞或获自胎儿的生殖组织的胚胎生殖细胞获得。示例性多能干细胞还可以通过与多能性相关的某些转录因子的表达将其重编程为多能状态而由体细胞产生；这些细胞被称为“诱导多能干细胞”或“iPSC或iPS细胞”。
“胚胎干(ES)细胞”是未分化的多能细胞，其在早期阶段从胚胎(例如胚泡阶段的内细胞团)获得，或者通过人工方式(例如核转移)产生，并且可以在胚胎或成人中产生任何分化的细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。
“诱导多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”是通过表达因子(本文中称为重编程因子)的组合或诱导因子组合的表达重编程体细胞而产生的细胞。可以使用胎儿、出生后、新生儿、幼年或成人体细胞产生iPS细胞。在某些实施方案中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)，Sox2，c-Myc和Klf4，Nanog和Lin28。在一些实施方案中，体细胞通过表达至少两种重编程因子，至少三种重编程因子，至少四种重编程因子，至少五种重编程因子，至少六种重编程因子或至少七种重编程因子来重编程，以将体细胞重编程为多能干细胞。
“造血祖细胞”或“造血前体细胞”是指定向于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，并包括造血干细胞，多潜能造血干细胞，常见髓样祖细胞，巨核细胞祖细胞，红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞(HSC)是产生所有血细胞类型的多潜能干细胞，这样的血细胞类型包括髓样(单核细胞和巨噬细胞，粒细胞(嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞和肥大细胞)，红细胞，巨核细胞/血小板，树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞，NK细胞)(参见例如Doulatov等人，2012；Notta等人，2015)。定义了“多淋巴样系祖细胞”(MLP)来描述任何能产生所有淋巴样谱系(B，T和NK细胞)但可能具有或可能不具有其他(髓样)潜能并且是CD45RA+/CD10+/CD7-的祖细胞(Doulatov等人，2010)。任何B、T和NK祖细胞可称为MLP。“常见髓样祖细胞”(CMP)是指通过可产生粒细胞、单核细胞、巨核细胞和红细胞的CD45+/CD31+/CD43+/CD34-细胞的表达定义的常见髓样祖细胞。造血祖细胞可表达CD34。造血祖细胞可以共表达CD133并且对于CD38表达是阴性的。造血前体细胞包括CD34+/CD45+造血前体细胞和CD34+/CD45+/CD43+造血前体细胞。CD34+/CD43+/CD45+造血前体细胞可以高度富集髓样祖细胞。造血细胞还包括各种原始造血细胞亚群，包括CD34-/CD133+/CD38-(原始造血前体细胞)，CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(红细胞巨核细胞生成)，lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(多潜能)和lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(髓样倾斜)细胞，CD133+/ALDH+(醛脱氢酶)(例如Hess等人，2004；Christ等人，2007)。预计这些原始造血细胞类型或造血前体细胞中的任何一种可以如本文所述转化成iPS细胞。在一些方面，细胞可以包括肥大细胞，朗格罕氏细胞，破骨细胞，NK细胞，T细胞，CIK T细胞或T细胞的其他亚型、NK细胞和B细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，包括但不限于T细胞，NK细胞，T/NK细胞，树突细胞，巨噬细胞，B细胞，嗜中性粒细胞，红细胞，单核细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，嗜曙红细胞及其任何组合。
T细胞的“激活剂”或将激活T细胞的条件是指激活T细胞的刺激物并包括可存在于抗原呈递细胞上或其他表面上的抗原；结合许多T细胞受体(TCR)复合物而不考虑特异性的多克隆激活剂，并且包括凝集素例如伴刀豆球蛋白A(Con-A)和植物凝集素(PHA)以及试剂例如特异性结合TCR或CD3蛋白上的不变框架表位的抗体；和刺激显著数目的T细胞的超抗原，并且包括例如肠毒素，如葡萄球菌肠毒素。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且是指表达当在抗原呈递细胞或基质的表面上展示时能够识别抗原的T细胞抗原受体(TCR)以及一个或多个MHC分子或一个或多个非经典MHC分子的细胞。
术语“T细胞”是指如本领域中定义的T淋巴细胞，并且意欲包括胸腺细胞，未成熟T淋巴细胞，成熟T淋巴细胞，静止T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4+CD8+T细胞或CD4-CD8-细胞。T细胞也可以是T辅助细胞，例如T辅助细胞1(TH1)或T辅助细胞2(TH2)细胞或TH17细胞，以及细胞毒性T细胞，调节性T细胞，天然杀伤T细胞，幼稚T细胞，记忆T细胞或γδT细胞(Wilson等人，2009；Wynn，2005；Ladi等人，2006)。通过至少一个标记如CD4而彼此不同的T细胞在本文中被称为T细胞的“亚群”。
“CD4+T细胞”是指在其表面上表达CD4并与细胞介导的免疫应答相关的T细胞子集。它们的特征在于刺激后的分泌谱，其可以包括细胞因子如IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4和IL-10的分泌。“CD4”是最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原的55kD糖蛋白，但也在包括单核细胞/巨噬细胞的其他细胞上发现。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并被认为是MHC(主要组织相容性复合物)II类限制性免疫应答中的联合识别元件。在T淋巴细胞上，它们定义了辅助子/诱导子的子集。
“CD8+ T细胞”是指在其表面上表达CD8的T细胞亚群，是I类MHC限制性的并且起细胞毒性T细胞的作用。“CD8”分子是在胸腺细胞和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的联合识别元件。
“多能干细胞”是指具有分化成构成一个或多个组织或器官，或优选地，三种胚层中的任何一种：内胚层(内胃衬，胃肠道，肺)，中胚层(肌肉，骨骼，血液，泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)的所有细胞的潜力的干细胞。
如本文所用，术语“体细胞”是指不是生殖细胞例如卵子、精子等的任何细胞，其不直接将其DNA转移至下一代。通常，体细胞具有有限的或没有多能性。本文用的体细胞可以是天然存在的或遗传修饰的。
“编程”是改变细胞可产生的后代类型的过程。例如，当细胞已经被改变从而与在相同条件下无编程的情况能够形成的细胞相比，其可以在培养物或体内形成至少一种新细胞类型的后代时，细胞是被编程的。这意味着在充分增殖后，观察到具有新细胞类型表型特征的可测量比例的后代，如果在编程之前基本上不能形成这样的后代；或者，与编程之前相比，具有新细胞类型特征的比例可测量地更多。这个过程包括分化，去分化和转分化。
“分化”是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分或终末分化的细胞回复到更早期发育阶段，如多能性或多潜能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型的过程。典型地，通过编程发生转分化而细胞不经过中间多能性阶段-即，细胞直接从一种分化细胞类型编程为另一种分化细胞类型。在某些条件下，具有新细胞类型特征的子代的比例可以按照增加的优先顺序为至少约1％，5％，25％或更多。
“重编程”是赋予与在没有重编程的相同条件下相比细胞显著增加的在培养物或体内形成至少一种新细胞类型的后代能力的过程。更具体地说，重编程是赋予体细胞多能性潜能的过程。这意味着在充分增殖之后，如果在重编程之前基本上不存在这样的后代，则具有可测量的具有新细胞类型的表型特征的子代的比例；否则，与重编程前相比，具有新细胞类型特征的比例可测量地更多。在某些条件下，具有新细胞类型特征的子代的比例可以按照增加的优先顺序为至少约1％，5％，25％或更多。
术语“正向编程”是指通过向多潜能或多能细胞提供一种或多种特定谱系决定基因或基因产物而编程多潜能或多能细胞，与不具有多能性的分化的体细胞相反。例如，正向编程可描述将ESC或iPSC编程为造血前体细胞或其他前体细胞或造血细胞或其他分化的体细胞的过程。
如本文所用，术语“受试者”或“有需要的受试者”是指任何年龄的雄性或雌性的需要细胞或组织移植的哺乳动物，优选人。通常，受试者需要细胞或组织移植(在本文中也称为受体)，这是由于适合经由细胞或组织移植治疗的病症或病理或不期望的状况、状态或综合征或身体、形态学或生理学异常。
如本文所用，基因的“破坏”是指与不存在破坏的基因产物的表达水平相比，在细胞中消除或减少由研究基因编码的一种或多种基因产物的表达。示例性的基因产物包括由该基因编码的mRNA和蛋白质产物。某些情况下的破坏是暂时的或可逆的，而在其他情况下则是永久性的。尽管事实上可能产生截短的或无功能的产物，但在某些情况下破坏是功能性或全长蛋白质或mRNA。在本文的一些实施方案中，与表达相反，基因活性或功能被破坏。通常通过人工方法诱导基因破坏，即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物，和/或通过破坏基因的核酸或与之相关的核酸，例如在DNA水平。用于基因破坏的示例性方法包括基因沉默、敲低、敲除和/或基因破坏技术，例如基因编辑。实例包括通常导致表达暂时减少的反义技术，例如RNAi，siRNA，shRNA和/或核酶，以及导致靶向的基因失活或破坏的基因编辑技术，例如通过诱导断裂和/或同源重组。例子包括插入，突变和删除。破坏通常导致该基因编码的正常或“野生型”产物的抑制和/或完全不表达。这种基因破坏的实例是基因或基因部分的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可发生在编码区中，例如在一个或多个外显子中，导致不能产生全长产物，功能性产物或任何产物，例如通过插入终止密码子。这种破坏也可以通过启动子或增强子或影响转录激活的其他区域的破坏而发生，以阻止基因的转录。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组靶向基因失活。
“Notch配体”是能够结合存在于许多不同哺乳动物细胞例如造血干细胞的膜中的Notch受体多肽的蛋白质。已经在人细胞中鉴定的Notch受体包括Notch-1，Notch-2，Notch-3和Notch-4。Notch配体通常具有在氨基端包含20至22个氨基酸和在细胞外表面包含3至8个EGF样重复序列(Furie和Furie，1988；Knust等人1987；Suzuki等人，1987)的DSL结构域(D-Delta，S-Serrate和L-Lag2)。
II.体细胞衍生的iPSC
A.体细胞的起始群体
本公开内容的实施方案涉及重编程为iPSC的体细胞(例如血细胞或皮肤细胞)的起始群体。血细胞群体可以包括外周血单核细胞(PBMC)，全血或其含有混合群体的部分，脾细胞，骨髓细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，通过白细胞分离术获得的细胞，活检组织和淋巴结，例如从肿瘤中排出淋巴结。合适的供体包括免疫的供体，未免疫的(幼稚的)供体，经处理或未经处理的供体。“经处理”的供体是已经暴露于一种或多种生物调节剂的供体。未经处理的供体尚未暴露于一种或多种生物调节剂。
在一些方面，血细胞群体包含T细胞。T细胞可以是T细胞的纯化群体，或者T细胞可以位于具有不同类型细胞(例如B细胞和/或其他外周血细胞)的群体中。T细胞可以是T细胞子集的纯化群体，例如CD4+ T细胞，或者它们可以是包含不同T细胞子集的T细胞群体。在另一个实施方案中，T细胞是已经在培养物中保持较长时间的T细胞克隆。T细胞克隆可以被转化到不同程度。在具体的实施方案中，T细胞是在培养物中无限增殖的T细胞克隆。
在一些方面，T细胞是原代T细胞。术语“原代T细胞”旨在包括从个体获得的T细胞，而不是在延长的时间段内在培养物中维持的T细胞。因此，原代T细胞尤其是从受试者获得的外周血T细胞。原代T细胞群体可以主要由T细胞的一个子集组成。或者，原代T细胞群体可以由不同的T细胞子集组成。
T细胞可以来自先前储存的血液样品，来自健康个体或可选地来自受病况影响的个体。该病况可以是感染性疾病，例如由病毒感染，细菌感染或任何其他微生物感染引起的病症，或过度增殖性疾病如癌症如黑素瘤。在具体的实施方案中，T细胞来自感染人免疫缺陷病毒(HIV)的个体。在又一个实施方案中，T细胞来自患有或易患自身免疫疾病或T细胞病理的受试者。T细胞可以是人源，鼠源或任何其他哺乳动物物种。
获得包含T细胞的细胞群体的方法在本领域中是公知的。例如，可根据本领域已知的方法描述获得外周血单核细胞(PBMC)。这些方法的例子在实施例中列出并由Kim等人(1992)；Biswas等人(1990)；Biswas等人(1991)讨论。
在一些方面，血细胞的起始群体包含造血干细胞(HSC)。HSC通常存在于骨髓中，但可以被迫进入血液，这一过程被称为动员，其在临床上用于在外周血中收集大量HSC。一种选择的动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞可通过单采血液成分技术以未受干扰的状态或在外部施用造血生长因子如G-CSF后的动员后采集。动员后收集的干细胞或祖细胞的数量大于无干扰状态下的单采血液成分后获得的数量。在一些方面，细胞群体的来源是其细胞未被外部应用的因子动员的受试者，因为不需要富集造血干细胞或祖细胞。
从细胞群体获得造血前体细胞的方法在本领域中也是公知的。可以使用各种细胞因子如hSCF，hFLT3和/或IL-3扩增造血前体细胞(Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS或FACS富集CD34+细胞。如上所述，阴性选择技术也可用于富集CD34+细胞。
用于本文所述方法的细胞群体可以是哺乳动物细胞，例如人细胞，非人灵长类细胞，啮齿动物细胞(例如小鼠或大鼠)，牛细胞，绵羊细胞，猪细胞，马细胞，羊细胞，犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类动物细胞包括恒河猴细胞。细胞可以从动物例如人患者获得，或者它们可以来自细胞系。如果细胞从动物获得，则它们可以原样使用，例如作为未分离的细胞(即混合群体)；它们可以首先在培养中建立，例如通过转化；或者它们可以已经经受初步纯化方法。例如，基于细胞表面标记的表达，可以通过阳性或阴性选择来操纵细胞群体；在体外或体内用一种或多种抗原刺激；用一种或多种生物调节剂在体外或体内处理；或者任何或全部这些的组合。在示例性实施方案中，细胞群体经历阴性选择以耗竭非T细胞和/或特定T细胞子集。可以基于各种分子的细胞表面表达来进行阴性选择，所述分子包括B细胞标记如CD19和CD20；单核细胞标记CD14；NK细胞标记CD56。或者，可以对细胞群体进行阴性选择以消除非CD34+造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。可以基于多种分子的细胞表面表达进行阴性选择，所述分子为例如抗体混合物(例如CD2，CD3，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123，CD235a和CD41(例如用于巨核细胞谱系的细胞)，其可以用于例如经由MACS或柱分离来分离其他细胞类型。
还可以从受试者获得细胞样品，然后富集其以获得期望的细胞类型。例如，如本文所述，可以从血液中分离PBMC和/或CD34+造血细胞。逆流离心(淘洗)可用于从PBMC富集T细胞。还可以使用多种技术从其他细胞中分离细胞，例如用与所需细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或激活，例如，一些T细胞分离试剂盒使用抗体缀合物珠子来激活细胞，然后用相同的珠子分离柱子。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标记的抗体进行阴性选择以选择性富集特定细胞类型而不通过受体接合激活细胞。
骨髓细胞可以从髂嵴，股骨，胫骨，脊柱，肋骨或其他髓质空间获得。骨髓可以从患者身上取出并通过各种分离和洗涤程序分离。已知的用于分离骨髓细胞的方法包括以下步骤：a)离心分离骨髓悬液成三个级分并收集中间部分或淡黄色层；b)将来自步骤(a)的淡黄色层级分再一次在分离液(通常为Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals AB的商标))中离心分离，并收集含有骨髓细胞的中间部分；和c)清洗来自步骤(b)的收集级分以回收可再输注的骨髓细胞。
如果希望使用富含T细胞的细胞群体，则可以使用连续流式细胞分离器通过白细胞去除术和机械血液分离术从混合细胞群体获得此类细胞群体。例如，可以通过任何已知的方法从血沉棕黄层中分离T细胞，包括在Ficoll-HypaqueTM梯度上分离，在Percoll梯度上分离或淘洗。
在某些方面，T细胞被结合T细胞受体的试剂激活以触发T细胞活化的信号级联。例如，可以使用CD3抗体。为了将T细胞扩增至显著数目和用于重编程的增殖状态，也可以使用细胞因子，例如IL-2。在某一方面，抗CD3和抗CD28可用于涉及共刺激的T细胞活化。在另一个方面，可以应用抗CD3的交联，例如与平板结合的抗CD3。如果使用可溶性抗-CD3来活化PBMC中的T细胞，则可溶性抗-CD3抗体可以与PBMC中的APC结合，然后将抗体呈递给T细胞。如果在纯化的T细胞群体中单独使用可溶性抗CD3抗体，则由于上述原因会导致无反应性。某个实施方案包括在抗CD3(OKT3)和IL2存在下培养T细胞，这是有利和方便的，因为不需要使用昂贵且麻烦的珠子或与平板结合的抗体；加入OKT3和IL2后，PBMC的细胞环境将有助于激活T细胞。由于优先扩增，T细胞然后在PBMC培养物中排挤其他细胞类型。
在某些方面，血细胞的起始群体包含淋巴母细胞样细胞，例如来自淋巴母细胞样细胞系(LCL)。本领域已知LCL的产生，例如通过用EB病毒(EBV)感染B细胞(Frisan等人,Epstein-Barr Virus Protocols,Part III,125-127,2001)。
B.重编程因子
在某些实施方案中，体细胞的起始群体通过引入重编程因子重编程为iPS细胞。用于诱导的重编程因子对iPS细胞的产生至关重要。以下因子或其组合可以用于本公开中公开的方法中。在某些方面，编码Sox和Oct的核酸(特别是Oct3/4)将被包括在重编程载体中。例如，一种或多种重编程载体可包含编码Sox2、Oct4、Nanog和任选的Lin28的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Klf4和任选的c-Myc的表达盒或编码Sox2、Oct4和任选的Esrrb的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Nanog、Lin28、Klf4、c-Myc和任选的SV40大T抗原的表达盒。编码这些重编程因子的核酸可包含在相同的表达盒、不同的表达盒、相同的重编程载体或不同的重编程载体中。
Oct4和Sox基因家族的某些成员(Sox1，Sox2，Sox3和Sox15)已经被鉴定为参与诱导过程的关键转录调节因子，其缺乏使得不能实现诱导。然而，其他基因包括Klf家族(Klf1，Klf2，Klf4和Klf5)、Myc家族(c-Myc，L-Myc和N-Myc)的某些成员、Nanog和Lin28已被鉴定为提高诱导效率。
Oct4(Pou5f1)是八聚体(“Oct”)转录因子家族之一，并且在维持多能性中起关键作用。在Oct4+细胞(如卵裂球和胚胎干细胞)中缺少Oct4导致自发性滋养层细胞分化，因此Oct4的存在引起胚胎干细胞的多能性和分化潜能。“Oct”家族中的各种其他基因，包括Oct4的近亲Oct1和Oct6，都未能引发诱导，因此证明了Oct-4对诱导过程的排他性。
Sox家族基因与维持与Oct4类似的多能性相关，尽管它与多能干细胞和单能干细胞相关，而Oct4在多能干细胞中专门表达。尽管Sox2是用于重编程诱导的最初基因，但Sox家族中的其他基因在诱导过程中也发挥了作用。Sox1以与Sox2相似的效率产生iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也产生iPS细胞，但效率降低。
在胚胎干细胞中，Nanog以及Oct4和Sox2在促进多能性中是必需的。因此，令人惊讶的是Yamanaka等人报道Nanog对诱导是不必要的，尽管Thomson等人已经报道有可能以Nanog作为其中一个因子来产生iPS细胞。
Lin28是与分化和增殖相关的在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达的mRNA结合蛋白。Thomson等人证明其是iPS生成的一个因子，尽管其是非必需的。
Klf家族基因的Klf4最初由Yamanaka等人，2007鉴定，并且由Jaenisch等人，1988确认为用于产生小鼠iPS细胞的因子，并且由Yamanaka等人，2007证明是产生人iPS细胞的因子。但是，Thompson等人报道Klf4对于产生人iPS细胞是不必要的，并且事实上不能产生人iPS细胞。发现Klf2和Klf4是能够产生iPS细胞的因子，并且相关基因Klf1和Klf5也能够产生iPS细胞，尽管效率降低。
Myc家族基因是涉及癌症的原癌基因。Yamanaka等人，2007和Jaenisch等人，1988证明c-Myc是参与小鼠iPS细胞产生的因子，并且Yamanaka等人，2007证明它是涉及人iPS细胞产生的因子。然而，Thomson等人和Yamanaka等人报道c-Myc对于产生人iPS细胞不是必要的。SV40大抗原可用于减少或预防c-Myc表达时可能发生的细胞毒性。
本公开内容中使用的重编程蛋白质可被具有大约相同重编程功能的蛋白质同源物取代。编码这些同源物的核酸也可用于重编程。保守氨基酸取代是优选的-即例如天冬氨酸-谷氨酸作为极性酸性氨基酸；赖氨酸/精氨酸/组氨酸作为极性碱性氨基酸；亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸作为非极性或疏水性氨基酸；丝氨酸/苏氨酸作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸。保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，有理由认为用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸或用结构相关氨基酸取代氨基酸的相似取代将不具有对所得多肽的性质的显著影响。通过测定多肽的特定活性可以容易地确定氨基酸变化是否导致功能性多肽。
C.体细胞重编程
在本公开内容的某些方面，重编程因子从包含在一个或多个载体(例如整合载体或游离载体)中的表达盒表达。另一方面，重编程蛋白质可通过蛋白质转导直接导入体细胞。
本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)和人造染色体(例如YAC)，如逆转录病毒载体(例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)，MSCV，SFFV，MPSV，SNV等)，慢病毒载体(例如衍生自HIV-1，HIV-2，SIV，BIV，FIV等)，包括有复制活性的、复制缺陷的和其无功能形式的腺病毒(Ad)载体，腺相关病毒(AAV)载体，猴病毒40(SV-40)载体，牛乳头瘤病毒载体，Epstein-Barr病毒载体，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，哈维鼠肉瘤病毒载体，鼠乳腺肿瘤病毒载体，Rous肉瘤病毒载体。
1.病毒载体
可以在本公开内容的某些方面提供病毒载体。在产生重组病毒载体时，非必需基因通常用异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列置换。病毒载体是利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质导入细胞的一种表达构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并整合入宿主细胞基因组并稳定而有效地表达病毒基因的能力使其成为将外来核酸转移入细胞(例如哺乳动物细胞)的有吸引力的候选物。以下描述了可用于递送本公开内容的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。
由于逆转录病毒将它们的基因整合到宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广谱的物种和细胞类型和被包装在特定的细胞系中的能力，其具有用作基因递送载体的前景(Miller，1992)。
为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中以取代某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建了包含gag，pol和env基因的包装细胞系(但没有LTR和包装组分)(Mann等人，1983)。当将含有cDNA以及逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入特定细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒然后将其分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外还含有具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域中是公知的(参见例如Naldini等人，1996；Zufferey等人，1997；Blomer等人，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可以用于体内和体外基因转移和核酸序列的表达。例如，美国专利5,994,136描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用携带包装功能，即gag，pol和env以及rev和tat的两种或更多种载体转染，在此引入作为参考。
2.游离载体
基于质粒或脂质体的染色体外(即游离型)载体的使用也可以在本公开内容的某些方面提供。这种游离载体可以包括例如基于oriP的载体，和/或编码EBNA-1衍生物的载体。这些载体可以允许DNA的大片段被引入细胞并维持在染色体外，每个细胞周期复制一次，有效分配到子细胞，并且基本上不引起免疫应答。
特别地，EBNA-1(基于oriP的表达载体的复制所需的唯一病毒蛋白)不引起细胞免疫应答，因为它开发了有效的机制以绕过将其抗原呈递至MHC I类分子所需的处理(Levitskaya等人，1997)。此外，EBNA-1可以反式作用以增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因的表达高达100倍(Langle-Rouault等人，1998；Evans等人，1997)。最后，这种基于oriP的表达载体的制造是便宜的。
其他染色体外载体包括其他基于淋巴营养性疱疹病毒的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人B淋巴母细胞)中复制并成为其天然生命周期一部分的质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性淋巴营养性疱疹病毒包括但不限于EBV，卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)；松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。也考虑了基于游离型的载体的其他来源，如酵母ARS，腺病毒，SV40或BPV。
本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994，两者均通过引用并入本文)。
载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达，或另外为靶细胞提供有益特性的其他组分或功能性。这样的其他组分包括例如影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。
这样的组分还可以包括标记，例如可用于检测或选择已摄取并正在表达由载体递送的核酸的细胞的可检测和/或选择标记。这些组分可作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或可修饰载体以提供此类功能。本领域已知多种这样的载体并且通常是可获得的。当载体保持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂过程中作为自主结构稳定地复制，并入宿主细胞的基因组中，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
3.基于转座子的系统
在某些方面，编程因子的递送可以使用转座子-转座酶系统。例如，转座子-转座酶系统可以是众所周知的Sleeping Beauty，Frog Prince转座子-转座酶系统(关于后者的描述，参见例如EP1507865)或TTAA特异性转座子PiggyBac系统。
转座子是可以在单个细胞的基因组内移动到不同位置的DNA序列，这称为转座过程。在这个过程中，它们可以引起突变并改变基因组中的DNA含量。转座子也曾被称为跳跃基因，并且是可移动遗传元件的实例。
存在各种可移动遗传元件，并且可以基于它们的转座机制对它们进行分组。I类可移动遗传元件或逆转录转座子首先被转录成RNA，然后通过逆转录酶逆转录为DNA，然后被插入到基因组中的另一位置而自我复制。II类可移动遗传元件直接从一个位置移动到另一个位置，使用转座酶在基因组中“剪切和粘贴”它们。
在具体的实施方案中，本公开内容提供的构建体(例如，多谱系构建体)使用PiggyBac表达系统。PiggyBac(PB)DNA转座子通过“剪切-粘贴”机制动员起来，其中由转座子自身编码的转座酶(PB转座酶)在基因组内的其他位点切除并重新整合转座子。PB转座酶特异性识别转座子侧翼的PB反向末端重复序列(ITR)；它结合这些序列并催化转座子的切除。PB随后以相对随机的方式整合到整个基因组的TTAA位点。为了产生基因捕获突变(或适合于产生转基因动物)，转座酶在一个质粒上反式供应，并与包含供体转座子的质粒共转染，该重组转座子包含侧接转座酶(ITR)结合位点的基因陷阱。转座酶将催化从质粒中切除转座子并随后整合到基因组中。在编码区内的整合将捕获基因陷阱表达所需的元件。PB具有几个理想特性：(1)它优先插入基因内(50％到67％的插入命中基因)；(2)它没有局部跳跃(广泛的基因组覆盖)；(3)对过度生产抑制(升高的转座酶水平导致转座减少)不敏感；4)它从供体位点干净地切除，不像Sleeping Beauty那样留下“足迹”。
4.调控元件
包含在用于本公开内容的重编程载体中的表达盒优选含有(以5'至3'方向)与蛋白质编码序列有效连接的真核转录启动子，包含插入序列的剪接信号以及转录终止/聚腺苷酸化序列。
a.启动子/增强子
本文提供的表达构建体包含驱动编程基因表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。这最好的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始的位置。额外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域，尽管已经显示许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。为了使编码序列“受控于”启动子，将转录阅读框的转录起始位点的5'末端定位在所选启动子的“下游”(即3')处。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是柔性的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加到50bp，然后活性开始下降。根据启动子的不同，单个元件可以共同或独立地起作用以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”指涉及核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列获得的启动子。这样的启动子可以被称为“内源性”。类似地，增强子可以是与位于核酸序列的下游或上游的与该序列天然相关的增强子。或者，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下来获得某些优点，所述重组或异源启动子是指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子也指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)连同本文公开的组合物产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，预期可以使用指导在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的序列转录和/或表达的控制序列。
当然，使用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的应用(参见例如Sambrook等人，1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的，组织特异性的，可诱导的和/或在合适的条件下用于指导导入的DNA片段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录，作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体。
启动子的非限制性例子包括早期或晚期病毒启动子，如SV40早期或晚期启动子，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，例如，β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等人，1989)，GADPH启动子(Alexander等人，1988，Ercolani等人，1988)，金属硫蛋白启动子(Karin等人，1989；Richards等人，1984)；和连接的响应元件启动子，例如环状AMP应答元件启动子(cre)，血清应答元件启动子(sre)，佛波醇酯启动子(TPA)和在最小TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，Genbank中描述的人生长激素最小启动子，登录号X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC获得，目录号ATCC 45007)。
作为鉴定衍生的造血细胞和前体的方法，组织特异性转基因表达，特别是来自编程的造血细胞和造血细胞前体中的报道基因表达可能是期望的方式。为了提高特异性和活性，已经考虑使用顺式作用调节元件。例如，可以使用造血细胞特异性启动子。许多这样的造血细胞特异性启动子是本领域已知的，例如表1中提供的造血基因的启动子。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并且具有顺式作用且不管其取向甚至在相对长的距离(距离目标启动子多至几千个碱基)上起作用的可能性的核酸序列。然而，增强子功能不一定限于如此长的距离，因为它们也可以靠近给定的启动子起作用。
已经鉴定了许多造血细胞启动子和增强子序列，并且可以用于本发明的方法中。参见例如美国专利5,556,954；美国专利申请20020055144；美国专利申请20090148425。
b.起始信号和连锁表达
在本公开内容中提供的表达构建体中也可以使用特定的起始信号来有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“符合读框”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以增强表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并开始在内部位点翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES成分(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及哺乳动物信息中的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个框架由一个IRES分隔开来，从而形成多顺反子信息。凭借IRES元件，核糖体可以利用每个开放阅读框进行高效翻译。使用单个启动子/增强子可以有效表达多个基因以转录单个信息(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。
另外，某些2A序列元件可用于在本公开内容中提供的构建体中产生编程基因的连锁或共表达。例如，可以使用切割序列通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。示例性的切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如Thosea asigna病毒2A；T2A)(Minskaia和Ryan，2013)。在具体的实施方案中，F2A切割肽用于连接多谱系构建体中基因的表达。
c.复制起点
为了在宿主细胞中增殖载体，其可以含有一个或多个复制位点起始(通常称为“ori”)，例如，与上述EBV的oriP或在编程中具有相似或升高的功能的遗传上工程化的oriP相对应的核酸序列，其是启动复制的特定核酸序列。或者，可以使用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
d.选择和可筛选标记
在某些实施方案中，含有核酸构建体的细胞可以通过在表达载体中包含标记而体外或体内鉴定。这种标记会赋予细胞可识别的变化，从而容易鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予允许选择的属性的标记。阳性选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而阴性选择标记是其存在阻止其选择的标记。阳性选择标记的一个例子是耐药性标记。
通常包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，DHFR，GPT，博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标记之外，还设想了其他类型的标记，包括基于比色分析的可筛选标记，例如GFP。或者，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标记，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标记，其可与FACS分析结合。所使用的标记不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记的其他例子对于本领域技术人员来说是公知的。
如本文所述，将核酸(例如DNA或RNA)引入待利用本公开内容编程为造血前体细胞的多能干细胞中可以使用用于核酸递送以转化细胞的任何合适的方法，或者正如本领域普通技术人员所知道的那样。这些方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson等人，1989，Nabel等人，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624,5,981,274,5,945,100,5,780,448,5,736,524,5,702,932,5,656,610,5,589,466和5,580,859，通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253,通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人,1986；Potter等人,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖和聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783 5,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)以及这些方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可以被稳定或瞬时转化。
III.免疫细胞的产生
A.产生HPC
本公开内容的实施方案涉及体细胞衍生的PSC向HPC的分化。可通过本领域已知的方法将体细胞衍生的PSC分化成HPC，例如美国专利号8,372,642中所述，其通过引用并入本文。例如，可以使用BMP4、VEGF、Flt3配体、IL-3和GM-CSF的组合来促进造血分化。在某些实施方案中，将细胞培养物依次暴露于第一培养基以制备用于分化的PSC，包含BMP4、VEGF和FGF的第二培养基，随后在包含Flt3配体、SCF、TPO、IL-3和IL-6的第三培养基中培养，可以将多能细胞分化为造血前体细胞和造血细胞。第二确定培养基还可以包含肝素。此外，在含有BMP4和VEGF的培养基中包含FGF-2(50ng/ml)可以提高由多能细胞产生造血前体细胞的效率。另外，在第一确定培养基中加入糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂(例如CHIR99021，BIO和SB-216763)可以进一步增强HPC的产生。
可以使用确定的或非确定的条件进行多能细胞向造血前体细胞的分化。一般而言，将意识到，确定的条件通常在其中所得细胞打算施用于人受试者的实施方案中是优选的。造血干细胞可以来自确定条件下的多能干细胞(例如，使用TeSR培养基)，并且造血细胞可以由来自多能细胞的胚状体产生。在其他实施方案中，多能细胞可以在OP9细胞或小鼠胚胎成纤维细胞上共培养并随后分化。
可以允许多能细胞形成胚状体或聚集体作为分化过程的一部分。为了诱导分化，“胚状体”(EB)或生长细胞簇的形成通常涉及人多能干细胞体外聚集到EB中并允许人多能干细胞自发和随机分化成代表内胚层、外胚层和中胚层起源的多个组织类型。因此可以使用三维EB来产生一部分造血细胞和内皮细胞。
EB可以使用以下方案形成。适应于在MatrigelTM包被的平板上的无饲养细胞生长的未分化的iPSC可以在汇合时使用0.5M EDTA在室温下处理约8-10分钟来收获。孵育后抽吸EDTA，并且可以通过将细胞收集在含有rock抑制剂或blebbistatin的SFD培养基中来形成EB。培养基可以在第二天更换为含有不同细胞因子制剂的EB1分化培养基。将细胞以每毫升0.25-0.5百万个细胞/ml的密度铺板以促进聚集体形成。
为了促进聚集体形成，可以将细胞转移到低附着平板上以在由75％IMDM(Gibco)、补充有0.05％N2和B-27而不含RA补充剂的25％Ham's Modified F12(Cellgro)、200mM 1-谷氨酰胺、0.05mg/ml抗坏血酸-2-磷酸镁盐(Asc2-P)(WAKO)和4.5×10-4MTG组成的无血清分化(SFD)培养基中孵育过夜。第二天，可以从每个孔收集细胞并离心。然后可将细胞在分化的前四天重悬于“EB分化培养基”中，所述“EB分化培养基”由补充有约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)、约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和50ng/ml zb FGF的SFD基础培养基组成。这些细胞每48小时更换一半的培养基。在分化的第五天，用包含补充有50ng/ml干细胞因子(SCF)、约50ng/ml Flt-3配体(Flt-3L)、50ng/ml SFD培养基白细胞介素-6(IL-6)、50ng/ml白细胞介素-3(IL-3)、50ng/ml血小板生成素(TPO)的SFD培养基的第二培养基替换培养基。每48小时用新鲜的分化培养基替换细胞的一半培养基。通过将分化培养物以300g离心5分钟并从分化培养物吸取一半体积并用新鲜培养基补充来进行培养基更换。在某些实施方案中，EB分化培养基可以包含约BMP4(例如约50ng/ml)，VEGF(例如约50ng/ml)和任选的FGF-2(例如约25-75ng/ml或约50ng/ml)。可以吸出上清液并用新鲜的分化培养基代替。可选地，细胞可以每两天用新鲜培养基更换一半培养基。细胞可以在分化过程中的不同时间点收获。
可以使用确定的培养基从多能干细胞培养造血前体细胞。使用确定的培养基将多能细胞分化为造血CD34+干细胞的方法描述于例如美国申请12/715,136中，不作放弃声明地将其全部内容通过引用整体并入本文。预期这些方法可以与本公开内容一起使用。
例如，可以使用确定的培养基来诱导造血CD34+分化。确定的培养基可含有生长因子BMP-4，VEGF，Flt3配体，IL-3和/或GMCSF。可以在包含BMP4、VEGF和任选的FGF-2的第一确定培养基中培养多能细胞，随后在包含(Flt3配体，IL-3和GMCSF)或(Flt3配体，IL-3，IL-6和TPO)的第二培养基中培养。第一和第二培养基还可以包含SCF，IL-6，G-CSF，EPO，FGF-2和/或TPO中的一种或多种。基本上低氧的条件(例如，低于20％的O2)可以进一步促进造血或内皮分化。
细胞可以通过机械或酶促手段(例如，使用胰蛋白酶或TrypLETM)基本上个体化。培养基中还可以包含ROCK抑制剂(例如H1152或Y-27632)。预期这些方法可以使用例如机器人自动操作来自动化。
在某些实施方案中，可以使用基本上低氧的条件来促进多能细胞分化成造血祖细胞。如本领域技术人员将认识到的，小于约20.8％的大气氧含量将被认为是低氧的。与环境空气相比，培养中的人细胞可以在氧含量降低的大气条件下生长。这种相对低氧可以通过减少暴露于培养基的大气氧来实现。胚胎细胞通常在减少氧的条件下在体内发育，通常约1％至约6％的大气氧，二氧化碳为环境水平。不希望受理论束缚，预计低氧条件可能模仿某些胚胎发育条件的一个方面。如下面的实施例所示，在某些实施方案中可以使用低氧条件来促进多能细胞(例如iPSC或hESC)进一步分化成更分化的细胞类型，例如造血前体细胞。
以下低氧条件可用于促进多能细胞分化成造血祖细胞。在某些实施方案中，小于约20％，小于约19％，小于约18％，小于约17％，小于约16％，小于约15％，小于约14％，小于约13％，小于约12％，小于约11％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，约5％，约4％，约3％，约2％或约1％的大气氧含量可用于促进分化成造血前体细胞。在某些实施方案中，低氧环境包含约5％的氧气。
不管在任何给定的造血祖细胞扩增中使用的特定培养基如何，所用培养基优选补充有至少一种细胞因子，浓度为约0.1ng/mL至约500ng/mL，更通常为10ng/mL到100ng/mL。合适的细胞因子包括但不限于c-kit配体(KL)(也称为钢因子(StI)，肥大细胞生长因子(MGF)和干细胞因子(SCF))，IL-6，G-CSF，IL-3，GM-CSF，IL-1α，IL-11MIP-1α，LIF，c-mpl配体/TPO和flk2/flk3配体(Flt2L或Flt3L)。(Nicola等人，1979；Golde等人，1980；Lusis，1981；Abboud等人，1981；Okabe，1982；Fauser等人，1981)。特别地，培养物将包括SCF，Flt3L和TPO中的至少一种。更具体地说，培养物将包括SCF，Flt3L和TPO。
在一个实施方案中，细胞因子包含在培养基中并通过培养基灌注补充。或者，当使用生物反应器系统时，细胞因子可以通过单独的入口端口作为浓缩溶液分开加入，而无需培养基灌注。当添加细胞因子而没有灌注时，通常将它们作为10×至100×溶液添加，其量等于生物反应器体积的十分之一至1/100，并且大约每2至4天添加一次新鲜的细胞因子。此外，新鲜浓缩的细胞因子还可以另外加入，除了灌注培养基中的细胞因子之外。
在一些实施方案中，HPC展现破坏的甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)，并在促进髓样分化或淋巴样分化的条件下培养。在一些方面，HPC表达基本上不与甲基化DNA结合的非功能性MeCP2。在某些方面，HPC不以足以影响MeCP2DNA结合活性的水平表达MeCP2。在具体方面，MeCP2由于MeCP2基因中的截短或突变而不起作用。在一些方面，获得展现破坏的MeCP2的HPC包括使HPC与siRNA、shRNA或MeCP2的小分子抑制剂接触。
B.淋巴样细胞分化
然后可以将从体细胞衍生的PSC分化的HPC进一步分化成淋巴样谱系细胞，包括T细胞，NK细胞和T/NK细胞。在一些方面，分化过程中的HPC在第7-12天如第8-11天分离以分化成淋巴样细胞。在这个阶段的HPC可以通过CD34和CD43的表达来鉴定。此外，具有淋巴样细胞潜能的HPC可以以在第11天下降的低水平表达CD144、DLL4、CD7和CD235，这意味着在存在DLL4时引发细胞朝向淋巴样分化需要这些标记的某个阈值水平。
在一些方面，在分化过程的第7-11天如第7天，第8天，第9天，第10天或第11天分离的HPC可以分化为淋巴样细胞如T和NK细胞。在某些方面，淋巴样祖细胞起源的时机恰恰与HPC分化过程中血管内皮祖细胞的减少和红系祖细胞的出现相一致。在特定方面，第9天HPC可能在产生T细胞方面具有提高的效率。能够进行淋巴样分化的HPC可以通过某些标记的表达来分离和/或鉴定。例如，可以选择表面表达CD34和/或CD43的细胞进行淋巴样分化。检测淋巴样祖细胞的其他标记包括DLL4,CD144,CD31,CD34,CD43lo,CD45lo/-,CD235,CD7,Flk-1,APNLR。在特定方面，使用CD34/CD7,CD235/CD7,DLL4/CD34,DLL4/CD31,DLL4/CD144,或CD34/CD43lo双阳性群体的存在来鉴定淋巴样祖细胞。HPC上的CD144表达与CD31、CD34和DLL4共染色。HPC上的CD7表达与CD235、CD34和CD43共染色。因此，共表达CD144和CD7的HPC展示了表达膜结合缺口配体(DLL4)以及血内皮标记的淋巴样潜力捕获前体，并且产生了能够在体外产生确定性造血谱系的新生淋巴样祖细胞的表型标记。在具体的方面，可以通过分选包括CD31，CD34，CD144，CD43，CD45，CD6，CD335，Flk-1和DLL4的表面标记将HPC进一步分选成具有增强的淋巴样细胞潜力的细胞。在一些方面，HPC的CD114/CD34，CD144/CD45，CD144/CD7和CD144/CD34/CD45/CD7的阳性级分分化为淋巴样细胞。在具体方面，HPC的CD144/CD7阳性级分分化为淋巴样细胞。
HPC可以在确定的无饲养细胞条件下培养以进行淋巴样分化。培养基可含有一种或多种基质组分，如RetroNectin，纤连蛋白或RGD肽。不希望受任何理论束缚，基质组分可以为胚胎干细胞的生长提供坚实的支持。在某些实施方案中，可将基质组分施加到培养表面并在将细胞接种到培养基中之前与培养基接触。例如，在将细胞机械分离成团块或个体化细胞并诱导分化为造血前体细胞之前，可以在用纤连蛋白或MatrigelTM包被的平板上的确定培养基(例如TeSR培养基)中培养细胞。
可以使用各种基质组分来培养多能细胞，包括胶原蛋白(例如胶原IV)，层粘连蛋白，玻连蛋白，MatrigelTM，明胶，聚赖氨酸，血小板反应蛋白(例如TSP-1，-2，-3，-4和/或-5)和/或ProNectin-FTM。在某些实施方案中，由于可能对细胞存活力产生不利影响，可以避免与先前使用TeSR培养的细胞一起仅使用MatrigelTM、胶原蛋白IV或层粘连蛋白；尽管如此，这些组合物可以有利地与其他基质组分组合使用。这些基质组分的组合可以为促进细胞生长和细胞活力提供额外的益处。在某些实施方案中，可以使用1、2、3、4、5、6或更多种上述基质组分来培养细胞，例如在造血分化之前。
在实施例4中公开了用于淋巴样分化的示例性无饲养细胞的基质。在具体的方面，可以用DLL4：Fc嵌合蛋白和RetroNectin(纤连蛋白片段CH-296；Takara Shuzo，Japan)包被非组织培养物处理的平板，用于HPC的淋巴样分化。
在一些实施方案中，抗坏血酸可用于增强淋巴样分化。确定的培养基可补充有约10μM至约1mM的抗坏血酸，如约50μM至约100μM，如约95μM。抗坏血酸可以选自各种抗坏血酸盐，例如抗坏血酸磷酸镁。在一些实施方案中，烟酰胺(例如烟酸)可用于增强淋巴样分化，例如浓度为约0.1mM至约5mM。
在一些方面，通过施用增加受试者中Notch配体产生的物质来改变Notch配体的内源活性，从而将HPC分化成淋巴样细胞，例如T细胞。该方法还包括在培养基中培养细胞，其中该培养基包含有效量的notch配体和一种或多种选自IL-7，IL-15，SCF，Flt-3和IL-3的细胞因子。在一些具体的实施方案中，培养基可以还包含IL-6。在一些实施方案中，notch配体是δ4notch配体(DLL4)，例如DLL4：Fc嵌合体。
选择促进和维持T细胞谱系细胞的分化和增殖的Notch配体。Notch配体可以来源于人，或者可以来自其他物种，包括哺乳动物物种，例如啮齿动物，狗，猫，猪，绵羊，牛，山羊和灵长类动物。Notch配体的具体例子包括Delta家族。Delta家族包括Delta-1(Genbank登录号AF003522，智人)，Delta-3(Genbank登录号AF084576，褐家鼠)，Delta样-1(Genbank登录号NM-005618和NP-005609，智人；Genbank登录号X80903，I48324，M.家鼠)，Delta样-3(Genbank登录号NM-053666，N-446118，褐家鼠)，Delta-4(Genbank登录号AF273454，BAB18580，小家鼠；Genbank登录号AF279305，AAF81912，智人)，和Delta样-4(Genbank登录号Q9NR61，AAF76427，AF253468，NM-019074，智人；Genbank登记号NM-019454，小家鼠)。Notch配体是可商购的，或者可以通过重组DNA技术产生并且被不同程度地纯化。
该方法还包括将HPC细胞维持在上述培养物中足以产生分化的NK细胞的时间的步骤。在一些实施方案中，分化的NK细胞与T细胞一起出现在培养物中，但是NK细胞可能在第6周后停止增殖。一般而言，确定NK细胞数量和/或其分化状态的增加可以使用本领域普通技术人员已知的常规方法进行评估。例如，可以通过流式细胞术通过用抗CD56和抗CD3抗体染色细胞来监测培养的细胞的NK细胞发育。CD56+/CD3-的细胞将指示分化的NK细胞。
C.髓样分化
使用例如髓样分化培养基，可将由体细胞衍生的PSC产生的HPC分化成髓样细胞。髓样分化培养基可以是无血清或确定的培养基，培养基可以含有SCF，EPO，TPO，胰岛素，地塞米松或氢化可的松和/或转铁蛋白。髓样细胞可以是树突细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，单核细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞和/或嗜酸性粒细胞。在特定方面，髓样细胞是树突细胞。例如，在表4-6中描述了示例性的髓样分化和扩增培养基。
在一个示例性方法中，将HPC在低附着板中转移到含有SFEM(Stem CellTechnologies)，肝素(例如1至10U/mL，诸如5U/mL，Sigma)，TPO(例如，50-150ng/mL，诸如100ng/mL)，人重组SCF(例如50-150ng/mL，诸如100ng/mL)，FLT3L(例如50-150ng/mL，诸如100ng/mL)，IL-3(例如1至20ng/mL，诸如10ng/mL)和IL-6(例如1至20ng/mL，诸如10ng/mL)的培养基。大约5-15天后，例如8天，髓样细胞在含有GM-CSF(例如25-150ng/mL，如100ng/mL)的SFEM培养基中扩增。最后，将细胞在含有SFEM(Stem Cell Technologies)，Excyte(例如，0.1％-2％，如1％)，GM-CSF(25-150ng/mL，诸如100ng/mL)，IL-4(10至30ng/mL，诸如20ng/mL)和TNFα(0.5至5ng/mL，诸如2.5ng/mL)的培养基中再培养1-2周以产生树突细胞。可以通过表达选自CD209+，CD1a+，HLA-DR+，CD11c+，CD14+，CD83+和CD86+的一种或多种标记来表征树突细胞。这些标记主要染色髓样DC而不是浆细胞样DC(CD123+)。瑞氏染色可以在细胞离心涂片样品上进行，以确认树突状细胞的典型形态。
D.细胞培养
在某些实施方案中，可使用基本上低氧的条件来促进HPC分化成髓样或淋巴样谱系。在某些实施方案中，小于约20％，小于约19％，小于约18％，小于约17％，小于约16％，小于约15％，小于约14％，小于约13％，小于约12％，小于约11％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，约5％，约4％，约3％，约2％或约1％的大气氧含量可用于促进分化成造血前体细胞。在某些实施方案中，低氧环境包含约5％的氧气。
如本文所述，一种或多种确定的培养基可有利地用于促进HPC分化成髓样和淋巴样谱系；特别是消除诸如血清和小鼠饲养层的动物产品可以降低与将细胞暴露于动物产品相关的风险，并且允许产生可以更安全地施用于人受试者的细胞。由于传统干细胞培养的发展依赖于血清产品和小鼠饲养层来将干细胞分化成多种细胞类型，这些传统方法具有受限的可以进行分化的规模，增加的生物变异性和潜在的污染，和严重阻碍的ES细胞在转化疗法中的使用，否则它们在其中可能证明是有用的。
通常，将本公开内容的细胞在培养基中培养，所述培养基是能够维持细胞生长的富含营养物的缓冲溶液。根据本文所述的方法，适合于将多能干细胞分离，扩增和分化成造血前体细胞和造血细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖Dubelcco改良Eagle培养基(DMEM)，DMEM/F-15，RPMI 1640，Iscove改良Dubelcco培养基(IMDM)和Opti-MEM SFM(Invitrogen Inc.)。包含补充有人血清白蛋白、人ExCyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和促细胞分裂剂的最小基本培养基，例如Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)的化学成分确定的培养基也是合适的。如本文所用，促细胞分裂剂是指刺激细胞分裂的试剂。试剂可以是化学物质，通常是某种形式的蛋白质，它刺激细胞开始细胞分裂，从而触发有丝分裂。在一个实施方案中，如美国系列号08/464,599和WO96/39487中所述的无血清培养基和如美国专利号5,486,359中所述的“完全培养基”预期与本文所述的方法一起使用。在一些实施方案中，培养基补充有补充有肝素(2U/ml)的10％胎牛血清(FBS)，人自体血清，人AB血清或富含血小板的血浆。
可通过在增加足以促进细胞分化成髓样或淋巴样谱系的因子的细胞内水平的条件下，在培养基中培养多能干细胞或造血前体细胞来产生免疫细胞。培养基还可以含有一种或多种造血细胞分化和成熟剂，如各种生长因子。这些试剂可以帮助诱导细胞表现更成熟的表型-或优先促进成熟细胞的存活-或者具有这两种效应的组合。分化和成熟剂可以包括能够促进造血细胞谱系细胞生长的可溶性生长因子(肽激素，细胞因子，配体-受体复合物和其他化合物)。这些试剂的非限制性实例包括但不限于造血或内皮生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，干细胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)，FLT-3(FLT3L)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-9(IL-9)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其同种型或变体。
IV.免疫细胞的用途
由某些方面的方法和组合物提供的免疫细胞可用于各种应用。这些包括但不限于体内移植或植入细胞；筛选细胞毒性化合物，致癌物，诱变剂生长/调节因子，药物化合物等；阐明血液病和损伤的机制；研究药物和/或生长因子的作用机制；诊断和监测患者的癌症；基因治疗；和生物活性产品的产生，仅举几例。
A.测试化合物筛选
本公开内容的免疫细胞可用于筛选影响本文提供的淋巴样细胞的特征的因子(诸如溶剂，小分子药物，肽和多核苷酸)或环境条件(诸如培养条件或操作)。
本公开内容的特定筛选应用涉及药物研究中的药物化合物的测试。读者通常参考标准教科书“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”，Academic Press，1997，和美国专利号5,030,015。在某些方面，髓样细胞和淋巴样细胞在标准药物筛选和毒性测定中起到测试细胞的作用，如之前在短期培养中对造血细胞和前体进行的那样。候选药物化合物活性的评估通常涉及将某些方面提供的造血细胞或前体与候选化合物组合，确定归因于该化合物的细胞的形态学，标记表型或代谢活性的任何变化(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将化合物的作用与观察到的变化相关联。可以进行筛选，因为化合物被设计为对造血细胞或前体具有药理学作用，或者因为设计为具有其他效应的化合物可能对造血细胞或前体具有意想不到的作用。两种或两种以上的药物可联合使用(通过与细胞同时或顺序联合)来检测可能的药物-药物相互作用效应。
B.造血细胞治疗
本公开内容还提供了将本文提供的免疫细胞用于恢复可能由于血液疾病或病症或损伤而需要这种治疗的受试者的功能程度。例如，通过本文公开的方法衍生的免疫细胞可用于治疗血液学疾病和病症，例如血红蛋白病，贫血症等。此类细胞可用于治疗由细胞抑制疗法(例如化学疗法)引起的造血细胞缺陷。
为了确定本文提供的细胞对治疗应用的适用性，可以首先在合适的动物模型中测试细胞。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。将本文提供的细胞在适于进一步观察的位置(例如在肾囊下，脾脏中，肝小叶中或骨髓中)施用于免疫缺陷动物(例如NOG小鼠或化学地或通过辐射致免疫缺陷的动物)。在几天到几周或更长时间后收获组织，并评估起始细胞类型如红细胞是否仍然存在。这可以通过向被施用细胞提供可检测标记(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)来进行；或者通过测量对施用的人细胞具有特异性的组成型标记。当在啮齿动物模型中测试本文提供的细胞时，可以通过使用人特异性抗体的免疫组织化学或ELISA或通过使用引起特异于人多核苷酸序列的扩增的引物和杂交条件的RT-PCR分析来评估施用的细胞的存在和表型。在本公开内容的其他地方提供了用于评估mRNA或蛋白质水平上的基因表达的合适标记。
通过本公开内容的方法提供的免疫细胞可以在各种动物模型中测试其治疗血液病症和损伤的能力。例如，镰状细胞贫血症小鼠模型或T/B细胞缺陷型Rag-2敲除小鼠可能是用于测试本文公开的髓样和淋巴样细胞的特别有用的动物模型。
在本公开内容的某些方面中提供的在动物模型中表现出期望的功能特征或功效的免疫细胞也可适于直接施用于有需要的人受试者。出于止血的目的，细胞可以在任何有足够通路进入循环的部位给药。造血细胞或其前体也可以在损伤或疾病部位递送。
本公开内容的某些方面中提供的细胞可用于治疗有此需要的任何受试者。可能适合于这种治疗的人疾病包括各种贫血和血红蛋白病，以及以造血细胞数量减少为特征的疾病(例如髓样增生异常综合征，髓样纤维化，嗜中性白血球减少症，粒细胞缺乏症，格兰士曼氏血小板无力症，血小板减少症和获得性免疫缺陷综合征)。对于人治疗，剂量通常在约109至1012个细胞之间，并且通常在约5×109至5×1010个细胞之间，从而调整受试者的体重，疾病的性质和严重程度，以及施用的细胞的复制能力。确定治疗模式和适当剂量的最终责任在于管理临床医师。
C.商业、治疗和研究目的的分配
为了制造、分配和使用的目的，本公开内容的免疫细胞通常以在等渗赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮液的形式供应，任选冷冻以促进运输或储存。
本文还提供了不同的试剂系统，其包含在制造、分配或使用过程中的任何时间存在的细胞集合或组合。细胞集合包括本公开内容中描述的两种或更多种细胞群体的任何组合，例如但不限于编程衍生的细胞(造血谱系细胞，其前体和亚型)，与未分化的干细胞组合，体细胞衍生的造血细胞或其他分化细胞类型。该集合中的细胞群体有时共享相同的基因组或其遗传修饰形式。每个细胞类型可以在相同或不同的时间、在共有商业关系的相同实体或不同实体的控制下、在相同工厂或在不同地点包装在一起，或包装在不同容器中。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1-产生T细胞衍生的PSC(TiPSC)
为了产生iPS细胞，从血液样品分离T细胞，激活，并以逆转录病毒重编程为iPSC。首先，将外周血单核细胞(PBMC)在具有300IU/ml rhIL2(Peprotech)和10ng/ml可溶性抗CD3抗体(OKT3克隆，eBiosciences)和抗CD28抗体的新制备的AIM-V培养基+pen/strep/谷氨酰胺(AIV-V/ps/s/g培养基)(Invitrogen)中扩增。激活几天后，通过CEDEX细胞计数验证指数生长。在培养3天后，测定细胞的T细胞表型，然后用重编程因子转导。
如前所述构建逆转录病毒载体Nanog RFP，Lin28 RFP，Oct4 eGFP和Sox2 eGFP(参见美国申请号61/088，054，通过引用并入本文)。逆转录病毒载体c-Myc RFP，Klf4 RFP，Oct4 eGFP和Sox2 eGFP类似地构建。
将CD3-和CD28-活化的外周单核细胞在包含含有2％人AB血清和10ng/mL IL-2的AIM-V培养基的T细胞培养基中培养。在第6天，使用Amaxa U-014程序(1-5x106个细胞/转染，Amaxa T细胞转染溶液)通过电穿孔用6种重编程因子转染T细胞。直到转染后第25天，将细胞在每孔转染一次的情况下在6孔板的retronectin(0.3μg/cm2)-和玻连蛋白(0.2μg/cm2)包被的孔中培养，并逐渐从T细胞过渡到从第14天开始的E8 PSC培养基。
活化和扩增的T细胞显示出特征性的细胞形态和聚集行为。逆转录病毒转导效率的检测通过在初始转导后72小时的GFP和RFP表达来确定，在～3周的过程中转基因被沉默并显示hES细胞表型。明确确定的iPS细胞集落在第23天开始出现。GFP和RFP沉默通过荧光显微镜检查证实，并且使用移液管尖端在解剖罩中挑取集落。然后将集落块转移至新鲜的6孔板中。考虑到输入平板细胞的数量，计数集落数以估计重编程效率。从此刻开始，克隆集落每天喂养并手动再传代一次，然后扩增以产生TiPSC细胞系。
实施例2-TiPSC分化成造血前体细胞(HPC)
对包括实施例1的TiPSC的各种游离型和病毒重编程的iPSC(表1)进行用于产生HPC的3D分化方案(图1)。首先，在Essential 8(E8)培养基中的MatrigelTM-或玻连蛋白-涂布的超低附着(ULA)平板上，在无饲养细胞条件下将iPSC适应低氧条件5-10次传代。在补充有5μM blebbistatin的无血清确定(SFD)培养基存在下，从亚汇合iPSC以0.25-0.5百万个细胞/ml的密度制备聚集体。该过程在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充物(Invitrogen17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充物(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油的SFD基础培养基中的超低附着(ULA)平板或旋转瓶中进行。
一旦EB形成，通过在前4天用50ng/ml的BMP-4、VEGF和FGF2补充SFD基础培养基来启动分化。在分化EB的第五天，将培养物置于各50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF和TPO以及5000单位的肝素的存在下。在分化过程中，每2天向EB培养物补充一半体积的含有细胞因子的新鲜分化培养基直至低氧条件下分化的第12-16天。在分化过程后收获细胞，并通过流式细胞术评估表型，并使用CFU测定评估功能性能力。收获细胞并通过流式细胞术定量CD43/CD34细胞的百分比(图1B)。通过以每个输入数量的iPS细胞产生的HPC的绝对数量来计算该过程的效率(图1C)。
表1：使用多个iPSC细胞系的过程验证
对于流式细胞术分析，收集细胞并用培养基洗涤一次。使用TrypLETM或0.5％胰蛋白酶在37℃培养箱中消化细胞沉淀5-10分钟，然后用培养基洗涤并通过70-μm细胞过滤器。将细胞重悬于含有FACS缓冲液的PBS-FBS中，计数以估计细胞活力并用荧光染料缀合的单克隆抗体染色：抗人CD43(1G10)，抗人CD31(WM-59)，抗人CD41(HIP8)；抗人CD45(HI30)；抗人CD34(581、8G12)(BD Biosciences San Jose，CA)；和抗人CD235。用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD Biosciences)排除非活细胞。活细胞分析在FACSCaliburTM或Accuri流式细胞仪和Cell Quest软件上进行。
对于克隆形成性造血祖细胞的测定(CFU测定)，使用TryplE或0.5％胰蛋白酶/EDTA将EB分散为单细胞悬浮液中。对活细胞进行定量，铺板(50,000-300,000个细胞/mL)，并使用包含50ng/mL干细胞因子(SCF)、3U/mL促红细胞生成素(EPO)、10ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10ng/mL白细胞介素-3(IL-3)的人甲基纤维素完全培养基(R&D Systems，Minneapolis，MN)在增湿室中测定造血CFC。14天后，根据集落形态对集落进行评分，并对每105个铺板细胞的集落进行定量。
实施例3-修饰的iPSC向造血前体细胞(HPC)的分化
通过聚集悬浮(3D)培养将1C T细胞衍生的iPSC(通过逆转录病毒重编程衍生的TiPSC)分化成CD34+造血祖细胞。在Essential 8(E8)培养基中，将1C细胞在无饲养细胞条件下维持在MatrigelTM-或玻连蛋白-涂布的6孔板上。在补充有50ng/ml FGF2、50ng/mlVEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和10μM blebbistatin(肌球蛋白-II抑制剂)的Essential 3(E3)培养基(仅包含E8培养基的8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基，抗坏血酸2-磷酸镁和亚硒酸钠)中以0.5-1百万个细胞/ml的密度从亚汇合的1C细胞(<80％汇合)制备聚集物。在摇床平台上以15rpm(包括所有随后的培养步骤)连续搅拌下，在超低附着(ULA)烧瓶中培养24小时期间进行聚集体形成。
将形成的细胞聚集体(即胚状体-EB)进一步转移至补充有造血中胚层诱导细胞因子-25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的无血清分化培养基(50％IMDM，50％Hams F12培养基，100μg/ml聚乙烯醇，100μg/ml重组人血清白蛋白，1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)，0.1x化学确定的脂质补充剂(Invitrogen)，125μM抗坏血酸2-磷酸镁，0.25μM亚油酸，痕量元素补充剂A(0.3x)，B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)，5mM氯化钠，100μM单硫代甘油，20μM乙醇胺，100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)。培养持续4天，第二天完全更换培养基。
为了支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移到补充有造血支持性细胞因子-50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/mlBMP4的无血清分化培养基(如上所述)。培养持续4天，第二天完全更换培养基。
在分化过程的第7-9天期间收获培养物。通过在37℃在Accutase(或Accumax)溶液中消化分化细胞聚集物15-20分钟获得单细胞悬浮液。细胞在MACS缓冲液(例如含有5mg/mlBSA和1mM EDTA的PBS)中洗涤，通过70μM细胞过滤器过滤并在4℃用直接CD34顺磁性微珠(Miltenyi Biotec)标记30分钟。根据制造商(Miltenyi Biotec)的建议，使用MS或LS磁性柱、合适的磁体和标准分离程序分离CD34+细胞。将分离的CD34+细胞铺在T/NK分化培养板上，或在分离后1小时内冷冻保存以备后用。
实施例4-HPC的淋巴样分化
为了确定实施例2和实施例3的HPC的淋巴样分化参数，使细胞系经受T和NK细胞分化的培养条件。首先，在基质依赖性方案中测试了几种变体的T细胞分化。对来自不同细胞系的第12天的HPC测试基质细胞系(包括OP9骨髓基质细胞和MS5鼠骨髓基质细胞)的T细胞潜能。将细胞在具有20％FBS，10ng/mL SCF，5ng/mL Flt-3和5ng/mL IL-7的αMEM培养基中培养。细胞每周三次更换一半的培养基。就T细胞存在进行的细胞分析表明细胞具有产生髓样细胞的倾向，并且不能检测到CD3+细胞的存在。此外，基质共培养物在低氧条件下表现不佳。
表2：用于淋巴样分化的基质的选择。铺在Retronectin-DLL4上的细胞揭示了T前体细胞(CD5+/CD7+)的存在。
用于T细胞分化的基质 ％CD5 ％CD7 ％CD5/CD7
Retronectin-DLL4 11％ 40％ 11％
腱生蛋白-DLL4 0.7％ 5.2％ 0.7％
玻连蛋白-DLL4 0.6％ 6％ 0.6％
表3：低氧有利于T细胞分化。低氧条件下分化的细胞揭示了T和NK细胞的存在。
因此，开发了无饲养细胞的T细胞分化方案。将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度接种于以0.5μg/cm2覆盖有Retronectin和Notch DLL4的未处理的组织培养板上。将HPC在补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM抗坏血酸(WAKO实验室)以及50ng/mL IL-7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCell Technologies)中培养。每48小时补充培养基，并在2周时将细胞分配到新的配体包被的平板。另外，在2和3周之间，通过细胞表面标记CD5和CD7分析细胞中T前体细胞的存在。在4周时，通过细胞表面标记CD3，CD4和CD8分析细胞中T细胞的存在。在6-8周时，使用细胞表面标记CD4，CD8，CD3，CD94和CD56分析细胞中T和NK细胞的存在。
测试其对T细胞分化的影响的参数之一是培养板上基质涂层的选择。通过使用与Notch DLL4的各种基质组合使用脐带血细胞分析在在铺板后3周无血清条件下T前体细胞的出现来进行比较。结果显示，与玻连蛋白或腱生蛋白的组合相比，retronectin与DLL4的组合在分化脐带血细胞至T前体细胞方面更有效(表2)。
令人惊讶的是，发现低氧条件增强了无饲养细胞的T细胞分化。具体而言，观察到与常氧条件下分化的细胞相比，低氧导致CD8阳性细胞百分比增加和CD4阳性细胞百分比降低(表3)。
通过在实施例2中描述的HPC分化的第5天，第7天，第9天和第11天收获各种细胞系来分析将血细胞衍生的iPSC分化成淋巴样谱系的效率。将HPC细胞解冻并涂布在Retronectin和DLL4包被的平板上。每2天给细胞更换新鲜培养基，并在HPC细胞解冻后分析2周时的T前体细胞标记，4周时的T细胞标记和6周时的T和NK细胞标记。针对CD7，CD8，CD56(图3A)，CD45，CD7，CD5(图3B)和CD56，CD8，CD3(图3C)的表面表达对细胞染色用于检测T、NK和NK/T细胞的存在。观察到TiPSC和游离型重编程的3908细胞在第7-11天具有增加的淋巴样细胞潜能(图3A)。
为了确定表面标记可用于增加淋巴样分化的效率，对TiPSCs1E细胞系和游离型3902细胞系执行CD43/CD34、CD34、DLL4、CD31/CD144和CD235的分析(图4)。发现DLL4的表达和CD235的水平在分化的第11天下降，而CD34表达降低并且CD43表达随着分化的日子而增加。由于在分化的第11天没有淋巴样细胞，这意味着这些标记的表达的某个阈值水平对于在存在DLL4时引发细胞向淋巴样分化是必需的。
HPC分化过程中淋巴样祖细胞的进一步分析通过表面标记CD31，CD34，CD144，CD43，CD45，CD6，CD335，Flk-1和DLL4的磁性分选来进行。第8天将HPC分选成CD114/CD34，CD144/CD45，CD144/CD7和CD144/CD34/CD45/CD7阳性和阴性级分以及未分类的对照(图5)。然后将这些部分进行淋巴样分化过程并在第16天分析CD3+细胞的存在(图6A)。观察到与阴性级分和未分类的对照相比，每个阳性级分显示出淋巴样潜能显著增加。这由来自阳性级分磁性分选的T细胞产生的富集倍数的增加进一步支持(图6B)。将阳性级分重新涂布在新鲜的Ret-DLL4表面上进行另外两周。
在淋巴样分化4周时，第8天CD144+/CD7+和CD144+/CD45+ HPC在体外持续产生T细胞，如图7A中CD3阳性细胞的百分比所示。CD3细胞为CD335阳性，CD161阳性和不变的T细胞受体(6B11)阴性。因此，晚期状态培养物具有新生的NK/T细胞表型。另外，CD144+/CD7+ HPC显示在产生T细胞时具有增加的效率，如通过在第16天输入HPC与输出T细胞的比率所测量的。然而，在4周结束时过程的累积效率显示对于CD144/CD34/Cd45/CD7阳性级分是最高的。
实施例5-HPC的髓样分化
实施例2和3的CD34+ HPC经历髓样分化以产生相对纯的人树突细胞(DC)群体。整个过程中细胞在低附着组织培养板或烧瓶上培养。将细胞以0.5-1x106个细胞/mL的密度重悬于含有50ng/mL的Flt-3配体(FlT-3L)、50ng/mL干细胞因子(SCF)、50ng/mL血小板生成素(TPO)，50ng/mL白细胞介素-3(IL-3)和50ng/mL白细胞介素-6(IL-6)的无血清培养基(SCF)中。
为了开始髓样分化，将细胞以0.25至0.5百万个细胞/mL之间的密度接种于髓样祖细胞培养基(表4)中并扩增约2周。监测细胞在第4天和第8天的活力和CD34+/CD45+/CD43+的表达。观察到CD34+群体减少并且在培养物中出现CD45+/CD43+/CD31+群体。该阶段培养物的表型主要是CD43+/CD45+/CD31+/CD34Lo。
表4：髓样祖细胞
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
Pen/Strep Gibco 15140 1％
SCF Peprotech 300-07 50ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 50ng/mL
TPO Peprotech 300-18 50ng/mL
IL-3 Peprotech 200-06 50ng/mL
Flt-3L Peprotech 300-19 50ng/ml
*StemSpanTMSFEM(Stem Cell Technologies，目录号09650)，Stem Pro 34(Invitrogen，目录号10639-011)，或Stemline II(Sigma，目录号S0192)可以被用作无血清培养基。
当细胞显示超过50％的CD43+/CD45+/CD31+/CD34-细胞表面标记表达时，将细胞置于髓样扩增培养基中(表5)8天。每隔一天给细胞喂新鲜培养基。在8天结束时，培养的细胞具有富集的髓样细胞群体，显示80-90％的CD43+/CD45+/CD31+/CD34-。在髓样扩增阶段结束时，测定细胞数目，存活力和纯度。
表5：髓样扩增培养基
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
GM-CSF Peprotech 300-03 100ng/mL
*StemSpanTMSFEM(Stem Cell Technologies，目录号09650)，Stem Pro 34(Invitrogen，目录号10639-011)，或Stemline II(Sigma，目录号S0192)可以被用作无血清培养基。
最后，在16天培养结束时，将培养物置于树突状细胞富集培养基(表6)中。细胞密度保持在每毫升0.5-1百万个细胞之间，并且每隔四天在无离心步骤的情况下给细胞喂新鲜培养基。在这个分化阶段几乎没有观察到增殖。相反，观察到细胞粘附在低附着板上并且尺寸增大。在一周结束时，收集样品并通过流式细胞术测试CD209+，CD1a+，HLA-DR+，CD11c+，CD14+，CD83+和CD86+的存在(图9-10)。这些标记主要染色髓样DC而不是浆细胞样DC(CD123+)。将细胞维持在树突状细胞富集培养基中并在各个时间点分析以量化产率和纯度。对细胞离心涂片进行Wright染色以确认树突状细胞的典型形态。
表6：树突细胞富集培养基
组分 制造商 目录号 浓度
无血清培养基*
GlutaMAX Gibco 35050 1％
GM-CSF Peprotech 300-03 100ng/mL
Excyte Millipore 81-129-1 1％
IL-4 Peprotech 200-04 20ng/mL
TNFα Peprotech 300-01A 2.5ng/mL
实施例6-PSC分化和T细胞扩增的方法
PSC向CD34+淋巴样造血祖细胞的分化：通过聚集悬浮(3D)培养将1C T细胞来源的iPSC(通过逆转录病毒重编程衍生的TiPSC)分化为CD34+造血祖细胞。在Essential 8(E8)培养基中，将1C细胞维持在MatrigelTM-或玻连蛋白-涂布的6孔板上的无饲养细胞条件下。在补充有50ng/ml FGF2、50ng/ml VEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和10μMblebbistatin(肌球蛋白-II抑制剂)的Essential 3(E3)培养基(仅包含E8培养基的8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基，抗坏血酸2-磷酸镁和亚硒酸钠)中以0.5-1百万个细胞/ml的密度从亚汇合的1C细胞(<80％汇合)制备聚集物。在摇床平台上以15rpm(包括所有随后的培养步骤)连续搅拌下，在超低附着(ULA)烧瓶中培养24小时期间进行聚集体形成。
将形成的细胞聚集体(胚状体-EB)进一步转移至补充有造血中胚层诱导细胞因子-25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的无血清分化培养基(50％IMDM，50％Hams F12培养基，100μg/ml聚乙烯醇，100μg/ml重组人血清白蛋白，1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)，0.1x化学确定的脂质补充剂(Invitrogen)，125μM抗坏血酸2-磷酸镁，0.25μM亚油酸，痕量元素补充剂A(0.3x)，B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)，5mM氯化钠，100μM单硫代甘油，20μM乙醇胺，100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)。培养持续4天，第二天完全更换培养基。
为了支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持性细胞因子-50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/mlBMP4的无血清分化培养基(如上所述)。培养持续4天，第二天完全更换培养基。
在1+4+4(总共9天)分化过程后收集培养物。通过在37℃在Accutase(或Accumax)溶液中消化分化细胞聚集物15-20分钟获得单细胞悬浮液。细胞在MACS缓冲液(含有5mg/mlBSA和1mM EDTA的PBS)中洗涤，通过70μM细胞过滤器过滤并在4℃用直接CD34顺磁性微珠(Myltenyi Biotec)标记30分钟。根据制造商(Myltenyi Biotec)的建议，使用MS或LS磁性柱、合适的磁体和标准分离程序分离CD34+细胞。将分离的CD34+细胞铺在T/NK分化培养板上，或在分离后1小时内冷冻保存以备后用。
T/NK分化培养物：对于T/NK分化，用在PBS中稀释的Notch配体hDLL4-Fc嵌合蛋白和retronectin(各0.5μg/cm2)包被非组织培养物处理的塑料板。细胞铺板前，吸出包被溶液，用细胞培养基础培养基(DMEM/F12或其他)洗涤一次，并用0.25ml/cm2的由StemSpanSFEM(Stem Cell Technologies)、GlumaMax(1/100)、PenStrep(1/200)、抗坏血酸磷酸镁(250μM)、烟酰胺(2mM)和细胞因子SCF、TPO、FLT3L和IL7(各50ng/ml)组成的T细胞分化培养基(TCDM)填充。分离的PSC衍生的CD34+细胞以5000个细胞/cm2密度铺板并在低氧(5％O2)CO2培养箱中培养2周，在第3天和第6天加入新鲜的TCDM培养体积，并且每三天更换一半培养体积。通过温和重悬和收集非贴壁细胞收获总分化细胞，然后用PBS-EDTA(0.5mM)处理10-15分钟使贴壁细胞脱离。
T细胞扩增培养：对于T细胞扩增，将组织培养塑料板用在PBS中稀释的抗-CD3mAb(克隆OKT3)和retronectin(各0.5μg/cm2)包被。在细胞铺板前，吸出包被溶液，用细胞培养基础培养基(DMEM/F12或其他)洗涤板两次，并用由ImmunoCult XF培养基(Stem CellTechnologies)、GlumaMax(1/100)，PenStrep(1/200)和细胞因子IL2和IL7(各10ng/ml)组成的0.2ml/cm2T细胞扩增培养基(TCEM)填充。也可以添加IL15和/或IL21以改善扩增。将从T/NK分化培养物收获的细胞以20000个细胞/cm2密度接种并在低氧(5％O2)CO2培养箱中培养2周，第3天加入新鲜的TCEM培养物体积，并每三天更换一半培养体积。通过温和地重悬和收集非贴壁细胞收获扩增的T细胞。
实施例7-用于产生HPC的2D方案
使01279.107.3902 MeCP2敲除和TiPSCs1E细胞经历用于产生HPC的2D分化方案(图16)。首先，在Essential 8(E8)培养基中在MatrigelTM-或Vitronectin-包被的平板上在无饲养细胞条件下将iPSC适应低氧条件5-10次传代。将iPSC个体化，并且在补充有5μMblebbistatin的无血清确定(SFD)培养基中以25000/cm2的密度在PureCoat Amine-涂布的6孔板(Corning Inc.)上铺板。SFD基础培养基含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)，25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)，0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)，不含视黄酸的1％B27补充物(Invitrogen 12587-010)，0.05％BSA，50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M单硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF。
通过在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N 2补充物(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充物(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5×10-4M单硫代甘油的补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基中培养，在第1天开始造血分化的诱导。在第2天，将培养基吸出并将细胞置于新鲜的EB1培养基中。(SFD基础培养基含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)，25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)，0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)，不含视黄酸的1％B27补充物(Invitrogen 12587-010)，0.05％BSA，50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M单硫代甘油，补充有50ng/ml BMP-4、VEGF和bFGF)，在其中培养额外48小时。
在第5-10天，吸出培养基并将细胞置于EB2培养基中进行额外48小时。EB2培养基包含补充有50ng/ml Flt-3配体、IL3、IL6、SCF和TPO(各50ng/ml)和5000U/ml的肝素的含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充物(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M单硫代甘油的新鲜SFD基础培养基。使用TrypLE在分化的第7、8、9、10天收获细胞，并对HPC标记和淋巴样祖细胞的存在进行染色。
对于T细胞分化，将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度接种于以0.5μg/cm2包被有Retronectin和Notch DLL4的未处理的组织培养板上。将HPC在StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCell Technologies)培养基或补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素，95μM抗坏血酸(WAKO实验室)以及50ng/mL的IL7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的SFD中培养。每48小时补充培养基，并在2周时将细胞非酶促分配至新的配体包被的平板。另外，在2和3周之间，通过细胞表面标记CD5和CD7分析细胞中T前体细胞的存在。在4周时，通过细胞表面标记CD3，CD4和CD8分析细胞中T细胞的存在。在6-8周时，使用细胞表面标记CD4，CD8，CD3，CD94和CD56分析细胞中T和NK细胞的存在。
实施例8-MeCP2破坏对淋巴样分化的影响
为了确定MeCP2在造血分化过程中的作用，产生了MeCP2敲除iPSC细胞系。将雄性野生型(WT)01279 iPSC细胞系工程化以敲除MeCP2以产生01279.107.3902细胞系。使用TAL核酸酶，通过转染MeCP2 TALEN，在MeCP2的甲基CpG结合结构域(图17B)之前插入一系列终止密码子，然后通过反向插入侧接LoxP的PGKp-嘌呤霉素-SV40pA进行含有终止密码子的供体质粒插入。用MeCP2 TALENS和表达野生型EBNA1的供体质粒p1553转染0.1279iPSC。
用嘌呤霉素筛选选择插入阳性的细胞，然后挑取集落并通过整合PCR进行筛选。在筛选的集落中，96％通过两次PCR筛选反应对于插入是阳性的。扩增第14个克隆并在第3代筛选，发现8个克隆对于骨架质粒的整合是阴性的。因此，其余三个克隆通过插入序列测序，发现两个克隆是多克隆的。选择一个单克隆系0.1279.107.302并充分表征以供进一步研究。其他克隆也被获得并表征为正确工程化的。MeCP2变体001、002、005和008的氨基酸比对在图17C中示出。变体008不编码MethylCpG结合域。
使实施例1的01279.107.3902 MeCP2敲除细胞和WT 01279细胞经历用于产生HPC的3D分化方案(图17A)。首先，在Essential 8(E8)培养基中的MatrigelTM-或玻连蛋白-涂布的超低附着平板上，在无饲养细胞条件下将iPSC适应低氧条件5-10次传代。在补充有5μMblebbistatin的无血清确定(SFD)培养基存在下，从亚汇合iPSC以0.25-0.5百万个细胞/ml的密度制备聚集体。该过程在含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mMHEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)、0.5％N2补充物(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充物Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50ug/ml抗坏血酸和4.5×10-4M硫代甘油的SFD基础培养基中的超低附着(ULA)平板或旋转瓶中进行。
一旦形成胚状体(EB)，通过在前4天用50ng/ml的BMP-4，VEGF和bFGF补充SFD基础培养基来启动分化。在第五天，将EB培养物置于各50ng/ml的Flt-3配体、IL3、IL6、SCF、肝素和TPO的存在下。在分化过程中，每2天向EB培养物补充一半体积的含有细胞因子的新鲜分化培养基直至低氧条件下分化的第12-16天。
对于淋巴样分化，将HPC以约5,000至约25,000个细胞/cm2的细胞密度接种于以0.5μg/cm2覆盖有Retronectin和Notch DLL4的未处理的组织培养板上。将HPC在补充有1％Glutamax、1％青霉素链霉素、95μM抗坏血酸(WAKO实验室)以及50ng/mL IL-7、SCF、Flt-3和TPO(Peprotech)的StemSpan无血清扩增培养基II(SFEM；StemCell Technologies)中培养。每48小时补充培养基，并在2周时将细胞分配到新的配体包被的平板。另外，在2和3周之间，通过细胞表面标记CD5和CD7分析细胞中T前体细胞的存在。在4周时，通过细胞表面标记CD3，CD4和CD8分析细胞中T细胞的存在。在6-8周时，使用细胞表面标记CD4，CD8，CD3，CD94和CD56分析细胞中T和NK细胞的存在。
通过在HPC分化的第5天、第7天、第9天和第11天收获01279.107.3902、01279.107.3905、01279.107.3906、01279.107.3907和01279.107.3908克隆来分析MeCP2敲除克隆在分化成淋巴样谱系时的效率。在先前描述的时间点将冷冻保存的HPC细胞解冻并涂布在Retronectin和DLL4包被的平板上。每2天用新鲜培养基喂养细胞，并在解冻HPC细胞4周后分析2周时的T前体细胞标记(图18A，18B)，T和NK细胞标记。在T前体细胞标记的分析中，除野生型01279.107.0904细胞外的所有细胞均具有被鉴定为CD5+CD7+、CD7+CD45+和CD5+CD45+的T前体细胞的存在。对细胞进行CD45，CD7和CD5(图19)和CD56，CD8和CD3(图20)的表面表达染色，并定量T、NK和NK/T细胞的存在。
由于已知细胞的输入数量，因此确定了T(CD3+/CD8+)，NK(CD3-/CD56+)和NK/T细胞(CD3+/CD56+)的绝对数量。该过程的效率通过细胞类型(T、NK或NK/T)的绝对数量/总细胞的输入数量的比率或通过细胞类型的绝对数量/HPC的输入数量的比率来计算。通过流式细胞术在FSC-SSC门和淋巴样分散门下定量T细胞百分比(CD3+/CD8+)(图17)和NK细胞百分比(CD3-/CD56+)(图21)。还测定了新出现的NK/T(CD3+/CD56+)，(CD3+/CD8+)，NK/T(CD3+/CD56+)和NK(CD3-/CD56+)细胞的数量。进一步分析表明，在分化的第11天，CD235/CD7，CD144+/Dll4+和Flk-1+/CD34+的表达下降。由于在分化的第11天没有淋巴样细胞，这可能意味着这些标记的表达的某个阈值水平对于在存在DLL4的情况下诱导细胞朝向淋巴样细胞分化是必需的。
T细胞标记的分析显示MeCP2 KO细胞系但非MeCP2WT细胞系具有淋巴样分化的潜力。来自MeCP2 WT细胞的第9天HPC祖细胞基本上没有CD3+ CD8+ T细胞，而测试的其他HPC祖细胞分化为CD3+ CD8+ T细胞群体。因此，MeCP2的甲基结合结构域的敲除增强了HPC祖细胞产生T和NK细胞的潜力。
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根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下对所述方法的步骤或者所述方法的步骤顺序进行变化。更具体地说，明显的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (85)

1.一种产生免疫细胞的方法，其包括：
(a)获得多能干细胞(PSC)，其中所述PSC从体细胞群体重编程而来；
(b)将PSC分化成造血前体细胞(HPC)；和
(c)在促进免疫细胞分化的条件下培养HPC，从而产生免疫细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述PSC是诱导多能干细胞(iPSC)。
3.权利要求1的方法，其中所述PSC是胚胎干细胞(ECS)。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫细胞是淋巴样细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述淋巴样细胞是T细胞、B细胞和/或NK细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述免疫细胞是髓样细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述髓样细胞是树突细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述体细胞群体是血细胞群体或皮肤细胞群体。
9.权利要求8的方法，其中所述血细胞群体包含T细胞、B细胞和/或NK细胞。
10.权利要求8的方法，其中所述血细胞群体进一步定义为祖血细胞、外周血单核细胞或淋巴母细胞样细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述体细胞群体是哺乳动物体细胞群体。
12.权利要求1的方法，其中所述体细胞群体是人体细胞群体。
13.权利要求8的方法，其中所述血细胞群体分离自外周血、脐带血或淋巴样组织。
14.权利要求13的方法，其中所述淋巴样组织包括骨髓、淋巴结或胎儿肝脏。
15.权利要求8的方法，其中所述血细胞群体包括T细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述T细胞在抗CD3抗体和/或抗CD28抗体存在下培养。
17.权利要求15的方法，其中所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
18.权利要求15的方法，其中所述T细胞是T辅助细胞1(TH1)细胞，T辅助细胞2(TH2)细胞，TH17细胞，细胞毒性T细胞，调节性T细胞，天然杀伤T细胞，幼稚T细胞，记忆T细胞或γδT细胞。
19.权利要求1的方法，其中所述重编程包括将重编程因子导入所述体细胞群体。
20.权利要求1的方法，其中所述重编程包括将RNA、蛋白质或小分子导入所述体细胞群体。
21.权利要求19的方法，其中所述体细胞群体是血细胞或皮肤细胞。
22.权利要求19的方法，其中所述重编程因子由一个或多个表达盒编码。
23.权利要求19的方法，其中所述重编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28的两个或更多个基因。
24.权利要求19的方法，其中所述重编程因子包括选自Sox2、Oct4、cMyc、Klf4、Nanog、SV40大T抗原和Lin28的3、4、5或6个基因。
25.权利要求22的方法，其中所述一个或多个表达盒包含在选自病毒载体、游离载体和转座子的重编程载体中。
26.权利要求25的方法，其中所述病毒载体被进一步定义为逆转录病毒载体。
27.权利要求25的方法，其中所述游离载体进一步定义为基于EB病毒(EBV)的游离载体。
28.权利要求1的方法，其中所述重编程包括在确定的无饲养细胞条件下培养细胞。
29.权利要求1的方法，其中所述PSC基本上不含整合的外源病毒元件。
30.权利要求8的方法，其中所述血细胞群体未用外源施用的G-CSF动员。
31.权利要求1的方法，其中HPC分化成每个HPC至少20个免疫细胞。
32.权利要求1的方法，其中HPC分化成每个HPC至少50个免疫细胞。
33.权利要求1的方法，其中HPC分化成每个HSC至少100个免疫细胞。
34.权利要求1的方法，其中PSC分化成每个PSC至少50个免疫细胞。
35.权利要求1的方法，其中将所述PSC分化成HPC包括以下顺序步骤：
(a)在包含至少一种生长因子的第一确定培养基中培养或维持多个基本上未分化的多能细胞；
(b)在不含或基本上不含IL-3、Flt3配体和GM-CSF的第二确定培养基中孵育细胞；
(c)在足以扩增或促进多个细胞分化的包含BMP4、FGF2和VEGF的第三确定培养基中培养细胞；和
(d)在足以扩增或促进多个细胞分化的包含IL-3和Flt3配体的第四确定培养基中培养细胞，
其中多个多能细胞分化成HPC。
36.权利要求35的方法，其中所述第二确定培养基包含blebbistatin和/或Rock抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述第二确定培养基还包含GSK3抑制剂。
38.权利要求37的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021。
39.权利要求35的方法，其中所述第二确定培养基还包含BMP4、VEGF和FGF2。
40.权利要求39的方法，其中所述细胞在步骤(b)之前个体化。
41.权利要求40的方法，其中使用胺培养板执行步骤(b)至(d)。
42.权利要求36的方法，其中所述第二确定培养基还包含VEGF和FGF2。
43.权利要求35的方法，其中所述第四确定培养基还包含选自IL-3、IL-6、SCF、TPO和BMP4的一种或多种细胞因子。
44.权利要求35的方法，其中所述第四确定培养基包含肝素。
45.权利要求35的方法，其中所述方法包括在低于25％的氧的大气压力下培养所述细胞。
46.权利要求35的方法，其中所述方法包括在低于5％的氧气的大气压力下培养所述细胞。
47.权利要求35的方法，其中多个多能细胞形成胚状体(EB)。
48.权利要求35的方法，其中所述HPC表达CD34。
49.权利要求35的方法，其中所述HPC表达选自CD43、CD34、CD31、CD41、CD235和CD45的至少两种标记。
50.权利要求1的方法，其中促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进淋巴样分化的条件。
51.权利要求50的方法，其中在促进淋巴样分化的条件下培养表达CD34和CD43的HPC。
52.权利要求1的方法，其中培养细胞以促进淋巴样分化包括：
(i)在确定的培养基中在包被有基质和Notch配体的表面上培养HPC，其中HPC表达选自CD34、CD43、CD7、DLL4、CD144和CD235的一种或多种细胞表面标记；和
(ii)在一种或多种细胞因子存在下维持培养物，从而产生淋巴样细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述基质是细胞外基质蛋白。
54.权利要求52的方法，其中所述HPC表达CD144、CD34，CD45和/或CD7。
55.权利要求52的方法，其中步骤(i)还包括分离表达一种或多种细胞表面标记的HPC。
56.权利要求55的方法，其中分离包括磁激活细胞分选(MACS)。
57.权利要求52的方法，其中所述细胞在低于5％的氧的大气压力下培养。
58.权利要求52的方法，其中所述细胞在5％的氧的大气压力下培养。
59.权利要求52的方法，其中所述确定的培养基包含抗坏血酸和/或烟酰胺。
60.权利要求59的方法，其中所述抗坏血酸以50μM至1mM的浓度存在。
61.权利要求59的方法，其中所述抗坏血酸以90μM至100μM的浓度存在。
62.权利要求59的方法，其中所述烟酰胺以0.1mM至5mM的浓度存在。
63.权利要求52的方法，其中所述基质是retronectin，胶原蛋白，层粘连蛋白或纤连蛋白。
64.权利要求52的方法，其中所述基质是retronectin。
65.权利要求52的方法，其中所述Notch配体是DLL4。
66.权利要求63的方法，其中所述DLL4是DLL4：Fc嵌合蛋白。
67.权利要求52的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自SCF、TPO、IL-7和Flt-3。
68.权利要求52的方法，其中步骤(ii)为1至6周。
69.权利要求52的方法，其中步骤(ii)为2至4周。
70.权利要求52的方法，其中所述淋巴样细胞表达选自CD8、CD7、CD45、CD5、CD4和CD3的一种或多种标记。
71.权利要求70的方法，其中超过5％的淋巴样细胞对于所述标记中的至少两种是阳性的。
72.权利要求70的方法，其中超过10％的所述淋巴样细胞对于所述标记中的至少两种是阳性的。
73.权利要求1的方法，其中促进免疫细胞分化的条件进一步定义为促进髓样分化的条件。
74.权利要求73的方法，其中在促进髓样分化的条件下培养HPC包括：
(i)在包含TPO、SCF和Flt3配体的第一确定培养基中培养HPC，由此产生髓样细胞群体；和
(ii)将细胞在基本上不含TPO、SCF和Flt3配体的第二确定培养基中孵育，从而产生富集的髓样细胞群体。
75.权利要求74的方法，其中所述第一确定培养基还包含IL-6和IL-3。
76.权利要求74的方法，其中所述第二确定培养基包含GM-CSF。
77.权利要求74的方法，其中步骤(i)中产生的髓样细胞群体的至少50％对于CD45、CD43和CD31是阳性的。
78.权利要求77的方法，其中对于CD45、CD43和CD31阳性的髓样细胞群体基本上不表达CD34。
79.权利要求74的方法，其中所述富集的髓样细胞群体的至少80％是CD43+、CD45+、CD31+和CD34-。
80.权利要求74的方法，其中步骤(ii)为5至10天。
81.权利要求74的方法，其进一步包括将所述富集的髓样细胞群体分化成树突细胞。
82.权利要求81的方法，其中将富集的髓样细胞群体分化成树突细胞包括在包含GM-CSF、IL-4和TNFα的确定培养基中培养富集的髓样细胞群体，从而产生树突细胞。
83.权利要求82的方法，其中所述确定的培养基还包含脂蛋白。
84.权利要求82的方法，其中所述树突细胞表达选自CD209、CD1a、HLA-DR、CD11c、CD14、CD83和CD86的一种或多种标记。
85.权利要求82的方法，其中所述树突细胞基本上不表达CD12。
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