CN113710796A - 作为减少或预防转移、治疗自身免疫和炎性病症以及重新平衡免疫环境和失调的小生境的平台的基因修饰的造血干细胞和祖细胞(hspc)及间充质细胞 - Google Patents

Abstract

提供了包含基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)和/或基因修饰的间充质细胞的组合物，其中所述细胞含有包含转基因的载体，以及产生所述基因修饰的HSPC和基因修饰的间充质细胞的方法，以及治疗或预防癌症(例如转移)和神经变性病况、自身免疫病症和炎性病症的方法。

Description

作为减少或预防转移、治疗自身免疫和炎性病症以及重新平 衡免疫环境和失调的小生境的平台的基因修饰的造血干细胞 和祖细胞(HSPC)及间充质细胞

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2019年2月9日提交的美国临时专利申请第62/803,468号的权益，所述美国临时专利申请通过引用并入。

序列表

通过引用以其整体并入本文的是与此同时提交的核苷酸/氨基酸序列表。

发明背景

转移是实体瘤患者死亡的主要原因。为了制定有效的治疗策略，需要对这一过程的关键调节物(regulator)进行更深入的了解。

利用免疫系统靶向和消除远处转移性病变是一个主要的挑战。大多数免疫治疗策略(包括CAR-T细胞疗法)受到肿瘤和转移前肿瘤微环境中的免疫抑制的限制。

需要有效的预防和/或治疗转移的方法。

发明简述

本发明提供了包含(a)基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，(b)基因修饰的间充质细胞，或者(c)(a)和(b)两者的组合物，其中所述细胞含有包含转基因的载体(例如慢病毒载体)。本发明还提供了包含基因修饰的骨髓衍生的髓样细胞如CXCR4+髓样细胞的组合物。

本发明提供了用于产生基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，其包括从哺乳动物获得HSPC，以及用包含转基因的载体(例如，慢病毒载体)转染所述HSPC，从而产生基因修饰的HSPC。

本发明还提供了用于产生基因修饰的间充质干细胞的方法，其包括从哺乳动物获得间充质干细胞，以及用包含转基因的病毒载体转染所述间充质干细胞，从而产生基因修饰的间充质干细胞。

另外，本发明提供了使用基因修饰的HSPC或基因修饰的间充质细胞的治疗方法，其包括用于治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症，在患有癌症的哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发，延长患有癌症的哺乳动物的存活时间，预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠，减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移，治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症，重新平衡哺乳动物中失调的小生境，恢复哺乳动物中的肠道功能、记忆、行为、毛发生长、指甲生长和/或骨髓功能，以及减少或预防哺乳动物中的运动障碍、记忆功能障碍、意识模糊或动力异常。

附图的几个视图的简要说明

图1A-1M显示了在远处部位的横纹肌肉瘤原发性肿瘤生长期间，免疫细胞群失调并上调肺中的核心免疫抑制基因标签。小鼠腿部原位接种M3-9-M横纹肌肉瘤原发性肿瘤。在不同的时间点收获来自初始和荷瘤小鼠的肺(n＝8)。(A)髓细胞群体(髓细胞＝CD11b⁺，粒细胞＝CD11b⁺Ly6G⁺，单核细胞＝CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺，巨噬细胞＝CD11b⁺F4/80⁺，单核细胞的DC＝CD11b⁺CD11c，常规的DC＝CD11b^-CD11c⁺)以及(B)淋巴细胞群体(T细胞＝CD3⁺，CD8⁺T细胞＝CD3⁺CD8⁺，CD4⁺T细胞＝CD3⁺CD4⁺，NK细胞＝CD3^-NK1.1⁺)的流式细胞术分析。所有群体以活的CD45⁺细胞设门。通过普通的单向方差分析来分析数据，在第0天和每个时间点的平均值之间进行邓尼特多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)。(C)与更多功能失调的T细胞相关的PD1^hiCD44^int群体和活化的PD1^intCD44^hi细胞。(D)在肿瘤接种后第18天，通过磁珠阴性选择从初始未荷瘤小鼠或M3-9-M荷瘤小鼠中分离T细胞。将细胞用CellTrace Violet脉冲，并在10ng/mL IL-7存在下用小鼠T活化剂CD3/CD28珠粒以1：1的比例活化3天。通过流式细胞术以CD4⁺或CD8⁺T细胞设门来分析细胞。(E)所有表达基因的火山图和所选差异表达基因的热图，其中免疫抑制基因标签以粗体表示。(F)在荷瘤小鼠对比初始小鼠的肺中具有最高倍数变化的增加和降低的前50个基因。仅显示p值<0.05的基因。这些基因标签(图1E-F)标记转移过程，并且可以用作转移进展的生物标志物，并且用于测量对微环境靶向治疗的响应。(G)与初始肺相比，在转移前上调的前50个基因的基因本体(GO)分析。显示了与转移前肺相关的有关的显著变化的GO术语。箭头表示>100倍富集。(H)与初始肺相比，转移前差异表达基因的创新途径分析的条形图。(I)在第15天收获肺，并将其加工成单细胞悬液用于单细胞RNA测序(n＝4)。用虚线突出显示最显著变化的群体的UMAP图，通过柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)统计分析每个聚类的细胞数目的条形图，以及细胞群体的饼形图说明了初始肺和转移前肺中免疫细胞群体的变化。(J)在初始肺和转移前肺中的每个聚类中相关基因的表达水平。(K)在胰腺癌进展期间，免疫细胞群体在转移前肝脏中失调。与来自携带肉瘤原发性肿瘤的小鼠的肺中的发现类似，在胰腺转移进展之前，肝脏的免疫环境在该组织中显示出升高的髓样细胞以及降低的抗原呈递细胞和淋巴细胞。(上图面)髓细胞群体(髓细胞＝CD11b⁺，巨噬细胞＝CD11b+F4/80+，单核细胞＝CD11b⁺CD11c^-Ly6C⁺Ly6G^-，粒细胞＝Ly6G+Ly6C+，常规的DC＝CD11b^-CD11c⁺和抗原呈递细胞MHCII+)的流式细胞术分析。在髓样细胞和淋巴细胞群体(T细胞＝CD3+，CD8+T细胞＝CD3+CD8+，CD4+T细胞＝CD3+CD4+，NK细胞＝CD3-NK1.1+)上的PD-L1表达(下图面)。所有群体以活的CD45⁺细胞设门。(L-M)使用人类细胞图谱(Human Cell Atlas)骨髓单细胞相互作用的门户网站查询来自正常人类骨髓的数据。转移前肺中每个聚类选择转录物的基因表达数据。

图2A-2E显示了基因工程化髓样细胞(GEMy)的产生和验证。(A)是用于产生GEMy的IL-12慢病毒图谱的示意图。(B)在培养4天后收获细胞并通过流式细胞术对其进行分析。顶部图面：髓样细胞群体。底部图面：Thy1.1表达作为转导效率的读出。(C)是显示了培养的髓样细胞在被编码IL-12的慢病毒转导时可以产生IL-12的图。在50ng/mL的IL-6、FLT3-L和SC存在下用各种稀释度的编码IL-12的慢病毒上清稀释液或培养基铺板细胞。通过ELISA评估培养物的IL-12。(D)显示了载体控制髓样细胞和GEMy向各种器官的运输。在静脉注射后24小时，通过流式细胞术评估组织的CD45.1+细胞。内源性和转移的髓样细胞的表型在下面显示为饼形图。(E)显示了IL-12GEMy全身性递送到腿部具有局部原发性肉瘤肿瘤的小鼠后，肺中IL12水平升高。

图3A-J显示了IL12-GEMy处理挽救并活化转移前肺中的T细胞群体。用M3-9-M横纹肌肉瘤原发性肿瘤原位接种小鼠，以及不进行处理(n＝9)或者在第12天、第19天和第26天，用未转导的髓样细胞(n＝5)或IL12-GEMy(n＝10)处理。在第27天在原发性肿瘤终点收获肺并通过流式细胞术以活的CD45⁺细胞设门进行分析。(A)肺中T细胞和NK细胞(T细胞＝CD3+，CD8+T细胞＝CD3+CD8+，CD4+T细胞＝CD3+CD4+，NK细胞＝CD3-NK1.1+)的数目。(B)肺中表达PD1和CD44的CD8+和CD4+T细胞的比例以区分活化的PD1^intCD44^hi和功能失调的PD1^hiCD44^intT细胞群体。(C)显示了特定器官中的淋巴样群体的图。在肿瘤接种后的第12天，将未转导的髓样细胞或GEMy转移到M3-9-M荷瘤小鼠中。在原发性肿瘤终点(第27天)收获组织并通过流式细胞术分析淋巴细胞群体。(D)在GEMy处理后随着时间的推移肺中的免疫细胞群体。在第11天用1.85x10⁶个GEMy静脉内注射M3-9-M荷瘤小鼠，并在GEMy转移后的第1天、第3天和第7天收获肺。描绘了在GEMy处理后随着时间的推移的T细胞和NK细胞的数目、T细胞活化标志物PD1和CD44的水平、髓细胞群体和转移的细胞(IL12-GEMy)。(E)在IL12-GEMy处理后三天，从荷瘤小鼠的肺中分离的大量RNA中关键T细胞表型基因的表达(n＝4)。来自单细胞RNA测序数据的箱形图显示了通过聚类的基因表达(n＝4只小鼠/组)。来自单细胞RNA测序的细胞毒性T细胞聚类的创新途径分析。将来自(F)OT-I或(G)OT-II小鼠的脾细胞分别在1μg/mLOVA_257-264(SIINFEKL；SEQ ID NO:1)或OVA_323-339肽存在下与各种比例的未转导的髓样细胞或IL12-GEMy共培养。为了产生活化的T细胞，在1ng/mL肽存在下与髓样细胞共培养之前，首先在1μg/mL肽和50单位/mL的重组IL-2存在下培养脾细胞4天。24小时后收集来自共培养物的上清液，并通过ELISA定量IFNγ(n＝3次重复)。(H)肺中的髓样细胞群体(髓细胞＝CD11b⁺，单核细胞的DC＝CD11b⁺CD11c⁺，常规的DC＝CD11b^-CD11c⁺，粒细胞＝CD11b⁺Ly6G⁺，经典单核细胞＝CD11b⁺CD43⁺Ly6C⁺，巨噬细胞＝CD11b⁺CD43⁺Ly6C⁺F480⁺)。(I)在肿瘤接种后第12天，将未转导的髓样细胞或IL12-GEMy转移到M3-9-M荷瘤小鼠中。在原发性肿瘤终点(第27天)收获组织并通过流式细胞术分析脾脏、淋巴结和肿瘤中的髓细胞群体。(J)从未处理的小鼠和IL12-GEMy处理的小鼠(n＝3)在原发性肿瘤终点收集肺切片的CODEX免疫荧光染色。显示了核、CD11b和TCRB染色。T细胞用白色箭头表示。

图4A-E显示了IL12-GEMy处理逆转肺微环境中的核心免疫抑制基因程序并促进免疫活化。用M3-9-M横纹肌肉瘤原发性肿瘤原位接种小鼠并在第12天用IL12-GEMy处理。处理后3天收获肺。对从快速冷冻的肺中分离的RNA进行测序(n＝4)。(A)用M3-9-M横纹肌肉瘤原发性肿瘤原位接种小鼠并在第12天用IL12-GEMy处理。处理后3天收获肺。对从快速冷冻的肺中分离的RNA进行测序(n＝4)。在初始小鼠、未处理的荷瘤小鼠和IL12-GEMy处理的荷瘤小鼠中比较已知与免疫活化和免疫抑制相关的所选基因在肺中的表达。来自转移前基因标签的关键免疫抑制基因呈粗体。(B)与未处理的小鼠相比，来自IL12-GEMy处理的小鼠的肺中差异基因表达数据的创新途径分析(IPA)。(C)用M3-9-M横纹肌肉瘤原发性肿瘤原位接种小鼠并在第12天用IL12-GEMy处理。处理后3天收获肺。对从快速冷冻的肺中分离的RNA进行测序(n＝4)。IL12-GEMy注射后3天，从荷瘤小鼠的肺中进行单细胞RNA测序数据的UMAP投影(n＝4)。标记的虚线区分最显著变化的聚类。针对单独髓样细胞聚类的IL12-GEMy处理和未处理的转移前肺之间的差异基因表达的IPA。(D)与来自图4C的未处理小鼠相比，在IL-12GEMy处理的小鼠的肺中每个髓样细胞群中上调的限定了IL12-GEMy功效的基因标签的前50个基因。(E)对于未处理的和IL12-GEMy处理的荷瘤小鼠，与对IL-12的应答、抗原加工和呈递以及免疫抑制和转移前小生境相关的关键基因的表达水平在每个聚类的基础上显示。

图5A-I显示了IL12-GEMy处理延缓了小鼠中的肿瘤进展和转移。(A)在腓肠肌中原位注射5x10⁵个M3-9-M-ffLuc2-mCherry横纹肌肉瘤细胞后，在第12天用一剂8x10⁶个IL12GEMys或载体对照髓样细胞处理小鼠。小鼠显示出降低的原发性肿瘤生长、延长的存活和降低的转移负荷。IL12-GEMy处理导致总生存期加倍。(B-C)：用5x10⁵个M3-9-M-ffLuc2-mCherry细胞对小鼠进行原位接种，并在肿瘤接种后12天、19天和26天用等量的未转导的髓样细胞、在10ng/mL IL-12存在下培养的未转导的髓样细胞或IL12-GEMy(在每个时间点分别为4.1x10⁶个、2.8x10⁵个和5x10⁶个细胞)。(B)跟踪小鼠的原发性肿瘤生长和存活(n＝8)。(C)在第27天收获肺，并通过IVIS离体生物发光成像来评估转移(未处理：n＝12，髓细胞：n＝9，IL-12预处理：n＝9，IL12-GEMy：n＝12)。左图：来自收获的肺的平均辐射率。右图：肺的图片被归一化，目视检查生物发光，并且明确地分组为高转移(存在生物发光)或无/低转移(无生物发光)。通过费希尔精确检验(Fisher’s exact test)确定统计分析。(D)IL12-GEMy以剂量依赖性方式抑制肿瘤进展。向小鼠注射M3-9-M，并且在第12天，小鼠组保持未处理或者用1x10⁶个或8x10⁶个IL12-GEMy静脉内(i.v.)处理(分别标记为“低IL12-GEMy”和“高IL12-GEMy”)，然后跟踪原发性肿瘤生长和存活(n＝10)。显示了低剂量IL12-GEMy与高剂量IL12-GEMy相比的统计学(p＝0.0003)。比较用高剂量和低剂量IL12-GEMy处理的小鼠。(E)用5x10⁵个M-3-9M-ffLuc2-mCherry细胞原位接种小鼠。在第10天，小鼠组保持未处理或腹腔内(i.p)给予单剂量的2mg环磷酰胺(Cy)。在第12天，小鼠组保持未处理或者用1x10⁶或8x10⁶个IL12-GEMy静脉内处理(分别标记为“低IL12-GEMy”和“高IL12-GEMy”)，然后跟踪原发性肿瘤生长和存活(n＝10)。比较用环磷酰胺(Cy)和高或低IL12-GEMy剂量(单独的Cy：n＝10，低剂量IL12-GEMy：n＝10，高剂量IL12-GEMy：n＝9)处理的小鼠。显示了Cy与未处理相比(p＝0.0035)、Cy+低IL12-GEMy与Cy相比(p＝0.006)以及Cy+高IL12-GEMy与Cy相比(p<0.001)的统计学。(F)经由尾静脉向小鼠注射5x10⁴个M-3-9M以及在肿瘤注射后11天用8x10⁶个IL12-GEMy静脉内处理，然后通过IVIS跟踪存活和转移进展(未处理n＝10，IL12-GEMy n＝8)。在肿瘤接种后第20天显示定量。(G)用5x10⁵个M3-9-M-ffLuc2-mCherry细胞原位注射小鼠，在第17天用8x10⁶个IL12-GEMy处理小鼠，在第24天切除原发性肿瘤，并通过IVIS监测存活和转移进展(未处理：n＝15，IL12-GEMy：n＝10)。(H)向小鼠脾内注射5x10⁵个KPC177669-ffLuc2-mCherry细胞，切除脾，并在第5天用8x10⁶个IL12-GEMy处理小鼠。通过IVIS监测小鼠的存活和肿瘤生长(未处理：n＝11，IL12-GEMy：n＝12)。通过对数秩检验(log-rank test)测试存活数据的显著性。(I)在小鼠乳房脂肪垫中皮下(s.c.)注射3×10⁴个4T1乳腺癌细胞，并在第10天用Cy/Flu处理，然后在第12天用5x10⁶个IL12-GEMy处理，以及监测原发性肿瘤生长和存活。

图6描绘了GEMy治疗的功效依赖于CD8+T细胞。在第9天、第11天和第12天用200μg同种型、抗CD8或抗CD4抗体或100μg抗NK-1抗体腹膜内(i.p.)处理M3-9-M荷瘤小鼠。在第12天静脉内注射GEMy。在实验期间，每3-5天以200μg/剂量继续消耗性抗体处理。图说明了用GEMy和抗体消耗(antibody depletion)方案处理的小鼠的存活率和肿瘤生长。

图7A描绘了表达卵清蛋白的M3-9-M的产生。图7A是插入MSCV慢病毒骨架的卵清蛋白基因的示意图。用含有卵清蛋白的慢病毒载体转导M3-9-M-ffuc2-mCherry细胞。通过荧光激活细胞分选(FACS)来分选SIINFEKL(SEQ ID NO:1)阳性细胞以建立M3-9-M-ffluc2-mCherry-OVA细胞系。用1μg/mL SIINFEKL(SEQ ID NO:1)肽和50单位/mL的重组IL-2在培养物中活化来自OT-1小鼠的脾细胞。将M3-9-M-ffluc2-mCherry和M3-9-M-ffluc2-mCherry-OVA细胞铺板并使其粘附过夜。在活化后第5天收集OT-1细胞，并以指定的比例铺板到肿瘤细胞上。在24小时收集上清液并通过ELISA分析IFNγ(右下图)。除去上清液后，将荧光素加入到细胞中，并将发光记录为表达荧光素酶的肿瘤细胞丰度的读出。如下计算肿瘤杀伤百分比：100–[(肿瘤细胞+T细胞)/(单独的肿瘤细胞)×100](左下图)。

图7B显示了IL12-GEMy处理通过与肿瘤特异性CD8⁺T细胞组合而增强。向小鼠原位注射M3-9-M-OVA肿瘤。用1μg/mL SIINFEKL(SEQ ID NO:1)肽和50单位/mL的重组IL-2活化来自Rag1^-/-OT-I小鼠的脾细胞，并培养4天。小鼠在第12天静脉内接受7.4x106个OT-I T细胞、3.5x10⁶个IL12-GEMys或两者(未处理：n＝10，OT-I T细胞：n＝11，IL12-GEMy：n＝11，OT-I T细胞+IL12-GEMy：n＝11)。

图8A-D显示了与在许多过继性细胞疗法中使用的标准化学疗法调理方案(conditioning regimen)组合的IL12-GEMy。(A)用2mg环磷酰胺和5mg氟达拉滨i.p.处理非荷瘤小鼠，并在处理后48小时通过流式细胞术分析血液中的免疫细胞群体。(B)向小鼠注射M3-9-M-OVA，并在第8天用2mg环磷酰胺和5mg氟达拉滨(图中缩写为Cy/Flu)i.p.处理。图描绘了随时间的存活和肿瘤生长(未处理：n＝10，Cy/Flu：n＝9，Cy/Flu+IL12-GEMy：n＝10)。(C)用1μg/mL SIINFEKL(SEQ ID NO:1)肽和50单位/mL的重组IL-2活化来自Rag1-/-OT-1小鼠的脾细胞，并培养4天。小鼠在第10天接受7.4×10⁶个OT-I T细胞、3.5×10⁶个GEMy或两者(未处理：n＝10，Cy/Flu：n＝9，Cy/Flu+IL12-GEMy：Cy/Flu T细胞和IL12-GEMy n＝10)。(D)与新的初始年龄匹配的对照小鼠(n＝5)相比，100％的小鼠用IL12-GEMy处理治愈-然后在对侧腿中用未标记的M3-9-M细胞或它们的原始肿瘤细胞系M3-9-M-ffLuc2-mCherry-OVA再激发这些小鼠。通过对数秩检验测试存活数据的显著性。

图9A-9D描绘了人类GEMy的产生。(A)用于产生人类IL12-GEMy的人类截短的EGFR(tEGFR)IL-12慢病毒图谱的示意图。(B)人类CD34细胞分离自具有动员干细胞的患者的单采术(apheresis)，并且在StemSpan SFEM中在人类重组SCF、FLT3L、TPO和/或IL-6的存在下培养6天。洗涤细胞，用含有IL-12的慢病毒以50个病毒颗粒/细胞的感染复数(MOI)转导，以及在24小时收集上清液用于ELISA。(C)人类CD34细胞分离自具有动员的干细胞的患者的单采术，并且在StemSpan SFEM中在SCF、FLT3L、TPO和IL-6存在下培养6天。洗涤细胞，并用含有IL-12的慢病毒转导2天，此时收集上清液用于ELISA并冷冻细胞沉淀。从细胞沉淀中分离DNA并进行qPCR以测定拷贝数。(D)人类髓样细胞获自健康供体的淘析的(elutriated)单采术产物的RO级分。用含有IL-12的慢病毒载体转导细胞2天，并收集上清液用于ELISA。

图10A-10C对应于CXCL9、IL12-CXCL2 GEMy或双重IL12-CXCL9慢病毒的产生。(A)-(B)分别是用于产生CXCL9 GEMy和双重IL12-CXCL9 GEMy的载体图谱。(C)如先前所述产生小鼠GEMy并用IL-12、CXCL9或双重IL12-CXCL9慢病毒转导4天。收集培养物上清液，通过ELISA分析小鼠IL-12和CXCL9。

图11A-11C对应于表达小鼠透明质酸酶(HYAL2)和精子粘附分子1(SPAM1)的基因工程化间充质细胞(GEMesy)的产生。(A-B)是用于产生表达小鼠HYAL2和SPAM1的GEMesy的载体图谱。(C)用对照空载体、小鼠Hyal2过表达或小鼠Spam1过表达慢病毒载体转导48小时的原代小鼠肺间质干细胞(MSC)中Hyal2和Spam1表达的蛋白质印迹分析。洗涤细胞并再培养3天，此时收获细胞，制备细胞裂解物并通过蛋白质印迹分析。粘着斑蛋白作为蛋白质上样对照，箭头表示mHyal2或mSpam1蛋白质条带。

图12是UMAP，其是可视化工具的图形表示，具有基于流形学习技术的降维算法和用于拓扑单细胞测序数据的思想，允许多分支细胞轨迹的可视化。每个点代表来自转移性骨肉瘤的单细胞悬液的单个细胞。聚类分析揭示了靠近在一起的细胞比相距较远的那些细胞更相关。髓样细胞簇保持在转移前小生境基因标签中提示髓细胞介导的免疫抑制的基因表达。

发明详述

本发明提供了细胞疗法的模块化系统，其可以被用作平台以递送肿瘤和转移性微环境的局部靶向以治疗和/或预防转移，限制自身免疫(例如，自身免疫病症和炎性病症)，治疗小生境失调(改变的干细胞小生境或失调的小生境，如神经源性小生境或异常骨髓、隐窝或隆起的小生境)，和/或治疗神经变性(痴呆、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病和中风)。该系统允许目的蛋白(例如，免疫调节剂、酶、底物、受体、诱饵受体、抗体、自杀基因系统和/或CRISPR或用于调节吞噬功能和免疫抑制功能的其它基因编辑技术)的局部递送，而不受全身暴露的影响。

在这方面，本发明提供了包含(a)基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，(b)基因修饰的间充质细胞，或者(c)(a)和(b)两者的组合物，其中所述细胞含有包含一个转基因或多个转基因的载体。

基因修饰的HSPC可以通过任何合适的方法产生。在一个实施方案中，HSPC获自哺乳动物并用包含转基因的载体转染，从而产生基因修饰的HSPC。在特定的实施方案中，HSPC获自表达CD34的哺乳动物(即，细胞是CD34+)。HSPC可以来自哺乳动物中的任何合适的来源，包括骨髓和血液(例如，外周血)。在一个实施方案中，通过进行CD31、CD3、CD19、CD56和CD11b的骨髓或血细胞的谱系耗损而获得HSPC；在人类患者中，选择CD34+细胞。

尽管不希望受任何特定理论的束缚，但当基因修饰的HSPC递送到哺乳动物时，认为基因修饰的HSPC将比趋向存在于组织中并归巢至淋巴结的巨噬细胞和树突细胞更好地归巢于转移前、早期和晚期的部位。然后，基因修饰的HSPC一旦在特定组织部位中就可以增殖并分化成髓样细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)。

用于产生基因修饰的HSPC的方法还可以包括使基因修饰的HSPC分化成髓样细胞以产生基因工程化的髓样细胞(例如巨噬细胞和单核细胞)。可以使用使基因修饰的HSPC分化成髓样细胞的任何合适的方法。例如，支持髓样细胞分化的培养基包括但不限于StemSpan SFEM II(StemCell Technologies)、StemSpan CD34+Expansion Supplement(StemCell Technologies)和StemSpan Myeloid Expansion Supplement II(StemCellTechnologies)。

因此，基因工程化的髓样细胞(GEMy)可以在施用至哺乳动物之前在体外产生，或者基因修饰的HSPC可以递送到哺乳动物。

在一个实施方案中，基因修饰的髓样细胞是基因修饰的骨髓衍生的CXCR4+髓样细胞。

类似地，基因修饰的间充质细胞可以通过任何合适的方法产生。在一个实施方案中，间充质细胞获自哺乳动物并用包含转基因的载体转染，从而产生基因修饰的间充质细胞。间充质细胞可以来自哺乳动物中的任何合适的来源，包括骨髓和血液(例如，外周血)。在一个实施方案中，通过进行CD45、CD31、CD3、CD19、CD56和CD11b的骨髓或血细胞的谱系消耗而获得间充质细胞；选择CD51、PDGFRa(CD140)和CD105呈阳性的细胞。在低氧中生长的细胞增强这些细胞的干细胞能力。

在一个实施方案中，间充质细胞是间充质干细胞。用于产生基因修饰的间充质细胞的方法还可以包括使基因修饰的间充质干细胞分化成基因工程化的基质细胞，如活化的周细胞、肌上皮细胞、成纤维细胞(肌成纤维细胞)和血管平滑肌细胞。

HSPC和/或间充质(例如间充质细胞骨髓衍生的)细胞可以表达高水平的CXCR4并归巢至SDF1+转移前小生境。

合适载体的实例包括质粒(例如DNA质粒)、细菌载体(例如李斯特菌或沙门氏菌载体)、酵母载体和病毒载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体，如逆转录病毒，痘病毒(例如正痘病毒(例如痘苗、修饰的安卡拉痘苗(MVA)、Wyeth、NYVAC、TROYVAC、Dry-Vax或POXVAC-TC)，禽痘(例如鸡痘、鸽痘或金丝雀痘，如ALVAC)，浣熊痘，兔痘，羊痘(例如山羊痘或绵羊痘)，野兔痘或猪痘(suipox)(例如猪痘(swinepox))，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，脊髓灰质炎病毒，甲病毒，杆状病毒(baculorvirus)和辛德毕斯病毒。在具体的实施方案中，载体是慢病毒载体。

逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)是将各种目的基因稳定导入广泛范围的靶细胞的基因组DNA的合适的递送媒介物。不受理论的束缚，逆转录病毒载体将未重排的单拷贝转基因递送到细胞中的能力使得逆转录病毒载体非常适于将基因转移到细胞中。此外，逆转录病毒通过逆转录病毒包膜糖蛋白与宿主细胞上的特定细胞表面受体的结合进入宿主细胞。因此，也可以使用假型逆转录病毒载体，其中编码的天然包膜蛋白被具有与天然包膜蛋白不同的细胞特异性(例如，与天然包膜蛋白相比结合不同的细胞表面受体)的异源包膜蛋白代替。

有许多逆转录病毒，实例包括：鼠白血病病毒(MLV)、慢病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤浪肉瘤病毒(Fujinami sarcoma virus、FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔森鼠白血病病毒(Abelson murineleukemia virus、A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)。适合使用的其它逆转录病毒包括但不限于禽白血病病毒、牛白血病病毒和水貂细胞病灶诱发病毒。逆转录病毒载体的核心序列可以来源于多种逆转录病毒，包括例如B、C和D型逆转录病毒，以及泡沫病毒(spumaviruses)和慢病毒。适用于本文公开的组合物和方法的逆转录病毒的实例包括但不限于慢病毒。

一种慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如1型或2型(即HIV-1或HIV-2)。其它慢病毒载体包括绵羊维斯纳/梅迪(Visna/Maedi)病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。

除了转基因之外，载体还可以包括与转基因的编码序列可操作地连接的表达控制序列，使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。表达控制序列包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)、用于内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的适当翻译以及终止密码子。合适的启动子包括但不限于hVMD2启动子、SV40早期启动子、RSV启动子，腺病毒主要晚期启动子、人类CMV立即早期I启动子、痘病毒启动子、30K启动子、I3启动子、sE/L启动子、7.5K启动子、40K启动子、C1启动子和EF-1α启动子。

本文所用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于距离核酸序列的编码区许多千碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的改变。来自各种不同来源的大量增强子是本领域众所周知的，并且可以以克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(来自，例如，保藏机构，如ATCC以及其它商业或个体来源)。许多包含启动子(如通常使用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。例如，编码多肽的核酸可以与CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(也称为“CAG启动子”)可操作地连接。

另外，载体可以包含报告物以鉴定载体的转染/转导效率。示例性报告物包括但不限于EGFR和CD90.1。如实施例9中所述，截短的EGFR(tEGFR)可以用作测量转导效率的报告物以及用作通过使用抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)在体内消耗转导的细胞的潜在安全开关。

可以通过体外方法，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)来克隆或扩增编码多肽的核酸。例如，可以使用基于分子DNA序列的引物通过cDNA的聚合酶链式反应分离编码多肽的多核苷酸。各种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员众所周知的。

用于本发明的示例性载体包括图2A、9A、10A、10B、11A和11B中描绘的那些。

转基因可以是任何合适的转基因，如编码以下中的一种或多种的转基因：细胞因子，趋化因子，酶，底物，受体诱饵/死亡受体(TNFα诱饵/死亡受体)，抗体(例如scFv、IgG或者用于分泌、结合和调理肿瘤/增加吞噬作用的双特异性或三特异性抗体；或者靶向肿瘤细胞，受损神经元，或者受损、死亡或垂死细胞的抗体-药物)，自杀基因系统，CRISPR编辑基因，或结合受体后诱导的蛋白。

在一个实施方案中，转基因编码作为细胞外基质重塑蛋白的酶，如透明质酸酶。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但细胞外基质重塑蛋白的表达通过与基质细胞相互作用来改变细胞外基质以限制、预防和/或治疗转移。

在另一个实施方案中，转基因编码自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统和诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。自杀基因系统独立于宿主的免疫系统杀伤弥散性肿瘤细胞。

转基因还可以编码细胞因子、趋化因子或相关蛋白，如IL-12、CXCL9、CXCL10(抗肿瘤)；IL-10、SMAD(免疫抑制以重新平衡免疫环境)、TGFβIL-2、TREM1、TREM2、CD2AP、GPR32、FPR2、P2ry2、P2ry6、ChemR23、ERV、GPR32、GPR18、GPR37和LGR6。

在一个实施方案中，所述方法包括施用一种或多种(例如2种、3种、4种或更多种)转基因，所述转基因可以执行或不执行互补功能。例如，出于治疗和/或预防肿瘤转移的目的，IL-12募集T细胞，并且CXCL9活化T细胞。本发明涵盖两种不同的转基因(bi-GEMy；例如，如实施例10中所述的IL-12和CXCL9)的共分泌或共表达以及三种转基因(Tri-GEMy)的共表达或共分泌。

一种或多种转基因可以存在于单个载体中。或者，可以使用一种或多种载体，每种载体含有一种或多种转基因，其中一种或多种载体中的转基因可以相同或不同。

在一个实施方案中，所述方法包括一种或多种互补转基因的不同时间施用。例如，已经用包含第一转基因的第一载体转染的基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的第一群体在已经用包含第二转基因的第二载体转染的基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的第二群体之前(即，依次递送)施用，其中所述第一转基因和第二转基因编码互补蛋白质。在一个实例中，本发明提供了一种局部蛋白或诱饵受体或TRAP在结合或分泌另一种因子后的时间递送。

在另一个实施方案中，将已经用包含第一转基因的第一载体转染的基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的第一群体与已经用包含第二转基因的第二载体转染的基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的第二群体同时施用，其中所述第一转基因和第二转基因编码互补蛋白质。

本发明包括双-或三-GEMy/GEMesy。例如，双-GEMy/GEMesy结合肿瘤抗原以诱导细胞因子释放。本发明包括单-、双-或三-GEMy/GEMesy的共施用或依次施用。

本发明还提供了基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的诱导型系统。例如，在诱导型系统中，来自基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的一种或多种转基因的表达可以取决于温度、pH和/或特定药物的存在。诱导型系统可以用于靶向哺乳动物中的特定细胞或组织和/或靶向特定病症。

在一个实施方案中，所述方法包括施用编码蛋白质的转基因，所述蛋白质仅在暴露于特定的细胞外基质蛋白或响应于肿瘤特异性蛋白或响应于例如特定的分泌蛋白、pH变化或氧水平或受体表达后才释放。

可以将基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物(例如，含有药学上可接受的载体)施用至患有癌症的哺乳动物以治疗癌症。

特定类型的癌症的非限制性实例包括头颈癌、眼癌、皮肤癌、口腔癌、喉癌、食道癌、胸癌、骨癌、肺癌、结肠癌、乙状结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肠癌、心脏癌或肾上腺癌。更具体地，癌症包括实体瘤，肉瘤，癌，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤(endotheliosarcoma)，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendothelio sarcoma)，滑膜肉瘤，甲状腺髓样癌，肾上腺皮质癌，促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)，恶性外周神经鞘膜肿瘤(MPNST)，外周细胞瘤，NTRK+和NTRK-融合肿瘤，横纹肌样肿瘤(rhabdoidtumor)，融合阴性(Fusion negative)，尤因样肉瘤(Ewings like sarcomas)，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，威尔姆氏肿瘤(Wilms’tumor)，宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，卡波西肉瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤，menangioma，黑色素瘤，成神经细胞瘤，视网膜母细胞瘤，血源性肿瘤，急性成淋巴细胞白血病，急性成淋巴细胞B细胞白血病，急性成淋巴细胞T细胞白血病，急性成髓细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病，急性单核细胞白血病，急性红白血病，急性巨核细胞白血病，急性髓单核细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性未分化白血病，慢性髓细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，或多发性骨髓瘤以及超罕见/非常罕见的癌症(如球状体肿瘤(globustumor)、PECOMAs、IMF、GIST、脊索瘤等)。

癌症的治疗包括但不限于破坏肿瘤细胞，减轻肿瘤负荷，抑制肿瘤生长、减小原发性肿瘤的尺寸、减少转移性病变的数目、增加个体的存活，延迟、抑制、阻止或预防转移性癌症的发作或发展(如通过延迟、抑制、阻止或预防肿瘤迁移和/或原发癌外部组织的肿瘤侵袭和/或与癌症的转移进展相关的其它过程的发作或发展)，延迟或阻止原发癌进展，改善针对肿瘤的免疫应答，改善针对肿瘤抗原的长期记忆免疫应答，和/或改善患有疾病的患者的一般健康。应理解，由于例如支持细胞、血管化、纤维基质等的存在，肿瘤细胞死亡可以发生而不会显著降低肿瘤大小。因此，虽然减小肿瘤大小是优选的，但在癌症的治疗中不是必需的。

基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物的施用可以是“预防性的”或“治疗性的”。当预防性地提供时，可以向哺乳动物施用基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物，目的是预防、抑制或延迟肿瘤的转移和/或通常预防或抑制个体中癌症的进展，以及通常允许或改善宿主的免疫系统对抗宿主易患肿瘤的能力。当治疗性地提供时，在癌症诊断时或之后提供基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物，目的是如通过减轻个体中的肿瘤负荷，抑制个体中的肿瘤生长，增加个体的存活，和/或预防、抑制、逆转或延迟个体中的癌症进展来改善癌症。

因此，本发明提供了通过向哺乳动物施用基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物来减少患有癌症的哺乳动物中的肿瘤生长或者减少或预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤生长的复发，延长患有癌症的哺乳动物的存活时间以及预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠的方法。在一个实施方案中，癌症或肿瘤尚未在哺乳动物中转移。

另外，本发明提供了减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移的方法，其包括向所述哺乳动物施用基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物。

当哺乳动物已经被诊断出患有癌症(例如转移性癌症)时，基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物可以与其它治疗性治疗联合施用，所述其它治疗性治疗为如化学疗法、肿瘤的手术切除、用靶向癌症疗法治疗、同种异体或自体干细胞移植、T细胞过继转移、其它免疫疗法和/或放射。特别地，基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物可以与另外的治疗性试剂一起(同时或伴随)施用，所述另外的治疗剂包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、树突细胞疫苗、溶瘤病毒、化学疗法、小分子、单克隆抗体或其抗原结合片段、激素阻断疗法和/或放射疗法。

目前在临床中使用的大多数T细胞疗法是在环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的调理方案之后给予的。因此，本发明的方法可以包括环磷酰胺、氟达拉滨或它们的组合的施用。

在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括手术切除肿瘤和施用基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但认为施用基因修饰的HSPC将导致基因修饰的HSPC归巢到远处的组织部位并防止或限制转移性生长。

本发明还提供了治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症的方法，其包括施用基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物。示例性的神经变性病况、自身免疫病症和炎性病症包括但不限于阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)、多发性硬化和斑秃。

另外，本发明提供了在哺乳动物中重新平衡失调的小生境；恢复肠道功能、记忆、行为、毛发生长、指甲生长和/或骨髓功能；或者减少或预防运动障碍、记忆功能障碍、意识模糊或动力异常的方法，其包括施用基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物。

基因修饰的HSPC、基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物可以通过各种途径施用至哺乳动物，所述途径包括但不限于皮下、肌内、皮内、腹膜内、鞘内、静脉内和瘤内。在一个实施方案中，基因修饰的间充质细胞、基因工程化的髓样细胞、基因工程化的基质细胞或它们的组合物可以通过直接注射到癌性病变或肿瘤中而直接施用(例如，局部施用)。当给予多次施用时，可以在宿主中的一个或多个部位进行施用，并且可以通过将单剂量分成相等的部分用于在个体上的一个、两个、三个、四个或更多个部位施用来施用单剂量。

以下制剂仅仅是示例性的，并且决不是限制性的。合适的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以在生理学上可接受的稀释剂中在药物载体中施用，所述药物载体如无菌液体或液体混合物，包括水，盐水，右旋糖水溶液和相关糖溶液，醇，如乙醇、异丙醇或十六烷醇，二醇，如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮，如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇，醚类，如聚(乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或者乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，如皂或洗涤剂，悬浮剂，如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或者乳化剂和其它药物佐剂。

可以用于肠胃外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于肠胃外制剂的合适脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。

用于肠胃外制剂的合适皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，以及合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子洗涤剂，诸如例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐；烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐和磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，诸如例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，诸如例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，以及(3)它们的混合物。

合适的防腐剂和缓冲剂可以用于这样的制剂中。为了最小化或消除注射部位的刺激，这样的组合物可以含有亲水亲油平衡(HLB)为约12至约17的一种或多种非离子表面活性剂。这样的制剂中表面活性剂的量的范围为约5重量％至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物，其通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成。肠胃外制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临用前添加无菌液体载体(例如水)用于注射。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

优选地，通过注射，例如静脉内施用细胞。用于注射的细胞的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如例如生理盐水(约0.90％w/v的NaCl水溶液、约300mOsm/LNaCl水溶液、或约9.0g NaCl/L水)，NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)，PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)，约5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸盐(Ringer'slactate)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清蛋白。

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例

转移是非常苛刻的过程，即使对于最适合的肿瘤细胞亦如此。获得成功地增殖、存活、发展对化学疗法的抗性、迁移、侵袭和定植所需的所有基因智慧(acumen)不会赋予弥散性肿瘤细胞保证在远处器官部位成功形成转移。尽管存在这些挑战，但转移确实会发生，表明这些细胞的存活受基质和免疫细胞群体的调节。允许成功转移的主要事件包括在远处组织部位形成支持弥散性肿瘤细胞粘附、生长和存活的转移小生境环境(参见Kaplan等人,Nature,438(7069):820-827(2005)；以及Murgai等人,Nat.Med.,23(10):1176-1190(2017))。

为了探索将髓样细胞从免疫抑制重编程为免疫活化以逆转过继性细胞免疫中的功能损失的影响，将经工程改造以分泌IL-12的基因工程化的髓样细胞(GEMy)过继转移到小鼠中，以确定其归巢和功能能力，从而重新平衡肿瘤和早期转移部位中的免疫微环境并促进稳健的抗肿瘤免疫。这种免疫平衡的恢复与对转移结果的强烈影响有关，用GEMy处理的荷瘤小鼠的存活是用未改变的或载体对照髓样细胞处理的荷瘤小鼠的两倍。

用于以下实施例的材料和方法如下所示。

人类GEMy的合成

使用基于磁珠的CD34+细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，按照推荐的制造商的方案，富集来自健康供体(NIH血库)的分离产物的CD34+细胞。将分离的细胞在补充有100单位/mL的青霉素、100μg/mL链霉素和StemSpan CD34+Expansion Supplement(StemCellTechnologies)、StemSpan Myeloid Expansion Supplement II(StemCell Technologies)或细胞因子如SCF、FLT3L的StemSpan SFEM II(StemCell Technologies)中培养。IL-6和TPO(BioTechne)在37℃持续96小时。用编码人IL-12的慢病毒和截短的EGFR作为转导效率的报告物，在培养的第2-6天之间转导细胞。通过对培养物上清液进行IL-12的ELISA，定量PCR，并通过对推定的GEMys染色以截短的EGFR并通过流式细胞术进行分析来证实转导。

小鼠GEMy的合成

冲洗来自同基因小鼠的股骨和胫骨的骨髓，并根据推荐的制造商的方案使用基于磁珠的谱系消耗试剂盒(magnetic bead-based lineage depletion kit)(StemCellTechnologies)富集造血干细胞和祖细胞。将分离的细胞在37℃下在补充有50ng/mL小鼠SCF、IL-6和FLT3-L(Bio-Techne)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的StemSpan SFEM(StemCell Technologies)中培养96小时。细胞在培养开始期间用编码小鼠IL-12和/或CXCL9的慢病毒和用作为转导效率的报告物的CD90.1转导。通过对培养物上清液进行IL-12的ELISA，通过针对CD90.1的推定的GEMy染色并通过流式细胞术分析来确认转导效率。

人类和小鼠GEMesy(基因工程化的间充质细胞)

(1)培养基制备(MesenPure培养基(MSC+培养基))

在室温下或在4℃下解冻10X补充剂过夜。充分混合。一旦解冻，立即使用或等分试样并储存在-20℃。解冻等分试样后，立即使用。不要重新冻结。

将50ml的10X补充剂加入到450ml的基础培养基中。加入5ml的Pen/Strep/谷氨酰胺。充分混合。

在室温下解冻MesenPure。充分混合。一旦解冻，立即使用或等分试样并储存在-20℃。解冻等分试样后，立即使用。不要重新冻结。

在完全MesenCult扩增培养基中以1:1000稀释MesenPure(即每1ml完全培养基加入1ul MesenPure)，并充分混合。如果不立即使用，则将培养基在4℃下储存长达2周(可以更长，例如约2个月)。

(2)从骨分离：

小心地从骨(如2个胫骨和2个股骨)上去除肉。将骨加入研钵和研杵+5mL无菌的收集培养基(HBSS，500ml；FPS，10ml)。将骨压碎直至不再有大块骨和骨髓。使用血清移液管轻轻打散团块并应用到50mL锥形管上的70μm过滤器中。用5ml收集培养基洗涤研钵和研杵中剩余的骨块，并应用到过滤器上。以1400rpm离心细胞4分钟。将上清液倒出并将沉淀重悬在10ml收集培养基中。如果结块，再次过滤到新的50ml锥形管中。以1400rpm离心细胞4分钟。将上清液倒出并将沉淀重悬在2ml MesenPure培养基(MSC+培养基)中。

将1ml细胞悬液铺板到2-10cm板中，并向每个板中加入6ml MesenPure培养基(MSC+培养基)。置于低氧(5％O2)培养箱中。温育3小时后，吸出培养基并用PBS轻轻洗涤平板(重复洗涤)。向板中加入6ml MesenPure培养基(MSC+培养基)并置于低氧(5％O2)培养箱中。

(3)从软组织(肝脏、肺)分离：

使用镊子和手术刀将器官切成小块。将组织置于含有1ml胶原酶消化培养基(HBSS，10ml；胶原酶1，10mg；DNA酶1，100μL；分散酶2，100μL)中。在37℃下在摇床上温育20分钟。

温育后，将消化的组织转移到50ml锥形管上的70μm过滤器中。在用血清移液管加入5ml无菌收集培养基时，使用柱塞粉碎组织。使用额外的5ml无菌收集培养基洗涤过滤器。

以1400rpm离心细胞4分钟。将上清液倒出并通过上下吸打将沉淀重悬在10ml无菌收集培养基中。如果结块，再次过滤到新的50ml锥形管中。以1400rpm离心细胞4分钟。将上清液倒出并将沉淀重悬在2ml MesenPure培养基(MSC+培养基)中。

将1ml细胞悬液铺板到2-10cm板中，并向每个板中加入6ml MesenPure培养基(MSC+培养基)。置于低氧(5％O2)培养箱中。温育3小时后，吸出培养基，并用PBS轻轻洗涤平板(重复洗涤)。将6ml MSC+培养基加入到板中并置于低氧(5％O2)培养箱中。

(4)对于所有组织：

在初始接种后，不干扰细胞(即洗涤或传代)约2-3天以允许细胞完全粘附。定期监测板以确定何时清洗、加入培养基或传代。

对于骨髓，通常有很多漂浮的细胞留在板中。如果是这样的话，则在第3天或第4天更换培养基。如果有最少的漂浮细胞，则进行一半培养基更换(即吸出3ml培养基并加入3ml新鲜的MesenPure培养基)。

对于肺和肝脏，板会更快地汇合并且可能早在第4天就需要分离。如果需要更多时间，则在第3天或第4天进行一半培养基更换。

(5)传代MSC：

用5-10ml PBS(取决于板大小)轻轻洗涤细胞一次。加入3-5ml胰蛋白酶(取决于板大小)，并在37℃下温育约5分钟。骨髓MSC可能需要更长的时间进行胰蛋白酶化。在显微镜下每隔几分钟监测细胞分离以减少胰蛋白酶暴露时间。

加入5ml MesenCult培养基并在锥形管中收集细胞。使用显微镜确认所有细胞已经从板上收集。以1400rpm离心4分钟以沉淀细胞。吸出上清液并在1ml MesenPure培养基中重悬细胞。根据沉淀的大小(或细胞计数)，将细胞铺板到新的组织培养板上并置于低氧(5％O2)培养箱中。在T75上约1百万；在T175上三百万。

(6)冷冻MSC：

如上所述传代细胞并照例在90％FBS+10％DMSO中冷冻约1-2百万个细胞。在MSC小瓶解冻后，将细胞在常氧中培养(为了实验简单、氮成本等)。当在这个阶段在常氧中培养时，MSC不改变它们的表达表型。

将分离的人类间充质干细胞(MSC)在含有补充有StemProMSC SFM XenoFree补充剂(StemCell Technologies)和200mM L-谷氨酰胺的StemProMSC SFM XenoFree基础培养基(StemCell Technologies)的生长培养基中维持和扩增。将分离的鼠MSC在含有补充有MesenCult 1x补充剂(StemCell Technologies)和MesenPure(StemCell Technologies)的MesenCult基础培养基(StemCell Technologies)的生长培养基中维持和扩增。

在培养开始期间用包含一种或多种转基因的载体(例如慢病毒)转导细胞。

分化方案

将分离的鼠或人类(MSC)在含BFGF 10ng/ml或TGFβ5ng/ml、VEGF 5ng/mL和PDGFBB10μg/mL的αMEM中维持和扩增，以使MSC分化成不同的基质细胞群体(例如，常规的血管平滑肌细胞、活化的周细胞、肌上皮细胞、成纤维细胞)。然后可以将处理后的细胞切换到StemProMSC SFM培养基(StemCell Technologies)或αMEM以进行过继性细胞转移。

小鼠

6-10周龄C57BL/6和C57BL/6白化小鼠购自NCI Frederick的Charles River。B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(Pepboy)、C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J(OT-I)和B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J(OT-II)小鼠购自杰克森实验室(Jackson Laboratory)。RAG^-/-OT-I小鼠由Terry Fry捐赠。所有实验都由NCI动物护理和使用委员会批准，并在NIH动物设施中在特定的无病原体条件下进行。

细胞系

如Meadors等人,Pediatr.Blood Center,57,921-929(2011)中所述得到M3-9-M胚胎性横纹肌肉瘤细胞。KPC177669胰腺腺肉瘤细胞获自NCI高级临床前研究中心(Centerfor Advanced Preclinical Research，CAPR)。Lenti-X细胞由Terry Fry提供。经由微阵列分析验证所有细胞系并常规测试支原体。用pFUGW-Pol2-ffLuc2-eGFP或pFUGW-Pol2-ffLuc2-mCherry稳定转导肿瘤系，并通过荧光激活细胞分选(FACS)进行无菌分选以建立细胞系。用Terry Fry提供的编码卵清蛋白的逆转录病毒(pMSCV-OVA)转导M3-9-M-ffLuc2-mCherry细胞，用结合SIINFEKL的PE抗小鼠H-2K^b(BioLegend)染色，并通过FACS分选以建立M3-9-M-ffLuc2-mCherry-OVA细胞系。所有肿瘤细胞系在37℃，5％CO₂下在包含以下的完全RPMI中培养：10％FBS(Atlantic Biologicals)，1％glutamax(Gibco)，1％青霉素-链霉素(Gibco)，1％非必需氨基酸(Gibco)，1％丙酮酸钠(Gibco)，1mM HEPES(Gibco)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma)。

肿瘤模型

对于M3-9-M原位肿瘤实验，将在100μL HBSS(Gibco)中的5×10⁵个M3-9-M细胞注射到小鼠的腓肠肌中。一周测量原发性肿瘤两至三次，并监测小鼠随时间的存活。肿瘤体积计算为

其中X、Y和Z是小鼠腿各维度的半径。对于截肢实验，当肿瘤直径在最长方向上约为2cm时，手术切除原发性肿瘤。对于肺定植实验，经由尾静脉静脉内(i.v.)注射在200μL HBSS中的5×10⁴个M3-9-M-ffLuc2-mCherry细胞。对于KPC177669肿瘤实验，将小鼠脾内注射。简而言之，用异氟烷麻醉小鼠并做出8-10mm左肋下切口。将脾脏取出并且将5×10⁵个KPC177669-ffLuc2-mCherry细胞注射到100μL HBSS中，随后注射另外的100μL HBSS以将细胞冲到门脉循环中。两分钟后，进行脾切除术，并且以两层闭合切口。

生物发光肿瘤细胞追踪

对于转移实验，通过体内成像系统(IVIS)由全身体内和死后离体器官生物发光成像来检测病变。麻醉的小鼠接受100μL腹膜内(i.p.)注射30μg/ml D-荧光素(GoldBiotechnology)，并温育5分钟。对于离体组织成像，用PBS灌注组织，收获，并在1μg/ml D-荧光素的PBS中温育5分钟。通过IVIS Lumina Series III(Perkin Elmer)检测发光，暴露时间为1分钟。使用Living Image Software(Perkin Elmer)进行显示和图像分析。

慢病毒产生

由Genewiz合成基因构建体，并将其克隆到慢病毒转移载体pELNS中。将Lenti-X细胞在37℃,5％CO₂下在补充有10％FBS，25mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(Gibco)的高葡萄糖DMEM中培养。在慢病毒产生前的一天，将1.8×10⁷个细胞接种到150mm聚-D-赖氨酸包被的板(Corning)上。将细胞用含有Lipofectamine 3000和P3000(ThermoFischer)，15μg pRSV-Rev，15μg pMDLg/pRRE，7.5μg pMD2.G和22.5μg pELNS的Opti-MEM培养基(Gibco)瞬时转染6-8小时，之后抽吸转染混合物并用新鲜的培养基代替。在24小时和48小时收获含病毒的上清液，离心以去除细胞碎片，并储存在-80℃。

组织处理

用PBS灌注肺并用消化培养基(补充有1mg/ml胶原酶I、20μg/ml DNA酶I和分散酶II的HBSS)充气。通过用手术刀精细地切碎组织以及在37℃下在振荡器上在1ml消化培养基中温育组织20分钟来制备单细胞悬液。使组织通过70μM目滤网并用收集培养基洗涤两次。使用如Beury等人,J.Immunol,196:3470-3478(2016)中所述的改进的方案使肿瘤分离。将肿瘤碎块置于含有5ml消化培养基的gentleMACs C管(Miltenyi Biotech)中。然后用剪刀切碎肿瘤，在gentleMACS解离器(Miltenyi Biotech)上使用程序m_impTumor_02处理。将管固定在倒置位置并在37℃振荡器中以100rpm搅拌40分钟。在gentleMACS解离器上使用程序m_impTumor_03再次处理样品，使其通过70μM细胞滤网，并用收集培养基洗涤。对于脾脏和淋巴结，将组织通过70μM细胞滤网捣碎并用收集培养基洗涤。对于脾脏和肿瘤组织，用ACK裂解缓冲液(Life Technologies)裂解红细胞5分钟，并用收集培养基洗涤。

流式细胞术

用PBS洗涤细胞并用Fixable Viability Dye e506(eBiosciences)或Live/DeadAqua(Thermo Fisher)在4℃下在黑暗中染色30分钟。然后将细胞在FACS缓冲液(补充有1％BSA和0.05％NaN₃的PBS)中洗涤，用纯的CD16/CD32抗体(Invitrogen)以及在FACS缓冲液或Brilliant Violet Stain Buffer(BD Biosciences)中稀释的抗体的组合在4℃下在黑暗中进行Fc阻断30分钟。洗涤细胞，以及如果必要的话，用4％多聚甲醛固定。在BD LSRFortessa或BD LSRII上获得流式细胞术数据，并用FlowJo软件版本10.5或更高版本(TreeStar)进行分析。在所有流式细胞术测定中，手动门控基于荧光减一(FMO)对照。

化学疗法处理

将环磷酰胺一水合物(Sigma Aldrich)在PBS中制备成终浓度为20mg/mL并通过22μm过滤器。磷酸氟达拉滨(Actavis Pharma,Inc.)用无菌PBS复溶至终浓度为50mg/ml。在IL12-GEMy转移前48小时，每只小鼠i.p.注射100μL。

抗体消耗

向小鼠i.p.注射100μL消耗性抗体。在肿瘤接种后第9天、第11天和第12天，施用利用200μg抗CD8α抗体克隆2.43、抗CD4抗体克隆GK1.5或大鼠IgG2b同种型对照克隆LTF-2或100μg抗NK1.1(PK136)(BioXcell)的初始消耗。在实验期间，每3-5天施用200μg抗体继续进行抗体消耗处理。

T细胞活化

如上所述，收获来自OT-I或Rag^-/-OT-I小鼠的脾脏并加工成单细胞悬液。在50U/mlIL-2和1μg/ml OT-I同源肽OVA_257-264(SIINFEKL)或OT-II同源肽OVA_323-339存在下在完全RPMI中活化脾细胞4天。将活化的OT-I T细胞经由尾静脉静脉内转移到小鼠中。

免疫荧光

收获肺，将其包埋新鲜冷冻在OCT中并切片。根据发表的方案(AkoyaBiosciences)(Goltsev等人,Cell,174:968-981e915(2018))与NCI CollaborativeProtein Technology Resource合作进行CODEX分析。使用为NIH开发的Palantir Foundry图像观看和分析平台(Palantir Technologies)准备图像。

批量RNA测序

在肿瘤接种后第12天，用8x10⁶个IL12-GEMy处理初始或荷瘤小鼠，或者不处理初始或荷瘤小鼠。在IL12-GEMy转移后三天使小鼠安乐死并收获肺。对于批量RNA测序，将肺在液氮中快速冷冻。将组织在TRIzol(Thermo Fisher)中匀浆，并根据制造商的建议通过氯仿提取，然后通过RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离RNA。使用Illumina TruSeq Stranded mRNA试剂盒和Hiseq4000平台(Illumina)，按照CCR Genomics核心设备的标准操作程序，以每份样品总共10000万个读取进行3’文库制备。利用NIH HPC Biowulf聚类的计算资源(http://hpc.nih.gov)，如Murgai等人,Nat.Med.,23:1176-1190(2017)所述进行比对、归一化和初级基因表达分析。使用创新途径分析(Qiagen)对变化大于2倍和p值截止值为0.05的基因集进行途径分析。

单细胞RNA测序

将来自用或未用IL12-GEMy处理的初始或荷瘤小鼠(n＝4只小鼠/组)的肺加工成单细胞悬液，并通过在NCI-CCR单细胞分析设备使用Chromium Single Cell Controller(10x Genomics)系统的液滴分配对基于oligodT的cDNA文库进行条形码化。进行死细胞去除，并将样品与TotalSeq-A hashtag oligos(HTOs)(BioLegend)一起温育。每个捕获泳道一起运行两个生物学重复。在NCI-CCR测序设备中在NovaSeq(Illumina)上进行测序。使用cellranger版本3.0.2(10x Genomics)进行测序读取多路分解(demultiplexing)、与mm10(Ensembl Ref注释93)的比对和独特分子索引坍塌基因表达矩阵(unique-molecular-index-collapsed gene expression matrix)的产生。使用运行R v3.6.0的RStudio中的Seurat v3.0.2进行另外的数据处理和分析。简而言之，过滤每个样品集的细胞条形码，检测到超过500个基因和低于20％的线粒体基因表达。从分析中排除没有检测到细胞散列抗体(cell hashing antibody)或有多个细胞散列抗体的细胞条形码。合并来自所有样品的数据，并使用SCTransform进行归一化和缩放。对组合的数据进行聚类和UMAP投影，其中通过clustree经验分析告知生物学相关聚类的坍塌。用威尔科克森秩和检验(Wilcoxonranked sum test)在Seurat中用FindAllMarkers进行细胞类型/聚类标志物基因检测。用MAST进行针对每个聚类的跨条件的差异表达测试。使用ggplot在Seurat中生成单细胞图。

统计分析

所有统计分析在Prism版本7.03或更高版本(GraphPad Software)中进行。图表示平均值±标准误差。使用Prism中针对存活分析的未配对的双尾学生t检验、单向方差分析或对数秩统计来计算条形图的p值，如图中图例所示。误差条代表标准误差。在箱线图中，中心线代表中值，箱界限(box limit)表示第25至第75个百分位数，箱须(whisker)代表最小值和最大值。p<0.05被认为是统计学显著的。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。

实施例1

本实施例显示了免疫抑制的核心程序与干细胞样小生境一致。

为了探索不同的免疫群体如何在转移进展期间响应于原发性肿瘤生长而在远处转移部位转化，利用了M3-9-M，其是横纹肌肉瘤的原位同基因肿瘤模型，该模型可靠地转移到肺并且高度类似于人类转移性横纹肌肉瘤。通过流式细胞术分析荷瘤小鼠的转移前和转移早期肺中的免疫群体动态(图1A-C)。

在每个时间点取出初始小鼠，并且表示为肿瘤接种后的第0天。在荷瘤小鼠的肺中观察到髓样(CD11b⁺)细胞群体(包括粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)、单核细胞(CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺)、巨噬细胞(CD11b⁺F4/80⁺)和单核细胞树突细胞(CD11b⁺CD11c⁺))的数目显著增加(图1A)。有趣的是，观察到常规的DC(CD11b^-CD11c⁺)显著降低，表明抗原呈递和有效的过继性免疫应答的引发减弱。

观察到髓细胞群体增加的同时，随着原发性肿瘤负荷的增加，淋巴细胞(包括总T细胞(CD3⁺)、CD4⁺T细胞(CD4⁺CD3⁺)以及B细胞(CD19⁺))的数目显著减少，而NK细胞(CD3^-NK1.1⁺)的数目保持不变(图1B)。与更多功能失调的T细胞相关的PD1^hiCD44^int群体在转移前肺中的增加最显著。有趣的是，在早期时间点(第15天)，转移前肺中活化的PD1^intCD44^hi细胞的百分比低于初始肺(图1C)。虽然T细胞数目减少，但当从转移前微环境中分离并在体外活化时，在转移前肺中发现的那些T细胞保留了它们的增殖能力，表明转移前环境中的局部信号抑制T细胞活性而不是T细胞功能的固有缺陷(图1D)。这些数据显示，在从转移前阶段到晚期转移阶段的疾病进展期间，在转移部位形成的富含髓细胞T细胞贫乏的环境的发展。

为了研究转移小生境环境下的转录程序，对原发性肿瘤接种后15天的初始和转移前小鼠的全肺进行了深度转录分析。响应于远处肿瘤的存在，观察到肺中许多基因的表达显著变化，其中上调的基因多于下调的基因(图1E)。显示了与初始肺相比在转移前上调和下调的前50个基因(图1F)。与初始小鼠相比，与免疫活化相关的基因(Cxcl9、Tarm1、Ifng、Gzmb、Pdcd1和Klrg1)在荷瘤小鼠中显著增加，表明对肿瘤的免疫应答。然而，最值得注意的是，鉴定了与免疫抑制相关的强基因标签(Acod1、Ly6g、S100a8、S100a9、Mmp8、Mmp9、Ido1、Trem1、Il1b、Arg1、Arg2、Cd274、Cybb、Nfe2l2、Nos2、Tgfb和Pik3cg)，并且该核心转录程序是转移前肺的最高度上调的功能特征之一。

为了研究大多数改变的基因程序的功能含义，对转移前肺中上调的前50个基因进行基因本体(GO)分析，这揭示了许多免疫抑制生物学过程的富集(图1G)。其中，白细胞和嗜中性粒细胞迁移和聚集表明促进嗜中性粒细胞内渗进入转移性小生境的基因表达增强，而一氧化氮(NO)和活性氧物质(ROS)生物合成和蛋白质亚硝基化抑制T细胞受体信号传导和T细胞活化。为了更多地了解转移前肺与初始肺之间最大差异表达的基因的潜在生物学，进行了转移前肺中显著上调的基因集的途径分析(图1H)。途径分析表明髓样细胞介导的免疫抑制的多个途径中的显著富集，包括NO和ROS的产生、p38 MAPK信号传导、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号传导、炎性小体途径和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)信号传导(图1H)。T细胞耗竭相关的途径也在转移前肺中富集，并且T细胞活化基因(如IL12a、Tril和Ccr6)在转移前环境中下调，这意味着在转移发展期间过继性免疫应答的抑制。此外，抗炎、抗血管生成途径肝脏X受体(LXR)/类视黄醇X受体(RXR)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号传导在荷瘤小鼠的肺中显著下调，其是涉及脂质代谢、肿瘤生长抑制、MDSC丰度减少和抑制骨髓小生境中的炎症的途径。LXR激动剂，如RGX-104，已经开始用于患有转移性实体瘤的患者的临床试验以减少MDSC扩增(ClinicalTrials.gov ID:NCT02922764)。

总之，转录组学数据支持在由Acod1、Ly6g、Tarm1、S100a8、S100a9、Mmp8、Mmp9、Ido1、Trem1、Il1b、Arg1、Arg2、Cd274、Cybb、Nfe2l2、Nos2、Tgfb1和Pik3cg的上调表示的转移前小生境中的免疫抑制的核心功能模块(我们将其定义为核心免疫抑制程序)(图1E)。这种转移前的小生境基因标签是转移的标志物，并且可以作为对微环境靶向疗法的反应的读出。

为了进一步阐明在荷瘤宿主的肺中我们的转录免疫抑制小生境程序的细胞来源，在肿瘤移植后第15天进行初始和转移前肺的scRNA-seq。通过在每个聚类中富集的谱系标志物的表达来定义每个聚类的细胞类型身份。ScRNA-seq揭示了特异性免疫细胞群体的相对丰度的整体变化。与流式细胞术数据一致，观察到与初始肺(

lung)相比，粒细胞数目的显著增加以及淋巴细胞(包括非细胞毒性T细胞、NK细胞和B细胞)的显著减少(图1I)。髓样细胞群体显示了在全肺转移前小生境中看到的许多负责免疫抑制特征的基因的上调，包括Acod1、S100a8和S100a9(图1J)。另外，在转移前肺中最高度上调的基因之一Retnlg在几乎所有检查的细胞类型中表达，并且已经报道参与早幼粒细胞分化和髓样细胞趋化性(图1J)。

与初始小鼠相比，在荷瘤小鼠的转移前肺中的许多上调基因先前已经涉及转移性小生境生物学(S100a8、S100a9和Mmp9)。然而，发现一组新的免疫调节基因在转移前小生境中的许多细胞聚类中上调：IFN-诱导型跨膜(IFITM)基因Ifitm1和Ifitm3(图1J)。这些干扰素刺激的基因(ISG)响应于细胞外囊泡中的核酸和在组织损伤的情况下来自凋亡细胞的核酸而被活化，这在癌症中经常发生。这些基因是高度进化上保守的，以通过防止病毒进入的内吞融合事件来保护干细胞免受病毒侵入，并且已经在干细胞小生境内发展，以负调节可能潜在地损害干细胞库的I型干扰素应答。发现这些相同的基因在转移前小生境中上调，在那认为它们减弱干扰素介导的对癌症的免疫应答。附图在干细胞小生境与转移前小生境之间进一步平行，神经源性小生境中T细胞的缺乏被认为是健康小生境的迹象，而旧的神经源性小生境中T细胞的浸润与小生境功能的损失相关，概括了在转移前小生境形成期间观察到的T细胞排除的发现。

肝脏是许多癌症中另一种常见的转移部位。使用转移到肺的原位胰腺肿瘤模型，分析了在转移前时间点(第10天)肝脏中的免疫群体(图1K)。我们在转移前肺中观察到的相同趋势存在于转移前肝脏中，主要是髓样细胞的增加、树突细胞和抗原呈递的减少以及T细胞(主要是CD4+T细胞)的减少。

基于上述数据，本申请的发明人提出髓样细胞在产生免疫特权小生境环境中起重要作用以保护干细胞免受免疫攻击。因此，为了测试存在于人类环境中的转录调节小生境程序的贡献，探索了人类造血干细胞小生境中的核心免疫抑制程序(图1L)。实际上，在来自造血干细胞小生境(TREM1、CYBB、S100A8、S100A9和IL1B)的人类骨髓髓细胞群体的批量测序数据以及单细胞数据中发现了许多髓细胞相关的免疫抑制基因的高度相似性。尽管这种转录标签在髓样细胞群体中最显著地上调，但重要的是承认多种其它细胞类型也有助于转移前小生境的这种免疫抑制程序，这与其它细胞类型在干细胞小生境环境的产生中的作用一致。此外，IFITM1和IFITM3在髓细胞、基质和淋巴细胞群体中也以与转移前小生境中类似的表达模式在人类骨髓小生境中上调，验证了包括干细胞保护的高度保守机制的该小生境基因程序(图1M)。在小生境生物学中具有共有转录标签的这种鉴定的核心免疫抑制程序在转移发展的早期阶段期间在肺中产生，这意味着免疫抑制和增强的小生境形成在转移进展的过程中是必不可少的。在胰腺癌环境中在肺和其它转移前器官如肝脏中的免疫抑制标签(图1E-F)标记失调的小生境和转移过程。

实施例2

本实施例显示了基因工程化的髓样细胞(GEMy)的产生，以调节转移前环境中的关键调节程序。

髓样细胞在循环中升高并且在小鼠和人类的肿瘤和转移性微环境中都高度富集(图1A)。为了利用髓样细胞向转移前肺的这种显著浸润，GEMy被生成为递送货物的新平台以操纵小生境微环境中的细胞窜扰(crosstalk)。由于已经显示IL-12被证明具有有效的抗肿瘤活性，因此设计GEMy以产生IL-12(IL12-GEMy)作为评价逆转转移性微环境中核心免疫抑制基因小生境程序的功能影响的原理论证。

IL12-GEMy是通过用编码有效抗肿瘤细胞因子IL-12的慢病毒转导谱系消耗的骨髓细胞而产生的(图2A)。将这些细胞在促进髓样细胞扩增的培养基中培养4天，这是产生最大细胞扩增的时间点。产生IL-12的构建体共表达Thy1.1以使IL12-GEMy能够追踪并评价转导效率。IL12-GEMy产物是异质性髓样细胞群体，其中大部分是Ly6G^-Ly6C⁺单核细胞，转导效率范围为25％-50％(图2B)。通过ELISA确认培养物中IL12-GEMy的IL-12产生并且发现与病毒滴度直接相关(图2C)。

IL12-GEMy以与载体对照细胞类似的比例主要存在于肝脏、肺和脾脏中，表明细胞自主归巢行为没有被IL-12表达破坏，并且说明这些细胞归巢到许多部位的能力(图2D)。IL12-GEMy和载体对照髓样细胞均以非常低的频率存在于骨髓、肿瘤、淋巴结和循环血液中。以CD11b⁺细胞的百分比显示存在于肺中的髓细胞群体的表型变化的饼形图显示了IL12-GEMy在肺中保持Ly6C⁺Ly6G^-单核细胞表型，表明它们的表型在体内没有显著变化(图2D)。在将IL-12-GEMy经静脉内(i.v.)转移到荷瘤小鼠后，在高于基线水平的血浆中不能检测到IL-12，但在肺组织中检测到IL-12，表明分泌的IL-12限于微环境并且没有累积到显著的全身水平(图2E)。这是IL12-GEMy与全身性IL-12施用相比的优点，全身性IL-12施用已经在临床中显示出剂量限制性毒性(Leonard等人,Blood,90:2541-2548(1997))。总之，这些数据显示了IL12-GEMy归巢于转移前的肺，并且可以用于递送细胞因子以在转移前微环境中重编程核心免疫抑制程序。这些研究首次显示了在转移性微环境中从造血干细胞和祖细胞产生功能性鼠GEMy的可行性。

实施例3

本实施例显示了IL12-GEMy恢复并活化转移前的肺中的T细胞群体。

为了测定IL12-GEMy对免疫抑制转移性微环境的影响，分析了在原发性肿瘤终点(第27天)小鼠肺中的淋巴样和髓样细胞群体，所述小鼠未接受处理、接受未转导的髓样细胞或IL12-GEMy。与未接受处理或接受未转导的髓样细胞的小鼠相比，接受IL12-GEMy的荷瘤小鼠的肺具有显著更多的CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞和NK细胞(图3A)。另外，表达PD1^intCD44^hi的CD4⁺和CD8⁺T细胞的百分比在IL12-GEMy处理的小鼠的肺中也显著增加，表明来自IL12-GEMy处理的小鼠的T细胞展示出更加活化的表型(图3B)。脾脏、肿瘤引流淋巴结或肿瘤中CD3⁺和NK1.1⁺细胞的频率没有可感知的差异，除了IL12-GEMy处理的小鼠的肿瘤引流淋巴结中NK1.1⁺细胞减少，表明荷瘤小鼠对IL12-GEMy处理的转移性小生境特异性反应(图3C)。

为了进一步描绘T细胞募集或扩增的动力学，从用IL12-GEMy处理的M3-9-M荷瘤小鼠中收获肺，并在转移前时间点和早期转移时间点通过流式细胞术分析(图3D)。T细胞和NK细胞的数目早在IL12-GEMy转移后3天就增加(图3D)，而PD-1⁺和CD44⁺T细胞的比例的最大增加发生在IL12-GEMy递送后的3至7天(图3D)。

总之，这些数据显示了T细胞募集和/或扩增在响应IL12-GEMy处理的早期发生，并导致随后的T细胞活化，其持续存在以限制转移进展。

IL12-GEMy处理的小鼠的肺的全肺深度转录物组学图谱显示了与初始T细胞相关的基因表达较低以及与细胞毒性相关的基因表达升高，表明IL12-GEMy细胞疗法促进细胞毒性T细胞应答的活化(图3E)。此外，与T细胞耗竭相关的基因表达较低，表明T细胞在IL12-GEMy处理的小鼠的肺中被功能性活化。单细胞分析显示了细胞毒性T细胞中关键T细胞活化标志物(包括Il2ra(CD25)、Tnfrsf18(GITR)、Cd69和Klrg1)的上调(图3E)。来自scRNA-seq的细胞毒性T细胞簇的途径分析支持这些发现，因为代谢活性在这些细胞中富集并且T细胞耗竭信号传导被下调(图3E)。这些数据提示细胞毒性T细胞作为IL12-GEMy细胞疗法限制转移进展的关键效应子。

由于与T细胞活化相关的标志物和基因表达途径在IL12-GEMy处理的小鼠的肺中上调，因此通过体外分析IL12-GEMy对T细胞功能的影响来研究IL12-GEMy对T细胞活化的机制。考虑到在全肺的转录组学分析中观察到的强的Ifng基因标签和通过单细胞分析在细胞毒性T细胞簇中Ifng的诱导，评价了IL12-GEMy在分离的培养系统中诱导T细胞产生IFNγ的能力。相对于与未转导的髓样细胞的共培养，T细胞与IL12-GEMy的共培养提高了初始和活化的OT-I CD8⁺和OT-II CD4⁺T细胞在体外响应同源肽而产生IFNγ的能力(图3F-G)。这些数据显示了IL12-GEMy对T细胞产生IFNγ具有直接影响，并支持我们先前的发现，即IL12-GEMy在体内诱导T细胞产生IFNγ。

尽管与对照相比，IL12-GEMy处理的小鼠的肺中CD11b⁺髓样细胞的总数目没有显著减少，但髓样细胞群体的组成有变化(图3H)。单核细胞的DC和常规的DC(分别为CD11b⁺CD11c⁺和CD11b^-CD11c⁺)的数目显著较高，而单核细胞(CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G^-)或巨噬细胞(CD11b⁺CD43⁺Ly6C⁺F4/80⁺)群体的数目或频率没有变化(图3H)。这表明IL12-GEMy处理增强了专职抗原呈递DC群体以活化适应性免疫。

在IL12-GEMy处理的小鼠与对照小鼠之间，脾脏、淋巴结和肿瘤中的髓细胞群的数目变化最小(图3I)，除GEMy处理显著降低肿瘤引流淋巴结中的总髓样细胞的频率之外(图3I)。

IL12-GEMy细胞数目在转移后长达一周在肺中保持稳定(图3D)，表明IL12-GEMy在体内不扩增，这是与许多T细胞过继转移疗法相关的毒性的原因。

总体而言，通过肺组织的CODEX免疫荧光成像也观察到用IL12-GEMy处理的T细胞增加，而总的髓样细胞浸润没有显著变化(图3J)。

这些数据表明IL12-GEMy处理通过促进抗肿瘤免疫群体(包括活化的T细胞、NK细胞和DC)的积聚来重塑转移环境。

实施例4

本实施例显示了IL-12-GEMy逆转转移前的肺中的核心免疫抑制程序。

为了确定IL12-GEMy处理对转移前微环境的直接功能影响，分析了用IL12-GEMy处理后3天，携带原发性瘤的小鼠的转移前的肺中的转录组图谱。IL12-GEMy处理在转移前的肺的转录程序中产生全局变化，这与未处理的荷瘤小鼠的肺不同。IL12-GEMy处理诱导与Th1免疫活化(Tbx21、Ifng和Stat1)和细胞毒性(Prf1、Ctsw)以及抗原呈递(Ciita、Batf3、B2m、Tap1、H2-K1、H2-Q4、H2-Aa、H2-Ab1和H2-Eb1)相关的基因(图4A)。引人注目的是，我们鉴定的在转移前肺中作为核心免疫抑制程序的一部分的上调的免疫抑制基因被IL12-GEMy处理下调(Trem1、Ly6g、Nfe2l2、Arg1、Nos2、Cybb、Il1b、Tgfb1、S100a8、S100a9、Mmp8、Mmp9和Pik3cg)(图14A)。

途径分析揭示了与抗肿瘤活性(如ICOS信号传导、PPAR信号传导、Th1活化、NFAT信号传导和干扰素信号传导)相关的T细胞途径的上调，所述T细胞途径是IL-12信号传导的下游途径并且与适应性免疫和抗肿瘤应答的活化相关(图4B)。与此同时，IL12-GEMy处理的肺的转录谱揭示了参与小生境相关免疫抑制的途径，如TGF-β、IL-1、IL-6和iNOS信号传导，以及氧化应激反应和NO及ROS产生的显著下调(图4B)。核心免疫抑制基因小生境程序的这种逆转说明了转移前小生境表型的可塑性，所述转移前小生境表型可以通过引入一小群GEMy以诱导荷瘤小鼠的肺中小生境环境的深远重编程来靶向。

为了检查IL12-GEMy对特定细胞群体的转录作用，对来自未处理的和IL12-GEMy处理的荷瘤小鼠的肺进行scRNA-seq分析。尽管髓样细胞群体的相对数目没有显著变化，但髓样细胞确实显示了代表响应于IL12-GEMy的深远转录重编程的群体变化(图4C)。为了更好地理解髓样细胞的转录程序中IL12-GEMy依赖性表型变化，对IL12-GEMy处理的荷瘤小鼠对比未处理的荷瘤小鼠的肺中的特定髓样细胞群体进行途径分析(图4C)。在髓细胞群体中观察到干扰素和Th1途径的显著活化(图4C)。此外，与DC成熟相关的基因途径在单核细胞、巨噬细胞和粒细胞细胞簇中上调(图4C)。值得注意的是，髓细胞亚群中的途径存在强烈的下调，所述途径包括PD-1/PD-L1轴，与Th2信号传导、TGF-β和IL-8信号传导相关的基因，所有这些都与免疫抑制髓细胞生物学相关(图4C)。与粒细胞群体中的白细胞外渗相关的基因也存在强烈的减少(图4C)。在每个髓样细胞群体中上调的前50个基因可以用作响应于GEMy疗法的生物标志物(图4D)。这些发现提示IL12-GEMy细胞疗法减少转移前小生境中多种不同的信号传导途径，后者可以有助于弥散性肿瘤细胞侵袭、免疫逃避和存活。

为了进一步阐明特定细胞类型对IL12-GEMy处理的响应的贡献，检查每个聚类的各种相关基因的表达(图4E)。IL-12信号传导的主要下游作用之一是IFNγ产生，其响应于IL12-GEMy施用而在细胞毒性T细胞和NK细胞中稳健地诱导，并且在非免疫基质细胞中以较小程度诱导。IFNγ通过Stat1发信号，Stat1响应于IL12-GEMy而在转移前小生境中的许多细胞类型中高度上调。IFNγ诱导的Slamf8(其为髓样细胞中ROS产生和迁移的负调节物)在DC、巨噬细胞和单核细胞中稳健地上调。IL-12信号传导也与抗原加工和呈递的上调相关。与MHC I类(H2-K1、H2-D1、Psmb8、Tap2)和MHC II类(Ciita、H2-DMa)抗原加工和呈递相关的许多基因在髓样细胞以及许多其它细胞类型中显著上调。此外，单细胞分析揭示了许多免疫抑制基因的表达在特定细胞群体中降低，如巨噬细胞中的Mmp9、NK细胞和所有髓细胞群体中的Il1b以及DC、巨噬细胞和单核细胞中的Cybb。另外，最近鉴定的控制免疫抑制的分子开关Pik3r5在细胞毒性T细胞、NK细胞和单核细胞群体中也减少。在转移前小生境中发挥重要作用的其它基因也受到差异调节。Cxcr4(其是造血干细胞归巢的重要趋化因子)在许多细胞类型中减少。另外，血管周细胞衍生的纤连蛋白(Fn1)是转移前小生境的关键成分。在本文，显示了单核细胞和嗜酸性粒细胞也有助于纤连蛋白的产生，其在IL12-GEMy存在下减少。

总之，这些数据提供了以下证据：IL12-GEMy具有诱导多种细胞类型中转录事件的级联的能力，从而逆转转移前肺微环境中的免疫抑制，导致适应性T细胞免疫应答的活化。此外，它提供了体内对IL-12和IFN信号传导的细胞特异性应答的新见解，显示了共有的和独有的细胞特异性应答在小生境环境中协调以产生集合性的抗肿瘤表型。

实施例5

本实施例显示了用IL12-GEMy处理限制了同基因肿瘤模型中的原发性肿瘤负荷和转移进展。

为了确定用IL12-GEMy处理逆转转移前微环境中的核心免疫抑制标签是否对肿瘤进展具有治疗影响，在第12天将8×10⁶个载体对照或IL-12 GEMy静脉内转移到荷瘤小鼠中。IL12-GEMy导致大的建立的原发性横纹肌肉瘤肿瘤的消退并显著改善存活，使平均存活时间从22天倍增至45.5天(图5A)。另外，在肿瘤接种后第12天、第19天和第26天，将未转导的髓样细胞、体外IL-12处理的未转导的髓样细胞(IL-12预处理的)或IL12-GEMy以低剂量(≤5×10⁶个细胞)过继转移到携带M3-9-M原发性肿瘤的小鼠中(图5B-5C)。与接受未转导的髓样细胞、IL-12预处理的髓样细胞或未处理的小鼠相比，仅IL12-GEMy减少了肿瘤进展并显著增加了荷瘤小鼠的存活(图5B)。

考虑到显示了IL12-GEMy处理对转移性肺微环境具有深远影响的流式细胞术和转录组数据，评价了IL12-GEMy处理对转移的影响。通过生物发光成像评价携带表达荧光素酶的原发性M3-9-M肿瘤的小鼠的肺，以定量转移性肿瘤负荷。与来自未处理小鼠的肺相比，来自IL12-GEMy处理的小鼠的肺具有显著更少的转移负荷和转移频率(图5C)。相比之下，与未接受处理的小鼠相比，接受未转导的或IL-12预处理的髓样细胞的小鼠在转移负荷和转移频率方面没有显著差异。总之，这些结果显示了IL12-GEMy疗法能够显著减少小鼠中的自发性转移。

为了确定IL12-GEMy处理的功效是否可以通过增加剂量来改善，通过向具有建立的M3-9-M原发性肿瘤的小鼠施用单个高剂量(8x10⁶个IL12-GEMy)、单个低剂量(1x10⁶个IL12-GEMy)或不施用处理来检查IL12-GEMy的剂量依赖性影响(图5D)。与未处理和低剂量IL12-GEMy处理的小鼠相比，接受高剂量IL12-GEMy的小鼠具有延迟的原发性肿瘤生长和显著改善的存活，表明IL12-GEMy的治疗功效是剂量依赖性的。

为了测试环磷酰胺化学疗法预处理是否增强了IL12-GEMy疗法的功效，在肿瘤接种后10天，向M3-9-M荷瘤小鼠施用单剂量的2mg环磷酰胺，然后在2天后进行IL12-GEMy处理(图5E)。与未处理的小鼠相比，单独的环磷酰胺在原发性肿瘤生长中具有适度的延迟并且显著地增加存活。与单独的环磷酰胺相比，环磷酰胺与低剂量或高剂量IL12-GEMy的组合显示了显著降低的肿瘤进展和显著改善的存活。这表明当与单剂量环磷酰胺预处理方案组合使用时，IL12-GEMy处理更有效。此外，环磷酰胺与IL12-GEMy处理的组合在接受低剂量IL12-GEMy的30％小鼠中治愈，但在接受高剂量IL12-GEMy的小鼠中达到66.7％。这些数据表明，化学疗法预处理的治疗益处可以推广到许多类型的基于细胞的免疫疗法，并且可能对IL12-GEMy如何在将来的临床环境中使用具有更大的影响。

数据显示了基于IL12-GEMy的疗法限制了来自原发性肿瘤的自发转移进展(图5C)。为了评价IL12-GEMy对明显的转移性肿瘤的影响，向白化C57BL/6小鼠静脉内给予M3-9-M以建立肺病变，然后在7天后进行IL12-GEMy处理，并通过生物发光成像评估转移进展和存活(图5F)。用IL12-GEMy处理的小鼠具有降低的转移负荷和增加的存活，表明IL12-GEMy能够减轻大量转移性肿瘤生长。

临床上，许多横纹肌肉瘤患者经历其原发性肿瘤的手术切除；然而，30％的患者随后复发转移性疾病。为了模拟新辅助治疗，在第17天用IL12-GEMy处理小鼠，然后在第24天对荷瘤的腿进行截肢。IL12-GEMy细胞疗法在新辅助环境中显著延长小鼠的存活(图5G)。总之，这些数据表明IL12-GEMy疗法可以靶向转移并且在临床相关的新辅助环境中具有功效。

考虑到IL12-GEMy有效地归巢至肝脏并将发现扩展到上皮肿瘤模型，在高度侵袭性胰腺癌肝脏转移模型中测试IL12-GEMy疗法对癌症进展的影响。KPC177669是来源于KPC小鼠模型的Kras^-/p53^-肿瘤细胞系，当细胞被递送到脾脏循环中时，所述Kras-/p53-肿瘤细胞系特异性地转移到肝脏。在脾内注射肿瘤细胞后5天施用IL12-GEMy延迟了原发性肿瘤和转移性生长，并且显著延长了具有KPC177669胰腺肿瘤的小鼠的存活，其中一些IL12-GEMy处理的小鼠从未发展出可检测的肿瘤病变(图5H)。

为了确定GEMy治疗的效果对M3-9-M模型不是特异性的，在肿瘤接种后12天用BALB/c衍生的GEMy处理携带4T1乳腺癌的BALB/c小鼠，并监测小鼠的原发性肿瘤生长和存活(图5I)。如所预期的，GEMy疗法减少了原发性肿瘤生长并且显著延长了4T1携瘤小鼠的存活时间。

总之，这些数据首次显示了静脉内施用基于髓细胞的免疫疗法在多种转移性肿瘤模型中治疗肿瘤进展和转移的显著治疗功效。

实施例6

本实施例显示了IL12 GEMy在与环磷酰胺和氟达拉滨调理组合时治愈了患有晚期疾病的荷瘤小鼠的横纹肌肉瘤肿瘤。

为了测定IL12-GEMy与氟达拉滨/环磷酰胺的化学疗法调理的组合在转移性横纹肌肉瘤模型的功效，在临床环境中，大多数过继性细胞疗法是在用环磷酰胺和氟达拉滨进行化学疗法调理后递送的。向小鼠注射M3-9-M-OVA，然后在肿瘤植入后第8天，用2mg环磷酰胺和5mg氟达拉滨(i.p.)以及免疫细胞群体处理。向小鼠注射M3-9-M-OVA，并在第8天用2mg环磷酰胺和5mg氟达拉滨腹膜内处理以及在第10天给予5x10⁶个IL-12 GEMy或不给予细胞。令人惊讶的是，在氟达拉滨/环磷酰胺后所有给予IL12 GEMy的小鼠都被治愈。

为了检查在治愈的小鼠中长期抗肿瘤免疫应答的发展，与初始年龄匹配的对照相比，在对侧腿中，用未标记的M3-9-M细胞或其原始肿瘤细胞系M3-9-M-ffLuc2-mCherry-OVA再激发IL12-GEMy治愈的小鼠。当用相同的M3-9-M OVA肿瘤再激发时，IL12-GEMy治愈的小鼠没有发生肿瘤，表明有效的免疫。有趣的是，与先前未治愈的小鼠相比，给予未标记的M3-9-M细胞的IL-12 GEMy治愈的小鼠具有显著延迟的肿瘤生长，这显示了T细胞克隆发展超过主要的OVA抗原和有效的表位扩散。

实施例7

本实施例显示了IL12-GEMy功能依赖于CD8⁺T细胞。

对靶标CD8+、CD4+或NK1.1+细胞进行体内抗体消耗实验，以评价哪些淋巴样群体对于介导IL12-GEMy疗法的功效是必需的(图6)。在同种型处理组中的IL12-GEMy处理减小了荷瘤小鼠的大的建立的原发性肿瘤并且显著延长了荷瘤小鼠的存活(p＝0.008)(图6)。消耗CD8⁺细胞的小鼠对IL12-GEMy疗法没有反应，表明CD8⁺细胞对于IL12-GEMy的抗肿瘤作用是必不可少的。基于存活数据，CD4靶向对GEMy功效具有部分影响。相比之下，与同种型+IL12-GEMy处理相比，NK1.1⁺细胞的不完全消耗与IL12-GEMy处理的组合在存活方面没有显著差异。这些数据显示了T细胞在IL12-GEMy疗法的作用机制中发挥关键作用。

为了更好地理解IL12-GEMy活化T细胞的机制，测试了IL12-GEMy对培养中的T细胞的影响。产生了对OT-I T细胞杀伤敏感的表达OVA的M3-9-M细胞系(图7A)。IL12-GEMy通过初始和再活化的CD4⁺和CD8⁺细胞增强IFNγ的产生(图7A)。

IL12-GEMy疗法依赖于CD8⁺T细胞，并在体外(图3F-G)和体内(图4A，图4E)促进初始和再活化的CD4⁺和CD8⁺T细胞的IFNγ产生。为了确定IL12-GEMy疗法是否可以增加过继性T细胞疗法的功效，将OVA特异性T细胞系统用作有效的基于TCR的免疫疗法的模型。用亚治疗剂量的IL12-GEMy和T细胞将OT-I T细胞、IL12-GEMy或组合转移到M3-9-M-OVA荷瘤小鼠中(图7B)。单独的T细胞或低剂量IL12-GEMy的转移不影响原发性肿瘤生长。IL12-GEMy处理与T细胞的组合能够显著增加小鼠的存活并导致肿瘤消退。这种治疗活性的增强是在任何预处理方案不存在下引起的，表明用单独的IL12-GEMy细胞疗法逆转免疫逃避足以增强转移的T细胞的抗肿瘤活性。

总之，这些数据表明IL12-GEMy疗法需要CD8+T细胞，并且部分依赖于CD4+T细胞。另外，这些数据支持了IL12-GEMy可以增强过继性T细胞疗法。

实施例8

本实施例显示了化学疗法预处理与IL12-GEMy疗法的组合增强了过继性T细胞疗法并产生功能性T细胞记忆。

目前在临床中使用的大多数T细胞疗法是在环磷酰胺和氟达拉滨(Cy/Flu)的预处理方案之后给予的。在Cy/Flu预处理之后观察到循环T细胞的消耗，而髓细胞群体在所检查的时间点在循环中没有受到影响(图8A)。出乎意料的是，当在细胞转移前48小时与Cy/Flu的单剂量预处理方案组合时，IL12-GEMy细胞疗法导致具有建立的原发性肿瘤的小鼠的完全和持久的治愈(图8B)。在Cy/Flu预处理后接受IL12-GEMy的100％的小鼠被治愈(n＝10，重复实验两次)。

为了探究IL12-GEMy在引发完全免疫应答中的功能，在对侧腿中用未标记的肿瘤或原始表达OVA的肿瘤再激发治愈的小鼠。当用缺乏强OVA抗原的未标记M3-9-M再激发时，相对于年龄匹配的初始对照，IL12-GEMy治愈的小鼠显示出肿瘤生长的统计学显著的延迟，证明了IL12-GEMy引发识别多种肿瘤抗原(包括非主要抗原(non-dominant antigen))的内源性T细胞应答(图8C)。用原始肿瘤系M3-9-M-ffLuc2-mCherry-OVA再激发的小鼠在IL12-GEMy处理后100天免疫，与功能性记忆T细胞的产生一致(图8C)。

总之，这些研究显示了IL12-GEMy通过增强次优T细胞疗法支持肿瘤特异性CD8⁺T细胞的功能，以及IL12-GEMy疗法能够产生对多种抗原的内源性持久的T细胞记忆。这种与免疫抑制程序逆转相结合的适应性免疫应答的刺激在我们的临床前模型中对肿瘤和转移进展具有深远的影响。

实施例9

本实施例显示了产生人类GEMy的可行性。

用于产生人类IL12-GEMy的人类载体描绘在图9A中。截短的EGFR(tEGFR)用作测量转导效率的报告物以及用作通过使用抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)在体内消耗转导的细胞的潜在安全开关。

人类CD34+干细胞分离自单采术产物，在各种细胞因子条件下培养，并且用表达IL-12的慢病毒以各种MOI转导。通过ELISA测量转导后24小时上清液中的人类IL-12(图9B)。

通过ELISA分析转导的人类CD34+细胞的IL-12产生，并通过定量PCR对从细胞中分离DNA进行拷贝数分析(图9C)。

用慢病毒转导来自淘析的单采术产物的RO级分的人类单核细胞，并通过ELISA分析培养物上清液中的IL-12。

这些数据显示表达高水平IL-12的人类GEMy的产生可从CD34+干细胞以及外周血单核细胞获得。

实施例10

本实施例显示了产生同时表达不同转基因以及多于一种转基因以协调治疗反应的GEMy(bi-GEMy)的能力。

慢病毒载体被设计成表达T细胞化学引诱物CXCL9(图10A)，以及IL-12与CXCL9的组合(图10B)。

如前所述产生小鼠GEMy，并用慢病毒转导以表达IL-12、CXCL9或在一起的IL-12和CXCL9。通过ELISA分析培养物上清液显示了IL12-GEMy和bi-GEMy均产生IL-12，CXCL9-GEMy以及bi-GEMy产生CXCL9(图10C)。

这些数据提供了使用GEMy作为能够表达不同货物以及它们同时表达多种蛋白质的能力的平台的证据。

实施例11

本实施例显示了用于分离MSC的示例性方案。

当MSC在MesenCult培养基(无补充剂)中生长时，低氧(5％O₂)中的生长轻度减少CD45/Ter119⁺细胞并增加CD105+细胞。当MSC在MesenPure培养基中生长时，低氧也轻度增加CD105+细胞。然而，CD45/TER119表达没有差异(不管正常氧或低氧，约99％的细胞是CD45-TER119-)。低氧被认为维持干细胞样(stem like)表型，并且对于小鼠来源的MSC的初始生长/建立可能是最重要的。

慢病毒载体被设计成表达透明质酸酶(图11A)和Spam1(图11B)以在癌症和疾病状态中重塑细胞外基质。

通过蛋白质印迹验证GEMesy的Hyal2和Spam1表达。

这些数据显示了通过慢病毒转导产生GEMesy的过程，并确认了货物蛋白的表达。

实施例12

本实施例显示了转移前小生境中的免疫抑制特征在人类转移中可见，以及该特征可以用于标记转移过程以及评价对免疫抑制靶向的反应。

转移前小生境是由活化的间充质细胞、相关的细胞外基质/基质重塑以及造血干细胞和祖细胞的扩增组成的专门微环境，所述造血干细胞和祖细胞发育成免疫抑制髓样细胞。免疫抑制微环境包括随时间以淋巴样区室为代价的髓细胞区室的显著扩张。淋巴样细胞的丧失减少了适应性免疫应答，并为弥散性肿瘤细胞提供了免疫特权。转移前微环境的基因特征鉴定了参与免疫抑制的关键基因，特别是IDO、Arg、TREM、Acod1、MMP9。这种特征可见于转移性肉瘤(图12)。图4A中描绘了对该特征及其响应于IL12 GEMy的逆转的检查。Tbx21、IFNγ、Prf1、Ctsw、Klrg1、IL12b、IL12rb1、Lck、Lat、Stat1、Ccl12、Ccl22构成响应于IL12 GEMy而上调的基因标签，并且可以在对IL12 GEMy疗法的响应的临床试验评价期间使用。

实施例13

本实施例描述了评估鼠和人类HSPC、单核细胞和巨噬细胞的归巢能力的实验。

向C57BL/6小鼠的腓肠肌中原位注射5×10⁵个M3-9-M细胞。然后在静脉内施用⁸⁰Zr-喔星标记的IL12-GEMy或载体对照GEMy之前48小时，腹膜内给予小鼠2mg环磷酰胺和5mg氟达拉滨。用Zr-89处理细胞，以便在注射后的第0天、第2天、第4天、第8天标记小鼠中的细胞和全身成像。

向NSG小鼠施用来源于单采术的RO级分或CD34+HSPC的人类单核细胞或者在GMCSF中培养的人类巨噬细胞。将细胞用Zr-89处理以标记小鼠中的细胞，并且将在注射后第0天、第2天、第4天、第8天进行全身成像。初步研究表明HSPC比巨噬细胞更好地归巢。

实施例14

本实施例显示了在施用IL12 GEMy后使用IL12抗体处理来抑制潜在的毒性或消除过量的IL12信号传导。

向C57BL/6小鼠的腓肠肌中原位注射5×10⁵个M3-9-M细胞。在肿瘤注射后第10天给予小鼠8×10⁶个IL12 GEMy或载体对照GEMy。然后在实验期间每5天给予小鼠抗mIL12-p75或同种型1mg/小鼠。给予抗mIL12-p75的小鼠将显示出抗肿瘤免疫应答的减少。

实施例15

本实施例显示了在髓样细胞中使用CRISPR基因编辑来检查和分离(decouple)吞噬作用与免疫抑制之间的联系，功能性地改变基因表达以促进或消除免疫抑制，以及增强或减弱GEMy中的吞噬功能(除特定靶基因和过程之外)。

培养SC(人类单核细胞)、MD(人类单核细胞)和THP1(人类急性单核细胞白血病)细胞系，将全基因组的CRISPR/Cas9引导RNA置于细胞和克隆中，选择对免疫抑制和吞噬作用的下游测定的影响的筛选分析。针对增强或减弱该过程的特定基因的改善的筛选而开发免疫抑制或吞噬功能的荧光标志物。这些筛选直接告知基因工程化的髓样细胞设计，并且可以与另外的目的基因一起引入以防止免疫抑制或增强免疫抑制特性和/或吞噬功能。Arg1和IDO CRISPR/Cas9是初始靶标。

实施例16

本实施例显示了表达TREM2的基因工程化的髓样细胞用于改善阿尔茨海默病中的神经变性和行为变化。

TREM(髓样细胞上表达的触发受体)是细胞表面跨膜糖蛋白。它在髓样细胞上表达，在转移前小生境中观察到升高的水平，并且是转移前小生境免疫抑制基因标签的关键成分(图1E)。还已经对骨肉瘤转移进行的单细胞测序中在髓细胞簇中将其鉴定出来(图12)。

TREM1和TREM2在树突细胞、粒细胞和组织特异性巨噬细胞(包括破骨细胞、库普弗细胞(Kuppfer cell)和肺泡巨噬细胞)上表达。在脑中，小胶质细胞仅表达TREM2。TREM2表达随年龄增加而增加，并且在患有阿尔茨海默病的患者中增加。TREM2在患有阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化、中风和外伤性脑损伤的小鼠的脑中升高。已经在患有阿尔茨海默病的患者中确认了TREM升高。TREM2通过DAP-12发信号。TREM2结合LPS或脂磷壁酸(LTA)。脂质可以结合并活化TREM。ApoE是TREM的主要配体。TREM1和TREM2调节髓样细胞数目、增殖和存活。

阿尔茨海默病是进行性且不能治愈的神经变性病症，特征在于细胞外神经炎斑和神经元内神经原纤维缠结，其由错误折叠和聚集的β淀粉样肽和微管相关蛋白tau(MAPT或Tau)组成。早期疾病被认为是由于吞噬作用的功能障碍，随后变化的特征在于神经元损伤和死亡，以及促炎信号传导和小胶质细胞从稳态和致耐受性表型向特征在于促炎细胞因子和相关的缠结及神经元损失的神经变性小胶质细胞表型的过度活化。

TREM在阿尔茨海默病中的作用是未知的。TREM在阿尔茨海默病中的作用是复杂的，并且尚未清楚地理解。尽管小胶质细胞和星形胶质细胞能够清除Aβ，但由胶质活化产生的促炎细胞因子如TNFα和IL1β的产生对神经元是有害的和有毒的。TREM2或DPA12的损失导致Nasu-Hakola病(一种以骨囊肿和早期痴呆为特征的隐性病症)。TREM2已经显示与受损神经元和AD相关蛋白APOE和丛生蛋白(Clusterin)上发现的阴离子和两性离子脂质结合。阿尔茨海默病的早期阶段可能具有与晚期阶段不同的病理生理学。胶质增生可以通过控制淀粉样蛋白负荷而发挥神经保护作用，但随后变得对神经元具有毒性并且成为神经变性的催化剂。TREM2可以调节小胶质细胞中的吞噬作用和溶酶体活性，因此在阿尔茨海默病发病机理中发挥潜在的保护作用。TREM2还可以调节炎性信号传导。缺乏TREM2的巨噬细胞释放较高水平的促炎细胞因子，如TNFα、IL1β、IL6和NO合酶-2(NOS2)。在小胶质细胞中升高的TREM2表达可以具有保护作用。

将TREM2 GEMy和TREM2 APOE诱饵受体或APOE TRAP GEMy施用至衰老和疾病进展小鼠模型，包括APP-PS1(人类淀粉样蛋白前体蛋白和早老蛋白1的过表达突变基因)和5xFAD小鼠(携带5个家族性APP和PSEN1突变)。表达TREM2的GEMy(TREM2 GEMy)经静脉内或脑内递送以改善阿尔茨海默病疾病进展。用定期行为测试密切关注小鼠，并在终点检查脑中的神经炎斑和神经原纤维缠结及神经元损失和变性的证据。

ApoE是已知的阿尔茨海默病风险基因，并且APOE在小胶质细胞中的过表达与恶化的神经变性相关。APOE在从MO稳态和致耐受性小胶质细胞表型转变到神经变性变形虫样-吞噬细胞表型中上调。该转变由miR155调节。免疫抑制和吞噬作用可以代表髓样细胞中两个相互排斥或几乎相互排斥的程序。增强APOE螯合(sequestering)调节阿尔茨海默病或其它神经变性病况中的促炎途径和神经元损失的进展。

实施例17

本实施例描述了以下实验，其中将表达或诱导表达6-O-硫酸化的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖作为细胞表面锚的CD2AP GEMy施用至APP-PS1的衰老和疾病进展小鼠模型。

阿尔茨海默病的特征在于老年斑的细胞外沉积、细胞内发生由淀粉样蛋白β(Aβ)的异常聚集产生的神经原纤维缠结和tau的过度磷酸化。这些斑块和缠结干扰钙信号传导和突触传递。CD2AP是调节肌动蛋白细胞骨架的支架分子。它参与T细胞和抗原呈递细胞连接。它在内吞作用和胞质分裂期间在动态肌动蛋白重塑和膜运输中发挥很强的作用。在小胶质细胞或髓样细胞中的CD2AP表达可以增强神经变性病况中的突触功能，这可以改善阿尔茨海默病中的神经元损失。提高脑内CD2AP的表达可能是有效的治疗。

将CD2AP GEMy施用至衰老和疾病进展小鼠模型，包括APP-PS1(过表达人类淀粉样蛋白前体蛋白和早老蛋白1的突变基因)和5xFAD小鼠(携带5个家族性APP和PSEN1突变)。经静脉内或脑内递送CD2AP GEMy以改善阿尔茨海默病疾病进展。用定期行为测试密切关注小鼠，并在终点检查脑中神经炎斑和神经原纤维缠结及神经元损失和变性的证据。

实施例18

本实施例显示了向APP-PS1的衰老和疾病进展小鼠模型施用CD33 DECOY或CD33TRAP GEMy。

CD33是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素，其调节先天免疫但在脑中没有已知的功能。然而，CD33基因已被鉴定为阿尔茨海默病的危险因素。CD33在小胶质细胞上表达。具有CD33的小胶质细胞是免疫反应性的并且与AD脑中的增强的斑块负荷，特别是淀粉样蛋白β42(Aβ42)相关。

将诱饵受体CD33或TRAP CD33 GEMy施用至衰老和疾病进展小鼠模型，包括APP-PS1(过表达人类淀粉样蛋白前体蛋白和早老蛋白1的突变基因)和5xFAD小鼠(携带5个家族性APP和PSEN1突变)。诱饵受体CD33或TRAP CD33 GEMy经静脉内或脑内递送以改善阿尔茨海默病疾病进展。用定期行为测试密切关注小鼠，并在终点检查脑中神经炎斑和神经原纤维缠结及神经元损失和变性的证据。

实施例19

本实施例显示了表达TREM1和/或TREM2 TRAP或TREM1/2诱饵受体(TREM1/2 TRAPGEMy和TREM1/2诱饵受体GEMy)的基因工程化的髓样细胞的用途。在患有DSS诱导的结肠炎的C57BL/6小鼠中测试炎性肠病(IBD)模型。给予小鼠TREM1或TREM2 TRAP或TREM1或TREM2诱饵受体，其具有表达scFv的GEMy，用于诱导诱饵或TRAP表达的肠道结合。

炎性肠病是指影响胃肠道的慢性炎性病症。免疫反应性的精调是必不可少的或者慢性炎症可以发生，其中急性炎症尚未消退和/或是过度的并且导致组织损伤。TREM家族在免疫应答的调节中发挥作用并且可以修饰模式识别受体。TREM1 mRNA和蛋白质在结肠炎模型中已经显示出显著上调，并且升高可能在疾病的组织学体征出现之前。将这种免疫调节受体靶向髓样细胞将限制或逆转或消除结肠炎。

实施例20

本实施例显示了表达IBD促炎症消退(proresolving)受体的受体GPR32 GEMy的基因工程化的髓样细胞的用途，所述IBD促炎症消退受体促进在患有DSS诱导的结肠炎的C57/B16小鼠中测试的特异性促炎症消退介质(SPM)。单独或以不同组合和/或在不同时间给予小鼠促炎症消退受体ChemR23 GEMy、ERV GEMy、FPR2 GEMy、DRV GEMy、GPR32 GEMy、GPR18GEMY、GPR37 GEMy或LGR6 GEMy，并且任选地给予用于CSL受体的非信号传导scFv，用于肠道定位和促炎症消退受体的诱导。

炎症最初以发红、肿胀、疼痛开始。然后其导致趋化因子和细胞因子的释放，然后是脂质介质-前列腺素和白三烯的释放。这导致嗜中性粒细胞迁移和嗜中性粒细胞流入的LTB4依赖性扩增。凋亡的嗜中性粒细胞可以诱导巨噬细胞清除，这导致专门的促分解介质的生物合成，该介质降低IL6和IFNγ的表达并抑制树突细胞的迁移和活化以及进一步的细胞因子分泌。在持续存在炎症的情况下，由于极度活跃的促炎反应或者由于介质功能紊乱或对介质反应失败而导致的刺激炎症消退的低效，持续的凋亡嗜中性粒细胞活化树突细胞抗原呈递和T细胞活化可以是慢性炎性病症(如动脉粥样硬化、糖尿病、炎性肠病和关节炎)典型的。将髓细胞程序重新平衡到消退(resolution)表型恢复了这些病症中的免疫平衡，而不需要传统的免疫抑制治疗方法。

实施例21

本实施例显示了表达P2ry2和/或P2ry6的基因工程化的髓样细胞用于患有DSS诱导的结肠炎的C57/B16小鼠的炎性肠病以及在患有神经变性的APP-PS1小鼠中逆转神经变性的治疗益处。

髓样细胞的转录表型在调节局部免疫应答中可能是关键的。这些细胞在通过关键转录因子介导的基因程序打开功能性抗微生物或抗肿瘤免疫的适应性免疫臂以及通过替代转录因子介导的基因程序减少急性炎症和增强伤口愈合方面具有关键功能。通过改变髓样细胞的转录表型来操纵基因程序以局部方式重定向免疫平衡，所述局部方式可以在不同改变的微环境中保持治疗益处。P2ry2和P2ry6是小胶质细胞和髓样细胞中的关键稳态基因。恢复这些途径引发可以重新平衡微环境的下游和分泌介质的级联。APP-PS1模型中P2ry12的蛋白质水平恢复改善斑块消除/恢复。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献均被单独且具体地指示为通过引入并入本文并在本文整体阐述。

在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”和“至少一种”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖了单数和复数两种，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后是一项或多项的列表(例如，“A和B中的至少一种”)的使用应理解为意指选自所列项(A或B)的一项或所列项(A和B)的两种或多种的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人有意以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。

序列表

<110> 美国卫生和人力服务部

罗珊德拉·N·卡普兰；

萨比纳·A·克拉茨梅尔；

丹尼尔·W·贝里；

秦海瑛

<120> 作为减少或预防转移、治疗自身免疫和炎性病症以及重新平衡免疫

环境和失调的小生境的平台的基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)及间充质细胞

<130> 747120

<150> 62/803468

<151> 2019-02-09

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

Claims (50)

1.本发明提供了组合物，其包含(a)基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，(b)基因修饰的间充质细胞，或者(c)(a)和(b)两者，其中所述细胞含有包含转基因的载体。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述HSPC是CD34+。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述间充质细胞是间充质干细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述载体是病毒载体。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述转基因编码以下中的一种或多种：细胞因子、趋化因子、酶、底物、诱饵/死亡受体、抗体和自杀基因系统。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述酶是细胞外基质重塑蛋白，任选地是透明质酸酶。

8.如权利要求6所述的组合物，其中所述抗体是scFv、IgG、双特异性抗体或三特异性抗体。

9.如权利要求6所述的组合物，其中所述载体编码选自以下的一种或多种转基因：IL-12、IL-10、CXCL9、CXCL10、TGFβ、IL-2、SMAD、TREM2、CD2AP，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统和诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。

10.用于产生基因修饰的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，其包括：

用包含转基因的载体转染分离的哺乳动物HSPC，

从而产生基因修饰的HSPC。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述HSPC来自骨髓或外周血。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述HSPC是CD34+。

13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其还包括使所述基因修饰的HSPC分化成髓样细胞，从而产生基因工程化的髓样细胞。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述基因工程化的髓样细胞是基因工程化的骨髓来源的CXCR4+髓样细胞。

15.用于产生基因修饰的间充质细胞的方法，其包括：

用包含转基因的病毒载体转染分离的间充质细胞，

从而产生基因修饰的间充质细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述间充质细胞是间充质干细胞。

17.如权利要求16所述的方法，其还包括使所述基因修饰的间充质干细胞分化成基质细胞，从而产生基因工程化的基质细胞。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述基因工程化的基质细胞是活化的周细胞、肌成纤维细胞、血管平滑肌细胞或它们的组合。

19.如权利要求10-18中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。

20.如权利要求10-19中任一项所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体。

21.如权利要求10-20中任一项所述的方法，其中所述转基因编码以下中的一种或多种：细胞因子、趋化因子、酶、底物、诱饵/死亡受体、抗体和自杀基因系统。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述酶是细胞外基质重塑蛋白，任选地是透明质酸酶。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述抗体是scFv、IgG、双特异性抗体或三特异性抗体。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述载体编码选自以下的一种或多种转基因：IL-12、IL-10、CXCL9、CXCL10、TGFβ、IL-2、SMAD、TREM2、CD2AP、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统和诱导型半胱天冬酶自杀基因系统。

25.治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用权利要求1-9中任一项所述的组合物。

26.如权利要求25所述的方法，其中依次施用或共施用两种或更多种所述组合物。

27.治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

28.治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症的方法，其包括：

根据权利要求16或17所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

29.在患有癌症的哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发的方法，其包括将权利要求1-9中任一项所述的组合物施用至所述哺乳动物。

30.在患有癌症的哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

31.在哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发的方法，其包括：

根据权利要求17或18所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

32.延长患有癌症的哺乳动物的存活时间的方法，其包括将权利要求1-9中任一项所述的组合物施用至所述哺乳动物。

33.延长患有癌症的哺乳动物的存活时间的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

34.延长患有癌症的哺乳动物的存活时间的方法，其包括：

根据权利要求17或18所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

35.预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠的方法，所述方法包括将权利要求1-9中任一项所述的组合物施用至所述哺乳动物。

36.预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

37.预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠的方法，其包括：

根据权利要求17或18所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

38.如权利要求25-37中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤尚未在所述哺乳动物中转移。

39.减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移的方法，其包括将权利要求1-9中任一项所述的组合物施用至所述哺乳动物。

40.减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

41.减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移的方法，其包括：

根据权利要求17或18所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

42.如权利要求25-41中任一项所述的方法，其还包括将另外的治疗试剂施用至所述哺乳动物。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述另外的治疗试剂选自：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、树突细胞疫苗、溶瘤病毒、化学疗法、小分子、单克隆抗体或其抗原结合片段、激素阻断疗法和放射疗法。

44.治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症的方法，其包括将权利要求1-9中任一项所述的组合物施用至所述哺乳动物。

45.治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症的方法，其包括：

根据权利要求13或14所述的方法产生基因工程化的髓样细胞，以及

将所述基因工程化的髓样细胞施用至所述哺乳动物。

46.治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症的方法，其包括：

根据权利要求15或16所述的方法产生基因修饰的间充质细胞，以及

将所述基因修饰的间充质细胞施用至所述哺乳动物。

47.治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症的方法，其包括：

根据权利要求17或18所述的方法产生基因工程化的基质细胞，以及

将所述基因工程化的基质细胞施用至所述哺乳动物。

48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述神经变性病况、自身免疫性疾病或炎性疾病选自：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)、多发性硬化和斑秃。

49.权利要求1-9中任一项所述的组合物，其用于：

(a)治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症，

(b)在患有癌症的哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发，

(c)延长患有癌症的哺乳动物的存活时间，

(d)预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠，

(e)减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移，或者

(f)治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症，

(g)重新平衡失调的小生境，

(h)恢复肠道功能、记忆、行为、毛发生长、指甲生长和/或骨髓功能，或者

(g)减少或预防运动障碍、记忆功能障碍、意识模糊或动力异常。

50.权利要求1-9中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：

(a)治疗患有癌症的哺乳动物中的癌症，

(b)在患有癌症的哺乳动物中减少肿瘤生长或者减少或预防肿瘤复发，

(c)延长患有癌症的哺乳动物的存活时间，

(d)预防患有癌症的哺乳动物中的肿瘤休眠，

(e)减少或预防患有癌症的哺乳动物中的转移，

(f)治疗哺乳动物中的神经变性病况、自身免疫病症或炎性病症，

(g)重新平衡失调的小生境，

(h)恢复肠道功能、记忆、行为、毛发生长、指甲生长和/或骨髓功能，或者

(g)减少或预防运动障碍、记忆功能障碍、意识模糊或动力异常。

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