KR102167548B1 - 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 직접 리프로그래밍을 이용한 자연살해세포 제조방법 및 이로부터 제조된 자연살해세포, 상기 자연살해세포에 특이적인 바이오마커, 상기 자연살해세포를 포함하는 세포치료제, 암 치료 및 예방용 조성물, 상기 자연살해세포를 보관하는 동결보존용 세포바이얼, 상기 직접 리프로그래밍 유도용 배지 키트에 관한 것이다. 상기 제조방법을 이용하여 제조된 자연살해세포는 증식능 및 암세포 살상능이 우수한 바, 대량생산, 암 치료 및 예방용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도{A method for producing natural killer cells and uses thereof}
본 발명은 직접 리프로그래밍을 이용한 자연살해세포 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
선천면역을 담당하는 중요한 세포인 자연살해세포는 암세포-특이적인 항원을 인식하여 암세포의 증식이나, 전이를 억제하는 능력을 가진 세포이다. 자연살해세포는 접촉 의존성(Contact-dependent) 세포독성을 가지며 면역 조절에 관한 사이토카인을 생산함으로써 비정상 세포를 제거하는 중요한 역할을 한다. 표적 종양세포 사멸(Apoptosis)은 퍼포린(Perforin, Prf1), 그랜자임 B(Granzyme B, GzmB), 인터페론-감마(Interferon-γ), 및 종양 괴사인자-알파(Tumor-necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 사이토카인의 분비에 의해 종양세포를 선택적으로 살해함으로써 매개된다[Yoon SR, et al(2015), Exp Mol Med 47:e141]. 이러한 자연살해세포의 특성으로 인해 자연살해세포는 항암 치료제 및 암 재발 억제제 등 기존 항암 치료법의 한계를 극복하기 위한 유용한 자원으로써 이들의 활용을 극대화하기 위한 기술 개발이 활발히 진행되고 있다.
기존 연구에서 휴지기의 림프구를 IL-2를 함께 생체외(In vitro) 배양하면 종양 세포를 살상할 수 있는 림프구 활성화 살상 세포(Lymphokine-activated killer)를 확보할 수 있고, 이를 이용하여 흑색종, 신장암, 대장암세포와 공배양 할 경우 약 30% 암세포가 살상됨을 확인함으로써 림프구가 항암 효과를 가지고 있음을 밝혔다[Rosenberg(1988), A review. Ann Surg 208 (2):121-135]. 그러나 림프구 활성화 살상 세포는 대량 배양이 어렵고 살상 효과를 지속 시키기 위해 첨가되는 고농도의 IL-2로 인해 저혈압 및 호흡곤란 등의 모세혈관 누출 증후군 (Capillary leak syndrome)이 동반 되는 부작용이 문제점으로 부각되었다.
지난 수십 년 동안 자연살해세포를 이용한 면역치료제 개발 및 활용 분야는 빠르게 성장하고 있으며 기술 수요에 대한 양적 니즈는 급속히 증가하고 있어 동종 및 자가 인간 자연살해세포의 대량 생산 기술은 면역치료제 개발의 핵심 기술로 부각되었다. 인간 자연살해세포 자원의 소스로는 말초혈액에서 자연살해세포를 분리, 증식하여 사용하는 방법이 주를 이루고 있으며, 분화능이 우수한 인간 조혈줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 등 줄기세포로부터 분화 유도 배양을 통해 자연살해세포를 생산하는 기술 또한 활발하게 다차원적으로 발전하고 있다. 그러나, 줄기세포로부터 자연살해세포를 분화 유도하는데 시간이 오래 걸리고, 비용이 많이 소요된다는 점, 효율이 낮다는 점 등은 개선되어야 할 문제점으로 지적되고 있다. 최근 줄기세포 분화능을 이용하여 표적 세포를 분화 유도 배양을 통해 생산하는 기술 이외 체세포 리프로그래밍 기술을 이용하여 비교적 확보가 용이한 초기 인간 체세포로부터 다른 계통 특성을 가진 고부가가치 인간 조직-특이 표적 세포를 직접 생산하는 기술이 급발전하고 있다. 이는 인간 체세포 확보를 위한 종래 기술의 문제점을 극복할 수 있는 새로운 대안으로 부각되어 학술 또는 임상 적용, 신약 개발 활용 등 무한한 적용 가능성을 제시하고 있으며 다양한 세포 타입을 대상으로 광범위하게 기술 개발이 진행되고 있다. 하지만, 현재 본 발명에서와 같이 직접 리프로그래밍을 통해 자연살해세포를 직접 생산하는 기술 개발 성과는 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인간 자연살해세포를 고효율로 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 분리된 인간 체세포로부터 직접 리프로그래밍 유도 배양을 통해 고효율로 비교적 빠른 시간 안에 자연살해세포를 생산할 수 있으며, 생산된 자연살해세포는 항암치료제를 위한 면역세포치료제로서의 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지, 및 ii) 사이토카인 및 성장인자를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는 자연살해세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지, ii) 사이토카인 및 성장인자를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, 동결보존용 세포바이얼 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 동결보존용 세포바이얼을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 사이토카인, 성장인자, GSK3β 저해제, 스템레게닌 I (StemRegenin I), 인터루킨 7, 및 인터루킨 15를 제1배지로 포함하는 제1용기; 및 (b) 사이토카인, 성장인자, 스템레게닌 I (StemRegenin I), 및 CH-223191을 제2배지로 포함하는 제2용기;를 포함하는 직접 리프로그래밍 유도용 배지 키트를 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지, 및 ii) 사이토카인 및 성장인자를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는 자연살해세포 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 (a) 단계는 (i) 분리된 세포에 하나 이상의 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계이다.
본 발명의 용어, “분리된 세포”는 특별한 제한은 없으나, 구체적으로는 생식세포, 체세포(Somatic cell) 또는 전구세포(Progenitor cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있다. 그 예로 인간에게서 유래한 세포일 수 있으나, 다양한 개체에서 유래된 세포 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.
또한, 본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있으며, 구체적으로, 생체에서 분리된 세포일 수 있다.
상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)를 가지고 있는 모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 말초혈액 단핵세포(실시예 1), 섬유아세포 및 치수강세포(실시예 6)의 직접 리프로그래밍에 의해 자연살해세포가 제조됨을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)"는 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자(혹은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 또는 단백질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 유도하고자 하는 그 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍이 유도되는 분리된 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 자연살해세포를 제조하는 경우에 있어서 리프로그래밍 인자는, Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct3, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것일 수 있으며, 그 외에도 자연살해세포를 제조할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 또한, 상기 리프로그래밍 인자를 이용하여 자연살해세포로의 직접 리프로그래밍을 유도할 수 있다. 직접 리프로그래밍 방법론에서 리프로그래밍 유전 인자를 이용하는 방법이 있는데, 본 발명의 벡터는 이와 같은 용도로 활용될 수 있다. 따라서, 당업자는 그 목적 세포 및 리프로그래밍되기 전의 세포의 종류에 따라 적절한 인자를 선택할 수 있고, 이는 당업계에 공지된 범위 내에서라면 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것으로, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 리프로그래밍 유전인자를 이용한 리르로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것이므로, 상기 리프로그래밍 유전 인자가 세포에 도입되고, 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 초기 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 리프로그래밍 인자군을 분리된 세포에 도입하여 직접 리프로그래밍을 유도하였다. 그 결과, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc; Klf4, Oct4 및 Sox2; Klf4 및 Myc; Klf4; Myc이 도입된 세포에서 직접 리프로그래밍을 통해 자연살해세포가 제조됨을 확인하였다(실시예 1 및 실시예 5).
본 발명에서 "리프로그래밍 인자를 도입하는 단계"는 세포 내에 존재하는 리프로그래밍 인자, 특히 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 유전자의 발현 수준을 증가시키는 방법; 또는 발현 벡터, 유전자 변형, 외래 발현 유전자 도입, 발현 유도 효과를 가지는 물질의 처리 등을 통하여 세포 내의 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수도 있으나, 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 한 제한되지 않는다. 특히, 리프로그래밍 인자를 도입하는 단계는 원하는 시간 및 조건 하에서 리프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 방법일 수 있다.
구체적으로, 상기 (a) 단계의 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 제공하는 데에 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 리프로그래밍 인자를 세포의 배양액에 투여하는 방법, 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법 또는 리프로그래밍 인자의 유전자를 가진 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환 시키는 방법을 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(Microinjection), 전기천공법(Electroporation), 입자분사법(Particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(Insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 용어 “발현벡터”는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명의 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 발현벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
상기 발현벡터는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 (Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 더욱 구체적으로 RNA 기반 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명 에피솜 벡터(Episomal vector)는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함한다. 또한, 에피솜 벡터는 하나 이상의 리프로그래밍 인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결된(Operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(Functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
다음으로, (b) 단계는 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지, ii) 사이토카인 및 성장인자를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계이다.
(b)단계의 상기 제1배지에는 스템레게닌 Ⅰ, 인터루킨 7, 인터루킨 15 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있으며, (b)단계의 제2배지에는 스템레게닌 Ⅰ, CH-223191 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "사이토카인"은 세포에서 생산되어 세포 신호 전달에 사용되는 비교적 작은 크기의 다양한 단백질로서, 자신을 포함하는 다른 세포에 영향을 끼칠 수 있다. 일반적으로 염증 또는 감염에 대한 면역 반응과 관련이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, BMP4, Acivin A, Notch ligand, G-CSF, SDF-1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "성장인자"는 여러 세포의 분열, 성장 및 분화를 촉진하는 폴리펩티드를 의미하며, 상피 세포 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자-AA(PDGF-AA), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 형질 전환 성장 인자-β(TGF-β) 또는 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상, 사이토카인 및 성장인자는 분리된 세포를 계통이 전환된 세포로 직접 리프로그래밍하는 배지에 포함되는 것이며, 직접 리프로그래밍에 이용되는 것이라면 사이토카인 및 성장인자의 종류에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, "GSK3β 저해제"는 글리코겐 신타아제 카이네이즈-3 (Glycogen synthase kinase-3, GSK3)의 두 개의 동형단백질 중 하나인 GSK3 β 의 활성을 억제 또는 저해하는 물질로서, 리튬, SB216763, CHIR-98014, TWS119, AR-A014418 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 CT99021일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, (b) 단계의 제1배지에 GSK3β 저해제가 포함된 경우가 미포함된 경우보다 자연살해세포 제조 효율이 우수함을 확인하였다(실시예 2). 이는, GSK3β 저해제가 직접 리프로그래밍을 통한 자연살해세포 제조방법에서 중요한 역할을 함을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "배양"은 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 본 발명의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
특히, (b) 단계는 리프로그래밍 인자가 도입된 세포를 제1배지 및 제2배지에서 배양하는 과정이므로, 세포를 배양하는 제1배지 및 제2배지의 조성은 상기 리프로그래밍 인자가 도입된 세포를 자연살해세포로 직접 리프로그래밍 하는데에 적합한 조성을 갖고, 구체적으로 상기 제1배지는 사이토카인, 성장인자 및 GSK3 β 저해제를 포함할 수 있고, 제2배지는 사이토카인 및 성장인자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “배지”는 세포의 배양시 사용되는 공지된 배지를 의미하며, 공지의 세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지를 모두 포괄하는 의미이다.
상기 제1배지에서의 용어, “스템레게닌 I (StemRegenin I)"은 아릴 탄화수소 수용체 억제제로서, (4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6- 일아미노)에틸)페놀하이드로클로라이드)(4-(2-((2-Benzo[b]thiphen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-yl)amino)ethyl)phenol hydrochloride)를 의미한다. 상기 스템레게닌 I은 제1배지의 사이토카인, 성장인자, GSK3 β 저해제 이외에 인터루킨 7, 인터루킨 15와 함께 추가적으로 포함되어 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
상기 제2배지에서의 용어, "CH-223191"은 아릴 탄화수소 수용체 억제제로서,(1-메틸-N-[2-메틸-4-[2-(2-메틸페닐)디아제닐]페닐-1H-피라졸-5-카르복사미드)(1-Methyl-N-[2-methyl-4-[2-(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl-1H-pyrazole-5-carboxamide)다. 상기 “아릴 탄화수소 수용체 억제제”는 인간에 있어서 AHR 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 그의 변형인 아릴 탄화수소 수용체의 활성을 하향조절하거나 감소시키는 화합물을 의미하며, 직접 리프로그래밍 효율을 높일 수 있는 역할을 하는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 아릴 탄화수소 수용체 억제제인 CH-223191는 제2배지의 사이토카인, 성장인자 이외에 스템레게닌 I과 함께 추가적으로 포함되어 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 제1배지 및 제2배지는 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시켜 자연살해세포 생산을 촉진시키는 것으로, 상기 제1배지는 사이토카인, 성장인자, GSK3β 저해제, StemRegenin I, 인터루킨 7, 및 인터루킨 15를 포함하고, 상기 제2배지는 사이토카인, 성장인자, 스템레게닌 I(StemRegenin I), 및 CH-223191을 포함할 수 있으나, 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시키는 배지 조성물이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시 예에서는 상기 제1배지의 3종의 혼합첨가물(SRI+IL-7+IL-15)이 단일 첨가물, 2종의 첨가물에 비해 CD56+, CD3- 유도 자연살해세포의 생산을 촉진하는 효과가 높음을 확인하였다. 또한 상기 제2배지의 아릴탄화수소수용체 길항제(스템레게닌 I(StemRegenin I), CH-223191)를 처리한 군에서 유도 자연살해세포의 수득률이 현저히 증가함을 확인하였다(실시예 3)
이는 유도 자연살해세포의 대량생산에 상기 혼합첨가물의 배지 조성물이 효과가 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍(Reprogramming)"은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴 (Global gene expression pattern) 등을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키는 방법을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에서 리프로그래밍은 세포의 운명을 인위적으로 조작하여 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 일례로, 리프로그래밍은 세포의 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍 (Direct reprogramming 또는 Direct conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "직접 리프로그래밍(Direct reprogramming)"은 리프로그래밍 과정을 통해 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 제작하는 기술과는 차별화되며, 리프로그래밍 배양을 통해 직접적으로 원하는 목적 세포로의 직접 전환을 유도하는 기술이다. 기존 유도 만능 줄기세포 리프로그래밍 기술을 이용하여 목적 세포인 자연살해세포를 생산하기 위해서는 우선적으로 분리된 체세포로부터 유도 만능 줄기세포를 제작하고, 중간체인 조혈 줄기(전구)세포를 분화 생산 해야 한다. 유도 만능 줄기세포로부터 분화 유도된 조혈 줄기(전구)세포로부터 다시 최종 목적 세포인 자연살해세포를 분화 생산해야 하는 복잡한 생산 배양 과정을 순차적으로 거쳐야 하기 때문에 생산 효율이 낮고 시간적, 비용적 소모가 크다는 단점이 있다. 또한 태생적으로 전분화능 줄기세포를 경유하여 생산되기 때문에 미분화 세포의 잔류 여부, 안전성 확보 여부가 검증되어야 할 중요한 쟁점이 되고 있다. 하지만, 본 발명은 직접 리프로그래밍 기술을 통해 목적 세포인 자연살해세포를 초기세포로부터 직접 생산함으로써 생산시간, 비용, 효율, 안전성 등 상기 기술의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있을 것으로 기대한다. 본 발명의 목적상 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있다. 본 발명에서 직접 리프로그래밍은 특히 자연살해세포로의 직접 역분화 또는 교차 분화를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분화된 세포"란 구조나 기능이 특수화된 세포를 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변화된 상태를 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포로부터 유래된 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포가 분화된 세포이고, 좁게는 조혈모세포로부터 유래된 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 또한 분화된 세포이다.
본 발명에서 용어, "중간체 세포" 또는 "자연살해 전구세포"란, 자연살해세포로 분화되기 전 단계의 세포로서, 림프계 줄기세포일 수 있으나, 자연살해세포로 분화될 수 있는 가능성이 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "자연살해세포(Natural killer cell)"는, 선천면역을 담당하는 중요한 림프구 세포로서, 전체 림프구 세포 중 5-10%를 차지하며 T 세포와 달리 간이나 골수에서 성숙한다. 자연살해세포는 다양한 선천면역 수용체를 세포 표면에 발현하여 정상세포와 비정상 세포를 구별할 수 있는 것으로 알려져 있으며 바이러스 감염세포나 종양 세포 등 표적세포를 인지하면 즉각적으로 공격하여 제거할 수 있는 것으로 알려져 있다. 비정상세포를 인지한 자연살해세포는 퍼포린을 분비하여 표적 세포의 세포막에 구멍을 내고, 그랜자임을 세포막 내에 분비하여 세포질을 해체함으로써 세포사멸(Apoptosis) 일으키거나, 세포 내부에 물과 염분을 주입해서 세포 괴사(Necrosis)를 일으킨다. 또한 간접적인 방법으로서, 사이토카인을 분비하여 세포독성 T 세포, B 세포를 활성화시킬 수 있다. 이러한 자연살해세포에 매개되는 면역 작용 효과는 자연살해세포의 수와 높은 활성도가 모두 매우 중요한 척도가 되는 것으로 알려져 있으나, 높은 활성도를 가진 자연살해세포를 대량 확보하기 위한 기술 개발은 아직 미흡한 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 자연살해세포의 특성으로 인하여, 면역질환 치료 및 암 치료에 이용할 수 있는 자연살해세포를 대량으로 제조하고자 하였으며, 그 결과 직접 리프로그래밍을 통해 자연살해세포를 직접 대량으로 생산할 수 있는 방법을 최초로 규명하였다.
특히, 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포는 기존의 자연살해세포보다 다양한 종류의 암세포에 대한 살상능이 우수하고, 사이토카인 분비능이 우수함을 확인하였다.
본 발명에 의해 제조된 자연살해세포는 CD56, CD16 또는 이들의 조합을 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CD56 및 CD16은 자연살해세포의 표면에 있는 지표로서, 본 발명에서는 CD56, CD16 또는 이들의 조합의 발현을 유세포 분석기(Flow cytometry)를 통해 분석하여 자연살해세포가 제조된 것을 확인하였다(실시예 1).
본 발명의 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 제공한다.
본 발명의 직접 리프로그래밍을 통해 유도된 자연살해세포의 특성을 기존의 자연살해세포인 NK-92 및 제대혈 유래 자연살해세포와 비교 분석한 결과, 본 발명의 자연살해세포는 증식능이 우수하고(실시예 4), 다양한 암세포에 대한 살상능이 우수하며(실시예 8), 사이토카인 분비능 또한 우수함(실시예 9)을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 자연살해세포 제조방법을 통해 제조된 자연살해세포는 기존의 자연살해세포보다 우수한 효과를 가지는 바, 다양한 질환, 구체적으로, 암치료 및 면역질환치료 등에 더 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 목적상 상기 방법에 따라 제조된 자연살해세포는 특이적인 바이오마커를 발현하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 자연살해세포에 특이적인 바이오마커는 인간으로부터 분리된 자연살해세포와 비교하여 조혈 세포 계통에 연관된 유전자 또는 자연살해세포 매개 세포독성에 연관된 유전자를 상향 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “조혈 세포 계통에 연관된 유전자”는 일반적으로 세포 분화의 과정 또는 조혈 줄기세포로부터 특정화된 혈액 세포의 형성에 관련된 유전자를 의미한다. 조혈은 발달 동안에 태아 간으로부터 골수로 전위하며, 이후 골수는 성인기 내내 조혈부위로 남는다. 또한 조혈 조직은 수임된 다능성, 올리고능성, 및 단분화능성 전구세포뿐만 아니라 장기간 및 단기간 재생 능력을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명에서 자연살해세포에 특이적으로 발현이 증가된 조혈세포계통과 관련된 바이오마커 유전자는 CD71, CD3e, TNF, M-SCF, CD59 및 CD9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 조혈세포계통과 관련된 유전자 중에서 상기 자연살해세포에서 특이적으로 발현이 증가되는 유전자는 제한 없이 포함할 수 있다.
또한, 상기 “자연살해세포 매개 세포독성”은 자연살해세포의 세포독성적인 효과를 통해 바이러스에 감염되거나 비정상적으로 변형된 세포들을 인지하고 제거하는 특성을 의미하며, 활성화 수용체와 부착 분자의 협력을 통해 자극되고 활성화 신호전달은 자연살해세포를 자극하여 세포독성적인 과립을 분비하는 것을 의미한다.
본 발명에서 자연살해세포에 특이적으로 발현이 증가된 자연살해세포 매개 세포독성 관련 바이오마커 유전자는 KIR2DL, KIR2DS, NKp30, FCER1G, ULBP3, SAP, TNFa, IFNg, TRAIL, FAS 및 CASP로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 자연살해세포 매개 세포독성 관련 유전자 중에서 상기 자연살해세포에서 특이적으로 발현이 증가되는 유전자는 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 방법으로 제조된 유도 자연살해세포는 기존에 공지된 배양 방법으로 배양된 자연살해세포나 인간으로부터 분리된 자연살해세포(wild type)와 비교하여 자연살해세포로의 분화 및 활성과 연관이 있는 조혈세포계통 유전자 및 항암 기전과 연관이 있는 자연살해세포 매개 세포독성 유전자가 상향 조절됨을 확인한 바, 상기 상향 조절된 유전자는 바이오마커로서 기능하는 것을 확인하였다(실시예 7-3).
이를 통해, 본 발명의 방법으로 제조된 유도 자연살해세포가 기존에 공지된 배양 방법으로 배양된 자연살해세포나 인간으로부터 분리된 자연살해세포(wild type)와 비교하여 자연살해세포의 활성화 정도가 높은 자연살해세포를 새롭게 분리한 것임을 알 수 있다.
또한, 상기 방법에 따라 제조된 자연살해세포는 동결보존 후 해동시에도 자연살해세포의 특성이 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 동결 보존된 유도 자연살해세포의 특성을 검증하기 위해 해동 후 신선한(fresh) 유도 자연살해세포와 세포 표면 수용체 발현 양상을 유세포분석기(FACS)를 이용하여 비교 분석한 결과, CD56, CD16, CD69, DNAM-I, NKG2D, NKp46등의 발현이 신선한 유도 자연살해세포와 동결 보존된 유도 자연살해세포에서 유사함을 확인함으로써 동결 보존 후 세포의 특성이 변하지 않음을 확인하였다(실시예 11).
본 발명의 또 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 용어, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 자연살해세포의 면역반응 등에 의해 치료 또는 예방의 결과를 나타내는 암일 수 있으며, 구체적으로 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 대장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 결장암, 신경교종, 흑색종, 림프종, 직장암, 혈액암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 자연살해세포는 전립선암[Liu(2013), J Clin Invest 123 (10):4410-4422], 위암, 결장암, 신경교종, 흑색종, 림프종 및 직장암[Dahlberg(2015), Front Immunol 6:605]의 치료 또는 예방에 효과가 있음이 알려져 있다.
또한, 상기 조성물은 암 줄기세포에 대한 살상능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시 예에서는 유도 자연살해세포와 대장암 세포인 SW620, HCT116 암세포, 상기 유도 자연살해세포와 각각 암줄기세포를 1:1 비율로 4시간 반응한 후 살상능을 나타내는 지표로써 CD107a 발현을 유세포분석기(FACS)로 측정한 결과, 각각 SW620, HCT116의 암세포와 암 줄기세포에 대해 상기 유도 자연살해세포의 발현이 암 줄기세포에서 더 높다는 것을 확인하였다(실시예 8-3).
이를 통해 상기 유도 자연살해세포가 암세포뿐만 아니라 암줄기세포에 더 높은 살상능을 가지고 있음을 시사한다.
본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 각각 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 개체란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 "개체", "투여", "암", 및 "치료"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 직접 리프로그래밍에 의해 제조된 자연살해세포가 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 대장암, 골수암, 간암, 뇌암 또는 혈액암의 다양한 암세포에 대해 우수한 살상능을 가진다는 것을 확인하였고, 기존의 자연살해세포와의 암세포 살상능의 비교실험 결과, 본 발명의 자연살해세포의 암세포 살상능이 더 우수함을 확인하였다(실시예 8).
이를 통해, 기존의 자연살해세포보다 본 발명의 직접 리프로그래밍을 통해 제조된 자연살해세포가 암세포 치료에 더 우수함을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지, ii) 사이토카인 및 성장인자를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, 동결보존용 세포바이얼 제조방법을 제공한다.
또한 상기 방법에 따라 제조된 동결보존용 세포바이얼은 동결보존 후 해동시에도 자연살해세포의 특성이 유지되는 동결보존용 세포바이얼을 제공한다.
상기 “분리된 세포”, “리프로그래밍 인자”, “사이토카인”, “성장인자”, “GSK3β 저해제”, “배양”, “자연살해세포” 및 “직접리프로그래밍”은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 “동결보존(cryopreservation)”은 동결을 통해 장시간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양에서 일만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어나고 있으며, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면, 본래의 세포집단과는 다른 세포집단으로 변하고, 심하게는 세포가 가진 특정 기능이 계대 배양에 의해 소실되는 경우도 있다. 또한, 계대배양 중 마이코플라스마 등에 감염될 수도 있다. 이러한 문제점으로 인하여 세포의 고유한 특성이 소실되기 전에 세포를 동결시키고 이를 보존하고, 필요 시에 꺼내어 사용할 수 있도록 세포의 동결 보존을 수행한다. 특히, 줄기세포의 경우 치료제로 이용하기 위해서는 필요한 상황에 건강한 줄기세포를 즉시 사용할 수 있어야 하므로, 효과적인 동결보존은 줄기세포에서 더욱 중요하게 여겨지고 있다. 동결 보존은 세포를 동결시켜 보존하는 당업계의 통상적인 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 그 예로 유리화 동결법(Vitrification method) 또는 완만 동결법(Slow freezing method)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 “바이얼”은 동결 보존액을 나누어 사용할 경우 사용되는 용기를 의미한다. 상기 바이얼은 무균 상태에서 밀폐하여 보존하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 세포 동결보존 방법은 적정 농도의 세포를 상기 바이얼에 포함하여 수행할 수 있다. 상기 바이얼에 포함된 세포의 농도는 바이얼당 1x104 내지 1x108 cell/㎖일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 특히 1x108 cell/㎖일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 동결 보존된 유도 자연살해세포의 특성을 검증하기 위해 해동 후 신선한(fresh) 유도 자연살해세포와 세포 표면 수용체 발현 양상을 유세포분석기(FACS)를 이용하여 비교 분석하였다.
그 결과, CD56, CD16, CD69, DNAM-I, NKG2D, NKp46등의 발현이 신선한 유도 자연살해세포와 동결 보존된 유도 자연살해세포에서 유사함을 확인함으로써 동결 보존 후 세포의 특성이 변하지 않음을 확인하였다(실시예 11).
이를 통해, 상기 제조방법으로 제조된 동결보존용 세포바이얼을 이용하여 동결 보존 후 해동 시에도 자연살해세포의 특성이 유지되는 것을 시사한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 사이토카인, 성장인자, GSK3β 저해제, 스템레게닌 I(StemRegenin I), 인터루킨 7, 및 인터루킨 15를 제1배지로 포함하는 제1용기; 및 (b) 사이토카인, 성장인자, 스템레게닌 I(StemRegenin I), 및 CH-223191을 제2배지로 포함하는 제2용기;를 포함하는 직접 리프로그래밍 유도용 배지 키트를 제공한다.
상기 “사이토카인”, “성장인자”, “GSK3β 저해제”, “배지”, “스템레게닌 I (StemRegenin I)", "CH-223191", “인터루킨 7”, 및 “인터루킨 15”는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "배지 키트"는 임의의 실시 형태를 포함하는 세포 배양에 필요한 배지 조성물을 포함하는 장치이다. 본 발명의 배지 키트는 상기 제1배지를 포함하는 제1용기; 및 상기 제2배지를 포함하는 제2용기를 포함하고, 제1용기 및 제2용기를 순차적으로 사용함으로써 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 직접 리프로그래밍을 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법은 기존의 줄기세포 분화과정을 통해 자연살해세포를 수득하는 방법보다 초기 (환자)세포 사용량이 현저히 적고, 빠른 시간 안에 많은 양의 자연살해세포의 확보를 가능케하며, 확보된 자연살해세포의 암세포 살상능이 우수한 바, 자연살해세포의 대량생산에 효과적으로 활용될 수 있고, 상기 자연살해세포를 포함하는 세포치료제 및 약학적 조성물을 암 치료 또는 예방에 활용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 제조방법으로 제조된 자연살해세포에 특이적인 바이오마커를 선별하였는 바, 이를 통해 세포 분화 및 항암 기전과 관련이 있는 조혈세포계통 및 자연살해세포 매개 세포독성인자의 상향 조절되는 유전자를 확인하였고, 동결보존 후 해동시 특성이 유지됨을 확인한 바, 상기 자연살해세포는 암 치료 및 예방용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1의 A는 직접 리프로그래밍에 의한 자연살해세포 제조방법에 대해 간략히 설명한 도면이고, B는 4개의 리프로그래밍 인자의 도입 유무에 따른 자연살해세포 제조를 나타내는 도면이다.
도 2는 GSK3β 저해제의 효과를 나타내는 도면이다.
도 3의 A는 NKIM-Ⅰ 배지의 조성에 따른 직접 리프로그래밍의 효율을 나타내는 도면이고, B는 NKIM-Ⅱ 배지의 조성에 따른 직접 리프로그래밍의 효율을 나타내는 도면이다.
도 4의 A는 리프로그래밍 유도 자연살해세포의 증식능을 나타내는 도면이고, B 는 리프로그래밍 인자의 도입 유무에 따른 자연살해세포의 제조를 나타내는 도면이다.
도 5의 A는 리프로그래밍 인자에 따른 세포 증식능을 나타내는 도면이고, B는 리프로그래밍 인자에 따른 자연살해세포의 제조를 나타내는 도면이다.
도 6의 A는 자연살해세포 제조방법 a 및 b에 대해 간략히 설명한 도면이고, B 및 C는 각각 인간 피부섬유아세포 및 인간 치수강세포에서 a 및 b 방법에 의한 자연살해세포 제조를 나타내는 도면이다.
도 7은 리프로그래밍 유도 자연살해세포의 표지마커 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
도 8은 리프로그래밍 유도 자연살해세포(iNK)와 제대혈세포 유래 자연살해세포(CB-NK)의 표지마커 발현 패턴을 비교실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9의 A는 말초혈액 자연살해세포와 유도 자연살해세포의 세포 표면 수용체의 발현 특성에 관한 유세포 분석을 나타내는 도면이고, B는 상기 두 세포의 활성화 정도를 비교를 나타내는 도면이고, C는 유도 자연살해세포에서 상향 또는 하향 조절되는 유전자를 확인한 마이크로어레이 분석을 나타내는 도면이고, D는 조혈 세포 계통에 연관된 유전자의 발현을 분석한 도면이며, E는 자연살해세포 매개 세포독성에 연관된 유전자의 발현을 분석한 도면이다.
도 10은 혈액암, 뇌암, 폐암, 간암, 췌장암, 유방암, 대장암, 및 난소암 세포주에 대한 자연살해세포의 암세포 살상능을 나타내는 도면이다.
도 11은 리프로그래밍 유도 자연살해세포(iNK)와 기존의 자연살해세포(NK92)의 암세포 살상능을 비교실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12의 A는 대장암세포인 SW620 및 HCT116의 암줄기세포의 수득률을 나타내는 도면이고, B는 상기 암세포 및 암줄기세포에 대한 유도 자연살해세포의 살상능의 비교를 나타내는 도면이다.
도 13의 A는 유도 자연살해세포의 생체 내에서 항암효과를 확인하기 위한 실험 수행일을 나타내는 도면이고, B 및 C는 유도 자연살해세포의 항암 효과를 확인한 종양 크기의 변화를 나타내는 도면이다.
도 14는 리프로그래밍 유도 자연살해세포(iNK)와 제대혈세포 유래 자연살해세포(CB-NK)의 암세포 살상능과의 비교실험을 나타내는 도면이다.
도 15의 A는 기존의 자연살해세포와 기술된 암세포의 공배양시 사이토카인 INF-γ 와 Granzyme B 분비능의 비교실험한 결과를 나타내는 도면이다. B는 기술된 암세포와의 공배양시 사이토카인 INF-γ, Granzyme B, 및 TNF-α 분비능을 나타내는 도면이다
도 16의 A는 비삽입성 에피솜 벡터를 이용하여 직접 리프로그래밍된 자연살해세포의 제조를 나타내는 도면이고, B는 상기 자연살해세포의 암세포 살상능을 나타내는 도면이다.
도 17은 동결 보존된 유도 자연살해세포의 특성을 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PBMC로부터 자연살해세포로의 직접 리프로그래밍
분리된 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 배양액에서 2일에 한번씩 배지 교환하며 4일간 배양한 후, CD34 isolation microbeads kit (Miltenyl Biotec) 및 CD56 isolation microbeads kit(Miltenyl Biotec)를 사용한 Magnetic activated cell sorting(MACS) 기술을 이용하여 전체 말초혈액 단핵세포로부터 CD34-positive 세포 및 CD56-positive 세포를 제거하여, NK 세포 등의 면역세포를 제거한 PBMC(CD34-CD56-)세포를 회수하였다.
상기 분리된 PBMC(CD34-CD56-)세포에 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)를 형질전환하기 위해 바이러스 시스템[Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc 발현 RNA 기반 센다이바이러스(CytoTune 2.0 Sendai reprogramming kit, Thermo Scientific)]을 이용하였다 (도 1A).
구체적으로, 상기 리프로그래밍 인자를 형질전환 시키기 위해 상기 바이러스(5 MOI, KOS기준), 분리된 PBMC(CD34-CD56-)세포 및 폴리브렌(4μg/ml)을 함께 1일 동안 배양 후 신선한 배지로 교체하였다.
다음 날 24-웰 배양접시에 2x105개의 상기 형질전환된 세포를 NKIM-Ⅰ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5μM CT 99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 9일간 배양하였다(도 1A; STEP I). 배양 10일차에, 상기 배양에서 생성된 콜로니(자연살해세포 전구체)를 분리한 후, 분리된 콜로니를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 14일 동안 배양하여 자연살해세포로 유도하였다(도 1A; STEP II).
상기의 직접 리프로래밍을 통해 자연살해세포가 제조되었는지 확인하기 위해, 자연살해세포의 마커인 CD56, CD16 또는 CD4로 상기 세포를 염색 후 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 자연살해세포(CD56+ 및 CD16+ 또는 CD56+ 및 CD4-)군을 분석하였다.
구체적으로, 단일세포로 분리된 유도된 세포를 형광이 부착된 CD56, CD16 및 CD4에 대한 항체가 첨가된 FACS buffer(1% BSA, 2mM EDTA를 포함한 인산염완충액)로 상온에서 20분 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수 후, FACS(BD Bioscience)로 분석하였다.
리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)가 도입된 말초혈액 단핵세포가 직접 리프로그래밍(도 1A)에 의해 인간 자연살해세포로 유도됨을 확인하였다.
리프로그래밍 인자를 형질전환하지 않은 대조군에서는, 자연살해세포 지표를 발현하는 세포군이 0.3%인 반면, 실험군에서는 약 80%가 자연살해세포 지표 발현 세포군임을 확인하였다(도 1B).
이를 통해, 리프로그래밍 인자의 도입에 의한 직접 리프로그래밍에 의해 자연살해세포가 제조됨을 확인하였다.
실시예 2: PBMC로부터 자연살해세포로의 직접 리프로그래밍에서 GSK3β 저해제의 역할
상기 실시예 1에서 NKIM-Ⅰ 배지에 포함된 GSK3β 저해제인, CT99021의 역할을 확인하기 위해서, 실시예 1에서와 같이 PBMC(CD34-CD56-)세포를 회수한 후, 1일차에 세포를 NKIM-Ⅰ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 CT99021를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우와의 비교실험을 수행하였다.
실시예 1에서와 같이 직접 리프로그래밍이 시작된 지 24일째에 세포를 회수하여 형광이 부착된 CD56 및 CD4에 대한 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기(Flow cytometry)로 자연살해세포 (CD56+ 및 CD4-)군을 분석하였다.
그 결과, CT99021를 첨가하지 않은 경우, 자연살해세포로의 분화가 현저히 낮아짐을 확인하였다(도 2). 이는 자연살해세포로의 직접 리프로그래밍의 시작 단계에서 CT99021이 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 3.NKIM-Ⅰ 배지 및 NKIM-Ⅱ 배지의 조성에 따른 직접 리프로그래밍 효율
상기 NKIM-I 배지 및 NKIM-Ⅱ 배지에서 배양된 PBMC에 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)의 도입 후, 직접 리프로그래밍에 의해 제조된 자연살해세포의 생산능을 촉진시키고자 상기 배지에 혼합첨가물을 첨가하여 분석하였다.
실시예 3-1: NKIM-Ⅰ 배지의 조성에 따른 직접 리프로그래밍 효율
구체적으로, NKIM-Ⅰ 배지의 경우, PBMC에 OSKM을 도입한 후, 다음 날 48-웰 배양접시에 1x105개의 형질전환된 세포를 NKIM-Ⅰ 배지에 5μM CHIR 99021, 2 mM LiCl, 20ng/ml 2μM 스템레게닌 I(StemRegenin I), 인간 IL-7, 20ng/ml 인간 IL-15을 서로 다른 조합으로 리프로그래밍 배양 과정에 첨가하여 CD56+ 유도 자연살해세포 생성능을 확인하였다.
그 결과, 각각의 CHIR 99021, LiCl, 스템레게닌 I, IL-7, IL-15 첨가물은 첨가물을 넣지 않은 조건에 비교하여 첨가하였을 경우, CD56+CD3- 유도 자연살해세포의 생산을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였고, IL7+SRI, IL15+IL-7, SRI+IL-15 2종의 혼합첨가물, SRI+IL-7+IL15 3종 화합물이 단일첨가물에 비해 높은 생산 촉진 효과가 있음을 확인하였다. 특히, SRI+IL-7+IL-15 3종의 혼합첨가물이 단일 첨가물, 2종의 첨가물에 비해 CD56+CD3- 유도 자연살해세포의 생산을 촉진하는 효과가 높음을 확인하였다(도 3A).
실시예 3-2: NKIM-Ⅱ 배지의 조성에 따른 직접 리프로그래밍 효율
NKIM-Ⅱ 배지의 경우, PBMC세포에 OSKM을 도입한 후, 다음 날 48-웰 배양접시에 1x105개의 형질전환된 세포를 NKIM-Ⅰ 배지에서 6일 동안 배양한 후에, NKIM-II에 아릴탄화수소수용체 길항제(Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonist)인 스템레게닌 I, CH-223191 또는 아릴탄화수소수용체 작용제(Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist)인 FICZ를 첨가한 배지에 29일 동안 배양하였다.
그 결과, 아릴탄화수소수용체 길항제(스트렘게닌 I(StemRegenin I), CH-223191)를 처리한 군에서 유도 자연살해세포의 수득률이 현저히 증가함을 확인하였다. 아릴탄화수소수용체 작용제인 FICZ를 첨가한 경우 유도 자연살해세포의 수득률이 현저히 감소함을 확인하였다(도 3B).
이를 통해, 본 발명에 의해 제조되는 유도 자연살해세포의 수득률은 배지의 조성과 관련이 있으며, NKIM-Ⅰ 배지에 상기 혼합물의 첨가 또는 NKIM-II 배지에 상기의 길항제를 처리한 경우 유도 자연살해세포의 증가된 생산능을 확인한 바, 이를 통해 유도 자연살해세포의 대량생산에 상기 배지 조성물이 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 직접 리프로그래밍된 자연살해세포의 증식능 측정
본 발명에 의해 제조된 자연살해세포의 증식능을 평가하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ 배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 3일 간격으로 신선한 배지로 교환하면서, 39일 동안 Hemocytometer를 이용하여 생장속도를 측정하여 증식능을 확인한 결과, 리프로그래밍 인자가 형질전환된 실험군의 경우, 49일째에 초기 세포 수에 비하여 약 1200배 증가함을 확인하였다(도 4A).
상기 실험군 및 대조군을 실시예 1에서와 같이, 형광이 부착된 CD56 및 CD16에 대한 항체를 이용하여 염색한 후, 유세포 분석기(Flow cytometry)로 자연살해세포(CD56+ 및 CD16+)군을 분석하였다.
그 결과, 대조군의 경우, 자연살해세포 지표인 CD56이 양성인 세포군이 0.3%인 반면, 실험군에서는 93.6%가 CD56 양성인 자연살해세포군임을 확인하였다(도 4B).
이를 통해, 본 발명에 의해 제조된 자연살해세포는 우수한 증식능을 가지는 바, 자연살해세포의 대량생산에 유용할 것으로 판단된다.
실시예 5: 리프로그래밍 인자에 따른 증식능 측정
리프로그래밍에 의한 자연살해세포 유도의 최소 리프로그래밍 인자 조합 조건을 확인하기 위해 Oct4, Sox2, Klf4, 및 Myc 인자의 다른 조합을 말초혈액 단핵세포에 도입하고 직접 리프로그래밍에 의해 자연살해세포로 유도되는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같은 PBMC 세포에 4개 세트(a: Klf4, Oct4 및 Sox2; b: Klf4 및 Myc; c: Klf4; d: Myc)의 리프로그래밍 인자 조합을 각각 형질전환시켰다.
다음 날 24-웰 배양접시에 2x105개의 각각의 세트로 형질전환된 세포를 NKIM-Ⅰ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 9일간 배양하였다. 배양 10일차에, 상기 배양에서 생성된 콜로니(계통이 전환된 세포)를 분리한 후, 분리된 콜로니를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 18일 동안 배양하였다.
그 결과, 리프로그래밍 인자, Oct4, Sox2, Klf4, 및 Myc 모두가 도입되지 않은 경우에도, 자연살해세포가 제조됨을 확인하였다(도 5).
실시예 6: 다양한 세포로부터 자연살해세포로의 직접 리프로그래밍
말초혈액 단핵세포 이외의 다른 세포를 이용하여, 직접 리프로그래밍에 의해 유도된 자연살해세포를 제조할 수 있는지 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)가 형질전환된 인간 피부 섬유아세포 또는 인간 치수강 세포가 직접 리프로그래밍에 의해 자연살해세포로 유도됨을 확인하였다(도 6).
상기 인간 피부 섬유아세포 또는 인간 치수강 세포를 2가지 방법 (도 5A; a와 b)으로 각각 배양하여 자연살해세포로 유도하였다(도 6A). 공통적으로, FF 배지(FBS 15%가 포함된 MEM-α 배지)에서 4일간 배양 후, 실시예 1과 같이 4개의 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)를 형질전환하였다. 형질전환 후, 4일간 IM-Ⅰ배지(FBS 5%, KSR 10%, NEAA 1%, β-mercaptoethanol 0.11mM, bFGF 10ng/ml, CT99021 3μM, Na-butyrate 0.1mM, Parnate 2μM, RG108 0.5μM, NECA 0.5μM을 포함하는 DMEM/F12 배지)에서 배양하였다.
그 후, 방법 a의 경우에는, IM-Ⅱ배지(StemPro-34 supplement, Ascorbate 1mM, MTG 1mM, Glutamax-I 1%, Human transferrin 150ug/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μM, IL-3 30ng/ml, IL-6 10ng/ml, IL-11 5ng/ml, SCF 50ng/ml, FLT3 10ng/ml, TPO 30ng/ml, EPO 2U를 포함하는 Stempro-34 배지)에서 11일간 배양 후, 배양 16일차에, 상기 배양에서 생성된 콜로니(자연살해세포 전구체)를 분리한 후, 분리된 콜로니를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 14일 동안 배양하였다.
방법 b의 경우에는, IM-Ⅲ 배지(N2 0.5%, B27 1%, BSA 0.05%, Ascorbate 1mM, MTG 1nM, Glutamax-I 1%, Human transferrin 150ug/ml, BMP4 50ng/ml, bFGF 5ng/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μM를 함유하는 IMDM/F12=75%/25% 배지)에서 2일간 배양 후, 상기 IM-Ⅱ 배지(StemPro-34 supplement, Ascorbate 1mM, MTG 1nM, Glutamax-I 1%, Human transferrin 150μg/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μM, IL-3 30ng.ml, IL-6 10ng/ml, IL-11 5ng/ml, SCF 50ng/ml, FLT3 10ng/ml, TPO 30ng/ml, EPO 2U를 포함하는 Stempro-34 배지)에서 9일간 배양하였다. 그 후, 배양 16일차에, 상기 배양에서 생성된 콜로니(계통이 전환된 세포)를 분리한 후, 분리된 콜로니를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 14일 동안 배양하였다.
상기 방법 a 또는 방법 b에 의해 배양된 인간 피부섬유아세포 또는 인간 치수강 세포를 실시예 1에서와 같이, 형광이 부착된 CD56에 대한 항체를 이용하여 염색한 후, 유세포 분석기(Flow cytometry)로 자연살해세포(CD56+)군을 분석하였다.
그 결과, 인간 피부섬유아세포의 경우, 방법 a의 경우에는 자연살해세포 지표인 CD56이 양성인 세포군이 71.7%이고, 방법 b의 경우에는 CD56이 양성인 세포군이 58.6%로 확인되었다(도 6B). 또한, 인간 치수강세포의 경우, 방법 a의 경우에는 자연살해세포지표인 CD56이 양성인 세포군이 42.4%이고, 방법 b의 경우에는 CD56이 양성인 세포군이 32.7%로 확인되었다(도 6C).
실시예 7: 자연살해세포의 활성도 측정
실시예 7-1: 자연살해세포의 특이적 마커의 발현양상 측정
실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ 배지에서 28일 동안 배양된 세포에서 다양한 자연살해세포 관련 활성화 및 억제 수용체의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. CD16, NKG2D, NKp46, NKG2A, DNAM1과 같은 활성화 수용체 및 억제 수용체인 KIR2DL1, KIR3DL1, KIR2DL4 등이 높은 빈도의 발현을 보임을 확인하였다(도 7).
실시예 7-2: 제대혈세포 유래 자연살해세포와의 비교실험
제대혈(CB)에서 Rosettsep를 이용하여 CD3양성 T세포가 제거된 CB-CD3를 얻은 후, 초기 농도를 1X106개 세포/ml로 하여 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10ng/ml 인간 IL-21, 10ng/ml 인간 IL-15, 10nM 히드로코르티손을 포함하는 α-MEM에 부유하고, T75 플라스크에서 배양을 시작하였다. 2-3일 마다 새로운 배지로 교체하고 세포 수 측정 및 CD3, CD56 등의 지표 측정을 통해 자연살해세포 분화를 측정하여, 자연살해세포의 분화를 2-3주 동안 확인하였다.
실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ 배지에서 28일 동안 배양된 세포와 상기와 같이 제대혈에서 얻은 CB-자연살해세포(CB-NK)에서 다양한 자연살해세포 관련 활성화 및 억제 수용체(CD16, NKG2D, NKp46, NKG2A, DNAM1, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR2DL4)의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 비교 분석하였다. 그 결과 제대혈 세포 유래 자연살해세포와 유사하게 본 발명의 유도 자연살해세포에서 자연살해세포-특이 표지마커 수용체들이 유의하게 발현되고 있음을 확인하였다(도 8).
실시예 7-3. 유도 자연살해세포의 특이적 바이오마커
말초혈액 자연살해세포와 유도 자연살해세포의 세포 표면 수용체의 발현 특성과 차이를 유세포 분석기를 이용하여 CD56, CD16, CD69, NKG2D, DNAM-I, NKp46, NKG2A, KIR2DL2/3, KIR2DL1, KIR3DL1 등의 발현 양상을 분석하였다. 특이적으로, 말초혈액에 자연적으로 존재하는 자연살해세포에 비해 유도 자연살해세포에서 자연살해세포의 활성화 정도를 나타내는 CD69 및 NKG2D의 발현이 현저히 높은 특성을 확인할 수 있었다. 따라서 유도 자연살해세포는 CD56+, CD3-, CD16+, CD69+, NKG2D+인 특성을 가진 세포임을 확인하였다(도 9A 및 9B).
또한, 일차 배양 자연살해세포(pNK, wild type)와 유도 자연살해세포(iNK)(28일)의 글로벌 유전자 발현 양상을 보기 위해 cDNA 마이크로어레이 유전자 칩 분석을 실시하였다. 전 21,448개의 유전자 중에 두 개의 그룹간에 상향 또는 하향 조절되어 2배 이상 유의한 차이를 보이는 유전자 1,523개를 확인하였다(도 9C). 전체적으로 유도 자연살해세포에서 세포분열, 면역반응에 대한 유전자가 상향 조절되어 있고, 세포 신호전달에 관련된 유전자는 하향 조절되어 있음을 확인하였다. 유도 자연살해세포에서만 약 15배 이상 상향 조절되는 유전자를 확인하였고(표 1), 조혈 세포 계통(Hematopoietic cell lineage)에 연관된 유전자, CD71 (3.1배), CD3e (4.5배), TNF (7.1배), M-SCF (44.0배), CD59 (3.1배) 및 CD9 (4.5배)의 발현 차이를 확인하였고(도 9D), 자연살해세포 매개 세포독성(Natural killer cell-mediated cytotoxicity)에 연관된 유전자, KIR2DL (8.7배), KIR2DS (4.7배), NKp30 (2.8배), FCER1G (2.0배), ULBP3 (2.2배), SAP (2.2배), TNFa (7.1배), IFNg (3.1배), TRAIL (5.9배), FAS (3.6배) 및 CASP (2.6배)의 발현 차이를 확인하였다(표 2 및 도 9E).
이를 통해, 본 발명의 유도 자연살해세포는 일차 배양 자연살해세포와 비교하여 자연살해세포로의 분화 및 활성과 연관이 있는 조혈세포계통 유전자; 및 항암 기전과 연관이 있는 자연살해세포 매개 세포독성 유전자가 상향 조절됨을 확인한 바, 상기 상향 조절된 유전자는 바이오마커로서 기능하는 것을 확인하였다. 또한 상기 유도 자연살해세포는 상기 유전자의 조절을 통해 암세포 살상능의 효과를 높이는 것을 확인하였다.
Figure 112018094325613-pat00001
Figure 112018094325613-pat00002
Figure 112018094325613-pat00003
실시예 8: 자연살해세포의 암세포 살상능 측정
상기 실시예를 통해 검토한 결과, 리프로그래밍 인자를 이용하여 말초혈액 단핵세포에서 분리된 PBMC(CD34-CD56-)세포로부터 리프로그래밍 유도된 자연살해세포의 증식능 및 활성이 우수한 바, 상기 자연살해세포를 이용하여 다양한 암세포에 대한 살상능을 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ배지에서 14일 또는 35일 동안 배양하여 유도된 자연살해세포의 암세포 살상능을 측정하였다. 암세포 살상능은 Calcein-AM을 사용한 세포 살상능 측정법으로 평가하였다.
암세포를 각각 1x105개 세포/ml이 되도록 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 희석 후, 25μM이 되도록 Calcein-AM을 첨가하여 37℃에서 1시간 배양 후에 DMEM 배지로 세척한 세포를 Calcein 표지 표적세포로 하였다.
실시예 8-1: 다양한 암세포에 대한 암세포 살상능 측정
다양한 종양세포를 표적세포로 하여 본 발명에서 제조된 자연살해세포의 암세포 살상능을 측정하였다(표 3).
Figure 112018094325613-pat00004
자연살해세포를 각각 0.25x105개 세포/ml, 1x105개 세포/ml, 2.5x105개 세포/ml의 세포수 밀도로 NKIM-II로 희석하여 준비한 후에, 96-웰 세포배양 플레이트에 각각 100μl씩 분주하였다. 조제한 Calcein 표지 상기 표적세포(1x105개 세포/ml)를 100μl/well씩 96웰 플레이트에 첨가한 후, 400g로 1분간 원심분리하여 4시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에서 배양하였다. 그 다음에 각 웰로부터 상층액 100μl를 취하여, 형광 플레이터 리더(485nm/535nm)로 측정하였다. 세포살상능(%)은 아래 수식에 따라서 산출하였다.
암세포 살상능(%)=(측정값-최소값)/(최대값-최소값)x100
상기 식에서, 최소값은 Calcein표지 표적세포만 존재하는 웰의 측정값이고, 최대값은 Calcein표지 표적세포에 0.1% TritonX-100을 첨가해서 세포를 완전 용해한 웰의 측정값이다.
그 결과, 다양한 암세포에 대하여 높은 살상능을 보유하는 것을 확인하였다(도 10).
실시예 8-2: 본 발명의 자연살해세포 및 기존의 자연살해세포의 암세포 살상능 비교실험
본 발명에서 제조된 자연살해세포의 암세포 살상능의 우수성을 확인하기 위해 기존의 인간 자연살해세포와의 비교실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ배지에서 28일 동안 배양하여 유도된 자연살해세포(실험군) 및 기존의 NK92 인간 자연살해세포(ATCC)(대조군)의 K562 및 HepG2 암세포에 대한 암세포 살상능을 실시예 7-1과 같이 Calcein-AM을 사용한 세포 살상능 측정법으로 평가하였다.
그 결과, 실험군의 암세포 살상능이 대조군에 비해 약 3.8 - 5.8배 이상 우수함을 확인하였다(도 11).
실시예 8-3. 본 발명의 자연살해세포의 암줄기세포에 대한 살상능 및 생체 내 효과 검증
본 발명에서 제조된 자연살해세포의 암세포 살상능뿐만 아니라 암줄기세포의 살상능의 우수성을 확인하기 위해 암세포 및 암줄기세포의 비교실험을 수행하였다.
실시예 8-2에서 실험한 혈액암(K562)과 간암(HepG2) 이외의 대장암세포인 SW620 및 HCT116 두 종으로부터 암줄기세포를 증식 배양하기 위해 10,000 세포수를 35mm 배양접시에 플레이팅하고 97% DMEM/F12, 1% penicillin/streptomycin, 10ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF 및 2% B27의 무-혈청 배양 배지에서 부유 배양하였다(Sci Rep. 2014 Dec 15;4:7481). 부유 배양된 세포는 3차원적 스페로이드(spheroid) 구조를 형성하며 배양되었고, 3 내지 4일 마다 기존 배양액의 1/2을 첨가하여 배양하였다. 7 내지 10일 동안 배양된 스페로이드는 계대 배양을 위해 5분간 1,000rpm 조건에서 원심분리하여 회수 하고 trypsin/EDTA를 처리하여 단일 세포로 해리한 다음 단일 세포를 상기 배양배지에서 부유 배양하였다.
대장암 세포로부터 증식 배양된 암줄기세포는 대표적인 암줄기세포 표지마커인 CD133의 발현 여부를 유세포분석기(FACS)로 분석함으로써 확인하였다.
그 결과 SW620 세포와 HCT116 세포로부터 상기 암줄기세포 배양 과정을 거친 세포군에서 각각 79.5%, 80.4%의 세포군이 CD133+ 양성인 암줄기세포가 수득됨을 확인하였다.
유도 자연살해세포와 각각 SW620, HCT116 암세포, 유도 자연살해세포와 각각 SW620, HCT116 암줄기세포를 1:1 비율로 4시간 반응한 후 살상능을 나타내는 지표로써 CD107a 발현을 유세포분석기(FACS)로 측정한 결과, 각각 SW620 암세포와 암줄기세포에 대해 유도 자연살해세포가 6.8%, 12.8% 발현을 나타내면서 암줄기세포에 대해 높은 발현을 나타냄을 확인하였다. HCT116 암세포와 암줄기세포에 대해 유도 자연살해세포가 4.7%, 8.6% 발현을 나타내면서 암줄기세포에 대해 높은 발현을 보였다. 이를 통해 유도 자연살해세포가 암줄기세포에 대해 높은 살상능을 가지고 있음을 알 수 있었다(도 12A 및 12B).
또한, 유도 자연살해세포의 항암 효과를 검증하기 위해 마우스를 이용하여 생체 내 실험을 수행하였다. 생후 8주차의 누드 마우스(Nude mouse)(Balb/c-nude mouse, 평균무게 20-25g) 등에 2x106 Sw620을 피하 주입(subcutaneous injection)한 다음날 유도 자연살해세포 (5x106, 1.5 x107) 와 독소루비신(Doxorubicin) 2mg/kg 를 주입하였다. 유도 자연살해세포는 D1 과 D4에 두 차례 정맥주사 (intravenous, i.v)하였고, 독소루비신은 2일에 한번씩(격일), 2주 동안 복강주사 (intraperitoneal, i.p)하였다. 28일째에 각 그룹의 마우스를 경추탈골 기법으로 희생시킨 후, 각 그룹의 마우스의 피하에서 형성되어 돌출된 암덩어리를 적출하였다. 적출한 Sw620 암을 그룹별로 비교하여 유도 자연살해세포의 항암효과를 확인하였다(도 13A).
SW620을 피하 주사하여, 각 그룹 별로 (PBS, iNK500, iNK1500, 독소루비신) 비교한 결과, 28일차에서 PBS를 주입한 조건에서 형성된 종양크기 (1369mm3) 대비 유도 자연살해세포 [iNK500 (5x106) - 262mm3, iNK1500 (1.5 x107) - 183mm3]를 주입한 마우스의 종양이 현저히 줄었음을 확인할 수 있었다. 특히, 독소루비신(262mm3)을 주입한 조건 대비 1.5 x107 유도 자연살해세포를 주입한 조건에서 높은 항암효과를 나타냄을 확인하였다(도 13B 및 13C).
실시예 8-4: 본 발명의 자연살해세포 및 제대혈 유래 자연살해세포의 암세포 살상능 비교실험
본 발명에서 제조된 자연살해세포의 암세포 살상능의 우수성을 확인하기 위해 제대혈 유래 자연살해세포와의 비교실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같이 NKIM-Ⅰ배지에 의해 유도된 계통이 전환된 세포를 NKIM-Ⅱ배지에서 28일 동안 배양하여 유도된 자연살해세포(실험군) 및 제대혈 유래 자연살해세포(ATCC)(대조군)의 K562 및 HepG2 암세포에 대한 암세포 살상능을 실시예 7-1과 같이 Calcein-AM을 사용한 세포 살상능 측정법으로 평가하였다.
그 결과, 본 발명의 자연살해세포의 암세포 살상능이 제대혈 유래 자연살해세포에 비해 약 1.4 - 2.13배 이상 우수함을 확인하였다(도 14).
실시예 9: 사이토카인 분비능 측정
본 발명에서 제조된 자연살해세포의 사이토카인 분비능의 우수성을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 조건 배지(Conditioned medium)를 얻기 위해, 실시예 7에서와 같이 다양한 암세포에 대하여 각각 1x105개 세포/ml 0.5ml 및 동일한 세포 농도 및 동일한 양의 자연살해세포를 혼합하였다. 16시간 후, 상기 배양된 배양액 1ml 은 0.22μm 필터(Millipore)를 이용하여 필터링 하였다. 분비된 사이토카인(IFN-γ, Granzyme B, 및 TNF-α)의 농도를 측정하기 위해, 제작자의 프로토콜(Abcam)에 따라 대조군(No target) 및 실험군 유래의 조건 배양액에서 ELISA를 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 자연살해세포의 사이토카인 분비능이 K562 및 HepG2 암세포와의 공배양 조건에서 기존의 NK92 인간 자연살해세포에 비해 현저히 우수함을 확인하였다(도 15A). 또한 K562 및 HepG2 암세포 이외 다양한 암세포 u373mg, THP_1, A549, Hep3B, 및 MCF7 등과의 공배양 조건에서도 사이토카인 분비가 현저히 촉진됨을 확인하였다(도 15B).
실시예 10: 비삽입성 에피솜 벡터를 이용하여 유도된 자연살해세포의 특성
바이러스 시스템을 이용하여 리프로그래밍 인자를 도입한 실시예 1 내지 8와는 다르게, 리프로그래밍 인자의 또 다른 전달체인 비삽입성 에피솜 벡터를 이용하여 리프로그래밍 인자를 형질전환시키는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서와 같이 PBMC-34-56 세포를 회수한 후, 1x106개 세포수로 Neon®transfectionsystem(Invitrogen)을 사용하여 제조사가 제공하는 프로토콜로 hOCT3/4, hSOX2, hKLF4, hLIN28, hL-MYC 5개의 리프로그래밍 인자와 리프로그래밍의 효율을 증진시켜주는 인자인 shp53을 발현하는 oriP/EBNA1 기반의 pCEP4 에피솜 벡터를 전기천공법(Electroporation)으로 1650V 펄스 전압, 10ms 펄스 너비, 3 펄스 수의 기본 조건으로 설정하여 형질전환 하였다. 24-웰 배양접시에 상기 형질전환 된 세포를 플레이팅 하여 PBMC 배지에 배양 하였다.
다음날, NKIM-Ⅰ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 5일간 배양하였다. 배양 6일차에, 상기 배양에서 생성된 콜로니(계통이 전환된 세포)를 분리한 후, 분리된 콜로니를 NKIM-Ⅱ 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 14일 동안 배양하여 자연살해세포로 유도하였다.
상기의 직접 리프로래밍을 통해 자연살해세포가 제조되었는지 확인하기 위해, 실시예 1에서와 같이, 형광이 부착된 CD56 및 CD3에 대한 항체를 이용하여 염색한 후, 유세포 분석기(Flow cytometry)로 자연살해세포(CD56+ 및 CD3-)군을 분석하였다.
그 결과, 대조군의 경우, 자연살해세포 지표인 CD56가 양성인 세포군이 0.8%인 반면, 실험군에서는 24.6%가 CD56 양성인 자연살해세포군임을 확인하였다(도 16A).
또한, 상기 에피솜 벡터를 이용하여 유도된 자연살해세포의 암세포 살상능을 평가하기 위해, 실시예 7-1과 같이 Calcein-AM을 사용한 세포 살상능 측정법으로 평가한 결과, K562 세포 또는 HepG2에 대해서 각각 40.32% 또는 49.23%의 암세포 살상능을 보여줬다(도 16B)
이를 통해, 바이러스를 이용하지 않고 비삽입성 에피솜 벡터를 이용하여, 직접 리프로그래밍으로 유도된 자연살해세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 11. 동결 보존된 유도 자연살해세포의 특성
유도 자연살해세포의 장기 보존 및 특성의 유지를 위해 동결보존하였고, 해동시 상기 유도 자연살해세포의 특성이 유지되는지 확인하기 위해 신선한 유도 자연살해세포와 비교실험을 수행하였다.
상기 유도 자연살해세포의 보존 및 특성의 유지를 위해 액체질소에 1 x 108 세포의 유도 자연살해세포를 1ml 의 RecoveryTM 세포 배양 동결 배지인 동결보존용 세포바이얼에 보관하였다. 동결 보존된 유도 자연살해세포의 특성을 검증하기 위해 해동 후 신선한(fresh) 유도 자연살해세포와 세포 표면 수용체 발현 양상을 유세포분석기(FACS)를 이용하여 비교 분석하였다.
그 결과, CD56, CD16, CD69, DNAM-I, NKG2D, NKp46등의 발현이 신선한 유도 자연살해세포와 동결 보존된 유도 자연살해세포에서 유사함을 확인함으로써 동결 보존 후 세포의 특성이 변하지 않음을 검증하였다(도 17).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는 자연살해세포 제조방법으로서,
    (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계;
    (b) 도입 후 다음날부터 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지에서 배양하여 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시키는 단계, 및 ii) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포 생산을 촉진시키는 단계를 포함하고,
    상기 제1배지의 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고, 상기 제1배지의 성장인자는 SCF, FLT3 ligand 및 TPO를 포함하고, EPO, BMP4, 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고,
    상기 제2배지의 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고, 상기 제2배지의 성장인자는 SCF, 및 FLT3 ligand인 것인, 자연살해세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리프로그래밍 인자는
    i) Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것;
    ⅱ) Oct4 및 Sox2를 포함하고, Lin28 또는 Nanog인 것;
    ⅲ) Ascl1 및 Pitx3인 것;
    ⅳ) Ascl1 및 Nurr1인 것;
    ⅴ) Ascl1 및 Lmx1a인 것; 또는
    ⅵ) Oct3 및 Klf4인 것인, 자연살해세포 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제1배지 또는 제2배지에 인터루킨 7, 인터루킨 15 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 자연살해세포 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제2배지에 스템레게닌 I (StemRegenin I)을 추가로 포함하고, 상기 GSK3β 저해제는 CT99021인, 자연살해세포 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포는 자연살해세포를 제외한 체세포인 것인, 자연살해세포 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제조된 자연살해세포는 CD56, CD16 또는 이들의 조합을 발현하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 제조방법.
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  12. 제1항의 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 세포치료제.
  13. 제1항의 방법에 따라 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 대장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 결장암, 신경교종, 흑색종, 림프종, 직장암, 혈액암 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 암줄기세포에 대한 살상능력을 갖는 것을 특징으로 하는, 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  16. 자연살해세포(Natural killer cell)로 직접리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, 동결보존 후 해동시에도 자연세포의 특성을 유지하는 자연살해세포 제조방법 으로서,
    (a) 분리된 세포에 리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)를 도입하는 단계;
    (b) 도입 후 다음날부터 상기 (a) 단계의 세포를 i) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제1배지에서 배양하여 직접 리프로그래밍의 효율을 증가시키는 단계, ii) 사이토카인, 성장인자 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제2배지에서 배양하여 자연살해세포 생산을 촉진시키는 단계를 포함하고,
    상기 제1배지의 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고, 상기 제1배지의 성장인자는 SCF, FLT3 ligand 및 TPO를 포함하고, EPO, BMP4, 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고,
    상기 제2배지의 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이고, 상기 제2배지의 성장인자는 SCF, 및 FLT3 ligand인 것인, 동결보존 후 해동시에도 자연세포의 특성을 유지하는 자연살해세포 제조방법.
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