CN110257320A - 一种临床级iPS的诱导和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种临床级iPS的诱导和筛选方法，包括先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；诱导剂的浓度为1μM；分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导24‑36小时，再加入改良的诱导培养基进行培养24‑36天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；将筛选出来的初级干细胞放入诱导培养基继续培养10‑15天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。本方法快速筛选出干细胞。

Description

一种临床级iPS的诱导和筛选方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞筛选的技术领域，尤其是一种临床级iPS的诱导和筛选方法。
背景技术
作为生物技术最新的研究领域，干细胞(简称iPS)的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。因此如何对临床级iPS的诱导和筛选然后获取最终合适的临床级iPS是相对重要的环节，目前还没有一个合适的方法，故此需要进行研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法。
为了实现上述目的，本发明所设计的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为24-36小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1～2g/L、血管内皮生长因子2～8μg/L、表皮生长因子5～8μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导24-36小时，再加入改良的诱导培养基进行培养24-36天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养10-15天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1.5g/L、血管内皮生长因子6μg/L、表皮生长因子6μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
进一步，在步骤三中利用染色法进行细胞重编程效率检测。
本发明得到的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，本发明操作简单、能够稳定快速的分离和筛选出临床级干细胞，提高工作效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
本实施例提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为24小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1～2g/L、血管内皮生长因子2～8μg/L、表皮生长因子5～8μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导24小时，再加入改良的诱导培养基进行培养24天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养10天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1.5g/L、血管内皮生长因子6μg/L、表皮生长因子6μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
实施例2：
本实施例提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为28小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1g/L、血管内皮生长因子2μg/L、表皮生长因子5μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导28小时，再加入改良的诱导培养基进行培养28天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养12天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
实施例3：
本实施例提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为30小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1.2g/L、血管内皮生长因子3μg/L、表皮生长因子6μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导30小时，再加入改良的诱导培养基进行培养30天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养13天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
实施例4：
本实施例提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为32小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1.8g/L、血管内皮生长因子7μg/L、表皮生长因子7μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导35小时，再加入改良的诱导培养基进行培养35天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养14天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
进一步，在步骤三中利用染色法进行细胞重编程效率检测。
实施例5：
本实施例提供的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为36小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白2g/L、血管内皮生长因子8μg/L、表皮生长因子8μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导24-36小时，再加入改良的诱导培养基进行培养24-36天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养10-15天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
进一步，在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
进一步，在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
进一步，在步骤三中利用染色法进行细胞重编程效率检测。

Claims (7)

1.一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤一：先选择诱导剂和制备培养基；使用全反式维甲酸作为诱导剂，利用改良的诱导培养基作为培养基处理干细胞；所述诱导剂的浓度为1μM；所述诱导剂的诱导时间为24-36小时；所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1～2g/L、血管内皮生长因子2～8μg/L、表皮生长因子5～8μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L；
步骤二：分离培养人体单细胞，并进行扩充单细胞；
步骤三：诱导扩充单细胞进行分化：加入诱导剂进行预诱导24-36小时，再加入改良的诱导培养基进行培养24-36天；进行细胞重编程效率检测；筛选出符合的初级干细胞；
步骤四：将筛选出来的初级干细胞放入改良的诱导培养基继续培养10-15天，然后对IPS cells样集落进行筛选和传代；
步骤五：对IPS cells进行最终的鉴定和特性基因进行检测，并进行分化试验获得最终的干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：所述改良的诱导培养基采用在在基础培养基中添加有以下组分，各组分中浓度分别为：人血清白蛋白1.5g/L、血管内皮生长因子6μg/L、表皮生长因子6μg/L、促红细胞生成素1μg/L、α-D-葡萄糖3000mg/L、维生素C 175mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：在步骤三中诱导后利用全细胞膜片钳检测细胞静息电位来测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
4.根据权利要求1或2所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
5.根据权利要求3所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：在步骤一中利用磁珠分离法分离人体单细胞。
6.根据权利要求1或2所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：在步骤三中利用染色法进行细胞重编程效率检测。
7.根据权利要求3所述的一种临床级iPS的诱导和筛选方法，其特征在于：在步骤三中利用染色法进行细胞重编程效率检测。
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