ES2862676T3 - Producción de células precursoras hematopoyéticas multilinaje mediante programación genética - Google Patents

Producción de células precursoras hematopoyéticas multilinaje mediante programación genética Download PDF

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Junying Yu
Maksym Vodyanyk
Jeffrey Sasaki
Deepika Rajesh
Sarah Burton
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Abstract

Un método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes que comprende: (a) proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden al menos una construcción de expresión que codifica genes de programación precursores hematopoyéticos, en los que los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden un gen ETS/ERG, GATA2, y HOXA9; y (b) cultivar las células madre pluripotentes bajo condiciones tales que se expresan los genes de programación precursores hematopoyéticos, produciendo de esta manera células precursoras hematopoyéticas (HPC), en el que el gen ETS/ERG es ERG (homólogo del oncogén del virus de eritroblastosis E26 v-ets), ETV2 (variante ets 2), FLI-1 (integración 1 del virus de la leucemia Friend), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS), ETS1 (C-ets- 1), o ETS2 (C-ets-2).

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de células precursoras hematopoyéticas multilinaje mediante programación genética
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular, las células madre y las células diferenciadas. Más particularmente, se refiere a la programación de células madre pluripotentes (PSC) hacia linajes celulares específicos, particularmente células hematopoyéticas y precursoras de células hematopoyéticas.
2. Descripción de la técnica relacionada
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son las únicas células con la capacidad de autorrenovarse de por vida, diferenciarse en todos los tipos de células sanguíneas y reconstituir todo el sistema hematopoyético luego del trasplante. Estas células, junto con sus tipos de células derivadas diferenciadas terminalmente, tales como eritrocitos, plaquetas, granulocitos y células linfoides, tienen aplicaciones terapéuticas bien establecidas en el tratamiento de diversos trastornos sanguíneos y, más recientemente, cánceres. Sin embargo, la disponibilidad limitada de HSC de donantes vivos compatibles con HLA impone una restricción importante a su amplio uso en las clínicas. Por tanto, se han realizado esfuerzos considerables para derivar HSC a partir de tipos celulares alternativos. Se conocen métodos generales para proporcionar hematopoyéticos y precursores de células hematopoyéticas de una variedad de fuentes celulares, tales como células madre pluripotentes o células somáticas (WO 2012/109208A2).
Un enfoque para derivar HSC a partir de tipos celulares alternativos es transdiferenciar tipos de células somáticas no HSC en HSC. Se han utilizado varias combinaciones de transgenes para transdiferenciar fibroblastos de ratón en progenitores hematopoyéticos no injertables (Pereira et al., 2013; Batta et al., 2014). Sin embargo, este enfoque está limitado debido al número de células primarias iniciales junto con una baja eficiencia de transdiferenciación. Por lo tanto, hay una falta de métodos que proporcionen un suministro ilimitado de células precursoras hematopoyéticas que tengan el potencial de injerto a largo plazo.
Las células madre embrionarias humanas (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son capaces de una proliferación ilimitada in vitro, al tiempo que retienen el potencial para diferenciarse en todos los tipos de células somáticas. Por lo tanto, las ESC humanas y las iPSC podrían proporcionar un suministro ilimitado de células sanguíneas funcionales y de células sanguíneas hematopoyéticas específicas del paciente para aplicaciones in vitro e in vivo. La diferenciación de las PSC humanas a células de linaje hematopoyético in vitro recapitula el desarrollo in vivo normal, incluidas las etapas de inducción del mesodermo y la especificación de precursores hematopoyéticos multipotentes. Por tanto, se han desarrollado numerosos métodos para diferenciar las PSC humanas en linajes hematopoyéticos mediante programación directa.
Sin embargo, actualmente no se dispone de ningún método para permitir la generación robusta de HSC que sean capaces de una diferenciación mieloide y linfoide eficaz y un injerto a largo plazo de las PSC, principalmente debido a la naturaleza compleja de la ontogenia hematopoyética. En un método, se ha demostrado que la sobreexpresión de transgenes como HoxB4 y Lhx2 para la diferenciación hematopoyética de PSC de ratón genera células similares a HSC injertables (Kyba et al. 2002; Kitajima et al., 2011). Sin embargo, estos transgenes no pudieron generar HSC a partir de PSC humanas. En otro método, Doulatov et al. informaron que una combinación de transgenes ERG, HOXA9, RORA, SOX4 y MYB en PSC humanas permitió la producción de progenitores hematopoyéticos que eran capaces de diferenciación mieloide y eritroide (Doulatov et al., 2013). Sin embargo, este método solo generó células capaces de injerto a corto plazo que dependían de la expresión continua del transgén. Por tanto, aunque la programación genética demuestra ser un enfoque muy prometedor, hay una falta de métodos que permitan la generación robusta de células precursoras hematopoyéticas capaces de potencial linfoide y mieloide y de injerto a largo plazo a partir de PSC humanas in vitro.
Resumen de la invención
Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan métodos para la programación eficaz de células madre pluripotentes humanas en progenitores hematopoyéticos de múltiples linajes. En una primera realización, se proporciona un método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas (HPC) a partir de células madre pluripotentes que comprende proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden al menos una construcción de expresión que codifica genes de programación precursores hematopoyéticos, en el que los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden un gen ETS/ERG, GATA2 y HOXA9, y cultivar las células madre pluripotentes en condiciones tales que los genes de programación precursores hematopoyéticos se expresen, produciendo así células precursoras hematopoyéticas, en las que el gen ETS/ERG es ERG (homólogo del oncogén E26 del virus de la eritroblastosis v-ets), ETV2 (variante 2 de ets), FLI-1 (integración 1 del virus de la leucemia de Friend), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS), ETS1 (C-ets-1) o ETS2 (C-ets-2). En ciertos aspectos, las HPC son capaces de diferenciarse en linajes mieloides y linfoides. En algunos aspectos, las células madre pluripotentes son células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En ciertos aspectos, las células madre pluripotentes son humanas.
En ciertos aspectos, la construcción de expresión es una construcción de expresión basada en transposón o episomal. En algunos aspectos, los genes de programación de precursores hematopoyéticos están bajo el control de un solo promotor. En aspectos particulares, el promotor único es un promotor inducible. En un aspecto específico, el promotor inducible es un promotor inducible por tetraciclina.
En aspectos adicionales, el método para producir células precursoras hematopoyéticas comprende además cultivar las HPC en condiciones tales que los genes de programación precursores hematopoyéticos no se expresen. En ciertos aspectos, las HPC se cultivan en ausencia de células estromales. En algunos aspectos, las HPC se cultivan en medio definido o sin suero. En ciertos aspectos, las HPC se pueden diferenciar en dos o más tipos de células seleccionados del grupo que consiste en células plasmáticas, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, mastocitos, megacariocitos, eritrocitos, granulocitos, linfocitos, monocitos, leucocitos y trombocitos. En ciertos aspectos, el linfocito es un linfocito B y/o un linfocito T.
En algunos aspectos, el cultivo de las células madre pluripotentes en condiciones tales que los genes de programación precursores hematopoyéticos se expresan es de aproximadamente cuatro a aproximadamente diez días.
En ciertos aspectos, las HPC expresan uno o más marcadores precursores hematopoyéticos. En algunos aspectos, los marcadores precursores hematopoyéticos se seleccionan del grupo que consiste en CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a y CD41a. En aspectos particulares, el uno o más marcadores precursores hematopoyéticos se seleccionan del grupo que consiste en CD43, CD45 y CD34. En algunos aspectos, las HPC son HPC inmaduras. En ciertos aspectos, las HPC inmaduras expresan CD34 y CD43. En algunos aspectos, al menos el 50 por ciento de las HPC son HPC inmaduras, como al menos el 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de las HPC. En otros aspectos, al menos el 70 por ciento de las HPC son HPC inmaduras. Incluso en otros aspectos, al menos el 90 por ciento de las HPC son HPC inmaduras.
En aspectos particulares, el gen ETS/ERG es ERG o ETV2.
En algunos aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2 y HOXA9. En otros aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2 y HOXA9.
En ciertos aspectos, los genes de programación del precursor hematopoyético se fusionan con una secuencia de direccionamiento. Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio del mismo. En ciertos aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10. En otros aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10.
En aspectos adicionales, las PSC que comprenden al menos una construcción de expresión que codifica genes de programación de precursores hematopoyéticos comprenden además al menos una construcción de expresión adicional que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas.
Incluso en aspectos adicionales, el método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes comprende además cultivar las HPC en condiciones tales que uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se expresen, produciendo así células madre hematopoyéticas (HSC) capaz de injerto a largo plazo en un mamífero. En ciertos aspectos, el mamífero es un ser humano. En algunos aspectos, uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667, y ZNF682. En ciertos aspectos, uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4a 2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 y MSI2. En aspectos particulares, el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 y RBAK.
En algunos aspectos, la expresión de uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas es constitutiva en las HPC. En ciertos aspectos, la expresión de uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se silencia esencialmente en las células madre pluripotentes.
En ciertos aspectos, los genes de programación de células madre hematopoyéticas se fusionan con una secuencia de direccionamiento. En aspectos particulares, la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio del mismo.
En otra realización, se proporciona un método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes que comprende proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden una construcción de expresión que codifica ERG, GATA2 y HOXA9 bajo el control de un solo promotor, y cultivar las células madre pluripotentes en condiciones tales que se expresen ERG, GATA2 y HOXA9, produciendo así células precursoras hematopoyéticas (HPC).
En otra realización más, se proporciona un método in vitro para producir células madre hematopoyéticas (HSC) a partir de células madre pluripotentes que comprende proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden una construcción de expresión que codifica ERG, GATA2 y HOXA9 bajo el control de un solo promotor y al menos una segunda construcción de expresión que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas, cultivando las células madre pluripotentes en condiciones tales que ERG, GATA2, HOXA9 y uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se expresan, produciendo así HSC capaz de injerto a largo plazo en un mamífero.
En una realización adicional, se proporciona una construcción de expresión que codifica genes de programación de precursores hematopoyéticos, en la que los genes de programación comprenden un gen ETS/ERG, GATA2 y HOXA9. En algunos aspectos, la construcción es una construcción de expresión basada en transposones o episomas. En ciertos aspectos, los genes de programación de precursores hematopoyéticos están bajo el control de un solo promotor. En algunos aspectos, el promotor único es un promotor inducible. En aspectos particulares, el promotor inducible es un promotor inducible por tetraciclina. En algunos aspectos, el gen eTs /ERG es ERG (homólogo del oncogén E26 del virus de la eritroblastosis v-ets), ETV2 (variante 2 de ets), FLI-1 (integración 1 del virus de la leucemia de Friend), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS), ETS1 (C-ets-1) o ETS2 (C-ets-2). En aspectos específicos, el gen ETS/ERG es ERG o ETV2. En algunos aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2 y HOXA9. En otros aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2 y HOXA9. En ciertos aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos se fusionan con una secuencia diana. En aspectos particulares, la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio del mismo. En algunos aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10. En otros aspectos, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden Et V2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10.
En otra realización, se proporciona una célula que comprende la construcción de expresión que codifica genes de programación precursores hematopoyéticos, en la que los genes de programación comprenden un gen ETS/ERG, GATA2 y HOXA9.
Como divulgación, se proporciona una construcción de expresión que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas. Como divulgación particular, el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en BCL2, BEND4, BMI1, CIiTa , EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667, y ZNF682. Como cierto aspecto de la divulgación, el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 y MSI2. Como divulgación particular, el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 y RBAK. Como cierto aspecto de la divulgación, uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas están bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV). Como aspecto adicional de la divulgación, los genes de programación de células madre hematopoyéticas se fusionan con una secuencia de direccionamiento. En un aspecto específico de la divulgación, la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio del mismo.
Como descripción adicional, se proporciona una célula que comprende la construcción de expresión que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas.
Como otra divulgación más, se proporciona una célula madre hematopoyética, diferenciada in vitro de una célula madre pluripotente humana, capaz de injertarse en la médula ósea de un mamífero y producir células sanguíneas humanas diferenciadas.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia de esta descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar más ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este documento.
Fig. 1A-1F. La coexpresión ligada de ETV2/ERG, GATA2 y HOXA9 programa de manera eficiente las PSC humanas a progenitores hematopoyéticos CD34+ inmaduros. (A) Se muestran las configuraciones probadas de los genes de programación ETV2/ERG, GATA2 y HOXA9. (B) Las configuraciones de genes inductivos de E G, EG y EGH se probaron usando PSC humanas diseñadas para expresar constitutivamente la proteína rtTET para la expresión génica inducible por doxiciclina (DOX). (C) Recuento absoluto de células en cultivos inducidos en el día 8 en configuraciones génicas basadas en ETV2 y ERG. (D) Se muestran los potenciales de expansión y diferenciación de las células inducidas por DOX del día 8 en cocultivo con células estromales MS5. (E) Recuentos absolutos de células CD43+ totales y CD43+ CD34+ inmaduras después de un cocultivo de 2 semanas con células estromales MS5. (F) Se detectó potencial de formación de colonias multilinaje en células inducidas por EGH después de 2 semanas de cocultivo con estroma MS5.
Fig. 2: Expresión del transgén posterior a la inducción utilizando el promotor de CMV (pCMV). Las construcciones pCMV-EGFP y pTight-EG se introdujeron en PSC humanas que expresan rtTET usando vectores de expresión PiggyBac. La expresión de EGFP en células CD43+ se muestra siguiendo la programación hematopoyética inducida por DOX.
Fig. 3A-3C: detección de transgenes complementarios de EGH que mejoran la expansión y confieren expresión de CD133 de progenitores hematopoyéticos primitivos. (A) Las células inducidas por EGH con expresión constitutiva de HOXA10 (pCMV) muestran una población menor de células CD43+CD34+CD133+ asociadas con las células parecidas a células madre más primitivas después de un cocultivo de 2 semanas con estroma MS5. (B) Esquema del modelo de cribado ideado para detectar genes complementarios de EGH para la producción mejorada de células primitivas CD43+CD34+ y CD43+CD34+CD133+. (C) Se muestran los resultados del cribado de genes que demuestran un efecto positivo sobre la expansión de progenitores primitivos inducidos por EGH. Puntuación = P34 * P133 * (P34/P45), donde P - producción del subconjunto respectivo calculado como una fracción del control interno de EGH, 34 - CD43+ CD34+, 133 - CD43+CD34+CD133+, 45 - células CD43/45+CD34-.
Fig. 4A-4B: potencial de diferenciación linfoide de células inducidas por EGH. (A) Esquema del modelo de detección ideado para detectar genes que mejoran el desarrollo de células linfoides a partir de células inducidas por EGH. (B) Análisis de citometría de flujo de cultivos de diferenciación de células B y T/NK de 4 semanas.
Fig. 5A-5C: potencial de injerto de células inducidas por EGH. (A) Esquema del modelo de cribado ideado para detectar genes complementarios de EGH que permiten el injerto hematopoyético en ratones inmunodeprimidos. (B) Se muestra la detección de células CD45+ hematopoyéticas humanas en sangre periférica y médula ósea de ratones NBSGW 12 semanas después de la inyección. (C) Se muestra la detección de células CD43/45+ hematopoyéticas humanas en sangre periférica y médula ósea de ratones NBSGW 12 semanas después de la inyección.
Fig. 6: Gráfico que muestra una relación de expresión transgénica en células injertadas frente a células inyectadas. Las respectivas relaciones de expresión injertadas/inyectadas muestran enriquecimiento (valores positivos) o agotamiento (valores negativos) de transgenes después del trasplante celular.
Descripción de realizaciones ilustrativas
La presente divulgación supera varios problemas importantes con las tecnologías actuales al proporcionar métodos y composiciones para producir células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes a partir de células madre pluripotentes (PSC). En particular, las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes se pueden programar en células madre hematopoyéticas capaces de injertarse a largo plazo. Los inventores han descubierto que una forma de lograr células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes es transfectar las PSC con uno o más vectores de expresión que efectúan la expresión de al menos tres genes específicos cuya expresión modera una “programación directa” de las PSC en múltiples linajes. células precursoras hematopoyéticas. En particular, los métodos de la presente divulgación se aplican a cualquier tipo de células madre pluripotentes, incluidas, por ejemplo, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. En particular, los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes tienen el potencial de diferenciarse eficazmente en células de linaje mieloide y linfoide.
Preferiblemente, los genes de programación hematopoyética son ETV2 o ERG, GATA2 y HOXA9. En aspectos particulares, los genes de programación hematopoyética están bajo el control de un solo promotor, tal como un promotor inducible. Generalmente, los genes de programación directa hematopoyética se expresan solo durante un período de tiempo suficiente para programar las PSC en células precursoras hematopoyéticas.
Una vez que se forman los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes inmaduros, los inventores han descubierto que se prefiere dar un paso o pasos adicionales para hacer que las células madre hematopoyéticas sean capaces de un injerto a largo plazo. En un método, las PSC se transfectan con una o más construcciones de expresión adicionales que codifican uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas cuya expresión permite que los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes se injerten de forma estable in vivo. En ciertos aspectos, el gen o genes de programación de células madre hematopoyéticas para el injerto a largo plazo se expresan en las células precursoras hematopoyéticas inmaduras, pero no se expresan en las PSC.
Por tanto, los métodos de la presente divulgación proporcionan un número ilimitado de precursores hematopoyéticos y células madre hematopoyéticas de múltiples linajes para una amplia gama de aplicaciones tales como el trasplante estable de los precursores hematopoyéticos in vivo, el cribado de compuestos in vitro y elucidar los mecanismos de enfermedades y lesiones hematológicas.
I. Definiciones
Como se usa en el presente documento, “esencialmente libre”, en términos de un componente especificado, se usa en el presente documento para significar que ninguno de los componentes especificados se ha formulado a propósito en una composición y/o está presente solo como un contaminante o en cantidades traza. Por tanto, la cantidad total del componente especificado resultante de cualquier contaminación no intencionada de una composición está muy por debajo del 0.05 %, preferiblemente por debajo del 0.01 %. La más preferida es una composición en la que no se puede detectar ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos estándar.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, “un” o “una” pueden significar uno o más. Como se usa aquí en la reivindicación (s), cuando se usa junto con la palabra “que comprende”, las palabras “un” o “una” pueden significar uno o más de uno.
El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente para referirse solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y “y/o”. Como se usa en este documento, “otro” puede significar al menos un segundo o más.
A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
El término “exógeno”, cuando se usa en relación con una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido en una célula u organismo, se refiere a una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido que se ha introducido en la célula u organismo. por medios artificiales o naturales; o en relación con una célula, el término se refiere a una célula que fue aislada y posteriormente introducida en otras células o en un organismo por medios artificiales o naturales. Un ácido nucleico exógeno puede ser de un organismo o célula diferente, o puede ser una o más copias adicionales de un ácido nucleico que se encuentra naturalmente dentro del organismo o célula. Una célula exógena puede ser de un organismo diferente o puede ser del mismo organismo. A modo de ejemplo no limitativo, un ácido nucleico exógeno es uno que se encuentra en una ubicación cromosómica diferente de dónde estaría en las células naturales, o está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente a la que se encuentra en la naturaleza.
Por “construcción de expresión” o “casete de expresión” se entiende una molécula de ácido nucleico que es capaz de dirigir la transcripción. Una construcción de expresión incluye, como mínimo, uno o más elementos de control de la transcripción (como promotores, potenciadores o una estructura funcionalmente equivalente de los mismos) que dirigen la expresión génica en uno o más tipos de células, tejidos u órganos deseados. También se pueden incluir elementos adicionales, como una señal de terminación de la transcripción.
Un “vector” o “construcción” (a veces denominado sistema de administración de genes o “vehículo” de transferencia de genes) se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprenden un polinucleótido que se administrará a una célula huésped, ya sea in vitro o en vivo.
Un “plásmido”, un tipo común de vector, es una molécula de ADN extracromosómico separada del ADN cromosómico que es capaz de replicarse independientemente del ADN cromosómico. En ciertos casos, es circular y de doble cadena.
Un “origen de replicación” (“ori”) o “origen de replicación” es una secuencia de ADN, por ejemplo, en un virus del herpes linfotrófico, que cuando está presente en un plásmido en una célula es capaz de mantener secuencias enlazadas en el plásmido. y/o un sitio en o cerca de donde se inicia la síntesis de ADN. Como ejemplo, un ori para EBV incluye secuencias FR (20 copias imperfectas de una repetición de 30 pb) y preferiblemente secuencias DS; sin embargo, otros sitios en EBV se unen a EBNA-1, por ejemplo, las secuencias Rep* pueden sustituir al DS como origen de replicación (Kirshmaier y Sugden, 1998). Por tanto, un origen de replicación de EBV incluye secuencias FR, DS o Rep* o cualquier secuencia funcionalmente equivalente a través de modificaciones de ácidos nucleicos o combinaciones sintéticas derivadas de las mismas. Por ejemplo, los presentes métodos también pueden usar el origen de replicación del VEB modificado genéticamente, como por inserción o mutación de elementos individuales, como se describe específicamente en Lindner et al., 2008.
Un “gen”, “polinudeótido”, “región codificante”, “secuencia”, “segmento”, “fragmento” o “transgén” que “codifica” una proteína en particular, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe y opcionalmente también se traduce en un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, la molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla (es decir, la cadena codificante) o de cadena doble. Los límites de una región codificante están determinados por un codón de inicio en el terminal 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el terminal 3' (carboxi). Un gen puede incluir, pero no se limita a, ADNc de ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN procariótico o eucariótico y secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción se ubicará normalmente en 3' con respecto a la secuencia del gen.
El término “elementos de control” se refiere colectivamente a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en la dirección ascendente de la cadena, orígenes de replicación, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES), potenciadores, uniones de empalme y similares, que colectivamente proporcionan para la replicación, transcripción, procesamiento postranscripcional y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todos estos elementos de control estén presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula huésped apropiada.
El término “promotor” se usa en el presente documento en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación (dirección 3') dirección descendente de la cadena. Puede contener elementos genéticos a los que se pueden unir proteínas y moléculas reguladoras, como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las frases “posicionado operativamente”, “ligado operativamente”, “bajo control” y “bajo control transcripcional” significan que un promotor está en una ubicación funcional y/u orientaciones correctas en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio transcripcional y/o expresión de esa secuencia.
Por “potenciador” se entiende una secuencia de ácido nucleico que, cuando se coloca próxima a un promotor, confiere una actividad de transcripción aumentada en relación con la actividad de transcripción resultante del promotor en ausencia del dominio potenciador.
Por “enlazado operativamente” o coexpresado “con referencia a moléculas de ácido nucleico se entiende que dos o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico a transcribir, un promotor y un elemento potenciador) están conectadas de tal manera que permita la transcripción de la molécula de ácido nucleico. “Unida operativamente” o “coexpresada” con referencia a moléculas de péptidos y/o polipéptidos significa que dos o más moléculas de péptidos y/o polipéptidos están conectadas de tal manera que, para producir una única cadena polipeptídica, es decir, un polipéptido de fusión, que tiene al menos una propiedad de cada péptido y/o componente polipeptídico de la fusión. El polipéptido de fusión es preferiblemente quimérico, es decir, compuesto de moléculas heterólogas.
“Homología” se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y otra se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas de polipéptido alineando la información de secuencia y utilizando programas informáticos fácilmente disponibles. Alternativamente, la homología puede determinarse mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que promuevan la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa o nucleasas específicas de cadena única y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN, o dos polipéptidos, son “sustancialmente homólogas” entre sí cuando al menos aproximadamente el 80 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 90 %, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % de los nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, coinciden sobre una longitud definida de las moléculas, determinada utilizando los métodos anteriores.
El término “célula” se usa aquí en su sentido más amplio en la técnica y se refiere a un cuerpo vivo que es una unidad estructural de tejido de un organismo multicelular, está rodeado por una estructura de membrana que lo aísla del exterior, tiene la capacidad de autorreplicarse, y tiene información genética y un mecanismo para expresarla. Las células utilizadas en el presente documento pueden ser células de origen natural o células modificadas artificialmente (por ejemplo, células de fusión, células modificadas genéticamente, etc.).
El término “célula madre” se refiere en el presente documento a una célula que, en condiciones adecuadas, es capaz de diferenciarse en un rango diverso de tipos de células especializadas, mientras que en otras condiciones adecuadas es capaz de autorrenovarse y permanecer en un estado pluripotente esencialmente indiferenciado. El término “célula madre” también abarca una célula pluripotente, una célula multipotente, una célula precursora y una célula progenitora. Pueden obtenerse células madre humanas ejemplares a partir de células madre hematopoyéticas o mesenquimales obtenidas de tejido de la médula ósea. También se pueden producir células madre pluripotentes ejemplares a partir de células somáticas reprogramándolas a un estado pluripotente mediante la expresión de ciertos factores de transcripción asociados con la pluripotencia; estas células se denominan “células madre pluripotentes inducidas” o “iPSC”.
Una “célula madre embrionaria (ES)” es una célula pluripotente indiferenciada. Solo como referencia, puede obtenerse de un embrión en una etapa temprana, como la masa celular interna en la etapa de blastocisto, o producirse por medios artificiales (por ejemplo, transferencia nuclear). Puede dar lugar a cualquier tipo de célula diferenciada en un embrión o un adulto, incluidas las células germinales (por ejemplo, espermatozoides y óvulos).
Las “células madre pluripotentes inducidas (iPSC)” son células generadas reprogramando una célula somática expresando o induciendo la expresión de una combinación de factores (denominados aquí factores de reprogramación). Las iPSC se pueden generar utilizando células somáticas fetales, postnatales, recién nacidas, juveniles o adultas. En determinadas realizaciones, los factores que pueden usarse para reprogramar células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, Oct4 (a veces denominado como Oct 3/4), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog y Lin28. En algunas realizaciones, las células somáticas se reprograman expresando al menos dos factores de reprogramación, al menos tres factores de reprogramación, al menos cuatro factores de reprogramación o al menos cinco factores de reprogramación para reprogramar una célula somática en una célula madre pluripotente.
“Célula madre pluripotente” se refiere a una célula madre que tiene el potencial de diferenciarse en todas las células que constituyen uno o más tejidos u órganos, o preferiblemente, cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital) o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso).
Como se usa en el presente documento, el término “célula somática” se refiere a cualquier célula distinta de las células germinales, como un óvulo, un espermatozoide o similares, que no transfiere directamente su ADN a la siguiente generación. Normalmente, las células somáticas tienen una pluripotencia limitada o nula. Las células somáticas utilizadas en este documento pueden ser de origen natural o genéticamente modificadas.
La “programación” es un proceso que altera el tipo de progenie que puede producir una célula. Por ejemplo, una célula se ha programado cuando se ha alterado para que pueda formar la progenie de al menos un nuevo tipo de célula, ya sea en cultivo o in vivo, en comparación con lo que habría podido formar en las mismas condiciones sin programación. Esto significa que después de una proliferación suficiente, se observa una proporción mensurable de la progenie que tiene características fenotípicas del nuevo tipo de célula, si es que esencialmente no se pudo formar tal progenie antes de la programación; alternativamente, la proporción que tiene características del nuevo tipo de celda es considerablemente mayor que antes de la programación. Este proceso incluye diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación.
La “diferenciación” es el proceso mediante el cual una célula menos especializada se convierte en un tipo de célula más especializada. La “desdiferenciación” es un proceso celular en el que una célula diferenciada parcial o terminalmente vuelve a una etapa de desarrollo anterior, como pluripotencia o multipotencia. La “transdiferenciación” es un proceso de transformación de un tipo de célula diferenciada en otro tipo de célula diferenciada. Normalmente, la transdiferenciación por programación se produce sin que las células pasen por una etapa de pluripotencia intermedia, es decir, las células se programan directamente desde un tipo de célula diferenciada a otro tipo de célula diferenciada. En determinadas condiciones, la proporción de progenie con características del nuevo tipo de célula puede ser de al menos aproximadamente 1 %, 5 %, 25 % o más en orden de preferencia creciente.
El término “programación directa” se refiere a la programación de una célula multipotente o pluripotente, en oposición a una célula somática diferenciada que no tiene pluripotencia, mediante la provisión de uno o más genes determinantes de linaje o productos génicos específicos a la célula pluripotente o multipotente. Por ejemplo, la programación directa puede describir el proceso de programación de ESC o iPSC en células precursoras hematopoyéticas u otras células precursoras, o en células hematopoyéticas u otras células somáticas diferenciadas.
El término “gen de programación precursor hematopoyético” es un gen que, cuando se expresa solo o en combinación con otro gen de programación, es capaz de programar directamente células madre pluripotentes en células precursoras hematopoyéticas capaces de producir células de linaje linfoide y mieloide.
El término “gen de programación de células madre hematopoyéticas” es un gen que, cuando se expresa solo o en combinación con otro gen de programación, es capaz de programar células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo en combinación con genes de programación precursores hematopoyéticos.
Como se usa en el presente documento, las “secuencias 2A” se refieren a péptidos cortos que permiten la coexpresión de múltiples proteínas a partir de un solo vector. Estos pequeños péptidos se pueden introducir como enlazadores entre dos proteínas, lo que permite el autoprocesamiento intraribosómico autónomo de poliproteínas (véase, por ejemplo, de Felipe. Genetic Vaccines y Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Se conocen en la técnica muchos elementos 2A. Ejemplos de secuencias 2A que se pueden usar en los métodos y sistemas divulgados en este documento, sin limitación, incluyen secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A), el virus A de la rinitis equina (E2A), el virus Aquellosa asigna (T2A), y teschovirus-1 porcino (P2A) como se describe en la publicación de patente de EE.UU. No. 20070116690.
Como se usa en este documento, el término “sujeto” o “sujeto que lo necesita” se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que necesita un trasplante de células o tejidos. Normalmente el sujeto está en necesidad de trasplante de células o tejidos (también denominado en el presente documento receptor) debido a un trastorno o una afección, estado o síndrome patológico o no deseado, o una anomalía física, morfológica o fisiológica susceptible de tratamiento mediante trasplante de células o tejidos.
La “construcción de múltiples linajes” se usa en el presente documento para hacer referencia a una construcción que codifica al menos tres genes de programación hematopoyética que incluyen un gen ETS, un gen homeobox y un gen de desarrollo hematopoyético. Una construcción ejemplar codifica ETV2 o ERG, GATA2 y HOXA9.
Como se usa en este documento, el término “injerto” con respecto a células madre hematopoyéticas o células precursoras hematopoyéticas significa que las células que se introducen en un receptor se localizan en la médula ósea del receptor y pueden proporcionar reconstitución a largo plazo tanto de linajes de células mieloides y linfoides en ese receptor.
El “injerto a largo plazo” se define en el presente documento como el trasplante estable de células tales como las células precursoras hematopoyéticas proporcionadas por los métodos del presente documento en un receptor tal que las células trasplantadas persistan en la sangre y/o médula ósea del huésped más de 10 semanas, preferiblemente más de 20 semanas. Además, el injerto a largo plazo puede caracterizarse por la persistencia de células de trasplante en ratones trasplantados en serie.
II. Células involucradas en la programación de células hematopoyéticas
En determinadas realizaciones, se divulgan métodos y composiciones para proporcionar células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes a partir de células madre pluripotentes. Las células madre pluripotentes pueden ser células madre que incluyen, pero no se limitan a, células madre pluripotentes inducidas y células madre embrionarias.
Las células madre pluripotentes utilizadas en los presentes métodos para producir células precursoras hematopoyéticas se caracterizan por la capacidad de renovarse a sí mismas mediante la división de células mitóticas y la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células especializadas. Los dos tipos generales de células madre de mamíferos son: células madre embrionarias que se encuentran en blastocistos y células madre adultas que se encuentran en tejidos adultos. En un embrión en desarrollo, las células madre pueden diferenciarse en todos los tejidos embrionarios especializados. En los organismos adultos, las células madre y las células progenitoras actúan como un sistema de reparación para el cuerpo, reponiendo células especializadas y también mantienen la renovación normal de los órganos regenerativos, como la sangre, la piel o los tejidos intestinales.
En aspectos particulares, las células madre pluripotentes utilizadas en este documento son células madre embrionarias humanas (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que son capaces de proliferar a largo plazo in vitro, conservando el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo, incluidas las células precursoras hematopoyéticas de la presente divulgación. Por tanto, estas células podrían proporcionar potencialmente un suministro ilimitado de células hematopoyéticas funcionales específicas del paciente tanto para el desarrollo de fármacos como para usos terapéuticos. Ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan células precursoras hematopoyéticas de linaje múltiple mediante programación directa a partir de PSC humanas tales como ESC e iPSC mediante la expresión de una combinación de genes de programación importantes para la diferenciación/función de las células hematopoyéticas.
A. Células madre embrionarias
En determinados aspectos, las células madre pluripotentes como células madre embrionarias (ESC). Como referencia, las células ES embrionarias derivan de la masa celular interna de blastocistos y tienen una alta capacidad de diferenciación in vitro. Las células ES embrionarias se pueden aislar eliminando la capa externa del trofectodermo de un embrión en desarrollo y luego cultivando las células de la masa interna en una capa alimentadora de células que no crecen. Las células replantadas pueden continuar proliferando y producir nuevas colonias de células ES que pueden eliminarse, disociarse, volverse a sembrar y dejar crecer. Este proceso de “subcultivo” de células ES indiferenciadas puede repetirse varias veces para producir estirpes celulares que contienen células ES indiferenciadas (Patentes de Estados Unidos No. 5,843,780; 6,200,806; 7,029,913). Las células ES embrionarias tienen el potencial de proliferar mientras mantienen su pluripotencia. Por ejemplo, las células ES embrionarias son útiles en la investigación de células y genes que controlan la diferenciación celular. La pluripotencia de las células ES embrionarias combinada con la manipulación y selección genética se puede utilizar para estudios de análisis de genes in vivo mediante la generación de ratones transgénicos, quiméricos y modificados.
Los métodos para producir células ES de ratón son bien conocidos. En un método, un blastocisto de preimplantación de la cepa 129 de ratones se trata con antisuero de ratón para eliminar el trofectodermo, y la masa celular interna se cultiva en una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados químicamente en un medio que contiene suero de ternero fetal. Las colonias de células ES no diferenciadas que se desarrollan se subcultivan en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón en presencia de suero de ternero fetal para producir poblaciones de células ES. En algunos métodos, las células ES de ratón se pueden cultivar en ausencia de una capa alimentadora añadiendo el factor inhibidor de la leucemia de citocinas (LIF) al medio de cultivo que contiene suero (Smith, 2000). En otros métodos, las células ES de ratón pueden cultivarse en medio sin suero en presencia de proteína morfogenética ósea y LIF (Ying et al., 2003).
Las células ES humanas pueden producirse o derivarse de la patogénesis o la reprogramación de la cromatina y la posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula embrionaria mediante métodos previamente descritos (Thomson y Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000). En algunos métodos, las células ES humanas se pueden cultivar sin suero cultivando las células ES en una capa alimentadora de fibroblastos en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Amit et al., 2000). En otros métodos, las células ES humanas se pueden cultivar sin una capa de células alimentadoras cultivando las células en una matriz de proteína como MATRIGEL ™ o laminina en presencia de medio “acondicionado” que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (Xu et al., 2001).
Como referencia, las células ES también pueden derivarse de otros organismos, incluidos el mono rhesus y el tití, mediante métodos descritos anteriormente (Thomson y Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson y Odorico, 2000; Patente de EE. UU. No. 5,843,780), así como de estirpes celulares de ratón y humanas establecidas. Por ejemplo, las estirpes celulares ES humanas establecidas incluyen MAOI, MA09, ACT-4, HI, H7, H9, H13, H14 y ACT30. Como ejemplo adicional, las estirpes de células ES de ratón que se han establecido incluyen la estirpe celular CGR8 establecida a partir de la masa celular interna de los embriones de la cepa 129 de ratón, y los cultivos de células CGR8 se pueden cultivar en presencia de LIF sin capas alimentadoras.
Las células madre ES pueden detectarse mediante marcadores de proteínas que incluyen el factor de transcripción Oct4, fosfatasa alcalina (AP), antígeno embrionario específico de estadio SSEA-1, antígeno embrionario específico de estadio SSEA-3, antígeno embrionario específico de estadio SSEA-4, factor de transcripción NANOG, antígeno de rechazo tumoral 1-60 (TRA-1-60), antígeno de rechazo tumoral 1-81 (TRA-1-81), SOX2 o REX1.
B. Células madre pluripotentes inducidas
En otros aspectos, las células madre pluripotentes utilizadas en este documento son células madre pluripotentes inducidas (iPS), comúnmente abreviadas como células iPS o iPSC. La inducción de pluripotencia se logró originalmente en 2006 utilizando células de ratón (Yamanaka et al. 2006) y en 2007 utilizando células humanas (Yu et al. 2007; Takahashi et al. 2007) mediante la reprogramación de células somáticas mediante la introducción de factores de transcripción que están vinculados a la pluripotencia. El uso de iPSC evita la mayoría de los problemas éticos y prácticos asociados con el uso clínico a gran escala de células madre embrionarias, y los pacientes con trasplantes autólogos derivados de iPSC pueden no requerir tratamientos inmunosupresores de por vida para prevenir el rechazo del injerto.
Con la excepción de las células germinales, cualquier célula puede usarse como punto de partida para las iPSC. Por ejemplo, los tipos de células podrían ser queratinocitos, fibroblastos, células hematopoyéticas, células mesenquimales, células hepáticas o células del estómago. Las células T también se pueden usar como fuente de células somáticas para reprogramación (patente de EE.UU. No. 8,741,648). No hay limitación sobre el grado de diferenciación celular o la edad de un animal del que se recolectan las células; incluso células progenitoras indiferenciadas (incluidas las células madre somáticas) y finalmente se pueden usar células maduras diferenciadas como fuentes de células somáticas en los métodos divulgados en este documento.
Las células somáticas se pueden reprogramar para producir células madre pluripotentes inducidas (iPSC) usando métodos conocidos por un experto en la técnica. Un experto en la técnica puede producir fácilmente células madre pluripotentes inducidas, véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense publicada No. 20090246875, la solicitud de patente estadounidense publicada No. 2010/0210014; Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No.
20120276636; Patente de Estados Unidos No. 8,058,065; Patente de Estados Unidos No. 8,129,187; Patente de Estados Unidos No. 8,268,620; Publicación PCT NO. WO 2007/069666 A1 y Patente de Estados Unidos No.
8,268,620. Generalmente, los factores de reprogramación nuclear se utilizan para producir células madre pluripotentes a partir de una célula somática. En algunas realizaciones, se utilizan al menos tres, o al menos cuatro, de Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28. En otras realizaciones, se utilizan Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4.
Las secuencias de ADNc de ratón y humano de estas sustancias de reprogramación nuclear están disponibles con referencia a los números de acceso de NCBI mencionados en el documento WO 2007/069666 y la patente de EE.UU. No. 8,183,038. Los métodos para introducir una o más sustancias de reprogramación, o ácidos nucleicos que codifican estas sustancias de reprogramación, se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU.
Nos. 8,268,620, 8,691,574, 8,741,648, 8,546,140, en la patente publicada de EE.UU No. 8,900,871 y en la patente de EE.UU No. 8,071,369.
Una vez derivadas, las iPSC se pueden cultivar en un medio suficiente para mantener la pluripotencia. Las iPSC se pueden usar con diversos medios y técnicas desarrolladas para cultivar células madre pluripotentes, más específicamente, células madre embrionarias, como se describe en la patente de EE.UU. No. 7,442,548 y la publicación de patente de EE.UU. No. 2003/0211603. En el caso de células de ratón, el cultivo se realiza con la adición de Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) como factor de supresión de la diferenciación a un medio ordinario. En el caso de células humanas, es deseable añadir factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en lugar de LIF. Con los presentes métodos se pueden usar otros métodos para el cultivo y mantenimiento de iPSC, como sabrá un experto en la técnica.
En determinadas realizaciones, se pueden utilizar condiciones indefinidas; por ejemplo, las células pluripotentes pueden cultivarse en células alimentadoras de fibroblastos o en un medio que ha sido expuesto a células alimentadoras de fibroblastos para mantener las células madre en un estado indiferenciado. En algunas realizaciones, la célula se cultiva en copresencia de fibroblastos embrionarios de ratón tratados con radiación o un antibiótico para terminar la división celular, como células alimentadoras. Alternativamente, las células pluripotentes se pueden cultivar y mantener en un estado esencialmente indiferenciado utilizando un sistema de cultivo definido, independiente del alimentador, como un medio TESR ™ (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) o Medio E8 ™/Essential 8 ™ (Chen et al., 2011).
Los plásmidos se han diseñado con una serie de objetivos en mente, como lograr un alto número de copias regulado y evitar posibles causas de inestabilidad de plásmidos en bacterias, y proporcionar medios para la selección de plásmidos que sean compatibles con el uso en células de mamíferos, incluidas las células humanas. Se ha prestado especial atención a los requisitos duales de los plásmidos para su uso en células humanas. En primer lugar, son adecuados para el mantenimiento y la fermentación en E. coli, por lo que se pueden producir y purificar grandes cantidades de ADN. En segundo lugar, son seguros y adecuados para su uso en pacientes humanos y animales. El primer requisito requiere plásmidos de alto número de copias que puedan seleccionarse y mantenerse de manera estable con relativa facilidad durante la fermentación bacteriana. El segundo requisito llama la atención sobre elementos tales como marcadores seleccionables y otras secuencias de codificación. En algunas realizaciones, los plásmidos que codifican un marcador se componen de: (1) un origen de replicación de alto número de copias, (2) un marcador seleccionable, tal como, pero no limitado a, el gen neo para la selección de antibióticos con kanamicina, (3) transcripción secuencias de terminación, que incluyen el potenciador de tirosinasa y (4) un sitio de multiclonación para la incorporación de varios casetes de ácido nucleico; y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador unido operativamente al promotor de tirosinasa. Existen numerosos vectores plásmidos que se conocen en la técnica para inducir un ácido nucleico que codifica una proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, los vectores descritos en la Patente de Estados Unidos No. 6,103,470; Patente de Estados Unidos No. 7,598,364; Patente de Estados Unidos No. 7,989,425; y Patente de Estados Unidos No. 6,416,998.
Un sistema de administración de genes episomales puede ser un plásmido, un vector episomal basado en el virus de Epstein-Barr (EBV) (Patente de EE.UU. 8,546,140), un vector basado en levadura, un vector basado en adenovirus, un vector episomal basado en virus de simio 40 (SV40), un vector basado en el virus del papiloma bovino (BPV) o un vector lentiviral. Un sistema de administración de genes virales puede ser un vector viral basado en ARN o en ADN (PCT/JP2009/062911).
C. Células madre embrionarias derivadas por transferencia nuclear de células somáticas
Las células madre pluripotentes para producir las células precursoras hematopoyéticas también podrían prepararse mediante transferencia nuclear de células somáticas, en la que un núcleo donante se transfiere a un ovocito sin huso. Las células madre producidas por transferencia nuclear son genéticamente idénticas a los núcleos del donante. En un método, los núcleos de fibroblastos del donante de los fibroblastos de la piel de un macaco rhesus se introducen en el citoplasma de ooctyes de macaco rhesus maduros en metafase II sin huso mediante electrofusión (Byrne et al., 2007). Los ovocitos fusionados se activan por exposición a ionomicina y luego se incuban hasta la etapa de blastocisto. La masa celular interna de los blastocistos seleccionados se cultiva luego para producir estirpes de células madre embrionarias. Las estirpes de células madre embrionarias muestran una morfología de células madre embrionarias normal, expresan varios marcadores de células madre embrionarias y se diferencian en múltiples tipos de células tanto in vitro como in vivo.
III. Factores de programación de células precursoras hematopoyéticas
A. Factores de programación de precursores hematopoyéticos
Ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan construcciones que codifican genes de programación de precursores hematopoyéticos para programar p Sc en células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes. Las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes de la presente divulgación podrían producirse directamente a partir de células madre pluripotentes modificando las PSC para expresar al menos tres genes de programación precursores hematopoyéticos tales como un gen ETS, un gen de desarrollo hematopoyético y un gen homoebox. Los al menos tres genes de programación de precursores hematopoyéticos pueden estar codificados por una o más construcciones de múltiples linajes.
El gen de programación del precursor hematopoyético se puede fusionar con una secuencia conocida en la técnica para la expansión de las células precursoras hematopoyéticas (publicación de patente estadounidense No. US20080299095). Una secuencia ejemplar es NUP98 o un homeodominio del mismo.
1. Genes ETS
La construcción o construcciones de múltiples linajes codifican al menos un gen de la familia de factores de transcripción específicos de transformación E26 (ETS). Todos los miembros de la familia ETS se identifican a través de un dominio de unión de ADN altamente conservado, el dominio ETS, que es una estructura de hélice-giro-hélice alada que se une a sitios de ADN con una secuencia de ADN central GGA (A/T). Además de las funciones de unión al ADN, la evidencia sugiere que el dominio ETS también está involucrado en interacciones proteína-proteína. La familia ETS está presente en todo el cuerpo y participa en una amplia variedad de funciones que incluyen la regulación de la diferenciación celular, el control del ciclo celular, la migración celular, la proliferación celular, la apoptosis (muerte celular programada) y la angiogénesis. Los miembros de esta familia de genes han estado implicados en el desarrollo de diferentes tejidos, así como en la progresión del cáncer.
El gen ETS puede ser cualquier gen de la familia ETS que se divide en 12 subfamilias que incluyen ELF, ELG, ERG, ERF, ESE, ETS, PDEF, PEA3, ER71, SPI, TCF y TEL. Por ejemplo, el ETS podría ser ERG (homólogo del oncogén del virus de la eritroblastosis v-ets E26; número de acceso NM_001136154), ETV2 (variante 2 de ets; número de acceso NC_000019.10), FLI-1 (integración del virus de leucemia Friend 1; número de acceso NM_001167681), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS; número de acceso NM_001303511), ETS1 (C-ets-1; número de acceso Nm_001143820), ETS2 (C-ets-2; número de acceso NM_001256295), factor similar al E741 (ELF1; número de acceso M_001145353), factor 2 similar al E74 (ELF2; número de acceso NM_001276457), factor de transcripción relacionado con ETS (ELf4; número de acceso NM_001127197), variante 3 de Ets (ETV3; número de acceso NM_001145312), o factor de transcripción PU.1 (SPI1; número de acceso NM_001080547). En particular, el gen ETS podría ser el factor de diferenciación endotelial llamado ERG, que también se conoce como: regulador transcripcional ERG, proteína transformante relacionada con ets ERG, TMPRSS2-ERG específico del cáncer de próstata, oncogén del virus de la eritroblastosis v-ets E26 como, v- ets virus de la eritroblastosis aviar E26 relacionado con el oncogén o proteína transformante ERG. En algunas realizaciones, el gen ETS es una isoforma particular de ERG, tal como la isoforma 2 de ERG (ERG-2) (número de acceso NM_004449) o la isoforma 3 de ERG (ERG-3) (número de acceso NM_001136154). En realizaciones particulares, el gen ETS es ETV2.
2. Genes de desarrollo hematopoyético
La construcción o construcciones de múltiples linajes también codifican al menos un gen de desarrollo hematopoyético. El gen del desarrollo hematopoyético podría ser cualquier gen que induzca el desarrollo hematopoyético. Los ejemplos no limitantes del gen de desarrollo hematopoyético incluyen GFI1 (represor de la transcripción 1 independiente del factor de crecimiento; número de acceso NM_001127215), GFI1B (represor de la transcripción 1B independiente del factor de crecimiento; número de acceso NM_001135031), TAL1 (leucemia linfocítica aguda de células T; número de acceso No. NM_001287347), LYL1 (secuencia derivada de leucemia linfoblástica 1; No. de acceso NM_005583), LMO2 (dominio LIM solo 2 (similar a rombotina 1); No. de acceso M_001142315), GATA2 (proteína de unión a GATA 2; No. de acceso NM_001145661), o GATA3 (proteína de unión a GATA 3; número de acceso NM_001002295). En realizaciones particulares, el gen de desarrollo hematopoyético es GATA2.
3. Genes Homeobox
Además, la construcción o construcciones de múltiples linajes codifican al menos un gen homeobox. Los genes homeobox codifican un homeobox de aproximadamente 180 pares de bases de largo que codifica un dominio de proteína que se une al ADN. El pliegue característico de la proteína del homeodominio consiste en una estructura de hélice-vuelta-hélice (HTH) de 60 aminoácidos en la que tres hélices alfa están conectadas por regiones de bucle corto. Las dos hélices N-terminales son antiparalelas y la hélice C-terminal más larga es aproximadamente perpendicular a los ejes establecidos por las dos primeras. Es esta tercera hélice la que interactúa directamente con el ADN a través de una serie de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas, que ocurren entre cadenas laterales específicas y las bases expuestas y los grupos de timina metilo dentro del surco principal del ADN. Muchas proteínas de homeodominio inducen la diferenciación celular iniciando las cascadas de genes corregulados necesarios para producir tejidos y órganos individuales.
El gen homeobox puede ser cualquier gen que codifique un dominio homeobox. Por ejemplo, el gen homeobox podría ser un gen HOX como HOXA9 (número de acceso NM_152739), HOXA10 (número de acceso NM_018951), HOXA3 (número de acceso NM_030661), HOXA4 (número de acceso n M_002141), HOXA5 (número de acceso NM_019102), HOXA6 (número de acceso n M_024014), HOXA7 (número de acceso NM_006896), HOXB3 (número de acceso NM_002146) o HOXB6 (número de acceso NM_018952). Otros ejemplos no limitantes de genes HOX incluyen homeobox neuroprotector dependiente de la actividad (ADNP; número de acceso NM_001282531), proteína Homeobox tipo aristaless 4 (ALX4; número de acceso NM_021926), proteína Homeobox DBX1 (número de acceso NM_001029865), homeobox doble 4 (DUX4; NM_001127386), proteína Homeobox EMX1 (número de acceso NM_001040404), GBX2 (número de acceso NM_001301687), Homeobox expresado en células ES 1 (HESX1; número de acceso NM_003865), NANOG (número de acceso NM_001297698), PAx 3 (No. de acceso NM_000438), homeobox de retina y pliegue neural anterior (RAX; No. de acceso NM_013435), o homeobox 1 de unión a caja E de dedos de zinc (ZEB1; No. de acceso NM_001128128). En realizaciones particulares, el gen homeobox es HOXA9.
B. Factores de programación de células madre hematopoyéticas
Ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan construcciones que codifican factores de programación de células madre hematopoyéticas para el potencial de injerto a largo plazo. Las células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo podrían producirse directamente a partir de las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes de la presente divulgación aumentando el nivel de genes de programación de células madre hematopoyéticas, en particular los genes enumerados en la Tabla 1, en las células. Los inventores también contemplan que todas las isoformas y variantes de los genes enumerados en esta sección estén incluidas en la presente divulgación y se proporcionan ejemplos no limitantes de números de acceso para ciertas isoformas o variantes.
La Tabla 1 proporciona una lista de genes para programar precursores hematopoyéticos de múltiples linajes en células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo. Toda la secuencia de genes y la información relacionada proporcionada por el ID de gen y los números de acceso enumerados se incorporan por la presente como referencia a partir de la fecha de presentación de esta solicitud.
Tabla 1: Genes de programación de células madre hematopoyéticas para potencial de injerto a largo plazo.
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En algunas realizaciones, un gen de programación de células madre hematopoyéticas es uno cualquiera de los genes incluidos en la Tabla 1, que incluye genes implicados en la especificación de células hematopoyéticas, genes implicados en el mantenimiento y/o proliferación de células hematopoyéticas y genes expresados en células hematopoyéticas.
En determinadas realizaciones, se utilizan uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas en combinación para programar en células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo. En algunas realizaciones, tres o más, tales como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, hasta 20 o cualquier rango derivado de las mismas, los genes de programación de células madre hematopoyéticas se utilizan en combinación para la programación de células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo.
El gen de programación de células madre hematopoyéticas se puede fusionar con una secuencia conocida en la técnica para la expansión de las células precursoras hematopoyéticas (publicación de patente estadounidense No. US20080299095). Una secuencia ejemplar es NUP98 o un homeodominio del mismo.
IV. Suministro de genes de programación hematopoyética
En determinadas realizaciones, los vectores para el suministro de ácidos nucleicos que codifican factores de programación se construyen para expresar esos factores en las células madre pluripotentes. Los detalles de los componentes de dichos vectores y métodos de administración se describen a continuación.
En un aspecto adicional, los siguientes sistemas y métodos también pueden usarse en la administración de un casete de expresión informadora para la identificación de los tipos de células deseados, tales como células precursoras hematopoyéticas. En particular, se puede usar un elemento regulador específico para células madre hematopoyéticas o precursores hematopoyéticos para impulsar la expresión de un gen indicador. Por tanto, las células madre hematopoyéticas o los precursores derivados de la programación pueden caracterizarse, seleccionarse o enriquecerse mediante el uso del informador.
A. Sistemas de suministro de ácido nucleico
Un experto en la técnica estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 y Ausubel et al., 1996). Los vectores incluyen, entre otros, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC), como vectores retrovirales (por ejemplo, Derivados de vectores del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV, etc.), vectores lentivirales (por ejemplo, derivados de VIH-1, VIH-2, SIV, BIV, VIF, etc.), vectores adenovirales (Ad) que incluyen replicación competente, replicación deficiente y formas sin intestino de los mismos, adeno vectores virales asociados (AAV), vectores del virus simio 40 (SV-40), vectores del virus del papiloma bovino, vectores del virus de Epstein-Barr, vectores del virus del herpes, vectores del virus de la vacuna, vectores del virus del sarcoma murino de Harvey, vectores del virus del tumor mamario murino, vectores del virus del sarcoma de Rous.
1. Vectores virales
Se pueden proporcionar vectores virales en ciertos aspectos de la presente divulgación. Al generar vectores virales recombinantes, los genes no esenciales se reemplazan típicamente con un gen o secuencia codificante de una proteína heteróloga (o no nativa). Un vector viral es un tipo de construcción de expresión que utiliza secuencias virales para introducir ácido nucleico y posiblemente proteínas en una célula. La capacidad de ciertos virus para infectar células o ingresar a las células a través de endocitosis mediada por receptores, y para integrarse en los genomas de la célula huésped y expresar genes virales de manera estable y eficiente los ha convertido en candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños a las células (por ejemplo, células de mamíferos). A continuación, se describen ejemplos no limitantes de vectores de virus que pueden usarse para administrar un ácido nucleico de ciertos aspectos de la presente divulgación.
Los retrovirus son prometedores como vectores de administración de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del huésped, transferir una gran cantidad de material genético extraño, infectar un amplio espectro de especies y tipos de células y empaquetarse en estirpes celulares especiales (Miller, 1992).
Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es de replicación defectuosa. Para producir viriones, se construye una estirpe celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env, pero sin los componentes de empaquetamiento y LTR (Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un cDNA, junto con la lTr retroviral y las secuencias de empaquetamiento, se introduce en una estirpe celular especial (por ejemplo, Mediante precipitación con fosfato de calcio), la secuencia de empaquetamiento permite empaquetar la transcripción de ARN del plásmido recombinante en partículas virales, que luego se secretan en el medio de cultivo (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). A continuación, se recoge el medio que contiene los retrovirus recombinantes, se concentra opcionalmente y se utiliza para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células huésped (Paskind et al., 1975).
Los lentivirus son retroviruses complejos, que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; Patentes de Estados Unidos 6,013,516 y 5,994,136).
Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar células que no se dividen y se pueden usar para la transferencia de genes y la expresión de secuencias de ácido nucleico tanto in vivo como ex vivo. Por ejemplo, el lentivirus recombinante capaz de infectar una célula que no se divide, en el que una célula huésped adecuada se transfecta con dos o más vectores que llevan las funciones de empaquetamiento, a saber, gag, pol y env, así como rev y tat, se describe en la patente estadounidense 5,994,136.
2. Vectores episomales
El uso de vectores extracromosómicos (es decir, episomales) basados en plásmidos o liposomas también puede proporcionarse en ciertos aspectos de la presente divulgación. Dichos vectores episomales pueden incluir, por ejemplo, vectores basados en o oriP y/o vectores que codifican un derivado de EBNA-1. Estos vectores pueden permitir que se introduzcan grandes fragmentos de ADN en una célula y se mantengan extracromosómicamente, se repliquen una vez por ciclo celular, se dividan en células hijas de manera eficaz y no provoquen sustancialmente ninguna respuesta inmunitaria.
En particular, EBNA-1, la única proteína viral requerida para la replicación del vector de expresión basado en oriP, no provoca una respuesta inmune celular porque ha desarrollado un mecanismo eficiente para evitar el procesamiento requerido para la presentación de sus antígenos. en moléculas de MHC de clase I (Levitskaya et al., 1997). Además, EBNA-1 puede actuar en trans para potenciar la expresión del gen clonado, induciendo la expresión de un gen clonado hasta 100 veces en algunas estirpes celulares (Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). Finalmente, la fabricación de tales vectores de expresión basados en oriP es económica.
Otros vectores extracromosómicos incluyen otros vectores basados en el virus del herpes linfotrófico. El virus del herpes linfotrófico es un virus del herpes que se replica en un linfoblasto (por ejemplo, Un linfoblasto B humano) y se convierte en un plásmido durante una parte de su ciclo de vida natural. El virus del herpes simple (HSV) no es un virus del herpes “linfotrófico”. Los virus del herpes linfotróficos ejemplares incluyen, pero no se limitan a EBV, virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV); Herpes virus saimiri (HS) y virus de la enfermedad de Marek (MDV). También se contemplan otras fuentes de vectores basados en episomas, tales como levadura ARS, adenovirus, SV40 o BPV.
Un experto en la técnica estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar (ver, por ejemplo, Maniatis et al., 1988 y Ausubel et al., 1994).
Los vectores también pueden comprender otros componentes o funcionalidades que modulan adicionalmente el suministro de genes y/o la expresión de genes, o que de otro modo proporcionan propiedades beneficiosas a las células diana. Dichos otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influyen en la unión o direccionamiento a las células (incluidos componentes que median en la unión de tipo celular o específica de tejido); componentes que influyen en la absorción del ácido nucleico del vector por la célula; componentes que influyen en la localización del polinucleótido dentro de la célula después de la absorción (como agentes que median la localización nuclear); y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido.
Dichos componentes también pueden incluir marcadores, tales como marcadores detectables y/o de selección que pueden usarse para detectar o seleccionar células que han captado y están expresando el ácido nucleico liberado por el vector. Dichos componentes pueden proporcionarse como una característica natural del vector (como el uso de ciertos vectores virales que tienen componentes o funcionalidades que median la unión y la absorción), o los vectores pueden modificarse para proporcionar tales funcionalidades. Se conoce en la técnica una gran variedad de tales vectores y generalmente están disponibles. Cuando un vector se mantiene en una célula huésped, el vector puede ser replicado de manera estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, incorporado dentro del genoma de la célula huésped o mantenido en el núcleo o citoplasma de la célula huésped.
3. Sistema basado en transposones
En ciertos aspectos, la entrega de factores de programación puede usar un sistema transposón-transposasa. Por ejemplo, el sistema transposón-transposasa podría ser el conocido Sleeping Beauty, el sistema transposóntransposasa Frog Prince (para una descripción de este último, ver, por ejemplo, EP1507865), o el sistema PiggyBac de transposón específico de TTAA.
Los transposones son secuencias de ADN que pueden moverse a diferentes posiciones dentro del genoma de una sola célula, un proceso llamado transposición. En el proceso, pueden causar mutaciones y cambiar la cantidad de ADN en el genoma. Los transposones también se denominaron una vez genes saltarines y son ejemplos de elementos genéticos móviles.
Existe una variedad de elementos genéticos móviles, y se pueden agrupar en función de su mecanismo de transposición. Los elementos genéticos móviles de Clase I, o retrotransposones, se copian a sí mismos primero se transcriben a ARN, luego se transcriben de nuevo a ADN mediante transcriptasa inversa y luego se insertan en otra posición del genoma. Los elementos genéticos móviles de clase II se mueven directamente de una posición a otra utilizando una transposasa para “cortarlos y pegarlos” dentro del genoma.
En realizaciones particulares, las construcciones (por ejemplo, la construcción de linaje múltiple) proporcionadas en la presente divulgación usan un sistema de expresión PiggyBac. Los transposones de ADN PiggyBac (PB) se movilizan a través de un mecanismo de “cortar y pegar” mediante el cual una enzima transposasa (PB transposasa), codificada por el transposón mismo, escinde y reintegra el transposón en otros sitios dentro del genoma. La transposasa PB reconoce específicamente las repeticiones terminales invertidas de PB (ITR) que flanquean el transposón; se une a estas secuencias y cataliza la escisión del transposón. Luego, PB se integra en sitios TTAA en todo el genoma, de una manera relativamente aleatoria. Para la creación de mutaciones de trampa de genes (o adaptadas para generar animales transgénicos), la transposasa se suministra en trans en un plásmido y se cotransfecta con un plásmido que contiene transposón donante, un transposón recombinante que comprende una trampa de genes flanqueada por los sitios de unión para la transposasa (ITR). La transposasa catalizará la escisión del transposón del plásmido y la posterior integración en el genoma. La integración dentro de una región codificante capturará los elementos necesarios para la expresión de la trampa de genes. PB posee varias propiedades ideales: (1) se inserta preferentemente dentro de los genes (50 a 67 % de las inserciones de genes de acierto) (2) no exhibe saltos locales (cobertura genómica generalizada) (3) no es sensible a la inhibición de la sobreproducción en cuyos niveles elevados de transposasa provocan una disminución de la transposición 4) se escinde limpiamente de un sitio donante, sin dejar “huella”, a diferencia de la Bella Durmiente.
4. Recombinación homóloga
En ciertos aspectos, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en las células de una manera específica para la ingeniería del genoma, por ejemplo, mediante recombinación homóloga. Como se discutió anteriormente, algunos enfoques para expresar genes en células implican el uso de vectores virales o transgenes que se integran aleatoriamente en el genoma. Sin embargo, estos enfoques tienen el inconveniente de que la integración se produce en sitios que no pueden mediar eficazmente la expresión del nucleico integrado o que dan como resultado la alteración de genes nativos. Los problemas asociados con la integración aleatoria podrían superarse parcialmente mediante recombinación homóloga con un locus específico en el genoma diana, por ejemplo, el locus Rosa26.
La recombinación homóloga (HR), también conocida como recombinación general, es un tipo de recombinación genética utilizada en todas las formas de vida en las que se intercambian secuencias de nucleótidos entre dos cadenas de ADN similares o idénticas. La técnica ha sido el método estándar para la ingeniería del genoma en células de mamíferos desde mediados de la década de 1980. El proceso implica varios pasos de ruptura física y la eventual reunión del ADN. Este proceso se utiliza más ampliamente para reparar roturas de doble cadena potencialmente letales en el ADN. Además, la recombinación homóloga produce nuevas combinaciones de secuencias de ADN durante la meiosis, el proceso mediante el cual los eucariotas producen células germinales como los espermatozoides y los óvulos. Estas nuevas combinaciones de ADN representan una variación genética en la descendencia que permite que las poblaciones se adapten evolutivamente a las condiciones ambientales cambiantes a lo largo del tiempo. La recombinación homóloga también se utiliza en la transferencia horizontal de genes para intercambiar material genético entre diferentes cepas y especies de bacterias y virus. La recombinación homóloga también se utiliza como técnica en biología molecular para introducir cambios genéticos en los organismos diana.
La recombinación homóloga se puede usar como modificación del genoma dirigido. La eficacia de la HR estándar en células de mamífero es de sólo 10-6 a 10-9 de las células tratadas (Capecchi, 1990). El uso de meganucleasas o endonucleasas autodirigidas, como I-SceI, se ha utilizado para aumentar la eficacia de la HR. Tanto las meganucleasas naturales como las meganucleasas manipuladas con especificidades de direccionamiento modificadas se han utilizado para aumentar la eficiencia de la frecuencia cardíaca (Pingoud y Silva, 2007; Chevalier et al., 2002).
En el camino hacia el aumento de la eficiencia de la HR ha sido la ingeniería de endonucleasas quiméricas con dominios de especificidad de ADN programables (Silva et al., 2011). Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) son un ejemplo de una molécula quimérica en la que los dominios de unión al ADN de los dedos de zinc se fusionan con el dominio catalítico de una endonucleasa de restricción de tipo IIS como FokI (como se revisó en Durai et al., 2005).
Otra clase de tales moléculas de especificidad incluye dominios de unión a ADN activadores de transcripción como efectores (TALE) fusionados al dominio catalítico de una endonucleasa de restricción de tipo IIS tal como FokI (Miller et al., 2011; PCT/IB2010/000154). Los TALEN pueden diseñarse para la modificación del genoma de un sitio específico en prácticamente cualquier sitio de interés determinado (Cermak et al., 2011; Christian et al., 2010; Li et al., 2011; Miller et al., 2011; Weber et al., 2011; Zhang et al., 2011). El dominio de unión al ADN específico del sitio se expresa como una proteína de fusión con una enzima de escisión del ADN como Fok I. El dominio de unión al ADN es un andamio de aminoácidos repetidos; uniendo cada una de las repeticiones hay dos aminoácidos variables que se unen a un solo nucleótido en el ADN. Por ejemplo, Asn-Asn se une a la guanosina, Asn-Ile se une a la adenosina, Asn-Gly se une a la timidina y His-Asp se une a la citosina. Estos dos aminoácidos se conocen como Diresidue variable de repetición o RVD. Hay muchos RVD diferentes y se pueden diseñar en la construcción de la proteína TAL Effector/Fok1 para crear un TALEN específico. El ARN que codifica el TALEN recombinante puede luego purificarse y transfectarse en una célula para la modificación del genoma específico del sitio. Una vez que TALEN introduce la ruptura del ADN de doble cadena, el ADN puede modificarse mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o mediante reparación dirigida homóloga (HDR). Esto permite mutagénesis, deleciones o adiciones del ADN dependiendo de qué secuencias adicionales estén presentes durante la reparación del ADN.
B. Elementos regulatorios
Los casetes de expresión incluidos en los vectores útiles en la presente divulgación contienen preferiblemente (en una dirección 5' a 3') un promotor transcripcional eucariota unido operativamente a una secuencia codificante de proteína, señales de empalme que incluyen secuencias intermedias y una terminación transcripcional/secuencia de poliadenilación.
1. Promotor/Potenciadores
Las construcciones de expresión proporcionadas en el presente documento comprenden un promotor para impulsar la expresión de los genes de programación. Un promotor generalmente comprende una secuencia que funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, como, por ejemplo, el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que se superpone al sitio de inicio en sí ayuda a fijar el lugar de inicio. Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Normalmente, estos se encuentran en la región 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores también contienen elementos funcionales cadena abajo del sitio de inicio. Para llevar una secuencia codificante “bajo el control de un promotor, se coloca el extremo 5 'del sitio de inicio de la transcripción del marco de lectura transcripcional “en la dirección descendente de la cadena” de (es decir, 3' de) el promotor elegido. El promotor “en la dirección ascendente de la cadena” estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del ARN codificado.
El espaciamiento entre los elementos promotores es frecuentemente flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí. En el promotor tk, el espaciamiento entre los elementos del promotor puede incrementarse a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción. Un promotor puede utilizarse o no junto con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.
Un promotor puede ser uno asociado naturalmente con una secuencia de ácido nucleico, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' ubicadas cadena arriba del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor puede denominarse “endógeno”. De manera similar, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, ubicado cadena abajo o cadena arriba de esa secuencia. Alternativamente, se obtendrán ciertas ventajas colocando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo también se refiere a un potenciador que normalmente no está asociado con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otro virus, o célula procariota o eucariota, y promotores o potenciadores que no “ocurren naturalmente”, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción. y/o mutaciones que alteran la expresión. Por ejemplo, los promotores que se usan más comúnmente en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas de promotores de p-lactamasa (penicilinasa), lactosa y triptófano (trp). Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores de forma sintética, las secuencias se pueden producir usando clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácido nucleico, incluida PCR™, en relación con las composiciones divulgadas en este documento (véanse las patentes de EE.UU. Nos. 4,683,202 y 5,928,906 cada una incorporada aquí como referencia). Además, se contempla que las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos y similares, también se pueden emplear.
Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, tipo celular, tejido, órgano u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, incorporado en este documento como referencia). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.
Además, cualquier combinación de promotor/potenciador (según, por ejemplo, la base de datos de promotores eucariotes EPDB, a través de la World Wide Web en epd.isb-sib.ch/) también podría usarse para impulsar la expresión. El uso de un sistema de expresión citoplásmico T3, T7 o SP6 es otra posible realización. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplasmática de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de administración o como una construcción de expresión genética adicional.
Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen promotores virales tempranos o tardíos, tales como promotores tempranos o tardíos de SV40, promotores tempranos inmediatos de citomegalovirus (CMV), promotores tempranos del virus del sarcoma de Rous (RSV); promotores de células eucariotas, tales como, e. ej., promotor de beta actina (Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), promotor GADPH (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), promotor de metalotioneína (Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); y promotores de elementos de respuesta concatenados, tales como promotores de elementos de respuesta de AMP cíclicos (cre), promotores de elementos de respuesta de suero (sre), promotores de ésteres de forbol (TPA) y promotores de elementos de respuesta (tre) cerca de una caja TATA mínima. También es posible utilizar secuencias promotoras de la hormona del crecimiento humana (por ejemplo, El promotor mínimo de la hormona del crecimiento humana descrito en Genbank, No. de acceso X05244, nucleótido 283­ 341) o un promotor de tumor mamario de ratón (disponible en ATCC, No. de cat. ATCC 45007).
La expresión transgénica específica de tejido, especialmente para la expresión del gen indicador en células hematopoyéticas y precursores de células hematopoyéticas derivadas de la programación, puede ser deseable como una forma de identificar células hematopoyéticas derivadas y precursores. Para aumentar tanto la especificidad como la actividad, se ha contemplado el uso de elementos reguladores que actúan en cis. Por ejemplo, puede usarse un promotor específico de células hematopoyéticas. Muchos de estos promotores específicos de células hematopoyéticas se conocen en la técnica, tales como los promotores de los genes hematopoyéticos proporcionados en la Tabla 1.
En ciertos aspectos, los presentes métodos también se refieren a secuencias potenciadoras, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que aumentan la actividad de un promotor y que tienen el potencial de actuar en cis, e independientemente de su orientación, incluso a distancias relativamente largas (hasta varias kilobases lejos del promotor objetivo). Sin embargo, la función potenciadora no está necesariamente restringida a distancias tan largas, ya que también pueden funcionar muy cerca de un promotor dado.
Se han identificado muchas secuencias promotoras y potenciadoras de células hematopoyéticas, y pueden ser útiles en los presentes métodos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,556,954; Solicitud de patente de EE. UU.
20020055144; Solicitud de patente de EE. UU. 20090148425.
En aspectos particulares, el promotor es un promotor inducible. La actividad de los promotores inducibles puede ser inducida por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. Los promotores inducibles son una herramienta muy poderosa en la ingeniería genética porque la expresión de genes ligados operativamente a ellos puede activarse o desactivarse en determinadas etapas del desarrollo de un organismo o en un tejido en particular. Por ejemplo, se pueden usar sistemas de expresión génica inducible Tet-On y Tet-Off basados en los componentes reguladores esenciales del operón de resistencia a tetraciclina de E. coli. Una vez establecido en las células de partida, el inductor doxiciclina (Dox, un derivado de la tetraciclina) podría controlar el sistema de expresión de manera dependiente de dosis, permitiendo la modulación precisa de los niveles de expresión de los genes programadores. En realizaciones ejemplares, el promotor inducible es un promotor Tight inducible por rtTET (pTight). Por lo tanto, el promotor pTight podría usarse para inducir la expresión de genes de programación de linaje múltiple como ETV2, GATA2 y HOXA9 durante un período de tiempo suficiente para permitir la programación de las PSC en células precursoras hematopoyéticas, y la expresión podría desactivarse posteriormente. El promotor pTight también podría ser un promotor bidireccional.
2. Señales de iniciación y expresión enlazadas
También puede usarse una señal de iniciación específica en las construcciones de expresión proporcionadas en los presentes métodos para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Se puede necesitar traducción exógena para proporcionar todas las señales de control, incluido el codón de iniciación ATG. Un experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente esto y proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de iniciación debe estar “en marco” con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Las señales de control de la traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.
En ciertas realizaciones, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) se usa para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de eludir el modelo de exploración de ribosomas de traducción dependiente de Cap metilada en 5 □ y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES se pueden vincular a marcos de lectura abiertos heterólogos. Se pueden transcribir juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Se pueden expresar de manera eficiente múltiples genes usando un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,925,565 y 5,935,819).
Además, ciertos elementos de la secuencia 2A podrían usarse para crear la expresión enlazada o coexpresión de genes de programación en las construcciones proporcionadas en la presente divulgación. Por ejemplo, las secuencias de escisión podrían usarse para coexpresar genes uniendo marcos de lectura abiertos para formar un solo cistrón. Una secuencia de escisión ejemplar es la F2A (virus de la fiebre aftosa 2A) o una secuencia “similar a 2A” (por ejemplo, El virus Thosea asigna 2A; T2A) (Minskaia y Ryan, 2013). En realizaciones particulares, se usa un péptido de escisión de F2A para unir la expresión de los genes en la construcción de múltiples linajes.
3. Orígenes de la replicación
Para propagar un vector en una célula huésped, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados “ori”), por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico correspondiente a oriP de EBV como se describió anteriormente o un gen oriP diseñado con una función similar o elevada en la programación, que es una secuencia de ácido nucleico específica en la que se inicia la replicación. Alternativamente, se puede emplear un origen de replicación de otro virus que se replica extracromosómicamente como se describió anteriormente o una secuencia de replicación autónoma (a Rs ).
4. Marcadores de selección y cribado
En determinadas realizaciones, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente divulgación pueden identificarse in vitro o in vivo mediante la inclusión de un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, lo que permitiría una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador de selección es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador de selección positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador de selección negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de marcador de selección positivo es un marcador de resistencia a fármacos.
Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores de selección útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes en función de la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores que incluyen marcadores cribables como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Alternativamente, se pueden utilizar enzimas detectables como marcadores de selección negativos tales como timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la técnica también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con el análisis Fa Cs . No se cree que el marcador utilizado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los expertos en la técnica conocen bien otros ejemplos de marcadores de selección y cribado.
C. Suministro de ácido nucleico
La introducción de un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, en las células madre pluripotentes para ser programadas a células precursoras hematopoyéticas con los presentes métodos puede usar cualquier método adecuado para el suministro de ácido nucleico para la transformación de una célula, como se describe en este documento o como sabrá un experto en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, el suministro directo de ADN tal como por transfección ex vivo (Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), por inyección (Patentes de Estados Unidos Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859), incluida la microinyección (Harland y Weintraub, 1985; Patente de Estados Unidos No. 5.789.215); por electroporación (patente de EE.Uu . No.
5,384,253, incorporada aquí como referencia; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); por precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfección mediada por liposoma (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); mediante bombardeo con microproyectiles (Solicitudes PCT Nos. WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de EE.UU. Nos. 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; Patentes de Estados Unidos No. 5,302,523 y 5,464,765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de Estados Unidos No. 5,591,616 y 5,563,055); por absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985), y cualquier combinación de tales métodos. Mediante la aplicación de técnicas como estas, los orgánulos, células, tejidos u organismos pueden transformarse de forma estable o transitoria.
1. Transfección mediada por liposomas
En una determinada realización, se puede introducir un ácido nucleico en la célula madre pluripotente mediante transfección mediada por liposomas. En este método, el ácido nucleico está atrapado en un complejo lipídico como, por ejemplo, un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). También se contempla un ácido nucleico complejado con Lipofectamine (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen). La cantidad de liposomas utilizada puede variar en función de la naturaleza del liposoma, así como de la célula utilizada, por ejemplo, se pueden contemplar de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 |ig de ADN de vector por 1 a 10 millones de células.
El suministro de ácido nucleico mediado por liposomas y la expresión de ADN externo in vitro ha tenido mucho éxito (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). También se ha demostrado la viabilidad de la liberación mediada por liposomas y la expresión de ADN extraño en embriones de pollo cultivados, células HeLa y de hepatoma (Wong et al., 1980).
En determinadas realizaciones, un liposoma puede formar complejos con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada celular de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, un liposoma puede formarse un complejo o emplearse junto con proteínas cromosómicas nucleares no histonas (HMG-1) (Kato et al., 1991). En otras realizaciones más, un liposoma puede complejarse o emplearse junto con HVJ y HMG-1. En otras realizaciones, un vehículo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma.
2. Electroporación
En determinadas realizaciones, se introduce un ácido nucleico en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante electroporación. La electroporación implica la exposición de una suspensión de células y ADN a una descarga eléctrica de alto voltaje. Las células receptoras pueden volverse más susceptibles a la transformación mediante heridas mecánicas. Además, la cantidad de vectores utilizados puede variar según la naturaleza de las células utilizadas, por ejemplo, se puede contemplar de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 |ig de ADN de vector por 1 a 10 millones de células.
La transfección de células eucariotas usando electroporación ha tenido bastante éxito. Se han transfectado linfocitos pre-B de ratón con genes de inmunoglobulina kappa humanos (Potter et al., 1984), y se han transfectado hepatocitos de rata con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Tur-Kaspa et al., 1986) de esta manera.
V. Métodos para producir células precursoras hematopoyéticas
A. Células precursoras hematopoyéticas multilinaje
La presente divulgación proporciona métodos para producir células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes a partir de células madre pluripotentes (PSC). Las PSC, como las ESC o las iPSC, se modifican genéticamente para expresar los genes de programación precursores hematopoyéticos descritos en el presente documento que programan directamente las PSC en células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes. En particular, los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes tienen el potencial de diferenciarse en células de linaje mieloide y linfoide. Preferiblemente, los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden un gen ETS, un gen de desarrollo hematopoyético y un gen homeobox. Los genes de programación de precursores hematopoyéticos ejemplares incluyen Ev T2 o ERG, GATA2 y HOXA9.
Los genes de programación de precursores hematopoyéticos adicionales, tales como HOXA10, pueden mejorar la eficacia de la programación directa. En algunos aspectos, el gen de programación hematopoyético se fusiona con una secuencia conocida en la técnica para la expansión de las células precursoras hematopoyéticas (publicación de patente estadounidense No. US20080299095). Una secuencia ejemplar es NUP98 o un homeodominio del mismo. En un método ejemplar, los genes de programación precursores hematopoyéticos incluyen EVT2 o ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10.
Los genes de programación de precursores hematopoyéticos pueden estar codificados por una o más construcciones de expresión. Preferiblemente, los genes están codificados por una construcción de expresión. De acuerdo con lo anterior, la expresión de los genes de programación del precursor hematopoyético puede estar bajo el control de un solo promotor. La expresión de los genes de programación hematopoyética se puede unir operativamente, por ejemplo, mediante elementos de secuencia IRES o 2A.
Preferiblemente, los tres genes de programación precursores hematopoyéticos se expresan solo durante un período de tiempo suficiente para programar las PSC en células precursoras hematopoyéticas. Por consiguiente, los genes de programación del precursor hematopoyético pueden estar bajo el control de un promotor inducible. Por tanto, la expresión de los genes de programación precursores hematopoyéticos se puede inducir en las PSC durante un período de tiempo suficiente para transmitir el programa a las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes. El período de tiempo puede ser de aproximadamente 1 día a aproximadamente 20 días, tal como aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días. Alternativamente, los genes de programación precursores hematopoyéticos pueden introducirse en las PSC mediante un vector episomal. Por tanto, los genes de programación precursores hematopoyéticos podrían expresarse de forma transitoria en las PSC.
Las células precursoras hematopoyéticas de linaje múltiple pueden cultivarse adicionalmente para producir células de linaje linfoide y mieloide, así como también programarse para obtener células madre hematopoyéticas injertables.
B. Células hematopoyéticas para injerto a largo plazo
Las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes pueden programarse adicionalmente para células madre hematopoyéticas capaces de injerto a largo plazo. Preferiblemente, las PSC o las células precursoras hematopoyéticas se transfectan con una o más construcciones de expresión adicionales que codifican uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas descritos en este documento (por ejemplo, Tabla 1) cuya expresión permite a los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes ser injertado de forma estable in vivo. Las una o más construcciones de expresión adicionales pueden introducirse en las PSC al mismo tiempo que las construcciones de múltiples linajes o después de que las PSC se hayan programado directamente a las células precursoras hematopoyéticas inmaduras.
Los genes de programación de células madre hematopoyéticas para el injerto a largo plazo pueden estar codificados por una o más construcciones de expresión. Preferiblemente, múltiples genes están codificados por una construcción de expresión. Por consiguiente, la expresión de uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas (es decir, genes de injerto a largo plazo) puede estar bajo el control de un único promotor. La expresión de los genes de injerto a largo plazo se puede unir operativamente, por ejemplo, mediante elementos de secuencia IRES o 2A.
En ciertos aspectos, el o los genes de programación de células madre hematopoyéticas para el injerto a largo plazo se expresan en los precursores hematopoyéticos de múltiples linajes y no se expresan en las PSC. Por consiguiente, el (los) gen (es) de programación de células madre hematopoyéticas pueden estar bajo el control de un promotor que está esencialmente silenciado en las PSC. En un método ejemplar, el gen de programación de células madre hematopoyéticas está bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV). Alternativamente, el o los genes de programación de células madre hematopoyéticas pueden estar bajo el control de un promotor inducible. Por tanto, la expresión del gen o genes de programación de células madre hematopoyéticas puede inducirse después de que las PSC se hayan programado de forma directa a las células precursoras hematopoyéticas de múltiples linajes. En otra alternativa más, la construcción o construcciones que codifican el gen o genes de programación de células madre hematopoyéticas se pueden transfectar en las células precursoras hematopoyéticas inmaduras después de que se hayan programado directamente desde las PSC.
C. Cultivo celular
Las células precursoras hematopoyéticas de linaje múltiple o las células madre hematopoyéticas capaces de un injerto a largo plazo pueden cultivarse en condiciones para el cultivo de células madre hematopoyéticas conocidas en la técnica. En particular, las células precursoras hematopoyéticas también se pueden cultivar en condiciones para derivar linajes hematopoyéticos específicos tales como linajes mieloides o linfoides.
En general, las células de la presente divulgación se cultivan en un medio de cultivo, que es una solución tamponada rica en nutrientes capaz de mantener el crecimiento celular. Los medios de cultivo adecuados para aislar, expandir y diferenciar células madre pluripotentes en células precursoras hematopoyéticas y células hematopoyéticas de acuerdo con el método descrito en este documento incluyen, entre otros, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, DMEM/F-15, Liebovitz L-15, RPMI 1640, medios Dubelcco modificados de Iscove (IMDM) y Opti-MEM SFM (Invitrogen Inc.). El medio químicamente definido comprende un medio esencial mínimo como el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) (Gibco), suplementado con albúmina sérica humana, lipoproteína Ex Cyte humana, transferrina, insulina, vitaminas, aminoácidos esenciales y no esenciales, piruvato de sodio, glutamina. y también es adecuado un mitógeno. Como se usa en este documento, un mitógeno se refiere a un agente que estimula la división de una célula. Un agente puede ser una sustancia química, generalmente alguna forma de proteína que estimula a una célula a comenzar la división celular, lo que desencadena la mitosis. En una realización, los medios libres de suero como los descritos en U.S. Ser. No. 08/464,599 y WO96/39487, y los “medios completos” como se describe en la patente de EE.UU. 5,486,359 se contempla para su uso con los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el medio de cultivo se complementa con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, suero autólogo humano, suero AB humano o plasma rico en plaquetas complementado con heparina (2U/ml). Los cultivos celulares pueden mantenerse en una atmósfera de CO2, por ejemplo, del 5 % al 12 %, para mantener el pH del fluido de cultivo, incubarse a 37 ° C en una atmósfera húmeda y pasarse para mantener una confluencia por debajo del 85 %.
Las células madre pluripotentes que se van a diferenciar en células hematopoyéticas y sus precursores pueden cultivarse en un medio suficiente para mantener la pluripotencia. El cultivo de células madre pluripotentes inducidas generadas en ciertos aspectos de la presente divulgación puede usar diversos medios y técnicas desarrolladas para cultivar células madre pluripotentes de primates, más especialmente, células madre embrionarias, como se describe en la Solicitud de patente de EE.UU. 20070238170 y la Solicitud de patente de EE.UU. 20030211603. Por ejemplo, al igual que las células madre embrionarias humanas, las células madre pluripotentes inducidas se pueden mantener en 80 % de DMEM/F12 (Gibco # 11330032 o # 11320082), 20 % de reemplazo de suero KnockOut, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 mM de L-glutamina, B-mercaptoetanol 0.1 mM y bFGF (4-100 ng/ml) (solicitud PCT WO 99/20741). Alternativamente, las células madre embrionarias humanas y las células iPS se pueden mantener en un medio sin suero definido químicamente, como mTeSR1.
Las células hematopoyéticas y sus precursores se pueden generar cultivando células madre pluripotentes u otras células no hematopoyéticas en un medio en condiciones que aumentan el nivel intracelular de factores de programación hematopoyéticos para que sean suficientes para promover la programación de las células en células precursoras hematopoyéticas. El medio también puede contener uno o más agentes de diferenciación y maduración de células hematopoyéticas, como varios tipos de factores de crecimiento. Estos agentes pueden ayudar a inducir a las células a comprometerse con un fenotipo más maduro, o promover preferentemente la supervivencia de las células maduras, o tener una combinación de ambos efectos. Los agentes de diferenciación y maduración de células precursoras hematopoyéticas y células hematopoyéticas pueden incluir factores de crecimiento solubles (hormonas peptídicas, citocinas, complejos ligando-receptor y otros compuestos) que son capaces de promover el crecimiento de células del linaje celular hematopoyético. Los ejemplos no limitantes de tales agentes incluyen, pero no se limitan a factores de crecimiento hematopoyéticos o endoteliales tales como factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), ligando FLT-3 (FLT3L), interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), interleucina-9 (IL-9) o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), o isoformas o variantes de los mismos.
VI. Características de las células precursoras hematopoyéticas y de las células madre hematopoyéticas
Las células precursoras hematopoyéticas y las células madre hematopoyéticas de la presente divulgación se pueden caracterizar de acuerdo con varios criterios fenotípicos. Los criterios incluyen, pero no se limitan a, la detección o cuantificación de los marcadores celulares expresados, la actividad funcional y la caracterización de las características morfológicas y la señalización intercelular. En otros aspectos, las células que se van a programar pueden comprender un casete de expresión del gen indicador que comprende elementos reguladores de la transcripción específicos de tejido o célula, como promotores específicos de células hematopoyéticas para la identificación de células hematopoyéticas.
Las células precursoras hematopoyéticas incorporadas en ciertos aspectos de la presente divulgación tienen rasgos morfológicos característicos de las células precursoras hematopoyéticas en la naturaleza. Las características son fácilmente apreciadas por los expertos en evaluar tales cosas e incluyen la detección de agrupaciones de células que producen células redondas no adherentes. Además, las células precursoras hematopoyéticas tienen una forma redondeada y una baja proporción de citoplasma a núcleo.
Las células de la presente divulgación también se pueden caracterizar según expresen ciertos marcadores característicos de las células del linaje celular hematopoyético. Ejemplos no limitantes de marcadores celulares útiles para distinguir células madre hematopoyéticas y precursores de células hematopoyéticas incluyen: CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a, CD38, CD90, CD133, CD105, CD117 (c-kit; el receptor de SCF), CD74 y CD41a. Por ejemplo, los precursores hematopoyéticos inmaduros capaces de diferenciarse en linajes mieloides y linfoides podrían distinguirse por ser positivos para CD43 y CD34. Para identificar las células que se han diferenciado de las células iniciales multipotentes, como las ESC o las iPSC, puede ser útil identificar las células que no expresan ciertos marcadores que están presentes en las células madre pluripotentes o en las células somáticas, como TRA-1-60, TRA-1-81, CD166 o CD140b.
La evaluación del nivel de expresión de dichos marcadores se puede determinar en comparación con otras células. Los controles positivos para los marcadores de células precursoras hematopoyéticas o células hematopoyéticas incluyen células hematopoyéticas adultas o células madre hematopoyéticas de la especie de interés y estirpes celulares hematopoyéticas establecidas. Se advierte al lector que las estirpes celulares permanentes o los cultivos de células hematopoyéticas a largo plazo pueden alterarse metabólicamente y no expresar ciertas características de las células hematopoyéticas primarias y las células precursoras hematopoyéticas. Los controles negativos incluyen células de un linaje separado, como una estirpe celular de fibroblastos adultos, células madre mesenquimales adultas o células epiteliales de pigmento retiniano (RpE). Las células madre indiferenciadas son positivas para algunos de los marcadores enumerados anteriormente, pero negativas para ciertos marcadores de células hematopoyéticas y células precursoras hematopoyéticas, como se ilustra en los ejemplos siguientes.
Los determinantes de oligosacáridos y proteínas hematopoyéticos específicos enumerados en esta descripción se pueden detectar usando cualquier técnica inmunológica adecuada, como inmunocitoquímica de flujo para marcadores de superficie celular, inmunohistoquímica (por ejemplo, de células fijadas o secciones de tejido) para marcadores de superficie celular células intracelulares o., análisis de transferencia Western de extractos celulares e inmunoensayo ligado a enzimas, para extractos celulares o productos secretados en el medio. Se dice que la expresión de un antígeno por una célula es “detectable por anticuerpos” si una cantidad de anticuerpo significativamente detectable se une al antígeno en un ensayo de citometría de flujo o inmunocitoquímica estándar, opcionalmente después de la fijación de las células, y opcionalmente usando un anticuerpo secundario etiquetado u otro conjugado (como un conjugado biotina-avidina) para amplificar el etiquetado.
La expresión de marcadores específicos (por ejemplo, específicos de células precursoras hematopoyéticas) también se puede detectar a nivel de ARNm mediante análisis de transferencia Northern, análisis de hibridación de transferencia puntual o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) usando cebadores específicos de secuencia en métodos de amplificación estándar (patente de EE.UU. No. 5,843,780). Los datos de secuencia para los marcadores particulares enumerados en esta divulgación se pueden obtener de bases de datos públicas como GenBank. Se dice que la expresión a nivel de ARNm es “detectable” de acuerdo con uno de los ensayos descritos en esta divulgación si el rendimiento del ensayo en muestras de células de acuerdo con los procedimientos estándar en un experimento controlado típico da como resultado un producto de hibridación o amplificación claramente discernible dentro de una ventana de tiempo estándar. A menos que se requiera lo contrario, la expresión de un marcador particular está indicada si el ARNm correspondiente es detectable por RT-PCR. La expresión de marcadores específicos detectados a nivel de proteína o ARNm se considera positiva si el nivel es al menos 2 veces superior al de una célula de control, y preferiblemente más de 10 o 50 veces superior al de una célula de control, como una célula madre pluripotente indiferenciada. un fibroblasto u otro tipo de célula no relacionada.
Las células también se pueden caracterizar según si presentan una actividad funcional característica de las células del linaje hematopoyético. Por ejemplo, las células precursoras hematopoyéticas tienen la capacidad de autorrenovarse y pueden dar lugar a más de un tipo de célula hematopoyética. En realizaciones particulares, las células precursoras hematopoyéticas obtenidas pueden dar lugar eficazmente a células linfoides (tales como, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK), células eritro-megacariocíticas (tales como, por ejemplo, eritrocitos y trombocitos), y células mieloides (como, por ejemplo, granulocitos y monocitos) in vitro. En otras realizaciones, las células madre hematopoyéticas son capaces de injertarse a largo plazo en mamíferos. Por ejemplo, el injerto a largo plazo en un modelo de ratón podría caracterizarse por la presencia de células hematopoyéticas humanas (por ejemplo, Células que son CD45+ y HLA Clase I ) en la sangre periférica y/o la médula ósea, como en 6, 12, 18, 20 o 25 semanas después del injerto.
Las células precursoras hematopoyéticas y las células madre hematopoyéticas proporcionadas mediante programación de acuerdo con los métodos actuales pueden tener varias características de la etapa de la célula que pretenden representar. Cuantas más de estas características estén presentes en una célula en particular, más se puede caracterizar como una célula del linaje celular hematopoyético. Las células que tienen al menos 2, 3, 5, 7 o 9 de estas características son cada vez más preferidas. En referencia a una población celular particular que puede estar presente en un recipiente de cultivo o una preparación para administración, la uniformidad entre células en la expresión de estas características es a menudo ventajosa. En esta circunstancia, las poblaciones en las que al menos aproximadamente el 40 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las células tienen las características deseadas son cada vez más preferidas.
VII. Usos de células precursoras hematopoyéticas y células madre hematopoyéticas
Las células precursoras hematopoyéticas y las células madre hematopoyéticas proporcionadas por métodos y composiciones de determinados aspectos de la presente divulgación se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones. Estos incluyen, pero no se limitan a, trasplante o implantación de células hematopoyéticas y precursor hematopoyético in vivo; cribado de compuestos citotóxicos, carcinógenos, factores de crecimiento/reguladores de mutágenos, compuestos farmacéuticos, etc., in vitro; dilucidar el mecanismo de las enfermedades y lesiones hematológicas; estudiar el mecanismo por el cual operan los fármacos y/o factores de crecimiento; diagnosticar y monitorear el cáncer en un paciente; terapia de genes; y la producción de productos biológicamente activos, por nombrar solo algunos.
A. Prueba de cribado de compuestos
Las células precursoras hematopoyéticas derivadas de programación y las células madre hematopoyéticas de la presente divulgación se pueden usar para seleccionar factores (tales como disolventes, fármacos de molécula pequeña, péptidos y polinucleótidos) o condiciones ambientales (tales como condiciones de cultivo o manipulación) que afectan las características de las células hematopoyéticas proporcionadas en este documento.
Las aplicaciones de cribado particulares de la presente divulgación se refieren al ensayo de compuestos farmacéuticos en la investigación de fármacos. Se remite al lector en general al libro de texto estándar In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997, y la patente de EE.UU. No. 5,030,015). En ciertos aspectos, las células programadas para el linaje hematopoyético cumplen una función de células de prueba para el cribado de fármacos estándar y los ensayos de toxicidad, como se ha realizado previamente en células hematopoyéticas y precursores en cultivos a corto plazo. La evaluación de la actividad de los compuestos farmacéuticos candidatos generalmente implica combinar las células hematopoyéticas o precursores proporcionados en ciertos aspectos con el compuesto candidato, determinando cualquier cambio en la morfología, fenotipo marcador o actividad metabólica de las células que sea atribuible al compuesto (en comparación con células no tratadas o células tratadas con un compuesto inerte) y luego correlacionar el efecto del compuesto con el cambio observado. El cribado se puede realizar porque el compuesto está diseñado para tener un efecto farmacológico sobre células hematopoyéticas o precursores, o porque un compuesto diseñado para tener efectos en otros lugares puede tener efectos no deseados sobre células hematopoyéticas o precursores. Se pueden probar dos o más fármacos en combinación (combinándolos con las células de forma simultánea o secuencial) para detectar posibles efectos de interacción fármaco-fármaco.
En algunas aplicaciones, los compuestos se pueden cribar para determinar su toxicidad para las células madre hematopoyéticas o las células precursoras hematopoyéticas.
B. Terapia con células hematopoyéticas
La presente divulgación también proporciona el uso de células madre hematopoyéticas y células precursoras hematopoyéticas proporcionadas en el presente documento para restaurar un grado de función a un sujeto que necesita tal terapia, quizás debido a una enfermedad o trastorno hematológico o una lesión. Por ejemplo, las células hematopoyéticas y las células precursoras hematopoyéticas derivadas por métodos divulgados en este documento pueden usarse para tratar enfermedades y trastornos hematológicos tales como hemoglobinopatías, anemias, etc. Además, las células madre hematopoyéticas y sus precursores pueden ser útiles para suministrar sangre o células sanguíneas (tales como, por ejemplo, glóbulos rojos, plaquetas y granulocitos neutrófilos) a sujetos que los necesitan (tales como, por ejemplo, sujetos que necesitan una transfusión de sangre o sujetos que tienen un trastorno hematológico). Tales células pueden ser útiles para el tratamiento de deficiencias de células hematopoyéticas causadas por terapias supresoras de células, como la quimioterapia.
Para determinar la idoneidad de las células madre hematopoyéticas y los precursores proporcionados en este documento para aplicaciones terapéuticas, las células se pueden probar primero en un modelo animal adecuado. En un nivel, se evalúa la capacidad de las células para sobrevivir y mantener su fenotipo in vivo. Las células programadas proporcionadas en el presente documento se administran a animales inmunodeficientes (como ratones NOG o animales que se vuelven inmunodeficientes químicamente o por irradiación) en un sitio susceptible de observación adicional, como debajo de la cápsula del riñón, en el bazo, en un lóbulo del hígado o en la médula ósea. Los tejidos se recolectan después de un período de unos pocos días a varias semanas o más, y se evalúa si los tipos de células iniciales, como las células madre pluripotentes, todavía están presentes. Esto se puede realizar proporcionando a las células administradas un marcador detectable (tal como proteína verde fluorescente o p-galactosidasa); o midiendo un marcador constitutivo específico para las células humanas administradas. Cuando las células programadas proporcionadas en el presente documento se prueban en un modelo de roedor, la presencia y el fenotipo de las células administradas pueden evaluarse mediante inmunohistoquímica o ELISA utilizando un anticuerpo específico para humanos, o mediante análisis de RT-PCR utilizando cebadores y condiciones de hibridación que provoquen que la amplificación sea específica para secuencias polinucleotídicas humanas. Los marcadores adecuados para evaluar la expresión génica a nivel de ARNm o proteína se proporcionan en otra parte de esta divulgación.
Las células madre hematopoyéticas y los precursores hematopoyéticos proporcionados por los métodos de la presente divulgación pueden probarse en varios modelos animales para determinar su capacidad para tratar trastornos y lesiones hematológicos. Por ejemplo, un modelo de ratón con anemia de células falciformes o el ratón modificado Rag-2 deficiente en células T/B pueden ser modelos animales particularmente útiles para probar las células hematopoyéticas y los precursores hematopoyéticos descritos en este documento.
Las células madre hematopoyéticas y las células precursoras hematopoyéticas proporcionadas en ciertos aspectos de la presente divulgación que demuestran características funcionales deseables o eficacia en modelos animales, también pueden ser adecuadas para la administración directa a sujetos humanos que lo necesiten. Para propósitos de hemostasia, las células pueden administrarse en cualquier sitio que tenga un acceso adecuado a la circulación. Las células hematopoyéticas o sus precursores también pueden administrarse en un sitio de lesión o enfermedad.
Las células proporcionadas en el presente documento se pueden usar para la terapia de cualquier sujeto que lo necesite. Las afecciones humanas que pueden ser apropiadas para dicha terapia incluyen las diversas anemias y hemoglobinopatías, así como enfermedades caracterizadas por un número reducido de células hematopoyéticas (como, por ejemplo, síndrome mielodisplásico, mielofibrosis, neutropenia, agranulocitosis, trombastenia de Glanzmann, trombocitopenia y enfermedades adquiridas). síndrome de inmunodeficiencia). Para la terapia humana, la dosis es generalmente entre aproximadamente 109 y 1012 células, y típicamente entre aproximadamente 5 * 109 y 5 * 1010 células, haciendo ajustes para el peso corporal del sujeto, la naturaleza y gravedad de la aflicción y la capacidad de replicación de las células administradas. La responsabilidad última de determinar el modo de tratamiento y la dosis adecuada recae en el médico responsable.
C. Distribución con fines comerciales, terapéuticos y de investigación
Para fines de fabricación, distribución y uso, las células precursoras hematopoyéticas y las células madre hematopoyéticas de la presente divulgación se suministran típicamente en forma de cultivo celular o suspensión en un excipiente o medio de cultivo isotónico, opcionalmente congeladas para facilitar el transporte. o almacenamiento.
La presente divulgación también incluye diferentes sistemas de reactivos, que comprenden un conjunto o combinación de células que existen en cualquier momento durante la fabricación, distribución o uso. Los conjuntos de células comprenden cualquier combinación de dos o más poblaciones de células descritas en esta divulgación, ejemplificadas, pero no limitadas a células derivadas de programación (células de linaje hematopoyético, sus precursores y subtipos), en combinación con unas células madre diferenciadas, células hematopoyéticas derivadas de células somáticas u otros tipos de células diferenciadas. Las poblaciones de células del conjunto a veces comparten el mismo genoma o una forma genéticamente modificada del mismo. Cada tipo de celda en el conjunto puede empaquetarse juntos o en contenedores separados en la misma instalación, o en diferentes ubicaciones, en el mismo momento o en diferentes momentos, bajo el control de la misma entidad o diferentes entidades que comparten una relación comercial.
VIH. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y todavía obtener un resultado similar o parecido sin apartarse del alcance de la invención.
Ejemplo 1 - Expresión ligada de ETV2/ERG, GATA2 y HOXA9 que programan de manera eficiente las PSC humanas a progenitores hematopoyéticos CD34+ inmaduros
Los presentes estudios se realizaron para producir precursores hematopoyéticos con potencial de linaje múltiple que incluyen potencial mieloide y linfoide. Se probaron múltiples configuraciones de genes de programación para determinar la eficiencia de la programación para lograr un potencial de linaje múltiple (Tabla 2). Las regiones codificantes de los transgenes se clonaron en vectores de expresión PiggyBac bajo el control del promotor Tight inducible por rtTET (pTight). ETV2/ERG y GATA2 (E G) se clonaron en vectores de expresión separados que portaban resistencia a blasticidina y genética, respectivamente. Se utilizó una selección combinada de blasticidina y genética para lograr la coexpresión de ETV2/ERG y GATA2 en células transfectadas. Alternativamente, para una expresión uniforme equilibrada en células transfectadas, ETV2/ERG y GATA2 (EG) se unieron a través del péptido de escisión F2A en un casete de expresión controlado por pTight. Se encontró que la coexpresión ligada de Et V2/ERG y GATA2 (EG) resultó en una eficiencia de programación significativamente mejorada, y pareció evitar la etapa intermedia de células endoteliales que se observó cuando se expresaron ETV2/ERG y GATA2 (E G) en vectores separados (Fig. 1).
Tabla 2: Configuraciones de genes de propagación
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A continuación, HOXA9 se vinculó al casete de expresión de EG (EGH) utilizando un promotor Tight bidireccional (bipTight) para determinar si HOXA9 puede mejorar la eficiencia de programación para producir precursores hematopoyéticos con potencial de múltiples linajes, incluido el potencial mieloide y linfoide. Las configuraciones de genes inductivos E G, EG y EGH se probaron utilizando PSC humanas diseñadas para expresar constitutivamente la proteína rtTET para la expresión génica inducible por doxiciclina (DOX). Se introdujeron vectores transgénicos PiggyBac junto con el vector que expresa hPBase en las PSC humanas que expresan rtTET usando electroporación. Las células con integración estable del transposón PiggyBac se seleccionaron en cultivo con 100 |jg/ml de blasticidina y/o geneticina. Para la programación hematopoyética inducida por transgenes, las PSC transfectadas se disociaron usando EDTA 0.5 mM durante aproximadamente 5-10 minutos, se resuspendieron en medio de cultivo de PSC (por ejemplo, TeSR o E8®) y se colocaron en placas de 6 pocillos recubiertas con matrigel a 5-10 x 104 células/pocillo en medio de cultivo PSC suplementado con 5 jM del inhibidor de ROCK blebbistatina. Al día siguiente, se inició la expresión transgénica y la inducción hematopoyética reemplazando el medio de cultivo PSC con 3 ml/pocillo de medio de inducción (Tabla 3) complementado con 0.25 jg/m l de doxiciclina. El medio de inducción se cambió cada dos días y los cultivos se recolectaron el día 8 de la inducción usando la solución de disociación celular Accutase (Innovative Cell Technologies).
Tabla 3: Medio de Inducción
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Las células recolectadas se contaron y analizaron mediante citometría de flujo para la medición de células endoteliales CD34+ CD43-, células hematopoyéticas totales CD43+ y progenitores hematopoyéticos inmaduros CD43+CD34+. Los gráficos de puntos y las imágenes demostraron que en las configuraciones génicas basadas en ETV2 y ERG, la inducción con genes E G separados resultó en las poblaciones hematopoyéticas mixtas CD43+ y endotelials CD34+CD43-, mientras que liga de manera eficiente los genes EG (> 80 %) de PSC programado en humanos para población hematopoyética CD43+. Más importante aún, mientras que las proporciones de progenitores CD43+CD34+ inmaduros fueron similares en cultivos inducidos por E G y EG (30-40 % del total de células CD43+), lo que sugiere una tasa de diferenciación similar en las células hematopoyéticas, la configuración del gen ETV2/ERG-GAT2-HOXA9 (EGH) indujo y mantuvo eficientemente la población inmadura de progenitores hematopoyéticos como se muestra por la expresión de CD34+ en más del 90 % de las células CD43+ (Figura 1B). Los recuentos absolutos de células en cultivos inducidos por DOX de 8 días demostraron que en las configuraciones génicas basadas en ETV2 y ERG, el número total de células hematopoyéticas CD43+ inducidas aumentó significativamente (por ejemplo, más de 5 veces) a través del enlace de genes inductivos (EG), mientras que un número más de 2 veces mayor de progenitores CD34+CD43+ inmaduros fue inducido específicamente por la configuración del gen EGH que contiene HOXA9 (Figura 1C).
Para examinar las características funcionales de las células hematopoyéticas inducidas por EG y EGH, se ensayaron los potenciales de expansión y diferenciación de células inducidas por DOX de 8 días en cocultivo con células estromales MS5. Las células inducidas se sembraron en placas a 104 células/pocillo en placas de 6 pocillos con monocapas de células MS5 tratadas con mitomicina C en 4 ml/pocillo de medio de cocultivo (Tabla 4). Los cultivos se mantuvieron durante 2 semanas con la mitad de cambio de medio cada 3 días. Se recogieron las células no adherentes y se disociaron las monocapas de células mediante tratamientos sucesivos con 1 mg/ml de colagenasa IV durante 15 minutos y Accutase durante 15 minutos. Se combinaron fracciones de células adherentes disociadas y no adherentes y se utilizaron para el análisis de recuentos celulares absolutos, proporciones de células hematopoyéticas CD43+ totales y CD34+CD43+ inmaduras mediante citometría de flujo, y células formadoras de colonias mediante el ensayo MethoCult (StemCell Technologies). En contraste con las células inducidas por EG, que mostraron un crecimiento muy limitado atribuido principalmente a pequeños grupos de células flotantes, las células inducidas por EGH demostraron una expansión robusta con áreas de crecimiento similares a empedrados notables y extensas (Fig. 1D), una característica bien conocida de muy progenitores hematopoyéticos primitivos. Los recuentos absolutos de células CD43+ totales y CD43+CD34+ inmaduras demostraron solo un aumento de aproximadamente 5 veces de las células CD43+ totales y una falta de células CD34+CD43+ inmaduras en las células expandidas inducidas por EG. Por el contrario, las células hematopoyéticas CD43+ totales se expandieron más de 30 veces, y las células inmaduras CD43+CD34+ se expandieron aproximadamente 5 veces en las células inducidas por EGH (Figura 1E). Si bien el potencial de formación de colonias se redujo gravemente en las células inducidas por EG con solo unas pocas colonias mieloides detectadas, se detectó el potencial de formación de colonias de múltiples linajes en células inducidas por EGH después de un cocultivo de 2 semanas con estroma de MS5 (Fig. IF).
Tabla 4: Medio de cocultivo
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Ejemplo 2: mejora del potencial de linaje múltiple de precursores hematopoyéticos inmaduros
Se cribaron genes adicionales para mejorar la eficiencia de programación directa de las PSC a los progenitores hematopoyéticos inmaduros. Se ideó un modelo de cribado para detectar genes adicionales que podrían ser complementarios de ETV2/ERG-GATA2-HOXA9 (EGH) para mejorar la producción de células inmaduras, CD43+CD34+ y CD43+CD34+CD133+.
Dado que se ha demostrado que pCMV se suprime esencialmente en las PSC humanas indiferenciadas y que tiene expresión activa en células diferenciadas como las HPC, se realizaron estudios para averiguar si esta característica del promotor de CMV podría usarse para la expresión génica posterior a la inducción. en las células CD43+ inducidas. Las construcciones pCMV-EGFP y pTight-EG se introdujeron en PSC humanas que expresan rtTET usando vectores de expresión PiggyBac. La expresión de EGFP en células CD43+ se controló siguiendo la programación hematopoyética inducida por DOX. En las iPSC indiferenciadas/no inducidas, y hasta el día 8 de inducción de DOX, se detectó una baja expresión de EGFP en aproximadamente el 20 % de las células, incluidas las células CD43+ inducidas. Por el contrario, después de 4 días adicionales (por ejemplo, el día 12), se detectó una alta expresión de EGFP en más del 50 % de las células CD43+ inducidas (Figura 2). Por tanto, el promotor pCMV podría usarse para la expresión transgénica posterior a la inducción de los genes adicionales.
Para cribar los genes adicionales, se transfectaron PSC que expresan rtTET con pTight-EGH (resistencia a blasticidina) y un gen de prueba pTight o pCMV adicional (resistencia a la genetina) en vectores de expresión PiggyBac. La coexpresión de EGH y del gen de prueba en células transfectadas se logró mediante selección combinada de blasticidina genetina. Las PSC humanas transfectadas con EGH y los genes de prueba se indujeron durante 8 días mediante DOX para producir células CD43+ y luego se expandieron adicionalmente en 2 cocultivos sucesivos de MS5 de 2 semanas (Figura 3B). Para cada gen de prueba, se calculó la producción de poblaciones de células hematopoyéticas primitivas y totales a lo largo de los cultivos de expansión y se expresó como una fracción del control interno de EGH. Los resultados del cribado de genes que demuestran un efecto positivo sobre la expansión de progenitores primitivos inducidos por EGH se muestran en la Fig. 3C. Se encontró que la adición de HOXA10 impulsada por el promotor del citomegalovirus (CMV), que permitió la expresión del transgén después del día 8, en ETV2/ERG, GATA2 y HOXA9, mejoró en gran medida la proliferación de células inducidas durante un cultivo de expansión de dos semanas en células alimentadoras del estroma EM-5 y la generación de células CD43+CD34+CD133+ (Figura 3A).
A continuación, se ideó un modelo de cribado para detectar genes que mejoran el desarrollo de células linfoides a partir de células inducidas por EGH (Figura 4A). Para las células T/NK, las células inducidas en el día 8 transfectadas con EGH y combinaciones de genes de prueba se sembraron en placas recubiertas con DLL4-Fc/retronectina (0.5 |jg/cm2 cada una) a 5x103 células/cm2 en medio de diferenciación T/NK (por ejemplo, StemSpan SFEM (Stem Cell Technologies) suplementado con ácido ascórbico, fosfato de magnesio (95 jM), Glutamax (1/100; Gibco), Penicilina/Estreptomicina (1/100; Gibco) y citocinas - SCF, FLT3L, TPO e IL7 (50 ng/ml cada uno). Los cultivos se mantuvieron en condiciones hipóxicas (por ejemplo, 5 % de O2) con un cambio de la mitad de medio volumen cada 2 o 3 días. Después de 2 semanas, las células se transfirieron a placas recién revestidas con DLL4-Fc/retronectina durante 2 semanas más. Las células recolectadas después de 4 semanas se analizaron mediante citometría de flujo en busca de células T CD3+CD8+ y células NK CD3-CD8+. Para las células B, las células inducidas en el día 8 transfectadas con EGH y combinaciones de genes de prueba se sembraron en monocapas de MS5 tratadas con mitomicina C a 103 células/cm2 en medio de diferenciación de células B (por ejemplo, IMDM suplementado con FBS (10 %, HyClone), Glutamax (1/100, Gibco), penicilina/estreptomicina (1/100; Gibco), monotioglicerol (100 □M) y citocinas: SCF, FLT3L, TPO (50 ng/ml cada una), IL7 (20 ng/ml) e IL3 (10 ng/ml, agregado solo en la placa celular; o por ejemplo, DMEM-F12 suplementado con FBS (10 %, HyClone), Glutamax (1/100, Gibco), Penicilina/Estreptomicina (1/100; Gibco), Ácido ascórbico (95 jM ) y citocinas: SCF y FLT3L (50 ng/ml cada una), IL7 (20 ng/ml, agregadas solo durante las 2 primeras semanas de cultivo de células B) e IL3 (10 ng/ml, agregadas solo para la primera semana de cultivo de células B). Los cultivos se mantuvieron 4 semanas con un cambio de la mitad del volumen medio cada 2 o 3 días. En cada alimentación con medio fresco, las células flotantes no adherentes se suspendieron y se retiraron con medio. Las células recolectadas después de 4 semanas se analizaron por citometría de flujo para células B CD45+CD19+. Se encontró que una combinación de genes EGH, pCMV-NA9HD (proteína de fusión de homeodominio NUP98-HOXA9) y pCMV-NA10 (proteína de fusión NUP98-HOXA10) permitía una diferenciación eficaz en células T, NK y B (Figura 4B).
Ejemplo 3 - Los genes de programación de células madre hematopoyéticas confieren potencial de injerto a largo plazo
Se ideó un modelo de cribado para detectar genes de programación de células madre hematopoyéticas que se pueden combinar con el vector de expresión de EGH para permitir el injerto hematopoyético a largo plazo. Se purificaron células CD34+ transfectadas con EGH y diferentes combinaciones de genes de prueba (por ejemplo, hasta 20 genes por combinación) a partir de cultivos de inducción de DOX del día 8 mediante clasificación de células activadas por imán (MACS) (Figura 5A). Para la inyección inmediatamente posterior a la inducción, se sembraron 4 * 106 células CD34+ en cultivo de recuperación a 106 células/ml en medio HSC (por ejemplo, StemSpan SFEM suplementado con SCF, FLT3L y TPO (100 ng/ml cada uno)), recolectados después de 18 -24 horas y se inyectó por vía intravenosa en ratones NOD/SCID/IL2Rg-/c-kitW41 (NBSGW) de 6-8 semanas. A continuación, los ratones inyectados se colocaron en jaulas con una dieta que contenía DOX (es decir, 625 mg de DOX/kg) para proporcionar suministro de DOX para la expresión continua del transgén in vivo durante 7 días. Para la inyección de células adaptadas al cultivo de HSC, se sembraron en placas 0.5 x 106 células CD34+ a 0.2 x 106 células/ml en placas recubiertas con DLL4-Fc/retronectina en medio HSC y se cultivaron durante 7 días en condiciones hipóxicas (por ejemplo, 5 % O2) con un cambio de volumen medio de cultivo el día 4. Después del cultivo, las células recolectadas se inyectaron en los mismos ratones previamente inyectados con células CD34+ del día 8 y alimentados con dieta que contenía DOX durante 7 días. Después de la inyección, los ratones se transfirieron con una dieta normal sin DOX y se analizaron para detectar la presencia de células hematopoyéticas humanas (es decir, CD45+ HLA Class1+) en sangre periférica a las 6, 12 y 18 semanas, y médula ósea a las 20-24 semanas.
Se detectaron células CD45+ hematopoyéticas humanas en la sangre periférica y la médula ósea de ratones NBSGW 12 semanas después de la inyección (Figura 5B). No se detectaron células CD45+ humanas en ratones inyectados con células inducidas por EGH, mientras que EGH en combinación con 10 genes de programación adicionales (Tabla 1) dio como resultado células CD45+ humanas detectables en sangre periférica y médula ósea. Se realizó un análisis adicional para la detección de células CD43/45+ en la médula ósea del ratón y la sangre periférica de los ratones NBSGW 12 semanas después de la inyección. Estas células CD43/45+ no se detectaron en ratones inyectados con células inducidas por EGH, mientras que EGH en combinación con los genes de programación adicionales dio como resultado un 4.64 % de células CD43/45+ en la médula ósea del ratón (Fig. 5C).
A continuación, como ejemplo de referencia, se cotransfectaron ESC H1-A16-TET con genes EGH hematopoyéticos inductivos (vector de selección de blasticidina) y diversas combinaciones de genes de prueba para la programación de HSC (vectores de selección G418). Las ESC transfectadas se cultivaron 2 pases en presencia de blasticidina y G418 para seleccionar transfectantes dobles (combinaciones de genes de prueba EGH+), luego se indujeron a células CD34+ y se ensayaron para el injerto en ratones NSGW como se describe en la Fig. 5A. La expresión de cada transgén probado en las muestras de médula ósea de ratón injertadas se analizó mediante qPCR específico del transgén normalizado a la población total de células transgénicas detectadas por cebadores específicos de EGH. Esta expresión se comparó con la expresión transgénica inicial en las células CD34+ inyectadas. Las respectivas relaciones de expresión injertadas/inyectadas muestran enriquecimiento (valores positivos) o agotamiento (valores negativos) de transgenes después del trasplante de células (Fig. 6).
Se probaron cuarenta genes de programación de HSC candidatos seleccionados de la selección preliminar in vitro en 3 experimentos de trasplante independientes (usando vectores de expresión de pCMV). En total, se detectaron veinte transgenes humanos en la médula ósea de ratones injertados más de 12 semanas después de las inyecciones de células. Como se muestra en la Fig. 6, los niveles de expresión de algunos transgenes en la médula ósea fueron significativamente más altos o más bajos en comparación con las células CD34+ inyectadas, lo que indica una selección in vivo de células trasplantables. Independientemente de los niveles de expresión, sin embargo, todos los genes humanos detectados pueden contribuir a la migración, supervivencia y persistencia de células CD34+ derivadas de PSC en el entorno de la médula ósea, una característica conocida de las células madre/progenitoras hematopoyéticas injertables.
Por tanto, utilizando una estrategia de selección combinada en ratones NBSGW (Mclntosh et al., 2015), se identificaron genes de programación de células madre hematopoyéticas que confieren un injerto a largo plazo de células derivadas de PSC humanas en médula ósea y sangre periférica.
Todos los métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Si bien las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos en el presente documento, mientras que se obtendrían resultados iguales o similares. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del alcance y concepto de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Referencias
Patente Europea No. EP1507865
Patente Europea No. EP0412700
Patente de los Estados Unidos 4,683,202
Patente de los Estados Unidos 5,030,015
Patente de los Estados Unidos 5,302,523
Patente de los Estados Unidos 5,322,783
Patente de los Estados Unidos 5,384,253
Patente de los Estados Unidos 5,460,964
Patente de los Estados Unidos 5,464,765
Patente de los Estados Unidos 5,486,359
Patente de los Estados Unidos 5,538,877
Patente de los Estados Unidos 5,538,880
Patente de los Estados Unidos 5,550,318
Patente de los Estados Unidos 5,556,954
Patente de los Estados Unidos 5,563,055
Patente de los Estados Unidos 5,580,859
Patente de los Estados Unidos 5,589,466
Patente de los Estados Unidos 5,591,616
Patente de los Estados Unidos 5,610,042
Patente de los Estados Unidos 5,635,387
Patente de los Estados Unidos 5,656,610
Patente de los Estados Unidos 5,677,136
Patente de los Estados Unidos 5,681,599
Patente de los Estados Unidos 5,702,932
Patente de los Estados Unidos 5,716,827
Patente de los Estados Unidos 5,736,396
Patente de los Estados Unidos 5,736,524
Patente de los Estados Unidos 5,750,397
Patente de los Estados Unidos 5,759,793
Patente de los Estados Unidos 5,780,448
Patente de los Estados Unidos 5,789,215
Patente de los Estados Unidos 5,811,094
Patente de los Estados Unidos 5,827,735
Patente de los Estados Unidos 5,827,740
Patente de los Estados Unidos 5,837,539
Patente de los Estados Unidos 5,837,670
Patente de los Estados Unidos 5,843,780
Patente de los Estados Unidos 5,925,565
Patente de los Estados Unidos 5,928,906
Patente de los Estados Unidos 5,935,819
Patente de los Estados Unidos 5,945,100
Patente de los Estados Unidos 5,981,274
Patente de los Estados Unidos 5,994,136
Patente de los Estados Unidos 5,994,624
Patente de los Estados Unidos 6,013,516
Patente de los Estados Unidos 6,184,038
Patente de los Estados Unidos 6,200,806
Patente de los Estados Unidos 6,833,269
Patente de los Estados Unidos 6,991,897
Patente de los Estados Unidos 7,015,037
Patente de los Estados Unidos 7,029,913
Patente de los Estados Unidos 7,399,632
Patente de los Estados Unidos 7,410,773
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Publicación de patente de los Estados Unidos 2002/0055144 Publicación de patente de los Estados Unidos 2002/0102265 Publicación de patente de los Estados Unidos 2003/0040038 Publicación de patente de los Estados Unidos 2003/0082561 Publicación de patente de los Estados Unidos 2003/0211603 Publicación de patente de los Estados Unidos 2004/0235175 Publicación de patente de los Estados Unidos 2007/0072295 Publicación de patente de los Estados Unidos 2007/0116690
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes que comprende:
(a) proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden al menos una construcción de expresión que codifica genes de programación precursores hematopoyéticos, en los que los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden un gen ETS/ERG, GATA2, y HOXA9; y
(b) cultivar las células madre pluripotentes bajo condiciones tales que se expresan los genes de programación precursores hematopoyéticos, produciendo de esta manera células precursoras hematopoyéticas (HPC), en el que el gen ETS/ERG es ERG (homólogo del oncogén del virus de eritroblastosis E26 v-ets), ETV2 (variante ets 2), FLI-1 (integración 1 del virus de la leucemia Friend), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS), ETS1 (C-ets-1), o ETS2 (C-ets-2).
2. El método de la reivindicación 1, en el que las HPC son capaces de diferenciarse en linajes mieloide y linfoide.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente (c) cultivar las HPC bajo condiciones tales que no se expresan los genes de programación precursores hematopoyéticos.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
i) la construcción de expresión es una construcción de expresión basada en transposón o episoma; o
ii) los genes de programación precursores hematopoyéticos están bajo el control de un promotor único, particularmente en el que el promotor único es un promotor inducible, especialmente en el que el promotor inducible es un promotor inducible por tetraciclina; o
iii) el cultivo de la etapa (b) es de aproximadamente cuatro a aproximadamente diez días; o
iv) las células madre pluripotentes son células madre embriónicas (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC); o
v) las células madre pluripotentes son humanas.
5. El método de la reivindicación 1, en el que las HPC expresan uno o más marcadores precursores hematopoyéticos, particularmente en el que A) los marcadores precursores hematopoyéticos se seleccionan del grupo que consiste en CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a, y CD41a o B) el uno o más marcadores precursores hematopoyéticos se seleccionan del grupo que consiste en CD43, CD45, y CD34.
6. El método de la reivindicación 1, en el que las HPC son HPC inmaduras,
particularmente en el que
i) las HPC inmaduras expresan CD34 y CD43; o
ii) al menos 50 por ciento de las HPC son HPC inmaduras; o
iii) al menos 70 por ciento de las HPC son HPC inmaduras; o
iv) al menos 90 por ciento de las HPC son HPC inmaduras.
7. El método de la reivindicación 3, en el que las HPC se cultivan A) en la ausencia de células estromales o B) en medio sin suero o definido;
particularmente en el que las HPC se pueden diferenciar en dos o más tipos de células seleccionados del grupo que consiste en células de plasma, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, mastocitos, megacariocitos, eritrocitos, granulocitos, linfocitos, monocitos, leucocitos y trombocitos, especialmente en los que el linfocito es un linfocito B y/o un linfocito T.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
i) el gen ETS/ERG es ERG o ETV2; o
ii) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, y HOXA9; o
iii) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2, y HOXA9; o
iv) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10; o
v) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10.
9. El método de la reivindicación 1, en el que los genes de programación precursores hematopoyéticos se fusionan a una secuencia de direccionamiento, particularmente en la que la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio de la misma.
10. El método de la reivindicación 1, en el que las PSC de la etapa (a) comprende adicionalmente al menos una construcción de expresión adicional que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas,
particularmente en el que
i) el método comprende adicionalmente (c) cultivar las HPC bajo condiciones tales que se expresan el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas, produciendo de esta manera células madre hematopoyéticas (HSC) capaces de injerto a largo plazo en un mamífero, especialmente en el que la expresión del uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas es A) constitutiva en las HPC o B) esencialmente silenciada en las células madre pluripotentes; o
ii) el mamífero es un humano; o
iii) el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667 y ZNF682; o
iv) el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682, y MSI2; o
v) el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, y RBAK; o vi) los genes de programación de células madre hematopoyéticas se fusionan a una secuencia de direccionamiento, especialmente en la que la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio de la misma.
11. Un método in vitro para producir células precursoras hematopoyéticas a partir de células madre pluripotentes que comprende:
(a) proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden una construcción de expresión que codifica ERG, GATA2, y HOXA9 bajo el control de un promotor único; y
(b) cultivar las células madre pluripotentes bajo condiciones tales que se expresan ERG, GATA2, y HOXA9, produciendo de esta manera células precursoras hematopoyéticas (HPC).
12. Un método in vitro para producir células madre hematopoyéticas (HSC) a partir de células madre pluripotentes que comprende:
(a) proporcionar células madre pluripotentes (PSC) que comprenden una construcción de expresión que codifica ERG, GATA2, y HOXA9 bajo el control de un promotor único y al menos una segunda construcción de expresión que codifica uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas; y
(b) cultivar las células madre pluripotentes bajo condiciones tales que se expresan ERG, GATA2, HOXA9 y el uno o más genes de programación de células madre hematopoyéticas, produciendo de esta manera HSC capaces de injerto a largo plazo en un mamífero.
13. Una construcción de expresión que codifica genes de programación precursores hematopoyéticos, en los que los genes de programación comprenden un gen ETS/ERG, GATA2 y HOXA9,
en la que el gen ETS/ERG es ERG (homólogo del oncogén del virus de eritroblastosis E26 v-ets), ETV2 (variante ets 2), FLI-1 (integración 1 del virus de la leucemia Friend), ELK3 (proteína que contiene el dominio ETS), ETS1 (C-ets-1), o ETS2 (C-ets-2).
14. La construcción de expresión de la reivindicación 13, en la que
i) la construcción es una construcción de expresión basada en transposón o episoma; o
ii) los genes de programación precursores hematopoyéticos están bajo el control de un promotor único; o
iii) el promotor único es un promotor inducible; o
iv) el promotor inducible es un promotor inducible por tetraciclina; o
v) el gen ETS/ERG es ERG o ETV2; o
vi) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, y HOXA9; o.
vii) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2, y HOXA9; o
viii) los genes de programación precursores hematopoyéticos se fusionan a una secuencia diana, particularmente en la que la secuencia de direccionamiento es NUP98 o un homeodominio de la misma; o
ix) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10; o
x) los genes de programación precursores hematopoyéticos comprenden ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 y NUP98-HOXA10.
15. Una célula que comprende la construcción de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14.
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