CN110669733A - 白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途，在该用途中，白杨素在扩增培养基中的浓度为1‑10μM。本发明还提供了一种人造血干细胞扩增培养基和一种扩增人造血干细胞的方法。本发明白杨素对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。

Description

白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途。
背景技术
造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)具有自我更新、多向分化、重建造血潜能以及损伤后自我修复的能力，它的特性使其在白血病治疗、肿瘤病人化疗后造血功能重建以及遗传病、肿瘤的基因治疗等方面发挥着重要作用。脐带血富含造血干细胞，并具有免疫原性低、供体安全、来源广泛、采集容易等优点，因此脐带血移植成为骨髓及外周血造血干细胞移植的极佳替代来源。
然而，脐带血中HSCs的比例仅占0.1％～1％左右，由于造血干祖细胞数量不够、质量欠佳、植活成功率低等诸多棘手问题导致脐带血HSCs移植后难以在患者体内进行有效地造血重建，很大程度上制约了干细胞产业的发展与临床应用。前人研究中曾尝试液体培养基中加入多种细胞因子组合、同基质细胞共培养或在生物反应器中培养等方法以达到体外扩增HSCs的目的，但上述方法扩增效果仍不够理想。因此，在体外安全有效地扩增脐带血干细胞对于临床的移植应用具有很重要的意义。
小分子化合物在体外培养中显示了其独特的优势。首先，小分子化合物相较于细胞因子或转录因子等其性质更为稳定；其次，化合物的作用效果可以通过改变化合物的结构、浓度来调控，其过程简单可控；此外，其给药途径方便多样，前期合成制备流程相对简单、易于大规模生产，有利于临床转化应用。Science杂志2010年报道的嘌呤衍生物SR1、2014年报道的UM171均能够在体外有效扩增人的造血干、祖细胞，除此之外目前还有多个小分子化合物被发现能在体外提高造血细胞亚群的比例，或者提高被处理细胞的移植成功率。因此，在传统扩增造血干细胞的方法中加入小分子化合物，可能对体外培养中失去体内niche环境而易于发生分化或衰竭的HSC的自我更新、分化、迁移、凋亡等方面发挥作用，进而促进HSPC的体外扩增。
发明内容
本发明旨在从化合物库中筛选得到体外扩增人造血干细胞效果良好的小分子化合物白杨素，并确定其体外扩增效果最佳的作用浓度，在此条件下体外培养人造血干细胞，以达到体外扩增造血干细胞的目的。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途。
白杨素的结构为：
Figure BDA0002261406680000021
在该用途中，白杨素在扩增培养基中的浓度为1-10μM，更优选地，白杨素在扩增培养基中的浓度为2.5μM。
本发明还提供了一种人造血干细胞扩增培养基，包括白杨素。
优选地，该人造血干细胞扩增培养基还包括条件性培养基。
优选地，在该人造血干细胞扩增培养基中，白杨素的浓度为1-10μM。更优选地，白杨素的浓度为2.5μM。
优选地，该条件性培养基的配方是：Iscove's Modified Dulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S。
本发明还提供了一种扩增人造血干细胞的方法，采用上述的人造血干细胞扩增培养基对人造血干细胞进行培养。
优选地，所述人造血干细胞为脐带血造血干细胞，更优选地，接种的密度为5×104细胞/mL。
优选地，所述培养的条件为：37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
优选地，该方法包括如下步骤：将新鲜分离的人脐带血CD34+细胞使用条件性培养基(Gibco Iscove's Modified Dulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mLTPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的白杨素小分子化合物，白杨素小分子化合物的终浓度为1-10μM。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
本发明所具有的有益效果：
本发明白杨素对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。
附图说明
图1.实施例3中体外培养后细胞表型比例和绝对数量变化统计分析图；
图2.实施例3中体外培养后细胞表型比例典型流式图；
图3.实施例4中克隆形成实验不同集落细胞数目统计图；
图4.实施例5中移植后各组小鼠骨髓内hCD45+细胞植入率水平统计分析图；
图5.实施例5中移植后各组小鼠骨髓内人源髓系细胞、淋系细胞比例统计分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种小分子化合物白杨素(白杨素C2968)，其结构为：
实施例2
一种人造血干细胞体外扩增方法，包括如下步骤：
将新鲜分离的人脐带血CD34+细胞使用培养基(Gibco Iscove's ModifiedDulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的白杨素(C2968)小分子化合物，白杨素(C2968)小分子化合物的终浓度为2.5μM。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
实施例3：细胞表型分析
采用流式检测CD34+CD38-、CD34+CD38-CD49f+、CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞的比例以及绝对数量对白杨素(C2968)小分子化合物体外扩增造血干细胞的作用进行验证，结果显示白杨素C2968小分子化合物对于造血干细胞的体外扩增作用明显。
流式分析检测白杨素(C2968)小分子化合物对人造血干细胞体外扩增作用的实验方法：
①将采集到的新生儿脐带血置于洁净无菌的200mL血浆瓶中，按照羟乙基淀粉(HES):脐带血＝4：1的体积比例加入HES，吹打混匀后，室温静置40分钟至1小时，充分沉降血液中的红细胞；
②使用25mL一次性无菌移液管将沉降后脐带血的上清轻轻吸出，置于50mL离心管中，每个离心管中约加入20到25mL上清液，离心1500rpm，10分钟；
③弃上清，向细胞沉淀中加入40mL无菌红细胞裂解液(ACK)进行重悬，将离心管置于37℃水浴中裂解红细胞约15分钟，期间上下颠倒离心管混匀数次，离心1500rpm，10分钟；
④弃上清，细胞沉淀先用1-2mL无菌PBS缓冲液吹打成单细胞悬液，再加入20mLPBS缓冲液洗涤细胞，同时取10μL细胞悬液(用PBS缓冲液稀释100倍后)进行MNC细胞计数。离心1500rpm，10分钟；
⑤弃上清，细胞沉淀用1mL PBS缓冲液重悬，吹打混匀后，根据MNC数量依次加入适量FCR Blocking Reagent(可封闭非特异性结合位点)受体阻断剂和CD34 Microbeads，充分混匀后，将离心管放置于4℃避光孵育20分钟(期间每隔10分钟晃动混匀，防止形成细胞沉淀影响磁珠孵育)；
Figure BDA0002261406680000041
⑥孵育结束后，每管用20mL PBS缓冲液洗细胞(洗去未与细胞结合的磁珠)，若有沉淀，需要过滤，离心1500rpm，10分钟，弃上清，用1mL PBS缓冲液重悬；
⑦安装LS柱于磁架上，在柱口处覆盖一块40μM细胞过滤网(以防细胞团块堵住分选柱)，依次用1mL PBS缓冲液润柱3遍；
⑧逐滴加入细胞悬液，于磁场中通过，至分选柱内细胞留尽后，向柱中加入1mLPBS缓冲液进行洗柱，以清洗柱内残留的非目标细胞，洗柱3遍；
⑨将柱子移出磁场，放在收集管上，加入2mL PBS缓冲液，用活塞快速推出磁珠标记的细胞，取10μL计数；
⑩将获得的细胞用培养基(Gibco Iscove's Modified Dulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬细胞至浓度为5×104cells/mL，每孔190μL细胞悬液铺于96孔板中，随后立即加入10μL终浓度为2.5μM的待测化合物(白杨素C2968)，对照组则添加0.01％DMSO，每组设置6-10个复孔，吹打混匀；
Figure BDA0002261406680000051
细胞于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养7天；
7天后，标记抗体CD34-APC、CD38-PE-Cy7、CD49f-PE、CD45RA-APC-H7、CD90-PerCP-Cy5.5，流式分析检测各细胞群的比例。
根据得出的各群细胞数量以及比例的数值，采用GraphPad Prism7软件进行统计分析。
结果分析：
由图1、2可知，白杨素C2968小分子化合物在体外培养中可显著提高HSPC(CD34+CD38-)的比例与绝对数(白杨素C2968组(2.5μM浓度)为4.0％与900，对照组(0.01％DMSO)为1.0％与200，p<0.0001)；显著提高HSC(CD34+CD38-CD49f+)的比例(白杨素C2968组(2.5μM浓度)为5.2％，对照组(0.01％DMSO)为2.1％，p<0.001)，同时，HSC细胞的绝对数量也提高了约4倍(p<0.0001)；对于较原始的干性较强的HSC(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)，白杨素C2968小分子化合物也有一定的促进作用，处理后C2968组(2.5μM浓度)CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞的绝对数比对照组提高了约7.5倍(p<0.0001)。由以上结果可知，白杨素C2968小分子化合物处理hCD34+后的确可以显著提高造血干细胞的水平。
实施例4：细胞体外功能分析
采用克隆形成实验(colony-forming cells，CFC)对经过白杨素C2968小分子化合物处理的人造血干细胞进行体外功能分析，结果显示白杨素C2968小分子化合物体外处理对HSCs体外短期分化为粒系细胞/巨噬细胞及多潜能祖细胞的能力有增强作用。
CFC实验检测白杨素C2968小分子化合物对人造血干细胞体外短期造血能力作用的实验方法：
①将新鲜分离的CD34+细胞用配制好的培养基(Gibco Iscove's ModifiedDulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬，调整至浓度为5×104细胞/mL，每孔190μL细胞悬液铺于96孔板中，随后立即加入10μL终浓度为2.5μM的待测化合物(白杨素C2968)，对照组则添加0.01％DMSO，每组设置6-10个复孔，吹打混匀；
②将细胞置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养7天；
③7天后取出96孔板，离心1500rpm 8分钟，弃上清，将细胞沉淀用2ml PBS缓冲液重悬，离心1500rpm 8分钟，洗细胞；
④弃上清，每孔用200μL IMDM重悬，取中间8个复孔中各4μL细胞悬液(对应200个原始细胞)于1.5mL EP管，再加入48μL双抗，每管共80μL；
⑤按照10μL细胞悬液对应1mL H4434半固体培养基的比例，将适量细胞悬液加入过夜4℃化冻好的半固体中，充分涡旋震荡混匀；
⑥静置5-10分钟以沉降涡旋过程中形成的气泡，使用Syringes针吸取半固体培养基，按每孔1mL缓慢加入6孔板中，避免产生气泡，缓慢晃动板子使其均匀铺在孔内，孔间空隙用PBS液封(若出现气泡，取注射器针头在酒精灯处短暂烧灼后，快速扎破气泡)，每组设置4-6个复孔；
⑦将6孔板小心放置在5％CO2，37℃恒温培养箱中培养10-14天，培养期间注意观察集落形成情况，击落密度合适时取出，显微镜下观察各血细胞集落形态，根据细胞克隆形成的形态计数不同种克隆的数目。
采用Excel统计各集落(BFU-E红细胞爆式集落形成单位，CFU-E红细胞集落形成单位，CFU-GM粒系细胞/巨噬细胞集落形成单位，CFU-GEMM多潜能祖细胞集落形成单位)数量，采用GraphPad Prism7软件进行统计分析。
结果分析：
由图3可知，白杨素C2968(2.5μM)处理后，体外形成的CFU-GM集落数目和CFU-GEMM集落数目与对照组相比有增多(p<0.05)，由此可知白杨素C2968小分子化合物体外处理对HSCs体外短期分化为粒系细胞/巨噬细胞及多潜能祖细胞的能力有增强作用。
实施例5：动物模型试验
采用免疫缺陷鼠模型是检测造血干细胞的造血重建能力的金标准，通过移植实验可检测移植细胞的长期造血能力，通过本次实验发现，白杨素C2968小分子化合物处理后并未损伤细胞的造血重建能力，且可有效提高人细胞的植入率。
①将新鲜分得的人脐带血CD34+细胞用少量无菌PBS缓冲液重悬，进行细胞计数；
②按照细胞数标记CD34、CD38、CD45RA、CD90抗体，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟，每隔10分钟涡旋混匀；
Figure BDA0002261406680000071
③孵育结束后的细胞加入适量PBS缓冲液混匀，离心1500rpm，8分钟；
④离心结束后弃上清，细胞沉淀用PBS缓冲液重悬至细胞浓度约为5×106-1×107cells/mL；
⑤上机分选前加入约1-2μL的无菌DAPI溶液，根据事先设定的荧光补偿模板进行流式分选，分选DAPI-CD34+CD38-CD45RA-CD90+于96孔板中，每孔收集300个细胞，96孔板中事先加好190μL扩增培养基(Gibco Iscove's Modified Dulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L)；
⑥96孔板中，给药组加入10μL使用同种培养基稀释过的白杨素(C2968)小分子化合物，白杨素(C2968)小分子化合物的终浓度为2.5μM。对照组则添加相同量0.01％DMSO，随后置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养4天；
⑦另取一定数量的新鲜分选DAPI-CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞，用PBS缓冲液调整浓度为每25μL中含有300个细胞，于Day0进行髓腔移植，作为未培养对照组；
⑧将培养结束后的细胞收集入离心管中，离心1500rpm，8分钟，洗去培养基及化合物；
⑨弃上清，细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重悬，调整浓度为每25μL中含有300个起始DAPI-CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞，随后准备移植；
⑩所采用小鼠为4-5周龄NOG小鼠，移植前8-10h进行半致死剂量(220cGy)照射；
Figure BDA0002261406680000072
将照射后的小鼠按体重进行随机分组后，在超净工作台中，每只腹腔注射200μL戊巴比妥钠麻醉剂，麻醉NOG小鼠；待小鼠完全麻醉后，用剃毛仪将其注射侧下肢部位脱毛处理，使小鼠皮肤暴露；用酒精棉球对脱毛部位消毒，按照分组用30号胰岛素针吸取25μl对应组别细胞悬液，并对NOG小鼠胫骨与股骨连接处的骨头端口进行穿孔，确定针头在骨髓腔内时慢慢推动胰岛素针，使细胞悬液进入髓腔中；将移植后的小鼠放置在电热垫上，待其苏醒，以防止麻醉后体温过低影响后续实验；待其苏醒后观察其活动情况，如活动正常，则将苏醒后的小鼠放回笼中继续饲养；
Figure BDA0002261406680000081
于移植后的16周，处死小鼠，取双侧骨髓进行流式分析检测hCD45+细胞所占比例，以及髓系细胞CD33、淋系细胞CD19、红系细胞CD235a、巨核系细胞CD41a、T细胞CD3、NK细胞CD56细胞表面标志，以检测移植水平、迁移能力、造血重建能力及多系分化能力。
结果分析：
由图4、5可知，利用以上实验方法，移植后在小鼠内可成功出现来源于人的细胞群，并且经白杨素C2968小分子化合物处理后，细胞的造血重建能力及迁移能力明显优于对照组和未培养组，白杨素C2968处理组小鼠注射侧与非注射侧骨髓中来源于人的CD45+细胞植入率在20％-30％的小鼠数目多于对照组和未培养组，如下表所示：
通过分析hCD45+细胞中CD33(髓系)、CD19(髓系)的比例，我们发现白杨素C2968处理扩增后HSCs依然能够向髓淋系分化。因此可认为，经过2.5μM白杨素C2968小分子化合物体外培养后HSCs细胞并未丧失其造血重建的能力，并进行了有效的自我更新和多向分化。

Claims (10)

1.白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：在该用途中，白杨素在扩增培养基中的浓度为1-10μM。
3.一种人造血干细胞扩增培养基，其特征在于:包括白杨素。
4.根据权利要求3所述的一种人造血干细胞扩增培养基，其特征在于:该人造血干细胞扩增培养基还包括条件性培养基。
5.根据权利要求3或4所述的一种人造血干细胞扩增培养基，其特征在于:在该人造血干细胞扩增培养基中，白杨素的浓度为1-10μM。
6.根据权利要求5所述的一种人造血干细胞扩增培养基，其特征在于:该条件性培养基的配方为：IMDM+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S。
7.一种扩增人造血干细胞的方法，其特征在于：该方法采用权利要求3-6任一项所述的人造血干细胞扩增培养基对人造血干细胞进行培养。
8.根据权利要求7所述一种扩增人造血干细胞的方法，其特征在于：所述人造血干细胞为脐带血造血干细胞。
9.根据权利要求7或8所述一种扩增人造血干细胞的方法，其特征在于：其特征在于：所述培养的条件为：37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
10.一种扩增人造血干细胞的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：将新鲜分离的人脐带血CD34+细胞使用条件性培养基(Gibco Iscove's Modified Dulbecco's Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬至细胞浓度为5×104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的白杨素小分子化合物，白杨素小分子化合物的终浓度为1-10μM；在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养7天。
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