CN112852733A - 欧当归内酯a在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及欧当归内酯A在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途，具体地，所述用途中，欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为1‑10μM,更优选地，欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为5‑10μM。本发明欧当归内酯A及其结构类似于对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。

Description

欧当归内酯A在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途

技术领域

本发明涉及欧当归内酯A的新用途，具体地，本发明涉及欧当归内酯A在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)的再生潜能使其在白血病治疗、肿瘤病人化疗后造血功能重建以及遗传病、肿瘤的基因治疗等方面发挥着重要作用。脐带血富含造血干细胞，并具有免疫原性低、供体安全、来源广泛、采集容易等优点，因次脐带血移植成为骨髓及外周血造血干细胞移植的极佳替代来源。

然而，脐带血中HSCs的比例仅占0.1％～1％左右，由于造血干祖细胞数量不够、质量欠佳、植活成功率低等诸多棘手问题导致脐带血HSCs移植后难以在患者体内进行有效地造血重建，很大程度上制约了干细胞产业的发展与临床应用。前人研究中曾尝试液体培养基中加入多种细胞因子组合、同基质细胞共培养或在生物反应器中培养等方法以达到体外扩增HSCs的目的，但上述方法扩增效果仍不够理想，HSCs在体外很快发生分化、衰竭，最终大部分丧失造血重建功能，难以获得足量的具有移植能力的HSCs应用于临床治疗。因此，在体外安全有效地扩增脐带血干细胞对于临床的移植应用具有很重要的意义。

小分子化合物在体外培养中显示了其独特的优势。首先，小分子化合物相较于细胞因子或转录因子等其性质更为稳定；其次，化合物的作用效果可以通过改变化合物的结构、浓度来调控，其过程简单可控；此外，其给药途径方便多样，前期合成制备流程相对简单、易于大规模生产，有利于临床转化应用。Science杂志2010年报道的嘌呤衍生物SR1、2014年报道的UM171均能够在体外有效扩增人的造血干、祖细胞，除此之外目前还有多个小分子化合物被发现能在体外提高造血细胞亚群的比例，或者提高被处理细胞的移植成功率。因此，在传统扩增造血干细胞的方法中加入小分子化合物，可能对体外培养中失去体内niche环境而易于发生分化或衰竭的HSC的自我更新、分化、迁移、凋亡等方面发挥作用，进而促进HSPC的体外扩增。

因此，寻求合适的小分子化合物用于体外安全有效地扩增脐带血干细胞对于临床的移植应用具有很重要的意义。

欧当归内酯A(LevistilideA)来源于川芎的根部，现主要作为中药对照品用于含量测定及医药研究。同时现有技术中也公开了一些其他用途，如：专利CN102772400A公开了欧当归内酯A或其可药用盐、前药的制备预防或者治疗肝纤维化或肝硬化的药物的用途。专利109568308A公布了藁本内酯及其结构类似物(丁烯基苯酞、欧当归内酯A)等，在制备预防或治疗急性髓系白血病的药物或保健品中的用途。

目前关于欧当归内酯A用于人造血干细胞体外扩增，国内外未见报道。本发明创造性地发现欧当归内酯A对人造血干细胞体外扩增有显著的作用。

发明内容

本发明的目的是提供了欧当归内酯A在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了欧当归内酯A或其结构类似物在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途。

所述的结构类似物为新蛇床内酯(化学名：正丁基四氢苯酞)。

欧当归内酯A(Levistilide A)的结构为：

新蛇床内酯(Neocnidilide)的结构为：

具体地，所述用途中，欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为1-10μM,更优选地，欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为5-10μM。

所述用途中，新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为10-40μM，更优选地，新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为20-40μM。

本发明还提供了一种人造血干细胞体外扩增的方法，该方法包括在人脐带血CD34⁺细胞在包含欧当归内酯A或其结构类似物的培养基中进行培养的步骤。

进一步，所述的培养基中，欧当归内酯A的浓度为：1-10μM。更优选为：5-10μM。

进一步，所述的结构类似物为新蛇床内酯，新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为10-40μM，更优选为20-40μM。

具体地，本发明还提供了一种人造血干细胞体外扩增方法，包括如下步骤：

将新鲜分离的人脐带血CD34⁺细胞使用培养基(IMDM+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P.S.)重悬至细胞浓度为5×10⁴细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的欧当归内酯A或新蛇床内酯，欧当归内酯A的终浓度为10μM；新蛇床内酯的终浓度为40μM。在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养7天。

本发明所具有的有益效果：

本发明欧当归内酯A及其结构类似于对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。

附图说明

图1.实施例2中不同浓度化合物的体外培养统计分析图；

图2.实施例4中体外培养后细胞表型比例和绝对数量变化统计分析图；

图3.实施例4中体外培养后细胞表型比例典型流式图；

图4.实施例5中克隆形成实验不同集落细胞数目统计图；

图5.实施例6中移植后各组小鼠骨髓内hCD45⁺细胞植入率水平统计分析图；

图6.实施例6中移植后各组小鼠骨髓内人源髓系细胞、淋系细胞、T细胞、巨核细胞、红细胞、NK细胞比例统计分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

一种小分子化合物欧当归内酯A(Levistilide A)，其结构为：

该小分子化合物欧当归内酯A的理化鉴别，包括：

高效液相色谱法(HPLC)测定纯度:98.8％.

氢核磁共振(¹H NMR)(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝6.6Hz,1H),5.06(t,J＝7.9Hz,1H),4.99(t,J＝7.5Hz,1H),3.24(d,J＝8.9Hz,1H),2.98(dd,J＝6.5,2.1Hz,1H),2.54(t,J＝7.7Hz,1H),2.28(q,J＝7.6Hz,2H),2.24–2.14(m,3H),2.13–1.98(m,2H),1.97–1.82(m,2H),1.63–1.40(m,6H),1.30(ddd,J＝12.2,4.7,2.6Hz,1H),0.98–0.87(m,6H).

碳核磁共振(¹³C NMR)(100MHz,CDCl3)δ168.6,165.0,155.1,150.6,148.1,142.2,134.3,126.7,112.3,108.7,47.7,41.7,41.6,38.4,31.2,29.1,28.1,27.6,25.9,22.4,22.4,19.9,14.1,13.9.

高分辨质谱HRMS(ESI)测定C₂₄H₂₉O₄ ⁺[M+H]⁺:381.2060,found 381.2062.

一种小分子化合物新蛇床内酯(Neocnidilide)，其结构为：

该小分子化合物新蛇床内酯的理化鉴别，包括：

高效液相色谱法(HPLC)测定纯度:98.3％.

氢核磁共振(¹H NMR)(400MHz,CDCl₃)δ6.75(s,1H),4.08–3.88(m,1H),2.48(s,1H),2.40–2.10(m,2H),1.97(m,2H),1.74(d,J＝5.8Hz,2H),1.58–1.44(m,2H),1.39(m,3H),1.25–1.07(m,1H),0.96–0.84(m,3H).

碳核磁共振(¹³C NMR)(100MHz,CDCl₃)δ170.4,135.3,131.3,85.5,43.2,34.5,27.7,25.5,25.1,22.7,20.9,14.0.

高分辨质谱HRMS(ESI)测定C₁₂H₁₈NaO₂ ⁺[M+Na]⁺:217.1199,found 217.1205.

实施例2不同浓度的化合物作用

将新鲜分离的人脐带血CD34⁺细胞使用培养基(Gibco Iscove’s ModifiedDulbecco Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬至细胞浓度为5×10⁴细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL浓度梯度为2.5、5、10、20和40μM欧当归内酯A(L)和新蛇床内酯(N)进行培养，以含量相同的0.05％DMSO作为溶剂对照，培养7天后进行流式分析检测CD34+细胞中CD34+CD38-造血干祖细胞和相对更原始的CD34+CD49f+细胞的比例。

结果分析：如图1所示，对于CD34+CD38-细胞群，两种化合物均呈现出近似于剂量依赖性的扩增效果，对于CD34+CD49f+细胞群，欧当归内酯A在2.5-10μM范围显著扩增，在10μM达到最高扩增倍数2.21倍，新蛇床内酯在20μM和40μM分别扩增2.03和2.65倍。

实施例3

一种人造血干细胞体外扩增方法，包括如下步骤：

将新鲜分离的人脐带血CD34⁺细胞使用培养基(Gibco Iscove’s ModifiedDulbecco Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬至细胞浓度为5×10⁴细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的欧当归内酯A小分子化合物，欧当归内酯A的终浓度为10μM。在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养7天。

实施例4：细胞表型分析

采用流式检测CD34+CD38-、CD34+CD38-CD49f+、CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞的比例以及绝对数量对欧当归内酯A体外扩增造血干细胞的作用进行验证，结果显示欧当归内酯A对于造血干细胞的体外扩增作用明显。

流式分析检测欧当归内酯A对人造血干细胞体外扩增作用的实验方法：

①将采集到的新生儿脐带血置于洁净无菌的200ml血浆瓶中，按照羟乙基淀粉(HES):脐带血＝4：1的体积比例加入HES，吹打混匀后，室温静置40分钟至1小时，充分沉降血液中的红细胞；

②使用25ml一次性无菌移液管将沉降后脐带血的上清轻轻吸出，置于50ml离心管中，每个离心管中约加入20到25ml上清液，离心1500rpm，10分钟；

③弃上清，向细胞沉淀中加入40ml无菌红细胞裂解液(ACK)进行重悬，将离心管置于37℃水浴中裂解红细胞约15分钟，期间上下颠倒离心管混匀数次，离心1500rpm，10分钟；

④弃上清，细胞沉淀先用1-2ml无菌PBS缓冲液吹打成单细胞悬液，再加入20mlPBS缓冲液洗涤细胞，同时取10μl细胞悬液(用PBS缓冲液稀释100倍后)进行MNC细胞计数。离心1500rpm，10分钟；

⑤弃上清，细胞沉淀用1ml PBS缓冲液重悬，吹打混匀后，根据MNC数量依次加入适量FCR Blocking Reagent(可封闭非特异性结合位点)受体阻断剂和CD34Microbeads，充分混匀后，将离心管放置于4℃避光孵育20分钟(期间每隔10分钟晃动混匀，防止形成细胞沉淀影响磁珠孵育)；

⑥孵育结束后，每管用20ml PBS缓冲液洗细胞(洗去未与细胞结合的磁珠)，若有沉淀，需要过滤，离心1500rpm，10分钟，弃上清，用1ml PBS缓冲液重悬；

⑦安装LS柱于磁架上，在柱口处覆盖一块40μm细胞过滤网(以防细胞团块堵住分选柱)，依次用1ml PBS缓冲液润柱3遍；

⑧逐滴加入细胞悬液，于磁场中通过，至分选柱内细胞留尽后，向柱中加入1mlPBS缓冲液进行洗柱，以清洗柱内残留的非目标细胞，洗柱3遍；

⑨将柱子移出磁场，放在收集管上，加入2ml PBS缓冲液，用活塞快速推出磁珠标记的细胞，取10ul计数；

⑩将获得的细胞用培养基(Gibco Iscove’s Modified Dulbecco Medium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P.S.)重悬细胞至浓度为5×10⁴cells/mL，每孔190μL细胞悬液铺于96孔板中，随后立即加入10μL终浓度为10μM的待测化合物欧当归内酯A，对照组则添加0.05％DMSO，每组设置6-10个复孔，吹打混匀；

细胞于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养7天；

7天后，标记抗体CD34-APC、CD38-PE-Cy7、CD49f-PE、CD45RA-APC-H7、CD90-PerCP-Cy5.5，流式分析检测各细胞群的比例。

根据得出的各群细胞数量以及比例的数值，采用GraphPad Prism7软件进行统计分析。

结果分析：

由图2、3可知，欧当归内酯A在体外培养中可显著提高HSC(CD34⁺CD38^-CD49f⁺)的比例(欧当归内酯A组(10μM浓度)为1.64％，对照组(0.05％DMSO)为0.81％)，处理后欧当归内酯A组中10μM浓度时，其为对照组的2倍，且具有显著性差异(p<0.01)；同时，在该浓度下，欧当归内酯A处理后，CD34⁺CD38^-CD49f⁺细胞的绝对数量也提高了约3.7倍(欧当归内酯A组为18/1036cells，对照组为5/620cells，p<0.0001)。对于干性更强的LT-HSC(CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺)，欧当归内酯A也有一定的促进作用，处理后欧当归内酯A组(10μM浓度)CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺细胞的绝对数比对照组提高了约2.4倍(欧当归内酯A组为5/60cells，对照组为2/57cells，p<0.05)。由以上结果可知，欧当归内酯A处理hCD34⁺后的确可以显著提高造血干细胞的水平。

实施例5：细胞体外功能分析

采用克隆形成实验(colony-forming cells，CFC)对经过欧当归内酯A处理的人造血干细胞进行体外功能分析，结果显示欧当归内酯A体外处理对HSCs体外短期分化能力有增强作用。

CFC实验检测欧当归内酯A对人造血干细胞体外短期造血能力作用的实验方法：

①将新鲜分离的CD34⁺细胞用配制好的培养基(Gibco Iscove’s ModifiedDulbeccoMedium+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L+1％P/S)重悬，调整至浓度为5×10⁴细胞/mL，每孔190μL细胞悬液铺于96孔板中，随后立即加入10μL终浓度为10μM的待测化合物欧当归内酯A，对照组则添加0.05％DMSO，每组设置6-10个复孔，吹打混匀；

②将细胞置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养7天；

③7天后取出96孔板，离心1500rpm 8分钟，弃上清，将细胞沉淀用2ml PBS缓冲液重悬，离心1500rpm 8分钟，洗细胞；

④弃上清，每孔用200μl IMDM重悬，取中间8个复孔中各4μl细胞悬液(对应200个原始细胞)于1.5ml EP管，再加入48μl双抗，每管共80μl；

⑤按照10μl细胞悬液对应1ml H4434半固体培养基的比例，将适量细胞悬液加入过夜4℃化冻好的半固体中，充分涡旋震荡混匀；

⑥静置5-10分钟以沉降涡旋过程中形成的气泡，使用Syringes针吸取半固体培养基，按每孔1ml缓慢加入6孔板中，避免产生气泡，缓慢晃动板子使其均匀铺在孔内，孔间空隙用PBS液封；(若出现气泡，取注射器针头在酒精灯处短暂烧灼后，快速扎破气泡)

⑦将6孔板小心放置在5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养10-14天，培养期间注意观察集落形成情况，击落密度合适时取出，显微镜下观察各血细胞集落形态，根据细胞克隆形成的形态计数不同种克隆的数目。

采用Excel统计各集落(BFU-E红细胞爆式集落形成单位，CFU-E红细胞集落形成单位，CFU-GM粒系细胞/巨噬细胞集落形成单位，CFU-GEMM多潜能祖细胞集落形成单位)数量，采用GraphPad Prism7软件进行统计分析。

结果分析：

由图4可知，欧当归内酯A(10μM)处理后，体外形成的CFU-E集落数目与总集落数目与对照组相比有增多(p<0.05)，由此可知欧当归内酯A小分子化合物体外处理对HSCs体外短期分化为红系细胞的能力有增强作用。

实施例6：动物模型试验

采用免疫缺陷鼠模型是检测造血干细胞的造血重建能力的金标准，通过移植实验可检测移植细胞的长期造血能力，通过本次实验发现，欧当归内酯A处理后并未损伤细胞的造血重建能力，且可有效提高人细胞的植入率。

①将新鲜分得的人脐带血CD34⁺细胞用少量无菌PBS缓冲液重悬，进行细胞计数；

②按照细胞数标记CD34、CD38、CD45RA、CD90抗体，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟，每隔10分钟涡旋混匀；

③孵育结束后的细胞加入适量PBS缓冲液混匀，离心1500rpm，8分钟；

④离心结束后弃上清，细胞沉淀用PBS缓冲液重悬至细胞浓度约为5×10⁶-1×10⁷cells/mL；

⑤上机分选前加入约1-2μl的无菌DAPI溶液，根据事先设定的荧光补偿模板进行流式分选，分选DAPI^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺于96孔板中，每孔收集3000个细胞，96孔板中事先加好200μl无血清扩增培养基(StemSpan SFEM培养基+100ng/mL SCF+100ng/mL TPO+100ng/mL Flt3L)；

⑥96孔板中，给药组加入适量10μM的欧当归内酯A工作液，对照组则添加相同量0.05％DMSO，随后置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养4天；

⑦另取一定数量的新鲜分选DAPI^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞，用PBS缓冲液调整浓度为每25μl中含有300个细胞，于Day0进行髓腔移植，作为未培养对照组；

⑧将培养结束后的细胞收集入离心管中，离心1500rpm，8分钟，洗去培养基及化合物；

⑨弃上清，细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重悬，调整浓度为每25μl中含有300个起始DAPI^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞，随后准备移植；

⑩所采用小鼠为4-5周龄NOG小鼠，移植前8-10h进行半致死剂量(220cGy)照射；

将照射后的小鼠按体重进行随机分组后，在超净工作台中，每只腹腔注射200μl戊巴比妥钠麻醉剂，麻醉NOG小鼠；待小鼠完全麻醉后，用剃毛仪将其注射侧下肢部位脱毛处理，使小鼠皮肤暴露；用酒精棉球对脱毛部位消毒，按照分组用30号胰岛素针吸取25μl对应组别细胞悬液，并对NOG小鼠胫骨与股骨连接处的骨头端口进行穿孔，确定针头在骨髓腔内时慢慢推动胰岛素针，使细胞悬液进入髓腔中；将移植后的小鼠放置在电热垫上，待其苏醒，以防止麻醉后体温过低影响后续实验；待其苏醒后观察其活动情况，如活动正常，则将苏醒后的小鼠放回笼中继续饲养；

分别于移植后的4周、8周、12周进行为尾血检测hCD45⁺比例；并于12周后，处死小鼠，取双侧骨髓进行流式分析检测hCD45⁺细胞所占比例，以及髓系细胞CD33、淋系细胞CD19、红系细胞CD235a、巨核系细胞CD41a、T细胞CD3、NK细胞CD56细胞表面标志，以检测移植水平、造血重建能力及多系分化能力。

结果分析：

由图5、6可知，利用以上实验方法，移植后在小鼠内可成功出现来源于人的细胞群，并且经欧当归内酯A处理后，细胞的造血重建能力明显优于对照组和未培养组，欧当归内酯A处理组小鼠骨髓中来源于人的CD45⁺细胞植入率在15％-30％和>45％的小鼠数目多于对照组和未培养组，如下表所示：

通过分析hCD45⁺细胞中CD33(髓系)、CD19(髓系)的比例，我们发现欧当归内酯A处理扩增后HSCs依然能够向髓淋系分化；同时，经欧当归内酯A处理后，能检测到小鼠骨髓内人源巨核细胞(hCD41a⁺)和红系细胞(hCD235a⁺)的比例明显高于未培养组和对照组，说明向该系分化的能力显著提高，与体外CFC功能验证结果一致，而免疫细胞T细胞(hCD45⁺CD3⁺)和NK细胞(hCD45⁺CD56⁺)的分化水平在各组间无显著差异。因此可认为，经过欧当归内酯A体外培养后HSCs细胞并未丧失其造血重建的能力，并进行了有效的自我更新和多向分化。

Claims (8)

1.欧当归内酯A或其结构类似物在制备人造血干细胞体外扩增的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的结构类似物为新蛇床内酯。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为1-10μM,更优选地，欧当归内酯A在扩增培养基中的浓度为5-10μM。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为10-40μM，更优选地，新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为20-40μM。

5.一种人造血干细胞体外扩增的方法，其特征在于：该方法包括在人脐带血CD34⁺细胞在包含欧当归内酯A或其结构类似物的培养基中进行培养的步骤。

6.根据权利要求5所述的一种人造血干细胞体外扩增的方法，其特征在于：所述的培养基中，欧当归内酯A的浓度为：1-10μM；更优选为：5-10μM。

7.根据权利要求5所述的一种人造血干细胞体外扩增的方法，其特征在于：所述的结构类似物为新蛇床内酯，新蛇床内酯在扩增培养基中的浓度为10-40μM，更优选为20-40μM。

8.一种人造血干细胞体外扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：

将新鲜分离的人脐带血CD34⁺细胞使用培养基(IMDM+10％FBS+100ng/mL SCF+100ng/mLTPO+100ng/mL Flt3L+1％P.S.)重悬至细胞浓度为5×10⁴细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190μL细胞悬液，随后向其中添加10μL使用同种培养基稀释过的欧当归内酯A或新蛇床内酯，欧当归内酯A的终浓度为10μM；新蛇床内酯的终浓度为40μM。在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养7天。

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