KR20180063332A - 유전자 프로그래밍에 의한 다중-계통 조혈 전구 세포 생산 - Google Patents

유전자 프로그래밍에 의한 다중-계통 조혈 전구 세포 생산 Download PDF

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쥔잉 유
막심 에이. 보디아니크
제프리 사사키
디피카 라제쉬
사라 에이. 버튼
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 일반적으로 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)로부터 다중-계통 조혈 전구 세포를 제공하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. PSC는 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 암호화하는 발현 작제물을 포함한다. 또한, 사람과 같은 포유동물에서 장기간 생착(engraftment)시킬 수 있는 조혈 줄기 세포를 제공하기 위한 방법도 제공된다. 추가로, 제공된 조혈 줄기 세포 및 조혈 세포의 전구체를 포함하는 치료학적 조성물 및 대상체의 치료를 위해 상기 치료학적 조성물을 이용하는 방법이 제공된다.

Description

유전자 프로그래밍에 의한 다중-계통 조혈 전구 세포 생산
본 출원은 2015년 10월 20일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제62/244,101호 및 2016년 10월 5일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제62/404,470호의 우선권 이익을 주장하고, 상기 출원 둘 다의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명의 배경
1. 본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학, 줄기 세포 및 분화된 세포의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 세포 계통에 대한 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell), 구체적으로는 조혈 세포 및 조혈 세포의 전구체(precursor)의 프로그래밍에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기술
조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)는 무기한 자기-재생하고, 모든 혈액 세포 유형으로 분화하고, 이식시에 전체 조혈계를 재구성하는 능력을 지닌 유일한 세포이다. 이들 세포는 적혈구, 혈소판, 과립구 및 림프구 세포와 같은 이들의 말단 분화된 유도체 세포 유형과 함께 각종 혈액 장애, 그리고 보다 최근에는 암을 치료하는데 있어서의 치료학적 적용을 잘 확립하여 왔다. 그러나, HLA-일치된(matched) 생체 공여자 유래의 HSC의 제한된 입수가능성(availability)은 진료소에서의 이들의 광범위한 사용을 주로 제한한다. 따라서, 대안의 세포 유형으로부터 HSC를 유도하기 위한 상당한 노력이 이루어져 왔다.
대안의 세포 유형으로부터 HSC를 유도하기 위한 하나의 접근법은 비-HSC 체세포 유형을 HSC로 전환분화시키는 것이다. 마우스 섬유아세포를 생착불가능한(non-engraftable) 조혈 선조체(progenitor)로 전환분화시키기 위해 전이유전자의 각종 조합을 이용하여 왔다(Pereira et al., 2013; Batta et al., 2014). 그러나, 이러한 접근법은 낮은 전환분화 효율과 함께 개시 1차 세포의 수로 인하여 제한된다. 따라서, 장기간 생착할 잠재력을 갖는 조혈 전구 세포의 무제한 공급을 제공하는 방법은 없다.
사람 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell) 및 유도된 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)는 모든 체세포 유형으로 분화할 잠재력을 보유하면서 시험관내에서(in vitro) 무제한 증식할 수 있다. 따라서, 사람 ESC 및 iPSC는 잠재적으로 시험관내 및 생체내(in vivo) 적용 둘 다를 위해 환자-특이적 HSC 및 기능적 혈액 세포의 무제한 공급을 제공할 수 있다. 시험관내에서 사람 PSC의 조혈 계통의 세포로의 분화는 중배엽 유도의 단계 및 다능성 조혈 전구체의 설계(specification)를 포함하는 정상적인 생체내 발생을 재현한다. 따라서, 순방향 프로그래밍(forward programming)을 통해 사람 PSC를 조혈 계통으로 분화시키기 위한 다수의 방법이 개발되어 왔다.
그러나, 주로 조혈 개체발생의 복잡한 성질로 인하여, PSC로부터의 효율적인 골수 및 림프구 분화 및 장기간 생착이 가능한 HSC의 강력한 생성을 가능하게 하는 방법은 없다. 한 방법에서, 마우스 PSC의 조혈 분화를 위한 HoxB4 및 Lhx2와 같은 전이유전자의 과발현은 생착가능한 HSC-유사 세포를 생성시키는 것으로 밝혀졌다(Kyba et al. 2002; Kitajima et al., 2011). 그러나, 이들 전이유전자는 사람 PSC로부터 HSC를 생성하는데 실패하였다. 다른 방법에서, Doulatov 등은 사람 PSC에서의 ERG, HOXA9, RORA, SOX4 및 MYB 전이유전자의 조합이 골수 및 적혈구를 분화시킬 수 있었던 조혈 선조체의 생산을 가능하게 하였음을 보고하였다(Doulatov et al., 2013). 그러나, 이러한 방법은 지속적 전이유전자 발현에 의존한 단기간 생착가능한 세포만을 생성시켰다. 따라서, 유전자 프로그래밍이 매우 유망한 접근법인 것으로 입증됨에도 불구하고, 시험관내에서 사람 PSC로부터의 림프구 및 골수의 잠재적 및 장기간 생착이 가능한 조혈 전구 세포의 강력한 생성을 가능하게 하는 방법은 없다.
본 발명의 요약
본 개시의 실시형태들은 다중-계통 조혈 선조체로의 사람 만능 줄기 세포의 효율적인 프로그래밍 방법을 제공한다. 제1 실시형태에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)를 제공하는 단계(여기서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 포함한다); 및 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic precursor cell)를 생산하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포(HPC)를 생산하기 위한 시험관내(in vitro) 방법이 제공된다. 소정 양상들에서, 상기 HPC는 골수 및 림프구 계통으로 분화할 수 있다. 몇몇의 양상들에서, 상기 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell) 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)이다. 소정 양상들에서, 상기 만능 줄기 세포는 사람이다.
소정 양상들에서, 상기 발현 작제물은 트랜스포손(transposon)- 또는 에피솜(episome)-기반 발현 작제물이다. 몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 특정 양상들에서, 상기 단일 프로모터는 유도가능한 프로모터이다. 특정 양상들에서, 상기 유도가능한 프로모터는 테트라사이클린-유도가능한 프로모터이다.
추가의 양상들에서, 상기 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 방법은 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 발현되지 않도록 하는 조건 하에서 상기 HPC를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 HPC는 기질 세포의 부재 하에 배양된다. 몇몇의 양상들에서, 상기 HPC는 무혈청 또는 제한 배지에서 배양된다. 소정 양상들에서, 상기 HPC는 혈장 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 비만 세포, 거핵구, 적혈구, 과립구, 림프구, 단핵구, 백혈구 및 혈소판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 소정 양상들에서, 상기 림프구는 B 림프구 및/또는 T 림프구이다.
몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 발현되지 않도록 하는 조건 하에서 상기 만능 줄기 세포를 배양하는 단계는 약 4일 내지 약 10일이다.
소정 양상들에서, 상기 HPC는 하나 이상의 조혈 전구체 마커를 발현한다. 몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 마커는 CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a 및 CD41a로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 전구체 마커는 CD43, CD45 및 CD34로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 몇몇의 양상들에서, 상기 HPC는 미성숙 HPC이다. 소정 양상들에서, 상기 미성숙 HPC가 CD34 및 CD43을 발현한다. 몇몇의 양상들에서, 상기 HPC의 적어도 50%, 예를 들면, 상기 HPC의 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%가 미성숙 HPC이다. 추가의 양상들에서, 상기 HPC의 적어도 70%가 미성숙 HPC이다. 또한 추가의 양상들에서, 상기 HPC의 적어도 90%가 미성숙 HPC이다.
소정 양상들에서, 상기 ETS/ERG 유전자는 ERG(v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 동족체), ETV2(ets 변이체 2), FLI-1(프리엔드(Friend) 백혈병 바이러스 통합 1), ELK3(ETS 도메인-함유 단백질), ETS1(C-ets-1) 또는 ETS2(C-ets-2)이다. 특정 양상들에서, 상기 ETS/ERG 유전자는 ERG 또는 ETV2이다.
몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ERG, GATA2 및 HOXA9를 포함한다. 다른 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETV2, GATA2 및 HOXA9를 포함한다.
소정 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 표적화 서열에 융합되어 있다. 예를 들면, 상기 표적화 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다. 소정 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함한다. 다른 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함한다.
추가의 양상들에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 작제물을 포함하는 상기 PSC는 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 추가의 발현 작제물을 추가로 포함한다.
또한 추가의 양상들에서, 만능 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 상기 시험관내 방법은 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 HPC를 배양함으로써 포유동물에서 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 포유동물은 사람이다. 몇몇의 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667 및 ZNF682로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 및 MSI2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 및 RBAK로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
몇몇의 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자의 발현은 상기 HPC에서 항상성(constitutive)이다. 소정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자의 발현은 상기 만능 줄기 세포에서 본질적으로 침묵화된다(silenced).
소정 양상들에서, 상기 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 표적화 서열에 융합되어 있다. 특정 양상들에서, 상기 표적화 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다.
다른 실시형태에서, 단일 프로모터의 제어 하에 ERG, GATA2 및 HOXA9를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계; 및 ERG, GATA2 및 HOXA9가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 조혈 전구 세포(HPC)를 생산하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 시험관내 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 단일 프로모터의 제어 하에 ERG, GATA2 및 HOXA9를 암호화하는 발현 작제물 및 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 제2 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계; 및 ERG, GATA2, HOXA9 및 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 포유동물에서 장기간 생착이 가능한 HSC를 생산하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포(HSC)를 생산하기 위한 시험관내 방법이 제공된다.
한 추가의 실시형태에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물로서, 상기 프로그래밍 유전자는 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물이 제공된다. 몇몇의 양상들에서, 상기 작제물은 트랜스포손- 또는 에피솜-기반 발현 작제물이다. 소정 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 몇몇의 양상들에서, 상기 단일 프로모터는 유도가능한 프로모터이다. 특정 양상들에서, 상기 유도가능한 프로모터는 테트라사이클린-유도가능한 프로모터이다. 몇몇의 양상들에서, 상기 ETS/ERG 유전자는 ERG(v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 동족체), ETV2(ets 변이체 2), FLI-1(프리엔드 백혈병 바이러스 통합 1), ELK3(ETS 도메인-함유 단백질), ETS1(C-ets-1) 또는 ETS2(C-ets-2)이다. 특정 양상들에서, 상기 ETS/ERG 유전자는 ERG 또는 ETV2이다. 몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ERG, GATA2 및 HOXA9를 포함한다. 다른 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETV2, GATA2 및 HOXA9를 포함한다. 소정 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 표적 서열에 융합되어 있다. 특정 양상들에서, 상기 표적화 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다. 몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함한다. 다른 양상들에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함한다.
다른 실시형태에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 세포로서, 상기 프로그래밍 유전자가 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 세포가 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물이 제공된다. 특정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667 및 ZNF682로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 및 MSI2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 및 RBAK로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정 양상들에서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 있다. 몇몇의 양상들에서, 상기 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 표적화 서열에 융합되어 있다. 한 특정 양상에서, 상기 표적화 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다.
한 추가의 실시형태에서, 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 세포가 제공된다.
또 하나의 추가의 실시형태에서, 포유동물의 골수에서 생착하여 분화된 사람 혈액 세포를 생산할 수 있는, 사람 만능 줄기 세포로부터 시험관내에서 분화된, 조혈 줄기 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명을 실시하기 위한 구체적 내용 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태들을 나타내지만 단지 설명의 방식으로 제공되는 것이고, 이는 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가들에게 명백해질 것이기 때문임이 이해되어야만 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 소정 양상들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시형태들의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1f. ETV2 /ERG, GATA2 및 HOXA9 의 연계된(linked) 공동-발현은 사람 PSC 를 미성숙 CD34 + 조혈 선조체로 효율적으로 프로그래밍한다. (도 1a) 프로그래밍 유전자 ETV2/ERG, GATA2 및 HOXA9의 시험된 배열(configuration)을 나타낸다. (도 1b) 독시사이클린(DOX: doxycycline)-유도성 유전자 발현을 위해 rtTET 단백질을 구성적으로 발현하도록 조작된 사람 PSC를 이용하여 E+G, EG 및 EGH 유도성 유전자 배열을 시험하였다. (도 1c) ETV2- 및 ERG-기반 유전자 배열 둘 다에서 8일째-유도된 배양물에서의 절대 세포수. (도 1d) MS5 기질 세포와의 공동-배양에서 8일째 DOX-유도된 세포의 확대 및 분화 잠재력을 나타낸다. (도 1e) MS5 기질 세포와의 2주의 공동-배양 후 총 CD43+ 및 미성숙 CD43+CD34+ 세포의 절대 수. (도 1f) MS5 기질과의 2주의 공동-배양 후 EGH-유도된 세포에서 다중-계통 콜로니-형성 잠재력이 검출되었다.
도 2: CMV 프로모터( pCMV )를 이용한 유도-후 전이유전자 발현. pCMV-EGFP 및 pTight-EG 작제물을 PiggyBac 발현 벡터를 이용하여 rtTET-발현 사람 PSC에 도입하였다. CD43+ 세포에서의 EGFP 발현은 DOX-유도된 조혈 프로그래밍에 따라 나타내어진다.
도 3a 내지 도 3c: 확대를 향상시키고 원시(primitive) 조혈 선조체의 CD133 발현을 부여하는 EGH -상보적 전이유전자에 대한 스크리닝. (도 3a) 구성적인 HOXA10 발현(pCMV)을 갖는 EGH-유도된 세포는 MS5 기질과의 2주의 공동-배양 후 가장 원시의 줄기 세포-유사 세포와 관련된 CD43+CD34+CD133+ 세포의 소량 집단을 나타낸다. (도 3b) 향상된 원시 CD43+CD34+ 및 CD43+CD34+CD133+ 세포 생산을 위한 EGH-상보적 유전자를 검출하기 위해 고안된 스크리닝 모델의 개략도. (도 3c) EGH-유도된 원시 선조체의 확대에 대한 긍정적인 효과를 입증하는 유전자에 대한 스크리닝 결과가 나타내어진다. 스코어 = P34 × P133 × (P34/P45), 여기서 P - 내부 EGH 대조군의 분획으로서 계산된 각각의 서브세트의 생산, 34 - CD43+CD34+, 133 - CD43+CD34+CD133+, 45 - CD43/45+CD34- 세포.
도 4a 내지 도 4b: EGH -유도된 세포의 림프구 분화 잠재력. (도 4a) EGH-유도된 세포로부터의 림프구 세포 발달을 향상시키는 유전자를 검출하기 위해 고안된 스크리닝 모델의 도식. (도 4b) 4주의 T/NK 및 B 세포 분화 배양물의 유동 세포측정 분석.
도 5a 내지 도 5c: EGH -유도된 세포의 생착 잠재력. (도 5a) 면역손상된(immunocompromised) 마우스에서 조혈 생착을 가능하게 하는 EGH-상보적 유전자를 검출하기 위해 고안된 스크리닝 모델의 도식. (도 5b) 주사 후 12주째에 NBSGW 마우스의 말초혈 및 골수에서의 사람 조혈 CD45+ 세포 검출이 나타내어진다. (도 5c) 주사 후 12주째에 NBSGW 마우스의 말초혈 및 골수에서의 사람 조혈 CD43/45+ 세포 검출이 나타내어진다.
도 6: 생착된 세포 대 주사된 세포에서의 전이유전자 발현의 비율을 보여주는 그래프. 각각의 생착된/주사된 발현 비율은 세포 이식 후 전이유전자의 농축(양의 값) 또는 결실(음의 값)을 나타낸다.
본 개시는 만능 줄기 세포(PSC)로부터 다중-계통 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 현재 기술로의 몇몇의 주요 문제점을 극복한다. 특히, 상기 다중-계통 조혈 전구 세포는 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포로 프로그래밍될 수 있다. 본 발명자들은, 유전자의 발현이 PSC의 다중-계통 조혈 전구 세포의 '순방향 프로그래밍'을 완화시키는 적어도 3개의 특정 유전자의 발현에 영향을 미치는 하나 이상의 발현 벡터로 PSC를 형질감염시키는 것이 다중-계통 조혈 전구 세포를 얻는 한 방법임을 발견하였다. 특히, 본 개시의 방법은 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포를 포함하는 임의의 유형의 만능 줄기 세포에 적용된다. 특히, 다중-계통 조혈 전구체는 골수 및 림프구 계통의 세포로 효율적으로 분화하는 잠재력을 갖는다.
바람직하게, 조혈 프로그래밍 유전자는 ETV2 또는 ERG, GATA2 및 HOXA9이다. 특정 양상들에서, 상기 조혈 프로그래밍 유전자는 단일 프로모터, 예를 들면, 유도가능한 프로모터의 제어 하에 있다. 일반적으로, 상기 조혈 프로그래밍 유전자는 상기 PSC를 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍하기에 충분한 시간 동안에만 발현된다.
본 발명자들은, 일단 미성숙 다중-계통 조혈 전구체가 형성되면, 조혈 줄기 세포를 장기간 생착할 수 있도록 하기 위해서 추가 단계 또는 단계들을 취하는 것이 바람직하다는 것을 발견했다. 하나의 방법에서, 상기 PSC는, 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)를 암호화하는 하나 이상의 추가의 발현 작제물(들)로 형질감염되고, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)의 발현은 다중-계통 조혈 전구체가 생체내에서 안정하게 생착되는 것을 가능하게 한다. 소정 양상들에서, 장기간 생착을 위한 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)는 미성숙 조혈 전구 세포에서는 발현되지만 PSC에서는 발현되지 않는다.
따라서, 본 개시의 방법은 생체내에서의 조혈 전구체의 안정한 이식, 시험관 내에서의 화합물의 스크리닝, 및 혈액학적 질환 및 손상(injuries)의 메커니즘을 밝히는 것과 같은 광범위한 적용을 위한 무수한 수의 다중-계통 조혈 전구체 및 조혈 줄기 세포를 제공한다.
I. 정의
본원에서 사용되는 특정 구성성분에 관하여 "본질적으로 포함하지 않는"은 본원에서 상기 특정 구성성분 중 의도적으로 조성물로 제형화된 것은 없었고/없었거나 단지 오염물질로서만 존재하거나 또는 미량으로 존재한다는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로부터 얻어지는 특정 구성성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만인 것이 좋다. 표준 분석 방법을 이용하여 검출될 수 있는 특정 구성성분의 양이 존재하지 않는 조성물이 가장 바람직하다.
본원 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 본원 청구범위(들)에서 사용되는 단어 "한" 또는 "하나"는 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다.
청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은 양자 중 하나(alternative)만을 언급하는 것으로 명확하게 나타내어지거나 양자(alternatives)가 상호 배타적이지 않은 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시는 단지 양자택일만을 언급하는 정의 및 "및/또는"을 지지한다. 본원에 사용되는 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전반에서 용어 "약"은 값이 장치에 대한 고유한 오류의 편차, 상기 값을 결정하는데 사용되는 방법 또는 연구 대상체들 사이에 존재하는 편차를 포함함을 나타내는 것으로 사용된다.
세포 또는 유기체에서의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "외인성(exogenous)"은 인공적 또는 자연적 수단에 의해 상기 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 나타내거나; 또는 세포와 관련하여 상기 용어는 단리되어 후속적으로 인공적 또는 자연적 수단에 의해 다른 세포에 또는 유기체에 도입된 세포를 나타낸다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포 유래일 수 있거나, 또는 상기 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 카피(copy)일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체 유래일 수 있거나, 또는 동일한 유기체 유래일 수 있다. 비-제한적 예로서, 외인성 핵산은 자연 세포 내에 존재할 수 있는 것과 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹(flanking)되어 있는 것이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트(cassette)"는 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직 또는 장기에서 유전자 발현을 지시하는 최소한 하나 이상의 전사 제어 요소(예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 이들의 기능적으로 등가인 구조물)를 포함한다. 또한, 추가의 요소들, 예를 들면 전사 종결 신호도 포함될 수 있다.
"벡터" 또는 "작제물"(유전자 전달 시스템 또는 유전자 전이 "비히클"로서 나타내는 경우가 있음)은 시험관내에서 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자들의 복합체를 나타낸다.
일반적인 유형의 벡터인 "플라스미드"는 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개인 염색체외 DNA 분자이다. 소정 경우에서, 이는 환형 또는 이중-가닥형이다.
"복제의 기원"("ori") 또는 "복제 기원"은 예를 들면 림프영양성 헤르페스(herpes) 바이러스에 있어서, 세포 내의 플라스미드에 존재하는 경우 링크된 서열을 플라스미드 내에 유지할 수 있는 DNA 서열 및/또는 DNA 합성이 개시되는 부위 또는 그 부근이다. 한 예로서, EBV에 대한 ori는 FR 서열(30bp 반복의 20개의 불완전한 카피), 바람직하게는 DS 서열을 포함하지만; EBV의 다른 부위는 EBNA-1에 결합하고, 예를 들면 Rep* 서열은 복제의 기원으로서 DS를 대체할 수 있다(Kirshmaier and Sugden, 1998). 따라서, EBV의 복제 기원은 FR, DS 또는 Rep* 서열 또는 이들로부터 유도된 핵산 변형 또는 합성 조합을 통한 기능적으로 등가인 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 방법은 문헌[Lindner et al., 2008]에 구체적으로 기술되어 있는 바와 같이 예를 들면 개별 요소의 삽입 또는 돌연변이에 의해 EBV의 유전적으로 조작된 복제 기원도 사용할 수 있다.
특정 단백질을 "암호화하는" "유전자", "폴리뉴클레오타이드", "암호화 영역", "서열", "절편", "단편" 또는 "전이유전자"는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이는 경우 시험관내에서 또는 생체내에서 전사되고 또한 임의로 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩타이드로 번역되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈성 DNA 또는 RNA 형태 중 어느 하나에 존재할 수 있다. DNA 형태 내에 존재하는 경우, 핵산 분자는 단일-가닥(즉, 센스 가닥(sense strand)) 또는 이중-가닥일 수 있다. 암호화 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA 유래의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA 유래의 게놈성 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열의 3'에 위치될 것이다.
용어 "제어 요소"는 총체적으로 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림(upstream) 조절 도메인, 복제의 기원, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site), 인핸서 및 스플라이스 접합(splice junction) 등을 나타내고, 이는 총체적으로 수용자 세포에서 암호화 서열의 복제, 전사, 전사-후 프로세싱 및 번역을 제공한다. 선택된 암호화 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, 번역될 수 있는 한 이들 제어 요소의 전부가 존재할 필요가 있는 것은 아니다.
용어 "프로모터"는 본원에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 나타내는 통상적인 의미로 사용되고, 여기서 상기 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합하여 다운스트림(downstream)(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유도된다. 이는 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합 할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. 어구 "작동적으로 위치된", "작동적으로 링크된", "제어 하에" 그리고 "전사적 제어 하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치에 그리고/또는 배향으로 존재하여 해당 서열의 전사적 개시 및/또는 발현이 제어됨을 의미한다.
"인핸서"는 프로모터에 근접하게 위치되는 경우 인핸서 도메인의 부재시의 프로모터로부터 얻어지는 전사 활성에 비하여 증가된 전사 활성을 부여하는 핵산 서열을 의미한다.
핵산 분자에 관하여 "작동적으로 링크된" 또는 "공동-발현된"은 2개 이상의 핵산 분자(예를 들면, 전사되는 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하도록 하는 방식으로 연결됨을 의미한다. 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드에 관하여 "작동적으로 링크된" 또는 "공동-발현된"은 2개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 융합의 구성성분인 각각의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄, 즉 융합 폴리펩타이드를 수득하도록 하는 방식으로 연결됨을 의미한다. 상기 융합 폴리펩타이드는 바람직하게는 키메라이고, 즉 이종성 분자들로 이루어진다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 사이의 동일성 백분율을 나타낸다. 한 서열과 다른 서열 사이의 상응(correspondence)은 당해 분야에 공지되어 있는 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 2개의 폴리펩타이드 분자들 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의해 결정될 수 있다. 대안으로, 상동성은 상동성 영역 사이의 안정한 듀플렉스(duplex) 형성을 촉진시키는 조건 하의 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화에 의해, 이어서 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)를 이용한 분해(digestion) 및 분해된 단편의 크기 측정에 의해 결정될 수 있다. 2개의 DNA 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 상기 방법을 이용한 측정시 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 약 95% 이상이 상기 분자의 한정된 길이에 각각 일치하는 경우 서로에 대해 "실질적으로 상동성"이다.
용어 "세포"는 본원에서 당해 분야에서 이의 가장 광범위한 의미로 사용되고, 다세포 유기체의 조직의 구조적 단위이고, 외부로부터 이를 단리시키고, 자기-복제 능력을 갖고, 이를 발현하기 위한 유전적 정보 및 메커니즘을 갖는 막(membrane) 구조에 의해 둘러싸인 생체(living body)를 나타낸다. 본원에서 사용된 세포는 자연-발생 세포 또는 인위적으로 변형된 세포(예를 들면, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
용어 "줄기 세포"는 본원에서 적합한 조건 하에 다양한 범위의 특화된 세포 유형들로 분화할 수 있고, 한편 다른 적합한 조건 하에 자기-재생하여 본질적으로 미분화된 만능 상태를 유지할 수 있는 세포를 나타낸다. 용어 "줄기 세포"는 또한 만능 세포, 다능(multipotent) 세포, 전구 세포 및 선조 세포를 포함한다. 예시의 사람 줄기 세포는 골수 조직으로부터 얻어진 조혈 또는 간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 얻어진 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 얻어진 배아 생식 세포로부터 얻어질 수 있다. 예시의 만능 줄기 세포는 또한 만능성(pluripotency)과 관련된 소정 전사 인자의 발현에 의해 이들을 만능 상태로 재프로그래밍함으로써 체세포로부터 생산될 수 있고; 이들 세포는 "유도된 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"라고 칭한다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 포배기에서의 내세포 집단(inner cell mass)과 같은 초기 단계의 배아로부터 얻어지거나 인공적 수단(예를 들면, 핵 이입(nuclear transfer))에 의해 생산되는 미분화된 만능 세포이고, 생식 세포(예를 들면, 정자 및 난자)를 포함하는 배아 또는 성체에서의 임의의 분화된 세포 유형을 발생시킬 수 있다.
"유도된 만능 줄기 세포(iPSC)"는 인자들의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도함에 의해 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 세포이다(본원에서 재프로그래밍 인자로서 언급됨). iPSC는 태아, 출산후, 신생아, 연소자 또는 성인 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는 예를 들면, Oct4(Oct 3/4로서 언급되는 경우가 있음), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28이 포함된다. 몇몇의 실시형태들에서, 체세포는 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위한 적어도 2개의 재프로그래밍 인자들, 적어도 3개의 재프로그래밍 인자들, 적어도 4개의 재프로그래밍 인자들 또는 적어도 5개의 재프로그래밍 인자들을 발현시킴으로써 재프로그래밍된다.
"만능 줄기 세포"는 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 또는 바람직하게는 3개의 배아층: 내배엽(위 내막, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 골, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(표피 조직과 신경계) 중 어느 하나로 분화시키는 잠재력을 갖는 줄기 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "체세포"는 난자 또는 정자 등과 같은 생식 세포 이외의 임의의 세포를 나타내고, 이는 이의 DNA를 다음 세대로 직접 전이시키지 않는다. 전형적으로, 체세포는 제한된 만능성을 갖거나 만능성을 갖지 않는다. 본원에서 사용되는 체세포는 자연-발생일 수 있거나 유전적으로 변형된 것일 수 있다.
"프로그래밍"은 세포가 생산할 수 있는 자손의 유형을 변경시키는 프로세스이다. 예를 들면, 세포는 프로그래밍 부재의 동일한 조건 하에 형성될 수 있었던 것과 비교하여 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성할 수 있도록 변경된 경우에 배양물에서 또는 생체내에서 프로그래밍되었다. 이는 본질적으로 프로그래밍 전에 이러한 자손이 형성될 수 없으면 충분한 증식 후 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 측정가능한 비율의 자손이 관찰되고; 대안으로는 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율은 프로그래밍 전보다 더 측정가능하게 높음을 의미한다. 이러한 프로세스는 분화, 탈분화(dedifferentiation) 및 전환분화(transdifferentiation)를 포함한다.
"분화"는 분화에 의해 덜 특화된 세포가 더 특화된 세포 유형이 되는 프로세스이다. "탈분화"는 부분 분화된 세포 또는 말단 분화된 세포가 만능성 또는 다능성과 같은 초기 발달 단계로 되돌아가는 세포 프로세스이다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형을 다른 분화된 세포 유형으로 형질전환시키는 프로세스이다. 전형적으로, 프로그래밍에 의한 전환분화는 중간의 만능성 단계를 통과하는 세포의 부재시에 발생한다 - 즉, 상기 세포는 하나의 분화된 세포 유형으로부터 다른 분화된 세포 유형으로 직접적으로 프로그래밍된다. 소정 조건 하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도 순서로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
용어 "순방향 프로그래밍"은 만능성을 갖지 않는 분화된 체세포와는 대조적으로, 다능 또는 만능 세포에 대한 하나 이상의 특정 계통-결정 유전자 또는 유전자 산물의 공급에 의한 다능 또는 만능 세포의 프로그래밍을 나타낸다. 예를 들면, 순방향 프로그래밍은 ESC 또는 iPSC를 조혈 전구 세포 또는 다른 전구 세포로, 또는 조혈 세포 또는 다른 분화된 체세포로 프로그래밍하는 프로세스를 기술할 수 있다.
용어 "조혈 전구체 프로그래밍 유전자"는 단독으로 또는 다른 프로그래밍 유전자와 조합하여 발현되는 경우에 만능 줄기 세포를 림프구 및 골수 계통 세포를 생산할 수 있는 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍할 수 있는 유전자이다.
용어 "조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자"는 단독으로 또는 다른 프로그래밍 유전자와 조합하여 발현되는 경우에 조혈 전구체 프로그래밍 유전자와 조합하여 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포를 프로그래밍할 수 있는 유전자이다.
본원에서 사용되는 "2A 서열"은 단일 벡터로부터의 다중 단백질의 공동-발현을 가능하게 하는 짧은 펩타이드를 말한다. 이들 작은 펩타이드는 2개의 단백질 사이의 링커(linker)로서 도입되어 다단백질(polyprotein)의 자율적인 리보솜내 자기-프로세싱(autonomous intraribosomal self-processing)을 가능하게 한다(예를 들면, 문헌[de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)]을 참조한다). 다수의 2A 원소가 당해 분야에 공지되어 있다. 본원에 개시되는 방법 및 시스템에서 사용될 수 있는 2A 서열의 예로는 본원에 인용에 의해 포함된 미국 특허 공개 번호 제20070116690호에 기술되어 있는 바와 같은 구제역 바이러스(F2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A) 및 돼지 테스코바이러스(teschovirus)-1(P2A) 유래의 2A 서열이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 포유동물, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식을 필요로 하는 임의의 연령의 남성 또는 여성인 사람을 말한다. 전형적으로, 상기 대상체(본원에서 수용자로서도 언급됨)는 장애 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 병태, 상태 또는 증후군, 또는 세포 또는 조직 이식을 통한 치료에 순응하는 육체적, 형태학적 또는 생리학적 이상으로 인하여 세포 또는 조직 이식을 필요로 한다.
"다중-계통 작제물"은 본원에서 ETS 유전자, 호메오박스 유전자 및 조혈 발달 유전자를 포함하는 적어도 3개의 조혈 프로그래밍 유전자를 암호화하는 작제물을 나타내는 것으로 사용된다. 한 예시의 작제물은 ETV2 또는 ERG, GATA2 및 HOXA9를 암호화한다.
조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "생착"은 수용자에게 도입되는 세포가 수용자의 골수에 국부화되어 해당 수용자에서 골수 및 림프구 세포 계통의 장기간 재구성을 제공할 수 있음을 의미한다.
"장기간 생착"은 본원에서, 이식된 세포가 숙주 혈액 및/또는 골수에서 10주 이상, 바람직하게는 20주 이상 지속되도록 수용자에게 본원의 방법에 의해 제공되는 조혈 전구 세포와 같은 세포의 안정한 이식으로서 정의된다. 또한, 장기간 생착은 일련의 이식된 마우스에서의 이식 세포의 지속성을 특징으로 할 수 있다.
II. 조혈 세포 프로그래밍에 관여하는 세포
소정 실시형태들에서, 만능 줄기 세포로부터 다중-계통 조혈 전구 세포를 제공하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 줄기 세포일 수 있다.
조혈 전구 세포를 생산하기 위한 본 발명의 방법에 사용되는 만능 줄기 세포는 유사분열 세포 분열을 통해 이들을 재생시키는 능력 및 다양한 범위의 특화된 세포 유형으로 분화시키는 능력을 특징으로 한다. 포유동물 줄기 세포의 2개의 광범위한 유형은 배반포에서 발견되는 배아 줄기 세포 및 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포이다. 발달중인 배아에서, 줄기 세포는 모든 특화된 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성체 유기체에서, 줄기 세포 및 선조 세포는 신체의 수복(repair) 시스템으로서 작용하고, 특화된 세포를 보충하고, 또한 혈액, 피부 또는 장 조직과 같은 재생성 장기의 정상적인 전환(turnover)을 유지한다.
특정 양상들에서, 본원에 사용되는 만능 줄기 세포는 사람 배아 줄기 세포(ESC) 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)이고, 이는 시험관내에서 장기간 증식할 수 있고, 한편 본 개시의 조혈 전구 세포를 포함하는 신체의 모든 세포 유형으로 분화할 잠재력을 보유한다. 따라서, 이들 세포는 잠재적으로 약물 개발 및 치료학적 용도 둘 다를 위한 환자-특이적 기능성 조혈 세포의 무제한 공급을 제공할 수 있다. 본 개시의 소정 양상들은 조혈 세포 분화/기능에 중요한 프로그래밍 유전자의 조합의 발현을 통한 ESC 및 iPSC와 같은 사람 PSC로부터의 순방향 프로그래밍에 의해 다중-계통 조혈 전구 세포를 제공한다.
A. 배아 줄기 세포
소정 양상들에서, 상기 만능 줄기 세포는 배야 줄기 세포(ESC)이다. ES 세포는 배반포의 내세포 집단으로부터 유도되고, 높은 시험관내 분화 능력을 갖는다. ES 세포는 발달중인 배아의 외부 영양외배엽층을 제거하고, 이어서 비-성장 세포의 피더층(feeder layer) 상에서 내세포 집단을 배양함으로써 단리될 수 있다. 재플레이팅된(replated) 세포는 계속해서 증식하여 ES 세포의 새로운 콜로니를 생산할 수 있고, 이는 제거되어, 해리되고, 재플레이팅되어 및 성장되도록 할 수 있다. 미분화된 ES 세포를 "계대배양(subculturing)"하는 이러한 프로세스는 미분화된 ES 세포를 함유하는 세포주를 생산하기 위해 여러번 반복될 수 있다(U.S. 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호). ES 세포는 이들의 만능성을 유지하면서 증식하는 잠재력을 갖는다. 예를 들면, ES 세포는 세포 및 세포 분화를 제어하는 유전자에 대한 연구에 유용하다. 유전자 조작 및 선택과 조합된 ES 세포의 만능성은 형질전환(transgenic), 키메라(chimeric) 및 녹아웃(knockout) 마우스의 생성을 통한 생체내 유전자 분석 연구에 사용될 수 있다.
마우스 ES 세포의 생산 방법은 익히 공지되어 있다. 한 방법에서, 마우스의 129 스트레인(strain)의 이식 전 배반포를 마우스 항혈청으로 처리하여 영양외배엽을 제거하고, 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 화학적으로 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 피더 세포층에서 배양한다. 발달하는 미분화된 ES 세포의 콜로니를 소 태아 혈청의 존재 하에 마우스 배아 섬유아세포 피더층에서 계대배양하여 ES 세포의 개체군을 생성시킨다. 몇몇 방법들에서, 마우스 ES 세포는 혈청-함유 배양 배지에 사이토카인 백혈병 억제성 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)를 첨가함으로써 피더층의 부재 하에 성장될 수 있다(Smith, 2000). 다른 방법들에서, 마우스 ES 세포는 골 형태형성 단백질 및 LIF의 존재 하에 혈청-불포함 배지에서 성장될 수 있다(Ying et al., 2003).
사람 ES 세포는 정자와 난자 세포의 융합, 핵 이입, 발병 기전 또는 염색질의 재프로그래밍 및 원형질막으로의 재프로그래밍된 염색질의 후속적 혼입(incorporation)에 의해 생성된 접합체(zygote) 또는 배반포-단계의 포유동물 배아로부터 생산되거나 유도되어 이전에 기술된 방법(Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000)에 의해 배아 세포가 생산될 수 있다. 한 방법에서, 사람 배반포는 항-사람 혈청에 노출되고, 영양외배엽 세포는 마우스 배아 섬유아세포의 피더층에서 배양된 내세포 집단으로부터 용해되어 제거된다. 또한, 내세포 집단으로부터 유도된 세포 덩어리(clump)가 화학적으로 또는 기계적으로 해리되어 재플레이팅되고, 미분화된 형태를 갖는 콜로니가 마이크로피펫에 의해 선택되고, 해리되어 재플레이팅된다. 몇몇의 방법에서, 사람 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에 섬유아세포의 피더층에서 상기 ES 세포를 배양함으로써 혈청 없이 성장될 수 있다(Amit et al., 2000). 다른 방법에서, 사람 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 "조정된(conditioned)" 배지의 존재 하에 MATRIGEL™ 또는 라미닌과 같은 단백질 매트릭스 상에서 상기 세포를 배양함으로써 피더 세포층 없이 성장될 수 있다(Xu et al., 2001).
ES 세포는 또한 이전에 기술된 방법(Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000; 미국 특허 제5,843,780호)에 의해 레서스(rhesus) 원숭이 및 마모셋(marmoset)을 포함하는 다른 유기체로부터 또한 확립된 마우스 및 사람 세포주로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 확립된 사람 ES 세포주로는 MAOI, MA09, ACT-4, HI, H7, H9, H13, H14 및 ACT30이 포함된다. 추가의 예로서, 확립된 마우스 ES 세포주로는 마우스 스트레인 129 배아의 내세포 집단으로부터 확립된 CGR8 세포주가 포함되고, CGR8 세포의 배양물은 피더층 없이 LIF의 존재 하에 성장될 수 있다.
ES 줄기 세포는 전사 인자 Oct4, 알칼리성 포스파타제(AP), 단계-특이적 배아성 항원 SSEA-1, 단계-특이적 배아성 항원 SSEA-3, 단계-특이적 배아성 항원 SSEA-4, 전사 인자 NANOG, 종양 거부 항원 1-60(TRA-1-60), 종양 거부 항원 1-81(TRA-1-81), SOX2 또는 REX1을 포함하는 단백질 마커에 의해 검출될 수 있다.
B. 유도된 만능 줄기 세포
다른 양상들에서, 본원에서 사용되는 만능 줄기 세포는 보통 iPS 세포 또는 iPSC로 약기하는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포이다. 만능성의 유도는 최초로 2006년에 마우스 세포를 이용하여(Yamanaka et al. 2006) 그리고 2007년에 사람 세포를 이용하여(Yu et al. 2007; Takahashi et al. 2007) 만능성과 연계된 전사 인자의 도입을 통한 체세포의 재프로그래밍에 의해 달성되었다. iPSC의 사용은 ES 세포의 대규모 임상학적 사용과 관련된 윤리적 및 실용적인 문제의 대부분을 회피하고, iPSC-유도된 자가 이식 환자는 이식편 거부를 방지하기 위한 평생 면역억제 치료를 요구하지 않을 수 있다.
생식 세포를 제외하고는 임의의 세포를 iPSC에 대한 시작점으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포 유형은 각질세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간엽 세포, 간 세포 또는 위 세포일 수 있다. 또한, T 세포는 재프로그래밍을 위한 체세포의 공급원으로서도 사용될 수 있다(미국 특허 제8,741,648호). 세포 분화의 정도 또는 세포가 수집되는 동물의 연령에는 제한이 없다. 심지어 미분화된 전구 세포(체세포 줄기 세포 포함) 및 최종 분화된 성숙 세포도 본원에 개시된 방법에서 체세포의 공급원으로서 사용될 수 있다.
체세포는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 생산하도록 재프로그래밍될 수 있다. 당해 분야 숙련가는 유도된 만능 줄기 세포를 용이하게 생산할 수 있고, 예를 들면, 공개된 미국 특허 출원 제20090246875호, 공개된 미국 특허 출원 제2010/0210014호; 공개된 미국 특허 출원 제20120276636호; 미국 특허 제8,058,065호; 미국 특허 제8,129,187호; 미국 특허 제8,268,620호; PCT 공보 제WO 2007/069666 A1호 및 미국 특허 제8,268,620호를 참조하고, 상기 문헌들은 본원에 인용에 의해 포함된다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자는 체세포로부터 만능 줄기 세포를 생산하는데 사용된다. 몇몇의 실시형태들에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28 중 적어도 3개 또는 적어도 4개가 이용된다. 다른 실시형태들에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 이용된다.
이들 핵 재프로그래밍 물질의 마우스 및 사람 cDNA 서열은 WO 2007/069666 및 미국 특허 제8,183,038호에 언급된 NCBI 수탁 번호를 참조하여 입수가능하고, 상기 문헌은 본원에 인용에 의해 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질 또는 이들 재프로그래밍 물질을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 제8,268,620호, 제8,691,574호, 제8,741,648호, 제8,546,140호에, 공개된 미국 특허 제8,900,871호 및 미국 특허 제8,071,369호에 개시되어 있고, 이들은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다.
일단 유도되면, iPSC는 만능성을 유지하기에 충분한 배지에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 제7,442,548호 및 미국 특허 공개 제2003/0211603호에 기술된 바와 같이 만능 줄기 세포, 보다 구체적으로는 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술과 함께 사용될 수 있다. 마우스 세포의 경우에, 배양은 백혈병 억제성 인자(LIF)를 분화 억제 인자로서 보통 배지에 첨가하여 수행한다. 사람 세포의 경우, LIF 대신에 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 첨가하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, iPSC의 배양 및 유지를 위한 다른 방법이 본 방법에 사용될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 정의되지 않은 조건을 사용할 수 있다; 예를 들면, 만능 세포는 줄기 세포를 미분화된 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 피더 세포 또는 섬유아세포 피더 세포에 노출된 배지 상에서 배양할 수 있다. 몇몇의 실시형태들에서, 상기 세포는 피더 세포로서 방사선 또는 항생제로 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공존 하에 배양되어 세포 분열을 종결시킨다. 대안으로, 만능 세포는 정의된 피더-독립적 배양 시스템, 예를 들면, TESR™ 배지(Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8™/필수 8™ 배지(Chen et al., 2011)를 이용하여 배양되어 근본적으로 미분화된 상태가 유지될 수 있다.
플라스미드는 규제된 높은 카피 수를 달성하고 세균에서의 플라스미드 불안정성의 잠재적인 원인을 회피하는 것, 그리고 사람 세포를 포함하는 포유동물 세포에서의 사용과 양립할 수 있는(compatible) 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공하는 것과 같은 다수의 목표를 염두에 두고 고안되었다. 사람 세포에서 사용하기 위한 플라스미드의 이중 요구사항에 특별한 주의가 기울여져 왔다. 첫째, 이들은 이. 콜라이(E. coli)에서의 유지 및 발효에 적합하여 다량의 DNA를 생산 및 정제 할 수 있다. 둘째, 이들은 안전하고 사람 환자 및 동물에서 사용하기에 적합하다. 첫 번째 요구사항은 세균성 발효 동안에 비교적 쉽게 선택되고 안정적으로 유지될 수 있는 높은 카피 수의 플라스미드를 필요로 한다. 두 번째 요구사항은 선택가능한 마커 및 기타 암호화 순서와 같은 요소에 주의를 요한다. 몇몇의 실시형태들에서, 마커를 암호화하는 플라스미드는 (1) 높은 카피 수 복제 기원, (2) 카나마이신을 이용한 항생제 선택을 위한 neo 유전자(이에 한정되는 것은 아님)와 같은 선택가능한 마커, (3) 티로시나제 인핸서를 포함하는 전사 종결 서열 및 (4) 다양한 핵산 카세트의 혼입을 위한 다중 클로닝 부위; 및 (5) 티로시나제 프로모터에 작동가능하게 링크된 마커를 암호화하는 핵산 서열. 단백질을 암호화하는 핵산을 유도하기 위한 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 플라스미드 벡터가 존재한다. 이들로는 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제6,103,470호; 미국 특허 제7,598,364호; 미국 특허 제7,989,425호; 및 미국 특허 제6,416,998호에 개시되어 있는 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
에피솜 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)-기반 에피솜 벡터(U.S. 특허 8,546,140), 효모-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 시미안(simian) 바이러스 40(SV40)-기반 에피솜 벡터, 소 유두종 바이러스(BPV)-기반 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스성 유전자 전달 시스템은 RNA-기반 또는 DNA-기반 바이러스 벡터일 수 있다(PCT/JP2009/062911).
C. 체세포 핵 이입에 의해 전달된 배아 줄기 세포
조혈 전구 세포를 생산하기 위한 만능 줄기 세포는 또한 체세포 핵 이입의 수단에 의해 제조될 수 있고, 여기서 공여자 핵이 방추체가 없는(spindle-free) 난모세포로 전이된다. 핵 이입에 의해 생성된 줄기 세포는 공여자 핵과 유전적으로 동일하다. 한 방법에서, 레서스 원숭이(rhesus macaque)의 피부 섬유아세포 유래의 공여자 섬유아세포 핵을 전기융합에 의해 방추체가 없는 성숙한 중기 II 레서스 원숭이 난모세포에 도입한다(Byrne et al., 2007). 융합된 난모세포를 이오노마이신에의 노출에 의해 활성화시키고, 이어서 배반포 단계까지 인큐베이션한다. 이어서, 선택된 배반포의 내세포 집단을 배양하여 배아 줄기 세포주를 생산한다. 배아 줄기 세포주는 정상 ES 세포 형태를 나타내고, 각종 ES 세포 마커를 발현시키고, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 다중 세포 유형으로 분화한다.
III. 조혈 전구 세포 프로그래밍 인자
A. 조혈 전구체 프로그래밍 인자
본 개시의 소정 양상들은 PSC를 다중-계통 조혈 전구 세포로 프로그래밍하기 위한 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 작제물을 제공한다. 본 개시의 다중-계통 조혈 전구 세포는, PSC를 ETS 유전자, 조혈 발달 유전자 및 호메오박스 유전자와 같은 적어도 3개의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 발현하도록 변형시킴으로써 만능 줄기 세포로부터 직접적으로 생산될 수 있다. 상기 적어도 3개의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 하나 이상의 다중-계통 작제물에 의해 암호화될 수 있다.
조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 조혈 전구 세포의 확대를 위한 당해 분야에 공지되어 있는 서열에 융합될 수 있다(본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 특허 공개 제US20080299095호). 예시의 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다.
1. ETS 유전자
다중-계통 작제물(들)은 전사 인자의 E26 형질전환-특이적(ETS) 패밀리로부터 적어도 하나의 유전자를 암호화한다. 모든 ETS 패밀리 구성원은 고도로 보존된 DNA 결합 도메인인 ETS 도메인을 통해 확인되고, ETS 도메인은 중앙 GGA(A/T) DNA 서열을 갖는 DNA 부위에 결합하는 날개가 달린(winged) 나선 대 나선(helix-turn-helix) 구조이다. DNA-결합 기능뿐만 아니라, ETS 도메인이 단백질-단백질 상호작용에도 관여함을 시사하는 증거가 있다. ETS 패밀리는 신체 전반에 걸쳐 존재하고, 세포 분화, 세포 주기 제어, 세포 이동, 세포 증식, 아폽토시스(apoptosis)(프로그래밍된 세포 사멸) 및 혈관신생의 조절을 포함하는 다양한 기능에 관여한다. 이러한 유전자 패밀리의 구성원은 암 진행뿐만 아니라 상이한 조직의 발달에 연루되어 왔다.
ETS 유전자는 ELF, ELG, ERG, ERF, ESE, ETS, PDEF, PEA3, ER71, SPI, TCF 및 TEL을 포함하는 12개의 서브패밀리로 나뉘어지는 ETS 패밀리 내의 임의의 유전자일 수 있다. 예를 들면, ETS는 ERG(v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 동족체; 수탁 번호 NM_001136154), ETV2(ets 변이체 2; 수탁 번호 NC_000019.10), FLI-1(프리엔드 백혈병 바이러스 통합 1; 수탁 번호 NM_001167681), ELK3(ETS 도메인-함유 단백질; 수탁 번호 NM_001303511), ETS1(C-ets-1; 수탁 번호 NM_001143820) 또는 ETS2(C-ets-2; 수탁 번호 NM_001256295), E74-유사 인자 1(ELF1; 수탁 번호 M_001145353), E74-유사 인자 2(ELF2; 수탁 번호 NM_001276457), ETS-관련 전사 인자(ELF4; 수탁 번호 NM_001127197), Ets 변이체 3(ETV3; 수탁 번호 NM_001145312) 또는 전사 인자 PU.1(SPI1; 수탁 번호 NM_001080547)일 수 있다. 특히, ETS 유전자는 ERG라고 칭하는 내피 분화 인자일 수 있고, 이는 또한 전사 조절제 ERG, ets-관련된 형질전환 단백질 ERG, TMPRSS2-ERG 전립선암 특이적, v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 유사, v-ets 조류 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 관련된, 또는 형질전환 단백질 ERG로서도 공지되어 있다. 몇몇의 실시형태들에서, ETS 유전자는 ERG의 특정 이소형(isoform), 예를 들면, ERG 이소형 2(ERG-2)(수탁 번호 NM_004449) 또는 ERG 이소형 3(ERG-3)(수탁 번호 NM_001136154)이다. 특정 실시형태들에서, ETS 유전자는 ETV2이다.
2. 조혈 발달 유전자
다중-계통 작제물(들)은 또한 적어도 하나의 조혈 발달 유전자를 암호화한다. 조혈 발달 유전자는 조혈 발달을 유도하는 임의의 유전자일 수 있다. 조혈 발달 유전자의 비-제한적 예로는 GFI1(성장 인자 독립적 1 전사 억제자; 수탁 번호 NM_001127215), GFI1B(성장 인자 독립적 1B 전사 억제자; 수탁 번호 NM_001135031), TAL1(T-세포 급성 림프구성 백혈병; 수탁 번호 NM_001287347), LYL1(림프구성 백혈병 유도된 서열 1; 수탁 번호 NM_005583), LMO2(LIM 도메인 온리(only) 2(롬보틴-유사 1); 수탁 번호 M_001142315), GATA2(GATA 결합 단백질 2; 수탁 번호 NM_001145661) 또는 GATA3(GATA 결합 단백질 3; 수탁 번호 NM_001002295)이 포함된다. 특정 실시형태들에서, 조혈 발달 유전자는 GATA2이다.
3. 호메오박스 유전자
또한, 다중-계통 작제물(들)은 적어도 하나의 호메오박스 유전자를 암호화한다. 호메오박스 유전자는 DNA에 결합하는 단백질 도메인을 암호화하는 약 180개 염기 쌍의 호메오박스를 암호화한다. 특징적인 호메오도메인 단백질 폴드(fold)는 3개의 알파 나선이 짧은 루프(loop) 영역에 의해 연결되어 있는 60개-아미노산 나선-대-나선(HTH) 구조로 이루어진다. N-말단의 2개의 나선은 역평행하고 더 긴 C-말단의 나선은 처음 2개에 의해 확립된 축에 대해 대략 수직이다. DNA의 주요 홈(groove) 내에서 특정 측쇄와 노출된 염기 및 티민 메틸 그룹 사이에서 발생하는 다수의 수소 결합과 소수성 상호작용을 통해 DNA와 직접 상호작용하는 것은 이러한 세 번째 나선이다. 다수의 호메오도메인 단백질은 개별 조직과 장기를 생산하기 위해 요구되는 공통조절되는 유전자의 캐스케이드(cascade)를 개시함으로써 세포 분화를 유도한다.
호메오박스 유전자는 호메오박스 도메인을 암호화하는 임의의 유전자일 수 있다. 예를 들면, 호메오박스 유전자는 HOX 유전자, 예를 들면 HOXA9(수탁 번호 NM_152739), HOXA10(수탁 번호 NM_018951), HOXA3(수탁 번호 NM_030661), HOXA4(수탁 번호 NM_002141), HOXA5(수탁 번호 NM_019102), HOXA6(수탁 번호 NM_024014), HOXA7(수탁 번호 NM_006896), HOXB3(수탁 번호 NM_002146) 또는 HOXB6(수탁 번호 NM_018952)일 수 있다. HOX 유전자의 다른 비-제한적 예로는 활성-의존적 신경보호자 호메오박스(ADNP; 수탁 번호 NM_001282531), 호메오박스 단백질 아리스타리스(aristaless)-유사 4(ALX4; 수탁 번호 NM_021926), 호메오박스 단백질 DBX1(수탁 번호 NM_001029865), 이중 호메오박스 4(DUX4; NM_001127386), 호메오박스 단백질 EMX1(수탁 번호 NM_001040404), GBX2(수탁 번호 NM_001301687), ES 세포 1에서 발현된 호메오박스(HESX1; 수탁 번호 NM_003865), NANOG(수탁 번호 NM_001297698), PAX3(수탁 번호 NM_000438), 망막 및 전방 신경 주름(anterior neural fold) 호메오박스(RAX; 수탁 번호 NM_013435) 또는 아연 핑거 E-박스-결합 호메오박스 1(ZEB1; 수탁 번호 NM_001128128)가 포함된다. 특정 실시형태들에서, 호메오박스 유전자는 HOXA9이다.
B. 조혈 줄기 세포 프로그래밍 인자
본 개시의 소정 양상들은 장기간 생착 잠재력을 위한 조혈 줄기 세포 프로그래밍 인자를 암호화하는 작제물을 제공한다. 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포는 세포 내에서 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들), 특히 표 1에 열거된 유전자의 수준을 증가시킴으로써 본 개시의 다중-계통 조혈 전구 세포로부터 직접 생산될 수 있다. 본 발명자들은 또한 이 섹션에 열거된 유전자의 모든 이소형 및 변이체가 본 개시에 포함되고 소정 이소형 또는 변이체에 대한 수탁 번호의 비-제한적 예가 제공됨을 고려한다.
표 1은 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포에 다중-계통 조혈 전구체를 프로그래밍하기 위한 유전자의 목록을 제공한다. 열거된 유전자 ID 및 수탁 번호에 의해 제공된 모든 유전자 서열 및 관련 정보는 본 출원의 출원일자로 참조로 본원에 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
몇몇의 실시형태들에서, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 표 1에 포함된 유전자들 중 임의의 하나이고, 이로는 조혈 세포의 명세와 관련된 유전자, 조혈 세포의 유지 및/또는 증식에 관여하는 유전자 및 조혈 세포에서 발현되는 유전자가 포함된다.
소정 실시형태들에서, 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포로 프로그래밍하기 위해 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 조합하여 사용한다. 몇몇의 실시형태들에서, 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포로 프로그래밍하기 위해 3개 이상, 예를 들면 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 최대 20 또는 이들 내에서 유도할 수 있는 임의의 범위의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 사용한다.
조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 조혈 전구 세포의 확대를 위한 당해 분야에 공지되어 있는 서열에 융합될 수 있다(본원에 인용에 의해 포함되는 U.S. 특허 공개 제US20080299095호). 예시의 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다.
IV. 조혈 프로그래밍 유전자의 전달
소정 실시형태들에서, 핵산 암호화 프로그래밍 인자의 전달을 위한 벡터는 만능 줄기 세포에서 이들 인자를 발현하도록 작제된다. 이러한 벡터의 구성성분 및 전달 방법의 상세설명은 하기에 개시된다.
한 추가의 양상에서, 하기 시스템 및 방법은 조혈 전구 세포와 같은 원하는 세포 유형의 확인을 위한 리포터 발현 카세트의 전달에도 사용될 수 있다. 특히, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구체에 대해 특이적인 조절 요소는 리포터 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 프로그래밍으로부터 유도된 조혈 줄기 세포 또는 전구체는 리포터의 사용을 통해 특성확인되거나, 선택되거나, 또는 농축될 수 있다.
A. 핵산 전달 시스템
당해 분야 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 소양을 잘 갖추고 있을 것이다(예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Sambrook et al., 2001] 및 문헌[Ausubel et al., 1996]을 참조한다). 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공적 염색체(예를 들면, YAC), 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도됨), 렌티바이러스 벡터(예를 들면, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도됨), 복제 컴피턴트(competent), 복제 결함 및 이들의 거트리스(gutless) 형태를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하비(Harvey) 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유선 종양 바이러스 벡터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
1. 바이러스 벡터
본 개시의 소정 양상들에서 바이러스 벡터가 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성함에 있어서, 비-필수 유전자는 전형적으로 이종(또는 비-천연) 단백질에 관한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 핵산 및 가능한 단백질을 세포 내로 도입하기 위해 바이러스 서열을 이용하는 발현 작제물의 일종이다. 수용체 매개된 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고, 숙주 세포 게놈에 통합되어 바이러스 유전자를 안정하게 그리고 효율적으로 발현시키는 소정 바이러스의 능력은 이들 바이러스를 외래 핵산의 세포(예를 들면, 포유동물 세포)로의 전이를 위한 매력적인 후보자가 되게 하였다. 본 개시의 소정 양상들의 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비-제한적인 예는 하기에 기술된다.
레트로바이러스는 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시키고, 다량의 외래 유전자 물질을 전이시키고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특정 세포주에 패키징되는(packaged) 능력으로 인하여 유전자 전달 벡터로서의 가능성을 갖는다(Miller, 1992).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해서, 소정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 핵산을 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해서, gag, pol 및 env 유전자를 함유하는 패키징 세포주 - LTR 및 패키징 구성성분은 제외됨 - 가 작제된다(Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특별한 세포주에 (예를 들면, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 도입되는 경우, 상기 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자에 패키징되도록 한다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).
렌티바이러스는 복합적인 레트로바이러스이고, 이는 통상적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에도 조절성 또는 구조적 기능을 지닌 다른 유전자들을 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Naldini et al., 1996]; 문헌[Zufferey et al., 1997]; 문헌[Blomer et al., 1997]; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호를 참조한다).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전이 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용될 수 있다. 예를 들면, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스 - 여기서, 적합한 숙주 세포는 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat를 갖는 2개 이상의 벡터로 형질감염된다 - 는 미국 특허 제5,994,136호(본원에 인용에 의해 포함됨)에 기술되어 있다.
2. 에피솜 벡터
본 개시의 소정 양상들에서 플라스미드- 또는 리포솜-기반 염색체외(즉, 에피솜) 벡터의 용도도 제공될 수 있다. 이러한 에피솜 벡터로는 예를 들면, oriP-기반 벡터 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터가 포함될 수 있다. 이들 벡터는 DNA의 큰 단편이 세포에 도입되어 염색체외에 유지되고, 세포 주기당 1회 복제되고, 효율적으로 딸 세포로 분할되고, 실질적으로 면역 반응을 유발하지 않도록 할 수 있다.
특히, oriP-기반 발현 벡터의 복제에 요구되는 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은, MHC 클래스 I 분자 상의 이의 항원 제시에 요구되는 프로세스를 우회시키는 효율적인 메커니즘이 개발되었기 때문에 세포 면역 반응을 유발하지 않는다(Levitskaya et al., 1997). 또한, EBNA-1은 트랜스로(in trans) 작용하여 클로닝된 유전자의 발현을 향상시킬 수 있고, 이는 몇몇의 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100배까지 유도할 수 있다(Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 마지막으로, 이러한 oriP-기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체-외 벡터로는 다른 림프영양성 헤르페스 바이러스-기반 벡터가 포함된다. 림프영양성 헤르페스 바이러스는 림프아구(예를 들면, 사람 B 림프아구)에서 복제하고 자연 생명-주기의 일부를 위한 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus)는 "림프영양성" 헤르페스 바이러스가 아니다. 예시의 림프영양성 헤르페스 바이러스로는 EBV, 카포시(Kaposi) 육종 헤르페스 바이러스(KSHV); 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 및 마렉(Marek) 질환 바이러스(MDV)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40 또는 BPV와 같은 에피솜-기반 벡터의 다른 공급원도 고려된다.
당해 분야 숙련가는 표준 재조합 기술(예를 들면, 문헌[Maniatis et al., 1988] 및 문헌[Ausubel et al., 1994]을 참조하고, 상기 문헌 둘 다는 본원에 인용에 의해 포함된다)을 통해 벡터를 작제하기 위한 소양을 잘 갖추고 있을 것이다.
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 또는 그렇지 않으면 표적화된 세포에 이로운 특성을 제공하는 다른 구성성분 또는 작용성(functionality)을 포함할 수 있다. 이러한 다른 구성성분으로는 예를 들면, 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 구성성분(세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 구성성분을 포함함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수(uptake)에 영향을 미치는 구성성분; 흡수 후 세포 내의 폴리뉴클레오타이드의 국부화에 영향을 미치는 구성성분(예를 들면, 핵 국부화를 매개하는 제제(agent)); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 구성성분이 포함된다.
이러한 구성성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출하거나 선택하는데 사용될 수 있는 검출가능한 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 구성성분은 벡터의 자연적인 특징(예를 들면, 결합 및 흡수를 매개하는 구성성분 또는 작용성을 갖는 소정 바이러스 벡터의 사용)으로서 제공될 수 있거나, 또는 벡터는 이러한 작용성을 제공하도록 변형될 수 있다. 매우 다양한 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고 일반적으로 입수가능하다. 벡터가 숙주 세포 내에 유지될 때, 벡터는 자율 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 혼입되거나, 또는 숙주 세포의 핵 또는 세포질 내에 유지될 수 있다.
3. 트랜스포손 -기반 시스템
소정 양상들에서, 프로그래밍 인자의 전달은 트랜스포손-트랜스포사제 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 트랜스포손-트랜스포사제 시스템은 익히 공지되어 있는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 프로그 프린스(Frog Prince) 트랜스포손-트랜스포사제 시스템(후자의 설명을 위해서는 예를 들면, EP1507865를 참조한다) 또는 TTAA-특이적 트랜스포손 피기백(PiggyBac) 시스템일 수 있다.
트랜스포손은 전위(transposition)라고 칭하는 프로세스인 단일 세포의 게놈 내의 상이한 위치로 이동할 수 있는 DNA의 서열이다. 상기 프로세스에서, 이들은 돌연변이를 야기하여 게놈 내의 DNA의 양을 변화시킬 수 있다. 또한, 트랜스포손은 한 때 점핑 유전자(jumping gene)라고 칭하였고, 이동성 유전적 요소의 예이다.
다양한 이동성 유전적 요소가 존재하고, 이들은 이들의 전위 메커니즘에 기초하여 분류될 수 있다. 클래스 I 이동성 유전적 요소 또는 레트로트랜스포손은 우선 RNA로 전사된 후 역전사효소에 의해 DNA로 역전사되고, 이어서 게놈 내의 다른 위치에 삽입됨으로써 스스로 카피한다. 클래스 II 이동성 유전적 요소는 게놈 내에서 트랜스포사제를 이용하여 한 위치에서 다른 위치로 "컷 앤 페이스트(cut and paste)"한다.
특정 실시형태들에서, 본 개시에 제공된 작제물(예를 들면, 다중-계통 작제물)은 PiggyBac 발현 시스템을 사용한다. PiggyBac(PB) DNA 트랜스포손은 "컷 앤드 페이스트" 메커니즘을 통해 동원되고, 이에 의해 트랜스포손 자체에 의해 암호화되는 트랜스포사제 효소(PB 트랜스포사제)가 트랜스포손을 절제하여 게놈 내의 다른 부위에 재-통합시킨다. PB 트랜스포사제는 트랜스포손을 플랭킹하는 PB 역전된 말단 반복단위(ITR: inverted terminal repeat)를 특이적으로 인식하고; 이는 이들 서열에 결합하여 트랜스포손의 절제를 촉진시킨다. 이어서, PB는 그런 다음 PB는 상대적으로 무작위 방식으로 게놈을 통해 TTAA 부위에 통합된다. 유전자 트랩 돌연변이의 생성(또는 형질전환 동물을 생성하는데 적합함 생성용으로 개작됨)을 위해, 트랜스포손은 하나의 플라스미드 상에 트랜스로 공급되고, 트랜스포사제에 대한 결합 부위에 의해 플랭킹된 유전자 트랩을 포함하는 재조합 트랜스포손인 공여자 트랜스포손을 함유하는 플라스미드로 공동-형질감염된다. 트랜스포손은 플라스미드로부터의 트랜스포손 절제 및 게놈으로의 후속적 통합을 촉진시킬 것이다. 암호화 영역 내에서의 통합은 유전자 트랩 발현에 필요한 요소를 포착할 것이다. PB는 몇몇의 이상적인 성질을 갖는다: (1) 유전자 내에 우선적으로 삽입한다(삽입의 50 내지 67%가 유전자에 도달한다). (2) 국부 호핑(hopping)(광범위한 게놈 도달 범위(coverage))을 나타내지 않는다. (3) 과-생산 억제에 민감하지 않고, 여기서 트랜스포사제 효소의 상승된 수준은 감소된 전위 4를 야기한다. (4) 공여자 부위로부터 깨끗하게 절제되어 슬리핑 뷰티와 달리 "풋프린트(footprint)"를 남기지 않는다.
4. 상동성 재조합
소정 양상들에서, 핵산 분자는 게놈 조작을 위한 특정 방식으로, 예를 들면, 상동성 재조합을 통해 세포에 도입될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 몇몇의 접근법은 게놈에서 무작위로 통합되는 바이러스 벡터 또는 전이유전자의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 통합된 핵산으로부터의 발현을 효과적으로 매개할 수 없는 부위에서 또는 본래 유전자의 붕괴를 초래하는 부위에서 발생하는 통합의 결점을 갖는다. 무작위 통합과 관련된 문제는 표적 게놈에서의 특정 유전자좌, 예를 들면 Rosa26 유전자좌에의 상동성 재조합에 의해 부분적으로 극복될 수 있다.
일반적 재조합으로서도 공지되어 있는 상동성 재조합(HR)은 DNA의 2개의 유사하거나 동일한 가닥 사이의 뉴클레오타이드 서열이 교환되는 모든 형태의 생명체에서 사용되는 유전적 재조합의 한 유형이다. 상기 기술은 1980년대 중반 이래로 포유동물 세포에서 게놈 조작을 위한 표준 방법이었다. 상기 프로세스는 몇몇의 단계의 물리적 파열과 DNA의 궁극적 재결합을 포함한다. 이러한 프로세스는 DNA에서 치명적인 이중-가닥의 단락을 잠재적으로 수복하는데 가장 널리 사용된다. 또한, 상동성 재조합은 감수분열 동안의 DNA 서열의 새로운 조합을 생산하고, 이에 의해 진핵생물이 정자 및 난자와 같은 생식 세포를 만드는 프로세스이다. 이들 새로운 DNA 조합은 시간 경과에 따라 개체군이 변화하는 환경 조건에 진화적으로 적응하도록 하는 새끼(offspring)의 유전적 변이를 나타낸다. 상동성 재조합은 또한 수평적 유전자 전이에 사용되어 상이한 스트레인와 세균 및 바이러스의 종 사이에서 유전적 물질을 교환한다. 또한, 상동성 재조합은 표적 유기체에 유전적 변화를 도입하기 위한 분자 생물학의 기술로서도 사용된다.
상동성 재조합은 표적화된 게놈 변형으로서 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서의 표준 HR의 효율성은 단지 치료된 세포의 10-6 내지 10-9이다(Capecchi, 1990). 메가뉴클레아제 또는 호밍 엔도뉴클레아제, 예를 들면, I-SceI는 HR의 효율성을 증가시키는데 사용되어 왔다. 천연 메가뉴클레아제 및 변형된 표적화 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제 둘 다는 HR 효율성을 증가시키는데 이용되어 왔다(Pingoud and Silva, 2007; Chevalier et al., 2002).
프로그래밍가능한 DNA 특이성 도메인을 갖는 키메라 엔도뉴클레아제를 조작하기 위한 HR의 효율성을 증가시키기 위한 경로가 존재하여 왔다(Silva et al., 2011). 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 아연-핑거 DNA 결합 도메인이 FokI와 같은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제의 촉매성 도메인과 융합되는 이러한 키메라 분자의 한 예이다(Durai et al., 2005에서 검토됨).
이러한 특이성 분자의 다른 클래스로는 FokI와 같은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제의 촉매성 도메인에 융합된 전사 활성화인자 유사 이펙터(TALE: Transcription Activator Like Effector) DNA 결합 도메인이 포함된다(Miller et al., 2011; PCT/IB2010/000154). TALEN은 사실상 임의의 주어진 목적하는 부위에서 부위-특이적인 게놈 변형을 위해 고안될 수 있다(Cermak et al., 2011; Christian et al., 2010; Li et al., 2011; Miller et al., 2011; Weber et al., 2011; Zhang et al., 2011). 부위-특이적 DNA 결합 도메인은 Fok I와 같은 DNA 절단 효소와의 융합 단백질로서 발현된다. DNA 결합 도메인은 반복되는 아미노산의 스캐폴드이고; 각각의 반복단위를 링크시키는 것은 DNA 내의 단일 뉴클레오타이드에 결합하는 2개의 가변 아미노산이다. 예를 들면, Asn-Asn은 구아노신에 결합하고, Asn-Ile은 아데노신에 결합하고, Asn-Gly는 티미딘에 결합하고, His-Asp는 사이토신에 결합한다. 이들 2개의 아미노산들은 반복단위 가변 2잔기(Repeat Variable Diresidue) 또는 RVD로서 공지되어 있다. 다수의 상이한 RVD가 존재하고, 이들은 TAL 이펙터/Fok1 단백질 작제물로 조작되어 특정 TALEN을 생성할 수 있다. 이어서, 재조합 TALEN을 암호화하는 RNA는 정제되어 부위-특이적 게놈 변형을 위해 세포에 형질감염될 수 있다. 일단 TALEN을 이중 가닥 DNA 단락에 도입하면, DNA는 비-상동성 말단 결합(NHEJ: non-homologous end joining)에 의해 또는 상동성 지시된 수복(HDR: homologous directed repair)에 의해 변형될 수 있다. 이는 DNA 수복 동안 추가의 서열이 존재하는지 여부에 따라 DNA 돌연변이유발, 결실 또는 부가를 가능하게 한다.
B. 조절 요소
본 개시에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 바람직하게는 (5'-대-3' 방향으로) 단백질-암호화 서열에 작동적으로 링크되는 진핵생물 전사적 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호 및 전사적 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
1. 프로모터/인핸서
본원에서 제공되는 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 출발 부위를 위치선정하는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이것의 가장 잘 알려져 있는 예는 TATA 상자이지만, 예를 들면 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같은 TATA 상자가 없는 몇몇의 프로모터에서는 출발 부위 위에 놓이는 별개의 요소 자체가 개시 장소를 고정정시키는 것을 보조한다. 부가적인 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 출발 부위 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 출발 부위 업스트림의 30 내지 110bp 영역에 위치한다. 프로모터"의 제어 하의" 암호화 서열을 가져 오기 위해, 선택된 프로모터의 "다운스트림"(즉, 3')의 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 간격은 주로 유연하므로 요소가 서로에 대해 역전되거나 이동되는 경우 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은 활성이 감소되기 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 밝혀진다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스(cis)-작용성 조절 서열을 나타내는 "인핸서(enhancer)"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 절편 및/또는 엑손(exon)의 업스트림에 위치된 5' 비-암호화 서열을 단리함으로써 얻어질 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 나타내어질 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 대안으로, 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합되지 않은 프로모터를 나타내는 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 암호화 핵산 절편을 위치시킴으로써 소정 이점이 얻어질 것이다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합하지 않는 인핸서를 말한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서 및 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연 발생"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 작제에 가장 흔히 사용되는 프로모터로는 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호를 참조한다). 또한, 미토콘드리아 및 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관 내에서의 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 또한 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포소기관, 세포 유형, 조직, 장기 또는 유기체에서의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당해 분야 숙련가들은 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 용도를 일반적으로 알고 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al. 1989]을 참조한다). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이 도입된 DNA 절편의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건 하에서 항상성이고/이거나, 조직-특이적이고/이거나, 유도가능하고/하거나, 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들면, www.epd.isb-sib.ch/를 통한 진핵생물 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따름)을 사용하여 발현을 유도할 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 다른 가능한 실시형태이다. 진핵생물 세포는 적절한 세균성 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가적인 유전적 발현 작제물의 일부로서 제공되는 경우, 소정의 세균성 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
프로모터의 비-제한적 예로는 초기 또는 후기 바이러스성 프로모터, 예를 들면 SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵생물 세포 프로모터, 예를 들면 베타 액틴 프로모터(Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 농축된 반응 요소 프로모터, 예를 들면 환상 AMP 반응 요소 프로모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르 프로모터(TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터(tre)가 포함된다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(Genbank, 수탁 번호 제X05244호, 뉴클레오티드 283 내지 341에 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 입수가능함)를 사용할 수 있다.
조직-특이적 전이유전자 발현, 특히 조혈 세포 및 프로그래밍으로부터 유도된 조혈 세포의 전구체에서의 리포터 유전자 발현은 유도된 조혈 세포 및 전구체를 확인하는 방법으로서 바람직할 수 있다. 특이성 및 활성 둘 다를 증가시키기 위해, 시스-작용성 조절 요소의 사용이 고려되어 왔다. 예를 들면, 조혈 세포-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 다수의 이러한 조혈 세포-특이적 프로모터는 표 1에 제공된 조혈 유전자의 프로모터와 같이 당업계에 공지되어 있다.
소정 양상들에서, 본 발명의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열 및 심지어 상대적으로 긴 거리(표적 프로모터로부터 수 킬로베이스(kilobase) 이하)에 걸쳐서도 시스로 그리고 이들의 배향에 관계없이 작용하는 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 주어진 프로모터에 매우 근접하게 기능할 수도 있으므로 이러한 긴 거리에 반드시 제한되는 것은 아니다.
다수의 조혈 세포 프로모터 및 인핸서 서열이 동정되었고, 이는 본 발명에서 유용할 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,556,954호; U.S. 특허 출원 20020055144; U.S. 특허 출원 20090148425를 참조한다.
특정 양상들에서, 상기 프로모터는 유도가능한 프로모터이다. 유도가능한 프로모터의 활성은 생물 또는 무생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도될 수 있다. 유도가능한 프로모터는 유전자 조작시 매우 강력한 도구이고, 작동가능하게 링크된 유전자의 발현이 유기체의 소정 발달 단계 또는 특정 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있기 때문이다. 예를 들면, 이. 콜라이 테트라사이클린-내성 오페론의 필수 조절 구성성분에 기초한 Tet-On 및 Tet-Off 유도가능한 유전자 발현 시스템을 사용할 수 있다. 출발 세포에 일단 확립되면, 유도물질인 독시사이클린(Dox, 테트라사이클린 유도체)이 발현 시스템을 용량-의존적 방식으로 제어하고, 이는 프로그래밍 유전자의 발현 수준의 정확한 조정을 가능하게 한다. 예시적 실시형태들에서, 유도가능한 프로모터는 rtTET-유도가능한 Tight 프로모터(pTight)이다. 따라서, pTight 프로모터는 PSC를 조혈 전구 세포에 프로그래밍하기에 충분한 시간 동안 ETV2, GATA2 및 HOXA9와 같은 다중-계통 프로그래밍 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있고, 해당 발현은 후속적으로 턴 오프(turn off)될 수 있다. pTight 프로모터는 또한 양-방향 프로모터일 수 있다.
2. 개시 신호 및 연계된 발현
특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 본 발명의 방법에서 제공되는 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호로는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야 숙련가는 쉽게 이를 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 암호화 서열의 판독 프레임과 "프레임-내에" 존재해야 한다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시킴으로써 향상될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 사용은 다중 유전자 또는 폴리시스트론(polycistronic) 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존적 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서의 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 2개의 구성원(소아마비와 뇌 심근염)으로부터의 IRES 요소(Pelletier and Sonenberg, 1988) 및 포유동물 메시지로부터의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)가 기술되어 있다. IRES 요소는 이종성 개방 판독 프레임과 링크될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론성 메세지를 생성할 수 있다. IRES 요소 덕분에, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 다중 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호를 참조한다).
추가로, 소정 2A 서열 요소는 본 개시에서 제공되는 작제물에서 프로그래밍 유전자의 연계- 또는 공동-발현을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 절단 서열은 개방 판독 프레임을 링크하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동-발현시키는데 사용될 수 있다. 예시의 절단 서열은 F2A(구제역 바이러스 2A) 또는 "2A-유사" 서열(예를 들면, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다(Minskaia and Ryan, 2013). 특정 실시형태들에서, F2A-절단 펩타이드는 다중-계통 작제물에서 유전자의 발현을 연계시키는데 사용된다.
3. 복제의 기원
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이는 하나 이상의 복제 부위 기원(종종 "ori"라고 칭함), 예를 들면 상기 기술된 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍시 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전자 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있고, 상기 핵산 서열은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 상기 기술된 다른 염색체외 복제성 바이러스 또는 자율 복제 서열(ARS)의 복제 기원이 사용될 수 있다.
4. 선택 및 스크리닝가능한 마커
소정 실시형태들에서, 본 개시의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 허용하는 세포에 확인가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로 선택 마커는 선택을 허용하는 성질을 부여하는 선택 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 마커이고, 한편 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 방해하는 마커이다. 양성 선택 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하고, 예를 들면 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 기초한 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에도, 그 기초가 비색 분석인 GFP와 같은 스크리닝가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 이용될 수 있다. 당해 분야 숙련가 중 하나는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝가능한 마커의 추가의 예는 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
C. 핵산 전달
본 방법을 이용하여 조혈 전구 세포로 프로그래밍되는 만능 줄기 세포에 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 도입하는 것은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달을 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들면, 생체외 형질감염(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989)에 의한, 마이크로인젝션(microinjection)(본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Harland and Weintraub, 1985]; 미국 특허 제5,789,215호)을 포함하는 주사(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호)에 의한; 인산 칼슘 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); 전기천공(본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,384,253호; 문헌[Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984])에 의한; 칼슘 포스페이트 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)에 의한; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 이용함(Gopal, 1985)에 의한; 직접적 초음파 부하(Fechheimer et al., 1987)에 의한; 리포솜 매개된 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) 및 수용체-매개된 형질감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)에 의한; 미세발사체 충격(microprojectile bombardment)(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 PCT 출원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호)에 의한; 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호)에 의한; 아그로박테리움 매개된 형질전환(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호)에 의한; 건조화(desiccation)/억제 매개된 DNA 흡수(Potrykus et al., 1985)에 의한 그리고 이러한 방법들의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접적 전달이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 기술의 적용을 통해 예를 들면, 이들 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
1. 리포솜 매개된 형질감염
한 소정 실시형태에서, 핵산은 리포솜-매개된 형질감염에 의해 만능 줄기 세포에 도입될 수 있다. 이러한 방법에서, 핵산은 예를 들면, 리포솜과 같은 지질 복합체에 포획된다. 리포솜은 인지질 이중층막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포성 구조이다. 다층판상(multilamellar) 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh and Bachhawat, 1991).
또한, 리포펙타민(Gibco BRL) 또는 수퍼펙트(Superfect)(Qiagen)와 복합체화된(complexed) 핵산도 고려된다. 사용되는 리포솜의 양은 사용된 세포뿐만 아니라 리포솜의 성질에 기초하여 다를 수 있고, 예를 들면 1 내지 1,000만 세포당 약 5 내지 약 20㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
리포솜-매개된 핵산 전달 및 시험관내에서의 외래 DNA의 발현은 매우 성공적이었다(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 또한, 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간종양 세포에서의 리포솜-매개된 전달 및 외래 DNA의 발현의 실행가능성(feasibility)도 입증되었다(Wong et al., 1980).
소정 실시형태들에서, 리포솜은 적혈구응집성 바이러스(HVJ: hemagglutinating virus)와 복합체화될 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 촉진시키고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다(Kaneda et al., 1989). 다른 실시형태들에서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 복합체화되거나 사용될 수 있다(Kato et al., 1991). 다른 추가의 실시형태들에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 함께 복합체화되거나 사용될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.
2. 전기천공
소정 실시형태들에서, 핵산은 전기천공을 통해 세포소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 도입된다. 전기천공은 세포와 DNA의 현탁액을 고-전압 방전에 노출시키는 것을 포함한다. 수용자 세포는 기계적 손상에 의해 형질전환에 더 취약하게(susceptible) 될 수 있다. 또한, 사용된 벡터의 양은 사용된 세포의 성질에 따라 다를 수 있고, 예를 들면 1 내지 1,000만 세포당 약 5 내지 약 20㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
전기천공을 사용한 진핵생물 세포의 형질감염은 꽤 성공적이었다. 마우스 프레-B 림프구는 사람 카파-면역글로불린 유전자로 형질감염되었고(Potter et al., 1984), 래트 간세포는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 이러한 방식으로 형질감염되었다(Tur Kaspa et al., 1986).
V. 조혈 전구 세포의 생산 방법
A. 다중-계통 조혈 전구 세포
본 개시는 만능 줄기 세포(PSC)로부터 다중-계통 조혈 전구 세포를 생산하는 방법을 제공한다. ESC 또는 iPSC와 같은 PSC는 PSC를 다중-계통 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍하는 본원에 기술된 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 특히, 다중-계통 조혈 전구체는 골수 및 림프구 계통 세포로 분화할 잠재력을 갖는다. 바람직하게는, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETS 유전자, 조혈 발달 유전자 및 호메오박스 유전자를 포함한다. 예시의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자로는 EVT2 또는 ERG, GATA2 및 HOXA9가 포함된다.
HOXA10과 같은 추가의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 순방향 프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있다. 몇몇의 양상들에서, 조혈 프로그래밍 유전자는 조혈 전구 세포의 확대를 위해 당해 분야에 공지되어 있는 서열에 융합된다(본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 공개 제US20080299095호). 예시의 서열은 NUP98 또는 이의 호메오도메인이다. 한 예시의 방법에서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자로는 EVT2 또는 ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10이 포함된다.
조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 하나 이상의 발현 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 하나의 발현 작제물에 의해 암호화된다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자의 발현은 단일 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 조혈 프로그래밍 유전자의 발현은 IRES 또는 2A 서열 요소에 의해 작동가능하게 링크될 수 있다.
바람직하게, 3개의 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 PSC를 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍하기에 충분한 시간 동안만 발현된다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 유도가능한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자의 발현은 다중-계통 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍하기에 충분한 시간 동안 PSC 내에서 유도될 수 있다. 상기 시간은 약 1일 내지 약 20일, 예를 들면 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일일 수 있다. 대안으로, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 에피솜 벡터에 의해 PSC에 도입될 수 있다. 따라서, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 PSC에서 일시적으로 발현될 수 있다.
이어서, 다중-계통 조혈 전구 세포를 배양하여 추가로 림프구 및 골수 계통 세포를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 생착가능한 조혈 줄기 세포로 더 프로그래밍할 수 있다.
B. 장기간 생착을 위한 조혈 세포
다중-계통 조혈 전구 세포는 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포로 추가로 프로그래밍될 수 있다. 바람직하게는, PSC 또는 조혈 전구 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)(예를 들면, 표 1)를 암호화하는 하나 이상의 추가의 발현 작제물(들)로 형질감염되고, 이의 발현은 다중-계통 조혈 전구체가 생체내에서 안정하게 생착되도록 한다. 하나 이상의 추가의 발현 작제물은 다중-계통 작제물(들)과 동시에 또는 PSC가 미성숙 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍된 후에 PSC에 도입될 수 있다.
장기간 생착을 위한 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)는 하나 이상의 발현 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 바람직하게는, 다중 유전자들은 발현 작제물에 의해 암호화된다. 따라서, 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)(즉, 장기간 생착 유전자)의 발현은 단일 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 장기간 생착 유전자의 발현은 예를 들면 IRES 또는 2A 서열 요소에 의해 작동가능하게 링크될 수 있다.
소정 양상들에서, 장기간 생착을 위한 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)는 다중-계통 조혈 전구체에서 발현되고 PSC에서는 발현되지 않는다. 따라서, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)는 PSC에서 근본적으로 침묵되는 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 한 예시의 방법에서, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 있다. 대안으로, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)는 유도가능한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)의 발현은 PSC가 다중-계통 조혈 전구 세포로 순방향 프로그래밍된 후에 유도될 수 있다. 또 다른 대안에서, 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자(들)를 암호화하는 작제물(들)은 이들이 PSC로부터 순방향 프로그래밍된 후에 미성숙 조혈 전구 세포에 형질감염될 수 있다.
C. 세포 배양
장기간 생착이 가능한 다중-계통 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포는 당해 분야에 공지되어 있는 조혈 줄기 세포 배양을 위한 조건 하에서 배양될 수 있다. 특히, 조혈 전구 세포는 골수 또는 림프구 계통과 같은 특정 조혈 계통을 유도하기 위한 조건 하에서 배양될 수 있다.
일반적으로, 본 개시의 세포는 세포 성장을 지속할 수 있는 영양이 풍부한 완충된 용액인 배양 배지에서 배양된다. 본원에 기술된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로 단리하고, 확대하고, 분화시키기에 적합한 배양 배지로는 고 글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), DMEM/F-15, 리보비츠(Liebovitz) L-15, RPMI 1640, 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 및 Opti-MEM SFM(Invitrogen Inc.)이 포함된다. 화학적으로 정의된 배지는 최소 필수 배지, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 사람 Ex Cyte 지질단백질, 트랜스페린, 인슐린, 비타민, 필수 및 비-필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 글루타민 및 미토겐이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함하고, 미토겐도 적합하다. 본원에 사용되는 바와 같이, 미토겐은 세포의 분열을 자극하는 제제를 말한다. 제제는 세포가 세포 분열을 시작하여 유사분열이 유발되도록 장려하는 화학물질, 보통 단백질의 일부 형태일 수 있다. 한 실시형태에서, 미국 특허 일련번호 제08/464,599호 및 WO96/39487호에 기술된 바와 같은 무혈청 배지 및 미국 특허 제5,486,359호에 기술된 바와 같은 "완전 배지"가 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 것으로 고려된다. 몇몇의 실시형태들에서, 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(FBS), 사람 자가 혈청, 사람 AB 혈청 또는 헤파린(2U/ml)이 보충된 혈소판 풍부 혈장으로 보충된다. 세포 배양물을 CO2 대기, 예를 들면 5% 내지 12%로 유지하여 배양액의 pH를 유지하고, 습한 대기의 37℃에서 인큐베이션하고, 컨플루언스(confluence)를 85% 미만으로 유지하도록 계대배양할 수 있다.
조혈 세포로 분화되는 만능 줄기 세포 및 이들의 전구체는 만능성을 유지하기에 충분한 배지에서 배양할 수 있다. 본 개시의 소정 양상에서 생성된 유도된 만능 줄기 세포의 배양은 미국 특허 출원 20070238170 및 미국 특허 출원 20030211603에 기술된 바와 같이, 영장류 만능 줄기 세포, 보다 구체적으로는 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 사람 배아 줄기 세포와 같이, 유도된 만능 줄기 세포는 80% DMEM/F12(Gibco #11330032 또는 #11320082), 20% 녹아웃 혈청 대체물, 1% 비-필수 아미노산, 1mM의 L-글루타민, 0.1mM의 β-머캅토에탄올 및 bFGF(4 내지 100ng/mL) 중에 유지된다(PCT 출원 WO 99/20741). 대안으로, 사람 ES 세포 및 iPS 세포는 mTeSR1과 같은 화학적으로 정의된 혈청-불포함 배지에서 유지될 수 있다.
조혈 세포 및 이들의 전구체는 조혈 전구 세포로의 세포의 프로그래밍을 촉진하기에 충분한 조혈 프로그래밍 인자의 세포내 수준을 증가시키는 조건 하에 배지에서 만능 줄기 세포 또는 다른 비-조혈 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 배지는 또한 다양한 종류의 성장 인자와 같은 하나 이상의 조혈 세포 분화 및 성숙 제제를 함유할 수 있다. 이들 제제는 세포가 보다 성숙한 표현형이 되도록 - 또는 성숙한 세포의 생존을 우선적으로 촉진시키도록 - 또는 이들 효과 둘 다의 조합을 갖도록 세포를 유도하는 것을 보조할 수 있다. 조혈 전구 세포 및 조혈 세포 분화 및 성숙 제제로는 조혈 세포 계통의 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 용해성 성장 인자(펩타이드 호르몬, 사이토카인, 리간드-수용체 복합체 및 다른 화합물)가 포함될 수 있다. 이러한 제제의 비-제한적인 예로는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FLT-3 리간드(FLT3L), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-9(IL-9) 또는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 이들의 이소형 또는 변이체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
VI. 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포 특징
본 개시의 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포는 다수의 표현형 기준에 따라 특성확인될 수 있다. 기준은 발현된 세포 마커의 검출 또는 정량화, 기능적 활성 및 형태학적 특성 및 세포간 신호전달의 특성확인이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 양상들에서, 프로그래밍되는 세포는 조혈 세포 확인을 위한 조혈 세포-특이적 프로모터와 같은 조직-특이적 또는 세포-특이적 전사 조절 요소를 포함하는 리포터 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다.
본 개시의 소정 양상들에서 구현되는 조혈 전구 세포는 자연에서 조혈 전구 세포의 특징인 형태학적 특성을 갖는다. 상기 특성은 이러한 것들을 평가하는 숙련가들에 의해 쉽게 이해될 수 있고, 원형 비-부착성 세포를 생성하는 세포 클러스터(cluster)의 검출을 포함한다. 또한, 조혈 전구 세포는 둥근 형태와 낮은 세포질-대-핵 비율을 갖는다.
본 개시의 세포는 또한 이들이 조혈 세포 계통의 세포의 특징인 소정 마커를 발현하는지 여부에 따라 특성확인될 수 있다. 조혈 줄기 세포 및 조혈 세포의 전구체의 구별에 유용한 세포 마커의 비-제한적 예로는 CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a, CD38, CD90, CD133, CD105, CD117(c-kit, SCF에 대한 수용체), CD74 및 CD41a이 포함된다. 예를 들면, 골수 및 림프구 계통으로 분화할 수 있는 미성숙 조혈 전구체는 CD43 및 CD34에 대해 양성임으로써 구별될 수 있다. ESC 또는 iPSC와 같은 다능성 출발 세포로부터 분화된 세포를 확인하기 위해서, 만능 줄기 세포 또는 체세포에 존재하는 TRA-1-60, TRA-1-81, CD166 또는 CD140b와 같은 소정 마커를 발현하지 않는 세포를 확인하는 것이 유용할 수 있다.
이러한 마커의 발현 수준의 평가는 다른 세포와 비교하여 결정될 수 있다. 조혈 전구 세포 또는 조혈 세포의 마커에 대한 양성 대조군으로는 목적하는 종의 성체 조혈 세포 또는 조혈 줄기 세포, 및 확립된 조혈 세포주가 포함된다. 독자는 영구 세포주 또는 장기간 조혈 모세포 배양이 대사적으로 변경될 수 있고, 1차 조혈 세포 및 조혈 전구 세포의 소정 특징을 나타내는데 실패할 수 있음에 주의한다. 음성 대조군으로는 성체 섬유아세포 세포주, 성체 간엽 줄기 세포 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포와 같은 별도 계통의 세포가 포함된다. 미분화 줄기 세포는 상기 열거된 마커들 중 몇몇에 대해 양성이지만, 하기 실시예에 열거되는 바와 같이 조혈 세포 및 조혈 전구 세포의 소정 마커에 대해서는 음성이다.
본 개시에 열거된 조혈-특이적 단백질 및 올리고사카라이드 결정인자는 임의의 적합한 면역학적 기술 - 예를 들면 세포-표면 마커에 대한 유동 면역세포화학, 세포내 또는 세포-표면 마커에 대한 (예를 들면, 고정된 세포 또는 조직 절편의) 면역조직화학, 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석, 및 세포 추출물 또는 배지에 분디되는 산물에 대한 효소-링크된 면역검정을 이용하여 검출될 수 있다. 세포에 의한 항원의 발현은, 임의로 세포의 고정화 후의 그리고 임의로 표지된(labeled) 2차 항체 또는 표지화를 증폭시키기 위한 다른 접합체(예를 들면, 비오틴-아비딘 접합체)를 이용한 표준 면역세포화학 또는 유동 세포측정 검정에서 현저히 검출가능한 양의 항체가 항원에 결합할 것인 경우 "항체-검출가능한" 항체라고 한다.
또한, 특이적(예를 들면, 조혈 전구 세포-특이적) 마커의 발현은 노던 블롯(Nothern blot) 분석, 도트-블롯 하이브리드화(dot-blot hybridization) 분석 또는 표준 증폭 방법에서 서열-특이적 프라이머를 이용한 역-전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준으로 검출될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호). 이러한 개시에 열거된 특정 마커에 대한 서열 데이터는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 전형적인 대조 실험에서 표준 절차에 따른 세포 샘플에 대한 검정의 수행이 표준 시간 윈도우(standard time window) 내에서 명확하게 식별가능한 하이브리드화 또는 증폭 산물을 초래하는 경우, mRNA 수준으로의 발현은 본 개시에 기술된 검정들 중 하나에 따라 "검출가능한" 것이다라고 한다. 달리 요구되지 않는 한, 상응하는 mRNA가 RT-PCR에 의해 검출가능하다면 특정 마커의 발현이 나타난다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출된 특정 마커의 발현은 상기 수준이 미분화된 만능 줄기 세포, 섬유아세포 또는 다른 비관련 세포 유형과 같은 대조군 세포의 수준보다 적어도 2배, 바람직하게는 10배 이상 또는 50배 이상인 경우 양성으로 간주된다.
세포는 또한 조혈 계통의 세포의 특징인 기능적 활성을 나타내는지의 여부에 따라 특성확인될 수 있다. 예를 들면, 조혈 전구 세포는 자기-재생하는 능력을 갖고, 1개 초과의 유형의 조혈 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 수득 된 조혈 전구 세포는 림프구 세포(예를 들면, T 세포, B 세포 및 NK 세포), 적혈-거핵구(예를 들면, 적혈구 및 혈소판) 및 골수 세포(예를 들면, 과립구 및 단핵구)를 시험관내에서 효율적으로 생성할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 조혈 줄기 세포는 포유동물에서 장기간 생착이 가능하다. 예를 들면, 마우스 모델에서의 장기간 생착은 생착 후 6, 12, 18, 20 또는 25주째에 말초혈 및/또는 골수에서 사람 조혈 세포(예를 들면, CD45+ 및 HLA 클래스 I+인 세포)의 존재에 의해 특성확인될 수 있다.
본 방법에 따른 프로그래밍에 의해 제공되는 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포는 이들이 나타내도록 의도되는 세포의 단계의 다수의 특성을 가질 수 있다. 특정 세포에 존재하는 이들 특성이 많을수록 보다 더 조혈 세포 계통의 세포로서 특성확인될 수 있다. 이들 특성 중 적어도 2개, 3개, 5개, 7개 또는 9개를 갖는 세포가 점점 더 선호된다. 배양 용기 또는 투여용 조제(preparation)에 존재할 수 있는 특정 세포 집단과 관련하여, 이들 특성의 발현시 세포들 사이의 균일성은 종종 유리하다. 이러한 상황에서, 세포의 적어도 약 40%, 60%, 80%, 90%, 95% 또는 98%가 원하는 특성을 갖는 집단이 점점 더 선호된다.
VII. 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포의 용도
본 개시의 소정 양상들의 방법 및 조성물에 의해 제공되는 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 이들로는 몇 가지만 말하자면, 생체내 조혈 세포 및 조혈 전구체의 이식(transplantation) 또는 체내이식(implantation); 시험관내 세포독성 화합물, 발암원, 돌연변이 유발원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 스크리닝; 혈액학적 질환 및 손상의 메커니즘의 설명; 메커니즘에 의해 약물 및/또는 성장 인자가 작동하는 메커니즘의 연구; 환자에서의 암의 진단 및 모니터링; 유전자 치료요법; 및 생물학적 활성 산물의 생산이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
A. 시험 화합물 스크리닝
본 개시의 프로그래밍-유도된 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포는 본원에서 제공되는 조혈 세포의 특징에 영향을 미치는 인자(예를 들면, 용매, 소분자 약물, 펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경적 조건(예를 들면, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 특정 스크리닝 적용은 약물 연구에서 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 독자는 일반적으로 표준 교과서[In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997] 및 미국 특허 제5,030,015호를 참조한다. 소정 양상들에서, 조혈 계통으로 프로그래밍된 세포는 단기간 배양시 조혈 세포 및 전구체에 대해 이전에 수행되었던 바와 같은 표준 약물 스크리닝 및 독성 검정을 위한 시험 세포의 역할을 한다. 후보 약제학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로 소정 양상들에서 제공되는 조혈 세포 또는 전구체를 후보 화합물과 조합하여, (치료되지 않은 세포 또는 불활성 화합물로 치료된 세포와 비교하여) 화합물에 기여할 수 있는 세포의 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의의 변화를 측정하고, 이어서 관찰된 변화와 상기 화합물의 영향을 상호관련되게 하는 것을 포함한다. 스크리닝은 화합물이 조혈 세포 또는 전구체에 대한 약리학적 효과를 갖도록 고안되므로, 또는 다른 곳에서 영향을 갖도록 고안된 화합물이 조혈 세포 또는 전구체에 의도하지 않은 영향을 가질 수 있으므로 수행될 수 있다. 2개 이상의 약물은 가능한 약물-약물 상호작용 효과를 검출하기 위해 조합하여(동시에 또는 순차적으로 세포와 조합함으로써) 시험될 수 있다.
몇몇의 적용에 있어서, 화합물은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포에 대한 독성에 관해 스크리닝될 수 있다.
B. 조혈 세포 치료요법
본 발명의 개시는 또한 혈액학적 질환 또는 장애 또는 손상으로 인한 아마도 이러한 치료요법을 필요로 하는 대상체에 대한 기능의 정도를 회복시키기 위한 본원에서 제공되는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포의 용도를 제공한다. 예를 들면, 본원에 개시된 방법에 의해 유도된 조혈 세포 및 조혈 전구 세포는 혈액학적 질환 및 장애, 예를 들면 혈색소병증, 빈혈 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 조혈 줄기 세포 및 이들의 전구체는 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 수혈을 필요로 하는 대상체 또는 혈액학적 장애를 갖는 대상체)에게 혈액 또는 혈액 세포(예를 들면, 적혈구 세포, 혈소판 및 호중성 과립구)를 공급하는데 유용할 수 있다. 이러한 세포는 화학 치료요법과 같은 세포-억제성 치료요법에 의해 야기된 조혈 세포 결핍증의 치료에 유용할 수 있다.
치료학적 적용을 위해 본원에서 제공되는 조혈 줄기 세포 및 전구체의 적합성(suitability)을 결정하기 위해, 우선 세포를 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 한 수준에서, 세포는 생체내에서 이들의 표현형을 생존시키고 유지하는 능력에 대해 평가된다. 본원에서 제공된 프로그래밍된 세포는 면역결핍 동물(예를 들면, NOG 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선조사에 의해 변역결핍이 된 동물)에게 추가의 관찰이 가능한 부위에, 예를 들면 신장 캡슐 아래에, 비장 내에, 간 소엽 내에 또는 골수 내에 투여된다. 조직은 수일 내지 수주 이상의 기간 후에 수거하고, 만능 줄기 세포와 같은 출발 세포 유형이 여전히 존재하는지 여부에 관해 평가한다. 이는 투여된 세포에 검출가능한 표지(예를 들면, 녹색 형광성 단백질 또는 β-갈락토시다제)를 제공함으로써; 또는 투여된 사람 세포에 대해 특이적인 구성적 마커를 측정함으로써 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 프로그래밍된 세포가 설치류 모델에서 시험되고 있는 경우, 투여된 세포의 존재 및 표현형은 사람-특이적 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 ELISA에 의해 또는 사람 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 특이적인 증폭을 야기하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 이용한 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하기 위한 적합한 마커는 본 개시의 다른 곳에서 제공된다.
본 개시의 방법에 의해 제공되는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포는 혈액학적 장애 및 손상을 치료하는 이들의 능력에 대해 다양한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들면, 겸상 적혈구 빈혈증 마우스 모델 또는 T/B 세포-결핍 Rag-2 녹아웃 마우스는 본원에 개시된 조혈 세포 및 조혈 전구체를 시험하는데 특히 유용한 동물 모델일 수 있다.
동물 모델에서의 바람직한 기능적 특성 또는 효능을 입증하는 본 개시의 소정 양상들에서 제공되는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포는 또한 이를 필요로 하는 사람 대상체에게 직접 투여하기에 적합할 수 있다. 지혈 목적을 위해, 세포는 순환계에의 적당한 접근을 갖는 임의의 부위에 투여될 수 있다. 조혈 세포 또는 이의 전구체는 손상 또는 질환의 부위에도 전달될 수 있다.
본원에서 제공되는 세포는 이를 필요로 하는 임의의 대상체의 치료요법에 사용될 수 있다. 이러한 치료요법에 적절할 수 있는 사람 병태로는 다양한 빈혈 및 혈색소병증뿐만 아니라 감소된 조혈 세포수를 특징으로 하는 질환(예를 들면, 골수형성이상 증후군, 골수섬유증, 호중구 감소증, 무과립구증, 글란츠만(Glanzmann) 혈소판 감소증, 혈소판 기능 저하증 및 후천성 면역 결핍 증후군)도 포함된다. 사람 치료요법의 경우, 용량은 일반적으로 약 109 내지 1012개의 세포이고, 전형적으로 약 5×109 내지 5×1010개의 세포이고, 이는 대상체의 체중, 고통의 성질 및 중증도 및 투여된 세포의 복제 능력을 조정한다. 치료 방식 및 적절한 용량을 결정하기 위한 궁극적인 책임은 관리 임상의에게 있다.
C. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 배포(distribution)
제조, 배포 및 사용의 목적으로, 본 개시의 조혈 전구 세포 및 조혈 줄기 세포는 전형적으로 수송 또는 보관을 용이하게 하기 위해 임의로 동결된, 등장성 부형제 또는 배양 배지 중의 세포 배양물 또는 현탁액의 형태로 공급된다.
본 개시는 또한 제조, 배포 또는 사용 동안 임의의 시점에 존재하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 상이한 시약 시스템을 포함한다. 상기 세포 세트는 본 개시에 기술된 2개 이상의 세포 집단의 임의의 조합을 포함하고, 프로그래밍-유도된 세포(조혈 계통 세포, 이들의 전구체 및 아형)가 미분화된 줄기 세포, 체세포-유도된 조혈 세포 또는 다른 분화된 세포 유형과 조합하여 예시된다. 세트의 세포 집단은 때때로 동일한 게놈 또는 이의 유전자 변형된 형태를 공유한다. 세트 내의 각각의 세포 유형은 동일한 시설에 또는 비즈니스 관계를 공유하는 동일한 실체 또는 상이한 실체의 통제 하에 동일하거나 다른 시간에 상이한 위치에 함께 또는 별도의 컨테이너에 패키징될 수 있다.
VIII. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태들을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에서 양호하게 기능하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 본 발명의 실행에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각될 수 있음이 당해 분야 숙련가에 의해 이해되어야만 한다. 하지만, 당해 분야 숙련가는 본 개시에 비추어 개시되는 특정 실시형태들에 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 이는 또한 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 유사하거나 동일한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야만 한다.
실시예 1 - ETV2/ERG, GATA2 및 HOXA9의 연계된 발현은 사람 PSC를 미성숙 CD34 + 조혈 선조체로 효율적으로 프로그래밍한다
본 연구는 골수 및 림프구 잠재성을 포함하는 다중-계통의 잠재성을 갖는 조혈 전구체를 생산하기 위해 수행되었다. 다중-계통 잠재성을 달성하기 위한 프로그래밍 효율에 대해 프로그래밍 유전자의 다중 배열을 시험하였다(표 2). 전이유전자의 암호화 영역을 rtTET-유도가능한 Tight 프로모터(pTight)의 제어 하에 PiggyBac 발현 벡터에 클로닝하였다. ETV2/ERG 및 GATA2(E+G)는 각각 블라스티시딘 및 제네티신 내성을 갖는 별도의 발현 벡터에 클로닝되었다. 조합된 블라스티시딘 및 제네티신 선택을 사용하여 형질감염된 세포에서 ETV2/ERG와 GATA2 공동-발현을 달성하였다. 대안으로, 형질감염된 세포에서 평형화된 균일 발현을 위해, ETV2/ERG 및 GATA2(EG)는 하나의 pTight-제어된 발현 카세트에서 F2A-절단 펩타이드를 통해 링크되었다. ETV2/ERG와 GATA2(EG)의 연계된 공동-발현은 현저하게 향상된 프로그래밍 효율을 초래하였고, ETV2/ERG 및 GATA2(E+G)가 별개의 벡터 상에서 발현되었을 때 나타난 중간 내피 세포 단계를 우회하는 것으로 나타났다(도 1).
Figure pct00004
이어서, HOXA9는 양방향 Tight 프로모터(bi-pTight)를 사용하여 EG 발현 카세트(EGH)에 링크되어 HOXA9가 골수 및 림프구 잠재성을 포함하는 다중-계통 잠재성을 갖는 조혈 전구체를 생산하기 위한 프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있는지를 결정하였다. DOX(독시사이클린)-유도가능한 유전자 발현을 위해 rtTET 단백질을 구성적으로 발현하도록 조작된 사람 PSC를 사용하여 E+G, EG 및 EGH 유도성 유전자 배열 시험하였다. PiggyBac 전이유전자 벡터를 hPBase-발현 벡터와 함께 전기천공을 사용하여 rtTET-발현 사람 PSC에 도입하였다. 안정한 PiggyBac 트랜스포손 통합을 갖는 세포를 100μg/ml의 블라스티시딘 및/또는 제네티신을 갖는 배양물에서 선택하였다. 전이유전자-유도된 조혈 프로그래밍을 위해, 형질감염된 PSC를 0.5mM EDTA를 이용하여 약 5 내지 10분 동안 해리시켰고, PSC 배양 배지(예를 efmaus, TeSR 또는 E8®)에 재현탁시켰고, 마트리겔(matrigel)-코팅된 6-웰 플레이트 상에 5μM의 ROCK 억제제 블레비스타틴이 보충된 PSC 배양 배지 중의 5 내지 10 × 104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, PSC 배양 배지를 0.25μg/ml의 독시사이클린이 보충된 3ml/웰의 유도 배지(표 3)로 대체함으로써 전이유전자 발현 및 조혈 유도를 개시하였다. 유도 배지는 2일마다 교환하였고, 배양물은 Accutase(Innovative Cell Technologies) 세포 해리 용액을 이용하여 유도 8일째에 수거하였다.
Figure pct00005
CD34+CD43- 내피 세포, CD43+ 전체 조혈 세포 및 CD43+CD34+ 미성숙 조혈 선조체의 측정을 위해 수거된 세포를 계수하였고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 도트-플롯 및 이미지는 ETV2- 및 ERG-기반 유전자 배열 둘 다에서 별개의 E+G 유전자를 이용한 유도가 혼합된 CD34+CD43- 내피 및 CD43+ 조혈 집단을 초래하였고, 한편 링크된 EG 유전자는 사람 PSC를 CD43+ 조혈 집단으로 효율적으로(>80%) 프로그래밍하였음을 입증하였다. 보다 중요하게도, 미성숙 CD43+CD34+ 선조체의 비율은 E+G 및 EG-유도된 배양물에서와 유사하였고(전체 CD43+ 세포의 30 내지 40%), 이는 조혈 세포에서의 유사한 분화율을 시사하지만, ETV2/ERG-GAT2-HOXA9(EGH) 유전자 배열은 CD43+ 세포의 90% 초과에서의 CD34+ 발현에 의해 나타내어지는 바와 같이 조혈 선조체의 미성숙 집단을 효율적으로 유도하였고 이를 유지하였다(도 1b). 8일째 DOX-유도된 배양물에서의 절대 세포수는 ETV2- 및 ERG-기반 유전자 배열 둘 다에서 유도된 CD43+ 조혈 세포의 총 수가 유도성 유전자(EG)의 링크를 통해 현저하게 증가되었고, 한편 미성숙 CD34+CD43+ 선조체의 수의 2배 초과가 HOXA9-함유 EGH 유전자 배열에 의해 특이적으로 유도되었음(도 1c)을 입증하였다.
EG- 및 EGH-유도된 조혈 세포의 기능적 특성을 검사하기 위해, MS5 기질 세포와의 공동-배양에서 8일째 DOX-유도된 세포의 확대 및 분화 잠재성을 시험하였다. 유도된 세포를 미토마이신 C-처리된 MS5 세포 단일층을 갖는 6-웰 플레이트에 4ml/웰 공동-배양 배지 중의 104개 세포/웰로 플레이팅하였다(표 4). 배양물은 3일마다 절반 배지 교환하여 2주 동안 유지하였다. 비-부착성 세포를 수집하였고, 세포 단일층을 15분 동안 1mg/ml의 콜라게나제 IV 및 15분 동안 Accutase를 이용하여 연속적으로 처리함으로써 해리시켰다. 비-부착성 및 해리된 부착성 세포 분획을 합하였고, 절대 세포 수, 유동 세포측정법에 의한 총 CD43+ 및 미성숙 CD34+CD43+ 조혈 세포의 비율, 및 MethoCult 검정(StemCell Technologies)에 의한 콜로니-형성 세포의 분석에 사용하였다. 주로 작은 부유(floating) 세포 클러스터로 인하여 매우 제한된 성장을 나타냈던 EG-유도된 세포와는 대조적으로, EGH-유도된 세포는 익히 공지되어 있는 매우 원시적인 조혈 선조체의 특성인 현저하고 광범위한 옥석-유사(cobblestone-like) 성장 영역을 갖는 강력한 확대를 입증하였다(도 1d). 총 CD43+ 및 미성숙 CD43+CD34+ 세포의 절대 수는 확대된 EG-유도된 세포에서 단지 총 CD43+ 세포의 약 5배 증가 및 미성숙 CD34+CD43+ 세포의 결여를 입증하였다. 대조적으로, EGH-유도된 세포에서 총 CD43+ 조혈 세포는 30배 이상 확대되었고, CD43+CD34+ 미성숙 세포는 약 5배 확대되었다(도 1e). 단지 몇몇의 골수 콜로니만이 검출된 EG-유도된 세포에서는 콜로니-형성 잠재성이 매우 고갈되어 있었지만, MS5 기질과의 2주의 공동-배양 후 EGH-유도된 세포에서 다중-계통 콜로니-형성 잠재성이 검출되었다(도 1f).
Figure pct00006
실시예 2 - 미성숙 조혈 전구체의 다중-계통 잠재성의 향상
미성숙 조혈 선조체로의 PSC의 순방향 프로그래밍 효율을 향상시키기 위한 추가의 유전자를 스크리닝하였다. 미성숙, CD43+CD34+ 및 CD43+CD34+CD133+ 세포의 향상된 생산을 위해 ETV2/ERG-GATA2-HOXA9(EGH)에 대해 상보성일 수 있는 추가의 유전자를 검출하기 위한 스크리닝 모델을 고안했다.
pCMV는 미분화된 사람 PSC에서 본질적으로 억제되고 HPC와 같은 분화된 세포에서 활성 발현을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, CMV 프로모터의 이러한 특성이 유도된 CD43+ 유전자에서 유도-후 유전자 발현에 사용될 수 있는지를 알아 내기 위한 연구가 수행되었다. pCMV-EGFP 및 pTight-EG 작제물을 PiggyBac 발현 벡터를 사용하여 rtTET-발현 사람 PSC에 도입하였다. DOX-유도된 조혈 프로그래밍 후 CD43+ 세포에서의 EGFP 발현을 모니터링하였다. 미분화된/비-유도된 iPSC에서 그리고 DOX 유도-8일째까지, 유도된 CD43+ 세포를 포함하는 약 20%의 세포에서 낮은 EGFP 발현이 검출되었다. 대조적으로, 추가의 4일 후(예를 들면, 12일째), 50% 이상의 유도된 CD43+ 세포에서 높은 EGFP 발현이 검출되었다(도 2). 따라서, pCMV 프로모터는 추가 유전자의 도입-후 전이유전자 발현을 위해 사용될 수 있다.
추가의 유전자를 스크리닝하기 위해, rtTET-발현 PSC를 PiggyBac 발현 벡터에서 pTight-EGH(블라스티시딘 내성) 및 1개의 추가의 pTight- 또는 pCMV-시험 유전자(제네티신 내성)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포에서 EGH와 시험 유전자 공동-발현은 조합된 블라스티시딘 + 제네티신 선택에 의해 달성되었다. EGH로 형질감염된 사람 PSC 및 시험 유전자를 DOX에 의해 8일 동안 유도하여 CD43+ 세포를 생성시켰고, 이어서 2회의 연속적 2-주 MS5 공동-배양으로 추가로 확대시켰다(도 3b). 각각의 시험 유전자에 대해, 확대 배양 전반에 걸친 총 및 원시 조혈 세포 집단의 생산을 계산하였고, 내부 EGH 대조군의 분획으로서 나타내었다. EGH-유도된 원시 선조체의 확대에 긍정적인 효과를 입증하는 유전자에 대한 스크리닝 결과를 도 3c에 나타낸다. 8일 후에 전이유전자 발현을 가능하게 한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도된 HOXA10의 ETV2/ERG, GATA2 및 HOXA9로의 부가가 MS-5 기질 피더 세포 상에서의 2-주 확대 배양 동안 유도된 세포의 증식 및 CD43+CD34+CD133+ 세포의 생성을 크게 향상시켰음이 발견되었다(도 3a).
이어서, EGH-유도된 세포로부터의 림프구 세포 발달을 향상시키는 유전자를 검출하기 위한 스크리닝 모델을 고안했다(도 4a). T/NK 세포의 경우, 8일-유도된 세포를 EGH로 형질감염시켰고, 시험 유전자 조합을 DLL4-Fc/레트로넥틴-코팅된 플레이트(각각 0.5μg/㎠)에 T/NK 분화 배지(예를 들면, 아스코르브산, 마그네슘 포스페이트(95μM), 글루타맥스(1/100; Gibco), 페니실린/스트렙토마이신(1/100; Gibco) 및 사이토카인 - SCF, FLT3L, TPO 및 IL7(각각 50ng/ml)이 보충된 StemSpan SFEM(Stem Cell Technologies)) 중의 5x103개의 세포/㎠로 플레이팅하였다. 배양물은 2 또는 3일마다 절반 체적 배지 교환하여 저산소(예를 들면, 5% O2) 조건에서 유지하였다. 2주 후, 상기 세포를 신선한 DLL4-Fc/레트로넥틴-코팅된 플레이트 상에 추가의 2주 동안 형질감염시켰다. 4주 후에 수거된 세포를 CD3+CD8+ T 세포 및 CD3-CD8+ NK 세포에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. B 세포의 경우, EGH로 형질감염된 8일-유도된 세포 및 시험 유전자 조합을 미토마이신 C-처리된 MS5 단일층 상에 B 세포 분화 배지(예를 들면, FBS(10%, Hyclone), 글루타맥스(1/100, Gibco), 페니실린/스트렙토마이신(1/100; Gibco), 모노티오글리세롤(100□M) 및 사이토카인 - SCF, FLT3L, TPO(각각 50ng/ml), IL7(각각 20ng/ml) 및 IL3(10ng/ml, 세포 플레이팅시에만 부가됨)이 보충된 IMDM; 또는 예를 들면, FBS(10%, HyClone), 글루타맥스(1/100, Gibco), 페니실린/스트렙토마이신(1/100; Gibco), 아스코르브산(95μM) 및 사이토카인 - SCF 및 FLT3L(각각 50ng/ml), IL7(20ng/ml, B 세포 배양의 처음 2주 동안만 부가됨) 및 IL3(10ng/ml, B 세포 배양의 첫 주에만 부가됨)이 보충된 DMEM-F12) 중의 103개의 세포/㎠로 플레이팅하였다. 배양물을 2 또는 3일마다 절반 체적 배지 교환하여 4주 유지하였다. 각각의 신선한 배지 공급시, 부유하는 비-부착성 세포를 배지로 현탁시켜 제거하였다. 4주 후에 수거된 세포를 CD45+CD19+ B 세포에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. EGH, pCMV-NA9HD(NUP98-HOXA9 호메오도메인 융합 단백질) 및 pCMV-NA10(NUP98-HOXA10 융합 단백질) 유전자의 조합은 T, NK 및 B 세포로의 효율적인 분화를 가능하게 하였음이 발견되었다(도 4b).
실시예 3 - 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자는 장기간 생착 잠재성을 부여한다
장기간 조혈 생착을 가능하게 하기 위해서 EGH 발현 벡터와 조합될 수 있는 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 검출하기 위한 스크리닝 모델을 고안했다. EGH로 형질감염된 CD34+ 세포 및 상이한 시험 유전자 조합(예를 들면, 조합당 20개 이하의 유전자)을 자석-활성화된 세포 분류(MACS: magnet-activated cell sorting)에 의해 8일 DOX 유도 배양물로부터 정제하였다(도 5a). 유도 직후 주사를 위해, 4×106개의 CD34+ 세포를 HSC 배지(예를 들면, SCF, FLT3L 및 TPO(각각 100ng/ml)가 보충된 StemSpan SFEM) 중의 106개 세포/ml로 회수 배양물에 플레이팅하였고, 18 내지 24시간 후에 수거하였고, 6 내지 8주령 NOD/SCID/IL2Rg-/c-kitW41(NBSGW) 마우스에 정맥내 주사하였다. 이어서, 주사된 마우스를 생체내 연속적 전이유전자 발현을 위한 DOX 공급을 제공하기 위한 DOX-함유 식이(즉, 625mg DOX/kg)와 함께 7일 동안 케이지에 넣었다. HSC 배양물 적응된 세포의 주사를 위해,0.5×106개의 CD34+ 세포를 HSC 배지 중의 DLL4-Fc/레트로넥틴-코팅된 플레이트 상에 0.2×106개의 세포/ml로 플레이팅하였고, 저산소(예를 들면, 5% O2) 조건에서 4일째에 절반 배양 체적 교환하여 7일 동안 배양하였다. 배양 후, 수거된 세포를 이전에 8일째 CD34+ 세포를 주사한 동일한 마우스에게 주사하였고 7일 동안 DOX-함유 식이를 공급하였다. 주사 후, 마우스를 DOX가 없는 정상 식이로 전환하였고, 6, 12 및 18주째의 말초혈 및 20 내지 24주의 골수 중의 사람 조혈(즉, CD45+HLA 클래스 1+) 세포의 존재에 대해 시험하였다.
주사 후 12주째의 NBSGW 마우스의 말초혈 및 골수에서 사람 조혈 CD45+ 세포가 검출되었다(도 5b). EGH-유도된 세포가 주사된 마우스에서 사람 CD45+ 세포는 검출되지 않았고, 반면 추가의 10개의 프로그래밍 유전자와의 조합으로의 EGH(표 1)는 말초혈 및 골수 중의 검출가능한 사람 CD45+ 세포를 초래하였다. 주사한지 12주 후의 NBSGW 마우스의 마우스 골수 및 말초혈 중의 CD43/45+ T세포의 검출을 위한 추가의 분석을 수행하였다. 이들 CD43/45+ 세포는 EGH-유도된 세포가 주사된 마우스에서는 검출되지 않았고, 반면 추가의 프로그래밍 유전자와의 조합으로의 EGH는 마우스 골수 중의 4.64% CD43/45+ 세포를 초래하였다(도 5c).
이어서, H1-A16-TET ESC를 조혈 유도성 EGH 유전자(블라스티시딘 선택 벡터) 및 HSC 프로그래밍을 위한 시험 유전자들의 각종 조합(G418 선택 벡터)으로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 ESC를 블라스티시딘 및 G418의 존재 하에 2계대 배양하여 이중 형질감염체(EGH + 시험 유전자 조합)를 선택하였고, 이어서 CD34+ 세포를 유도되었고, 도 5a에 기술된 바와 같이 SGW 마우스에서의 생착에 대해 시험하였다. 생착된 마우스 골수 샘플 중의 각각의 시험된 전이유전자의 발현은 EHG-특이적 프라이머에 의해 검출된 전체 유전자전이 세포 집단에 대해 정규화된 전이유전자-특이적 qPCR에 의해 분석하였다. 이러한 발현을 주사된 CD34+ 세포에서의 초기 전이유전자 발현에 대해 비교하였다. 각각의 생착된/주사된 발현 비율은 세포 이식 후 전이유전자의 농후(양의 값) 또는 결실(음의 값)을 나타낸다(도 6).
(pCMV 발현 벡터를 이용한) 3개의 독립적 이식 실험에서 사전 시험관내 스크리닝으로부터 선택되는 40개의 후보 SCH 프로그래밍 유전자를 시험하였다. 전체에서, 세포 주사의 12주 초과 후에 생착된 마우스의 골수에서 20개의 사람 전이유전자가 검출되었다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 골수 중의 몇몇의 전이유전자의 발현 수준은 이식가능한 세포의 생체내 선택을 나타내는 주사된 CD34+ 세포와 비교하여 유의하게 더 높거나 더 낮았다. 그러나, 발현 수준에 관계없이, 모든 검출된 사람 유전자는 생착가능한 조혈 줄기/선조 세포의 공지의 특성인 골수 환경에서의 PSC-유도된 CD34+ 세포의 이동, 생존 및 지속에 기여할 수 있다.
따라서, NBSGW 마우스에서의 조합적 스크리닝 전략(McIntosh et al., 2015)을 이용하여, 골수 및 말초혈에서의 사람 PSC-유도된 세포의 장기간 생착을 부여하는 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 동정되었다.
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본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 실시형태들의 관점에서 기술되었지만, 당해 분야 숙련가에게는 변경이 본원에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 방법 단계들의 순서에 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 적용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련이 있는 소정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있으면서 본원에 기술된 제제 대신에 대체될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 당해 분야 숙련가에게 명백한 이러한 모든 유사 대체 및 변형은 첨부되는 청구범위에서 정의하는 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참조문헌
다음 참고문헌은 예시적 절차를 제공하거나 또는 본원에 제시된 것에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 인용에 의해 포함된다.
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Claims (65)

  1. (a) 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)를 제공하는 단계(여기서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자는 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 포함한다); 및
    (b) 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic precursor cell)를 생산하는 단계
    를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 시험관내(in vitro) 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 골수 및 림프구 계통으로 분화할 수 있는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, (c) 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 발현되지 않도록 하는 조건 하에서 상기 HPC를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발현 작제물이 트랜스포손(transposon)- 또는 에피솜(episome)-기반 발현 작제물인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 단일 프로모터의 제어 하에 있는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단일 프로모터가 유도가능한 프로모터인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유도가능한 프로모터가 테트라사이클린-유도가능한 프로모터인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양이 약 4일 내지 약 10일인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell) 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC: induced poluripotent stem cell)인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 사람인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 하나 이상의 조혈 전구체 마커를 발현하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조혈 전구체 마커가 CD43, CD33, CD34, CD45, CD235a 및 CD41로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 전구체 마커가 CD43, CD45 및 CD34로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 미성숙 HPC인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 미성숙 HPC가 CD34 및 CD43을 발현하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 HPC의 적어도 50%가 미성숙 HPC인, 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 HPC의 적어도 70%가 미성숙 HPC인, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 HPC의 적어도 90%가 미성숙 HPC인, 방법.
  19. 제3항에 있어서, 상기 HPC가 기질 세포의 부재 하에 배양되는, 방법.
  20. 제3항에 있어서, 상기 HPC가 무혈청 또는 제한 배지에서 배양되는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 HPC가 혈장 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 비만 세포, 거핵구, 적혈구, 과립구, 림프구, 단핵구, 백혈구 및 혈소판으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 세포 유형으로 분화될 수 있는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 림프구가 B 림프구 및/또는 T 림프구인, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 ETS/ERG 유전자가 ERG(v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 동족체), ETV2(ets 변이체 2), FLI-1(프리엔드(Friend) 백혈병 바이러스 통합 1), ELK3(ETS 도메인-함유 단백질), ETS1(C-ets-1) 또는 ETS2(C-ets-2)인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 ETS/ERG 유전자가 ERG 또는 ETV2인, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ERG, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ETV2, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 표적화 서열에 융합되어 있는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표적화 서열이 NUP98 또는 이의 호메오도메인(homeodomain)인, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함하는, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함하는, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 PSC가 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 추가의 발현 작제물을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, (c) 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 HPC를 배양함으로써 포유동물에서 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667 및 ZNF682로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 및 MSI2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 및 RBAK로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자의 발현이 상기 HPC에서 항상성인, 방법.
  38. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자의 발현이 상기 만능 줄기 세포에서 본질적으로 침묵화되는(silenced), 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 표적화 서열에 융합되어 있는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표적화 서열이 NUP98 또는 이의 호메오도메인인, 방법.
  41. (a) 단일 프로모터의 제어 하에 ERG, GATA2 및 HOXA9를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계; 및
    (b) ERG, GATA2 및 HOXA9가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 조혈 전구 세포(HPC)를 생산하는 단계
    를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위한 시험관 내 방법.
  42. (a) 단일 프로모터의 제어 하에 ERG, GATA2 및 HOXA9를 암호화하는 발현 작제물 및 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 적어도 제2 발현 작제물을 포함하는 만능 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계; 및
    (b) ERG, GATA2 및 HOXA9가 발현되고 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 만능 줄기 세포를 배양함으로써 포유동물에서 장기간 생착이 가능한 조혈 줄기 세포(HSC)를 생산하는 단계
    를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포(HSC)를 생산하기 위한 시험관내 방법.
  43. 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물로서, 상기 프로그래밍 유전자는 ETS/ERG 유전자, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 조혈 전구체 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 작제물이 트랜스포손- 또는 에피솜-기반 발현 작제물인, 발현 작제물.
  45. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 단일 프로모터의 제어 하에 있는, 발현 작제물.
  46. 제43항에 있어서, 상기 단일 프로모터가 유도가능한 프로모터인, 발현 작제물.
  47. 제43항에 있어서, 상기 유도가능한 프로모터가 테트라사이클린-유도가능한 프로모터인, 발현 작제물.
  48. 제43항에 있어서, 상기 ETS/ERG 유전자가 ERG(v-ets 적혈모구증 바이러스 E26 종양유전자 동족체), ETV2(ets 변이체 2), FLI-1(프리엔드 백혈병 바이러스 통합 1), ELK3(ETS 도메인-함유 단백질), ETS1(C-ets-1) 또는 ETS2(C-ets-2)인, 발현 작제물.
  49. 제43항에 있어서, 상기 ETS/ERG 유전자가 ERG 또는 ETV2인, 발현 작제물.
  50. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ERG, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 발현 작제물.
  51. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ETV2, GATA2 및 HOXA9를 포함하는, 발현 작제물.
  52. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 표적 서열에 융합되어 있는, 발현 작제물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 표적화 서열이 NUP98 또는 이의 호메오도메인인, 발현 작제물.
  54. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ERG, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함하는, 발현 작제물.
  55. 제43항에 있어서, 상기 조혈 전구체 프로그래밍 유전자가 ETV2, GATA2, HOXA9, NUP98-HOXA9 및 NUP98-HOXA10을 포함하는, 발현 작제물.
  56. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 세포.
  57. 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자를 암호화하는 발현 작제물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 BCL2, BEND4, BMI1, CIITA, EGR3, ETV6, EZH1, EZH2, FOXL1, HIF3A, HLF, HMGA2, HOXA9, HOXA10, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXB3, HOXB6, HSF5, KLF2, KLF4, MECOM, MEIS1, MIR29A, MIR29B1, MSI2, MYB, MYCN, NKX2-3, NR4A2, PEG3, PRDM12, PRDM16, RBAK, RUNX1, RUNX3, SETBP1, SOX17, SOX8, TFEC, ZBTB14, ZBTB20, ZMAT1, ZNF131, ZNF134, ZNF136, ZNF256, ZNF26, ZNF300, ZNF337, ZNF350, ZNF414, ZNF662, ZNF667 및 ZNF682로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 발현 작제물.
  59. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350, RBAK, HOXA6, HOXB6, HOXA7, ZNF300, ZNF682 및 MSI2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 발현 작제물.
  60. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 HMGA2, MYCN, NR4A2, SOX17, TFEC, MEIS1, HOXA4, ZNF414, KLF4, ZNF131, BCL2, ETV6, ZNF350 및 RBAK로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 발현 작제물.
  61. 제57항에 있어서, 상기 하나 이상의 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 있는, 발현 작제물.
  62. 제57항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 프로그래밍 유전자가 표적화 서열에 융합되어 있는, 발현 작제물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 표적화 서열이 NUP98 또는 이의 호메오도메인인, 발현 작제물.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 세포.
  65. 포유동물의 골수에서 생착하여 분화된 사람 혈액 세포를 생산할 수 있는, 사람 만능 줄기 세포로부터 시험관내에서 분화된, 조혈 줄기 세포.
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