MX2010012088A - Celulas que forman colonias de hemangiomas y celulas de hemangioma sin injertar. - Google Patents

Celulas que forman colonias de hemangiomas y celulas de hemangioma sin injertar.

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Abstract

Métodos para generar y expandir células humanas formadoras de 'hemangiocolonias y hemangiocélulas de no injerto in vitro, y métodos para expandir y usar dichas células. Los métodos permiten la producción de grandes números de células formadoras de hemangiocolonias, hemangiocélulas de no injerto así como células derivadas, tales como células hematopoyéticas y endoteliales. Las células obtenidas por los métodos divulgados pueden usarse para una variedad de aplicaciones de investigación, clínicas y terapéuticas. Las hemangiocélulas humanas de no injerto son una nueva población células progenitora que está relacionada, pero es distinta de, con hemangioblastos y células humanas formadoras de hemangiocolonias. La invención también proporciona composiciones, preparaciones y soluciones que comprenden células formadoras de hemangiocolonias, hemangiocélulas de no injerto o células diferenciadas de las mismas. Las composiciones, preparaciones y soluciones incluyen preparaciones criopreservadas y preparaciones substancialmente purificadas, así como composiciones mezcladas formuladas en combinación con tipos de células progenitoras de hemangioblastos que pueden injertarse en la médula ósea.

Description

CÉLULAS QUE FORMAN COLONIAS DE HEMANGIOMAS Y CÉLULAS DE HEMANGIOMA SIN INJERTAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiómas humanos y células de hemangiómas sin injertar.
Particularmente, la invención se refiere a un método para generar y expandir células que forman colonias de hemangiómas humanos in vi tro usando un proceso de dos etapas primero, cultivando células troncales derivadas de embriones humanos en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de células troncales embriónicas en cuerpos embrioides, y segundo, cultivando los cuerpos embrioides en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiómas humanos en el medio que comprende cuerpos embrioides .
La invención también se refiere a un método para generar y expandir células de hemangioma humano sin injertar in vitro.
La invención adicionalmente se refiere a preparaciones de células que forman colonias de hemangiómas humanos y células de hemangiómas sin injertar. ,La invención además se refiere a métodos para diferenciar unidades que forman colonias de hemangiomas humanos y células de hemangiomas sin injertar junto con un linaje hematopoyético o endotelial, asi como también a métodos para preparar parcialmente o completamente tipos de células diferenciadas a partir de células que forman colonias de hemangiomas y células de hemangiomas sin injertar. Células que forman colonias de hemangiomas, células de hemangioma sin injertar, y células diferenciadas a partir de estas, tienen una variedad de usos in vi tro e in vivo. La capacidad para generar células expandidas que forman colonias de hemangiómas humanos y células de hemangiomas sin injertar en tales grandes cantidades in vi tro proporciona por primera vez el potencial para derivar grandes números de tipos de células derivadas de hemangiomas sin injertar y que forman colonias de hemangiomas humanos, tales como células troncales hematopoyéticas humanas, o células endoteliales , células hematopoyéticas diferenciadas, tales como células rojas dé la sangre y plaquetas, que serán útiles en varias aplicaciones terapéuticas. Además, los números expandidos de células .] que forman colonias de hemangiomas humanos y células de hemangiomas sin injertar derivadas por la presente invención, pueden ser utilizados en nuevas estrategias terapéuticas en el tratamiento de trastornos de células endotelialeá y hematopoyéticas o en bancos de sangre.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones aquí están incorporadas por referencia en la misma magnitud como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. La siguiente descripción incluye información que puede ser útil en el entendimiento de la presente invención, no es una admisión de que cualquier información proporcionada aquí sea la técnica anterior o relevante a la invención actualmente reivindicada, o que cualquier publicación específicamente o implícitamente referenciada sea la técnica anterior.
Células troncales hematopoyéti.cas (HSC) son capaces de auto-renovarse y son capaces de dar origen a todos los linajes de células de la sangre. Estas células, las cuales residen en la médula ósea, forman la base del sistema hematopoyético adulto. El transplante de estas células representa la terapia a base de células más común aplicada hoy en día en la clínica.
El transplante de HSC se usa para el tratamiento de pacientes con leucemia crónica o aguda, anemia aplásica y varios síndromes de inmunodeficiencia, así como también varios trastornos auto-inmunes y males no hematológicos . Para pacientes con males hematológicos , el transplante de HSC puede rescatar a pacientes de aplasia inducida por tratamiento, lo cual puede ocurrir después de la quimioterapia y/o radioterapia de altas dosis.
Debido a la utilidad clínica generalizada de transplante de HSC, las tres fuentes principales de HSC (médula ósea humana, sangre periférica movilizada y sangre de cordón umbilical) están limitadas ya que dos tercios de los pacientes en necesidad de transplante somático de HSC carecen de donadores bien compatibles. Por ejemplo, para cualquier paciente dado, existe solamente un 25% de oportunidad de que un hermano sea un compatible idéntico en antígeno de leucocito humano (HLA) .
Los HLA son proteínas en una superficie celular que ayudan al sistema inmune a identificar las células comó ya sea sí mismas (que pertenecen al cuerpo) o no las mismas (extrañas o del exterior del cuerpo) . Las proteínas del HLA son codificadas por agrupaciones de genes que forman una región localizada en el cromosoma humano 6 conocido como el Complejo Mayor de Histocompatibilidad, o MHC, en reconocimiento del papel importante de las proteínas codificadas por el loci del MHC en el rechazo al injerto. Por consiguiente, las proteínas codificadas por el loci del MHC también son referidas como proteínas del MHC. Aunque la compatibilidad de las moléculas del MHC de un transplante a aquellas del recipiente significantemente mejora la tasa, de éxito del transplante clínico, no previene el rechazo, aun cuando el transplante es entre los hermanos idénticos de HLA.
Tal rechace puede ser activado por diferencias entre los antígenos de Menor Histocompatibilidád. Estos antígenos polimórficos son usualmente "péptidos no autónomos unidos a moléculas del MHC en las células del tejido del transplante, y diferencias entre antígenos de Menor Histocompatibilidád a menudo causarán que el sistema inmune de un recipiente al transplante eventualmente rechace un transplante, aún en donde existe una compatibilidad entre los antígenos del MHC, a menos que se usen fármacos inmunosupresores .
Existen tres tipos cada uno de HLA clase I y clase II. Una persona (típicamente un hermano) quien tiene un HLA clase I y clase II es llamado un dolador relacionado. La supervivencia incrementada se asocia con una compatibilidad entre el recipiente y donador HLA-A, HLA-B , HLA-C clase I y HLA-DRBl y HLA-DQBl clase II (Morishima, et al., 2002 Blood (99) :4200-6) . Para pacientes quienes no tienen un donador relacionado, compatible, una búsqueda a través de bancos de donadores puede proporcionar a una persona con tipos de HLS compatibles. Sin embargo, el número de personas en necesidad de un transplante de tejido o célula, tal como un transplante de HSC, es bastante mayor que el suministro de células y tejidos disponibles para transplante. Bajo estas circunstancias, no es sorprendente que obtener un buen donador entre las proteínas MHC de un recipiente y aquellos del transplante es frecuentemente imposible. Por lo tanto, muchos recipientes de transplante deben esperar para que un transplante compatible con MHC llegue a estar disponible o aceptar un transplante no es compatible con MHC y soporta dosis superiores de fármacos inmunosupresivos y todavía riesgo de1 rechazo. La capacidad para generar y manipular HSC, y/o inducir tolerancia en recipientes de transplantes, por lo tanto, beneficiará mayormente al tratamiento y manejo de enfermedades humanas .
Basados en el trabajo en el embrión de ave, y subsecuentemente en ranas y mamíferos, se ha demostrado que los programas en desarrollo de sangre y endotelio están estrechamente ligados. Por ejemplo, células endoteliales y hematopoyéticas aparecen concurrentemente y en proximidad cercana en islas de sangre de la yema de huevo. Las islas de sangre de la yema de huevo se derivan de agregados de células mesodérmicas que colonizan la yema de huevo. El centró de estos agregados da origen a las células embriónicas mientras que la población periférica se diferencia en células endoteliales las cuales forman la vasculatura que circunda las células internas de la sangre. Estas observaciones soportan la noción de que células endoteliales y hematopoyéticas tienen un precursor común.
Adicionalmente, en embriones de ratón y pez cebra, linajes tanto endoteliales como hematopoyéticos portan la expresión de ciertos genes, tales como Flkl, Fltl , Tiel, Tie2, CD34, Sel, y Runxl (Fina et al. 1990 Blood (75): 2417-2426; Millauer et al. 1993 Cell (72): 835-846; Yamaguchi et al. 1993 Development (118): 489-498; Anagnostou et al. 1994 PNAS USA (91): 3974-3978; allianpur et al. 1994 Blood (83): 1200-12081; Young et al. 1995 Blood (85): 96-105, Asahara et al. 1997 Science (275): 964-967; Kabrun et al. 1997 Development (124) : 2039-2048) . Del mismo modo ciertas mutaciones de gen afectan el desarrollo de células tanto endoteliales como hematopoyéticas (Shalaby et al. 1995 Nature (376): 62-66; Robb et al. 1995 PNAS USA (92): 7075-7079; Shivdasani et al. 1995 Nature (373): 432-434; Stainier et al. 1995 Development (121): 3141-3150; Bollerot et al. 2005 APMIS (113): 790-803). Además, la supresión de ya sea Flkl o Fltl, los cuales son ambos receptores para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , resulta en un rompimiento del desarrollo hematopoyético y endotelial en el embrión de ratón.
La generación de hemangioblastos de ratón a partir de células troncales embriónicas de ratón in vitro se ha reportado en la literatura (Choi et al. 1998 Development 125: 727- 732) . Además, células precursoras humanas capaces de, dar origen a células tanto endoteliales como hematopoyéticas se han derivado de células ES humanas (Wang et al. 2004 I munity (21): 31-41 y Wang et al. J Exp Med (201): 1603-1614), pero solamente en cantidades menores, cientos de células en lo mejor. Sin embargo, no existe método o condición para la expansión de las células precursoras de hemangioblastos in vi tro.
Debido a la identificación previa de tipos de células capaces de dar origen a células del linaje hematopoyéticas , permanece una necesidad de métodos mejorados para generar grandes números de poblaciones de células progenitoras , así como también tipos de células diferenciadas. La presente invención atiende esta necesidad. Adicionalmente, la presente invención proporciona un nuevo tipo de células progenitoras que no se injertan en la médula ósea cuando se suministran in vivo a un animal inmunodeficiente . Sin embargo, debido a la incapacidad de estas células para injertarse en la médula ósea, las células son capaces de generar células hematopoyéticas diferenciadas, y pueden aún ser capaces de generar otros tipos de células no hematopoyéticas tales como tipos de células endoteliales , músculo esqueleto, y músculo liso.
Existe adicionalmente una necesidad crítica para sangre para transfusión disponible. El Red Cross y otros proveedores de sangre reportan un acortamiento de sangre casi constante. Esto es especialmente cierto para pacientes con tipos de sangre únicos, pacientes quienes son Rh+, o después de accidentes o desastres resultan en casualidades en masa. Adicionalmente, en tiempos de guerra, la milicia tiene una necesidad aguda de sangre disponible para uso en el tratamiento de lesiones traumáticas relacionadas con la guerra. La presente invención proporciona células hematopoyéticas diferenciadas para uso en bancos de sangre y transfusión. Las células y métodos de la presente invención proporcionarán un avance seguro y confiable más allá de la dependencia tradicional en donaciones de sangre, y ayudarán a prevenir acortamientos críticos en sangre disponible.
De este modo, permanece una necesidad de métodos para generar y expandir grandes números de hemangioblastos humanos así como también tipos de células derivadas de hemangioblastos, es decir, células hematopoyéticas y endoteliales , y todas las soluciones/mezclas que contienen tales cantidades de hemangioblastos o tipos de células derivadas . Tales métodos podrían incrementar la disponibilidad de células para transplante así como también tener utilidad en una variedad de otras aplicaciones terapéuticas, tales como en inducción de tolerancia inmunológica .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las siguientes modalidades y aspectos de la misma son descritos e ilustrados en conjunto con composiciones y métodos los cuales están significando ser ejemplares e ilustrativos sin limitaciones en el campo.
Varias modalidades de la presente invención proporcionan los problemas descritos en la sección antecedente anterior proporcionan un método para generar y expandir hemangioblastos humanos o células que forman colonias de hemangiomas in vi tro. La capacidad para expandir hemangioblastos humanos o células que forman colonias de hemangiomas por los nuevos métodos descritos en la presente permite la producción de células que pueden ser usadas en varias aplicaciones terapéuticas. Adicionalmente, la presente invención proporciona métodos para generar células de linaje que forman colonias de hemangiomas o hemangioblastos humanos (es decir, células endoteliales y hematopoyéticas) que pueden ser usadas en aplicaciones terapéuticas. Los métodos de la invención · proporcionan utilidad adicional en que permiten la generación de grandes números de hemangioblastos humanos o células que forman colonias dé hemangiomas asi como también células endoteliales y hematopoyéticas, y células diferenciadas a partir de estas, que pueden ser usadas a escala comercial . Los métodos de la presente invención representan un mejoramiento significante en la generación de hemangioblastos y aunque simplificadas de métodos previos, resultan en un incremento de 8 veces en rendimiento sobre los métodos del documento WO 2007/120811.
La presente invención proporciona un método para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos in vitro, dicho método comprende las etapas de: a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; y (b) agregar al menos dos factores de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides, en donde las células troncales, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) y (b) del método, y en donde al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF.
Esta invención también proporciona un método para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos in vitro, dicho método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos dos factores de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides, (c) los cuerpos embrioides son desagregados en células individuales; y (d) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en dicho cultivo que comprende dichas células individuales, en donde las células troncales, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) -(d) de dicho método, y en donde al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF. En ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d) .
En ciertas modalidades de la invención, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica.
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de. esta invención, el factor de crecimiento es una protéína que comprende una proteína homeobox (homeocaja) , o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas modalidades, la proteína homeobox es una proteína que comprende H0XB4, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. Se contempla que la H0XB4 podría ser H0XB4 de mamífero, que incluye H0XB4 humana y de ratón. La proteína H0XB4 puede ser la proteína H0XB4 de longitud completa. En aún modalidades adicionales, la H0XB4 comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 (Figura 9) o SEC ID NO: 3 (Figura 10) .
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención, el factor de crecimiento que comprende HOXB4 es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteína (PTD) . En aún modalidades adicionales, el PTD y la H0XB4 son conjugados 'vía un enlazador. En aún modalidades adicionales, el PTD es una proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma (que incluye un polipéptido TAT) . En ciertas modalidades, la proteína TAT comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14. En aún modalidades adicionales, el PTD comprende una o más copias de un polipéptido TAT con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14. En ciertas modalidades, el PTD es la SEC ID NO: 15.
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención, el factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor de célula troncal (SCF) , Flt-3L (FL) trom opoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO) . En modalidades adicionales, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o proteína morfogénica ósea (BMP), o ambos, se agregan a la etapa de cultivo (a) dentro de 0-48 horas de cultivar el cultivo celular que comprende las células hES. En todavía otras modalidades adicionales, el factor de célula troncal (SCF), Flt-3L (FL) o trombopoyetina (TPO), o" cualquier combinación de las mismas, se agregan al cultivo celular que comprende células hES dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa de cultivo (a) .
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención, un factor de crecimiento que comprende una proteína H0XB4 , o una variante funcional o fragmento actíivo (o dominio) de la misma, se agrega a la(s) etapa (s) en la cual la proteína se agrega múltiples veces, tal como, por ejemplo, una vez al día o una vez cada tercer día.
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención, el factor de crecimiento que comprende una proteína homeobox (homeocaja) se agrega a la etapa (b) dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) . En ciertas modalidades de los métodos de esta invención, la proteína H0XB4, o variantes funcionales o fragmentos activos de las mismas, se agrega a la etapa (b) dentro de 48-72 hqras a partir del inicio de la etapa (a) .
En ciertas modalidades, los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención además comprenden la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a la etapa (b) .
En ciertas modalidades, los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención además comprenden la(s) etapa (s) de purificar y/o aislar las células que forman colonias de hemangiomas humanos. Las células que forman colonias de hemangiomas pueden ser purificadas usando cromatografía en columna de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-CD7. Las células que forman colonias de hemangiomas pueden ser aisladas por tamaño y/o por morfología.
En ciertas modalidades de los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención, el cultivo celular que comprende células troncales derivadas de embriones humanos se derivan de una biblioteca de células troncales embrionicas humanas, en dónde la biblioteca de células troncales embrionicas humanas comprende células troncales, cada una de las cuales es hemicigota u homocigota por al menos un alelo de MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células troncales es hemicigoto u homocigoto para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca, en modalidades adicionales, la biblioteca de células troncales embriónicas humanas comprende células troncales que son hemicigotas u homocigotás por todos los alelos de MHC presentes en una población humana. Estos métodos generan una biblioteca de células humanas que forman colonias de hemangiomas, cada una de las cuales es hemicigota u homocigota por al menos un alelo de MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células troncales es hemicigoto u homocigoto para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca. En modalidades adicionales, estos métodos generan una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas humanos que son hemicigotos u homocigotos por todos los alelos de MHC presentes en una población humana. De éste modo, esta invención también proporciona una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por tales métodos. Esta biblioteca podría ser usada como sigue.
Esta invención proporciona un método para tratar un paciente humano en necesidad de tratamiento que involucra administrar células troncales hematopoyéticas humanas o células endoteliales humanas al paciente, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente; (b) identificar proteínas de MHC expresadas en la superficie de las células del paciente; (c) proporcionar una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas humanos descritas en el párrafo precedente; (d) seleccionar las células que forman colonias de hemangiomas humanos de la biblioteca que (Son compatibles con las proteínas de MHC del paciente en las células del paciente; (e) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas humanos identificadas en la etapa (d) en células troncales hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas, dependiendo de la necesidad; (f) administrar las células troncales hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas a partir de la etapa (e) al paciente. Éste método se puede realizar en un centro regional, tal como un hospital o un centro médico, o cualquier otra instalación adecuada.
En ciertas modalidades, los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención además comprenden la etapa de hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas.
En ciertas modalidades, los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de esta invención además comprenden la etapa de hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas. En modalidades adicionales, . ; la condición adecuada para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas comprende hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos en placas de cultivo recubiertas con fibronectina .
En ciertas modalidades de esta invención, los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos resultan en al menos 10,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 50,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 100,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 500,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 1 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 2 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 3 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos o al menos 4 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos . Estos métodos resultan en soluciones celulares que pueden comprender entre 10,000 hasta 4 millones de células que forman colonias de hemangiomas humanos.
De este modo, esta invención también proporciona una solución de células que forman colonias de hemangiomas humanos (las cuales podrían hacerse crecer en medio libre de suero) que comprende al menos 10,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 50,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 100,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 500,000 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 1 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 2 X 106 células que forman colonias, de hemangiomas humanos, al menos 3 X 10p células que forman colonias de hemangiomas humanos o al menos 4 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos. Estas soluciones podrían ser inyectables a un sujeto. Estas soluciones podrían ser adecuadas para congelamiento. Estas soluciones podrían ser libres de suero. Las células que forman colonias de hemangiomas humanos en estas soluciones son capaces de diferenciar en al menos células endoteliales y hematopoyéticas pero tienen mayor potencial de desarrollo para diferenciarse en otros tipos de células. Esta invención también proporciona un uso de estas soluciones para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad que se puede tratar por la administración de células que forman colonias de hemangiornas , células hematopoyéticas o células endoteliales .
Esta invención también proporciona un método para producir una solución de células que forman colonias de hemangiomas humanos adecuadas para inyección en un paciente que comprende las etapas de aislar la solución de células descrita en el párrafo precedente y colocar las células en una solución adecuada para inyección en un paciente. Esta invención también proporciona un método para producir una solución de células que forman colonias de hemangiomas humanos adecuadas para congelamiento que comprende las etapas de aislar la solución de células descritas en el párrafo precedente y colocar las células en una solución adecuada para congelamiento.
Esta invención también proporciona un método para administrar células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas y expandidas por un método de esta invención; (c) diferenciar dichas células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas de todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
Esta invención también proporciona un método para administrar · células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangipmas humanos en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiómas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o . todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente. Esta invención también proporciona un método para administrar células endoteliales humanas en un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiómas humanos generadas y expandidas por un método de esta invención; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiómas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente.
Esta invención también proporciona un método para administrar células endoteliales humanas en un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiómas humanos en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar células que forman colonias de hemangiómas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente. En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
Esta invención también proporciona un método para tratar un trastorno de célula endotelial en un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas y expandidas por un método descrito anteriormente; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente.
Esta invención también proporciona un método para tratar un trastorno de célula endotelial en un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de; (a) seleccionar un paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente. En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células . El trastorno de célula endotelial a ser tratado por estos métodos incluye infarto al miocardio, apoplejía, aterosclerosis e isquemia. La isquemia podría ocurrir en el cerebro, extremidades, corazón, pulmones, piel y ojos.
Esta invención proporciona un método para producir células troncales hematopoyéticas humanas in vi tro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas y expandidas por un método de esta invención; y (b) hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas.
Esta invención también proporciona un método para producir células endoteliales humanas in vitro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas y expandidas por un método de esta invención; y (b) hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas. Esta invención también proporciona un método para expandir células que forman* colonias de hemangiomas que comprende hacer crecer células de mamífero que forman colonias de hemangiomas en medio libre de suero en la presencia de una proteína que comprende una proteína homeobox (homeocaja) (tal como H0XB4) o un equivalente funcional o un fragmento activo de la misma en una cantidad suficiente para soportar la proliferación de células de hemangioblastos . Las células que forman colonias de hemangiomas a ser expandidas pueden ser enriquecidas, purificadas o aisladas de sangre de cordón umbilical, sangre periférica o médula ósea. Las células que forman colonias de hemangiomas pueden ser células que forman colonias de hemangiomas humanos. Éste método puede resultar en soluciones que comprenden células que forman colonias de hemangiomas de entre 10,000 hasta 4 X 106 células que forman colonias de hemangiomas, o más. La proteína HOXB4 usada para este método puede .ser cualesquiera que sean adecuadas para uso por los métodos para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos de ésta invención.
La presente invención también proporciona métodos para inducir tolerancia inmunológica usando las células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas y expandidas o expandidas de conformidad con los métodos de esta invención. Las células que forman colonias de hemangiomas humanos tolerantes se eligen por portar marcadores de histocompatibilidad con un aloinjerto, y pueden ser administradas a un recipiente humano antes o concurrentemente con el aloinjerto o tratamiento celular que regenera una función celular necesaria por el paciente. La tolerancia inmune resultante subsecuentemente reduce el riesgo de rechazo agudo o crónico de aloinjerto o tratamiento celular.
Los grandes números de células que forman colonias de hemangiomas generadas por los métodos descritos en la presente permiten protocolos de tolerancia en los cuales los tratamientos de pre-acondicionamiento tóxico pueden ser eliminados. Las células donadoras que forman colonias de hemangiomas humanos se pueden administrar a un recipiente humano previo al implante de un injerto o implante de un órgano, tejido, o células que son compatibles con respecto a células donadoras que forman colonias de hemangiomas. Las células que forman colonias de hemangiomas humanos e injertos se pueden obtener a partir del mismo donador. El injerto puede ser derivado de diferentes células donadoras diferenciadas células que forman colonias de hemangiomas humanos. Las células que forman colonias de hemangiomas humanos e injertos pueden alternativamente obtenerse a partir de diferentes donadores en donde los donadores son compatibles . Las células que forman colonias de hemangiomas humanos pueden ser administradas a recipientes humanos para inducir tolerancia en recipientes en necesidad del mismo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a un método para inducir tolerancia en un recipiente humano a un aloinjerto donador, en donde el método comprende las etapas de (a) administrar al recipiente un agente que inhibe la co-estimulación de células-T; (b) introducir en el recipiente células que forman colonias de hemangiomas humanos que son generadas y expandidas, o expandidas, de conformidad con los métodos descritos en la presente; y (c) implantar el aloinjerto en el recipiente. Las células que forman colonias-de hemangiomas humanos (células donadoras) promueven la aceptación del aloinjerto por el recipiente. En ciertas modalidades, un agente que inhibe la co-estimulación de células-T es un agente que. inhibe o bloquea la interacción coestimuladora de CD40-ligando-CD40. El método puede además comprenden administrar un agente que inhibe la interacción CD28-B7. El método puede o no puede comprender irradiación tímica y/o depleción o inactivación de células-T. El método mencionado anteriormente también puede producir quimerismo mezclado en la ausencia de espacio hematopoyético creado por irradiación del cuerpo completo.
La invención también proporciona un método para promover la tolerancia en un recipiente humano a un aloinjerto donador, en donde el método comprende las etapas de (a) crear espacio tímico en el recipiente; (b) agotamiento o inactivación de células-T reactivas del donador eri el recipiente; (c) introducir células donadoras que forman colonias de hemangiomas humanos del donador o que son compatibles al donador en el recipiente; y (d) implantar el aloinjerto en el recipiente, en donde las células donadoras que forman colonias de hemangiomas inducen tolerancia al aloinjerto. En ciertas modalidades, el método no comprende irradiación que crea espacio hematopoyético . El método puede comprender crear espacio timico administrando al recipiente al menos un tratamiento seleccionado de entre irradiación tímica (la cual puede ser fraccionada) , esteroides, corticoesteroides, un inmunosupresivo o brequinar o fármaco .
La invención también proporciona métodos para generar células adecuadas para uso en transfusión sanguínea. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para generar células rojas de la sangre que pueden ser usadas en transfusión. Como tal, la presente invención proporciona una solución para ayudar a aliviar el acortamiento crónico de sangre disponible para donación.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células que forman colonias de hemangiomas humanos in vitro, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar células que forman colonias de hemangiomas humanos; y (b) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas en células hematopoyéticas diferenciadas .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para realizar transfusiones . de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitró a partir de células que forman colonias de hemangiomas humarlos, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar células que forman colonias de hemangiomas humanos; (b) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas .
En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas son recuperadas a partir de cultivos congelados.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitró a partir de células que forman colonias de hemangiomas humanos, dicho método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (d) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, dichas células troncales pluripotentes, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de la etapa (a) de dicho método. En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitró a partir de células que forman colonias de hemangiomas humanos, dicho método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides , en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas en células hematopoyé icas diferenciadas; y (d) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, dichas células troncales, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) y (b) del método.
En ciertas modalidades de la invención, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica.
En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas son recuperadas a partir de cultivos congelados .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vatro a partir de células que forman colonias de hemangiomas humanos, dicho método comprende las etapas de; (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides; (c) desagregar los cuerpos embrioides en células .individuales; (d) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende dichas células individuales, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en dicho cultivo que comprende dichas células individuales; (e) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (0 realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, dichas células troncales, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de la etapas {a) -(d) de dicho método.
En ciertas modalidades de la invención, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica.
En ciertas modalidades, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox (homeoca a) , o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas modalidades, la proteína homeobox comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o una variante activa de la misma.
En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas diferenciadas son producidas como un tipo de célula individual. En ciertas modalidades, el tipo de célula individual se selecciona a partir de: células rojas de la sangre, plaquetas, o fagocitos. En ciertas modalidades, el fagocito se selecciona a partir de: granulocitos : neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos o monocitos. En ciertas modalidades, las células rojas de la sangre expresan hemoglobina F. En ciertas modalidades, el tipo de células individuales son mezcladas a aproximadamente igual la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentran en la sangre, en donde la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentran en la sangre es 96% de células rojas de la sangre, 1% de plaquetas, y 3% de fagocitos .
En ciertas modalidades, tipos de células hematopoyéticas diferenciadas múltiples son producidas en la misma etapa. En ciertas modalidades, los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas múltiples se seleccionan a partir de: células rojas de la sangre, plaquetas, o fagocitos. En ciertas modalidades, el fagocito se selecciona a partir de: granulocitos: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos o monocitos. En ciertas modalidades, las células rojas de la sangre expresan hemoglobina F. En ciertas modalidades, los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas múltiples son producidas en una proporción aproximadamente igual a la proporción de tipos de células hematopoyéticas diferenciadas encontradas en la sangre, en donde la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentran en la sangre es 96% de células rojas de la sangre, 1% de plaquetas, y 3% de fagocitos.
En ciertas modalidades, se agrega plasma a las células hematopoyéticas diferenciadas antes de la transfusión.
En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas son igualadas a un paciente ¿ara asegurar que las células hematopoyéticas diferenciadas del tipo de sangre propio del paciente sean producidas. En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas son negativas para factores antigénicos A, B, Rh, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas diferenciadas son células rojas de la sangre, y en donde una etapa de diferenciar las células rojas de la sangre incluye eritropoyetina (EPO) .
La invención también proporciona una célula que forma colonias de hemangioma humano, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales o hematopoyéticas, en donde la célula que forma colonias de hemangiomas humanos es poco adherida a otras células que forman colonias de hemangiomas humanos.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una célula que forma colonias de hemangioma humano, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas , en donde la célula que forma colonias de hemangiomas humanos es poco adherida a otras células que forman colonias de hemangiomas humanos .
En ciertas modalidades, la invención proporciona una célula que forma colonias de hemangioma humano, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde la célula que forma colonias de hemangiomas humanos es poco adherida a otras células que forman colonias de hemangiomas humanos, y en donde la célula que forma colonias de hemangiomas humanos no expresa la proteína CD34.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una célula que forma colonias de hemangioma humano, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde la célula que forma colonias de hemangiomas humanos no expresa alguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR, y CD133.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales o hematopoyéticas , en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende una población sustancialménte purificada de células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí, y en donde las células que forman colonias de hemangiomas no expresan, la proteína CD34.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos diferenciadas a partir de células troncales pluripotentes , en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí.
En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende al menos 1 x 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos. En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende al menos 5 x 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos .
En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente es una línea de cé^la troncal embriónica. En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente se selecciona a partir de un embrión, un blastómero, un blastocisto, o una masa de células internas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales o hematopoyéticas , en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí .
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde las células que forman colonias de hemangiomas son poco adheridas entre sí.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células endoteliales y hematopoyéticas, en donde las células que forman colonias de hemangiomas no expresan alguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR, y CD133.
En ciertas modalidades, la preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 5 x 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos .
En ciertas modalidades, las preparaciones farmacéuticas que comprenden células que forman colonias de hemangiomas son diferenciadas a partir de células troncales pluripotentes . En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica. En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente se selecciona a partir de un embrión, un blastómero, un blastocisto, o' una masa de células internas .
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación criopreservada de las células que forman colonias de hemangiomas descritos en cualquiera de los párrafos precedentes .
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación criopreservada de al menos lxlO6 células que forman colonias de hemangiomas humanos, en donde las células que forman colonias de hemangiomas no expresan alguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR, y CD133.
En ciertas modalidades, la preparación criopreservada comprende al menos 5x1O6 células que forman colonias de hemangiomas humanos .
En ciertas modalidades, la preparación criopreservada que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos no expresan la proteína CD34. En ciertas modalidades, la preparación criopreservada que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos no expresan proteínas CD34, CD31, CD133 y KDR. En ciertas modalidades, la preparación criopreservada que comprende células que forman colonias de hemangiomas humanos expresa proteínas LM02 y GATA2.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo que comprende una célula hematopóyética diferenciada a partir de las células que forman colonias de hemangiomas como se describe anteriormente. En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo que comprende una célula endotelial diferenciada a partir de las células que forman colonias de hemangiomas como se describe anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo que comprende una célula del músculo liso diferenciada a partir de las células que forman colonias dé hemangiomas como se describe anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo que comprende un cardiomiocito diferenciado a partir de las células que forman colonias de hemangiomas como se describe anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención se proporciona para el uso de las células que forman colonias de hemangiomas humanos como se describe anteriormente en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo.
En ciertas modalidades, la invención proporciona el uso del cultivo celular como se describe anteriormente en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo.
En ciertas modalidades, la invención proporciona el uso de la preparación farmacéutica como se describe anteriormente en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo.
En ciertas modalidades, la invención proporciona células que forman colonias de hemangiomas producidas por métodos como se describen anteriormente .
En ciertas modalidades, la invención proporciona células troncales hematopoyéticas humanas producidas por métodos como se describen anteriormente. En ciertas modalidades, la invención proporciona células endoteliales humanas producidas por métodos descritos anteriormente.
Otras modalidades de la presente invención proporcionan métodos para elaborar y usar un nuevo tipo de célula relacionado con, pero distinto de, células que forman colonias de hemangiomas. La presente invención también proporciona composiciones, soluciones, y preparaciones, que incluyen preparaciones criopreservadas , que comprenden este nuevo tipo de célula. La presente invención además proporciona usos terapéuticos in vitro e in vivo de estas células, así como también métodos para producir uno o más tipos de células diferenciadas que pueden las mismas ser usadas in vitro o in vivo.
En ciertas modalidades, esta invención proporciona una célula de hemangioma humano sin injertar, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas , en donde la célula de hemangioma no tiene la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
En ciertas modalidades, el hospedero es un mamífero. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano.
En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar expresa algunas pero no todas las proteínas las cuales caracterizan células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar tiene una o más características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en ' un hospedero. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar es poco adherida a otras células de hemangiomas .
En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar expresa proteínas LIMÓ2 y GATA2.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende una población sustancialmente purificada de células de hemangioma humano sin injertar, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas , en donde las células de hemangioma no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende células de hemangioma humano sin injertar diferenciada a partir de células derivadas de embriones, en donde las células de hemangioma sin injertar pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, y en donde las células de hemangioma no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende células de hemangioma sin injertar que expresan algunas pero no todas las proteínas las cuales caracterizan células que forman colonias de hemangiomas humanos qüe tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende células de hemangioma sin injertar que tienen uiía o más características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende células de hemangioma sin injertar que son poco adheridas a otras células de hemangiomas .
En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende células de hemangioma sin injertar que no expresan una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende células de hemangioma sin injertar que expresan proteínas LM02 y GATA2.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende una célula hematopoyética diferenciada a partir de las células de hemangioma sin injertar de la invención.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una solución de human células de hemangioma sin injertar, que comprende al menos 1 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la solución comprende al menos 2 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la solución comprende al menos 3 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la solución comprende al menos 4 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades ¡ la solución comprende células de hemangioma humano sin injertar que pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas , y en donde las células de hemangioma sin injertar no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la solución comprende células de hemangioma humano sin injertar que expresan algunas pero no todas las proteínas las cuales caracterizan células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la solución comprende células de hemangioma humano sin injertar que tienen una o más características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la solución comprende células de hemangioma humano sin injertar que son poco adheridas a otras células de hemangiomas.
En ciertas modalidades, la solución comprende células de hemangiomas sin injertar que no expresan una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133, En ciertas modalidades, la solución comprende células de hemangioma sin injertar que expresan proteínas LM02 y GATA2.
En ciertas modalidades, la solución es inyectable a un sujeto, en ciertas modalidades, la solución es adecuada para congelamiento. En ciertas modalidades, la solución se usa para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad que se puede tratar por la administración de células de hemangioma sin injertar o células hematopoyéticas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende una población sustancialmente purificada de células de hemangioma humano sin injertar, en la cual la célula puede diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde la célula de hemangioma no tiene la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar expresa algunas pero no todas las proteínas las cuales caracterizan células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma sin injertar tiene una o más de las características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma es poco adherida a otras células de hemangiomas. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma humano no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas modalidades, la célula de hemangioma humano expresa proteínas LM02 y GATA2 , En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 1 x 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 5 x 106 células de hemangioma humano sin injertar.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una preparación criopreservada de las células de hemangioma humano sin injertar de conformidad con la invención. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 1 x 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 2 x 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 3 x 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 4 x 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la preparación comprende al menos 5 x 106 células de hemangioma humano sin injertar.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para generar y expandir células de hemangioma humano sin injertar in vi tro, dicho método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embrión humano en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; y (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando' el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangiorna humano sin injertar en el cultivo de cuerpos embrioides , en donde los cuerpos embrioides son cultivados por 10-13 días, y en donde las células derivadas de embriones, cuerpos embrioides y células de hemangiomas sin injertar están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) y (b) del método.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para generar y expandir células de hemangioma humano sin in ertar in vi tro, el método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embrión humano en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangioma humano sin injertar en el cultivo de cuerpos embrioides; (c) desagregar los cuerpos embrioides en células individuales; y (d) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende las células individuales y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangioma humano sin injertar en el cultivo que comprende las células individuales, en donde el cultivó de células individuales es cultivado por 10-13 días, y en donde las células derivadas de embriones, cuerpos embrioides y células de hemangioma sin injertar están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) -(d) de dicho método .
En ciertas modalidades, la célula derivada de embrión es una célula troncal embriónica.
En ciertas modalidades, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox (homeocaja) o una variante funcional o una variante activa de la misma. En ciertas modalidades, la proteína homeobox comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o una variante activa de la misma. En ciertas modalidades, el factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , proteínas morfogénicas óseas (BMP) , factor de célula troncal (SCF) , Flt-3L (FL) trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO) .
En ciertas modalidades, . el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o proteína morfogénica ósea (BMP) , o ambos, se agregan a la etapa (a) dentro de 0-48 horas de cultivo celular. En ciertas modalidades, el factor de célula troncal (SCF) , FK-3L (FL) o trombopoyetina (TPO) , o cualquier combinación de las mismas, se agregan al cultivo dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) . En ciertas modalidades, el factor de crecimiento se agrega a la etapa (b) dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a). :! En ciertas modalidades, el método además comprende agregar eritropoyetina (EPO) a la etapa (b) . En ciertas modalidades, el método además comprende agregar eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d) .
En ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de purificar las células de hemangioma humano sin injertar, del cultivo. En ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de aislar las células de hemangioma humano sin injertar del cultivo.
En ciertas modalidades, el factor de crecimiento es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio: de transduccion de proteína (PTD) . En ciertas modalidades el PTD y HOXB4 son conjugados vía un enlazador. En ciertas modalidades, el dominio de transduccion de proteína (PTD) es una proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas modalidades, la HOXB4 es HOXB4 de mamífero. En ciertas modalidades, la H0XB4 de mamífero es H0XB4 humana o de ratón. En ciertas modalidades, la HOXB4 comprende una proteína de longitud completa.
En ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de cultivar las células de hemangioma sin injertar bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células de hemangioma sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas.
En ciertas modalidades, el cultivo comprendé al menos 1 X 106 células de hemangioma humano sin injertar;. En ciertas modalidades, el cultivo comprende al menos 2 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, el cultivo comprende al menos 3 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades; el cultivo comprende al menos 4 X 106 células de hemangioma humano sin injertar.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para producir células troncales hematopoyéticas humanas in vitro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; y (b) hacer crecer a las células de hemangioma humano sin injertar bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para administrar células de hemangioma humano sin injertar a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; (c) administrar algunas o todas las células de hemangioma humano sin injertar al paciente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para administrar células de hemangioma humano sin injertar a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,000 células; : (c) administrar algunas o todas las células que forman colonias de hemangiomas humanos al paciente. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para administrar células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para administrar células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para tratar un trastorno de célula troncal hematopoyética en un paciente en necesidad del mismo, que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para tratar un trastorno de célula troncal hematopoyética en un paciente en necesidad del mismo, : que comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente ¡ en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,:000 células; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar están en 'una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células de hemangioma sin injertar in vitro, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertar; y (b) diferenciar las céliilas de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células de hemangioma humano sin injertar, el método comprende ;las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano1 sin injertar; (b) diferenciar las células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células de hemangioma sin injertar in vitro, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar células; de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; y (b) diferenciar las células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células de hemangioma humano sin injertar, dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por los métodos de esta invención; (b) diferenciar las células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, la invención proporciona células de hemangioma sin injertar producidas por métodos como se describen anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona células troncales hematopoyéticas humanas producidas por métodos como se describen anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona diferenciadas células troncales hematopoyéticas humanas producidas por métodos como se describen anteriormente.
En ciertas modalidades, la invención proporciona células endoteliales humanas producidas por métodos descritos anteriormente.
Otros métodos ilustrativos, composiciones, preparaciones, y características de la invención son descritos en la Solicitud Estadounidense Serie ¡No. 11/787,262, presentada en Abril 13 de 2007, y titulada "Células que forman colonias de hemangiomas " . Las enseñanzas de esta solicitud están por este medio incorporadas ¡por referencia en su totalidad. Se debe notar que ;'los Solicitantes consideran todas las combinaciones operables! de las modalidades ilustrativas descritas por ser materia objeto patentable que incluye combinaciones de la materia objeto descrita en la Solicitud Estadounidense Serie No. 11/787,262.
En ciertas modalidades de cualquier antecedente, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas en la presente tienen una o más de las propiedades de las células descritas en la Solicitud Estadounidense Serie 'No. 11/787,262. En ciertas modalidades de cualquiera de ;los antecedentes, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas en la presente son formuladas como composiciones, preparaciones, preparaciones criopreservadas , o soluciones mezcladas o purificadas como se describe en la Solicitud Estadounidense Serie No. 11/787,262. En ciertas modalidades de cualquiera de los antecedentes, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas en la presente se usan terapéuticamente o en bancos de sangre como se describe en la Solicitud Es adounidense Serie No. 11/787,262. En ciertas modalidades de cualquiera de los antecedentes, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas en la presente se usan para generar parcialmente y/o terminalmente tipos de células diferenciadas para uso in vitro o in vivo como se describe en la Solicitud Estadounidense Serie No. 11/787,262. En ciertas modalidades de cualquiera de los antecedentes, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas en la presente se derivan de células ES, células ED, etc. usando cualquiera de las metodologías descritas en la presente y en la Solicitud Estadounidense Serie No. 11/787,262.
En ciertas modalidades de cualquiera de los antecedentes, las células de hemangioma sin injertar se usan para producir células hematopoyéticas diferenciadas, ¡por ejemplo, diferenciadas células rojas de la sangre.
' En ciertas modalidades de cualquiera de los antecedentes, células que forman colonias de hemangiomas y/o células de hemangioma sin injertar son generadas a partir de material embriónico, tal como células troncales embriónicás o células derivadas de embriones. En ciertas modalidades, las células son generadas a partir de células pluripotentes . Aunque las células troncales embriónicas son ejemplares de células pluripotentes, la invención también contempla que otros tipos de células pluripotentes, que incluyen tipos de células pluripotentes no embriónicas, pueden ser usados para generar células que forman colonias de hemangiomas y/o células de hemangioma sin injertar. Ejemplos de otras células pluripotentes incluyen, pero no se limitan a, células troncales pluripotentes inducidas (iPS) .
En ciertas modalidades en donde células iPS se usan, dichas células iPS son pasadas con tripsina, dichas células iPS son mantenidas con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o son mantenidas libres de alimentadores, y/o se agrega Y-27632 al medio de cuerpo embrioide libre de suero y/o medio de diferenciación.
En ciertas modalidades, la invención proporciona hemangioblastos , células que forman colonias de hemangiomas, células de hemangioma sin injertar, células hematopoyéticas y células endoteliales producidas a partir de células iPS como se describe en la presente. La invención contempla combinaciones de cualquiera de los aspectos antecedentes y modalidades de la invención.
Otras características y ventajas de la invención llegarán a ser aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada en conjunto, con los dibujos acompañantes, los cuales ilustran, por medio del ejemplo, varias características de modalidades de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Modalidades ejemplares son ilustradas en las Figuras de referencia. Se pretende que las modalidades y Figuras descritas en la presente sean consideradas ilustrativas en lugar de restrictivas.
La Figura 1 representa los efectos de BMPs y VEGFi6s en el desarrollo de colonias de blastos de conformidad con una modalidad de la presente invención. A. Diferentes dosis de BMP-4 se agregan en medio de EB que contiene 50 ng/ml de VEGFi6s/ y se observa un desarrollo dependiente de la dosis de colonias de blastos para BMP-4. B, medio de EB que contiene 50 ng/ml de BMP-4 y VEGFi6S se suplementaron con diferentes dosis (0, 10 y 20 ng/ml) de BMP-2 y BMP-7. BMP-2 y BMP-7 fallaron en promover el desarrollo de la colonia de blastos. C. Diferentes dosis de VEGFi65 se agregan en medio de EB que contiene 50 ng/ml de BMP-4. El desarrollo de colonias de blastos es dependiente de la dosis de VEGFi6s- **P<0.01, n = 3. 1 x 105 células a partir del día 3.5 de EB se colocaron en placas por cavidad.
La Figura 2 representa el efecto de bFGF en el desarrollo de colonias de blastos agregadas durante diferentes etapas de conformidad con una modalidad de la presente invención, (a) Diferentes dosis de bFGF se agregan en medio de EB; (b) Diferentes dosis de bFGF se suplementaron en medio de crecimiento de colonia de blastos (BGM) ; (c) Diferentes dosis de bFGF se agregaron en tanto medio de EB como de BGM. **P<0.01, n-3. B y C . La formación de estructura similar a red de células endoteliales derivadas de BCs se desarrollaron en BGM con (B) y sin (C) bFGF. Las células endoteliales de ambas fuentes formaron estructuras similares a red sin efectos obvios.
La Figura 3 representa el efecto de bFGF en el desarrollo de colonias de blastos a partir de tres líneas de hESC de conformidad con una modalidad de la presente invención. Bandas diagonal: Diferentes dosis de bFGF se agregaron en BGM. Horizontal: Varias dosis de bFGF se agregan en medio de EB. *P<0.05; **P<0.01, n-3.
La Figura 4 representa el crecimiento de hESC bajo condiciones libres de alimentadores que retienen la pluripotencia de marcadores y son capaces de una fuerte diferenciación de hemangioblasto de conformidad con una modalidad de la presente invención. Después de 4-5 pasa es bajo condiciones libres de alimentadores, células WA01 se tiñeron para la expresión de los marcadores de hESC Oct-4 (A-C: DAPI, Oct-4 y combinaron respectivamente) y Tra-1-60 (D-F DAPI, TRA-1-60, y combinaron respectivamente). Los paneles G y H demuestran diferencias en morfología de colonia cuando se cultivan hESCs en Matrigel (G) contra MEF (H) . Amplificación: originalmente X100. En el panel i, se hicieron crecer hESCs yá sea en MEFs o Matrigel y después se diferenciaron bajo las condiciones optimizadas descritas en la presente. De mañera considerable, se observó más expansión de hemangioblastos en células cultivadas con Matrigel comparadas con hESC cultivadas con MEF. *P<0.03, n-3.
La Figura 5 representa análisis de qRT-PCR dé la expresión del gen en EB cultivados bajo diferentes condiciones de conformidad con una modalidad de la presente invención. Se analizaron los niveles de expresión de varios genes asociados con el desarrollo de hemangioblastos en EB derivados en la presencia o ausencia de cualquiera o una combinación de tanto BMP-4 como VEGFi6s. Se usó ß-Actina como un control interno para normalizar la expresión del gen;., La expresión relativa del gen se presenta como una diferencia de veces comparada con los niveles de expresión promedio observados en hESC no diferenciadas, **P<0.002; * * *P<0.0004 , n = 3.
La Figura 6 representa la identificación de marcadores de superficie para progenitores de hemangioblastos de conformidad con una modalidad de : la presente invención. Se enriquecieron células EB con diferentes anticuerpos usando el kit EasySep, después plaquearon para el desarrollo de colonias de blastos. **P<0.01, n =3.
La Figura 7 representa una secuencia de ácido nucleico de proteína HOXB4 de conformidad con una modalidad de la presente invención.
La Figura 8 representa una secuencia de ácido nucleico, tipo nativa de la proteína HOXB4 de conformidad con una modalidad de la presente invención.
La Figura 9 representa una secuencia de aminoácido de HOXB4 de conformidad con una modalidad de la presente invención.
La Figura 10 representa una secuencia de aminoácido de H0XB4 de conformidad con una modalidad de la presente invención.
La Figura 11 representa el crecimiento de iPSC (IMR90-1) bajo condiciones libres de alimentador que retienen marcadores de pluripotencia de conformidad con una modalidad de la presente invención. Después de 4-5 pasajes bajo condiciones libres de alimentadores , se tiñeron células iPS (IMR90-1) para expresión de marcadores de pluripotencia, u, campo brilloso; b, Nanog; c, Oct-4; d, SSEA-4; y e, TRA-160. Amplificación: originalmente X200^ La Figura 12 representa el efecto del inhibidor ROCK en la diferenciación hemangioblástica de iPSC de conformidad con una modalidad de la presente invención. Los EBs generado a partir de células iPS(IMR90)-l 24 hr después de la colocación en placas sin (a, originalmente lOOx) y con (b, originalmente lOOx) inhibidor ROCK; Colonias de blastos derivadas de células iPS(IMR90)-l sin inhibidor ROCK (c, originalmente 200x) , con inhibidor ROCK (d, originalmente 20Ox) , y con inhibidor ROCK más inhibidor de la trayectoria Art (e, originalmente 20Ox) durante la formación de EB; f-j : diferenciación de células endoteliales y hematopoyéticas de hemangioblastos derivados e iPSC: f (originalmente 200x) ; CFU-E,- g (originalmente lOOx) , CFU- ; h (originalmente 40x) ; CFU-G; i (originalmente 400x) , absorción de Ac-LDL (rojo) por células endoteliales teñidas con VE-Caderina (verde) ; j (originalmente 40x) , red similar a tubo después de la colocación en placas de células endoteliales en Matrigel.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas aquí están incorporadas por referencia en sus totalidades como se exponen completamente. A menos que se declare de otro modo, los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado como se entienden comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Singleton et: al., Dictionary oí Microbiology and Molecular Biology 3ra ed. , J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); Marzo, Advanced Organic ¦ Che istry Reactions, Mechanis s and Structure 5 ed. , J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); y Sambrook and Russel, Molecular Cloning: ? Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, Y 2001), proporciona a un experto en la técnica con una guía generar de muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, los cuales podrían ser usados en la práctica de la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está en ninguna forma limitada a los métodos y materiales descritos. Para propósitos de la presente invención, los siguientes términos son definidos abajo.
Como se usa en la descripción aquí y a través de las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo. También, como se usa en la descripción aquí, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo.
A través de esta especificación, la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" serán entendidas para implicar la inclusión de un integrante declarado o grupos de integrantes pero sin la exclusión de cualquier otro integrante o grupos de integrantes .
El término "células troncales embriónicas" (células ES) se refiere a células derivadas de embrión y se usan aquí como se usan en la técnica. Este término incluye células derivadas de la masa de células internas de blastocistos humanos o mórulas, que incluyen aquellas que han sido serialmente pasadas como líneas celulares. Cuando se usa para referirse a células de humanos, se usa el término célula troncal embriónica humana (hES) . Las células ES se pueden derivas de la fertilización de una célula de óvulo con esperma, así como también usando ADN, transferencia nuclear, partenogénesis , o por medios para generar células ES con homocigocidad en la región HLA. Las células ES son también células derivadas de un cigoto, blastómeros o embrión de mamífero en etapa de blastocisto producido por la fusión de un esperma y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, androgénesis , o la reprogramación de cromatina e incorporación subsecuente de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una células. Células troncales embriónicas, con respecto a su fuente o el método particular usado para producirlas, puede ser identificado con base en (i) la capacidad para diferenciarse en células de las tres capas germinales, (ii) expresión de al menos Oct-4 y fosfatasa alcalina, y (iii) capacidad para producir teratomas cuando se transplantan en animales inmunodeficientes .
Como se usa en la presente, el término "células troncales pluripotentes" incluye células troncales embriónicas, células troncales derivadas de embriones, y células troncales pluripotentes inducidas, con respecto al método por el cual se derivan las células troncales pluripotentes. Las células troncales pluripotentes son definidas funcionalmente como células troncales que son: (a) capaces de inducir teratomas cuando se transplantan en ratones inmunodeficientes (SCID) ; (b) capaces de diferenciar a tipos celulares de las tres capas germinales (por ejemplo, pueden diferenciar a tipos de células ectodérmicas , mesodérmicas y endodérmicas ) ; y (c) expresar uno o más marcadores de células troncales embriónicas (por ejemplo, expresan Oct-4, fosfatasa alcalina, antígeno de la superficie SSEA-3, antígeno de la superficie SSEA-4, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REXl , etc) . Células troncales pluripotentes ejemplares pueden ser generadas usando, por ejemplo, métodos conocidos en la técnica. Células troncales pluripotentes ejemplares incluyen células troncales embriónicas derivadas de ICM de embriones en etapa de blastocistos , así como también células troncales embriónicas derivadas de uno o más blastómeros de un embrión en etapa de mórula o etapa de desdoblamiento (opcionalmente sin destruir el resto del embrión) . Tales células troncales embriónicas pueden ser generadas de material embrionico producido por fertilización o por medios asexuales, que incluyen transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) , partenogénesis y androgénesis . Células troncales pluripotentes ejemplares adicionales incluyen células troncales pluripotentes inducidas (células iPS) generadas por reprogramación de una célula somática expresando una combinación de factores (aquí referida como factores de reprogramación) , las células iPS pueden ser generadas usando células somáticas fetales, postnatales, de recién nacido, juveniles, o de adulto. En ciertas modalidades, factores que pueden ser usados para reprogramar células pluripotentes a células troncales pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct4 (algunas veces referido como Oct 3/4),. Sox2, c-Myc, , y Klf4. En otras modalidades, factores que pueden ser usados para reprogramar células somáticas a células troncales pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct 4, Sox2 , Nanog, y Liñ28. En otras modalidades, células somáticas son reprogram das expresando al menos 2 factores de reprogramación, al menos tres factores de reprogramación, o cuatro factores de reprogramación. En otras modalidades, factores de reprogramación adicionales son identificados y usados solos o en combinación con uno o más factores de reprogramación conocidos para reprogramar una célula somática a una célula troncal pluripotente . Células troncales pluripotentes inducidas son definidas funcionalmente e incluyen células que son reprogramadas usando cualquiera de una variedad de métodos (vectores integrativos , vectores no integrativos , medios químicos, etc.).
Las células troncales pluripotentes pueden de cualquier especie. Las células troncales em riónicas han sido exitosamente derivadas en, por ejemplo, ratones, especies múltiples de primates no humanos, y humanas, y células similares troncales embriónicas han sido generadas a partir de numerosas especies adicionales. De este modo, uno' de habilidad en la técnica puede generar células troncales embriónicas y células troncales derivadas de embrión de cualquier especie, que incluye pero no se limita a, humanos, primates no humanos, roedores (ratones, ratas) , ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (perros domésticos y salvajes), gatos (gatos domésticos y salvajes tales como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, jerbos, ardillas, cobayos, cabras, elefantes, panda (que incluye panda gigante), cerdos, mapache, caballos, cebras, mamíferos marinos (delfines, ballenas, etc.) y similares. En ciertas modalidades, la especie es una especie engendrada. En ciertas modalidades, la especie es una especie actualmente extinta.
( De manera similar, células iPS pueden ser' de cualquier especie. Las células iPS han sido exitosamente generadas usando células de ratón y humanas. Las células iPS han sido exitosamente generadas usando tejido embriónico, fetal, de recién nacido y de adulto. Por consiguiente, se pueden generar fácilmente células iPS usando una célula donadora a partir de cualquier especie, que incluye pero no se limita a, humanas, primates no humanos, roedores (ratones, ratas), un ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (perros domésticos y salvajes), gatos (gatos domésticos y salvajes tales como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, jerbos, ardillas, cobayos, cabras, elefantes, panda (que incluye panda gigante), cerdos, mapache, caballos, cebras, mamíferos marinos (delfines, ballenas, etc.) y similares.; En ciertas modalidades, la especie es una especie engendrada. En ciertas modalidades, la especie es una especie actualmente extinta .
Las células troncales pluripotentes inducidas pueden ser generadas usando, como un punto de partida, virtualmente cualquier célula somática de cualquier etapa, de desarrollo. Por ejemplo, la célula puede ser de un embrión, feto, neonato, donador juvenil o adulto. Células somáticas ejemplares que pueden ser usadas incluyen fibroblastos, tales como fibroblastos dermales obtenidas por una muestra de piel o biopsia, sinoviocitos de tejido sinovial, células' de prepucio, células de la mejilla, o fibroblastos de pulmón. Aunque la piel y mejilla proporcionan una fuente disponible y fácilmente alcanzable de células apropiadas, virtualmente cualquier célula puede ser usada. En ciertas modalidades/ la célula somática no es un fibroblasto.
Se nota que las células troncales pluripotentes pueden ser, por ejemplo, células ES o células troncales pluripotentes inducidas . Células troncales pluripotentes inducidas pueden ser producidas expresando una combinación de factores de reprogramación en una célula somática. En ciertas modalidades, al menos dos factores de reprogramación '; son expresados en una célula somática para reprográmar exitosamente la célula somática. En otras modalidades,; al menos tres factores de reprogramación son expresados en 'una célula somática para reprográmar exitosamente la célula somática. En otras modalidades, al menos cuatro factores de reprogramación son expresados en una célula somática para reprográmar exitosamente la célula somática.
El término "proteína de transducción de protéína (™PTD" ) se refiere a cualquier secuencia de aminoácido qué se transloca a través de una membrana celular en células o confiere o incrementa la tasa de, por ejemplo, otra molécula (tal como por ejemplo, un dominio de proteína) al cual está unido la PTD, para translocarse a través de una membrana celular en células . El dominio de transducción de proteína puede ser un dominio o secuencia que ocurre naturalmente como parte de una proteína más grande (por ejemplo, una PTD de una proteína viral tal como TAT de VIH) o puede ser una secuencia de aminoácido artificial o sintético.
Los términos "hemangioblasto" y "células" que forman colonias de hemangiomas" serán usados intercambiablemente a través de esta solicitud. Las células tienen numerosas características funcionales y estructurales. Entre las características de estas células está la capacidad para injertar en la médula' ósea cuando se administra a un hospedero. Estas células pueden ser descritas basadas en numerosas propiedades estructurales y funcionales que incluyen, pero no se limitan a, expresión (ARN o proteína) o carencia de expresión (ARN o proteína) de uno o : más marcadores . Células que forman colonias de hemangiomas son capaces de diferenciarse para dar origen al menos a tipos de células hematopoyéticas o tipos de células endoteliales . Células que forman colonias de hemangiomas son preferiblemente bi-potenciales y capaces de diferenciar para dar origen al menos a tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales. Como tal, células que forman colonias de hemangiomas de la presente invención son al menos uni-potenciales y preferiblemente bi-potenciales. Adicionalmente sin embargo, células que forman colonias de hemangiomas pueden tener un mayor grado de desarrollo potencial y pueden, en ciertas modalidades, diferenciarse para dar origen a tipos de células de otros linajes. En ciertas modalidades, las células que forman colonias de hemangiomas son capaces de diferenciarse para dar origen a otros derivados mesodérmicos tales como células cardiacas (por ejemplo, cardiomiocitos) y/o células del músculo liso.
El término "células de hemangioma sin injertar;" se usa a través de esta solicitud para referirse a una nueva población de células que portan algunas de , las características de células que forman colonias de hemangiornas . Sin embargo, las células de hemangioma isin injertar son distinguibles en que no se injertan en la médula ósea cuando se administra a un hospedero inmunodeficiente . Debido a esta diferencia, células de hemangioma sin injertar pueden portar una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las propiedades /características estructurales o funcionales de' células que forman colonias de hemangiornas . Por ejemplo, en ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar son poco adheridas entre sí. En otras modalidades, las células de hemangioma : sin injertar no expresan una o más que una (2, 3, 4) de' las siguientes proteínas: CD34, KDR, CD133, CD31. Sin íser ligado por teoría, células de hemangioma sin injertar pueden proporcionar una población de células tronca'les distintas que están algo más comprometidas que las células que forman colonias de hemangiomas, y aún todavía capaces de producir un intervalo de tipos de células hematopoyéticas .
Células que forman colonias de hemangiomas Esta invención proporciona un método paira generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos a partir de células troncales pluripotentes humanas, preparaciones y composiciones que comprenden células que forman colonias de hemangiomas humanos, métodos para producir varios tipos de células parcialmente o terminalménte diferenciadas a partir de células que forman colonias de hemangiomas , métodos de usar células que forman colonias; de hemangiomas terapéuticamente, y métodos para ;úsar terapéuticamente varios tipos de células parcialmente o terminalménte diferenciadas a partir de células que forman colonias de hemangiomas. ' Aquí, los inventores reportan un método 'más eficiente y más simple para la fuerte regeneración de progenitores hemangioblásticos . Además, para eliminar varios factores costosos que no son necesarios, se demostró que la proteína-4 morfogenética ósea (BMP-4) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son necesarios y suficientes para inducir entrega y desarrollo a partir de células troncales pluripotentes durante etapas tempranas, de diferenciación. La BMP-4 y VEGF signif cantemente regulan ascendentemente la expresión del gen T-braquiuro, KDR, CD31 y LM02, mientras dramáticamente regula descendentemente; la expresión de Oct-4. La adición del factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) durante el crecimiento y expansión se encontró además por mejorar el desarrollo de BC, consistentemente generando aproximadamente 1 x 108 BCs a partir de una placa de seis cavidades de hESC.
Esta invención también proporciona un método para expandir células que forman colonias de hemangiomas de mamífero obtenidas de cualquier fuente, que incluyen células ES, blastocistos o blastómeros, sangre de cordón umbilical de placenta o tejido umbilical, sangre periférica, de médula ósea, u otro tejido o por cualquiera de otros medios conocidos en la técnicas . Las células que forman colonias de hemangiomas humanos también pueden ser generadas a partir de células troncales pluripotentes humanas. Células troncales pluripotentes humanas pueden ser una población sustancialmente homogénea de células, una población heterogénea de células, o toda o una porción de un tejido embriónico. Como un ejemplo de células troncales pluripotentes que pueden ser usadas en los métodos de la presente invención, células que forman colonias de hemangiomas humanos pueden ser generadas a partir de células troncales embriónicas humanas. Tales células troncales embriónicas incluyen células troncales embriónicas derivadas de o usando, por ejemplo, blastocistos, ICM plaqueadas, uno o más blastómeros, u otras porciones de una estructura similar a embrión o embrión en etapa de pre-implantación, con respecto a si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) , partenogénesis , androgénesis , u otros medios sexuales o asexuales.
En ciertas modalidades, los hemangioblastos pueden ser además diferenciados a células hematopoyéticas que incluyen, pero no se limitan a, plaquetas y células rojas de la sangre. Tales células pueden ser usadas en transfusiones. La capacidad para generar grandes números de células para transfusión aliviará el acortamiento crónico de sangre experimentada en bancos de sangre y hospitales a través del país. En ciertas modalidades, los métodos de la invención permiten la producción de células universales para transfusión. Específicamente, células rojas de la sangre que son tipo ,0 y Rh- pueden ser fácilmente generadas y servirán como una fuente de sangre universal para transfusión.
Los métodos de esta invención permiten la expansión in vi tro de hemangioblastos a grandes cantidades útiles para una variedad de aplicaciones clínicas y comerciales. La • expansión de hemangioblastos in vitro se refiere a la proli eración de hemangioblastos.- Mientras los métodos de la invención permiten la expansión de células de hemangioblasto humano para alcanzar cantidades comercialmente útiles, la presente invención también se refiere a grandes números de células de hemangioblasto y a preparaciones celulares que comprenden grandes números de células de hemangioblas os humanos (por ejemplo, al menos 10,000, 100,000, o 500,000 células) . En ciertas modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 1 X 106 células. En otras modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 2 X 106 células de hemangioblastos humanos y en modalidades adicionales al menos 3 X 106 células de hemangioblastos humanos. En todavía otras modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 4 X 106 células de hemangioblastos humanos.
La presente invención se refiere a una solución, una preparación, y una composición que comprende entre 10,000 y 4 millones o más de células de hemangioblastó de mamífero (tal como humanas) . El número de células de hemangioblastó en tal solución, una preparación y una composición puede ser cualquier número entre el intervalo de 10,000 hasta 4 millones, o más. Este número podría ser, por ejemplo, 20,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1 millón, etc.
De manera similar, la invención se refiere a preparaciones de células de progenie de hemangioblastó humano (por ejemplo, células hematopoyéticas humanas que incluyen células troncales hematopoyéticas humanas, y células endoteliales ) . La invención además se refiere a métodos para producir, almacenar y distribuir células de hemangioblastó y/o células de linaje de hemangioblastó.
La invención también proporciona métodos y soluciones adecuadas para transfusión en pacientes humanos o animales. En modalidades particulares, la invención es adecuada para hace células rojas de la sangre y/o plaquetas, y/u otros tipos de células hematopoyéticas para transfusión. En ciertas modalidades, la invención es adecuada para usó en bancos de sangre y hospitales para proporcionar sangre para transfusión después de trauma, o en el tratamiento de ¡una enfermedad o trastorno relacionado con la sangre. En ci rtas modalidades, la invención proporciona células rojas dé: la sangre que son células donadoras universales. En ciertas modalidades, las células rojas de la sangre son funcionales y i expresan hemoglobina F previo a la transfusión.
La invención también proporciona células que forman colonias de hemangiomas humanos, cultivos de células ¡que comprenden una población sustancialmente purificada ¡ de células que forman colonias de hemangiomas humarlos, preparaciones farmacéuticas que comprenden células que forman colonias de hemangiomas humanos y preparaciones criopreservadas de las células que forman colonias!¦ de hemangiomas. En ciertas modalidades, la invención i se proporciona para el uso de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo. Alternativamente, la invención proporciona el uso de cultivos celulares en la manufactura de un medicamento para tratar , una condición en un paciente en necesidad del mismo. La invención también proporciona el uso de preparación farmacéuticas en la manufactura de un medicamento para tratar una condición erí un paciente en necesidad del mismo.
Las células que forman colonias de hemangiomas pueden ser identificadas y caracterizadas basadas en sus propiedades estructurales. Específicamente, y en ciertas modalidades, estas células son únicas en que son solamente poco adherentes entre sí (poco adherentes a otras células que forman colonias de hemangiomas) . Debido a que estas células son solamente poco adherentes entre sí, los cultivos o colonias de células que forman colonias de hemangiomas pueden ser disociados a células individuales usando solamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son suficientemente poco adherentes entre sí que la disociación mecánica sola, preferentemente disociación enzimática o una combinación de disociación mecánica y enzimática, es suficiente para desagregar los cultivos o colonias sin deteriorar sustancialmente la viabilidad de las células, en otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza para provocar lesión o muerte celular sustancial cuando se compara con aquella observada subsecuente a la disociación enzimática de agregados celulares.
Además, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser identificadas o caracterizadas basadas en la expresión o carencia de expresión (como se valora al nivel del gen o el nivel de la proteina) de uno o más marcadores. Por ejemplo, en ciertas modalidades, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser identificadas 1 o caracterizadas basadas en la carencia de expresión de una o más (por ejemplo, las células pueden ser caracterizadas basadas en la carencia de expresión de al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de los siguientes marcadores) de los siguientes marcadores de la superficie celular: CD34, KDR, CD133, o CD31. Adicionalmente o alternativamente, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser identificadas o caracterizadas basadas en ; la expresión de GATA2 y/o LM02. Adicionalmente o alternativamente, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser identificadas o caracterizadas basadas en la expresión o carencia de marcadores de expresión.
Células que forman colonias de hemangiomas dé la presente invención pueden ser identificadas o caracterizadas basadas en una o cualquier combinación de estas características estructurales o funcionales. Se nota que aunque estas células pueden ser derivadas de cualquiera dé un número de fuentes, por ejemplo, tejido embriónico, tejido, prenatal o tejido perinatal, el término "células que forman colonias de hemangiomas" aplica a células, con respecto de; la fuente, que son capaces de diferenciarse para dar origen al menos a tipos de células hematopoyéticas y/o tipos de células endoteliales y que tienen una o más de las propiedades funcionales o estructurales mencionadas anteriormente. ¡: En ciertas modalidades, marcador (es) para el progenitor de BC pueden ser usados para selecciona ; BC después del cultivo inicial.
En ciertas modalidades, colonias de hemangiomas. son producidas a partir de células pluripotentes sin formar cuerpos embrioides .
Diferenciación in vitro de células troncales pluripotentes para obtener cuerpos embrioides y hemangioblastos La presente invención proporciona un método para generar y expandir hemangioblastos humanos derivados ; de células troncales pluripotentes humanas, o de blastocistós o blastómeros humanos. Los hemangioblastos así producidos pueden ser purificados y/o aislados. ;' Células que forman colonias de hemangiomas humanos también se pueden generar a partir de células troncales pluripotentes humanas . Células troncales pluripotentes humanas pueden ser una población sustancialmente homogénea de células, una población heterogénea de células, o toda o Íuna porción de un tejido embriónico. Como un ejemplo de células troncales pluripotentes que pueden ser usadas en los métodos de la presente invención, células que forman colonias de hemangiomas humanos pueden ser generadas a partir de células troncales embriónicas humanas . Tales células troncales embriónicas incluyen células troncales embriónicas derivadas de o usando, por ejemplo, blastocistos, ICM plaqueadas, uno o más blastómeros, u otras porciones de un embrión en etapa de pre-implante o estructura similar al embrión, con respecto a si se produce por fertilización, transferencia nuclear de célula somática (SCNT) , partenogénesis , androgénesis u otros medios sexuales o asexuales.
Adicionalmente o alternativamente, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser generadas a partir de otras células troncales pluripotentes . Por ejemplo, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser generadas (sin ir necesariamente a través de una etapa de derivación de célula troncal embriónica) de o usando embriones colocados en placas, ICM, blastocistos, células de trofectoderma/trofoblastos , uno o más blastómeros, células troncales de trofoblastos , células germinales embriónicas u otras porciones de una estructura similar a embrión o embrión de etapa de pre-implante, con respecto a si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis u otros medios sexuales o asexuales. De manera similar, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser generadas usando células o líneas celulares parcialmente diferenciadas a partir de células troncales pluripotentes . Por ejemplo, si una línea de célula troncal em riónica humana se usa para producir células que son más desarrolladamente primitivas que células que formas colonias de hemangiomas, en términos de desarrollo potencial y plasticidad, tales células troncales pluripotentes pueden entonces ser usadas para generar células que forman colonias de hemangiomas .
Adicionalmente o alternativamente, células que forman colonias de hemangiomas pueden ser generadas a partir de otras fuentes pre-natales o peri-natales que incluyen sin limitación, cordón umbilical, sangre de cordón umbilical, fluido amniótico, células troncales amnioticas y placenta.
Se nota que cuando las células que forman colonias de hemangiomas son generadas a partir de tejido embriónico humano puede ser necesaria una etapa de formación de cuerpo embrioide. Sin embargo, dado que la formación de cuerpo embriónico sirve, al menos en parte, para ayudar a recapitular la interacción tridimensional de las capas germinales que ocurren durante el desarrollo temprano, tal etapa no es necesariamente requerida cuando las células troncales pluripotentes ya tienen una estructura u organización que sirve sustancialmente al mismo propósito como formación de cuerpo embrioide. Por medio del ejemplo, cuando células que forman colonias de hemangiomas son generadas a partir de blastocistos plaqueados, un nivel de organización tridimensional ya existe entre las células en el blastocisto. Como tal, una etapa de formación de cuerpo embrioide no es necesariamente requerida para proporcionar señales intercelulares, pistas inductivas o arquitectura tridimensional .
Los métodos y usos de la presente invención pueden ser usados para generar células que forman colonias de hemangiomas a partir de células troncales pluripotentes o células derivadas de embriones. En ciertas modalidades, las células derivadas de embriones son células troncales embriónicas. En ciertas otras modalidades, las células derivadas de embriones son e brioides plaqueados, ICM, blastocistos, células de trofoblastos/trofectodemaa, uñó o más blastómeros, células troncales de trofoblastos , u otras porciones de un embrión de pre-implantación temprana. Para cualquiera de los anteriores, las células derivadas de embriones pueden ser . de embriones producidos por fertilización, transferencia nuclear de células troncáles (SCNT) , partenogénesis , androgénesis , u otros medios sexuales o asexuales .
A través de esta solicitud, cuando un método se describe por referirse específicamente a generar células que forman colonias de hemangiomas a partir de células troncáles embriónicas, la invención contempla de manera general generar células que forman colonias de hemangiomas a partir de o usando otras células troncales pluripotentes o células derivadas embrionicas, y usando las células generadas para ; i cualquiera de las mismas aplicaciones terapéuticas.
En ciertos aspectos de la invención, las células troncales embrionicas humanas pueden ser el material de partida de este método. Las células troncales embrionicas pueden ser cultivadas en cualquier forma conocida en la técnica, tal como en la presencia o ausencia de células alimentadoras .
Células troncales embrionicas pueden formar cuerpos embrioides ("EBs") en suspensión en medio que contiene suero (Wang et al. 2005 J Exp Med ( 201 ) : 1603 -1614 ; Wang et al. 2004 Immunity ( 21 ) : 31-41 ; Chadwick et al. 2003 Blood ( 102 ) : 906-915 ) . La adición de suero, sin embargo, representa ciertos retos, que incluyen variabilidad en experimentos, costos, potencial para agentes infecciosos y suministro limitado. Además, para ciertas aplicaciones comerciales y clínicas, el uso de suero necesita acuerdos de cumplimiento regulador internacionales y Estadounidenses que rigen a los productos biológicos.
La presente invención proporciona métodos para generar y expandir hemangioblastos humanos a partir de células troncales pluripotentes en los cuales no se usa suero. Las condiciones libres de suero son más conductivas a producción a escala bajo buenos lineamientos de procesos de manufacturación (GMP) que son condiciones las cuáles requieren suero. Además, condiciones libres de suero extienden la vida media de ciertos factores agregados ; al medio (por ejemplo, la vida media de proteínas que incluyen factores de crecimiento, citocinas y H0XB4 en medio se incrementa cuando no está presente el suero) . En ciertas modalidades, el medio es suplementado con BMP4 y VEGF.1 En ciertas modalidades, se usa medio libre de suero a través del método de esta invención para generar y expandir hemangioblastos humanos.
En la primera etapa de este método para generar y expandir células de hemangioblastos humanos, células troncales humanas están creciendo en medio libre de suero y son inducidas para diferenciarse en cuerpos embrioides . Para inducir la formación de cuerpo embrioide, células troncales embriónicas pueden ser desprendidas y resuspendidas en medio libre de suero (por ejemplo, en medio Stemline I o II (Sigma™) suplementado con uno o más factores morfogénicós y citocinas y después plaqueados en discos de cultivo de baja unión (por ejemplo, unión ultra baja) . Los factores morfogénicós y citocinas pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas morfogénicas óseas (por ejemplo, BMP2 , BMP-4, BMP-7, pero no BMP-3) y VEGF, SCF y FL. Proteínas morfogénicas óseas y VEGF pueden ser usadas solas o en combinación con otros factores . Los factores morfogénicos y citocinas pueden ser agregados al medio a partir de 0-48 horas de cultivo celular. Después de la incubación bajo estas condiciones, la incubación en la presencia de citocinas de expansión hematopoyética temprana, que incluye, pero no se limita a trombopoyetina (TPO) , ligando Flt-3, y factor de célula troncal (SCF) , permite a las células ES plaqueadas formar EB. Además de TPO, ligando Flt-3 y SCF, VEGF, BMP-4, y HoxB4 también pueden ser agregadas al medio. En otra modalidad, células ES humanas se hacen crecer primero eri la presencia de BMP-4 y VEGFi6s (por ejemplo, 25-100 ng/mg) , seguido por hacer crecer en la presencia de BMP-4, VEGFi65, SCF, TPO, y ligando FLT3 (por ejemplo, 10-50 ng/ml) y HoxB4 (por ejemplo, 1.5-5 g/ml de una prote na de fusión HoxB4-de dominio de transducción de proteína triple como se describe en la presente) . Los factores adicionales pueden ser agregados 48-72 horas después del plaqueado.
En este método de la presente invención, células de hemangioblasto humano son aisladas de cuerpos embrioides tempranos ("EBs"). Aislar células de hemangioblastos a partir de EB soporta la expansión de las células in vitro. Para células humanas, las células de hemangioblasto se pueden obtener de EB que crecen por menos de 10 días. En ciertas modalidades de la presente invención, células de hemangioblasto se originan en EB humanos que crecen por 2-6 días . De conformidad con una modalidad, células de hemangioblastos son identificadas y pueden ser aisladas de EB humanos que crecen por 4-6 días. En otras modalidades,, EBs humanos están creciendo por 2-5 días antes que las células de i hemangioblastos sean aisladas. En ciertas modalidades, EB humanas están creciendo por 3-4.5 días antes de que sean aisladas células de hemangioblastos.
En ciertas modalidades, EB tempranas son lavadas y disociadas (por ejemplo, por Tripsina/EDTA o colagenasa1 B) , Un número seleccionado de células (por ejemplo, 2-5 X ¡ 105 células) son entonces mezclados con medio de metilcelulosa libre de suero optimizado para crecimiento de células' de hemangioblasto (por ejemplo, medio BL-CFU, por ejemplo, Stem Cell Technologies Catálogo H4436, o medio de expansión' de células de hemangioblasto (HGM) , o cualquier medio ! que contiene 1.0% de metilcelulosa en MDM, 1-2% de albúmina de suero bovino, 0.1 M de 2-mercaptoetanol , 10 ug/ml de ! rh-insulina, 200 ug/ml de transferrina humana saturada :! con hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF) ( "rh" significa "humano recombinante" ) . Este medio puede ser suplementado -con citocinas de etapa temprana (que incluye, pero no se limita a, EPO, TPO, SCF, FL, FLt-3, VEGF, BMPs tal como BMP2 , BMP4 y BMP7 , pero no BMP3 ) y HOXB4 (u otra proteína de homeobox) : En ciertas modalidades, se agrega eritropoyetina (EPO) al medio.
En modalidades adicionales, EPO, SCF, VEGF, BMP-4 y HoxB4 se agregan al medio. En modalidades adicionales, las células están creciendo en la presencia de EPO, TPO y FL. En ciertas modalidades en donde H9 es la línea de células ES humanas' de partida, se agregan al medio EPO, TPO y FL. Además de EPO, TPO y FL, medio para células derivadas de H9 u otras células ES pueden además comprender VEGF, BMP-4, y HoxB4. . ,¡ Las células así obtenidas por éste método (las células pueden estar en medio BL-CFU) , las cuales incliiyen células de hemangioblastos , son plaqueadas sobre discos de cultivo de ultra-baja unión e incubadas en una incubadora de C02 para hacer crecer colonias de hemangioblastos . Algunas células pueden ser capaces de formar EB secundarios . Después de aproximadamente 3-6 días, y en algunos casos 3-4.5 días, se observan colonias de hemangioblastos . Colonias : de hemangioblastos pueden ser distinguidas de otras células tales como EB secundarias y su morfología similar a , uva distintiva y/o por su tamaño pequeño. Además, los hemangioblastos pueden ser identificados por la expresión de ciertos marcadores (por ejemplo, la expresión de marcadores celulares tanto endoteliales como hematopoyéticos tempranos) así como también, por su capacidad para diferenciarse en al menos tanto células endoteliales como hematopoyéticas (véase abajo, Derivando células de linaje , de hemangioblastos) . Por ejemplo, mientras los hemangioblastos carecen de ciertas características distintivas de células endoteliales o hematopoyéticas maduras, estas células pueden ser identificadas por la presencia de ciertos marcadores (tal como, por ejemplo, CD71+) y la ausencia de otros marcadores (por ejemplo, CD34-) . Los hemangioblastos también puéden expresar proteínas GATA-1 y GATA-2, CXCR-4, y receptores TPO y EPO. Además, los hemangioblastos pueden ser caracterizados por la ausencia o baja expresión de otros marcadores (por ejemplo, CD31, CD34, KDR u otras moléculas de adhesión) . Además, los hemangioblastos pueden ser caracterizados por la expresión de ciertos genes, (por ejemplo, genes asociados con hemangioblastos y desarrollo de eritroblastos primitivos tempranos, tales como, por ejemplo, SCL, LM02 , FLT-1, genes embriónicos de globina fetal, NF-E2, GATA-1, EKLF, ICAM-4, glicoforiunos , y receptor EPO) .
Por consiguiente, hemangioblastos pueden ser aislados por tamaño (siendo más pequeño que las otras células) o purificados con un anticuerpo anti-CD71+, tal como por cromatografía en columna de inmunoafinidad.
Las células de hemangioblastos pueden ser aisladas por tamaño y/o morfología por el siguiente procedimiento. Después de 6 a 7 días de crecimiento, la mezcla de células contiene EB, las cuales son redondas y representan un grupo de células múltiples, y hemangioblastos, los cuales son similares a uvas, más pequeñas de las EB y son células individuales. Por consiguiente, hemangioblastos pueden ser aislados basados en su morfología y tamaño. Las células de hemangioblastos pueden ser manualmente escogidas, por ejemplo, cuando se observa la mezcla bajo un microscopio. Las células pueden crecer subsecuentemente en colonias, cada colonia tiene entre 100-150 células.
Colonias de hemangioblastos humanos derivadas como se describe anteriormente pueden ser escogidas y colocadas en placas nuevamente sobre medio-CFU de metilcelulosa para formar CFU hematopoyéticos . En ciertas modalidades, el medio-CFU comprende StemCell Technologies H4436. En modalidades adicionales, los hemangioblastos son plaqueados en medio Stemline II suplementado con citocinas y otros factores. Por ejemplo, colonias BL-CFC individuales pueden ser escogidas manualmente y transferidas a una placa revestida de fibronectina que contiene Stemline II con SCF recombinante humano (por ejemplo, 20 ng/ml), TPO (por ejemplo, 20ng/ml), FL (por ejemplo, 20 ng/ml) , IL-3 (por ejemplo, 20 ng/ml) VEGF (por ejemplo, 20 ng/ml), G-CSF (por ejemplo, 20n ng/ml), BMP-4 (por ejemplo, 15 ng/ml), IL-6 (por ejemplo, 10 ng/ml), IGF-1 (por ejemplo, 10 ng/ml) , suplemento de crecimiento de célula endotelial (ECGS, por ejemplo, 100 g/ml), Epo (por ejemplo, 3 U/ml) . Después de una semana de crecimiento in vitro, células hematopoyéticas no adherentes pueden ser removidas por pipeteo uniforme y usadas directamente para ensayos CFU hematopoyéticos . Después de la remoción de las células no adherentes, las poblaciones adherentes pueden hacerse crecer por una semana más en medio de célula endotelial EGM-2 (Cambrex™) , y después examinadas para la expresión de vWF.
Expansión de hemangioblastos in vi tro Ciertos aspectos de la invención se refieren a la expansión in vi tro de hemangioblastos. En ciertas modalidades, los hemangioblastos expandidos por los métodos de la invención se obtienen a partir de cuerpos embrioides tempranos derivados a partir de células troncales embriónicas humanas como se describe anteriormente.
Además de, derivar hemangioblastos a partir de células troncales embriónicas humanas (células hES) , los hemangioblastos a ser expandidos también pueden ser aislados de otras fuentes de mamífero, tal como embriones de mamífero (Ogawa et al. 2001 Int Rev Immunol (20) :21-44, Publicación de Patente Estadounidense no. 2004/0052771), sangre de cordón umbilical de placenta y tejido umbilical (Pelosi, et al. 2002 Blood (100) : 3203-3208; Cogle et al. 2004 Blood (103 ) : 133-5) , sangre periférica y médula ósea (Pelosi et al. 2002 Hematopoiesis (100) : 3203-3208) . En ciertas modalidades, hemangioblastos no humanos a ser expandidos pueden ser generados a partir de células troncales embriónicas no humanas (tal como ratón y primates no humanos) . En ciertas modalidades, se obtienen hemangioblastos a partir de sangre de cordón umbilical (UCB) o médula ósea por métodos tales como, por ejemplo, selección positiva de perlilla magnética o técnicas de purificación (por ejemplo, columna MACS) . Las células pueden ser seleccionadas basadas en su estado de CD71+ y pueden ser confirmadas como CD34-. Además, los hemangioblastos aislados pueden ser probados por su potencial para dar origen a tanto linajes de células hematopoyéticas como endoteliales . En ciertas modalidades, hemangioblastos aislados o purificados y opcionalmente enriquecidos de embriones, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea u otros tejidos, son más de 95% puro.
Células derivadas de médula ósea se pueden obtener a partir de cualquier etapa de desarrollo del donador individual, que incluye prenatal (por ejemplo, embriónico o fetal) , infante (por ejemplo, desde el nacimiento hasta aproximadamente tres años de edad en humano) , niños (por ejemplo, desde aproximadamente tres años de edad hasta aproximadamente 13 años de edad en humanos) , adolescente (por ejemplo, desde aproximadamente 13 años de edad hasta aproximadamente 18 años de edad en humanos), adultos jóvenes (por ejemplo, desde aproximadamente 18 años de edad hasta aproximadamente 35 años de edad en humanos), adultos (desde aproximadamente 35 años de edad hasta aproximadamente 55 años de edad en humanos) o personas mayores (por ejemplo, desde aproximadamente 55 años y más allá de edad en humanos) .
La médula ósea humana puede ser recolectada raspando del esternón dividido de un paciente que sufre de cirugía, por ejemplo. ' La médula ósea puede entonces ser preservada en grupos de tejidos de 0.1 'hasta 1 mm3 en volumen y después hacerse crecer en una capa alimentadora embriónica de ratón (por ejemplo, una capa alimentadora irradiada o tratada con mitomicina-C) . Las células de la médula ósea se unirán a las placas y durante un periodo de cultivo de 1-2 semanas, las células de hemangioblastos pueden ser identificadas basadas en características morfológicas y/o marcadores celulares y aisladas (véase publicación de patente Estadounidense no. 2004/0052771). Las células pueden entonces hacerse crecer subsecuentemente y expandir en condiciones libres de suero de conformidad con los métodos descritos en la presente.
En adición, las células de la médula ósea y células de sangre u otro tejido pueden ser fraccionadas para obtener células de hemangioblastos . Los métodos de fraccionamiento son bien conocidos en la técnica y en general involucran tanto selección positiva (es decir, retención de células basadas en una propiedad particular) como selección negativa (es decir, eliminación de células basadas en una propiedad particular) . Métodos para fraccionamiento y enriquecimiento de células derivadas de médula ósea son mejor caracterizados para células de ratón y humanas .
Existe una variedad de métodos conocidos en el arte para fraccionamiento y enriquecimiento de células derivadas de la médula ósea u otras. Los métodos de selección positivos tales como enriquecimiento por células que expresan CD71 pueden ser usados. Y los métodos de selección negativa los cuales remueven o reducen células que expresan CD3, CD10, CDllb, CD14, CD16, CD15, CD16, CD19, CD20, CD32, CD45, CD45R/B220 o Ly6G pueden también ser usados solos o en combinación con técnicas de selección positivas. En el caso de células de médula ósea, cuando las células derivadas de médula ósea donadora no son autólogas, la selección negativa puede ser realizada en la preparación celular para reducir o eliminar células T diferenciadas.
En general, métodos usados para selección/enriquecimiento de células derivadas de médula ósea, sangre u otras células, utilizarán tecnología de inmunoafinidad, aunque los métodos de centrifugación : de densidad también son útiles. La tecnología de inmunoafinidad puede tomar una variedad de formas, como es bien sabido en la técnica, pero en general utiliza un anticuerpo o derivado de anticuerpo en combinación con algún tipo de tecnología de segregación. Esta tecnología de segregación en general resulta en la segregación física de células unidas por el anticuerpo y células no unidas por el anticuerpo, aunque en algunos casos la tecnología de segregación la cual elimina las células unidas por el anticuerpo puede ser usada para selección negativa.
Cualquier tecnología de inmunoafinidad adecuada puede ser utilizada para selección/enriquecimiento de hemangioblastos a partir de células derivadas de médula ósea, sangre u otras, que incluye clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , paneo, separación inmunomagnética, cromatografía de inmunoafinidad, fijación, de complemento mediada por anticuerpo, inmunotoxina, segregación de gradiente de densidad, y similar. Después del procesamiento en el proceso de inmunoafinidad, las células deseadas (las células unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de selección positiva, y células no unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de selección negativa) son recolectados y pueden ser sometidos a rondas adicionales de selección/enriquecimiento de inmunoafinidad.
La selección/enriquecimiento de inmunoafinidad típicamente se lleva a cabo incubando una preparación de células que comprende células derivadas de médula ósea con un anticuerpo o reactivo de afinidad de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo específico para un marcador de superficie dado) , después utilizando el reactivo de afinidad de enlace para seleccionar ya sea por o contra las células a las cuales el anticuerpo se une. El proceso de selección en general involucra una separación física, tal como puede ser realizada dirigiendo gotitas que contienen células individuales en diferentes contenedores dependiendo de la presencia o ausencia de reactivo de afinidad unido (FACS) , utilizando un anticuerpo unido (directamente o indirectamente) a un sustrato de fase sólida (paneo, cromatografía de afinidad) , o utilizando un campo magnético para recolectar las células las cuales están unidas a partículas magnéticas vía el reactivo de afinidad (separación inmunomagnético) . Alternativamente, células indeseables pueden ser eliminadas a partir de la ¦ separación de células derivadas de médula ósea usando un reactivo de afinidad el cual dirige un ataque citotóxico a las células unidas por el reactivo de afinidad. El ataque citotóxico puede ser activado por el reactivo de afinidad (por ejemplo, fijación de complemento), o puede ser localizado a las células objetivo por el reactivo de afinidad (por ejemplo, inmunotoxina, tal como cadena B de ricina) .
Aunque los métodos descritos anteriormente se refieren al enriquecimiento de células a partir de una preparación de células de la sangre o derivadas de médula ósea, un experto en la técnica reconocerá que técnicas de selección positiva y negativa similares pueden ser aplicadas a preparaciones celulares a partir de otros tejidos.
Ciertos aspectos de la invención se refieren a la expansión in viro de hemangioblastos. En ciertas modalidades, los hemangioblastos expandidos por los métodos de la invención se obtienen a partir de cuerpos embrioides tempranos derivados a partir de células troncales embriónicas humanas como se describe anteriormente. En otras modalidades, los hemangioblastos son aislados o enriquecidos a partir de tejido humano (por ejemplo, placenta o sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea, etc.).
En ciertas modalidades, los hemangioblastos son expandidos en la presencia de una proteína de homeodominio (también referido aquí como una proteína homeobox (homeocaja) ) . En modalidades adicionales, los hemangioblastos son expandidos en la presencia de HOXB4. En ciertas modalidades, HOXB4 se agrega a las células de hemangioblastos a través del método para expandir células de hemangioblastos.
La HOXB4 es un factor de transcripción de homeodominio (también llamado HOX2F, HOX2 , HOX-2.6, y en la HOXA5 de rata) que se expresa in vivo en la fracción de células troncales de la médula ósea y que es subsecuentemente regulado descendentemente durante la diferenciación. La expresión del gen de HOXB4 está asociada con el mantenimiento, de fenotipos de células troncales primitivas (Sauvageau et al. 1995 Genes Dev 9: 1753-1765; Buske et al. 2002 Blood 100: 862-868; Thorsteinsdottir et al. 1999 Blood 94: 2605-2612; Antonchuk et al. 2001 Exp Hematol 29: 1125-1134).
La H0XB4 usada en los métodos de la presente invención para generar y expandir hemangioblastos incluye, pero no se limitan a, H0XB4 de longitud completa (por ejemplo, polipéptidos de HOXB4 especificados por los números de acceso públicos Gl:13273315 (Figura 9), Gl:29351568 (Figura 10) , así como también cualquiera de las variantes funcionales y fragmentos activos de las mismas . La protéína HOXB4 de tipo nativo puede ser. codificada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 1 (Figura 9), SEC ID NO: 3 (Figura 10) o cualquier otra forma alélica alternativa de tales proteínas . Tales secuencias pueden ser accedidas vía bases de datos públicamente disponibles, tales como Genbank. Además, la HOXB4 puede ser ectópicamente expresada dentro de la célula o puede ser proporcionada en el medio. La H0XB4 expresada ectópicamente puede ser operablemente ligada a un promotor inducible, la HOXB4 proporcionada en el medio puede ser excretada por otro tipo de célula (por ejemplo, una capa alimentadora) o agregada directamente al medio.
La presente invención también se refiere a proteínas de fusión que comprenden HOXB4 (que, incluye proteínas de fusión que comprenden H0XB4 de longitud completa, o variantes funcionales de H0XB4 o fragmentos activos de HOXB4) . En adición a HOXB4, esta 'proteína de fusión puede también comprender algunas proteínas adicionales, dominios de proteína o péptidos. En ciertas modalidades, la H0XB4 puede ser unida a un dominio de transducción de proteína (PTD) para permitir la translocación de la proteína a partir del medio en las células y subsecuentemente en compartimientos nucleares. Las proteínas de fusión pueden o no pueden comprender una o más secuencias enlazadoras localizadas entre los dominios de la proteína.
Las variantes funcionales de H0XB4 incluyen mutantes de H0XB4 y variantes alélicas, y fragmentos activos de las mismas. Las variantes funcionales de H0XB4 incluyen algunos polipéptidos de HOXB4 y fragmentos activos de las mismas que son capaces de expandir hemangioblastos de conformidad con los métodos de la presente invención. Las variantes funcionales de HOXB4 también incluyen polipéptidos de HOXB4 que exhiben mayor actividad transcripcipnal comparada con la proteína de HOXB4 nativa. Las variantes de HOXB4 incluyen proteínas con una o más sustitución, adición y/o supresión de aminoácido con relación a una H0XB4 de tipo nativo. Las variantes de HOXB4 también incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que son al menos 75% similares a la secuencia proporcionada en la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3. Por consiguiente, las variantes de HOXB4 incluyen polipéptidos que son 80%, 85%, 90%, 95%, y 99% similares a la secuencia de aminoácido proporcionada en la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3.
Las variantes de H0XB4 también incluyen polipéptidos codificados por secuencias de ácido nucleico que son al menos 80% idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica su complemento (por ejemplo, la proteína de HOXB4 de tipo nativo puede ser codificada por secuencias de ácido nucleico de la SEC ID NO: 3 (Gl : 85376187 ; Figura 7) o SEC ID NO: 4 (Gl : 29351567 ; Figura 8)) . De este modo, las variantes de HOXB4 incluyen polipéptidos de HOXB4 que son codificadas por secuencias de ácido nucleico que son 85%, 90%, 95%, y 99% idénticas a la secuencia proporcionada eri la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4 o complemento de estas.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican HOXB4 también incluyen, pero no se limitan a, algunas secuencias de ácido nucleico que hibridizan bajo condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2 o 4, complemento de esta, o fragmento de la misma. De manera similar, los ácidos nucleicos los cuales difieren de los ácidos nucleicos como se expone en la SEC ID NO: 2 o 4 debido a la degeneración en el código genético también están dentro del alcance de la invención. Los polipéptidos variantes de H0XB4 también incluyen variantes de empalme u otras proteínas de H0XB4 que se originan naturalmente o secuencias de ácido nucleico.
Los fragmentos activos de H0XB4 incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los fragmentos de polipéptidos de H0XB4 de longitud completa que son capaces de mantener hemangioblastos de conformidad con los métodos de la presente invención. Por consiguiente, en una modalidad, una proteína de H0XB4 de la presente invención es una proteína de HQXB4 que carece de parte del N-término, tal como, por ejemplo, . ¡los aminoácidos 31, 32 o 33 N-terminales de H0XB4 de longitud completa.
Cualquiera de las proteínas H0XB4 puede ¡ser fusionada con proteínas adicionales o dominios de proteína. Por ejemplo, la HOXB4 puede ser unida a un dominio, de transducción de proteína (PTD) . ' Los dominios de transducción de proteína, covalentemente o no covalentemente ligados a HOXB4, permiten la translocación de HOXB4 a través de las membranas celulares de manera que la proteína puede finalmente alcanzar¦ los compartimientos nucleares de las células .
Los PTD que pueden ser fusionados con una protéína HOXB4 incluyen el PTD de la proteína de transactivación de VIH (TAT (Tat 47-57) (Schwarze and Dowdy 2000 Trends Pharmacol. Sci. 21: 45-48; rosl efc al. 2003 Nature Medicine (9): 1428-1432). Para la proteína TAT de VIH, la secuencia de aminoácido que confiere actividad de translocación,; de membrana corresponde a los residuos 47-57 (YGR KRRQRRR, SEC ID NO: 5) (Ho et al., 2001, Cáncer Research 61: 473-477; Vives et al., 1997, J. Biol . Chem. 272: 16010-16017). Ésta secuencia sola puede conferir actividad de translocación de proteína. El PTD de TAT también puede ser la secuencia de péptido de nueve aminoácidos RKKRRQRRR (SEC ID NO: 6) (Park et al., Mol Cells 2002 (30) :202-8) . Las secuencias del PTD de TAT pueden ser cualquiera de las secuencias peptídicas descritas en Ho et al., 2001, Cáncer Research 61: 473-477 (la descripción la cual está por este medio incorporada por referencia en la presente) , que incluye YARKARRQARR (SEC ID NO: 7), YARAAARQARA (SEC ID NO : 8), YARAARRAARR (SEC ID NO: 9) y RARAARRAARA (SEC ID NO: 10) .
Otras proteínas que contienen PTD que pueden ser fusionadas a proteínas HOXB4 de la presente invención incluyen el virus simplex del herpes 1 (HSV-1), proteína VP22 de enlace a ADN y el factor de transcripción homeótico Drosophila Antennapedia (Antp) (Schwarze et al., 2000 Trends Cell Biol. (10) : 290-295) . Para. Antp, los aminoácidos 43-58 (RQIKIWFQNRRMKWKK, SEC ID NO: 11) representan el dominio de transduccion de proteína, y para HSV VP22 el PTD es representado por los residuos DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEC ID NO: 12) . Alternativamente, HeptaARG (RRRRRRR, SEC ID NO: 13) o péptidos artificiales que confieren actividad de transduccion pueden ser usados como un PTD de la presente invención.
En modalidades adicionales, el PTD puede ser un péptido de PTD que es duplicado o multimerizado . En ciertas modalidades, el PTD es uno o más del péptido PTD de TAT YARAAARQARA (SEC ID NO: 14). En ciertas modalidades, el PTD es un multímero que consiste de tres de los péptidos PT ; de TAT YARAAARQARA (SEC ID NÓ : 15) . Una proteína HOXB4 que: es fusionada o ligada a un PTD multimérico, tal como, ¦ por ejemplo, un dominio de transducción de proteína sintética triplicado (tPTD) , puede exhibir labilidad y estabilidad incrementada en células . Tal constructo de HOXB4 puede también ser estable en medio libre de suero y en la presencia de células hES .
Las técnicas para elaborar genes de fusión que codifican proteínas de fusión son- bien conocidas en la técnica. , Esencialmente, la unión de varios fragmentos de ;ADN que codifican para diferentes secuencias de polipéptidos se realiza de conformidad con técnicas convencionales. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado :por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores dé ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR 'de fragmentos de gen se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje los cuales dan origen a sobresalientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivo los cuales pueden subsecuentemente ser templados para generar juna secuencia de gen quimérico (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds, Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
En ciertas modalidades, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia poly-(His), puede ser ligada al N-término de' la porción deseada del polipéptido de HOXB4 o proteína de fusión de HOXB4 , permitiendo la proteína de fusión ser purificada por cromatografía de afinidad usando una resina de metal de Ni2+. La secuencia líder de purificación puede entonces ser subsecuentemente removida por tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptidos de H0XB4 purificado (por ejemplo, véase Hochuli et al., (1987) J". Chromatográphy 411:177; y Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
En ciertas modalidades, una proteína HOXB4, o variante funcional o dominio activo de esta, es ligada al C-término o al N-término de una segunda proteína o dominio de proteína (por ejemplo, un PTD) con o sin una secuencia enlazante de intervención. La longitud exacta y secuencia' del enlazador y su orientación con relación a las secuencias ligadas pueden variar. El enlazador puede comprender, por ejemplo, 2, 10, 20, 30, o más amino ácidos y pueden ser seleccionados basados en las propiedades deseadas tales como solubilidad, longitud, separación estérica, etc. En modalidades particulares, el enlazador puede comprender una secuencia funcional útil para la purificación, detección o modificación, por ejemplo, de la proteína de fusión. En ciertas modalidades, el enlazador comprende un polipeptido de dos o más glicinas.
Los dominios de proteína y/o el enlazador por el cual los dominios son fusionados pueden ser modificados para alterar la efectividad, estabilidad y/o características funcionales de HOXB4.
En ciertas modalidades, la H0XB4 es ectópicamente expresada dentro de la célula de hemangioblasto o se proporciona en el medio. La HOXB4 expresada ectópicamente puede ser operablemente ligada a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y son seleccionadas para dirigir la expresión del polipéptido de HOXB .
La H0XB4 proporcionada en el medio puede ser excretada por otro tipo de célula. El otro tipo de célula puede ser' una capa alimentadora, tal como una capa de célula estromal de ratón transducida para expresar HOXB4 excretable. Por ejemplo, la HOXB4 puede ser fusionada a o diseñada por ingeniería para comprender un péptido señal, o una secuencia hidrofóbica que facilita la exportación y secreción de la proteína. Alternativamente, la HOXB4 tal como una proteína de fusión covalentemente o no covalentemente ligada a un PTD, puede ser agregada directamente al medio. Adicionalmente, la H0XB4 puede originarse en un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector adenoviral. Tal vector podría transducir ya sea el hemangioblasto u otras células en su cultivo .
Dependiendo de la proteína HOXB4 usada, en modalidades particulares se agrega HOXB4 al medio a tiempos seleccionados durante la expansión de los hemangioblastos . Debido a que los hemangioblastos son expandidos en medio libre de suero, la HOXB4 es relativamente estable. Por consiguiente, en ciertas modalidades, una proteína HOXB4 o proteína de fusión se agrega cada tercer día a los hemangioblastos humanos. En otras modalidades, una proteína HOXB4 o proteína de fusión se agrega cada tercer día, y en todavía otras modalidades, una proteína HOXB4 o proteína de fusión se agrega cada 2 días. En una modalidad, una proteína de fusión HOXB4 , HOXB4-PTD, se agrega cada 2 días al medio.
En ciertas modalidades, los hemangioblastos pueden ser expandidos en la presencia de algunos otros factores de crecimiento o proteínas que están presentes en una cantidad suficiente para expandir tales células .
Los hemangioblastos obtenidos de cualquier fuente, que incluyen células ES humanas o no humanas, médula ósea, sangre de cordón umbilical o placenta, sangre periférica u otros tejidos pueden ser expandidos de conformidad con los métodos descritos anteriormente. Por consiguiente, en ciertas modalidades, un número seleccionado de hemangioblastos purificados o células enriquecidas son mezclados con medio de metilcelulosa libre de suero optimizado para crecimiento de hemangioblasto (por ejemplo, medio BL-CFU, véase el Ejemplo 1 y 2) . Este medio puede ser suplementado con citocinas de etapa temprana (que incluye pero no se limitan a, EPO, TPO, FL, VGF, BMP2 similar a BMP, BMP4 y BMP7 , pero no BMP3 ) y HOXB4. En ciertas modalidades, se agrega eritropoyetina (EPO) al medio. En ciertas modalidades, EPO, TPO y FL se agregan al medio. Las células son entonces plaqueadas en discos de cultivo de ultra-baja unión y se hacen crecer en una incubadora de C02. Como se mencionó anteriormente, colonias de hemangioblastos exhiben una morfología similar a ;uva distintiva y son comparativamente más pequeñas que otras células y pueden consecuentemente ser distinguidas de otros tipos de células. Los hemangioblastos también pueden ser probados por- marcadores así como también por su capacidad para diferenciarse además en ya sea linajes de células endoteliales o hematopoyéticas . Los hemangioblastos son subsecuentemente aislados y expandidos in vitro.
El medio que puede ser usado para expansión incluye medio de metilcelulosa libre de suero optimizado para crecimiento de hemangioblasto (por ejemplo, BL-CFU) suplementado con citocinas de etapa temprana y H0XB4. Las citocinas de etapa temprana incluyen, pero no se limitan a, EPO, TPO, FL, VEGF, BMP2 similar a BMP, BMP4 y BMP7 , pero no BMP3. En ciertas modalidades, se agrega eritropoyetina (ÉPO) al medio. En modalidades adicionales, se agregan EPO, TPO y FL al medio .
Por consiguiente, un medio para expandir hemangioblastos puede comprender VEGF, SCF, EPO, BMP-4> y HoxB4; en ciertas modalidades el medio puede además comprender TPO y FL. Por ejemplo, células individuales preparadas a partir de EB cultivados por aproximadamente 3.5 días, se- recolectaron y disociaron por 0.05% de tripsina-0.53 mM de EDTA (Invitrogen) por 2-5 min, y se preparó xana suspensión celular única pasando a través de la aguja 22G 3-5 veces. Las células se recolectaron por centrifugación a 1,000 rpm por 5 minutos. Las pelotillas celulares se resuspendi ron en 50-200 µ? de medio Stemline la. Para expandir hemangioblastos, la suspensión celular única derivada dé la diferenciación de 2 a 5 X 105 células hES se mezcló con 2 mi de medio de expansión de hemangioblasto (HGM) que contiene 1.0% de metilcelulosa en MDM de Iscove, 1-2% de albúmina de suero bovino, 0.1 mM de 2-mercaptoetano , 10 pg/ml de rh-Insulina, 200 ug/ml de transíerrina humana saturada de hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF, 3 a 6 unidades /mi de rh-Epo, 50 ng/ml de rh-SCF, 50ng/ml de rh-VEGF y 50 ng/ml de rh-BMP-4, y 1.5 pg/ml de tPTD-HoxB4, con/sin 50 ng/ml de po y FL. Las mezclas celulares se plaquearon en discos ultra-bajos e incubaron a 37°C en 5% de C02 por 4-6 días.
En ciertas situaciones puede ser deseable obtener hemangioblastos a partir de un paciente o relativo al paciente y expandir los hemangioblastos in vitro. Tales situaciones incluyen, por ejemplo, un paciente programado para comenzar quimioterapia o terapia de radiación, u otras situaciones en donde un transplante de HSC autólogo (usando las células troncales propias del paciente), puede ser usádo. De este modo, la presente invención proporciona métodos para tratar pacientes en necesidad de terapia basada por células (por ejemplo, pacientes en necesidad de reconstitución o tratamiento hematopoyético , o crecimiento de vasos sanguíneos o tratamiento de lesiones vasculares que incluyen isquemia, véase posteriormente) usando células de linaje ; de hemangioblastos o hemangioblastos expandidos de la invención, en donde los hemangioblastos se obtienen a partir de la médula ósea, sangre, u otros tejidos del paciente o un paciente relativo. Por consiguiente, en ciertas modalidades, métodos para tratar un paciente en necesidad j de hemangioblastos (o células de linaje de hemangioblastos) pueden comprender una etapa de aislar hemangioblastos de un paciente o un paciente relativo. Los hemangioblastos aislados del paciente o paciente relativo pueden ser expandidos in vitro de conformidad con los métodos de la presente invención y subsecuentemente administrados al paciente.
Alternativamente los hemangioblastos expandidos se pueden hacer crecer además para dar origen a células hematopoyéticas o células endoteliales antes del tratamiento al paciente.
También es posible obtener células ES humanas a partir de tal paciente por cualquier método conocido en la técnica, tal como transferencia nuclear de células somáticas. Los hemangioblastos de tal paciente pueden entonces ser generados y expandidos a partir de sus propias células ES usando un método de esta invención. Estos derivados de linaje o hemangioblastos de los mismos pueden ser . administrados a tal paciente o a sus relativos .
Usando los métodos de la presente invención, los hemangioblastos son expandidos para alcanzar comercialmente grandes cantidades las cuales pueden ser subsecuentemente usadas en varias aplicaciones clínicas y terapéuticas . Además, los hemangioblastos obtenidos por los métodos descritos aquí pueden ser diferenciados además para dar origen a ya sea linajes de células endoteliales o hematopoyéticas para uso en aplicaciones clínicas.
Los hemangioblastos obtenidos a partir del método de esta invención para generar y expandir hemangioblastos humanos a partir de células ES tienen el potencial para diferenciar al menos células endoteliales o células hematopoyéticas (es decir, son al menos bi-potencial ) . Otros hemangioblastos pueden ser bi-potenciales también. Aún otros hemangioblastos pueden ser capaz de diferenciarse en células distintas de células endoteliales y hematopoyéticas, es decir, son multi o pluri-potenciales ) .
Genes MHC diseñados por ingeniería en células troncales embriónicas humanas para obtener hemangioblastos de complejidad reducida Las células troncales embriónicas humanas usadas como el punto de partida por el método para generar y expandir células de hemangioblastos de esta invención, también pueden ser derivadas de una biblioteca de células troncales embriónicas humanas, cada una de las cuales! es hemicigota u homocigota por al menos un alelo de MHC presente en una población humana. En ciertas modalidades, cada miembro de dicha biblioteca de células troncales es hemicigoto u homocigoto para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca. En ciertas modalidades, la biblioteca de células troncales es hemicigota u homocigota por todos los alelos de MHC que están presentes en una población humana. En el contexto de esta invención, células troncales que son homocigotas para uno o más genes de antígeno de histocompatibilidad incluyen células que son nulicigotas para un uno o más de tales genes (y en algunas modalidades, todos). Los nulicigotos para un locus genético significa que el gen es nulo en tal locus, es decir, ambos alelos de tal que son suprimidos o inactivados . Células troncales que son nulicigotas para todos los genes MHC pueden ser producidas por métodos estándares conocidos en el arte, tal como, por ejemplo, gen de objetivo ylo pérdida de heterocigocidad (LOH) . Véase por ejemplo, publicaciones de Patente Estadounidense US 20040091936, US 20030217374 y US 20030232430, y número de solicitud provisional US 60/729,173, las descripciones de todas las cuales están por este medio incorporadas por referencia en la presente.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a métodos para obtener hemangioblastos, que incluyen una biblioteca de hemangioblastos, con complejidad de MHC reducida. Los hemangioblastos y células de linaje de hemangioblastos con complejidad de MHC reducida incrementarán el suministro de células disponibles para aplicaciones terapéuticas ya que eliminarán las dificultades asociadas con la compatibilidad de pacientes. Tales células pueden ser derivadas de células troncales que son diseñadas por ingeniería para ser hemicigotas u homocigotas por genes del complejo MHC.
Una célula ES humana puede comprender modificaciones a uno de los alelos de cromosomas hermanos en el complejo MHC de la célula. Una variedad de métodos para generar modificaciones de gen, tal como objetivo de gen, puede ser usada para modificar los genes en el complejo de MHC. Además, los alelos modificados del complejo MHC en las células pueden ser subsecuentemente diseñados por ingeniería para ser homocigotos ya que alelos idénticos están presentes en cromosomas hermanos . Métodos tales como pérdida de heterocigocidad (LOH) pueden ser utilizados para diseñar células para tener alelos homocigotos en el complejo de MHC. Por ejemplo, uno o más genes en una serie de genes de MHG de un alelo madre pueden ser dirigidos para generar células hemicigotas . La otra serie de genes de MHC puede ser removida por el gen de objetivo o LOH para hacer una línea nula. Ésta línea nula puede ser usada además como la línea de células embriónicas en la cual caen arreglos de los genes HLÁ, o genes individuales, para hacer un banco hemicigoto u homocigoto con un antecedente de otro modo genético uniforme.
En un aspecto, una biblioteca de líneas de célula ES, en donde cada miembro de la biblioteca es homocigoto por al menos un gen HLA, se usa para derivar hemangioblastos de conformidad con los métodos de la presente invención. En otro aspecto, la invención proporciona una biblioteca de hemangioblastos (y/o células de linaje de hemangioblasto) , en donde varias líneas de células ES son seleccionadas y diferenciadas en hemangioblastos. Estos hemangioblastos y/o células de linaje de hemangioblasto pueden ser usadas para un paciente en necesidad de una terapia a base de células.
Por consiguiente, ciertas modalidades de esta invención pertenecen a un método para administrar hemangioblastos humanos, células troncales hematopoyéticas, o células endoteliales humanas que han sido derivadas de células troncales embriónicas de complejidad reducida a un paciente en necesidad del mismo. En ciertas modalidades, éste método comprende las etapas de: (a) identificar un paciente que necesita tratamiento que involucra administrar hemangioblastos humanos, células troncales hematopoyéticas, o células endoteliales humanas a él o ella; (b) identificar proteínas de MHC expresadas en la superficie de las células del paciente; (c) proporcionar una biblioteca de hemangioblastos humanos de complejidad de MHC reducida elaboradas por el método para generar y expandir células de hemangioblastos humanos in vitro de la presente invención; (d) seleccionar las células de hemangioblastos humanos dé la biblioteca que son compatibles con estas proteínas de MHC del paciente en las células de él o ella; (e) opcionalménte diferenciar las células de hemangioblastos humanos identificadas en. la etapa (d) en células troncales hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas, o células que son además diferenciadas en cualquiera o ambos de estos dos linajes, dependiendo de la necesidad; (f) administrar cualquiera de las células a partir de la etapa (d) y/o (e) al paciente. Este método puede ser realizado en centro regional, tal como, por ejemplo, un hospital, una clínica, una oficina del especialista, y otras instalaciones al cuidado de la salud. Además, los hemangioblastos seleccionados como uno compatible para el paciente, si se almacena en números de células pequeñas, pueden ser expandidos previo al tratamiento del paciente.
Células que forman colonias de hemangiomas humanos/hemangioblastos En ciertos aspectos, la presente invención proporciona células que forman colonias de hemangiomas humanos. Estas células son un tipo de célula primitiva, única, con una variedad de usos terapéuticos y otros. Además, este tipo de célula proporciona una herramienta importante para estudiar el desarrollo de al menos los linajes hematopoyéticos y/o endoteliales . Como tal, la invención contempla varias preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden células , :que forman colonias de hemangiomas humanos, así como también preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden uno o más tipos de células parcialmente o terminalmente diferenciadas a partir de células que forman colonias de hemangiomas .
Células que forman colonias de hemangiomas humanos de la presente invención tienen al menos una de las siguientes características estructurales: (a) pueden diferenciarse para dar origen al menos a tipos de células hematopoyéticos o tipos de células endoteliales; (b) pueden diferenciarse para dar origen al menos a tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales;. (c) son poco adheridas entre sí (a otras células que forman colonias de hemangiomas humanos; (d) no expresan la proteína CD34; (e) no expresan la proteína CD31; (f) no expresan la proteína KDR; (g) no expresan la proteína CD13; (h) expresan la proteína GATA2; (i) expresan la proteína LM02. En ciertas modalidades, células que forman colonias de hemangiomas humanos tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, o al menos nueve de las características estructurales o funcionales descritas en la presente.
La invención proporciona células que forman colonias de hemangiomas humanos. Tales células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales, en ciertas modalidades, las células se caracterizan por ser poco adherentes a otras células que forman colonias de hemangiomas humanos . Alternativamente o adicionalmente, estas células también pueden ser descritas basadas en la expresión o carencia de expresión de ciertos marcadores. Por ejemplo, estas células también pueden ser descritas basadas en la carencia de expresión de al menos una de las siguientes proteínas: CD34, KDR, CD133, y CD31.
Como se detalla anteriormente, . una de las propiedades interesantes de células que forman colonias de emangiomas¦ humanos es que son poco adheridas entre sí . Debido a que estas células son solamente poco adherentes entre sí, cultivos o colonias de células que forman colonias de hemangiomas pueden ser disociadas a células individuales usando solamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son suficientemente poco adherentes entre sí que : la disociación mecánica solo, preferentemente disociación enzimática o una combinación de las mismas, es suficiente para desagregar los cultivos o colonias sin deteriorar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza para provocar lesión o muerte celular sustancial.
Esta propiedad no es únicamente útil para describir las células y distinguirlas fenotípicamente de otros tipos de células, pero también tiene implicaciones terapéuticas significantes. Por ejemplo, números relativamente grandes (mayor que lxl-06 o aún mayor que lxlO7 o aún mayor que lOxlO8) de las células que forman colonia de hemangioma se pueden inyectar en humanos u otros animales con sustancialmente menor riesgo de causar coágulos o émbolos, o de otra forma alojarse en el pulmón. Esto es un progreso significante en terapia celular. La capacidad para administrar seguramente números relativamente grandes de células que hace la terapia celular práctica y posible para el tratamiento efectivo de un número incrementado de enfermedades y condiciones .
El término "poco adherente" se describe cualitativamente antes y se refiere al comportamiento de las células que forman colonia de hemangioma humano con respecto a alguna otra. Los cultivos o colonias de células que forman colonia de hemangioma pueden ser disociada a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánicas y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. Las células son suficientemente poco adheridas entre sí que solo la disociación mecánica, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de los mismos, es suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin sustancialmente dañar la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica por lo tanto no requiere mucha fuerza como para causar lesión o muerte celular sustancial.
El término también se- puede describir más cuantitativamente. Por ejemplo y en ciertas modalidades,- el término "poco adherente" se usa para referirse a cultivos o colonias de células que forman colonia de hemangioma en donde al menos 50% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. En otras modalidades, el término se refiere a cultivos en los cuales al menos 60%, 65%, 70% o 75% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. En aún otras modalidades, el término se refiere a cultivos en los cuales al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o aún 100% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática .
La capacidad para disociar las células las células que forman colonia de hemangioma usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática puede ser además cuantificada en base a la salud y viabilidad de las células después de la disociación mecánica. En otras palabras, si la disociación sin las técnicas enzimáticas requiere no tanta fuerza mecánica de forma que un número significante de las células sean dañadas o muertas, las células no son poco adherentes , como se describe en la presente. Por ejemplo y en ciertas modalidades, el término "poco adherente" se refiere a cultivos de células que se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática, sin sustancialmente dañar la salud o viabilidad o las células en comparación al observado cuando las mismas células se disocian usando técnicas de disociación enzimática. Por ejemplo, la salud o viabilidad de las células es disminuidio p menos de 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o aún menos del 1% en comparación al observado cuando un cultivo de las mismas células se disocian usando técnicas de disociación enzimática .
Técnicas de disociación enzimáticas ejemplares incluyen, pero* no se limitan a, tratamiento con tripsina, colagenasa u otras enzimas que rompen las interacciones célula-célula o célula-matriz. Técnicas de disociación mecánica ejemplar incluyen, pero no se limitan a, uno o más pasadas a través de una pipeta.
Células que forman colonia de hemangioma humano de conformidad con la presente invención son definidas estructuralmente o funcionalmente . Estas células puede ser generadas a partir de cualquiera de un número de fuentes que incluyen de tejido embriónico, tejido prenatal, tejido perinatal y aún del tejido de adulto. Por medio de ejemplo, las células que forman colonia de hemangioma humano se pueden generar de células troncales embriónicas humanas, otras células derivadas del embrión (blastocistos , blastómeros, ICMs, embriones, células de trofoblastos/trofectodermo, células troncales de trofoblasto, células germinales primordiales, células germinales embriónicas, etc.), fluido amniótico, células troncales amnióticas, placenta, células troncales de placenta y cordón umbilical .
La invención proporciona células que forman colonia de hemangioma humano, composiciones que comprenden células que forman colonia de hemangioma humano y preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) que comprenden células que forman colonia de hemangioma humano. Ciertas características de estos aspectos de la invención : se describen en detalles a continuación. La invención contempla combinaciones de cualquiera de los siguientes aspectos y modalidades de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona una célula que forma colonia de hemangioma. La célula se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética y/o endotelial. En ciertas modalidades, las células son poco adherentes a otras células que forman colonia de hemangioma humano. En ciertas modalidades, las células no expresan la proteína CD34. En otras ciertas modalidades, las células no expresan uno o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de las siguientes proteínas) de las siguientes proteínas: CD34, CDl, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, las células expresan proteína GATA2 , y/o LM02.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula que forma colonia de hemangioma humana. La célula, la cual se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética y/o endotelial, y la célula no expresa cualquiera de las siguientes proteínas: CD3 , CD31, KE)R y CD133. En ciertas modalidades, la célula es poco adherente a otras células que forman colonia de hemangioma humano. En otras modalidades, la célula no expresa proteína GATA2 y/o LM02.
En otro aspecto, la invención proporciona un cultivo celular que comprende una población sustancialménte purificada de células que forman colonia de hemangioma humano. Las células se pueden diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética y endotelial, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, la célula no expresa proteína CD34. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02.
En otro aspecto, la invención proporciona , un cultivo celular que comprende células que forman colonia de hemangioma humano, diferenciadas de tejido embriónico. E-n ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma son poco adherentes entre sí . En ciertas modalidades, las células se pueden diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética ylo endotelial, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, la célula no expresa proteína CD34. En otras' ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa el menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa proteína GATA2 y/o LM02.
En otro aspecto, la invención proporciona, un cultivo celular que comprende células que forman colonia de hemangioma humano, las células se pueden diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética y/o endotelial. En ciertas modalidades, las células son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, las células no expresan proteína CD34. En otras ciertas modalidades, las células no expresan una o más de (por ejemplo, las célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres o al írtenos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133 KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02.
En otro aspecto, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células que forman colonia de hemangioma humano, estas células se puede diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales . En ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma son poco adhereñtes entre sí. En ciertas modalidades, la célula no expresa proteína CD34. En otras ciertas modalidades, las células no expresan una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa proteína GATA2 y/o LM02. La preparació farmacéutica se puede preparar usando cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células que forman colonia de hemangioma humano, en donde las células que forman colonia de hemangioma no expresan cualquiera de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética y/o endotelial . En ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma son poco adhereñtes entre sí. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos lxlO5 células que forman colonia de hemangioma humano. En ciertas modalidades, de cualquiera de las precedentes, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1x10 , al menos 5xl06, al menos 1x10 o mayor de lxlO7 células que forman colonia de hemangioma humano .
Células, composiciones y preparaciones adicionales incluyen células parcialmente o terminalmente diferenciadas de células que forman colonia de hemangioma humano. Por ejemplo, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipos de células hematopoyética y/o endotelial diferenciadas de una célula que forma colonia de hemangioma. Tipos de células hematopoyéticas ejemplares incluyen células troncales hematopoyéticas, plaquetas, RBCs, linfocitos, megacariocitos y similares. Por medio de ejemplos adicionales, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más de otros tipos de célula, tal como uno o más tipo de célula mesodérmica parcialmente o terminalmente diferenciada, diferenciada de células que forman colonia de hemangioma.
En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes, la invención proporciona una preparación criopreservada de células de colonia de hemangioma humano o células parcialmente o terminalmente diferenciadas de las mismas .
En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes , la invención proporciona el uso terapéutico de células que forman colonia de hemangioma humano o composiciones o preparaciones de células que forman colonia de hemangioma humano . Las células y preparaciones se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de las condiciones o enfermedades detalladas a través de la especificación, así como también en la industria de bancos de sangre. Además, las células diferenciadas de células que forman colonia de hemangioma humano, o composiciones o preparaciones de células que forman colonia de hemangioma humano, se pueden usar terapéuticamente en el tratamiento de cualquiera de las condiciones o enfermedades detalladas a través de la especificación, así como también en la industria de bancos de sangre.
Las células que forman colonia de hemangioma humano de la invención se pueden usar terapéuticamente. Adicionalmente o alternativamente, las células que forman colonia de hemangioma humano se pueden usar para estudiar el desarrollo de linajes endoteliales y hematopoyéticos o en selección de ensayos para identificar factores que se pueden usar, por ejemplo, para (i) mantener células que forman colonia de hemangioma humano o (ii) para promover diferenciación de células que forman colonia de hemangioma humano para uno o más tipos de célula parcialmente o diferencialmente diferenciadas. Además, células que forman colonia de hemangioma humano se pueden usar para generar uno o más tipos de célula parcialmente o terminalmente diferenciadas para uso in vi tro o in vivo.
Las células que forman colonia de hemangioma humano de la invención se pueden usar en cualquiera de los métodos o aplicaciones descritas en la presente solicitud que incluyen, pero no se limitan a, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o condiciones descritas en la presente.
Preparaciones celulares que comprenden hemangioblastos expandidos in vi tro En ciertas modalidades de la presente invención, los hemangioblastos de mamífero (incluyendo humano) se expanden para alcanzar cantidades comerciales y se usan en varias aplicaciones terapéuticas y clínicas. En modalidades particulares, los hemangioblastos se expanden para alcanzar números de células en el orden de 10,000 hasta 4 millones (o más) . Estos números de células se pueden alcanzar dentro de los 3-4 días del comienzo de las preparaciones iniciales. Por lo tanto, la presente invención se refiere a preparaciones que comprenden números grandes de hemangioblastos, las preparaciones que comprenden al menos 10,000, 50,000, 100,000, 500,000 un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células. ': Esta invención también proporciona una solución, una composición y una preparación que comprende grandes números de menagioblastos, la solución, la composición y la preparación comprenden al menos 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones: de células . Los hemangioblastos pueden ser humanos .
Otro aspecto de la presente' invención se refiere a la diferenciación de hemangioblastos obtenidos por . los métodos descritos en la presente en ya sea linaje de célula hematopoyética o endotelial, o en ambos, que son subsecuentemente usadas en aplicaciones clínicas. De ésta forma, la presente invención también se refiere1 a preparaciones celulares que comprenden grandes números de células hematopoyéticas o endoteliales . La invención también se refiere a diferenciación de hemangioblastos obtenidos por los métodos descritos en la presente en otros, linajes celulares, diferentes a células hematopoyética o endotelial. De esta forma, la presente invención también se refiere a preparaciones celulares que comprenden grandes números [ de otras células derivadas de hemangioblastos.
Las composiciones y preparaciones que comprenden grandes números (por ejemplo, miles o millones) de hemangioblastos se puede obtener expandiendo hemangioblastos que se obtienen como se describe anteriormente. Por lo tanto, la invención pertenece a composiciones y preparaciones que comprenden grandes números de hemangioblastos logrado por expansión de células ES (tal como células ES humanas) o hemangioblastos obtenidos de sangre del cordón umbilical o médula ósea. Además, los métodos de expansión se pueden aplicar a hemangioblastos de origen de ratón, rata, bovino o primates no humanos, por ejemplo, la presente invención también se refiere a composiciones y preparaciones que comprenden grandes números de hemangioblastos de otras especies además a los humanos . Los hemangioblastos a ser expandidos por los métodos de esta invención pueden ser bi-potenciales, es decir, se pueden diferenciar en ya sea células endoteliales o células troncales hematopoyéticas . En ciertas modalidades, los hemangioblastos humanos generadas y expandidos de células ES humanas son bi-potenciales . Las células que forman colonia de hemangioma son capaces de diferenciación para dar lugar a al menos tipos de célula hematopoyética o tipos de célula endotelial. Células que forman colonia de hemangioma son preferiblemente · bi-potenciales y capaces de diferenciación para dar lugar a al menos tipos de célula hematopoyética y tipos de célula endotelial. Tal como, células que forman colonia de hemangioma de la presente invención son al menos üni- potenciales, y preferiblemente bi-potenciales . Adicionalmente sin embargo, las células que forman colonia de hemangioma pueden tener un mayor grado de desarrollo potencial y pueden, en ciertas modalidades, diferenciarse para dar lugar a tipos de células de otros linajes. En ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma son capaces de diferenciarse para dar lugar a derivados mesodérmicos tal como células cardiacas (por ejemplo, cardiomiocitos (y/o células del músculo liso.
Marcadores de célula hemangioblasto de mamífero Como se describe anteriormente, las células que forman colonia de hemangioma carecen de ciertos aspectos característicos de células endoteliales o hematopoyéticas maduras. Estas células que forman colonia de hemangioma o hemangioblastos , sin embargo se pueden identificar por varios marcadores tal como, por ejemplo, proteínas CD71+, GATA-1 y GATA-2 , CXCR-4 y TPO, y receptores EPO. En modalidades adicionales, los hemangioblastos expresan LMQ2. Los hemagioblastos pueden adicionalmente ser caracterizados por la ausencia o expresión baja de otros marcadores. Por lo tanto, los hemangioblastos pueden ser CD34-CD31-, y KCR- . En modalidades adicionales, los hemangioblastos pueden ser CD34, CD31, KDR y CD133.
Por lo tanto, en ciertas modalidades, los hemangioblastos generados y expandidos por los métodos de la presente invención se caracterizan por la presencia o ausencia de cualquiera de uno o más marcadores listados erl la Tabla 2 de WO2007/120811, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Por ejemplo, los hemangioblastos pueden ser prueba negativa para expresión de cualquiera de uno o más de los marcadores listados en la Tabla 2 qué, se denota como "_" bajo "BL_CFC" . Por lo tanto, en algunas modalidades, los hemangioblastos pueden ser negativos para expresión CD34. Las células pueden adicionalmenté: o alternativamente ser negativos para expresión CD31, CD133 y/o KDR. En modalidades adicionales, los hemangioblastos pueden expresar cualquiera de los marcadores denotados en la Tabla 2 con "+" . Por ejemplo, las células pueden expresar uno o más de los marcadores MLO-2 y GATA-2. La expresión de un marcador puede ser valorado por cualquier método, tal como, por ejemplo, inmunohistoquímica o inmunomanchado para prueba para expresión de proteína, o análisis ARNm para prueba para expresión del nivel AR .
Células de linaje hemangioblasto de derivación Los métodos y preparaciones celulares de la presente invención también se refieren a células derivadas de hemangioblasto. Los hemangioblastos generados y expandidos por esta invención y hemangioblastos expandidos por los métodos de la invención pueden ser diferenciados in vitro para obtener células hematopoyéticas (que incluyen células troncales hematopoyéticas (HSCs) ) o células endoteliales, ' jasí como células que diferenciados adicionalmente en estos dos linajes. Estas células pueden subsecuentemente ser usadas en las aplicaciones terapéuticas y comerciales como se describe posteriormente .
En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas se derivan del crecimiento de hemangioblastos en BL-VFU libre de suero por 3-10 días. En otras modalidades, suspensiones de célula única de células BL-CFC derivadas de hES se hacen crecer por 10-14 días. Mantener las condiciones libres de suero es óptimo en la medida que las condiciones libre de suero facilitan la producción a gran escala y cumplimiento con la guía reguladora así como reducir el costo. Los hemangioblastos de la presente invención también se puede hacer crecer en cultivo Hem libre de suero (Bhatia et al. 1997 J Exp Med (186) : 619-624), el cual sostiene células troncales hematopoyéticas humanas y comprende BSA (por ejemplo, BSA al 1%), insulina (por ejemplo, 5 ug/ml-. de insulina humana) , medio de transferrina o transferrina (por ejemplo, 100 µg/ml de transferrina humana) , L-glutamina, beta-mercaptoétanol (por ejemplo, 10~4 M) y factores de crecimiento . Los factores de crecimiento pueden comprender SCF (por ejemplo, 300 ng/ml) , factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF) (por ejemplo, 50 ng/ml), Fit-3 (por ejemplo, 300 ng/ml) , IL-3 (por ejemplo, 10 ng/ml) y IL-6 (por ejemplo, 10 ng/ml) . Otros factores útiles para obtener células hematopoyéticas de hemangioblastos incluyen trombopoyetina (TPO) y VEGF (véase, por ejemplo, Wang et al., 2005 Ann NY Acad Sci (1044) : 29-40) y BMP-4. Los hemangioblastos se pueden también hacer crecer en medio de metilcelulosa libre de suero suplementado con un coctel: de factor de crecimiento hematopoyético de multilinaje. De esta forma, los hemangioblastos se pueden hacer crecer en metilcelulosa en medio Dulbecco modificado con Iscove (IMDM) que comprende BSA, transferrina humana saturada, LDL humano, suplementado con factores de crecimiento que actúa primero (por ejemplo, ligando c-kit, ligando fit3), factores de crecimiento de multilinaje (por ejemplo, IL-3 , granulocito, macrófago-CSF (GM-CSF) ) , y factores de crecimiento unilinaje (por ejemplo, G-CSF, M-CSF, EPO, TPO)), VEGF y bFGF . Alternativamente, los hemangioblastos se pueden hacer crecer en medio que comprende factores de crecimiento unilinaje para soportar el crecimiento de un tipo de célula hematopoyétiica (por ejemplo, glóbulos rojos, macrófagas o granulocitos) .
En una modalidad, las colonias de hemangioblastos se resuspenden en medio Stemline I. Las células entonces se mezclan con 1 mi de medio CFU hematopoyético libre de suero (H4436, Stem Cell Technologies™) más 1.5 g/ml de tPTD-HoxB4 y 0.5% de EX-Cyte (Serological Proteins Inc . ) . Las mezclas celulares entonces se colocan en placas sin tratar de cultivos celulares y se incuban a 37 aC por 10-14 días después que colocación inicial se pueda caracterizar morfológicamente, tal como por teñido con tinte Wright-Giemsa.
Las ¦ células hematopoyéticas también se pueden derivar del hemangioblasto usando otras condiciones conocidas en la técnica (por ejemplo, en medio que comprende IMD , 30% de suero de ternero fetal al 30% (FCS) , albúmina de suero de bovino al 1% (BSA) , beta-mercaptoetanol 10"4 M y 2 mM de L-glutamina) . Además, en otras modalidades se puede usar el factor de crecimiento de fibroblasto básico para promover tanto la frecuencia BL-CFC con EBs como promover la diferenciación hematopoyética (Faloon et al., 2000 Development (127): 1931-1942). En aún otras modalidades,: se usa la hemangiopoyetina del factor de crecimiento (HAPO) para promover el crecimiento y diferenciación hematopoyética de los hemangioblastos (Liu et al., 2004 Blood (103): 4449-4456). La diferenciación en células hematopoyéticas se puede valorar por estado CD45 (CD45+) y en ensayo CFU, por ejemplo.
Para formar células hematopoyéticas, se pueden hacer crecer los hemangioblastos humanos por 3-10 días, u opcionalmente por periodos prolongados de tiempo (por ejemplo, 10-14 días) en medio CFU. Los hemangioblastos humanos de la presente invención son capaces de formar GFUs que comprenden granulocitos , eritrocitos, macrófagos y megacariocitos (CFU-GEMM/mezcla) así como unidades que forman colonia que contienen únicamente uno de los tipos celulares últimos (por ejemplo, CFU-G, CFU-E, CFU-M y CFU-GM) . En ciertas modalidades, suspensiones celulares únicas de células BL-CFC derivadas de hES se hacen crecer por 10-14 días para derivar células hematopoyéticas tales como, por ejemplo, células eritroide, mieloide, macrófagas y hematopoyéticas multilinaje.
Otro aspecto de la invención se refiere a células endoteliales derivadas de los hemangioblastos humanos obtenidos y expandidos o hemangioblastos de mamífero expandidos por los métodos descritos en la presente. Los hemangioblastos se pueden hacer crecer en condiciones favorables para maduración endotelial .
En ciertas modalidades de la presente invención, para obtener células endoteliales, los hemangioblastos son primero colocados en una superficie recubierta de fibronectina y después de 3-5 días (o en otras modalidades 3-7 días) , se colocan nuevamente en una paca espesa de Matrigel para soportar la diferenciación en células endoteliales. Estas condiciones mantienen las condiciones libres de suero establecidas durante el desarrollo de hemangioblastos. Alternativamente, los hemangioblastos se pueden hacer crecer en medio conocido para soportar la diferenciación en células endoteliales . Tales condiciones incluyen, por ejemplo, cultivo Endo que comprende 20% de suero de bovino f tal (FBS) , 50 ng/ml de suplemento de crecimiento celular endotelial (es decir, extractos pituitarios) , 10 IU/ml de heparina y 5 ng/ml de VEGF-Ai65 humano (Terramani et al., 2000 In vitro Cell Dev Biol Anim (36) : 125-132) . Otras condiciones conocidas en la técnica incluyen medio suplementado con ;25% de suero FCH/caballo, y en algunas modalidades heparina (por ejemplo, 10 U/ml) , insulina similar al factor de crecimiento (IGFl) (por e emplo, 2 ng) , y suplemento de crecimiento; EC (ECGS, por ejemplo 100 µg) . Los factores de crecimiento VEGF y EGF también se pueden usar en combinación con HAPO para soportar la diferenciación endotelial (Liu et al., 2004). ;Los hemangioblastos también se pueden sembrar en discos recubiertos con colágeno y fibronectina, por ejemplo, ¡para promover la diferenciación en células endoteliales. ''Las células se pueden analizar por el factor von Willebrand (yWF) y sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) y la capacidad para formar una red endotelial in vitro. ¦ Por lo tanto, para formar células endoteliales,' las colonias de hemangioblasto derivados por los métodos descritos anteriormente se eligen y reemplazan en placas del cultivo recubiertas por fibronectina optimizadas por ¡ la primera etapa hacia la diferenciación endotelial. Las células se pueden colocar en medio completo EGM-2 o EGM-2MV (Cambrex™) . Después de 3 a 5 días, y en modalidades alternativas de 3 a 7 días, las células se colocan nuevamente en una superficie que soporta la diferenciación endotelial, tal como en una capa de Matrigel . Después de 16-24 horas de incubación, la formación de cordones umbilicales de tubos ramificados sugiere el comportamiento endotelial típico. Los ensayos endoteliales específicos tal como absorción LDL también se pueden usar para confirmar que estas células son endoteliales naturales.
En otros aspectos de la invención, los hemangioblastos . humanos generados y expandidos por esta invención y hemangioblastos de mamífero expandidos por los métodos de la invención pueden ser diferenciados in vi tro para obtener otras células, así como también células que son además diferenciadas de estos linajes celulares. Los linajes de célula adicionales pueden ser derivados de los hemangioblastos generados y expandidos por esta invención y los hemangioblastos de mamífero expandidos por los métodos de la invención porgue las células de hemangioblastos pueden tener un grado aún mayor de potencial de desarrollo más allá de la diferenciación en células hematopoyéticas y endoteliales.
Células de hemangioma sin injertar La presente invención proporciona una población de célula nueva que comparte algunas características de hemangioblastos y de células que forman colonia de hemangioma previamente identificados. Sin embargo, la ' nueva población de célula descrita en la presente es distinta en que no se injerta en la médula ósea cuando se administra a animales inmunodeficientes . Esta nueva población de célula progenitora es útil para el estudio de desarrollo básico y biología de célula troncal, es útil para generar tipo de célula parcialmente o terminalmente diferenciada in vi tro e in vivo, y es útil para el desarrollo de terapéuticos. Adicionalmente, estas células se pueden usar en la selección de ensayos para identificar, por ejemplo, (i) factores o condiciones que promueven la expansión de células de hemangioma sin injertar y (ii) factores o condiciones que promueven la generación de uno o más tipo de célula diferenciada de células de hemangioma sin injertar. Se pueden usar factores1 y condiciones identificadas en la producción de terapias a base de célula y libres de célula, en la producción de medios y formulaciones, y en el estudio del desarrollo y biología de célula troncal Revisión General presente invención proporciona células hemangioma sin injertar, composiciones y preparaciones que comprenden células de hemangioma sin injertar, métodos para producir y expandir células de hemangioma sin injertar, métodos para producir tipos de célula diferenciadas a partir de células de hemangioma sin injertar, y métodos para usar células de hemangioma sin injertar y células derivadas de estas terapéuticamente.
Los métodos descritos en la presente se pueden usar para generar células de hemangioma sin injertar. Sin embargo, las células se pueden obtener de otras especies que incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, vacas, perros, gatos, ovejas, cerdos y primates no humanos.
Esta invención proporciona un método para expandir células de hemangioma sin injertar de mamífero obtenidas de cualquier fuente, que incluyen células ES, blastocitos o blastómeros, sangre del cordón umbilical de la placenta o tejido umbilical, sangre periférica, médula ósea u otro tejido o por cualquier medio conocido en la técnica. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar se generan de células troncales embriónicas u otras células troncales pluripotentes . Por medio de ejemplo, las células de hemangioma humano sin injertar se pueden generar de células troncales embriónicas, así como de células iPS.: En otras modalidades, las células de hemangioma sin injertar se generan de células derivadas de embrión humano. Las células derivadas del embrión humano pueden ser una población sustancialmente homogénea de células, una población heterogénea de células, o todo o una porción de un tejido embriónico. Como un ejemplo de células derivadas del embrión que se pueden usar en los métodos de la presente invención, se pueden generar células de hemangioma humano sin injertar a partir de células troncales embriónicas humanas . Las células troncales embriónicas incluyen células troncales embriónicas derivadas de o usando, por ejemplo, blastocistos , ICMs en placa, uno o más blastorneros, u otras porciones de un embrión en etapa de pre-implantación o estructura similar al embrión, independiente de si se produce por fertilización, transferencia nuclear de célula somática (SC T) , partogénesis , androgénesis u otros medios sexual o asexual. En ciertas modalidades, las células, de hemangioma sin injertar se generan de células troncales pluripotentes. Células troncales pluripotentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células troncales embriónicas y células iPS. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar se generan de células no pluripotentes.
Las células no pluripotentes pueden incluir células somáticas, tales como células derivadas de la piel, hueso, sangre, tejido conectivo, corazón, riñon, pulmón o cualquier otro órgano interno. En ciertas modalidades, las células no pluripotentes pueden ser células derivadas del tejido conectivo, tales como fibroblastos. En ciertas modalidades, las ' células no pluripotentes son células derivadas de un tejido adulto.
En ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar pueden ser además diferenciadas a tipos de células troncales hematopoyéticas y/o células hematopoyéticas que incluyen, pero no se limitan a, plaquetas y glóbulos rojos. Estas células se pueden usar en transfusiones ó en otras terapias . A pesar que las células tienen numerosos usos, un uso particularmente importante puede ser en la mejora de la disponibilidad de sangre para transfusiones. En ciertas modalidades, la invención proporciona glóbulos rojos diferenciados de células de hemangioma sin injertar. , Los glóbulos rojos diferenciados se pueden usar para transfusiones.
Aspectos adicionales de la invención se refiere a métodos para generar células hematopoyéticas diferenciadas de células de hemangioma sin injertar para uso en transfusiones de sangre para aquellos en necesidad de la misma. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas diferenciadas son transfundidas para tratar trauma, pérdida de sangre durante cirugía, enfermedades de la sangre tales como anemia, anemia de la célula falciforme, o enfermedades hemolíticas, o enfermedades malignas. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos son transfundidos para tratar, pérdida de sangre durante la cirugía, o enfermedades de la sangre tal como anemia, anemia de célula falciforme, o enfermedades hemolíticas. En ciertas modalidades, se transfunde una población mezclada de glóbulos rojos. Se debe notar ! que muchos tipos de célula hematopoyéticas diferenciadas, particularmente glóbulos rojos, típicamente existen in vivo como una población mezclada. Específicamente, se encuentran glóbulos rojos que circulan de niveles variados de edad y diferenciación in vivo. Adicionalmente, los glóbulos rojos maduran con el tiempo de forma que expresan menos hemoglobina fetal y más hemoglobina de adulto. La presente invención contempla transfusiones de ya sea poblaciones purificadas de glóbulos rojos o de una población mezclada de glóbulos rojos que tiene niveles variados de edad y niveles j de diferenciación. En modalidades particulares, la invención contempla transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal (hemoglobina F) . La transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal puede ser especialmente útil en el tratamiento de anemia de célula falciforme.! La capacidad para generar grandes números de células para transfusión puede aliviar falta crónica de sangre experimentada en bancos de sangre y hospitales a través del país.
En ciertas modalidades, los métodos de la invención permiten .la. producción de células universales ara transfusión. Específicamente, los glóbulos rojos que son del ' tipo 0 y Rh pueden ser fácilmente generados y pueden servir como una fuente de sangre universal para transfusión., i En ciertas modalidades, los glóbulos rojos producidos a partir de los métodos de la solicitud son funcionales . En ciertas modalidades, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F aiites de la transfusión. En ciertas modalidades, los glóbulos rójos portan oxígeno. En ciertas modalidades, los glóbulos rtíjos tienen una duración de vida igual a los glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen una duración de vida que es 75% que la de. los glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen una duración de vida que es 50% que la los glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen : una duración de vida que es 25% que la de los glóbulos rójos derivados naturalmente . <¦ En ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar pueden tener un potencial desarrollo mayor, y se puede diferenciar para producir tipos de célula endotelial, tipos de célula del músculo liso o tipos de célula cardiaca.
Los métodos de esta invención permiten la expansión in vi tro de células de hemangioma sin injertar a grandes cantidades útiles para una variedad de aplicaciones comerciales y clínicas. La expansión de células de hemangioma sin injertar in vitro se refiere a la proliferación de células de hemangioma sin injertar. Mientras los métodos de la invención permite la expansión de células de hemangioma humano sin injertar para alcanzar cantidades comercialmente útiles, la presente invención también se refiere a grandes números de células de hemangioma sin injertar y! a preparaciones celulares que comprenden grandes números, de células de hemangioma humano sin injertar (por ejemplo,, al menos 10,000, 100,000 o 500,000 células). En ciertas modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 1 X 106 células. En otras modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 2 X 106 células de hemangioma i humano sin injertar y en modalidades adicionales al menos' ¡3 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. En aún otras modalidades, las preparaciones celulares comprenden al menos 4 X 106 células de hemangioma humano sin injertar. Se ilota que estas preparaciones celulares pueden ser purificadas o sustancialmente purificadas. Sin embargo, en ciertas modalidades, las preparaciones celulares adecuadas comprenden una mezcla de células de hemangioma sin injertar y células que forman colonia de hemangioma. La mezcla puede 'ser cualquier proporción, que incluyen mezclas que comprende una proporción mayor de células de hemangioma sin injertar y mezclas que comprenden una proporción mayor de células que forman colonia de hemangioma.
La presente invención se refiere a una solución, una preparación o una composición que comprende entre 10; 000 y 4 millones o más de células de hemangioma sin injertar de mamífero (tal como humano). El número de células de hemangioma sin injertar en la solución, una preparación y una composición pueden ser cualquier número entre el intervalo de 10,000 hasta 4 millones o más. Este número puede ser, por ejemplo 20, 000, 50,000, 100,000, 500,000, 1 millón, etc.
Similarmente, la invención se refiere a preparaciones de células progenitoras de hemangioma sin injertar (por ejemplo, células hematopoyéticas humanas que incluyen células troncales hematopoyéticas humanas) . La invención además se refiere a métodos para producir, almacenar y distribuir células de hemangioma sin injertar y/o descendencia de la célula de hemangioma sin injertar.
La invención también proporciona métodos y soluciones adecuadas para transfusión en pacientes humanos y animales. En modalidades particulares, la invención proporciona métodos para elaborar glóbulos rojos y/o plaquetas, y/u otros tipos de célula hematopoyética para transfusión. En ciertas modalidades, la invención es adecuada para uso en bancos de sangre y hospitales para proporcionar sangre para transfusión después del trauma, o en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la sangre. En ciertas modalidades, la invención proporciona glóbulos rojos que son células del donador universales. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos son funcionales y expresan hemoglobina F antes de la transfusión.
La invención también proporciona células de hemangioma humano sin injertar, cultivos celulares que comprenden una población sustancialmente purificada de células de hemangioma humano sin injertar, preparaciones farmacéuticas que comprenden células de hemangioma humano sin injertar y preparaciones criopreservadas de las células de hemangioma sin injertar. En ciertas modalidades, la invención proporciona el uso de células de hemangioma humano sin injertar en la manufactura de un medicamento para tratar .una condición en un paciente en necesidad del mismo. Alternativamente, la invención proporciona el uso de los cultivos celulares en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo. La invención también proporciona el uso de preparaciones farmacéuticas en la manufactura de un medicamento para tratar una condición en un paciente en necesidad del mismo.
Las células de hemangioma sin injertar se pueden identificar y caracterizar en base a sus propiedades estructurales y/o propiedades de función. Estas células progenitoras no se injertan cuando se administran a hospederos inmunodeficientes . En ciertas modalidades, estas células son únicas porgue son únicamente poco adherentes entre sí (poco adherentes a otras células de hemangioma sin injertar) . En modalidades en las cuales las células son poco adherentes, los cultivos o colonias de células de hemangioma sin injertar pueden¦ ser disociadas a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. En ciertas modalidades, las células son suficientemente poco adherentes entre sí que la disociación mecánica sola, en lugar de disociación enzimática o una combinación de disociación mecánica o enzimática es suficiente para disgregar ;los cultivos o colonias sin sustancialmente dañar la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere de mucha fuerza como para causar lesión celular sustancial o muerte cuando se compara al subsecuente observado para disociación enzimática de agregados celulares .
En ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar pueden además ser identificadas y caracterizadas en base a la expresión o carencia de expresión (como se valora en el nivel del gen o el nivel de la proteína) de uno o más marcadores. En ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar tienen una o más de las características de células que forma colonia de hemangioma humano. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar se pueden identificar y caracterizar en base a la carencia de expresión de uno o más (por ejemplo, las células, se pueden caracterizar en base a la carencia de expresión de al menos uno, al menos dos, al menos tres ó al menos cuatro de los siguientes marcadores) de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, KDR, CD133 0 CD31. Adicionalmente o alternativamente, las células de hemangioma sin injertar se pueden identificar o caracterizar en base a la expresión de GATA2 y/o LM02.
Células de hemangioma humano sin injertar En ciertos aspectos, la presente invención proporciona células de hemangioma humano sin injertar. Estas células son únicas, tipo célula primitiva con una variedad de usos terapéuticos y otros. Además, este tipo de célula proporciona una herramienta importante para estudiar el desarrollo de al menos los linajes hematopoyéticos . Como tal, la invención contempla varias preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden células de hemangioma humano sin injertar, así como preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden uno o más de tipos de célula parcialmente o terminalmente diferenciadas a ' partir de células de hemangioma sin injertar. Sin estar unidas por cualquier teoría particular, estas células representan una población de célula troncal distinta, un poco más comprometida (que las células que forman colonia de hemangioma) que retiene la capacidad para generar numerosos tipos de célula hematopoyética .
Células de hemangioma sin injertar de la presente invención se pueden identificar o caracterizar en basé a ;una o cualquier combinación de las características estructurales o funcionales descritas para células que forman colonia de hemangioma. Nótese que a pesar que estas células se pueden derivar de cualquiera de un número de fuentes, por ejemplo, tejido embriónico, tejido prenatal o tejido perinatal,, el término "células de hemangioma sin injertar" aplica a células, independiente de la fuente, que no se injertan y que son capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos un tipo de célula hematopoyética, y opcionalmente tiene uno o más de las propiedades estructurales o funcionales precedentes .
Para ilustrar, las células de hemangioma humano sin injertar de la presente invención no se injertan cuando se administran a un hospedero inmunodeficiente y tienen al menos una de las siguientes características estructurales: (a) se pueden diferenciar para dar lugar a al menos un tipo de célula hematopoyética; (b) se pueden diferenciar para dar lugar a al menos tipos de célula hematopoyética y tipos de célula endotelial; (c) son poco adherentes entre sí (a otras células de hemangioma sin injertar) ; (d) no expresan proteína CD34; (e) no expresan proteína CD31; (f) no expresan proteína KDR; (g) no expresan proteína CD133; (h) expresan -protéína GATA2; (i) expresan proteína LM02. En ciertas modalidades, las células de hemangioma humano sin injertar tienen al menos dos, al. menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve de las características estructurales o funcionales detallas en la presente.
Como se detalla anteriormente, una de las propiedades de interés de las células de hemangioma humano sin injertar son poco adherentes entre sí. Debido a que estas células son únicamente poco adherentes entre sí, cultivos o colonias de células de hemangioma sin injertar se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas ', de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. Las células son suficientemente poco adherentes entre sí que sola la disociación mecánica,, en lugar de disociación enzimática o una combinación de las mismas, es suficiente para separar los cultivos o colonias sin sustancialmente dañar la viabilidad de las células ÷: En otras palabras, la disociación mecánica no requiere de ésta forma mucha fuerza para provocar lesión o muerte celular sustancial .
Esta propiedad no es únicamente útil para describir las células y distinguirlas fenotípicamente de otros tipos de célula, pero también tiene implicaciones terapéuticas significantes. Por ejemplo, números relativamente grandes (mayor que lxlO6 o aún mayor que 1 xlO7 o aún mayor que lxlO8) de las células de hemangioma sin injertar que se pueden inyectar en humanos u otros animales con sustancialmente menos riesgo de provocar coágulos o embolia, o de otra forma alojarse en el pulmón. Esta es una ventaja significante en terapia celular. La capacidad para seguramente administrar números relativamente grandes de células para hacer terapia celular práctica y posible para el tratamiento efectivo de un número incrementado de enfermedades y condiciones.
El término "poco adherentes" se describe cualitativamente anteriormente y se refiere al comportamiento de las células de hemangioma humano sin injertar con respecto de otras. Cultivos o colonias de células de hemangioma sin injertar se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. Las células son suficientemente poco adherentes entre sí, que la disociación mecánica sola, en lugar de disociación enzimática o una combinación de las mismas, es suficiente para separar los cultivos o colonias sin sustancialmente dañar la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere de esta forma mucha fuerza para provocar lesión o muerte celular sustancial.
El término también se puede describir más cuantitativamente. Por ejemplo y en ciertas modalidades, el término "poco adherentes" se usa para referirse a cultivos o colonias de células de hemangioma sin injertar en donde; al menos 50% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas usando únicamente las técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. En otras modalidades, el término se refiere a cultivos en los cuales al menos 60%, 65%, 70%, o 75% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas i usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática. En aún otras modalidades, el término se refiere a cultivos en los cuales al menos 80%,' 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o aún 100% de las células en el cultivo se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática .
La capacidad para disociar Las células de hemangioma sin injertar usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática puede ser además cuantificada en base a la salud y viabilidad de las células después de la disociación mecánica. En otras palabras, si la disociación sin técnicas enzimáticas requiere de esta forma mucha fuerza mecánica para que un número significante de las células sean dañadas o muertas, las células son poco adherentes, como se definen en la presente. Por ejemplo y en ciertas modalidades, el término "poco adherentes" se refiere a cultivos de células que se pueden disociar a células únicas usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin la necesidad para técnicas de disociación enzimática, sin sustancialmente dañar la salud o viabilidad o las células en comparación a lo observado cuando las mismas células son disociadas usando técnicas de disociación enzimática. Por ejemplo, la salujd o viabilidad de las células se incrementa por menos que 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o aún menos que 1 % en comparación a lo observado cuando un cultivo de las mismas células son disociadas usando técnicas de disociación enzimática.
Técnicas ejemplares de . disociación enzimática incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con tripsina, colagenasa, u otras enzimas que interrumpen interacciones célula-célula o célula-matriz. Técnicas ejemplares de disociación mecánica incluyen, pero no se limitan a, una o más pasadas a través de una pipeta. Las células de hemangioma humano sin injertar de conformidad con la presente invención se definen estructuralmente y funcionalmente . Las células; se pueden generar de cualquiera de un número de fuentes que incluyen de tejido embriónico, tejido prenatal, tejido perinatal, y aún de tejido de adulto. Por medio de ejemplo, las células de hemangioma humano sin injertar se pueden generar de células troncales embriónicas humanas, otras células derivadas del embrión (blastocistos , blastómeros, ICMs, embriones, células de trofoblastos/trofectodermo, células troncales de trofoblasto, células germinales primordiales, células germinales embriónicas, etc.), fluido amniótico, células troncales amnióticas, placenta, células troncales de la placenta, y cordón umbilical. Más generalmente, células de hemangioma sin injertar se pu den generar de células pluripotentes, tal como células troncales embriónicas o células troncales pluripotentes. Células troncales pluripotentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células troncales embriónicas y células troncales pluripotentes inducidas (células iPS) . Células de hemangioma humano sin injertar también se pueden generar de células no pluripotentes, tal como células somáticas, que incluyen pero no se limitan a, células derivadas de piel, hueso, sangre, tejido conectivo, corazón, riñon, pulmón, hígado, o cualquier otro órgano interno. En ciertas modalidades, las células no pluripotentes pueden ser células derivadas de tejido conectivo, tal como fibroblastos. En ciertas modalidades,, las células no pluripotentes son células derivadas de un tejido de adulto. La invención proporciona células de hemangioma sin injertar (tal como células humanas) , composiciones que comprende células de hemangioma humano sin injertar, y preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) que comprende células de hemangioma humano sin injertar. Ciertas características de estos aspectos de la invención ; se describen en detalle posteriormente. La invención contempla combinaciones de cualquiera de los siguientes aspectos y modalidades de la invención, así como también combinaciones con las descripciones proporcionadas en Solicitud Estadounidense Nó. de serie 11/787,262, la cual se incorpora por referencia en su totalidad.
Como se detalla anteriormente, células que forman colonia de hemangioma y/o células de hemangioma sin injertar se pueden producir a partir de una variedad de células que incluye, pero no se limita a, células pluripotentes (células troncales embriónicas, células derivadas del embrión,, y células troncales pluripotentes inducidas) .
En un aspecto, la invención proporciona a células de hemangioma sin injertar (tal como células humanas) . La célula se puede diferenciar para producir al menos un tipo de célula hematopoyéticas . En ciertas modalidades, la célula es poco adherente a otras células de hemangioma humano sin injertar. En ciertas modalidades, la célula no expresa Proteína CD34. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. En otras ciertas modalidades, la célula comparte una o más de una (2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales; o estructurales de células que forman colonia de hemangioma humano . j En otro aspecto, la invención proporciona , un cultivo celular que comprende una población sustancialm nte purificada de células de hemangioma sin injertar (tal domo células humanas) . Las células se pueden diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética . En ciertas modalidades, las células son poco adherentes entre sí.! En ciertas modalidades, la célula no expresa Proteína CD34 En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. En otras ciertas modalidades, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de células . que forman colonia de hemangioma humano.
En otro aspecto, la invención proporciona;! un cultivo celular que comprende células de hemangioma sin injertar diferenciados de tejido embriónico . En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo celular que comprende células de hemangioma sin injertar diferenciadas de células pluripotentes (células troncales pluripotentes) . En ciertas modalidades, Las células de hemangioma sin injertar son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, .¡las células se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, la célula no expresa proteína CD34. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. En otras ciertas modalidades, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de células que forman colonia de hemangioma humano .
En otro aspecto la invención proporciona un cultivo celular que comprende células de hemangioma humano sin injertar, estas células se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética. En ciertas modalidades, las células son poco adherentes entre sí, en ciertas modalidades, la célula no expresa Proteína CD34. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos uno, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. En otras ciertas modalidades, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de células que forman colonia de hemangioma humano, en otro aspecto, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células de hemangioma humano sin injertar, estas células se puede diferenciar para producir al menos tipos de célula hematopoyética . En ciertas modalidades, las células de hemangioma sin injertar son poco adherentes entre sí. En ciertas modalidades, la célula no expresa proteína CD34. En otras ciertas modalidades, la célula no expresa una o más de (por ejemplo, la célula no expresa al menos uno, al menos dos, al menos, tres, o al menos cuatro de las siguientes proteínas) las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En otras ciertas modalidades, la célula expresa proteína GATA2 y/o LM02. En otras ciertas modalidades, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, l,' 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de células que forman colonia de hemangioma humano. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende células de hemangioma humano sin injertar. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades , de cualquiera de las precedentes, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos lxlO5 células de hemangioma humano sin injertar. En otra cierta modalidad, de cualquiera-de las precedentes, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1x106, al menos 5x105, al menos lxlO7, o mayor que lxlO7 células de hemangioma humano sin injertar, En ciertas modalidades, la preparación es una preparación purificada o sustancialmente purificada. En otras modalidades, la preparación comprende una mezcla de células de hemangioma sin injertar y otros tipos de célula. Por ejemplo, una mezcla de células de hemangioma sin injertar y células que forman colonia de hemangioma.
Células, composiciones, y preparaciones adicionales incluyen células parcialmente o terminalmente diferenciadas a partir de células de hemangioma humano sin injertar. Por ejemplo, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipo de célula hematopoyética y/o endotelial diferenciados a partir de células de hemangioma sin injertar. Tipos ejemplares de célula hematopoyética incluyen células troncales hematopoyéticas , plaquetas, RBCs, linfocitos, megacariocitos , y similares. Por medio de ejemplos adicionales, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más de otro tipo de célula, tal como uno o más tipos de célula mesodermal parcialmente o terminalmente diferenciados, diferenciados a partir de células de hemangioma sin injertar.
En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes, la invención proporciona a preparación criopreservada de células de hemangioma humano sin injertar o células parcialmente o terminalmente diferenciados de estas.
En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes, la invención proporciona el uso terapéutico de células de hemangioma humano sin injertar, o composiciones o preparaciones de células de hemangioma humano sin injertar. Las células y preparaciones se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de las condiciones o enfermedades detalladas a través de la especificación, así como también en la industria de banco de sangre. Además, células diferenciadas a partir de células de hemangioma humano sin injertar, o composiciones o preparaciones de células de hemangioma humano sin injertar, se pueden usar terapéuticamente en el tratamiento de cualquiera de las condiciones o enfermedades detalladas a través de la especificación.
Las células de hemangioma humano sin injertar de la invención se pueden usar terapéuticamente. Adicionalmente o alternativamente, células de hemangioma humano sin injertar se pueden usar para estudiar el desarrollo de linajes endoteliales y hematopoyéticos o en ensayos de selección para identificar factores que se pueden usar, por ejemplo, para (i) mantener células de hemangioma humano sin injertar o (ii) para promover diferenciación de células de hemangioma humano sin injertar a uno o más tipos de célula parcialmente o terminalmente diferenciadas. Además, células de hemangioma humano sin injertar se pueden usar para generar uno o más tipos de células parcialmente o terminalmente diferenciadas para uso in vi tro o in vivo.
Las células de hemangioma humano sin injertar de la invención se pueden usar en cualquiera de los métodos o aplicaciones descritas en la presente solicitud que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o condiciones descritas en la presente. Enfermedades y condiciones ejemplares se discuten adicionalmente en la Solicitud Estadounidense con numera de serie 11/787,262, la cual se incorpora por referencia en su totalidad. Además, células que forman colonia de hemangioma humano y células de hemangioma sin injertar se pueden usar para producir tipos de célula hematopoyética diferenciadas, que incluyen glóbulos rojos diferenciados.
Preparaciones celulares que comprenden hemangioblastos expandidos in vitro En ciertas modalidades de la presente invención, células de hemangioma sin injertar mamífero (que incluye human) son expandidas para alcanzar cantidades comerciales y se usan en varias aplicaciones terapéuticas y clínicas. En modalidades particulares, las células de hemangioma sin injertar son expandidas para alcanzar números de células en el orden de 10,000 hasta 4 millones (o más). Este número de células pueden ser alcanzadas dentro de los 3-4 días del comienzo de las preparaciones iniciales. Por lo tanto, la presente invención se refiere a preparaciones que comprenden grandes números de células de hemangioma sin injertar, las preparaciones que comprenden al menos ??, ??, 50,000, 100,000, 500,000, un millón, 2 millones, 3 millones p 4 millones de células.
Esta invención también proporciona una solución, una composición, y una preparación que comprende grandes números de células de hemangioma sin injertar, la solución, la composición, y la preparación comprenden al menos 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células. Las células de hemangioma sin injertar pueden ser humanas. Las soluciones pueden ser purificadas, sustancialmente purificadas, o mezcladas con otros tipos: de células progenitoras que incluye, pero no se limita a células que forman colonia de hemangioma.
Otros aspectos de' la presente invención se refieren a diferenciación de las células de hemangioma sin injertar obtenidas por los métodos descritos en la presente en linajes de célula hematopoyética o endotelial, o ambas, |que subsecuentemente se usan en aplicaciones clínicas. De esta forma, la presente invención también se refiere: a 1 i preparaciones celulares que comprenden grandes números¦ de tipos de células parcialmente o terminalmente diferenciadas.
Composiciones y preparaciones que comprende grarides números (por ejemplo, miles o millones) de células1 i de hemangioma sin injertar pueden ser obtenidas expandiendo células de hemangioma sin injertar que se obtienen como' se describe anteriormente. Por lo tanto, la invención pertenece a composiciones y preparaciones que comprenden grandes números de células de hemangioma sin injertar obtenidas expandiendo células ES (tal como células ES humanas)! ' o células de hemangioma sin injertar obtenidas de sangre del cordón umbilical, sangre periférica o médula ósea. Además, los métodos de expansión pueden ser aplicados a células de hemangioma sin injertar de ratón, rata, bovino, o de origen : i primate no humano, por ejemplo, la presente invención también se refiere a composiciones y preparaciones , |que comprenden grandes números de células de hemangioma sin injertar de otras especies además de humanas. Las células de hemangioma sin injertar a ser expandidas por los métodos de esta invención pueden ser bi-potenciales, es decir, se pueden diferenciar en cualquiera de células endoteliales o células troncales hematopoyéticas . En ciertas modalidades, Las células de hemangioma humano sin injertar generadas y expandidas a partir de células ES humanas son bi-potenciales. Las células de hemangioma sin injertar son capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de célula hematopoyética . Células de hemangioma sin injertar son,' en ciertas modalidades, bi-potenciales y capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de célula hematopoyética y tipos de célula endotelial . Como tales, las células de hemangioma sin injertar de la presente invención son al menos uni-potenciales , y pueden ser bi-potenciales. Adicionalmente sin embargo, Las células de hemangioma sin injertar pueden tener un grado mayor de potencial de desarrollo y pueden, en ciertas modalidades, diferenciarse para dar lugar a tipos de célula de otros linajes. En ciertas modalidades, Las células de hemangioma sin injertar son capaces de diferenciarse para dar lugar a otros derivados mesodermales tales como células cardiacas (por ejemplo, cardiomiocitos ) y/o células del músculo liso.
Además, las células de hemangioma sin injertar se pueden usar en ensayos de selección para identificar agentes que, por ejemplo, (i) promueven la diferenciación de las células a uno o más tipo de célula hematopoyética o (ii) promueven la proliferación y/o supervivencia de las células para facilitar el almacenaje y banco de células. Las células de hemangioma sin injertar también se pueden usar para estudiar biología experimental básica o se pueden comparar a células que forman colonia de hemangioma para determinar las diferencias experimentales entre las dos poblaciones de células troncales relacionadas.
Modalidades clínicas y comerciales de hemangioblastos humanos, células de hemangioma sin injertar, células., de linaje de hemangioblasto y células de linaje de hemangioma sin injertar Terapias a base de célula Mientras las células de hemangioblastos humanos y células de hemangioma sin injertar tienen el potencial para diferenciarse in vivo en cualquiera de las células hematopoyéticas o endoteliales , se pueden usar en tratamientos a base de célula en los cuales cualquiera de estos dos tipos de célula se necesitan o pueden mejorar el tratamiento. Además, un paciente pueden ser tratado con cualquier terapia o tratamiento que comprende células de linaje de hemangioblasto o/y células de linaje de hemangioma sin injertar (es decir, células hematopoyéticas y/o células endoteliales) . La siguiente sección describe métodos para usar los hemangioblastos y células de hemangioma humano sin injertar de esta invención generadas y expandidas por los métodos de esta invención, o expandidas por los métodos de esta invención.
En ciertas modalidades de la presente invención, se contemplan tratamientos para incrementar o tratar células hematopoyéticas y tratamientos para incrementar el crecimiento de vasos sanguíneos y/o facilitar reparar vasos sanguíneos. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar un paciente en necesidad de células hematopoyéticas o el crecimiento o reparación de vasos sanguíneos . Los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar pueden ser inyectadas en el vaso sanguíneo de un sujeto o ser administrado al vaso sanguíneo de un sujeto a través de operación. El paciente o el sujeto pueden ser humano.
En ciertas modalidades de la presente invención, las células de hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar se usan en transplante, donde el transplante HSC puede ser de otra forma usado. El transplante puede ser usado, por ejemplo, en reconstitución hematopoyética para el tratamiento de pacientes con leucemia aguda o crónica, anemia aplástica y varios síndromes de inmunodeficiencia, así como también varias malignidades no hematológicas y trastornos auto-inmunes, y para rescatar pacientes de aplasia inducida por tratamiento después de quimioterapia y/o radioterapia de alta dosis. El transplante pueden ser llevado a cabo in vivo o ex vivo (tal como en transplante de médula ósea) . En otras modalidades de la invención, las células de hemangioblastós o células de hemangioma humano sin injertar se usan para tratar pacientes en necesidad de reconstitución hematopoyéticá o tratamiento hematopoyético . Estos pacientes incluyen, por ejemplo, pacientes con talasemias, anemia de célula falciforme, anemia aplástica (también llamada anemia hipoplástica) , citopenia, hipoplasia espinal, deficiencia de plaquetas, malignidades hematopoyéticas tales como leucemias, hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH) , y ADA (por ejemplo, deficiencia de desaminasa (ADA) severa combinada con inmunodeficiencia . (SCID) ) .
Particular modalidades de la presente invención por lo tanto se refieren a métodos para tratar un paciente en necesidad de reconstitución hematopoyéticá o tratamiento hematopoyético usando los hemangioblastós de la invención. Por lo tanto, la invención se refiere a métodos para tratar un paciente en necesidad de reconstitución hematopoyéticá o tratamiento que comprende seleccionar un paciente en necesidad del mismo, generar y expandir o expandir hemangioblastós o células de hemangioma humano sin injertar de conformidad con los métodos de la presente invención, y administrar los hemangioblastós o las células de hemangioma humano sin injertar en el paciente. Alternativamente, el método puede comprender diferenciar los hemangioblastos generados y expandidos o humanos expandidos o células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas humanas y subsecuentemente administrar las células hematopoyéticas al paciente .
Modalidades alternativas incluyen métodos en los cuales hemangioblastos o células de hemangioma humano ,sin injertar se producen a gran escala y se almacenan antes de la selección de un paciente en necesidad del mismo. De esta forma, otras modalidades de la invención se refieren a métodos para tratar un paciente en necesidad ' de reconstitución hematopoyética o tratamiento que comprende seleccionar un. paciente en necesidad del mismo, realizar una orden para hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar ya aisladas y expandidas de conformidad con los métodos descritos anteriormente, y administrar los hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar al paciente. Del mismo modo, el método puede comprender diferenciación de hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar en células hematopoyéticas humanas y administrar las células hematopoyéticas al paciente. ; En modalidades adicionales, se hacen crecer hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar hemicigotos u homocigotos por al menos un alelo MHC, opcionalmente se hacen crecer para cantidades comerciales , y opcionalmente almacenar por una entidad comercial. Cuando un paciente presenta una necesidad para las células, células de linaje de hemangioblasto o células de linaje de hemangioma sin injertar, un médico u hospital puede hacer un pedido con las empresas para las células .
Debido a que las células de hemangioblastos y células de hemangioma humano sin injertar de la invención pueden proliferar y diferenciarse en células endoteliales bajo un microambiente angiogénico, las células ' de hemangioblastos humanos pueden ser usadas en una manera terapéutica para proporcionar nuevos vasos sanguíneos o para inducir reparación de vasos sanguíneos dañados en un sitio de lesión en un paciente. De esta forma en ciertos aspectos, la presente invención se refiere a métodos para promover nuevo crecimiento vasos sanguíneos o reparación de vasculatura lesionada. Los hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar de la presente invención pueden ser usados para tratar lesión endotelial, tal como infarto al miocardio, apoplejía y cerebro isquémico, miembros isquémicos y heridas en la piel que incluye miembros isquémicos y heridas que ocurren en animales o pacientes diabéticos, y lesión por reperfusión isquémica en la retina. Otras condiciones isquémicas que pueden ser tratadas con los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar de la presente invención incluyen isquemia renal, isquemia pulmonar, y cardiomiopatia isquémica. Hemangioblastos pueden también ser usados para ayudar a reparar vasos sanguíneos lesionados después dé la angioplastia de balón o despliegue de una endoprótesis vascular. Los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar pueden adicionalmente ser usados en injerto de tejido, cirugía y después de lesión por radiación. Además, los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar pueden ser usados para tratar y/o prevenir el progresó de ateroesclerosis así como también para reparar daño en células endoteliales que ocurre en esclerosis sistémica y fenómeno de Raynaud (RP) (Blann et al. 1993 J Rheumatol (20) : 1325-30).
Por lo tanto, la invención proporciona varios métodos involucrados para proporcionar el crecimiento o reparación de vasos sanguíneos a un paciente en necesidad del mismo. En una modalidad, la invención proporciona un mé odo para inducir formación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido isquémico en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la preparación purificada de las células de hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar descritas anteriormente para inducir formación de vasos sanguíneos nuevos en el tejido isquémico. De esta forma ciertos aspectos de la presente invención proporciona un método para intensificar la formación de vaso sanguíneo en un paciente en necesidad del mismo, que comprende seleccionar el paciente en necesidad del mismo, aislar las células de hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar como se describe anteriormente, y administrar las células de hemangioblasto o células de hemangioma sin injertar al paciente. En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un vaso sanguíneo lesionado en un paciente en necesidad del mismo, que comprende seleccionar al paciente en necesidad del mismo, expandir o generar y expandir ¡las células de hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar como se describe anteriormente, y administrar las células de hemangioblasto o células de hemangioma sin injertar al paciente. Además a las modalidades antes mencionadas, los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar pueden ser producidas a gran escala y se almacenan antes de la selección del paciente en necesidad de hemangioblastos. En modalidades adicionales, se hacen crecer hemangioblastos hemicigotos u homocigotos por al menos un alelo MHC, opcionalmente se hacen crecer para cantidades comerciales, y opcionalmente se almacenan antes de que un paciente se seleccione para tratamiento de hemangioblasto o célula de hemangioma sin injertar. Cualquiera de los hemangioblastos antes mencionados, las células de hemangioma sin injertar, o preparaciones celulares de estas células pueden ser administradas directamente en la circulación (intravenosamente) . En ciertas modalidades (por ejemplo, en donde la reparación vascular es necesaria en el ojo, tal como en el tratamiento de lesión isquémica/por reperfusión ai la retina) , las células de hemangioblasto, células de hemangioma sin injertar, o preparaciones celulares de estas células pueden ser administradas por inyección intra-v trea.
La administración de las soluciones o preparaciones de hemangioblastos , células de hemangioma sin injertar, y células derivadas del mismo puede ser lograda por cualquier ruta y puede ser determinada en una base de caso por caso. También, una cantidad efectiva a ser administrada de estas soluciones o preparaciones de hemangioblastos o células derivadas del mismo es una cantidad que es terapéuticamente efectiva y puede ser determinada en una base de caso por caso.
En aspectos adicionales, células de linaje: de hemangioblasto o células de linaje de hemangioma sin injertar se usan en aplicaciones terapéuticas, que incluyen en el tratamiento las indicaciones descritas anteriormente, por ejemplo. Por lo tanto, hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar generadas y expandidas o expandidas por los métodos descritos en la presente son diferenciadas; in vitro primero para obtener células hematopoyéticas y/o endoteliales , y después para obtener células que son además diferenciadas en estos dos linajes. Estas células pueden ser subsecuentemente administradas a un sujeto o paciente para tratar condiciones hematopoyéticas o para reconstitución hematopoyética, o para el tratamiento de lesión isquémica o, vascular, por ejemplo.
Derivadas HSCs de los hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar obtenidas por los métodos descritos en la presente, se hacen crecer adicionalmente para expandir los HSCs y/o para derivar otro tipo de célula de linaje hematopoyético . Ciertos aspectos de la presente invención se refieren al uso de derivados HSCs de los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar en transplante. En modalidades adicionales, células hematopoyéticas diferenciadas (tal como, por ejemplo, granulocitos , eritrocitos, células mieloide, megacariocitos , plaquetas, macrófagos, células mástil y neutrófilos ( iles and eller 1991 Development (111): 259)) se usan en varios tratamientos tal como terapia de transfusión o para el tratamiento de infecciones. Por lo tanto, otras modalidades de la presente invención se refieren a métodos para tratar un paciente en necesidad de reconstitución hematopoyética o tratamiento usando los HSCs o células de linaje hématopoyéticos derivadas de hemangioblastos de la invención.
En ciertos aspectos, por lo tanto, la presente invención se refiere a métodos para tratar un paciente en necesidad de células hematopoyéticas o tratamiento que comprende seleccionar un paciente en necesidad del mismo, expandir o aislar y expandir hemangioblastos o células de hemangioma humano sin injertar de conformidad con los métodos de la presente invención, diferenciación de las células de hemangioblasto o células de hemangioma sin injertar , en células troncales hematopoyéticas y/o células hematopoyéticas maduras, y administrar las células hematopoyéticas al paciente .
En otros aspectos de la invención, los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar se hacen crecer para dar lugar a células endoteliales de conformidad con los métodos descritos en la presente. La endotelial puede subsecuentemente ser usada para proporcionar nuevos vasos sanguíneos o para inducir reparación de vasos sanguíneos dañados en un sitio de lesión en un paciente. De esta forma en ciertos aspectos, la presente invención se refiere a métodos para promover nuevo crecimiento de vasos sanguíneos o reparar vasculatura lesionada en los cuales las células endoteliales derivadas de hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar se usan como una terapia. Las células endoteliales pueden ser usadas para tratar lesión endotelial, tal como infarto al miocardio e isquemia pulmonar, apoplejía y cerebro isquémico, miembros isquémicos y heridas en la piel que incluye miembros isquémicos y heridas que ocurren en animales o pacientes diabéticos, lesión por reperfusión isquémica en la retina, isquemia renal. Las células endoteliales pueden también ser usadas para ayudar a reparar vasos sanguíneos lesionados después de angioplastia de balón o despliegue de una endoprotesis vascular así como también en injerto, cirugía y después de lesión por radiación. Además, las células endoteliales pueden ser usadas para tratar y/o prevenir el progreso de ateroesclerosis así como- también para reparar daño en células endoteliales que ocurre en esclerosis sistémica y fenómeno de Raynaud. La célula endotelial pueden ser además diferenciada y aquellas células, como las apropiadas, pueden ser usadas para tratar una o más de las enfermedades o condiciones de "célula endotelial, tal como aquellas listadas en el párrafo precedente.
Por lo tanto, ciertos aspectos de la invención se refieren a · métodos para tratar un paciente con lesión endotelial o vascular o en necesidad del crecimiento o reparación de vasos sanguíneos que comprende seleccionar un paciente en necesidad del mismo, expandir o aislar y expandir hemangioblastos o célula de hemangioma humano sin injertar de conformidad con los métodos de la presente invención, diferenciación de las células de hemangioblasto o células de hemangioma sin injertar en células endoteliales,1 y administrar las células endoteliales al paciente.
Banco de Sangre Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para producir células hematopoyéticas adecuadas; para transfusión. A pesar de que las células y métodos tiénen numerosos usos, un uso particularmente importante puede; 'ser en mejorar la disponibilidad de sangre para transfusiones. En ciertas modalidades preferidas, la invención proporciona glóbulos rojos diferenciados de hemangioblastos /unidades que forman colonia de emangioma o células de hemangioma · !sin injertar. Los glóbulos rojos diferenciados pueden ser usados para transfusiones.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a métodos para generar células hematopoyéticas diferenciadas a partir de hemangioblastos /unidades que forman colonia: de hemangioma o células de hemangioma sin injertar para usó; en transfusiones de sangre para aquellos en necesidad dé i la misma. En ciertas modalidades, células hematopoyéticas diferenciadas son transfundidas para tratar trauma, pérdida de sangre durante la cirugía, enfermedades de la sangre. tal como anemia, anemia de célula falciforme, o enfermedades hemolíticas, o enfermedades malignas. En ciertas modalidades, glóbulos rojos son transfundidos para tratar trauma, pérdida de sangre durante la cirugía, o enfermedades de la sangre ital como anemia, anemia de célula falciforme, o enfermedad hemolítica. En ciertas modalidades, las plaquetas son transfundidas para tratar trastornos de plaqueta congénitos o enfermedades malignas. En ciertas modalidades, una población mezclada de glóbulos rojos y plaquetas son transfundidas.
Se notará que muchos tipos de célula hematopoyética diferenciadas, particularmente glóbulos rojos, típicamente existen in vivo como una población mezclada. Específicamente, glóbulos rojos que circulan de niveles variados de edad y diferenciación se encuentran in vivo. Adicionalmente, los glóbulos rojos maduran después de un tiempo de forma que expresan menos hemoglobina fetal y más hemoglobina de adulto. La presente invención contempla transfusión de ya sea poblaciones purificadas de glóbulos rojos o de una población mezclada de glóbulos rojos que tiene niveles variados de edad y niveles de diferenciación. En modalidades particulares, la invención contempla transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal (hemoglobina F) . Esta invención proporciona un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células que forman colonia de hemangioma humano y células de hemangioma sin injertar in vitro, el método comprende las etapas de; (a) proporcionar células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar; y b) diferenciación de las células que forman colonia ' de hemangioma o células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas.
Esta invención también proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que son diferenciadas in vitro a partir de células que forman colonia de hemangioma humano o células1 de hemangioma sin injertar, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar; (b) diferenciación de las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas. Esta invención también proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que se han diferenciado in vitro a partir de células que forman colonia de hemangioma humano , el método comprende las etapas de : (a) cultivar un cultivo celular que comprende células humanas troncales embriónicas en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de las células troncales embriónicas en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento1 al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar el cultivo del cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar en el cultivo de cuerpos embrioides ; (c) diferenciación de las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (d) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas modalidades, las células troncales, cuerpos embrioides y que forman colonia de hemangioma se hacen crecer en medio libre de suero a través de etapas (¾) y (b) del método.
Esta invención también proporciona un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que se han diferenciado in vitro a partir de células que forman colonia de hemangioma humano, el método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células humanas troncales pluripotentes en medio, libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de las células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar el cultivo del cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar en el cultivo de cuerpos embrioides; i (c) desagregar los cuerpos embrioides en células I únicas; !j (d) agregar al menos un factor de crecimiento; al cultivo que comprende las células únicas y continuar j el cultivo del cultivo en medio libre de suero, en donde ¡ el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar en el cultivo ique comprende las células únicas; ; (e) diferenciación de las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y ; (f) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas. En ciertas modalidades, las células troncales pluripotentes , cuerpos embrioides, células que forman colonia de hemangioma, células de hemangioma sin injertar y células únicas se hacen crecer en medio libre de suero a través de etapas (a) -(d) 'del método. En ciertas modalidades, la célula troncal pluripotente es una célula troncal embriónica. , 1 En ciertas modalidades, el factor de crecimiento' es una proteína que comprende una proteína homeobox (homeocaja) , o una variante funcional o un fragmento activo del mismo.: En ciertas modalidades, la proteína homeobox comprende ^una I proteína H0XB4, o una variante funcional o un fragmento activo del mismo. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas diferenciadas se producen como un tipo de célula única tal como glóbulos rojos, plaquetas, y fagocitos. Nótese, sin embargo, que cuando se produce un tipo de célula única, el tipo de célula puede ser heterogénea en términos del nivel de madurez o diferenciación del tipo de célula particular. Por medio de ejemplo, los glóbulos rcjjos diferenciados pueden ser heterogéneos en términos de nivel de madurez y edad celular. Sin estar unidas por teoría, 1 la heterogeneidad de las células eritrocíticas puede ser benéfica debido a que imita la forma en la cual los glóbulos rojos se encuentran in vivo.
En ciertas modalidades, los tipos de célula única se mezclan para igualar la proporción de tipos de célula diferenciadas que se encuentran en la sangre. En ciertas modalidades, tipos de célula hematopoyética diferenciadas múltiples se producen en la misma etapa. En ciertas modalidades, el fagocito se selecciona de; granulocitos , neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfoci.tos o monocitos. En ciertas modalidades, los tipos de célula hematopoyética se producen en una proporción aproximadamente igual a : la proporción de tipos de célula hematopoyética diferenciadas encontradas en la sangre, 96% de glóbulos rojos, 1% de plaquetas, y 3% de fagocitos. En ciertas modalidades, se agrega plasma a las células- hematopoyéticas diferenciadas antes de la transfusión. En ciertas modalidades, células empaquetadas, por ejemplo glóbulos rojos empaquetados, son transfundidas en la ausencia o ausencia sustancial de plasma.
En ciertas modalidades, las células hematopoyétiiCas diferenciadas producidas a partir de los métodos de ! la solicitud son funcionales. En ciertas modalidades, las plaquetas producidas a partir de los métodos de la solicitud son funcionales. En ciertas modalidades, los fagocitos producidos a partir de los métodos de la solicitud son funcionales. En ciertas modalidades, los glóbulos róíjos producidos a partir de los métodos de la solicitud son funcionales. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F antes de la transfusión. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos portan oxígeno. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen una duración de vida i igual a glóbulos rojos naturalmente derivados. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen una duración de ida que es 75% de la de glóbulos rojos naturalmente derivados.; En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tienen una duración de vida que es 50% de la de glóbulos rojos naturalmente derivados. En ciertas modalidades, los glóbulos rojos tiénen una duración de vida que es 25% de la de glóbulos rojos naturalmente derivados. En ciertas modalidades, los métodos de la solicitud producen 1 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 2 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 3 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 4 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas' modalidades, se producen 5 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 6 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 7 x 106 células por plato de 100. mm. En ciertas modalidades,, se producen 8 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 9 x 106 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 1 x 107 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 5 x 107 células por plato de 100 mm. En ciertas modalidades, se producen 1 x 108 células por plato de 100 mm.
En ciertas modalidades, la etapa de diferenciación se realiza usando condiciones conocidas a un experto en la técnica como se discute anteriormente. En ciertas modalidades, la etapa de diferenciación se realiza usando métodos específicos para diferenciar células en glóbulos rojos (véase WO2005/118780 , incorporada en la presente para referencia) . En ciertas modalidades, la etapa de diferenciación se realiza usando métodos específicos para diferenciar células en plaquetas. En ciertas modalidades, la etapa de diferenciación se realiza usando métodos específicos para diferenciar células en leucocitos.
Agentes de diferenciación los cuales se pueden usar de conformidad con la presente invención incluyen citocinas tal como alfa A interferona, alfa A/D, interferona beta interferona, gamma interferona, proteína-10 inducible por gamma interferona, interleucina-1 , interleuciná-2 , interleucina-3 , interleucina-4 , interleucina-5 , interleucina-6, interleucina-7 , interleucina-8 , interleuciná-9 , interleucina-10 , interleucina-1, interleucina-12 , interleucina-13 , interleucina-15 , interleucina-17 , factor de crecimiento de queratinocito, leptina, factor inhibidor de leucemia, factor que estimula la colonia de macrófago, y proteína-1 alfa inflamatoria de macrófago.
Agentes de diferenciación de conformidad con la invención también incluyen factores de crecimiento tales como 6Ckine (recombinante) , activina A, Alfa A-interferona, alfa-interferona, anfiregulina, angiogenina, factor de crecimiento célula B endotelial, beta celulina, interferona B, factor neurotrófico derivado del cerebro, CIO (recombinante), cardiotrofina-1 , factor neurotrófico ciliar, quimioatrayente-1 neutrófilo inducido por citocina, suplemento del crecimiento de célula endotelial, eotaxina, factor de crecimiento epidermal, péptido-78 que activa neutrófilo epitelial, eritropoyetina, receptor alfa de estrógeno, receptor-B de estrógeno, factor de crecimiento fibroblasto (heparina acídica/básica, estabilizada, recombinante) , ligando FLT-3 /FLK-2 (ligando FLT-3), gamma-interferona, factor neurotrófico derivado de linea de célula glial, Gly-Hys-Lys, factor que estimula la colonia de granulocito, factor que estimula la colonia de macrófago' de granulocito, alfa GRO/MGSA, GRO-B, gamma GRO, HCC-1, epidermal factor de crecimiento unido a heparina similar factor de crecimiento, factor de crecimiento hepatocito, álfa heregulina (dominio EGF) , proteína-1 enlazada al factor de crecimiento de insulina, complejo proteína-1 /tGF-1 enlazado factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento II similar a insulina, factor de crecimiento nervio 2.5S (NGF) , 7S-NGF, proteína-1 B inflamatoria de macrófago, proteína-2 inflamatoria de macrófago, proteína-3 alfa inflamatoria; de macrófago, proteína-3B inflamatoria de macrófago, proteína-1 quimiotáctica de monocito, proteína-2 quimiotáctica de monocito, proteína-3 quimiotáctica de monocito, neurotrofina-3, neurotrofina-4 , NGF-B (recombinante humano o rata), oncostatina M (recombinante humano o ratón) , extracto pituitario, factor de crecimiento de placenta, factor de crecimiento célula endotelial derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta, pleyotrofina, rant.es, factor de célula troncal, factor que estimula el crecimiento de la célula factor 1 B/pre-B derivado de la célula estrorrial, trombopoyetina, factor de crecimiento alfa de transformación, factor de crecimiento-Bl de transformación, factor : ¡ de crecimiento-B2 de transformación, factor de crecimiento-B3 de transformación, factor de crecimiento-B5 de transformación, factor de necrosis del tumor (alfa y B) , y factor ; de crecimiento endotelial vascular.
Agentes de diferenciación de conformidad co ' la invención también incluyen hormonas y antagonista de hormona, tal como estradioll7B, hormona adrenocorticotrópica, adrenomeduilina, hormona de estimulación alfa-melanocito, gonadotropina coriónica, globulina enlazada a corticoesteroide, corticoestireno, dexametasona, estriol, hormona de estimulación del folículo, gastrina 1, glucagona, gonadotropina, hidrocortisona, insulina, proteína enlazada' al factor de crecimiento similar a insulina, L-3,3',:5'-triyodotironina, L-3 , 3 ' , 5-triyodotironine, leptina, hormona luteinizante, L-tiroxina, melatonina, MZ-4, oxitocina, hormona paratiroidea, PEC-60, hormona de crecimiento pituitario, progesterona, prolactina, secretina, globulina enlazada a hormona sexual, hormona de estimulación tiroidea, factor que libera tirotropina, globulina enlazada a tiroxina, y vasopresina . .' : Además, agentes de diferenciación de conformidad con la invención incluyen > componentes de matriz extracelular tal como fibronectina, fragmentos proteolíticos de fibronectina, laminina, tromboespondina, agrecano, y sindezan.
Agentes de diferenciación de conformidad con la invención también incluyen anticuerpos para factores variados, tal como anticuerpo del receptor lipoproteína antibaja densidad, receptor anti-progesterona, anticuerpo interno, anticuerpo cadena 2 del receptor anti-alfa interferona, anticuerpo del receptor 1 anti-c-c quimiocina, anticuerpo anti-CD 118, anticuerpo anti-CD 119, anticuerpo del factor-1 de estimulación anti-colonia, anticuerpo ariti-receptor CSF-l/c-aletas, anticuerpo del factor de crecimiento (AB-3) anti-epidermal , anticuerpo del receptor de facto de crecimiento anti-epidermal, receptor del factor de crecimiento anti-epidermal, anticuerpo fosfo-específico, anticuerpo factor de crecimiento (A8-1) anti-epidermal, anticuerpo receptor anti-eritropoyetiná, anticuerpo receptor anti-estrógeno, receptor anti-estrógeno, anticuerpo C-terminal, anticuerpo receptor-B anti-estrógeno, anticuerpo receptor factor de crecimiento anti-fibroblasto, factor de crecimiento anti- fibroblasto, anticuerpo básico, anticuerpo cadena del receptor anti-gamma-interferona, anticuerpo recombinante humano anti-gamma-interferona, anticuerpo C-terminal alfa-1 anti-GFR, anticuerpo . C-terminal alfa-2 anti- GFR, anticuerpo del factor que estimula la colonia anti-granulocito (AB-1) , anticuerpo .del receptor de factor que estimula la colonia de ánti-granulocito, anticuerpo del receptor anti-insulina, anticuerpo del receptor de factor de crecimiento-1 similar a anti-insulina, anticuerpo recombinante anti-interleucina-6 humano, anticuerpo recómbinante humano anti-interleucina-1 , anticuerpo recombinante humano anti-interleucina-2 , anticuerpo recombinante de ratón anti-leptina, anticuerpo del receptor de factor de crecimiento anti-nérvio, anti-p60, anticuerpo de pollo, anticuerpo proteína similar hormona anti-paratiroide, anticuerpo del receptor de factor de crecimiento derivado de anti-plaquetas , anticuerpo del receptor-B de factor de crecimiento derivado de anti-plaqueta, anticuerpo alfa del factor de crecimiento derivado de anti-plaqueta, anticuerpo del receptor anti-progesterona, anticuerpo del receptor-a!lfa anti-á'cido retinoico, anticuerpo del receptor hormona nuclear anti-tiroide, anticuerpo del receptor-alfa 1/Bi de hormona nuclear anti-tiroide, anticuerpo del receptor/CD71 anti-transferina, anticuerpo del factor de crecimiento-alfa antitransformación, anticuerpo del factor de crecimiento-B3 anti-transformación, anticuerpo anti-factor de necrosis del tumor-alfa, y anticuerpo del factor de crecimiento anti-endotelial vascular.
Esta invención tambié proporciona una biblioteca de células hematopoyéticas diferenciadas que puede proporcionar células compatibles a receptores pacientes potenciales como se describe anteriormente. En ciertas modalidades, las células se congelan para almacenamiento. Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un método para conducir un negocio farmacéutico, que comprende la etapa de proporcionar preparaciones celulares hematopoyéticas diferenciadas que son homocigotos por al menos un antígeno de histocompatibilidad, en donde las células se eligen de un banco de las células que comprende una biblioteca de células que forman una colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar que pueden ser expandidas por los métodos descritos en la presente, en donde cada preparación de célula que forma colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar es hemicigoto u homocigotos por al menos un alelo MHC presente en la población humana, y en donde el banco de células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar comprenden células que son cada una hemicigotas u homocigotas para una serie diferente de Alelos MHC en relación a los otros miembros en el banco de células . Como se menciona anteriormente, la orientación del gen o pérdida de heterocigocidad puede ser usada para generar las células troncales de alelo MHC hemicigoto u homocigoto usadas para derivar las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar. En ciertas modalidades, las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar de todos los tipos de sangre se incluyen en el banco. En ciertas modalidades, células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma : ¡sin injertar son compatibles con un paciente para asegurar qué se produzcan células hematopoyéticas diferenciadas del pro/pio tipo de sangre del paciente. En ciertas modalidades, illas células que forman colonia de hemangioma o células- ' de hemangioma sin injertar son negativas ¦ para factores antigénicos A, B, Rh, o cualquier combinación de los misinos. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas diferenciadas son células del donador universales. Por médio de ejemplo, las células hematopoyéticas que son tipo O y Rh i negativo pueden ser usadas universalmente para transfusión de sangre. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para producir glóbulos rojos tipo O, Rh negativo para transfusión universal. En ciertas modalidades, glóbulos rp' os diferenciados a partir de células que forman colonia¦ de hemangioma o células de hemangioma sin injertar expresan hemoglobina fetal. La transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal puede ser especialmente útil en el tratamiento de anemia de célula falciforme. Como tal, | la presente invención proporciona métodos mejorados para trátar anemia de célula falciforme. En una modalidad, después de ,que una preparación de célula que forma colonia de hemangioma particular o una preparación de célula de hemangioma sin injertar se elige por ser adecuada para un paciente, es después expandida para alcanzar cantidades apropiadas para; el tratamiento del paciente y diferenciada para obtener células hematopoyéticas diferenciadas antes de administrar las células al receptor. Métodos para conducir un negocio farmacéutico pueden también comprender establecer un sistema de distribución para distribuir la preparación para venta o i pueden incluir establecer un grupo de ventas para comercializar la preparación farmacéutica.
In cualquiera de las precedentes, las células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar pueden ser directamente diferenciadas o células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar pueden ser congeladas para uso posterior. En ciertas modalidades, la invención proporciona un cultivo congelado de células que forman colonia de hemangioma o células de hemangioma sin injertar adecuadas para descongelación y expansión posterior, y también adecuadas para diferenciación a linajes hematopoyéticos o endoteliales .
Células que forman colonia de hemangioma humano o células de hemangioma sin injertar se pueden usar para generar números sustanciales de tipos de célula hematopoyetica que se pueden usar en transfusiones de sangre.
Por ejemplos, números sustanciales de poblaciones RBCs homogéneas o heterogéneas y/o plaquetas se pueden generar de células humanas que forman colonia de hemangioma. Células que forman colonia de hemangioma, células de hemangioma isin injertar y tipos de célula hematopoyética diferenciadas! de las mismas pueden estar en bancos, como se hace actualmente con productos de sangre donada, y usados en transfusiones y Í otros tratamientos. La puesta en bancos de estos productos puede ayudar a aliviar la grave escasez de productos, ¡ de sangre donada. Adicionalmente, las células que forman colqnia de hemangioma, células de hemangioma sin injertar y productos derivados pueden ser genéticamente manipulados in vitro para proporcionar productos de sangre del donante universal . j Como tal, en ciertos aspectos la invención proporciona un método para conducir una empresa de banco! de sangre. El tema de negocio bancario involucra la derivación y almacenaje (periodo largo o corto) de células que forman colonia de hemangioma, células de hemangioma sin injertar Sy/o tipos de célula hematopoyética (por ejemplo, RBCs, plaquetas, linfocitos, etc.) generadas de estas. Las células pueden jser criopreservadas para periodos largos de almacenaje, | o mantenidas en cultivo para almacenaje por periqdos relativamente cortos. Las células pueden ser de categorizadas y de apareamiento cruzado en gran parte de la misma manera I que los productos de sangre actualmente disponibles :son categorizados, y las células pueden ser almacenadas en base al tipo. Adicionalmente y en ciertas modalidades, las células pueden ser modificadas para específicamente generar células que son A negativo y/o B negativo y/o Rh negativo para producir células que son universalmente o casi universalmente adecuadas para transfusión en cualquier paciente.
Nótese que las células que forman colonia de hemangioma, células de hemangioma sin injertar y/o tipos de célula hematopoyética diferenciadas se pueden generar usando cualquiera de los métodos de la invención detallados a tra és de la especificación.
En ciertas modalidades de un método para conducir a empresa de banco de sangre, las células (tipos de células que forman colonia de hemangioma, células de hemangioma sin injertar y/o células hematopoyéticas diferenciadas) son generadas y almacenadas en una o más instalaciones centrales. Células entonces se pueden transferir a, por ejemplo, hospitales o instalaciones de tratamiento para uso en el cuidado del paciente. En otras ciertas modalidades, las células son mantenidas en un estado criopreservadó y específicamente descongeladas y preparadas para transfusión en base a órdenes de hospitales u otras instalaciones de tratamiento. Las órdenes pueden ser una orden permanente (por ejemplo, generar y proporcionar una cierta cantidad de células de un cierto número de unidades.
En ciertas modalidades, el método incluye un sistema para facturación a hospitales o compañías de seguros para los costos asociados con los productos en bancos. | En ciertas modalidades de cualquiera de las precedentes, las células se pueden asignar en base al número de célula, volumen o cualquier unidad que permita al usuario cuantificar la dosis a ser administrada a los pacientes y/o para comparar estas dosis que se administra durante una transfusión de sangre estándar.
En ciertas modalidades, las células son generadas, almacenadas, y administradas como una población mezclada de células. Por ejemplo, la preparación puede incluir células de etapas variadas de desarrollo, así como también distintos tipos de célula. En otras modalidades, las células son generadas, almacenadas, y/o administradas como ' /una preparación sustancialmente purificadas de un tipo de célula única .
En ciertas modalidades, las preparaciones de células son seleccionadas para una o más enfermedades infecciosas. La selección puede ocurrir antes a o subsecuente a la generación o almacenaje. Por ejemplo, las preparaciones de células pueden ser seleccionadas para identificar hepatitis, VIH, u otras enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre que se pueden transmitir a los receptores de estos productos.
Inducción de tolerancia en recipientes injertados Las células de hemangioblastos humanos generadas y expandidas por los métodos de esta invención, o expandidas por los métodos de esta invención, se pueden usar para inducir tolerancia inmunológica . La tolerancia inmunológica se refiere a la inhibición de una respuesta inmune ^el receptor injertado la cual puede de otra forma ocurrir, por ejemplo, en respuesta a la inducción de un antígeno son MHC (por ejemplo, un antigeno comparte con el injerto y los hemangioblastos tolerantes) en el receptor. De esta forma, tolerancia se refiere a la inhibición de la respuesta inmune inducida por un antígeno donador específico opuesto a la inhibición inmune de espectro amplio que puede ser producida usando inmunosupresores . Tolerancia puede involucrar respuestas humoral, celular o ambas humoral y celular. Tolerancia puede incluir la eliminación y/o inactivación; de células T reactivas al donador maduras pre-existentes, así como también eliminación de acción prolongada (por ejemplo, duración de vida) y/o inactivación de células T reactivas nuevamente desarrolladas del donador.
Los métodos descritos en la presente invención para generar y expandir hemangioblastos humanos ofrecen varias ventajas para inducir tolerancia. Los métodos de la presente invención resultan en la generación de números grandes, previamente inalcanzable de mengioblastos humanos. Números grandes de hemangioblastos humanos permite la inducción de tolerancia en recipientes injertados con protocolos de preacondicionamiento menos tóxicos. Además, los métodos de la presente invención proporcionan la generación de una biblioteca de hemangioblastos humanos, cada uno de los cuáles es hemicigoto u homocigoto por al menos un alelo MHC presente en la población humana, en donde cada número de la biblioteca de células de hemangioblasto es hemicigoto u homocigoto para una serie diferente de alelos MHC en relación a otros miembros en la biblioteca. La biblioteca de hemangioblastos humanos se puede usar en la selección de células de hemangioblastos humanos toleradas de forma que las células, se pueden seleccionar para ser compatible con cualquier injerto donador disponible.
Trasplante de médula ósea y subsecuente establecimiento de quimerismo hematopoyético o mezclado previamente se han mostrado por inducir tolerancia específica a tipos de tejido nuevo derivados de células troncales hematopoyéticas tanto en modelos humanos como de murina. Quimerismo hematopoyético o mezclado se refiere a > la producción de un receptor de células hematopoyéticas derivadas tanto del donador como . de las células troncales receptoras. Puesto que, si un receptor logra quimerismo hematopoyético, el receptor puede ser tolerante a antígenos específicos del donador. En muchos protocolos para inducir tolerancia, las células del donador tolerantes que se administran al receptor injertado en la médula ósea del receptor. Para crear espacio hematopoyético en la médula ósea del receptor para las células del donador, algunos protocolos requieren una etapa para crear espacio hematopoyético (por e emplo, por irradiación de cuerpo completo) , y una etapa es típicamente tóxica o perjudicial al receptor. Sin embargo, si números muy grandes de células tolerantes del donador están disponibles, existe evidencia de modelos de roedor que la irradiación puede ser completamente eliminada, con ello se logra quimerismo hematopoyético o mezclado con la ventaja de regímenes de pre-acondicionamiento menos tóxicos. · De esta forma, el quimerismo mezclado puede ser logrado, por ejemplo, con acondicionamiento del receptor específico, , no mieloablativo .
Por lo tanto, los nuevos métodos descritos en la presente capaces de la producción de números grandes de células de hemangioblastos humanos, la presente invención ofrece la ventaja de inducir tolerancia inmune con protocolos de acondicionamiento de menos rigor o menos tóxicos. Por ejemplo, la etapa de crear espacio hematopoyético puede ser eliminada si se usa un número suficiente de células del donador tolerantes .
Por lo tanto, en ciertas modalidades de la presente invención, las células de hemangioblastos humano generadas y expandidas o expandidas por los métodos descritos en la presente se pueden usar para inducir tolerancia inmunologica. Mientras no se desee ser. unidas por una teoría en el mecanismo, las células de hemangioblasto humano pueden inducir tolerancia inmunologica dirigiéndose a la médula ósea del receptor e injertadas en la médula ósea del receptor para producir quimerismo mezclado.
En ciertas modalidades, las células de hemangioblasto humano del donador se administran a ? un paciente receptor (por ejemplo, por inyección intravenosa) antes de implantar un injerto o trasplantar un órgano, tejido o células del donador en el paciente receptor. En ciertas modalidades, se administran hemangioblastos humanos para inducir tolerancia en pacientes en necesidad de los mismos (por ejemplo, recipientes injertados o trasplantados). Por lo tanto, en ciertas modalidades, el método para inducir tolerancia en un paciente receptor humano comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente en necesidad de trasplante o terapia celular; (b) administrar al paciente humano, células de hemangioblasto derivadas de un donador que o que son compatibles del donador, en donde las células de hemangioblasto son generadas y expandidas o expandidas : de conformidad con los métodos de esta invención y (c) implantar un órgano, te ido o injerto celular del donador en el paciente receptor, en donde las células de hemangiobl sto inducen tolerancia a antígenos del donador. En ciertas modalidades, el paciente puede recibir un órgano, tejido o terapia celular, en donde el órgano, tejido o células . se obtienen del donador o una fuente 'de célula donadora. Por ejemplo, las células de hemangioblasto de un donador pueden ser (1) expandidas de conformidad con los métodos descritos en la presente para generar un número grande de células tolerantes del donador, y (2) expandidas y diferenciadas in vitro para obtener células hematopoyéticas o endoteliales o tejidos, los cuales pueden ser subsecuentemente implantados en el paciente receptor. En otras modalidades, el órgano, tejido o terapia celular no se deriva de células de hemangioblasto del donador pero son compatibles con los hemangioblastos del donador.
Como se usa en la presente, el término "compatible" se refiere a como la similitud de tipo HLA está entre el donador y el receptor (por e emplo, injerto) . En una modalidad, el término "compatible" con respecto a células de hemangioblasto del donador e injertadas se refiere a un grado de compatibilidad de los alelos MHC clase I y/o en el MHC clase II de forma que el rechazo no ocurre. En otra modalidad, el término "compatible" con respecto a hemangioblastos del donador e injerto se refiere a un grado de compatibilidad en los alelos MHC clase I y en el MHC clase II de forma que el injerto del donador es tolerado por sus células de hemangioblasto del donador compatible. En otra modalidad, el término "compatible" con respecto a hemangioblasto del donador e injerto se refiere a un grado de compatibilidad en los alelos MHC clase I y/o MHC clase II de forma que no se requiere la inmunosupresión.
Los métodos descritos en la presente para inducir tolerancia a un antígeno alogénico o injerto alogénico se pueden usar cuando, entre el donador y el receptor, existe grado de incompatibilidad en locus MHC u otro locus, de forma que resulta en rechazo del injerto. Por lo tanto, por ejemplo, en ciertas modalidades, puede existir una incompatibilidad en al menos un locus MHC o al menos en otro locus que interviene en él reconocimiento y rechazo, por ejemplo, un locus de antígeno menor. En algunas modalidades, por ejemplo, los alelos HLA del receptor y donador son incompatibles y resulta en uno o más antígenos incompatibles . Con respecto al locus MHC de clase I y clase II, el donador y receptor puede ser por ejemplo: compatible en la clase I e incompatible en la clase II; incompatible en la clase I y compatible en la clase II; incompatible en la clase i e incompatible en la clase II; compatible en la clase I, compatible en la clase II . En cualquiera de e^tas combinaciones, otros locus los cuales controlan el reconocimiento y rechazo, por ejemplo, locus de antígeno menor, puede ser compatible o incompatible. Incompatible en MHC de clase I significa incompatible para uno o más locus MHC clase I, por ejemplo, incompatible en uno o más de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Incompatible en MHC clase II significa incompatible en uno o más locus MHC clase II, por ejemplo, incompatible en uno o más de un DPA, DPB, DQA, DQB, DRA. O DRB. Por ejemplo, los hemangioblastos y el injerto pueden ser compatibles en alelos HLA-DRBl y DQBl clase II. Los hemangioblastos e injerto pueden además se compatibles en dos o más alelos HLA-A, B o C clase I (además por tener alelos DRB1 y DQBl compatibles). : En otras modalidades, las células del donador tolerantes son células derivadas de los hemangioblastos generados y expandidos o expandidos por los métodos descritos en la presente. De conformidad con esta modalidad, los hemangioblastos humanos del donador son diferenciados in vivo para dar lugar a células troncales hematopoyéticas del donador, y las células troncales hematopoyéticas del donador son entonces administradas al paciente receptor para inducir tolerancia. En cualquiera de los métodos anteriores, los hemangioblastos del donador o células troncales hematopoyéticas derivadas de estas y administradas al receptor, preparan al paciente receptor para . la compatibilidad (con respecto a las células tolerantes del donador) dé transplante o injerto para inducir tolerancia en el receptor.
En otras modalidades, el método para inducir tolerancia además comprende las etapas de crear espacio nematopoyético (para promover injerto de hemangioblastos o células troncales hematopoyéticas derivadas de estas). En otra modalidad, el método para inducir tolerancia además comprende las etapas de inhibir temporalmente el rechazo de células de hemangioblasto del donador o células troncales hematopoyéticas derivadas de estas por, por ejemplo, eliminar y/o inactivar las células T reactivas del donador pre-existentes. Para crear espacio hematopoyético, el método puede incluir irradiación (por ejemplo, cuerpo completo, linfoide o irradiación t mica selectiva) . Para prevenir: el rechazo de células de donador, el método puede además comprender la administración de fármacos o anticuerpos (por ejemplo, inhibidores de proliferación celular, anti-metabolitos o anticuerpos anti-célula T o anti-CD8 o anti-CD4) , y/u otros tratamientos que prometen supervivencia- e injerto de las células del donador y la formación ; de quimerismo mezclado (por ejemplo, la administración de células estromales o factores de crecimiento, citocinas, etc., al receptor, u otros agentes que reducen o inactivan los anticuerpos naturales del receptor) . En ciertas modalidades, la irradiación, anticuerpos, fármacos y/u otros agentes administrados para crear espacio hematopoyético y/o promueven supervivencia de células del donador en el receptor, es suficiente para inactivar timocitos y/o células T en el receptor. Se puede realizar la etapa para crear espacio hematopoyético y/o inhibir temporalmente el rechazo de células de donador, por ejemplo, antes de la introducción de las células de hemangioblasto del donador al receptor. Alternativamente, el paciente puede recibir un agente o método para bloquear, eliminar o inactivar las células T junto con la administración de las células tolerantes del donador .
En ciertas modalidades, se usa una combinación de métodos para crear espacio hematopoyético e inmunosupresivo . Por ejemplo, un receptor puede recibir un anticuerpo anti-célula T en combinación con irradiación de cuerpo completo a baja dosis y/o irradiación t mica. En una modalidad, el receptor puede recibir anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8, seguido por una dosis no mieloablativa, moderada de irradiación de cuerpo completo (por ejemplo, una dosis que elimina una fracción de la médula ósea del receptor sin proporcionar la médula ósea irrecuperable) e irradiación tímica selectiva o alternativamente, una dosis adicional de anticuerpos que inactiva la célula T o agentes de bloqueo coestimuladores (por ejemplo, anticuerpo CTLA4-Ig y/o anti-CD40L) . Después de la irradiación, las células de hemangioblasto del donador o células troncales hematopoyéticas de estas, pueden ser administradas al receptor (por ejemplo, por inyección intravenosa) . En esta modalidad, la irradiación de cuerpo completo que promueve el injerto de células del donador puede ser reemplazada por la administración de un gran número de hemangioblastos humanos del donador o células troncales hematopoyéticas derivadas de estas. La obtención este número grande de células humanas de donador se puede lograr de conformidad con los métodos descritos en la presente..
En otra modalidad, los tratamientos para reducir o inactivar células T en el receptor pueden ayudar para prevenir la inhibición del injerto o promover la supervivencia de las células de hemangioblasto humano tolerantes del donador administradas. En otra modalidad, el método puede incluir eliminación clonal de células reactivas del donador en el paciente receptor. Por ejemplo, un paciente puede recibir una dosis suave de irradiación de cuerpo completo, seguido por administración de hemangioblastos humanos del donador y bloqueo coestimulador de células. T. Alternativamente, un paciente puede recibir bloqueo coestimulador de célula T y administración de grandes números de células de hemangioblasto humano del donador son recibir irradiación .
En otra modalidad, la tolerancia se puede lograr sin acondicionamiento mieloablativo del receptor. En una modalidad, un receptor puede recibir hemangioblastos humanos del donador en combinación con anti-CD40L para facilitar el injerto de hemangioblas os del donador. Por ejemplo, un receptor puede recibir grandes números de hemangioblastos del donador, junto con un anticuerpo monoclonal anti-CD40L , después de uno pocos días por una dosis de CTLA4-Ig. i El protocolo puede eliminar células T reactivas del donador y bloquear la interacción CD40-CD40L. Los nuevos métodos descritos en la presente para generar y expandir hemangioblastos humanos in vitro proporcionan un posible protocolo de tolerancia media.
Después del acondicionamiento del receptor y/o eliminación o bloqueo de células T reactivas del donador, los hemangioblastos humanos tolerantes del donador generados por los métodos de la presente invención se administran al receptor. Los hemangioblastos humanos del donador pueden ser derivados de hemangioblastos obtenidos de un tejido o fuénte celular del donador. Alternativamente, los hemangioblastos humanos del donador pueden ser obtenidos de una fuente no del donador diferente que es compatible con el donador.
En ciertas modalidades, la tolerancia se induce en un paciente receptor administrando hemangioblastos humanos del donador en administraciones múltiples (por ejemplo, por dos, tres, cuatro o más administraciones de las células del donador) . Por lo tanto, la tolerancia puede ser inducida por un método que comprende administraciones múltiples de células tolerantes del donador, en donde las administraciones múltiples se proporcionan al receptor dentro de un marco de tiempo de una semana o menos.
En ciertas modalidades, la capacidad de las células de hemangioblasto humano de esta invención que induce tolerancia inmunológica puede ser evaluada usando diferentes sistemas de modelo experimental. Por ejemplo, la capacidad para establecer un sistema inmune humano en un ratón SCID se ha usado para estudiar la respuesta inmune humana en un modelo experimental. Se ha mostrado previamente que el hígado fetal de humano y el tejido del timo se puede usar para reconstituir un sistema inmune humano funcional en un receptor de ratón inmuno-incompetente. Similármente;, ¡ : la capacidad funcional de las células de hemangioblasto humano de esta invención se puede valorar usando un sistema de modelo experimental similar. Por ejemplo, la capacidad' de hemangioblastos humanos para reemplazar el hígado fetal humano para establecer un sistema inmune humano funcional en el ratón puede ser evaluada usando el modelo experimental descrito anteriormente. Además, en un ratón con un sistema inmune humano funcional (por ejemplo, en donde se usa un hígado fetal humano o tejido del timo para establecer un sistema inmune humano en un ratón SCID para producir un ratón hu-SCID) , hemangioblastos del donador" humanos (incompatibles con respecto al hígado fetal y tejido del timo usados para establecer el ratón hu-SCID) se pueden administrar al ratón hu-SCID, de conformidad con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, para lograr quimerismo mezclado. La tolerancia del antígeno donador puede subsecuentemente ser probado en implante de un injerto heterólogo compatible con respecto a hemangioblastos del donador en estos animales. .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a combinaciones celulares . Combinaciones de células efectivas comprenden dos componentes : un primer tipo 1 de células para inducir tolerancia inmunológica, y un segundo tipo de células que regeneran la función necesaria. Ambos tipos de células pueden ser producidas por los métodos de la presente invención y se obtienen del mismo donador. Por ejemplo, células de hemangioblastos humanos a partir de un donador se pueden usar como las células donadoras tolerantes. Las células a partir del donador (por ejemplo, células troncales embriónicas, células troncales pluripotentes o células progenitoras tempranas, o hemangioblastos) también se pueden usar para generar, por ejemplo, células hematopoyéticas o células endoteliales (como se describé en la presente) , células neurales tales como oligodendrocitos , hepatocitos, cardiomiocitos o precursores de cardiomiocitos , u osteoblastos y sus progenitores. Por consiguiente, los hemangioblastos humanos donadores se pueden usar para inducir tolerancia en un recipiente de manera que el recipiente es tolerante a células o tejidos derivados de dichas células de hemangioblastos donadores o de células troncales pluripotentes o embrionicas donadoras.
En otra modalidad, los dos componentes celulares de las combinaciones de células de la presente invención se pueden obtener a partir de diferentes fuentes o donadores, en donde las dos fuentes o donadores son compatibles . Por ejemplo, los hemangioblastos se pueden generar a partir de una fuente de célula troncal embriónica, mientras las . células o tejidos de injerto se pueden obtener a partir de una fuente que es diferente de la fuente de célula troncal embriónica usada para generar los hemangioblastos humanos. En tales modalidades, las dos fuentes son compatibles.
Para cualquiera de los propósitos terapéuticos descritos en la presente, células hematopoyéticas o hemangioblastos humanos derivados de estos por inmunotolerancia pueden ser suministrados en la forma de una composición farmacéutica, que comprende un excipiente isotópico preparado bajo condiciones suficientemente estériles para administración humana.
Hemangioblastos en terapia de gen Otros aspectos de la invención se refieren al uso de células de hemangioblastos, células de hemangioma sin injertar, o células endoteliales o hematopoyéticas diferenciadas a partir de estas, o a su vez a células además diferenciadas a partir de estas células, en terapia de gen. La preparación de células de hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar de la invención se pueden usar para suministrar un gen terapéutico a un paciente que tiene una condición que es sensible al tratamiento por el producto de gen del gen terapéutico. Los hemangioblastos y células de hemangioma sin injertar son particularmente útiles para suministrar genes terapéuticos que están involucrados en o influencian la angiogénesis (por ejemplo, VEGF para inducir formación de colaterales en tejido isquémico), hematopoyesis (por ejemplo, eritropoyetina para inducir producción de células rojas) , función de vasos sanguíneos (por ejemplo, factores de crecimiento para inducir proliferación de músculos lisos vasculares para reparar aneurisma) o función de células de la sangre (por ejemplo, factores de coagulación para reducir el sangrado) o código para proteínas secretadas por ejemplo, hormona de crecimiento. Los métodos para terapia de gen son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,399,346 por Anderson et al. Una cápsula biocompatible para suministrar material genético se describe en la Publicación de PCT WO 95/05452 por Baetge et al. Los métodos de transferencia de gen. en células derivadas de la médula ósea también han sido reportados previamente (véase, Patente Estadounidense No. 6,410,015 por Gordon et al .) . El gen terapéutico puede ser cualquier gen que tiene utilidad clínica, tal como un gen que codifica un producto de gen o una proteína que está involucrada en la prevención o tratamiento de enfermedad, o un gen que tiene un efecto regulador celular que está involucrado en la prevención o tratamiento de enfermedad. Los productos de gen pueden sustituir un producto de gen perdido o defectivo, proteína, o efecto regulador celular en el paciente, con ello permitiendo la prevención o tratamiento de una enfermedad o condición en el paciente.
Por consiguiente, la invención además proporciona un método para suministrar un gen terapéutico a un paciente que tiene una condición sensible a terapia de gen que comprende, seleccionar el paciente en necesidad del mismo, modificar la preparación de hemangioblastos o células , de hemangioma sin injertar de manera que las células portan un gen terapéutico, y administrar la preparación modificada al paciente. La preparación se puede modificar por técnicas que son en general conocidas en el arte. La modificación puede involucrar insertar un segmento de ADN o ARN que codifica1 un producto de gen en las células de hemangioblastos de mamífero, en donde el gen mejora los efectos terapéuticos de las células de hemangioblastos o las células de hemangioma sin injertar. Los genes son insertados en tal manera que la célula de hemangioblasto modificada producirá el producto; de gen terapéutico o tienen el efecto terapéutico deseado en el cuerpo del paciente. En una modalidad, los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar son preparados a partir de una fuente de célula originalmente adquirida del paciente, tal como médula ósea. El gen puede ser insertado en las células de hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar usando cualquier procedimiento de transferencia de gen, por ejemplo, incorporación de ADN desnudo, inyección directa de ADN, absorción de ADN mediada por el receptor, transíección mediada retroviral, transfección mediada viral, transfección no viral, transfección mediada lípida, electrotransferencia, electroporación, transfección mediada por fosfato de calcio, microinyección o proteoliposomas , todos los cuales pueden involucrar el uso de vectores de terapia de gen. Otros vectores pueden ser usados además de los vectores retrovirales , que incluyen aquellos derivados de virus de ADN y otros virus de ARN. Como debe ser aparente cuando se usa un virus de ARN, tales virus incluyen ARN que codifica el agente deseado de manera que las células de hemangioblastos que son transíectadas con tales virus de ARN son por lo tanto proporcionadas con ADN que codifica un producto de gen terapéutico. Los métodos para realizar: la introducción de genes en células son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, id.).
De conformidad con otro aspecto de la invención, una preparación purificada de células de hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar, en la cual las células han sido modificadas para llevar un gen terapéutico, i se pueden proporcionar en contenedores o paquetes comerciales que además comprenden instrucciones para uso de la preparación en terapia de gen para prevenir y/o tratar una enfermedad por el suministro del gen terapéutico. Por consiguiente, la invención además proporciona un paquete comercial (es decir, un kit) que comprende una preparación de células de hemangioblasto humano o células de hemangioma humano sin injertar de la invención, en donde la preparación ha sido modificada de manera que las células de la preparación portan un' gen terapéutico, e instrucciones para tratar un paciente que tiene una condición sensible a tratamiento con terapia de gen.
Otras aplicaciones comerciales y métodos Ciertos aspectos de la presente invención pertenecen a la expansión de hemangioblastos humanos1 y células de hemangioma sin injertar para alcanzar cantidades comerciales. En modalidades particulares, hemangioblastos humanos y células de hemangioma sin injertar se producen a gran escala, almacenan si es necesario, y suministran a hospitales, médicos u otras instalaciones al cuidado de la salud. Una vez que un paciente se presenta con una indicación tal como, por ejemplo, isquemia o lesión vascular, o está en necesidad de reconstitución hematopoyética, hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar pueden ser ordenados y proporcionados en una manera sincronizada. Por consiguiente, la presente invención se refiere a los métodos para generar y expandir hemangioblastos humanos y células! de hemangioma sin injertar para lograr células en una escala comercial, preparaciones de células que comprenden hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar derivadas de dichos métodos, así como también métodos para proporcionar (es decir, producir, opcionalmente almacenar, y vender) hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar a hospitales y médicos. Además, las células de linaje de hemangioblasto o células de linaje de hemangiomas sin injertar pueden ser producidas in vi tro y opcionalmente almacenadas y vendidas a hospitales y médicos.
Por consiguiente ciertos aspectos de la presente invención se refieren a métodos de producción, almacenaje y distribución de hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar expandidas por los métodos descritos en la presente. Después de la generación y expansión in vitro de hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar,, hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar pueden ser cosechadas, purificadas y opcionalmente almacenadas previo al tratamiento del paciente.
Alternativamente, en situaciones en las cuales se desean células de linaje de hemangioma sin injertar o hemangioblastos, hemangioblastos humanos o células i de hemangioma sin injertar pueden ser diferenciadas además, in vitro previo a un tratamiento del paciente. De este modo;,; en modalidades particulares, la presente invención proporciona métodos para suministrar hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar a hospitales, centros al cuidado1 de la salud, y médicos, con ello, los hemangioblastos, células de hemangioma sin injertar, células de linaje de hemangioblastos, o células de linaje de hemangioma -sin injertar producidos por los métodos descritos en la presente, son almacenados, ordenados a demanda por un hospital, centro al cuidado de la salud, o médico, y administrados a1 un i paciente en necesidad de terapia con hemangioblastos, células í de hemangioma sin injertar, linaje de hemangioblasto, o linaje de hemangioma sin injertar. En modalidades alternativas, un hospital, centro al cuidado de la salud, o médico, ordenan hemangioblastos humanos o células ! de ; i hemangioma sin injertar basados en los datos específicos ¡del paciente, los hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar se producen de conformidad con las especificaciones del paciente y subsecuentemente : se suministran al hospital o médico que coloca la orden.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a una biblioteca de hemangioblas os , células de hemangioma sin injertar, células de linaje de hemangioblasto, y/o células de linaje de hemangioma sin injertar que pueden proporcionar células compatibles a recipientes de pacientes potenciales .
¡ Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un método para conducir un negocio farmacéutico, que comprende la etapa de proporcionar preparaciones de células de hemangioma sin injertar o hemangioblastos que son homocigotos por al menos un antígeno de histocompatibilidad, en donde las células son elegidas de un banco de manera que las células comprenden una biblioteca de hemangioblastos humanos o células de hemangioma sin injertar que pueden iser expandidas por los métodos descritos en la presente, en donde cada hemangioblasto o preparación de células de hemangioma sin injertar es hemicigota u .homocigota para al menos; un alelo de MHC presente en la población humana, y en donde el banco de células de hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar comprende células que son cada una hemicigotas u homocigotas para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los otros miembros en el banco de células. Como se mencionó anteriormente, el gen de objetivo o pérdida de heterocigocidad se puede usar para generar las células troncales de alelos de MHC hémicigotos u homocigotos usados para suministrar los hemangioblastos. En una modalidad, después que una preparación de células de hemangioma ;sin injertar o hemangioblasto particular se elige por ser adecuada para un paciente, es posteriormente expandida para alcanzar cantidades apropiadas para el tratamiento.. ¡del paciente. Tales métodos pueden además comprender la etapa de diferenciar los hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar para obtener células endoteliales y/o hematopoyéticas previo a administrar células al recipiente. Los métodos para conducir negocios farmacéuticos también" pueden comprender establecer un sistema de distribución para distribuir la preparación para venta o pueden incluir establecer un grupo de ventas para comercializar la preparación farmacéutica.
Otros aspectos de la invención se refieren al uso de los hemangioblastos humanos y células de hemangioma sin injertar de la presente invención como una herramienta1 de búsqueda en instalaciones tales como una compañía farmacéutica, química o de biotecnología, un hospital, o una institución de investigación o académica. Por ejemplo, hemangioblastos humanos, células de hemangioma sin injertar y células derivadas de los mismos (por ejemplo, células endoteliales) se pueden usar para seleccionar y evaluar factores angiogenicos y anti-angiogénicos o se pueden usar en ingeniería de tejido. Además, debido a que los hemangioblastos y células de hemangioma sin injertar obtenidos y expandidos por los métodos descritos aquí, tienen potencial dual para diferenciarse en células hematopoyéticas y endoteliales , se pueden usar para la biología molecular y celular de hematopoyesis y vasculogénesis . Además, los j hemangioblastos humanos y células de hemangioma sin injertar se pueden usar para el descubrimiento de nuevos marcadores de estas células, genes, factores de crecimiento y factores! de diferenciación que juegan un papel en la hematopoyesis y vasculogénesis, o para descubrimiento de fármaco y, . el desarrollo de ensayos de selección para agentes protectores o ¡ potencialmente tóxicos. ; En otras modalidades de la presente invención, hemangioblasto y células de linaje de hemangioma sin injertar (tal como sangre células) también son usados comercialmente . Las células hematopoyéticas pueden ser usadas para generar productos de sangre, tales como hemoglobina y factores de crecimiento, que pueden ser usados para aplicaciones ; de . i investigación y clínicas. | La presente invención también incluye métodos para obtener células ES humanas a partir de un paciente y des ués generar y expandir hemangioblastos humanos o células,! de hemangioma sin injertar derivadas de las células ES. E¿tos hemangioblastos y células de hemangioma sin injertar pueden ser almacenados. En adición, estos hemangioblastos y células de hemangioma sin injertar pueden ser usados para tratar al paciente a partir del cual las ES se obtienen o un pariente de tal paciente.
Como los métodos y aplicaciones descritos anteriormente se refieren a tratamientos, preparaciones farmacéuticas, y el almacenamiento de hemangioblastos o células de hemangioma sin injertar, la presente invención también se refiere a soluciones de hemangioblastos y células de hemangioma sin injertar que son adecuados para tales aplicaciones. La presente invención por consiguiente se refiere a soluciones de hemangioblastos y células . de hemangioma sin injertar que son adecuados para inyección: en un paciente. Tales soluciones pueden comprender células formuladas en un líquido fisiológicamente aceptable (por ejemplo, salina normal, salina amortiguada, o una solución de sal balanceada) . Una solución puede comprender opcionalmente factores que facilitan la diferenciación celular in vivo. Una solución puede ser administrada a un paciente por administración vascular (por ejemplo, infusión intravenosa) , de conformidad con los métodos aceptados en la técnica utilizados , para transplante de médula ósea. En algunas modalidades, la solución celular se administra en una Vena periférica, una vena periférica superficial, o alternativamente, por administración venosa central (por ejemplo, a través de un catéter venoso central) . El número de células en la solución puede ser al menos aproximadamente 102 y menos de aproximadamente 109 células. En otras modalidades, el número de células en la solución puede variar desde aproximadamente 101, 102, 5xl02, 1?\ 5xl03, 104, 105, 106, 107, o 10s hasta aproximadamente 5xl02, 103, 5xl03, 104, 105, 106, 107, 108, o 109; en donde los límites superior e inferior son seleccionados independientemente, excepto que el límite inferior es siempre menos que el límite superior. Además, las células pueden ser administradas en administraciones únicas o múltiples .
Generación de hemangioblastos a partir de PSC humano Basados en el método para generar eficientemente y reproduciblemente grandes números de hemangioblastos a partir de líneas hESC múltiples descritas en la presente (véase también Lu et al. Nat Methods 2007; 4:501-509; Lu et al. Regen Med 2008;3:693-704), los inventores además usan la plataforma de hemangioblasto para diferenciar hESC a través de progenitores hemangioblásticos en células eritroides a gran escala (aproximadamente 1010 hasta 1011 células/hESC. de placa de seis cavidades) , que es más de mil veces más eficiente que los reportados previamente.
Se reportado poco acerca de la capacidad de iPSC para sufrir diferenciación directa, especialmente, hacia hemangioblastos. Un reporte reciente por Choi et al (STEM CELLS 2009; 27 (3 ): 559-567 ) describe estudios con iPSC humanos utilizando un sistema de cultivo a base de alimentador OP9 que proporciona diferenciación hematopoyética y endotelial, demostrando el potencial de iPSC humanos. De manera similar, Zhang et al. (Circ Res 2009; 104 : e30-e41. ) reporta la derivación de cardiomiocitos funcionales a partir de iPSC humanos, aunque con baja eficiencia comparados con hESC, usando el método EB. La generación eficiente ;; de hemangioblastos a partir iPSC humanos se describe en: la presente. Los inventores describen condiciones para ¡ la generación eficiente de hemangioblastos a partir de iPSC humanos, usando sus experiencias con el sistema hESC. 1 La presente invención será ahora más completamente descrita con referencia a los siguientes ejemplos, los cuáles i son ilustrativos solamente y no deben ser considerados como limitantes de la invención descrita anteriormente. ' j · I EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar mejor la invención reivindicada y no están siendo interpretados como limitantes del alcance de la invención.; En la magnitud de que se mencionan materiales específieos ,¦ es solamente para propósitos de ilustración y no se pretende limitar la invención. Un experto en la técnica puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin apartarse del alcance dé; la invención. ¡ Ejemplo 1 Materiales y Métodos Cultivo de hESC ; Se usaron líneas de hESC WAOl(Hl), HUES3 , y MA01 y se mantuvieron como se describe previamente16' . Brevemente, se hicieron crecer hESC en fibroblastos embriónicos de ratón tratados con mitomicina-C (MEF) en medio hESC completo. Los hESC se pasaron cada 3-5 días antes de alcanzar la confluencia usando 0.05% de tripsina-0.53 m de EDTA. P'ara cultivo libre de alimentador, las células entonces 1 se hicieron crecer en matriz de Matrigel calificada con hESC (BD Biosciences) en medio TeSR™l (m TeSR™l) modificado completo (Stem Cell Technologies, Inc) , el cual se basa en la formulación de Ludwig et al(7,8). Las células se mantuvieron de conformidad con las instrucciones sugeridas por 1 el fabricante. Brevemente, las células se pasaron cuándo alcanzaron aproximadamente 90% de confluencia, usualmente cada 5-7 días con relaciones divididas que varían desde 1:3 hasta 1:6. Las células se trataron con dispasa (lmg/ml de BD, Biosciences) e incubaron por 3-5 minutos a 37°C para comenzar a descargar las colonias . Las colonias se lavaron con DMEM/F12 (Mediatech) para remover la solución de dispasa. Para librar las colonias del plástico de cultivo de tejido, las cavidades se revistieron con DME /F12 y se rasparon uniformemente hasta que todas las colonias han sido desplazadas. Las colonias se transfirieron a tubos cónicos, las cavidades se la aron con D EM/F12 y las células se combinaron para recolectar¦ cualquier resto en las cavidades. Se centrifugaron por 5 minutos a 1000 rpm. Las pelotillas celulares se resuspendieron en medio mTeSR™l y ¡ se transfirieron a placas de 6 cavidades revestidas de Matrigel, en 2 mi de medio mTeSR™l por cavidad. Las células se mantuvieron a 37°C bajo 5% de C02 y el medio mTeSR™l se repuso diariamente.
Análisis de citoquímica inmunofluorescente Se ensayaron colonias de hESC libres de alimentadoras para expresión de Oct-4 y Tra-1-60 usando inmunofluorescencia. Las células se fijaron con 4% j de paraformaldehído (PFA) , se lavaron con PBS, y bloquearon con 5% de Suero de Cabra Normal (Vector Labs) , 1% de BSA (Sigma) y 0.2% de Triton-X-100 (Sigma) en PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpo primario contra Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology) o Tra-1-60 (Millipore/Chemicon) , en solución de bloqueo, durante la noche a 4°C, se lavaron con PBS e incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con biotina (Jackson ImmunoResearch Labs), en solución de bloqueo, por 45 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado adicional, las células se incubaron con estreptavidina conjugado con Alexa 954 (Invitrogen/Molecular probes) , por 15 minutos a temperatura ambiente seguido por un lavado final prolongado en PBS. Las células se montaron en Prolong Gold con DAPI (Invitrogen/Molecular Probes).
Diferenciación de hemangioblastos a partir de hESC Para inducir hESC cultivados en MEF en hemangioblastos, 80-90% de placas confluentes se disociaron por digestión de 0.05% de tripsina. Para diferenciar los hESC libres de alimentador en hemangioblastos, 85-90% de células confluentes se descargaron de la matriz de Matrigel usando el protocolo descrito anteriormente. Las células de ambas condiciones se plaquearon en discos Ultra-Bajos (Corning, Y) en medio Stemline II (Sigma) con diferentes dosis de BMP-4, VEGF y bFGF como se describe previamente!2> . La mitad del medio se reemplazó después de 48 horas con medio fresco que contiene las mismas citocinas o el mismo medio más SCF, ligando FLT3 (FL) y Tpo (20 ng/ml, R&D System) el cual depende de diferentes condiciones experimentales. Después de 3.5 días, los EB se recolectaron y disociaron por 0.05% de tripsina. Las suspensiones de células únicas se obtuvieron pasando las células a través de una aguja de calibre 22 y a través de un filtro de células de 40-µ??, recolectado por centrifugación, y resuspendido en 50-100 µ? de medio Stemline II. Se mezclaron células (0.75 x 105 a 1 x 105) con 2.5 mi de medio de crecimiento de colonia de blastos (BG ) como se describe previamente(2) , se plaquearon en discos Ultra-Bajo e incubaron a 37°C. Las colonias de blastos derivadas de tanto MEF como hESC libre de alimentador se observaron 3-4 días después de colocarlas en placas, seguido prontamente posteriormente por expansión rápida. Las células de blastos ' i (BC) se definen en el estudio actual como células obtenidas a partir de colonias de blastos de 6 días.
Enriquecimiento de precursores de hemangioblastos ] Marcadores de la superficie precursores de : BC potenciales CD31, CD34, KDR, CXCR-4, CD133, ACE, PCLiPl , PDGFRa , Tie-2, Nrp-2, Tpo-R y bFGFR-1 se seleccionaron piara enriquecimiento celular. Todos los anticuerpos son de isot'ipo IgG monoclonal de ratón y son: CD31 y CD34 (Dako Cytomatión) , KDR y Tpo-R (R&D Systems, Inc.), CXCR-4 (Abeam Inc.), Nrp¡-2, ACE, PCLP1 y PDGFRa (Santa Cruz Biotechnology) , Tie-2 (Cell Signaling Technology, Inc.), bFGFR-1 (Zymed Laboratories);, y CD133 (Miltenyi Biotech) . El montaje de cóctel de anticuerpo se realizó por el kit de Selección EasySep "Do-it-Yoursejlf" (Stem Cell Technologies) . Las suspensiones celulares derivadas de EB se centrifugaron a 1200 rpm por 4 minutos y se resuspendieron en PBS con 2% de FBS/1 mM de amortiguador EDTA a una concentración de 1-2 x 106 células/100 µ?. Las células se mezclaron con cócteles de anticuerpo diferehltes por 15 minutos a RT y después se incubaron con Nanopartículas EasySep a RT por 10 minutos adicionales. Las células seleccionadas positivas se separaron después de verter el sobrenadante cuando se coloca el tubo con las células en un sujetador Magnet . Las células positivas seleccionadas de anticuerpo (1 x 105) se mezclaron con 2.5 mi de BGM y se colocaron en placas para el desarrollo de colonia de blastos .
RT-PCR en tiempo real y análisis de datos Se extrajo ARN total a partir de EBs o hESC no diferenciadas usando its Rneasy Micro (Qiagen) , de conformidad con el protocolo del fabricante. Los ADNc se sintetizaron usando Kit de Síntesis de ADNc por PCR BD SMART (BD Biosciences) por instrucciones de manual. La RT-PCR; en tiempo real (qRT-PCR) se realizó usando Mezcla Master QPCR Green FullVelocity SYBR (Stratagene). Las reacciones , se ajustaron por triplicado con los siguientes componentes por reacción: 50ng de plantilla, 0.2 micromoles de cada cebador y mezcla Master IX. Las secuencias específicas del gen de los cebadores usados son listadas en la Tabla 1, y la temperatura de templado para todos los cebadores es 55°C. Se realizaron adquisición de datos en tiempo real y amplificación en un software Stratagene Mx3005P con MxPro versión 3.0. Se usaron las siguientes condiciones del ciclo: un ciclo de 95°C por diez minutos seguido por cuarenta ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 1 minuto, 72°C por 30 segundos seguido por un ciclo final de 95°C por 1 minuto, 55°C por 30 segundos y 95°C por 30 segundos. La cuantificación relativa de cada gen objetivo se realice basado en la normalización de umbral de ciclo (CT) a ß-actina (ACT) usando el método AACT(9) . El análisis de los datos de expresión de gen relativo usando PCR cuantitativo en tiempo real y el método 2 (-delta deltaC (T) ) (9) , en donde el Cy de cada gen examinado en las muestras experimentales se comparó con el ACT promedio de cada gen en una muestra de control de hESC no diferenciado (???t) . Después el cambio de veces en expresión se calculó como 2"??0?. Los datos de diferencia de veces negativas se convirtieron a un valor lineal "Cambio de veces en expresión" usando la siguiente fórmula: Cambio de Veces lineal en expresión = -(1/cambio de veces en expresión) .
Análisis estadísticos Todos los datos se presentaron como media ± SEM. Las comparaciones intergrupal se realizaron por la prueba-t de Studen no apareada usando el software GraphPad Prism, versión 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) , el p < 0.05 se interpretó como estadísticamente significante.
Ejemplo 2 .Ambos BMP-4 y VEGF son requeridos para desarrollo de hemangioblastos Un sistema libre de suero para inducir diferenciación de hESC hacia los linajes hemangioblásticos y hematopoyéticos se describió previamente (2-10). Aunque' ¡ se usaron BMP-4, VEGF, y un cóctel de citocinas hematopoyéticas tempranas, el requerimiento absoluto y concentraciones ' í óptimas de los factores individuales no se examinaron. Para reducir el costo y esfuerzo necesario para generar hemangioblastos para futura búsqueda y aplicaciones clínicas, los inventores examinaron específicamente los requerimientos mínimos y efectos de VEGFs, BMPs, y tres citocinas hematopoyéticas tempranas (TPO, FL y SCF) en el desarrollo eficiente de colonias de blastos a partir de hESC ' Se ¦ I encontró que el BMP-4 es absolutamente requerido para ' el desarrollo de colonias de blastos bajo condiciones libreé: de suero. No se obtuvieron colonias de blastos sin el suplemento de BMP-4 en el medio durante la formación de EB y un efecto de respuesta de dosis clara de BMP-4 se observó para! la formación de colonias de blastos a partir de hESC (Figura 1A) . Además, el BMP-4 no puede ser sustituido por otros I miembros de la familia BMP. Los BMP-2 y BMP-7 solos, o una combinación de los dos, fallan para promover el desarrolló) de BC . Además, la suplementación de BMP-2 y BMP-7 en el medio EB que contiene BMP-4, ya sea no muestra efecto (10 ng/ml) o inhibe (20 ng/ml) el desarrollo de la colonia de blastos (Figura IB) . Sin embargo, la adición de BMP-4, y BMP-2 y/o BMP-7 en el medio de crecimiento de la colonia de blastos (BGM) no tiene algún efecto en el desarrollo de colonias de blastos, sugiriendo que el BMP-4 solamente promueve la etapa de especificación hemangioblástica/mesoderma, pero no el crecimiento y expansión de BC. De manera similar, no se desarrollaron colonas de blastos cuando el VEGFi65 se eliminó a partir del medio de formación de EB . El VEGFi65 se encontró por promover el desarrollo de colonias de blastos en una manera dependiente de la dosis (Figura 1C) . El VEGF121 , una isoforma de miembros de VEGF que solamente puede enlazarse a receptores KDR y FLT1(11>, puede ser usado como un sustituto de VEGF165 para promover el desarrollo de colonias de blastos a partir de hESCs; casi números idénticos de colonias de blastos (68 + 5 contra 67 + 12) se desarrollaron cuando 50 ng/ml de ya sea VEGFi6s o VEGF121 , que es la dosis óptima bajo condiciones libres de suero,, se agregaron en medio EB. Sin embargo, contrario a BMP-4, no se obtuvieron colonias de blastos si el VEGF está ausente en BGM, demostrando que el VEGF juega un papel crítico tanto en etapa temprana de especificación hemangioblástica/mesoderma y en el crecimiento y expansión de BC.
En el reporte original de los inventores'21 , TPO, FL y. SCF se agregaron 48 horas después de colocar en placas hESC en medio de EB en un esfuerzo para promover además el crecimiento y expansión del progenitor hematopoyético temprano. Aquí se examinó si TPO, FL, y SCF jugaron algún papel en la especificación de hESC hacia el linaje de hemangioblasto/mesodermo . Los EB se formaron colocando' en placas hESCs en medio Stemline II con 50 ng/ml de B P-4 y VEGF, y se dividió en dos cavidades después de 48 horas; a una cavidad, se agregó 20 ng/ml de TPO, FL y SCF, a la otra cavidad, no se agregó factor adicional, y los EB se incubaron por otras 36 horas. Los EB entonces se recolectaron y se obtuvo suspensión celular única y se colocó en placa para la formación de colonias de blastos . Los resultados mostraron que el suplemento de TPO, FL y SCF durante la formación de EB no tiene efecto en el desarrollo de colonias de blastos, 242 ± 16 contra 287 ± 33 colonias de blastos desarrolladas por 1 x 105 células derivadas de EB tratados con y sin TPO, FL y SCF, respectivamente.
Ejemplo 3 bFGF promueve el crecimiento, pero no comprometido, de hemangioblastos a partir de hESC Estudios previos han mostrado que el suplemento1 de bFGF durante la diferenciación temprana promueve el desarrollo hematopoyético de ESC humano y murino'12'13'14'15' . De este modo, se investigó si la adición de bFGF durante la etapa de diferenciación de EB podría mejorar la formación de colonias de blastos a partir de hESC. La adición de bFGF durante la formación de EB no tiene efecto en el desarrollo de las colonias de blastos, y en efecto, a una dosis superior (40 ng/ml) inhibe la formación de colonias de blastos para líneas de hESC múltiples (Figura 2A y Figuras 3). Por el contrario, la adición de bFGF en BGM mejora significantemente el desarrollo de colonias de blastos (Figura 2A, Figura 3).
Tanto el número de colonias de blastos (p < 0.001) como el número total de BC incrementan significantemente comparado con BGM sin suplementación de bFGF. Con bFGF a dosis óptima (20 ng/ml) en BGM, las colonias de blastos son más grandes y más sanas, y fueron consistentemente cosechadas a aproximadamente 1 x 108 BCs a partir de una placa de seis cavidades de hESC WA01 de alta calidad (aproximadamente 1.2 x 107 células) después de 6 días de crecimiento, lo cual es 8 ± 1 veces superior que aquella obtenida de BGM sin el suplemento de bFGF.
Para investigar los potenciales de diferenciación de linaje de BC generadas con y sin suplementación de bFGF, números iguales de BC combinados se colocaron en placas para diferenciación de linaje hematopoyético y endotelial como se describe previamente<2) . Para formación de CFU hematopoyéticas, 129 + 9 y 86 + 22 CFUs/104 de BC se formaron a partir de BC derivadas de BGM suplementadas con y sin bFGF (20 ng/ml) , respectivamente. Además, no se observó diferencia para el desarrollo de CFU diferentes (mezcla-CFU, CFU-G, CFU-M y CFU-E) entre los dos grupos (datos no mostrados) . Para diferenciación de linaje endotelial, más BC (62 ± 3%) de BGM con bFGF (20 ng/ml) diferenciadas en células endoteliales que BC (55 ± 3%) derivadas de BGM sin suplemento de bFGF. ,Las células endoteliales a partir de ambas fuentes forman estructuras similares vasculares-capilares eficientemente después de la colocación en placas en Matrigel (Figura 2B y 2C) . Estos resultados sugieren que el bFGF promueve el crecimiento de BCs, pero no provocan diferenciación de linaje preferencial .
Ejemplo 4 Fuerte regeneración de hemangioblastos a partir de hESQ mantenidos sin células alimentadoras ; Se ha reportado que los hESC mantenidos en alimentadores de MEF contienen el ácido N-glicolilneuramínico de ácido siálico no humano (NeuSGc) <l3'7-8) y que fuentes animales de NeuSGc pueden causar una reacción inmunogénica potencial con complemento humano. El cultivo de hESC en capas alimentadoras de MEF previene la completa eliminación de NeuSGc animal, y origina intereses para las aplicaciones clínicas potenciales de hemangioblastos generados a partir de etapas de líneas de hESC bajo estas condiciones. Por lo tanto, se han tomado etapas para determinar si los hemangioblastos pueden ser generados a partir de hESC mantenidos sin alimentadores de MEF. Se pasaron tres líneas de hESC con dipasa sobre placas recubiertas con matriz de Matrigel calificada con hESC, y se mantienen en medio mTeSR como se describe en la sección Métodos y Materiales. Su " I estado no diferenciado se confirmó con teñido inmunofluorescente para la expresión de antígenos Oct-d y Tra-1-60 y morfología de colonia (Figura 4A-4H) . Estas células se recolectaron y utilizaron para el desarrollo de BC usando las condiciones optimizadas descritas anteriormente. De manera interesante, un número significantemente superior de BC se observaron con hESC libres de alimentadores comparados con hESC cultivados en alimentadores de MED cuando números idénticos de células EB se colocaron en placas (Figura 41, p < 0.05). Estos resultados se observaron para las tres líneas de hESC probadas WA01, MA01 y HUES-3 (datos no mostrados) .
Ejemplo 5 Mecanismo que fundamenta los efectos de BMP-4 y VEGF e desarrollo de hemangioblastos Para diseccionar el mecanismo molecular que fundamenta los efectos de BMP-4 y VEGF en el desarrollo de hemangioblastos a partir de hESC, los inventores compararon la expresión de genes asociados con el desarrollo de hemangioblastos en EB de 3,5 días que se formaron en el medio Stemline II tanto con y sin cada factor, así como también :con una combinación de BMP-4 y VEGF . La expresión del gen. se analizó por RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) y se comparó con sus niveles en hESC no diferenciados. Los EB se formaron sin algún factor que expresa niveles superiores de OCT-4, un marcador para hESC, que hESC no diferenciado. La suplementación de VEGF en medio EB conduce a una regulación descendente moderada de la expresión de OCT-4; mientras la adición de BMP-4 o BMP-4 más VEGF resulta en un decremento significante en la expresión de OCT-4 (p < 0.0005, Figura 5). No hubo efecto aditivo de BMP-4 y VEGF en la expresión de OCT-4. La expresión del gen T-braquiuro, el marcador más temprano expresado en células mesodérmicas , se reguló descendentemente en todas las muestras excepto los , EB derivados de cultivos que contienen tanto BMP-4 como VEGF (el último que muestra un incremento significante en su expresión (p < 0.0005). Patrones de expresión similar se observaron para CD31 y LM02 ; niveles significantemente incrementados de expresión fueron solamente detectados en EB expuestos a una combinación de BMP-4 y VEGF (p < 0.0005). El KDR, un receptor de VEGF más estudiado, ha sido mostrado por ser expresado en todas las líneas de hESC<4,5); su expresión fue dramáticamente regulada descendentemente en EB derivados de medio sin adición de factor exógeno, y con suplemento de BMP-4 o VEGF solo.
Sin embargo, un incremento moderado pero significante en la expresión de KDR se observó en EB formados en la presencia de BMP-4 y VEGF (p < 0.002), una condición que promueve el desarrollo eficiente de hemangioblastos a partir de hESC. De manera sorprendente, contrario a un reporte reciente (1 ) , reducciones sustanciales en la expresión de genes MixL y SCL/TAL-1 se detectaron en EB formados en todas las condiciones . Una explicación posible es que el crecimiento en diferentes medios libres de suero causa un patrón de expresión diferente en estos genes. Sin embargo, estos resultados sugieren que el compromiso y desarrolló de mesoderma/hemangioblastos a partir de hESC requiere tanto BMP-4 como VEGF, consistente con los resultados del desarrollo de colonia de blastos (Figura 1) .
Ejemplo 6 Identificación de marcadores de la superficie por progenitores de células de blastos En el método original (2> , los BCs se generaron colocando nuevamente en placas al día 3.5 células EB en 1% de metilcelulosa suplementado con factores definidos. Esta estrategia es importante cuando se identifican BC que poseen el potencial para formar células hematopoyéticas y endoteliales , y también es reprodücible cuando se generan BC a partir de hESC. Sin embargo, este procedimiento utiliza discos en incubadoras de cultivo de tejido estándar, y no puede ser adaptado a biorreactores rotatorios para aumento . Esta limitación es principalmente debido al hecho de que células a partir de EB del día 3.5 son heterogéneas e incluyen hESC no diferenciadas (solamente una porción de las células son progenitores de BC) . Colocar nuevamente la placa de esta población héterogénea en cultivo líquido podría !por lo tanto conducir al crecimiento de todas las células que incluyen la formación de EB secundarios a partir de hESC no diferenciados, excluyendo su posible uso en aplicaciones técnicas. Sin embargo, si un (os) marcador (es) para ; el progenitor de BC pueden ser identificados, el progenitor purificado puede ser sembrado en cultivo líquido adaptado con un biorreactor rotatorio para producción aumentada de BC . !Por lo tanto, se seleccionaron 12 moléculas de superficie celular que están asociadas con el desarrollo de derivados mesodérmicos . Los anticuerpos correspondientes se usaron para enriquecer células de EB de 3.5 días, y las células enriquecidas se sometieron a ensayo por la capacidad para formar colonias de blastos. Como se muestra en la Figura 5, células KDR+ de EB de 3.5 días generaron tres veces más colonias de blastos que las células de control , no fraccionadas (p < 0.01), lo cual es consistente con estudios previos <5). Aunque también se encontró un incremento moderado en colonias de blastos (* 1.5 veces) después de plaquear poblaciones enriquecidas CD31+ y CD34+, el incremento no alcanzó significancia estadística. Todas las otras poblaciones enriquecidas producen igual o menos colonias de blastos comparadas con células de control no fraccionadas, indicando que el progenitor de BC no expresa estas moléculas. Las células no unidas (a través del flujo) de todos los anticuerpos probados también forman números similares de colonias de blastos como las células no fraccionadas, sugiriendo que aún células KDR+, CD34+ y CD31+ representan una porción muy limitada de las células que son capaces de formar colonias de blastos .
Tabla 1. Secuencias de cebadores específicos del gen usados en qRT-PCR Ejemplo 7 Generación de células que forman colonias de hemangiomas humanos a partir de células ES humanas \ Cultivo de células ES humanas . Las lineas : de células hES usadas en este , estudio fueron previamente descritas HI y H9 (NIH-registrado como A01 y WA09) y cuatro lineas (MA01, MA03, MA40, y MA09) derivadas en Advanced Cell Technology. Células ES humanas no diferenciadas se cultivaron en células de fibroblasto embriónico de ratón (MEF ) , · no activadas (tratadas con mitomicina-C) en medio hES completo hasta que alcanzaron 80% de confluencia (Klimanskaya & McMahon; Approaches of derivation an maintenance of human ES cells: Detailed procedures and alternatives , in Handbook of Stem Cells. Volumen 1: Embryonic Stem Cells, ed. Lanza, R. et al. (Eisevier/Academíc Press, San Diego, 2004) . Después, las células hES no diferenciadas se disociaron por 0.05% ; de tripsina-0.53 mM de EDTA (Invitrogen) por 2-5 minutos y se recolectó por centrifugación a 1,000 rpm por 5 minutos.
Formación de EB. Para inducir la formación de precursor de hemangioblasto (mesoderma) , células hES (2 a 5 X 105 células /mi) se plaquearon en discos de unión ultra-baja (Corning) en medio Stemline libre de suero (por ejemplo, Stemline I o II, Sigma™) con la adición de BMP-4 y VEGFi65 (50 ng/ml, R&D Systems) y cultivaron en 5% de C02. Aproximadamente 48 horas después, el medio EB se repuso y suplemento con un cóctel de factores de crecimiento endotelial/hematopoyético temprano. Por ejemplo, la mitad del medio se removió y se agregó medio fresco con las mismas concentraciones finales de BMP-4 y VEGF, más SCF, ligando TPO y FLT3 (20 ng/ml, R&D Systems). La proteína de fusión del dominio de transducción de proteína triple (tPTD)-HoxB4 (1.5 µg/ml) se agregó al medio de cultivo entre 48-72 hr para expandir el hemangioblasto y su precursor.
Expansión de hemangioblasto . Después de 3.5-5 días, se recolectaron EB y se disociaron por 0.05% de tripsina-0.53 mM de EDTA (Invitrogen) por 2-5 min, y una suspensión celular única se preparó pasando a través de una aguja '22G 3-5 veces. Las células se recolectaron por centrifugación a 1,000 rpm por 5 minutos y se contaron. Las pelotillas celulares se resuspendieron en 50-200 µ? de medio Stemline libre de suero. Para expandir los hemangioblastos , suspensiones de células únicas de EB derivados de la diferenciación de 2 a 5 X 105 células hES se mezclaron con 2 mi de BL-CFC/medio de expansión de hemangioblasto (BGM) que contiene 1.0% de metilcelulasa en MDM de Iscove, í-2% de albúmina de suero bovino, 0.1 mM de 2-mercaptoetanol y un cóctel de factores de crecimiento. Por ejemplo, se agregó 10 g/ml de rh-Insulina, 200 g/ml de transferrina humana saturada con hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF, 3 a 6 unidades /mi de rh-EPO, 50 ng/ml de rh-SCF, 50 ng/ml ligando rh-Flt3, 50 ng/ml de rh-VEGF y 50 ng/ml de rh-BMP-4) ("rh" significa "humano recombinante" ) y 1.5 g/ml de proteína de fusión tPTD-HoxB4, con/sin 50 ng/ml de TPO y FL. Las mezclas de células se plaquearon con discos de ultra-baja unión e incubaron a 37°C en 5% de C02 por 4-7 días. Después de 4-6 días, colonias de blastos de hemangioblastos similares a uvas (referidos como BL-CF o BC) fueron visibles por microscopio. La preparación de citocina y teñido con Wright-Giemsa de las colonias de blastos derivadas de hES confirman los factores morfológicos de células' de blastos inmaduras. Para extender estos resultados a otras líneas de células hES (WA09 [H9] , MA01, MA03, MA40 y MA09 , suplementos de FL y Tpo fueron necesarios para el crecimiento sostenido de las colonias de BC (sin FL y Tpo, se obtuvieron 10-20 células pequeñas hES-BC las cuales murieron después de 4-8 días) . El Epo también fue esencial para la formación^ de BC y crecimiento en todas las líneas de células hES probadas. Estas células pueden ser fácilmente expandidas (una placa de 6 cavidades de hES genera aproximadamente 6.1 ± 0.66 [media ± SD] millones de hemangioblastos) bajo las condiciones reproducibles y bien definidas descritas anteriormente.
Para análisis inmunocitoquímico de BL-CFC, BL-CFC purificados se ci ocentrifugaron sobre laminillas de vidrio tratadas con polilisina y fijadas en 4% de formaldehído . Para examinar la expresión de muchos genes, los anticuerpos primarios se incubaron a 4°C durante la noche, seguido por anticuerpos secundarios etiquetados con tinte fluorescente, y finalmente examinados bajo microscopio fluorescente. Células BM humanas normales, células K562 y HUVEC se usaron como I controles. ; Los análisis inmunohistoquímicos revelaron que <las proteínas GAT A-l y GAT A-2 se expresan en BC o BL'-CF derivados de células hES, proteínas LM02, CXCR-4, receptores TPO y EPO, y reaccionan fácilmente con anticuerpo específico para CD71, el receptor de transferrina (Tabla 1 y Fig. l;6d-v) . Las células expresan poca o ninguna CD31, CD34 y KDRJ, u otras moléculas de adhesión. Como se describe . más completamente en el documento 11/787,262, las células ' íson . j células que forman colonias de hemangioma. j I Ejemplo 8 · i Expansión de un Tipo de Célula Distinto : Célula de hemangioma sin injertar ' ! Como se detalla anteriormente y en el documento 11/787,262, células que forman colonias de hemangioma ¡ se generaron después de la expansión por aproximadamente 4-7 días. Bajo ciertas condiciones, cultivos adicionales de! EB más allá de 7 días producen grandes números de un tipój de célula distinto. Como se describe a través de esta, este distinto tipo de célula progenitora es referido como una célula de hemangioma sin injertar.
Los EB se cultivaron como se describe anteriormente. Al día 7 del protocolo de expansión, después de la formación de agrupamientos similares a uva indicativo de células que forman colonias de hemangiomas, 5 mi de médio BL se agregó en la parte superior de estos cultivos de griipos de células similares a uvas. Los cultivos son semi-sólidós y contienen 10 mL de medio de metilcelulosa.
Después de la adición de medio fresco, las células son cultivadas unos 3-6 días adicionales, para un total; de 10-13 días en post-formación de EB. I i La adición de medio fresco mayormente aumenta! la proliferación continua de células y supervivencia durante estos periodos prolongados de cultivo. Después de 10-13 días en cultivo, las células se purificador de los grupos. Similar a células que forman colonias de hemangiomas, estas células de hemangioma sin injertar formaron grupos similares a uvas y fueron poco adherentes entre sí. Sin embargo, como se detállla abajo, estas células no fueron idénticas a las células previamente definidas que forman colonia de hemangiomas.
Cuando las células se separaron de los grupos en el día 10, y el rendimiento de células comparado con;' el rendimiento de células que forman colonias de hemangiomas' en general observado cuando se recolecta al día 7, se observó un incremento dramático en el número de células obtenidas.
Específicamente, más de 5 veces más células se purificaron al día 10 contra el día 7. Como tal, cantidades más grandes de células de hemangioma sin injertar pueden ser fácilmente producidas y usadas, por ejemplo, para producir cantidádes más grandes de tipos de célula diferenciadas.
Las células identificadas después de 10-13 días de cultivo de expansión son similares, en muchos sentidos, a las células previamente identificadas que forman colonias de hemangiornas . Por ejemplo, las células son típicamente pbco adherentes entre sí (similares a células que forman colonias de hemangiomas) . Adicionalmente, células identificadas después de 10-13 días de cultivo de expansión se diferencian in vitro para producir tipos de células hematopoyéticas . Específicamente, células de hemangioma sin injertar retienen la capacidad para formar CFU hematopoyéticas. Las células son separadas de los grupos similares a uvas después de 10-13 días en cultivo y plaqueadas en medio de metilcelulosa semi-sólido que contiene citocinas que soportan el crecimiento, de CFU hematopoyéticas. Después de 10-12 días en cultivo, CFU de eritrocito, CFU de granulocito, CFU de macrófago y CFU hematopoyéticas mezcladas se observaron, de esta f0rma demostrando el potencial para producir tipos de células hematopoyéticas.
Debido a las similitudes entre células que forman colonias de hemangioma y las células de hemangioma sin injertar descritas en la presente, estas células no tienen el mismo potencial de diferenciación. Sin desear ser ligado por cualquier teoría particular, las células de hemangioma sin injertar pueden representar un tipo de célula distintamente desarrollada que, contrario a células que forman colonias de hemangioma, no son ampliamente capaces de injertarse en la médula ósea después del suministro in vivo a un animal inmunodeficiente . Específicamente, 1-5 millones células de hemangioma sin injertar humanas (por ejemplo, células cultivadas por 10-13 días posteriores a la formación de EB) , se administraron a ratones NOD/SCID. La examinación de 24 ratones falló para revelar el injerto de células humanas en la médula ósea o vaso. Por el contrario, cuando números similares de células humanas que forman colonias de hemangioma (por ejemplo, células cultivadas por 6-8 días) fueron administradas a ratones NOD/SCID, se examinaron células humanas injertadas en la médula ósea de todos los 12 animales .
Otros métodos ilustrativos, composiciones, preparaciones y características de la invención son descritos en los siguientes documentos: Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262, presentada en Abril 13, 2007, y titulada "Células que forman colonias de hemangioma." Las enseñanzas de esta solicitud están por este medio incorporadas por referencia en su totalidad.
Se debe notar que los Solicitantes consideran todas las combinaciones operables de las modalidades ilustrativas descritas ser materia objeto patentable que incluye combinaciones de la materia objeto descrita en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262. Por ejemplo, las células de hemangioma sin injertar proporcionadas aquí.' (i) pueden tener una o más de las propiedades de las células como se describe en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262, (ii) pueden ser formuladas como composiciones, preparaciones, preparaciones criopreservadas , o soluciones mezcladas o purificadas como se describe en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262, (iii) pueden ser usadas terapéuticamente y en bancos de sangre como se describe en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262, y (iv) pueden ser usadas para generar parcialmente y terminalmente tipos de células diferenciadas para uso in vi tro o in vivo como se describe en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262. Además, las células de hemangioma sin injertar se pueden derivar de células ES, células ED, células troncales pluripotentes (que incluyen células iPS) etc., usando cualquiera de las metodologías descritas en la presente y en la Solicitud Estadounidense No. de serie 11/787,262.
Ejemplo 9 Generación eficiente de hemangioblastos a partir de iPSC humanos Generación de iPSC de alta calidad ' En varios de los estudios preliminares del inventor, son capaces de generar colonias de hemangioblastos a partir de IMR90 humano (Figura 12c) e iPSC de Adulto3-4 (datos no mostrados), usando las condiciones optimizadas! de diferenciación de hESC. Aunque su eficiencia fue muy inferior comparada con hESC, claramente demostraron el potencial: de diferenciación de hemangioblasto de iPSC humanos. La eficacia inferior observada puede ser debido a factores múltiples, uno de ellos es la calidad del iPSC. Los inventores observaron esto por ser uno de los factores más importantes para generación altamente eficiente de hemangioblastos. Los cultivos de hESC de alta calidad están compuestos de colonias con fronteras herméticas con signos mínimos de diferenciación como se observa bajo microscopio, a aproximadamente 80% de confluencia, pero sin tocarse entre sí. Se hacen crecer a una tasa moderada: 1:3, hESC de pasos divididos alcanzarán la confluencia en 3-5 días con teñido positivo de marcadores de pluripotencia en casi cada célula. Los hESC de alta cali'dad usualmente generan un número de células EB (por ejemplo, 2 x 106 hESC de alta calidad generan «2-3 x 106 células EB después de 3.5 días). Las etapas críticas para obtener iPSC de alta calidad incluyen: (1) pasos con tripsina contra colagenasa. Los inventores han demostrado que hESCs puede ser pasado rutinariamente por tripsina/EDTA después que de la adaptación inicial de cultivos mecánicamente pasados se ha realizado (Klimanskaya et al., Approaches of derivation and maintenan.ce of células ES humanas: Detailed procedures and alternatives . In: Lanza Rea, ed. Handbook of Stem Cells. Volumen 1: Embryonic Stem Cells. New York, USA: Elsevier/Academic Press, 2004:437-449.). En la experiencia de los inventores, la tripsina funciona mejor que la colagenasa IV ampliamente usada debido a que produce grupos de células más pequeños (2-5 células) y células únicas que forman colonias de tamaño similar y más uniformemente distribuidas, lo cual eliminará el contacto prematuro entre colonias y limitará la diferenciación espontánea, en donde el paso de colagenasa resulta en colonias más grandes que muestran diferenciación más extensiva y no tienen que ser pasadas ya sea a una relación de división inferior o antes de que se. alcance la densidad deseada del cultivo. En total, el paso de tripsina/EDTA permite la capacidad para aumentar el cultivo 3-4 veces más rápido que la colagenasa y dar una población celular homogénea. Estas observaciones también pueden ser válidas para iPSC humanas. Los experimentos de inventores mostraron que las iPSC humanas pueden ser adaptadas a la digestión de tripsina, y estas células mantienen el estado no diferenciado después de más de 20 pasos; (2) Mantenimiento con fibroblastos embriónicos de ratón (alimentador de MEF) o libre de alimentador: mantenimiento a largo plazo de hESC e iPSC requiere alimentadores de MEF. El cultivo de hESC e iPSC en capas alimentadoras de MEF previene la completa eliminación de componentes animales, y origina intereses para las aplicaciones clínicas potenciales de derivados generados de hESC e iPSC mantenidas bajo estas condiciones. Pori lo tanto, la primera etapa ha sido tomada para determinar si los hemangioblastos se pueden generar a partir de hESC mantenidos en matriz de Mátrigel en medio de mTeSR. Los inventores han demostrado que un número significantemente superior (incremento de 3 veces) de hemangioblastos se generó con hESC libre de alimentador comparado con hESC cultivadas ' en alimentadores de MEF cuando números idénticos de células EB se plaquearon (p < 0.05) para las tres líneas de hESC probadas WA01, MA01 y HuES-3 (Lu et al., Regen Med 2008; 3:693-704.). Los inventores después iniciaron los experimentos de cultivar iPSC humanas en el sistema libiré; de alimentador mencionado anteriormente, e iPSC humanos mantenidos en condición libre de alimentador que expresan los marcadores de pluripotencia de Nanog, Oct-4, SSEA-4, y Tra-1-60 (Figura 11) . Si los iPSC humanos a partir de condición libre de alimentador que diferenciarán a hemangioblastos con alta eficiencia serán probados.
Optimización de formación y diferenciación de cuerpos embrioides (EB) : Humanos El iPSC mostró escasa capacidad de supervivencia después de la disociación celular y durante la formación de EB, un fenómeno también observado para hESC . Se ha mostrado que además de un inhibidor de cinasa asociado con Rho selectivo (ROCK) . El Y-27632, a medio de formación de EB libre de suero previene a hESC de apoptosis, mejora la formación de EB, y promueve la diferenciación (Watanabe et al. Nat Biotechnol 2007; 25:681-686). Los experimentos mostraron que el suplemento de Y-27632 en el medio de formación y diferenciación de EB libre de suero resultó en mejor formación de EB a partir de células iPS(IMR90)-l humanas que el medio de control : EBs en medio StemLine II más citocinas solamente son usualmente más pequeñas con muchas células muertas después de 24 horas; en donde EB en el medio agregado con Y-27632 son lisas y grandes con algunas células muertas que las circundan (Figura 12a y 12b) , indicando que se realizaron EB más sanos. Después del plaqueado para formación de colonia de blastps, células de EB tratadas con Y-27632 desarrollaron más y más sanas colonias de blastos que las derivadas de EB sin tratamiento con Y-27632 (Figura 12,c y 12d) , generando >2 veces más de hemangioblastos . Estudios previos también sugieren que la insulina, un componente en casi todos los medios de cultivo celular que incluyen medio StemLine II usado en el sistema de formación de EB descrito en la presente, es un potente inhibidor de diferenciación de mesoderma de hESC, posiblemente a través de la trayectoria de señalización PI3K/Akt, inhibición de la diferenciación mesodérmica mejorada de la trayectoria de señalización de PI3K/Akt de hESC en condiciones libres de suero (Freund et al., Stem Cells 2008:26:724-733.). Los resultados mostraron que la suplementación con un inhibidor de la trayectoria de señalización de PI3K/Akt en el medio de formación y diferenciación sustancialmente incrementa la formación de hemangioblastos a partir de hESC MA09. Un incremento de >2.5 veces de hemangioblastos se obtuvieron de discos tratados ;con inhibidor de PI3K/Akt comparado con discos de control. De manera similar, la suplementación con el inhibidor de trayectoria de señalización PI3K/Akt solo o más Y-27632 durante la formación de EB también resulta en más y más saludables colonias de blastos a partir de células iPS(IMR90)-l que los controles (Figura 12e) , produciendo 2.1 veces y 2.6 veces más hemangioblastos para EB tratado con inhibidor de PI3K/Art e inhibidor PI3K/Art más EB tratados con inhibidor ROCK, respectivamente. Los hemangioblastos fueron entonces purificados y plaqueados bajo condiciones para diferenciación de células endoteliales o hematopoyé icas . Como se muestra en la Figura 12f-12j, estas células son diferenciadas en tanto células hematopoyéticas como endoteliales después de plaquearlas nuevamente bajo condiciones apropiadas. ¦ i Referencias 1. Wagner RC : Endothelial cell embryology and growth. Adv. Microcirc. 9, 45-75 (1980) . 2. Lu SJ, Feng Q, Caballero S et al: Generation of functional hemangioblastos from human embryonic stem cells. Nat. Methods 4(6) , 501T509 (2007) . 3. Wang L, Li L, Shojaei F et al: Endothelial 'and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21(1) , 31-41 (2004) . 4. Zambidis ET, Peault B, Park TS, Bunz F, Civin Cl: Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood 106 (3 ) , 860-870 (2005) . 5. Kennedy M, D ' Souza SL, Lynch-Kattman M, Schwantz S, Keller G: Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures. Blood 109(7) , 2679-2687 (2007) . 6. Klimanskaya I, McMahon J. Approaches of derivation and maintenance of human ES cells: Detailed procedures and alternatives . In: HandJbook of Stem Cells.
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Varias modalidades de la invención son descritas anteriormente en la Descripción Detallada. Mientras estas descripciones directamente describen las modalidades anteriores, se entiende que aquellos expertos en la técnica pueden concebir modificaciones y/o variaciones a las modalidades específicas mostradas y descritas en la presente. Cualquiera de tales modificaciones o variaciones que caen dentro del alcance de esta descripción están propuestas para ser incluidas en esta también. A menos que se note específicamente, es la intención de los inventores que las palabras y frases en la especificación y reivindicaciones proporcionan los significados ordinarios y habituales! a aquellos de habilidad ordinaria en las artes aplicable (s ) .
La descripción anterior de las varias modalidades de la invención conocida por el solicitante al momento de la presentación de la solicitud ha sido presentada y es propuesta para los propósitos de ilustración y descripción. La presente descripción no se pretende ser exhaustiva ni limitar la invención a la forma precisa descrita y muchas variaciones y modificaciones son posibles en vista de las enseñanzas anteriores. Las modalidades descritas sirven para explicar los principios de la invención y su aplicación práctica y permite a otros expertos en la técnica utilizar la invención en varias modalidades y con varias modificaciones como sean adecuadas al uso particular contemplado. Por lo tanto, se pretende que la invención no sea limitada a las modalidades particulares descritas para llevar a cabo' la invención.
Mientras particular modalidades de la presente invención han sido mostradas y descritas, será obvio para aquellos expertos en la técnica que, basados en las enseñanzas aquí, se pueden hacer cambios y modificaciones sin apartarse de esta invención y sus aspectos más amplios y, por lo tanto, las reivindicaciones adjuntas son abarcadas dentro de su campo, y todos los cambios y modificaciones están dentro del alcance y campo verdadero de esta invención. Se entenderá por aquellos dentro de la técnica que, en general, los términos usados aquí son en general propuestos como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "que incluye" debe ser. interpretado como "que incluye pero no se limitan a, " el término "que tiene" debe ser interpretado como "que tiene al menos", el término "incluye" debe ser interpretado como "incluye pero no se limita a", etc.).

Claims (183)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos in vi tro, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; y (b) agregar al menos dos factores de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides, en donde dichas células troncales pluripotentes, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) y (b) del método, y en donde al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF .
2. Un método para generar y expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos in vi tro, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células troncales pluripotentes en cuerpos embrioides; Y (b) agregar al menos dos factores de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en los cultivos de cuerpos embrioides, (c) los cuerpos embrioides son desagregados ' en células individuales; (d) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde ' el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células que forman colonias de hemangiomas humanos en dicho cultivo que comprende dichas células individuales, en donde dichas células troncales pluripotentes, cuerpos embrioides y células que forman colonias de hemangiomas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a)-(d) de dicho método, y en donde al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la célula troncal pluripotentei es una célula troncal embriónica .
4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox (homeocajaj o una variante funcional o una variante activa de la misma.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína homeobox (homeocaja) comprende una proteína H0XB4, o una variante funcional o una variante activa de la misma.
6. El método de conformidad con la reivindicación 4 o reivindicación 5, caracterizado porque el factor de crecimiento se agrega al cultivo en la etapa (b) múltiples veces a través de la etapa (b) . [
1. El método de conformidad con la reivindicación 4 o reivindicación 5, caracterizado porque el factor de crecimiento se agrega al cultivo en las etapas (b) y (d) múltiples veces a través de la etapas (b) y (d) .
8. El método de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, caracterizado porque la proteína se agrega una vez al día.
9. El método de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, caracterizado porque la proteína se agrega una vez cada tercer día.
10. Una célula que forma colonia de hemangioma aislado, caracterizada porque sé hace por el método de conformidad con la reivindicación 1.
11. Una célula que forma colonia de hemangioma aislado, caracterizada porque se hace por el método de conformidad con la reivindicación 2.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , proteínas morfogénicas óseas (BMP) , factor de célula troncal (SCF) , FLT-3L (FL) trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO) .
13. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o proteína morfogénica ósea (BMP), o am os, se agregan a la etapa (a) dentro de 0-48 horas de cultivo celular.
14. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el factor de célula troncal (SCF), Flt-3L (FL) o trombopoyetina (TPO) , o cualquier combinación de las mismas, se agregan al cultivo dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) .
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque el factor de crecimiento se agrega a la etapa (b) dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) .
16. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el factor de crecimiento se agrega a la etapa de cultivo (b) dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) .
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a la etapa (b) .
18. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d) .
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque comprende la etapa de purificar las células que forman colonias de hemangiomas humanos a partir del cultivo.
20. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la etapa de purificar las células que forman colonias de hemangiomas comprende la etapa de usar cromatografía en columna de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-CD7.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porgue comprende la etapa de aislar las células que forman colonias de hemangiomas humanos a partir del cultivo.
22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa de aislar las células que forman colonias de hemangiomas comprende una etapa de aislar las células que forman colonias de hemangiomas por tamaño y/o por morfología.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque el factor de crecimiento es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteína (PTD) .
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la PTD y la HOXB4 son conjugadas vía un enlazador.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el dominio de transducción; de proteína (PTD) es una proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma.
26. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la HOXB4 es HOXB4 de mamífero.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la HOXB4 de mamífero es HOXB4 humana o de ratón.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la HOXB4 de mamífero es HOXB4 humana .
29. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la H0XB4 comprende una proteína de longitud completa.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la H0XB4 comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: l o SEC ID NO: 3.
31. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la PTD comprende una o más copias; de un polipéptido TAT con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14.
32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la proteína TAT comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el cultivo celular que comprende células troncales pluripotentes humanas se deriva de una biblioteca de células troncales embrionicas humanas, en donde la biblioteca de células troncales embrionicas humanas comprende células troncales, cada una de las cuales es hemicigota u homocigota por al menos un alelo de HC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células troncales es hemicigoto u homocigoto para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca, en donde el método genera una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas, cada una de las cuales es hemicigota u homocigota por al menos un alelo de MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células troncales es hemicigoto u homocig'oto para una serie diferente de alelos de MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la biblioteca de células troncales embriónicas humanas comprende células troncales que son hemicigotas u homocigotas por todos los alelos de MHC presentes en una población humana, en donde el método genera una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas que comprende células que forman colonias de hemangiomas que son hemicigotas u homocigotas por todos los alelos de MHC presentes en una población humana.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque comprende la etapa de cultivar las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas .
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque comprende la etapa de cultivar las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas.
37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la condición comprende cultivar lias células que forman colonias de hemangiomas humanos en placas i de cultivo recubiertas con fibronectina .
38. El método de conformidad con cualquiera de' las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el cultivo comprende al menos 1 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos . 1
39. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porgue el cultivo comprende una cantidad seleccionada a partir del grupo que consiste de al menos 2 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos, al menos 3 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos, y al menos 4 X 105 células que forman colonias' de hemangiomas humanos .
40. Una célula que forma .colonia de hemangioma humano caracterizada porque se prepara por el método ¡ de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 17, o 18.
41. Una solución de células que forman colonias de hemangiomas humanos, caracterizada porque comprende : al menos 1 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos .
42. La solución de conformidad con la reivindicación 42 , caracterizada porque la solución es inyectable a un sujeto. j
43. La solución de conformidad con ¡ la reivindicación 42 , caracterizada porque la solución ¡ es adecuada para congelamiento .
44 . La solución de conformidad con : la reivindicación 42 , caracterizada porque la solución comprende al menos 2 X 106 células que forman colonias de hemangidmas humanos, al menos 3 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos o al menos 4 X 106 células que forman colonias de hemangiomas humanos .
45 . La solución de conformidad con la reivindicación 42 , caracterizada porque células que forman colonias de hemangiomas humanos son capaces de diferenciar en al menos células endoteliales o hematopoyéticas. j
46 . Uso de la solución de conformidad íleon cualquiera de las reivindicaciones 41 -45 , para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad que se puede tratar por la administración de células que forman colonias de hemangiomas, células hematopoyéticas o células endoteliales . !
47 . Un método para administrar células que forman colonias de hemangiomas humanos a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39; (c) administrar algunas o todas las células que forman colonias de hemangiomas humanos al paciente.
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas son elaboradas cultivando sin células alimentadoras .
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque células que forman colonias : de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
50. Un método para administrar células troncales t hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -39; (c) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque las células que forman colonias! de hemangiomas son elaboradas cultivando sin células alimentadoras . i
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las células que forman coloniasj de ¦ j hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 ha:sta 4 millones de células. :;
53. Un método para administrar células endoteliales humanas en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de : 1 ; (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias ; de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39; | (c) diferenciar las células que forman colonias! de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente. j
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque las células que forman colonias: de hemangiomas son elaboradas cultivando sin céliilas alimentadoras.
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
56. Un método para tratar un trastorno de célula troncal hematopoyética en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39; (c) diferenciar las células que forman colonias^ de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas ; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
5 . El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas son elaboradas cultivando sin células alimentadoras . !
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque células que forman colonias ; de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
59. Un método para tratar un trastorno de célula endotelial en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39; (c) diferenciar células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas las células endoteliales humanas al paciente.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas son elaboradas cultivando sin células alimentadoras .
61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque células que forman colonias ; de hemangiomas humanos están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-61, caracterizado porque el trastorno de célula endotelial se selecciona a partir del grupo que consiste de infarto al miocardio, apoplejía, aterosclerosis e isquemia .
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la isquemia ocurre en el cerebro, extremidades, corazón, pulmones, piel y ojos.
64. Un método para producir células troncales hematopoyéticas humanas in vitro, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -39; y (b) hacer crecer células que forman colonias ¡ de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para indücir la diferenciación de las células que forman colonias de hemangiomas humanos en células troncales hematopoyéticas humanas .
65. Una célula troncal hematopoyética humana caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 64.
66. Un método para producir células endoteliales humanas in vitro, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) suministrar células que forman colonias de hemangiomas humanos elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39; y (b) hacer crecer a las células que forman colonias de hemangiomas humanos bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células que forman colonias de hemangiomas humanos en células endoteliales humanas .
67. Una célula endotelial humana caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 66.
68. Una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas humanos caracterizada porque se elabora por un método de conformidad con ya sea la reivindicación 33 o reivindicación 34.
69. Un método para tratar un paciente humano- en necesidad de tratamiento que involucra administrar células troncales hematopoyéticas humanas o células endoteliales humanas al paciente, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) seleccionar el paciente; (b) identificar proteínas de MHC expresadas en la superficie de las células del paciente; (c) proporcionar una biblioteca de células que forman colonias de hemangiomas humanos de conformidad con la reivindicación 68; (d) seleccionar las células que forman colonias de hemangiomas humanos que son compatibles con las proteínas de MHC del paciente en las células del paciente; (e) diferenciar las células que forman colonias de hemangiomas humanos identificadas en la etapa (d) en células troncales hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas, dependiendo de la necesidad; (f) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas a partir de la etapa (e) al paciente. '
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el método se realiza en un centro regional.
71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el centro regional es un hospital'. i
72. Un método para expandir células que forman colonias de hemangiomas, caracterizado porque comprende hacer crecer células de mamífero que forman colonias de hemangiomas en medio libre de suero en la presencia de una proteína que comprende BMP4 y VEGF o equivalentes funcionales o fragmentos activos de los mismos en una cantidad suficiente para soportar la proliferación de las células que forman colonias de hemangiomas .
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas son enriquecidas, purificadas o aisladas a partir de sangre de cordón umbilical, sangre periférica, o médula ósea.
74. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas son células que forman colonias de hemangiomas humanos .
75. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas están creciendo in vitro para lograr al menos I X 106 células que forman colonias de hemangiomas.
76. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el medio libre de suero adémás comprende una proteína homeobox (homeocaja) , un equivalente funcional o un fragmento activo de la misma.
77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la proteína homeobox, equivaleinte funcional o fragmento activo de la misma es una proteína HOXB4 o un equivalente funcional o un fragmento activo de la misma.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la HOXB4 es H0XB4 de mamífero.
79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la HOXB4 de mamífero es HOXB4 humana o de ratón.
80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque la H0XB4 de mamífero es HQXB4 humana .
81. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la H0XB4 comprende una proteíná de longitud completa.
82. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la H0XB4 comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: l o SEC ID NO: 3.
83. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el medio libre de suero además comprende una proteína de fusión que comprende H0XB4 y un dominio de transduccion de proteína (PTD) .
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el dominio de transduccion de proteína (PTD) es una proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma.
85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la proteína TAT comprende : la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14.
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la PTD comprende una o más copias de un polipéptido TAT con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14.
87. Un método para inducir tolerancia en un recipiente humano a un aloinjerto donador caracterizado porque comprende las etapas de : (a) administrar al recipiente un agente que inhibe la co-estimulación de células-T; (b) introducir en el recipiente células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas por el método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células que forman colonias de hemangiomas son compatibles con respecto al donador, y (c) implantar el aloinjerto en el recipiente, en donde las células que forman colonias de hemangiomas humanos inducen tolerancia en el recipiente al aloinjerto,
88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el agente que inhibe la coestimulación de células T es un agente que inhibe ; la i interacción CD40-ligando CD40. !
89. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el método además comprende la etapa de administrar un agente que inhibe la interacción CD28-B7!.
90. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87-89, caracterizado porque el método no comprende la etapa de irradiación tímica o deplecióh o inactivación de células T.
91. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87-89, caracterizado porque el método además comprende la etapa de administrar irradiación tímica al recipiente.
92. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87-89, caracterizado porque el método además comprende la etapa de administrar al recipiente un tratamiento que agota o inactiva células T.
93. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87-89, caracterizado porque el método además comprende las etapas de administrar al recipiente irradiación tímica y un tratamiento que agota o inactiva células T.
94. Un método para inducir tolerancia en un recipiente humano a un aloinjerto donador caracterizado porque comprende las etapas de : (a) crear espacio tímico en el recipiente; (b) agotamiento o inactivación de células-T reactivas del donador en el recipiente; (c) introducir en el recipiente células que forman colonias de hemangiomas humanos generadas por el método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células que forman colonias de hemangiomas son compatibles con respecto al donador, y (d) implantar el aloinjerto en el recipiente,! en donde las células que forman colonias de hemangiomas humanos inducen tolerancia en el recipiente al aloinjerto.
95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el espacio tímico se crea administrando al recipiente al menos un tratamiento seleccionado a partir del grupo que consiste de irradiación tímica, esteroides, corticoesteroides , brequinar, y un químico o fármaco supresor inmune.
96. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el espacio tímico se crea administrando irradiación timica al recipiente.
97. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el espacio tímico se crea administrando un químico o fármaco supresor inmune al recipiente.
98. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el espacio tímico se crea administrando ciclosporina al recipiente.
99. El método de conformidad con la reivindicación 87 o reivindicación 94, caracterizado porque se proporcionan múltiples administraciones de células que forman colonias de hemangiomas al recipiente.
100. El método de conformidad con la reivindicación 87 o reivindicación 94, caracterizado porque la tolerancia se induce en la ausencia de espacio hematopoyético creado por irradiación de cuerpo completo.
101. El método de conformidad con la reivindicación 87 o reivindicación 94, caracterizado porque las células que forman colonias de hemangiomas humanos y el aloinjerto se obtienen a partir del mismo donador.
102. El método de conformidad con la reivindicación 87 o reivindicación 94, caracterizado porque las células ,que forman colonias de hemangiomas humanos y el aloinjerto se obtienen a partir de diferentes donadores.
103. Una célula de hemangioma humano sin injertar, caracterizada porque la célula puede diferenciarse para , producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas , en donde la célula de hemangioma no tiene la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
104. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con la reivindicación 103, caracterizada porque la célula de hemangioma expresa algunas pero no todas las proteínas las cuales distinguen células que forman colonias i de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
105. La célula de hemangioma sin injertar : de conformidad con la reivindicación 103, caracterizada porque la célula de hemangioma tiene una o más características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero .
106. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con la reivindicación 103, caracterizada porque la célula de hemangioma es poco adherida a otras células de hemangiomas .
107. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con la reivindicación 104, caracterizada porque la célula de hemangioma humano no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133.
108. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con la reivindicación 104, caracterizada porque la célula de hemangioma humano expresa proteínas LM02 y GATA2.
109. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 103 a 108, caracterizada porgue el hospedero es un mamífero.
110. La célula de hemangioma sin injertar de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada porque el mamífero es un humano.
111. Un cultivo celular caracterizado porque comprende una población sustancialmente purificada de células de hemangioma humano sin injertar, en las cuales las células pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde las células de hemangioma no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero .
112. Un cultivo celular caracterizado porque comprende células de hemangioma humano sin injertar diferenciadas a partir de células derivadas de embriones, en donde las células de hemangioma sin injertar pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, y en donde las células de hemangioma no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
113. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 111 o 112, caracterizado porque las células de hemangioma sin injertar expresa algunas pero no todas las proteínas las cuales distinguen células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
114. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 111 o 112, caracterizado porque las células de hemangioma sin injertar tiene una o más de las características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
115. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 111 o 112, caracterizado porque la célula de hemangioma es poco adherida a otras células de hemangiomas;.
116. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado porque la célula de hemangioma humano no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133.
117. El cultivo celular de conformidad con, la I reivindicación 113, caracterizado porque la célula de hemangioma humano expresa proteínas LM02 y GATA2.
118. Un cultivo celular caracterizado porque comprende una célula hematopoyética diferenciada a partir de las células de hemangioma sin injertar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 103-110.
119. Una solución de células de hemangioma humano sin injertar, caracterizada porque comprende al menos 1 X 106 células de hemangioma humano sin injertar, al menos 2 X 106 células de hemangioma humano sin injertar, al menos 3 X 106 células de hemangioma humano sin injertar, o al menos 4 X 106 células de hemangioma humano sin injertar.
120. La solución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119, caracterizada porque las células de hemangioma humano sin injertar pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, y en donde las células de hemangioma sin injertar no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero .
121. La solución de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque la célula de hemangioma sin injertar expresa algunas pero no todas las proteínas las cuales distinguen células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero.
122. La solución de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque la célula de hemangioma sin injertar tiene una o más características de células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero .
123. La solución de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque la célula de hemangioma es poco adherida a otras células de hemangiomas .
124. La solución de conformidad con - la reivindicación 121, caracterizada porque la célula de hemangioma humano no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133.
125. La solución de conformidad con la reivindicación 121, caracterizada porque la célula de hemangioma humano expresa proteínas LM02 y GATA2.
126. La solución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119-125, caracterizada porque la solución es inyectable a un sujeto o adecuada para congelamiento.
127. Uso de la solución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119-125, para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad que se puede tratar por la administración de células de hemangioma sin injertar o células hematopoyéticas .
128. Una preparación farmacéutica caracterizada porque comprende una población sustancialmente purificada de células de hemangioma humano sin injertar, en la cual la ^célula puede diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde la célula de hemangioma no tiene la capacidad de injertar y repobla la médula ósea en un hospedero .
129. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 128, caracterizada porque la célula, i de hemangioma sin expresar expresa algunas pero no todas ¡las proteínas las cuales distinguen células que forman colonias de hemangiomas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un hospedero. j
130. La preparación farmacéutica de conformidad ;Con la reivindicación 128, caracterizada porque la célula de hemangioma sin expresar tienen una o más de 'las características de células que forman colonias de hemangiQmas humanos que tienen la capacidad de injertar y repoblar' la médula ósea en un hospedero.
131. La preparación farmacéutica de conformidad: !con la reivindicación 128, caracterizada porque la célula; de hemangioma es poco adherida a otras células de hemangiomas;.
132. La preparación farmacéutica de conformidad ¡con la reivindicación 129, caracterizada porque la célula; de hemangioma humano no expresa una o más proteínas seleccionadas a partir de CD34, CD31, KDR y CD133.
133. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 129, caracterizada porque la célula j de hemangioma humano expresa proteínas LM02 y GATA2. j
134. La preparación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 128-133, caracterizada porque la preparación comprende al menos 1 x 106 células de hemangioma humano sin injertar.
135. La preparación farmacéutica de conformidad con I la reivindicación 134, caracterizada porque la preparación comprende al menos 5 x 106 células de hemangioma humano 'sin injertar . , \
136. Una preparación criopreservada de las células de hemangioma humano sin injertar caracterizada porque es| de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-110. S
137. La preparación criopreservada de conformidad con la reivindicación 136, caracterizada porque ¡ la preparación comprende al menos 1 x 106 células de hemangibma humano sin injertar, al menos 2 x 106 células de hemangi'oma humano sin injertar, al menos 3 x 106 células de hemangioma j humano sin injertar, al menos 4 x 106 células de hemangi'oma humano sin injertar, o al menos 5 x 106 células de hemangipma ' i humano sin injertar.
138. Un método para generar y expandir células : de hemangioma humano sin injertar in vitro, caracterizado porque el método comprende las etapas de: j (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embrión humano en medio libre de suero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; y (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangioma humano sin injertar en los cultivos de cuerpos embrioides, en donde los cuerpos embrioides son cultivados por 10-13 días, y en donde didhas células derivadas de embriones, cuerpos embrioides y células de hemangioma sin injertar están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a) y (b) del método.
139. Un método para generar y expandir células de hemangioma humano sin injertar in vitro, caracterizado porque i el método comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embrión humano en medio libre de silero en la presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; y ; (b) agregar al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangioma humano sin injertar en 'los cultivos de cuerpos embrioides, (c) los cuerpos embrioides son desagregados en células individuales; · (d) agregar al menos un factor de crecimiento! al cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando el cultivo en medio libre de suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células de hemangioma humano sin injertar en dicho cultivo que comprende dichas células individuales, en donde el cultivo de células individuales son cultivados por 10-13 días, y en donde dichas células derivadas de embriones, cuerpos embrioides y células de hemangioma sin injertas están creciendo en medio libre de suero a través de las etapas (a)-(d) de dicho método .
140. El método de conformidad con la reivindicación 138 or 139, caracterizado porgue la célula derivada de embrión es una célula troncal embriónica.
141. El método de conformidad con la reivindicación 138 o 139, caracterizado porque el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox (homeocaja) o una variante funcional o una variante activa de la misma.
142. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la proteína homeobox (homeocaja) comprende una proteína HOXB4 , o una variante funcional o una variante activa de la misma.
143. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-142, caracterizado porque el factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , proteínas morfogénicas óseas (BMP) , factor de célula troncal (SGF)i FIt- 3L (FL) trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO) .
144. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o proteína morfogénica ósea (BMP) , o ambos, se agregan a la etapa (a) dentro de 0-48 horas de cultivo celular.
145. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque el factor de célula troncal (SCF) , FIt-3L (FL) o trombopoyetina (TPO) , o cualquier combinación de las mismas, se agregan al cultivo dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) .
146. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 141 -142, caracterizado porque el factor' de crecimiento se agrega a la etapa (b) dentro de 48-72 horas a partir del inicio de la etapa (a) .
147. El método de conformidad con la reivindicación 138, caracterizado porque además comprende la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a la etapa (b) . ¡
148. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque además comprende la etapa de agregar eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d) .
149. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-140, caracterizado porque además comprende la etapa de purificar las células de hemangioma humano sin injertar del cultivo.
150. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-140, caracterizado porque adémás comprende la etapa de aislar las células de hemangioma humano sin injertar del cultivo.
151. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 141-142, caracterizado porque el factor' de crecimiento es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteína (PTD) .
152. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque la PTD y la HOXB4 son conjugadas vía un enlazador.
153. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque el dominio de transducción de proteína (PTD) es una proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma.
154. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la H0XB4 es HOXB4 de mamífero..
155. El método de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque la HOXB4 de mamífero es HOXB4 humana o de ratón.
156. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la H0XB4 comprende una proteína de longitud completa.
157. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-140, caracterizado porque además comprende la etapa de cultivar las células de hemangioma sin injertar bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células de hemangioma sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas .
158. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-140, caracterizado porque el cultivo comprende al menos 1 X 106 células de hemangioma humano sin injertar, al menos 2 X 106 células de hemangioma humano 'sin injertar, al menos 3 X 106 células de hemangioma humano sin injertar, o al menos 4 X 106 células de hemangioma humano sin injertar.
159. Una célula de hemangioma humano sin injertar caracterizada porque se produce por el método de conformidad con las reivindicaciones 138, 139, 147, o 148.
160. Un método para producir células troncales hematopoyéticas humanas in vi tro, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; y (b) hacer crecer a las células de hemangioma humano sin injertar bajo condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas.
161. Una célula troncal hematopoyética humana caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 160.
162. Un método para administrar células de hemangioma humano sin injertar a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: [ (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; (c) administrar algunas o todas las células de hemangioma humano sin injertar al paciente. |
163. Un método para administrar células 1 de hemangioma humano sin injertar a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,000 células; ¡ (c) administrar algunas o todas las células ¡que forman colonias de hemangiomas humanos al paciente.
164. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porgue las células de hemangioma humano sin injertar están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
165. Un método para administrar células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: : (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
166. Un método para administrar células troncales hematopoyéticas humanas a un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
167. El método de conformidad con la reivindicación 166, caracterizado porque las células de hemangioma humano sin injertar están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
168. Un método para tratar un trastorno de célula troncal hematopoyética en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por el método de conformidad ;con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; ' (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
169. Un método para tratar un trastorno de célula troncal hematopoyética en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar el paciente en necesidad del mismo; (b) suministrar células de hemangioma humano sin injertar en una cantidad de al menos 10,000 células; (c) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células troncales hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células troncales hematopoyéticas humanas al paciente.
170. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque las células de hemangioma humano sin injertar están en una cantidad entre 10,000 hasta 4 millones de células.
171. Un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células de hemangioma sin injertar in vitro, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertar; y , (b) diferenciar las células de hemangioma |sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas.
172. Una célula hematopoyética diferenciada caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 171.
173. Un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células de hemangioma humano sin injertar, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertar; (b) diferenciar las células de hemangioma humano sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
174. Un método para producir células hematopoyéticas diferenciadas a' partir de células de hemangioma sin injertar in vi tro, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertar elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; y (b) diferenciar las células de hemangioma sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas.
175. Una célula hematopoyética diferenciada caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 174. ,;
176. Un método para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vi tro a partir de células de hemangioma humano sin injertar, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) proporcionar células de hemangioma humano sin injertár elaboradas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 138-148; (b) diferenciar las células de hemangioma . sin injertar en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
177. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 17 o 18, caracterizado porque la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores , y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación. :
178. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porgue la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores, y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
179. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos1 de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores, y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
180. El método de conformidad con (las reivindicaciones 138, 139, 147, o 148, caracterizado porgue la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores , y/o ' Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
181. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos! de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores, y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
182. El método de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porgue la célula troncal pluripotente es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores, y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
183. El método de conformidad con la reivindicación 174, caracterizado porque la célula troncal pluripotente' es una célula troncal pluripotente inducida (iPSC) , y la iPSC se pasa con tripsina, la iPSC se mantiene con fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) o se mantiene libre de alimentadores , y/o Y-27632 se agrega a medio de cuerpos embrioides libre de suero y/o medio de diferenciación.
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